ES2314261T3 - Inhibidores de src quinasa para uso en la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
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Abstract
Método para identificar un compuesto terapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que comprende las etapas a) proporcionar una proteína Src y b) determinar el efecto inhibidor de un compuesto en la actividad Src quinasa.
Description
Inhibidores de Src quinasa para uso en la
enfermedad de Alzheimer.
La presente invención se refiere a la
identificación de inhibidores de Src quinasa, a ensayos y a métodos
útiles para dicha identificación y a la utilización del inhibidor de
Src PP2 para la preparación de fármacos para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer es un trastorno
neurodegenerativo del cerebro, que está acompañado a nivel celular
de una pérdida masiva de neuronas en el sistema límbico y en la
corteza cerebral. En las áreas del cerebro afectadas pueden
detectarse a nivel molecular depósitos de proteínas, denominadas
placas, que son una característica esencial de la enfermedad de
Alzheimer. La proteína que aparece más frecuentemente en estas
placas es un péptido de 40 a 42 aminoácidos de tamaño, que se
designa como péptido A\beta. Este péptido es un producto de
escisión de una proteína mayor de 695 a 770 aminoácidos, la
denominada Proteína Precursora Amiloide (APP).
APP es una proteína transmembrana integral, que
en primer lugar atraviesa la bicapa lipídica. Con mucho, la mayor
parte de la proteína es extracelular, mientras que el dominio
C-terminal más corto está dirigido hacia el citosol
(Figura 1). APP es el sustrato de tres proteasas diferentes:
\alpha-secretasa,
\beta-secretasa y
\gamma-secretasa. En APP, aproximadamente dos
tercios del péptido A\beta se originan a partir del dominio
extracelular y aproximadamente un tercio a partir del dominio
transmembrana.
Además de la APP unida a la membrana, puede
detectarse una forma secretada de APP que consiste en el ectodominio
grande de APP y se designa como APP_{sec} ("APP secretada").
APP_{sec} se forma a partir de APP por escisión proteolítica, que
es efectuada por la \alpha-secretasa (Figura 2).
Esta escisión proteolítica tiene lugar en la secuencia de
aminoácidos del péptido A\beta (después del resto de aminoácido 16
del péptido A\beta). La proteolisis de APP por la
\alpha-secretasa evita así la formación del
péptido A\beta.
El péptido A\beta sólo puede formarse por lo
tanto a partir de APP en una vía de procesamiento alternativa. Se
postula que en este procesamiento están implicadas dos proteasas,
una proteasa, que se designa como \beta-secretasa,
que escinde en el extremo N-terminal del péptido
A\beta de APP y la segunda proteasa, que se designa como
\gamma-secretasa, que libera el extremo
C-terminal del péptido A\beta (Kang, J. et
al., (1987) Nature, 325, 733 (Figura 2).
Existen muchas indicaciones de que el péptido
A\beta es un factor crucial en la aparición de la enfermedad de
Alzheimer. Entre otros, se postula la neurotoxicidad de las
fibrillas de A\beta en cultivo celular (Yankner, B.A. et
al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA, 87, 9020). En pacientes con
el síndrome de Down, en los que APP aparece en una copia adicional,
también aparece la neuropatología característica de la enfermedad de
Alzheimer incluso a una edad de 30 años. Aquí, se asume que la
sobreexpresión de APP produce una conversión incrementada en el
péptido A\beta (Rumble, B. et al., (1989), N. Engl. J.
Med., 320, 1446).
Además, la indicación más fuerte del papel
central del péptido A\beta en la enfermedad de Alzheimer son las
formas familiares de la enfermedad. Aquí, se encuentran mutaciones
en el gen APP alrededor del área de los sitios de escisión de la
secretasa o en dos genes más asociados a AD (presenilinas), que en
cultivo celular da lugar a un incremento significativo de la
producción de A\beta (Scheuner, D. et al., (1996), Nature
Medicine, 2, 864).
Existen varias indicaciones de que APP es
escindida en primer lugar por la \beta-secretasa,
para servir posteriormente como sustrato para la
\gamma-secretasa (Maruyama, K. Y. et al.,
(1994) Biochem. Biophys Res Commun, 202, 1517; Estus, S. et
al., (1992), Science, 255, 726). La
\gamma-secretasa tiene por lo tanto un papel
crucial en la formación del péptido A\beta. Una demostración de la
actividad de la \gamma-secretasa que se utiliza
habitualmente es la detección del péptido A\beta, que, sin
embargo, es habitualmente difícil.
Una razón importante para esto es que sólo una
pequeña parte de APP se convierte en el péptido A\beta (Simons M,
et al., Neurosci (1996)
1;16(3):899-908). Además, el péptido A\beta
es un fragmento pequeño de degradación de aproximadamente 4 kDa y,
debido a su carácter hidrofóbico, tiene una gran tendencia a
agregarse consigo mismo de manera que precipita fácilmente en
condiciones fisiológicas (Hilbich, C. et al., (1991) J. Mol.
Biol., 218, 149).
La cola C-terminal corta con una
longitud de 47 aminoácidos de APP está expuesta al citosol y es el
sitio de interacción de adaptadores moleculares que contienen
dominios PTB, denominados Fe65, X11, m-dab y Jip1.
Como la unión de estas proteínas es dependiente de la secuencia
YENPTY de APP, se espera que sus interacciones no sean simultáneas
(T. Russo et al. (1998) FEBS Lett. 434, 1-7;
N. Zambrano et al. (1997) J. Biol. Chem. 272,
6399-6405). En efecto, se ha mostrado, en células en
cultivo, que las proteínas Fe65 y X11 tienen efectos opuestos en el
procesamiento proteolítico de APP (Sabo S. et al. (1999) J.
Biol. Chem. 274, 7952-7957; Borg J.P. et al.
(1998) J. Biol. Chem. 273, 14761-14766). Una posible
explicación para estos descubrimientos puede residir en el
reclutamiento, bien por Fe65 o X11, de APP en diferentes complejos
macromoleculares, dependiendo de la interacción de diferentes
conjuntos de proteínas con los demás dominios de interacción
proteína-proteína de los dos adaptadores.
El citodominio de APP contiene varios restos de
serina y treonina, que se fosforilan in vitro por diferentes
actividades quinasa. Thr668 es un sitio principal de fosforilación
in vivo, fosforilándose por quinasas neuronales dependientes
de ciclina, Cdk5 en neuronas (lijima, K. et al. (2000) J.
Neurochem. 75, 1085-1091), cdc2 quinasa en células
en división (Suzuki, T. et al. (1994) EMBO J. 13,
1114-1122; Oishi, M. et al. (1997) Mol. Med.
3, 111-123) y glucógeno sintasa quinasa 3b (GSK3b) y
proteína quinasa activada por estrés 1b (SAP quinasa 1b) in
vitro (Aplin, E. E. et al. (1996) J. Neurochem. 67,
699-707; Standen, C. L. et al. (2001) J.
Neurochem. 76, 316-320). Se ha mostrado que la
fosforilación de APP regula la extensión de las neuritas en células
PC12 que se diferencian (Ando, K. et al. (1999) J. Neurosci.
19, 4421-4427), mientras que, a nivel molecular, la
fosforilación de APP puede regular la unión a los adaptadores que
contienen el dominio PTB y su procesamiento (Ando K. et al.
(2001) J Biol. Chem., 276, 40353-40361).
Previamente, se demostró que APP se fosforila en
la tirosina 682 en células que expresan una forma activa de la
tirosina quinasa no asociada a receptor Abl (Zambrano N. et
al. (2001) J Biol. Chem. 276, 19787-92); Abl
activa se recluta cerca de APP por Fe65, que puede unirse
simultáneamente a estas dos proteínas mediante su dominio WW (Abl)
y dominio PTB2 (APP). La fosforilación de Tyr682 de APP genera un
sitio de acoplamiento para el dominio SH2 de Abl y, de hecho, se
forman complejos estables entre APP y Abl.
Con el fin de ensayar la hipótesis de que la
fosforilación en tirosina regula la actividad biológica de
pp60c-src, Kmiecik y Shalloway (1987) Cell 49,
65-73 describieron la construcción y estudio de
mutantes de pp60c-src en los que Tyr 527 y Tyr 416
se alteraron independientemente o coordinadamente a fenilalanina. La
mutación
Tyr- - - -Phe 527 activó fuertemente las actividades de transformación y quinasa de pp60c-src, mientras que la introducción adicional de una mutación Tyr- - - -Phe 416 suprimió estas actividades. La mutación Tyr- - -Phe 416 de pp60c-src normal eliminó su actividad de transformación parcial, lo que sugiere que la fosforilación transitoria o restringida de otra forma de Tyr 416 es importante para la función de pp60c-src incluso si no se observa in vivo una fosforilación estable. Normalmente, pp60c-src se fosforila in vivo en la tirosina 527, un resto que no está presente en pp60v-src (su homólogo transformante) y no en la tirosina 416, su sitio de autofosforilación in vitro.
Tyr- - - -Phe 527 activó fuertemente las actividades de transformación y quinasa de pp60c-src, mientras que la introducción adicional de una mutación Tyr- - - -Phe 416 suprimió estas actividades. La mutación Tyr- - -Phe 416 de pp60c-src normal eliminó su actividad de transformación parcial, lo que sugiere que la fosforilación transitoria o restringida de otra forma de Tyr 416 es importante para la función de pp60c-src incluso si no se observa in vivo una fosforilación estable. Normalmente, pp60c-src se fosforila in vivo en la tirosina 527, un resto que no está presente en pp60v-src (su homólogo transformante) y no en la tirosina 416, su sitio de autofosforilación in vitro.
Williamson et al. (2002) J. Neurochem.
22, 10-20) han descrito la fosforilación rápida de
proteínas neuronales incluyendo Tau y la quinasa de adhesión Focal
en respuesta a la exposición al péptido
amiloide-\beta y una implicación de la familia
Src de proteínas quinasas.
Slack, B. E. y Berse; B. (1998) han descrito en
Society for Neuroscience Abstracts, Vol. 24, No.
1-2, p. 208 (Conference/Meeting Information: 28th
Annual Meeting of the Society for Neuroscience, Parte 1, Los
Angeles, California, EEUU, Nov. 7-12, 1998 Society
for Neuroscience, ISSN: 0190-5295) un papel para las
tirosina quinasas en la estimulación de la liberación de APP por
acción de los receptores muscarínicos m3 de la acetilcolina. Han
descrito un papel para la tirosina quinasa Src en la regulación de
la liberación de APP_{sec} por los receptores muscarínicos. Han
demostrado que un incremento de la forma activa de Src da lugar a
una disminución de secAPP.
La presente invención proporciona métodos para
identificar agentes terapéuticos para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer.
Una realización de la invención proporciona
métodos para identificar inhibidores de la actividad Src,
comprendiendo los métodos las etapas
- a)
- proporcionar una proteína Src (es decir, un ADN que codifica Src bajo el control de un elemento de expresión) y
- b)
- determinar si un compuesto inhibe la actividad de Src.
La proteína Src podría ser cualquier proteína
Src de mamífero, preferiblemente Src humana (SEQ ID NO. 1 (isoforma
1) y SEQ ID NO. 2 (isoforma 2)) o Src de roedor (SEQ ID NO. 3). La
proteína podría obtenerse expresando ADNc de Src humano o ADNc de
Src de roedor, utilizando, por ejemplo, las secuencias SEQ ID NO. 4
o SEQ ID NO. 5. Además, puede utilizarse una de las secuencias
depositadas bajo el No. de Registro de Genbank M17031 o
BC011566.
Para el método, se utiliza preferiblemente una
célula o línea celular de mamífero en la que se expresa Src, bien
de forma natural o porque la célula/línea celular se ha modificado
por ingeniería genética. En una realización particular se utilizan
cultivos primarios de neuronas.
Otra realización de la invención se refiere a un
método para identificar compuestos, que inhiben la expresión de
Src. El método comprende las etapas
- a)
- proporcionar una secuencia que regula la expresión de Src (es decir, una secuencia promotora de Src) y
- b)
- determinar si un compuesto inhibe la expresión de la proteína Src.
La secuencia que regula la expresión de Src está
unida preferiblemente a un gen informador o una construcción de gen
informador. Dicho gen informador puede utilizarse fácilmente para
determinar si un compuesto inhibe la expresión de Src. Otra
posibilidad es utilizar el gen Src. La región del cromosoma 20 que
incluye el gen Src está depositada bajo el no. de Registro de
Genbank AL133293.
Se ha descrito un promotor constitutivo, que
puede utilizarse como una secuencia que regula la expresión de Src,
así como un promotor alternativo regulado por el
Factor-1a Nuclear Hepático (Bonham et al.
(2000) J. Biol. Chem. 275, 37604) (número de registro de Genbank
AF272982).
Otra realización de la invención se refiere a la
utilización de PP2
(4-amino-5-(4-clorofenil)-7-(t-butil)pirazolo[3,4-d]pirimidina)
para la preparación de un fármaco para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer.
Los nuevos resultados demuestran que APP se
fosforila no sólo por Abl. De hecho, la quinasa Src también es
responsable de la fosforilación en tirosina de APP. Se espera que la
fosforilación en tirosina de APP altere las propiedades de unión de
su citodominio y entonces el procesamiento de APP podría modificarse
consecuentemente. Si esto es así, se demostrará la utilidad de los
inhibidores de tirosina quinasa disponibles actualmente y servirá
para diseñar unos nuevos para la modulación farmacológica de la
liberación de los productos de procesamiento de APP en modelos
celulares y animales de la enfermedad de Alzheimer.
Tomados en conjunto, los resultados de los
ejemplos siguientes sugieren que la actividad exógena Src es
responsable de la activación de una ruta que resulta en una
secreción incrementada de A\beta. Esto también sugiere que PP2
podría utilizarse como un agente farmacológico capaz de reducir la
secreción de A\beta en sistemas celulares y animales asemejando
el estado AD.
Por lo tanto, se utilizó una línea de células
CHO que sobreexpresa de manera estable la forma APP751 que secreta
niveles discretos de A\beta. Si la secreción implica la actividad
endógena Src, PP2 debería ser capaz de inhibir la producción de
A\beta también en este sistema celular. En efecto este es el caso,
ya que, como se muestra en la Figura 6, PP2 reduce de una manera
dependiente de la dosis la cantidad de A\beta en los tres
tiempos ensayados (1, 3 y 12 horas), mientras que PP3, utilizada a
la concentración más alta, no tiene efecto.
Estos experimentos resaltan claramente la
relevancia de la activación de Src en la secreción de A\beta y
constituyen la base para intentar aplicaciones farmacológicas de los
inhibidores de tirosina quinasa en el tratamiento de AD. El cribado
de dichos inhibidores y su optimización dará lugar al desarrollo de
agentes terapéuticos potenciales e innovadores para el tratamiento
de la enfermedad de Alzheimer.
Ejemplo
1
Se cultivaron células de riñón embrionarias
humanas (HEK293) en medio mínimo modificado por Dulbecco
suplementado con 10% de suero fetal de ternera a 37ºC en una
atmósfera con 5% de CO_{2}. Para la transfección, las células se
crecieron durante 16 horas en medio sin antibióticos y se
transfectaron con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) según las
instrucciones del fabricante. La cantidad total de ADN se mantuvo
constante mediante la adición de vector de ADN vacío. 48 horas
después de la transfección, se recuperó el medio de cultivo,
mientras que las células se recogieron en disolución salina
tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo y se lisaron
suavemente en tampón de lisis (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl,
0,5% Tritón X-100, 10% glicerol, 50 mM NaF, 1 mM
vanadato de Na), en presencia de una mezcla de inhibidores de
proteasas (Completo, sin EDTA, Roche). Los extractos se
clarificaron mediante centrifugación a 16.000 x g a 4ºC y la
concentración de proteínas se determinó por el ensayo de proteínas
Bio-Rad según las instrucciones del fabricante. Para
el marcaje metabólico, 36 horas después de la transfección, las
células se incubaron durante 30 minutos en medio sin metionina ni
cisteína, el medio se reemplazó por medio fresco que contiene 80
\muCi/ml de mezcla ^{35}S-metionina/cisteína
(Promix, 1000 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech). El pulso fue de
30 minutos y el medio radiactivo se reemplazó por medio completo
durante 90 minutos. Las células CHO que expresan APP751 de tipo
salvaje han sido descritas (N. Zambrano et al. (1997) J.
Biol. Chem. 272, 6399-6405).
Se realizaron
inmuno-precipitaciones bien en el medio de cultivo o
en los lisados celulares con 1 \mug/muestra del anticuerpo
monoclonal 6E10 (Signet).
Las muestras radiactivas se resolvieron en 10%
SDS-PAGE y se cuantificaron con un fosforimager
Storm 840 (Amersham Pharmacia Biotech).
PP2 y PP3 (Hanke, J.H. et al. (1996) J.
Biol. Chem. 271, 695-701) se obtuvieron de
Calbiochem y se disolvieron en DMSO; los tratamientos se realizaron
en células transfectadas durante 48 horas con vehículo solo o con
1, 5 y 20 \muM de PP2 o PP3. La concentración de DMSO fue la misma
en todas las muestras. Los tratamientos en células CHO/APP751 se
hicieron con DMSO o PP2 (5 y 20 \muM) o PP3 (20 \muM).
Ejemplo
2
Las células HEK293 se transfectaron con vectores
de expresión APP695. Este sistema celular se utilizó porque estas
células se transfectan con una eficacia alta y porque expresan el
conjunto completo de actividades de procesamiento requeridas para
la maduración de APP. De hecho, después de la transfección de
vectores de expresión APP695 humana, tanto el producto de la
\alpha-secretasa (APP_{sec}) como los productos
de la \beta- \gamma-secretasa (A\beta) se
acumulan en el medio de cultivo. Las células HEK293 se
co-transfectaron con APP y vector vacío o quinasa
Abl activa (Abl-PP) o quinasa Src activa (SrcYF) y
se evaluó la secreción de APP_{sec} y de A\beta. Las células
transfectadas se habían sometido a un pulso de marcaje con la
mezclaS-Met/Cys durante 30' y se siguieron con
aminoácidos fríos durante 90'. En los experimentos de
inmunoprecipitación se utilizaron tanto extractos de medio como de
proteínas para la dosificación cuantitativa de APP_{sec} y
holo-APP radiactivas, respectivamente. Mientras que
la estabilidad de holo-APP no se afectó por la
co-transfección con las quinasas activas
Abl-PP o SrcYF (Figura 3A), se observó en ambos
casos una reducción en las cantidades relativas de APP_{sec},
normalizada respecto a la holo-APP correspondiente
sintetizada durante el periodo del pulso (Figura 3B). Esto puede
interpretarse como una disminución de la actividad de la ruta de la
\alpha-secretasa después de la
co-transfección de APP con las quinasas activas.
Ejemplo
3
A continuación, se investigó la acumulación de
A\beta en células transfectadas como se ha indicado anteriormente.
La dosificación se realizó por ensayos de ELISA tipo sandwich en
medio de cultivo a las 48 horas después de la transfección (Figura
4). El ensayo muestra claramente que en las células que expresan Src
la cantidad de A\beta secretado es más elevada que en presencia
del vector control o Abl-PP.
El mecanismo por el que Src activa induce este
gran incremento en la secreción de A\beta no está claro. Sin
embargo, puede depender de la fosforilación de otras proteínas,
diferentes de APP, ya que la fosforilación en tirosina de APP por
Abl-PP no resulta en niveles incrementados de
A\beta. De acuerdo con esto, se obtiene un comportamiento similar
con varios mutantes de APP que tienen sustituciones de tirosina bien
a glicina o fenilalanina (datos no mostrados).
En cualquier caso, la elevación de los niveles
de A\beta depende de la actividad tirosina quinasa de Src, ya que
la acumulación de A\beta es sensible al tratamiento con el
inhibidor específico de la familia Src, PP2. De hecho, como se
muestra en la Figura 5, la exposición de células transfectadas
durante 48 horas a concentraciones crecientes de PP2 resulta en una
disminución dependiente de la dosis de A\beta secretada. Ni PP3,
una análogo inactivo de PP2, ni el vehículo solo, afectan la
elevación de A\beta por la transfección con SrcYF.
Tomadas en conjunto, estas observaciones
sugieren que la actividad Src exógena es responsable de la
activación de una ruta hasta ahora no identificada que resulta en
una secreción incrementada de A\beta.
1) T. Russo et al. (1998)
FEBS Lett. 434, 1-7.
2) N. Zambrano et al.
(1997) J. Biol. Chem. 272,
6399-6405.
3) Sabo S. et al. (1999)
J. Biol. Chem. 274, 7952-7957.
4) Borg J.P. et al. (1998)
J. Biol. Chem. 273, 14761-14766.
5) lijima, K. et al. (2000)
J. Neurochem. 75, 1085-1091.
6) Suzuki, T. et al. (1994)
EMBO J. 13, 1114-1122.
7) Oishi, M. et al. (1997)
Mol. Med. 3, 111-123.
8) Aplin, E. E. et al.
(1996) J. Neurochem. 67, 699-707.
9) Standen, C. L. et al.
(2001) J. Neurochem. 76, 316-320.
10) Ando, K. et al. (1999)
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11) Ando K. et al. (2001)
J Biol Chem.; 276, 40353-40361.
12) Zambrano N. et al.
(2001) J Biol Chem 276,
19787-19792.
13) Hanke, J. H. et al.
(1996) J. Biol. Chem. 271,
695-701.
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<110> AVENTIS PHARMA S.A.
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<120> Inhibidores de SRC quinasa para
utilizarse en la enfermedad de Alzheimer
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> FRAV2002/0030
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión PatentIn 3.1
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<210> 1
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<211> 542
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 536
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 541
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murinae gen. sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3.711
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.626
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Murinae gen. sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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Claims (7)
1. Método para identificar un compuesto
terapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que
comprende las etapas
- a)
- proporcionar una proteína Src y
- b)
- determinar el efecto inhibidor de un compuesto en la actividad Src quinasa.
2. Método para identificar un compuesto
terapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer que
comprende las etapas
- a)
- proporcionar una secuencia que regula la expresión de Src y
- b)
- determinar si un compuesto inhibe la expresión de la proteína Src.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que Src es Src humana o Src de ratón.
4. Método según una de las reivindicaciones
anteriores, en el que Src tiene la secuencia SEQ ID NO. 1, SEQ ID
NO. 2 o SEQ ID NO. 3.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
Src se expresa en una célula de mamífero.
6. Método según la reivindicación 2; en el que
la secuencia reguladora es el promotor de Src.
7. Utilización de PP2
(4-amino-5-(4-clorofenil)-7-(t-butil)pirazolo[3,4-d]pirimidina)
para la preparación de un fármaco para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer.
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