ES2314069T3 - Transferencia genica neuronal mejorada. - Google Patents

Abstract

Producto que comprende (i) un vector vírico que comprende un transgén y (ii) una toxina botulínica, particularmente la neurotoxina A botulínica, para la utilización simultánea o secuencial para suministrar dicho transgén a neuronas mediante inyección intramuscular o intracerebral y transporte retrógrado.

Description

Transferencia génica neuronal mejorada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a los campos de la genética y de la medicina. Más particularmente, la invención se refiere a composiciones para el suministro de ácidos nucleicos a neuronas en un mamífero, y a su utilización. La presente invención da a conocer específicamente la utilización de compuestos que provocan el disparo sináptico nervioso para aumentar el transporte retrógrado neuronal de un vector o de un producto (un polipéptido o un ácido nucleico, por ejemplo) en un mamífero. La invención se basa asimismo en la utilización de un compuesto que interacciona con las proteínas asociadas a los sinaptosomas para aumentar el transporte retrógrado neuronal de un vector o de un producto, tal como el que se ha mencionado anteriormente en un mamífero. La invención se refiere también a un producto que comprende un vector vírico que incluye un transgén y un compuesto que causa el disparo sináptico nervioso, para uso secuencial, con el fin de suministrar dicho transgén a las neuronas mediante transporte retrógrado y su utilización para la preparación de una composición que se emplea como tratamiento en varios trastornos neurológicos. Las composiciones de la presente invención pueden utilizarse para suministrar varios transgenes, tales como marcadores, vacunas, genes terapéuticos, etc, y son apropiadas también para aplicaciones experimentales, terapéuticas u otras diversas.

Antecedentes de la invención

La transferencia de información entre dos neuronas o el cruzamiento de órdenes desde una neurona a una célula diana, tal como una neurona motora y una fibra muscular contráctil, tiene lugar a través de uniones denominadas sinapsis.

La vía sináptica principal de comunicación implica la emisión de moléculas químicas o neurotransmisores desde las terminales nerviosas de la neurona transmisora (neurona presináptica) que son tomadas por la célula postsináptica receptora. La acetilcolina interviene como un neurotransmisor entre las neuronas motoras y los músculos esqueléticos estriados, por ejemplo.

En las terminaciones nerviosas, las moléculas químicas se almacenan en vesículas sinápticas que están compuestas por organelas pequeñas y esféricas de 50 nm de diámetro, delimitadas por una membrana lipídica. Estas moléculas son hasta 500.000 en las terminaciones nerviosas.

Para ordenar un impulso voluntario o un movimiento, o mantener una posición, se transmite la orden de contracción a los músculos mediante diversos impulsos eléctricos. Cada impulso se extiende a las terminaciones nerviosas de las neuronas motoras, desporalizándolas. Las proteínas asociadas a los sinaptosomas, principalmente los canales iónicos, son activados y se vuelven permeables a los iones cálcicos que alcanzan las terminaciones nerviosas. Esto induce la fusión de las vesículas sinápticas con las membranas terminales nerviosas. De este modo, el contenido de los neurotransmisores vesiculares se libera a través de la hendidura sináptica entre la neurona transmisora y la fibra muscular diana. Esta liberación se denomina exocitosis. La acetilcolina se difunde a través de la hendidura sináptica, y entonces las moléculas son detectadas mediante los receptores de la acetilcolina que se localizan sobre las fibras musculares. Esta detección induce una señal postsináptica, principalmente una desporalización, que da lugar a un potencial de acción.

A veces, este mecanismo de transducción de la señal es deficiente. La esclerosis lateral amiotrófica es un trastorno neurodegenerativo devastador, que afecta a las neuronas motoras del sistema nervioso central (córtex, tronco encefálico) y las neuronas motoras periféricas (médula espinal). Esta enfermedad destruye las células nerviosas que controlan el movimiento voluntario y está caracterizada porque presenta una debilitación progresiva de los músculos, parálisis y muerte, habitualmente en los 2 a 5 años después de la aparición del primer síntoma clínico. La enfermedad afecta a las extremidades, lengua, y músculos faríngeos y laríngeos. El principio tiene lugar habitualmente después de los 45 años y la velocidad y patrón de la progresión de la enfermedad varían ampliamente.

No existe tratamiento para esta enfermedad y su etiología permanece desconocida, aunque el descubrimiento de mutaciones de sentido alterado en el gen para la superóxido dismutasa zinc-cúprica (SOD1) en algunos árboles genealógicos con ALS familiar (FALS), ha constituido un avance importante en el conocimiento de la fisiopatología de ALS. La mayoría de los casos ALS son esporádicos (SALS) y del 10% de los casos autosómicos dominantes heredados, alrededor del 20% de los familiares están asociados con mutaciones en el gen SOD1. Hasta ahora, se han identificado de aproximadamente 60 mutaciones puntuales en la totalidad de los 5 exones del gen SOD1, implicando a 43 de los 153 residuos.

La enzima SOD1 juega una función crítica en la prevención del daño celular causado por los radicales libres, eliminando el radical aniónico superóxido. convirtiéndolo en oxígeno y peróxido de hidrógeno. Aunque el mecanismo por el cual las mutaciones en el gen que codifica la proteína ubicuota SOD1 conducen a la degeneración selectiva de las neuronas motoras no es conocido, algunas de dichas mutaciones provocan una enfermedad de las neuronas motoras cuando se expresan en ratones transgénicos. Por ejemplo, el ratón mutante G93A (sustitución de la glicina por la alanina en posición 93) desarrolla una pérdida progresiva de las neuronas motoras y degeneración vacuolar de las mitocondrias en el interior del cuerpo de las neuronas motoras de la médula espinal y tallo cerebral, conduciendo a pérdida progresiva de la función motora y muerte a los 5 o 6 meses de edad. Se cree que, más que una disminución en la actividad enzimática, en esta neurotoxicidad están implicadas nuevas propiedades citotóxicas de la SOD1 mutada. En particular, la mutación SOD1 puede inducir la no acumulación de los neurofilamentos (NF), tal como se ha descrito tanto en la ALS humana como en la experimental, habiéndose informado, en los ratones que transportaban tanto una mutación SOD-1 como un gen NF-L alterado de un nivel inferior de degeneración neuronal motora combinado con un retraso en la progresión de la enfermedad.

Otras enfermedades tales como la atrofia muscular espinal (SMA), epilepsia, enfermedad de Parkinson o enfermedad de Alzheimer también están causadas por trastornos neurológicos. Además, los traumas asociados con la médula espinal pueden inducir trastornos neurológicos.

Diversos factores neurotrópicos, neuroprotectores y de crecimiento constituyen candidatos potenciales para tratar ALS y otras Enfermedades de las Neuronas Motoras (MND) (Alisky y Davidson, 2000). Sin embargo, estos factores que se suministraron sistemáticamente, no fueron beneficiosos para los pacientes en los ensayos clínicos. Las razones para esta falta de éxito incluyen un acceso limitado a las neuronas motoras, especificidad insuficiente, o regulación por disminución de los sitios de unión (Sendtner, 1997). La transferencia de genes terapéuticos ofrece ventajas potenciales respecto a la administración directa de las proteínas, tal como la producción continua y/o dirigida del transgén deseado in vivo. La producción continua in situ de concentraciones fisiológicas de factores de crecimiento mediante transferencia génica puede permitir la expresión del efecto terapéutico potencial de dichas moléculas (Gravel et al, 1997; Alisky y Davidson, 2000). El transporte axónico retrógrado de vectores adenovíricos recombinantes puede utilizarse con éxito para suministrar genes a neuronas motoras en los mamíferos, después de la inyección de los vectores en los músculos (WO 98/31395). Véase también el Resumen en línea nº 96352233. Sin embargo, parece que sólo una pequeña proporción de las neuronas motoras absorbieron y transportaron de forma retrógrada las partículas adenovíricas.

La inyección intramuscular de adenovirus recombinantes constituye un enfoque particularmente bien ajustado para la terapia génica de MND, porque permite la transducción de neuronas motoras y la producción de las proteínas terapéuticas en el Sistema Nervioso Central (CNS) después del transporte retrógrado axónico de los vectores (Finiels et al, 1995; Ghadge et al, 1995). Sin embargo, varios estudios recientes informaron que sólo un escaso porcentaje de las neuronas motoras fueron transducidas después de la administración periférica de adenovirus recombinantes (Gravel, et al, 1997; Perrelet, et al, 2000). La inyección intramuscular de adenovirus recombinantes en la musculatura facial o en la lengua de ratones, dio lugar a que se transdujeran menos del 10% de las neuronas motoras (Gravel et al, 1997). Esto podría ser debido a que sólo sería susceptible de infección una subpoblación de neuronas motoras espinales (Perrelet et al, 2000). De acuerdo con estos estudios, también se observó una escasa proporción de transducción a neuronas motoras (4%) en el núcleo hipogloso de ratones, después de la inyección del adenovirus Ad-RSV-\betagal en la lengua.

La inyección intracerebral directa de vectores adenovíricos en varias estructuras cerebrales permite la transferencia de un gen terapéutico tanto en el sitio de la inyección como también a distancia, a través de neuronas que envían ramificaciones axónicas al sitio de la inyección (Akli et al, 1993; Davidson et al,1993; Le Gal La Salle et al, 1993). Esta observación sugiere que las partículas adenovíricas son absorbidas en las terminaciones nerviosas y son transportadas de forma retrógrada a los cuerpos celulares neuronales. Por ejemplo, las neuronas localizadas en la substantia nigra o en la oliva bulbar pueden ser transducidas de forma eficiente mediante la inoculación del núcleo estriado y del cerebelo, respectivamente, con los vectores (Akli et al, 1993; Ridoux et al, 1994). Esta propiedad digna de mención hace que los adenovirus recombinantes sean particularmente útiles para el marcado neuronal retrógrado en el CNS (Ridoux et al, 1994; Kuo et al, 1995). Otra aplicación de esta propiedad es la transducción de las neuronas motoras que no son fácilmente accesibles por la inyección periférica de los vectores (Finiels et al, 1995; Ghadge et al, 1995). Esta vía de administración resulta particularmente adecuada para tratar las enfermedades neurodegenerativas fatales que afectan a las neuronas motoras (Alisky y Davidson, 2000). Constituye una alternativa preferida a las inyecciones intramedulares más invasivas con vectores génicos. Sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, el porcentaje de neuronas motoras trasducidas es bajo, incluso cuando se utilizan dosis altas del vector (Gravel et al, 1997; Perrelet et al, 2000). Otro problema potencial es la producción ectópica de la proteína exógena, es decir, la presencia de la proteína en el músculo puede dar lugar a efectos secundarios.

La presente invención proporciona una mejora en el suministro génico a las neuronas motoras, particularmente con un enfoque de "transporte retrógrado", y permite una sobreexpresión en dichas neuronas in vivo de cualquier polipéptido o ácido nucleico. La invención es el resultado de la utilización de varios compuestos que causan el disparo de las sinapsis nerviosas que mejora significativamente el transporte retrógrado y la expresión génica en la neurona.

Sumario de la invención

La invención se refiere a composiciones que permiten un transporte retrógrado eficiente de vectores génicos o de cualquier otro producto (un polipéptido o un ácido nucleico, por ejemplo) en las neuronas. La invención se refiere más específicamente a la combinación de vectores de suministro génico y compuestos particulares que provocan el disparo de las sinapsis nerviosas, para proporcionar una mejora en el suministro génico in vivo.

La presente invención da a conocer un nuevo enfoque farmacológico para aumentar el suministro génico a neuronas después de inyección intramuscular o intracerebral de virus recombinantes. Este se basa en la inyección de un compuesto que induce el disparo sináptico en la unión neuronal, antes preferentemente de la del vector o del producto y, esencialmente, en el mismo lugar.

La invención muestra que la preinyección con un compuesto que causa el (mencionado) disparo, da lugar a una notable mejoría de la transferencia génica vírica a varios grupos de neuronas. Un objetivo de la presente invención consiste, por tanto, en utilizar un producto que provoque el disparo de las sinapsis nerviosas, o que cause un aumento de la plasticidad neuronal y de la endocitosis, para la preparación de una composición que aumente el transporte retrógrado neuronal de un vector en un mamífero.

Además, la presente invención muestra además que, inesperadamente, los compuestos que causan el disparo nervioso no sólo aumentan el número de neuronas transducidas, sino que elevan también el nivel de expresión de un transgen en cada neurona.

De acuerdo con esto, dichos compuestos son útiles en la preparación de una composición para el tratamiento del organismo humano. La presente invención se refiere, asimismo, por ejemplo, a un producto que comprende un vector vírico que incluye un transgén y un compuesto que provoca el disparo de las sinapsis nerviosas, para utilización secuencial, para el suministro de dicho transgén a las neuronas mediante inyección intramuscular o intracerebral y transporte retrógrado. En particular, los compuestos que poseen la capacidad para aumentar el disparo de las sinapsis nerviosas y del transporte retrógrado de las neuronas, representan compuestos de alto potencial para el tratamiento de enfermedades neuronales como la esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia, enfermedad de Parkinson o enfermedad de Alzheimer, por ejemplo. Las dianas o receptores de estos compuestos representan asimismo un objetivo interesante para el desarrollo de medicamentos o composiciones farmacológicamente activas que podrían entonces utilizarse con propósitos farmacéuticos, terapéuticos o experimentales.

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Leyenda de las Figuras

Figura 1: Curva dosis-respuesta para el pretratamiento con BoNT y la transducción de las neuronas motoras. Actividad luciferasa en el tronco encefálico (en negro) y en la lengua (en blanco) 8 días después de la inyección de Ad-N12-PGK-luc en la lengua de ratones pretratados con PBS o BoNT (1,25 a 250 pg). La actividad de la luciferasa se expresa en rlu/\mug de proteína total. Los datos se proporcionan como promedios +/- SEM para 3-6 animales. Se utilizó un ensayo Student's para comparar cada grupo tratado con BoNT con el grupo de control PBS(*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001).

Figura 2: Neuronas motoras que expresan \beta-galactosidasa en el núcleo hipogloso después de la administración de Ad-RSV-\beta-gal en lenguas en las que se había preinyectado PBS (A,D), 12,5 pg de BoNT (B,E) o 25 pg de BoNT (C,F). (A,B,C) se encuentran a bajo aumento y la dosis (representada por el correspondiente histograma) es de 50 \mum. (B,D,F) muestran detalles de neuronas motoras hipoglósicas que expresan \beta-galactosidasa, a gran aumento (dosis de 25 \mum en el histograma). Debe apreciarse la intensa expresión de la \beta-galactosidasa que fluye desde el núcleo al citoplasma de la neurona motora y la neuritis en (E,F).

Figura 3: Neuronas motoras que expresan \beta-galactosidasa en la médula espinal cervical (A-D) y lumbar (E-H) una semana después de la inyección de Ad-RSV-\beta-gal en los músculos tibial izquierdo y gemelo izquierdo, respectivamente. Los músculos se inyectaron previamente con PBS (cuadro a la izquierda) o con 12,5 pg de BoNT (cuadro a la derecha). (A,B,E,F) presentan un bajo aumento, la dosis es de 200 \mum (en el correspondiente histograma). (C,D,G,H) presentan un aumento más alto, la dosis es de 50 \mum (en el correspondiente histograma).

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere generalmente a la utilización de un compuesto que causa el disparo (o "encendido" o "puesta en marcha") de las sinapsis nerviosas, para la preparación de una composición que aumente el transporte retrógrado neuronal de un vector o de un producto tal como un polipéptido o un ácido nucleico, en un mamífero y preferentemente en el hombre.

Los vectores que se utilizan en la presente invención pueden ser cualesquiera vectores víricos o no víricos, apropiados para la introducción de ácidos nucleicos en una célula in vivo. Los vectores no víricos incluyen plásmidos que pueden utilizarse conjuntamente con liposomas, lípidos cargados eléctricamente, (citofectinas), complejos ADN-proteínas y biopolímeros. En una forma de realización preferida, los vectores son vectores víricos, preferentemente adenovirus, herpesvirus, virus adenoasociados (AAV), retrovirus que incluyen lentivirus, poxivirus, baculovirus, virus de la viruela vacunoide, virus de Epstein-Barr. Los vectores más preferidos son adenovirus.

Existen varios serotipos de adenovirus. De estos serotipos, resulta preferido, dentro del alcance de la presente invención, a utilizar el tipo 2 o el tipo 5 del adenovirus humano (Ad 2 o Ad 5) o adenovirus de origen animal tal como los adenovirus de origen bovino, murino, ovino, porcino, aviar y simiano. Un adenovirus animal preferido es el canino, tal como el adenovirus CAV2. Algunos estudios han demostrado que los adenovirus pueden infectar con una alta eficiencia células del CNS (WO 99/41396, FR 2774698 y WO 98/31395). Los adenovirus recombinantes que transportan un genoma de replicación defectuosa pueden prepararse según los procedimientos que se conocen en la técnica utilizando células competentes de empaquetamiento o de transfección transitoria (Graham F.L. y Prevec L., Gene transfer and expression protocols; Manipulation of adenovirus vectors, Methods in Molecular Biology (1991), The Humana Press Inc, Cliften, NJ, capítulo 11, páginas 109-128).

Los vectores preferidos son adenovirus de replicación defectuosa, que comprenden por lo menos una región vírica no funcional seleccionada de entre E1, E2 y/o E4. Dichos adenovirus pueden producirse según procedimientos convencionales, tal como se describe, por ejemplo, en Dedieu et al, Journal of Virology 71 (1997), páginas 4.626-4.637. En una forma de realización particular, el adenovirus constituye un vector "mínimo" o un vector "vacío", es decir, comprende un genoma adenovírico desprovisto de genes víricos funcionales. Dichos vectores pueden obtenerse tal como se describe, por ejemplo, en Mitani et al., PNAS 92 (1995), páginas 3.854-3.858 y en Parks et al,. PNAS 93 (1996), páginas 13.565-13.570.

Los vectores retrovíricos o AAV pueden producirse siguiendo técnicas convencionales tal como las descritas, por ejemplo, en WO 92/07943, WO 90/02806, US nº 5.278.056; WO 97/09441, W0 97/06272, WO 96/39530, WO 95/34671, WO96/22378.

Más preferentemente, el vector proporciona una regulación de la expresión del transgén. Por ejemplo, aunque la expresión puede ser constitutiva y/o ubicua, los vectores preferidos proporcionan una expresión génica inducible o histoespecífica. La expresión histoespecífica puede obtenerse con promotores histoespecíficos o regulados, tales como NSE (enolasa específica neuronal), etc. Alternativamente, la regulación de la expresión puede alcanzarse utilizando elementos silenciadores que controlen la expresión a partir de promotores ubicuos.

Típicamente, puede utilizarse en los vectores, según la presente invención, un elemento silenciador restrictivo neuronal (NRSE) frente a un promotor ubicuo, limitando de este modo la expresión transgénica a las neuronas, y evitando esencialmente la expresión en las células musculares. Los ejemplos de promotores apropiados, histoespecíficos o constitutivos, se describen en WO 99/41396 y FR 2 774 698 e incluyen, por ejemplo, promotores víricos, (RSV; LTR; CMV) u otros promotores activos en las células de mamíferos (actina, fibrina, PGK, enolasa, etc).

El transgén que se debe suministrar a las neuronas puede consistir en cualquier ADN o ARN que codifiquen un polipéptido o una molécula antisentido de interés.

El polipéptido puede ser cualquier marcador o cualquier molécula biológicamente activa, tal como un factor de crecimiento, una citoquina, una linfoquina, un factor neurotrópico, etc. Los ejemplos típicos incluyen NT-3, NT-4, NT-5, CNTF, GDNF, interferón, TNF, IGF, interleuquinas, etc.

La invención se basa en la utilización de compuestos que inducen o causan, o estimulan el "disparo" nervioso, particularmente el disparo de la sinapsis nerviosa (por ejemplo, en una unión neuromuscular), y/o que causan o inducen o estimulan la plasticidad neuronal o la endocitosis. Verdaderamente, demuestra de manera inesperada que, alterando el estado fisiológico de la unión terminal o de las terminaciones nerviosas, es posible aumentar muy significativamente el transporte retrógrado de un vector en el interior neuronal. Los compuestos que van a utilizarse según la invención son toxinas botulínicas.

Las neurotoxinas botulínicas y especialmente la neurotoxina botulínica A (BoNT) se utilizan para potenciar la transferencia génica a las neuronas motoras que inervan los músculos que se inyectan. Las modificaciones en la transducción de las neuronas motoras son una consecuencia del "disparo" nervioso inducido por la toxina en las placas (uniones neuromusculares) terminales.

La invención proviene notablemente del descubrimiento inesperado de que la preinyección de la BoNT tipo A en los músculos mejora mucho la transferencia génica en las neuronas motoras mediante el transporte retrógrado de adenovirus recombinantes.

El transporte retrógrado de los vectores adenovíricos puede mejorarse asimismo utilizando otras toxinas botulínicas.

La presente invención incluye la utilización de un compuesto que provoca un aumento en la plasticidad neuronal y en la endocitosis, para la preparación de una composición para aumentar el transporte retrógrado neuronal de un vector en un mamífero, siendo dicho compuesto una toxina botulínica.

En una forma de realización de la presente invención, la inducción de esta plasticidad sigue al bloqueo de la transmisión colinérgica como un mecanismo de compensación: BoNT fragmenta SNAP-25 (proteína sinaptosómica asociada de 25 kDa), una proteína membranosa de la vesícula sináptica (Schlavo et al, 1993) y la consecuencia es que la liberación de acetilcolina es bloqueada (Ambache, 1949, Burgen et al, 1949). Las toxinas botulínicas detienen la exocitosis de las vesículas sin prevenir la endocitosis. Más bien, el aumento en la transducción de las neuronas motoras que se ha apreciado en los mamíferos tratados con la toxina botulínica demuestra que la endocitosis vesicular aumenta in vivo por la toxina.

En otra forma de realización de la invención, se ha demostrado que la mayor endocitosis que fue observada después de utilizar el compuesto que causa un aumento de la plasticidad neuronal y/o un "disparo" de las sinapsis nerviosas, se debe a la activación de GAP-43, una proteína asociada al crecimiento, que se encuentra en los conos de crecimiento y en las terminaciones sinápticas, y que está implicada en el "disparo" (sináptico) y en la endocitosis. GAP-43 está unido mediante la calmodulina cuando los niveles de Ca^{2+} son bajos, y es liberado cuando los niveles de Ca^{2+} aumentan. Durante los aumentos en los niveles de Ca^{2+} dependientes de la actividad, GAP-43 interacciona con la rabaptina-5, una proteína que está implicada en la endocitosis. Como GAP-43 está regulado negativamente por la actividad fosfatasa de la calcineurina, el estado de fosforilación de GAP-43 aumenta secundariamente a la inhibición de la calcineurina debida a ALS, de modo similar a lo que se observa en células que sobreexpresan los mutantes SOD-1.

La inmunoreactividad de GAP-43 es alta, tanto en la médula espinal como en las terminales nerviosas de los pacientes con ALS, y en las placas terminales motoras (uniones neuromusculares) en los mamíferos tratados con la toxina botulínica.

La invención demuestra la implicación de una vía alternativa de endocitosis regulada por GAP-43, en el aumento en la absorción que se observó, tanto en ALS como en los mamíferos tratados con la toxina botulínica.

La invención se refiere además asimismo a la utilización de un compuesto que provoca el "disparo" de las sinapsis nerviosas en una unión neuromuscular, para la preparación de una composición que aumente el transporte retrógrado de un producto o de un vector adenovírico en neuronas motoras en un mamífero, siendo dicho compuesto la toxina botulínica.

La invención que se refiere a la transferencia génica es aplicable a mamíferos, particularmente a los humanos, más particularmente a los que sufren trastornos degenerativos tales como ALS, incluso después del comienzo de los primeros síntomas clínicos de la enfermedad, que permiten el diagnóstico. Según la invención, la eficacia de la transferencia génica retrógrada mejora mediante el disparo sináptico.

La mejora en la transferencia del producto o del gen del virus, y especialmente en la transferencia del gen del adenovirus en las neuronas motoras de los mamíferos ALS sintomáticos, a pesar de la no acumulación de neurofilamentos y anormalidades en el transporte axónico del que se ha informado en estos mamíferos, constituye un hallazgo sorprendente que demuestra la plasticidad de las neuronas motoras ALS, que llevan a cabo una compensación por la pérdida de fibras nerviosas, adquiriendo nuevas capacidades para la absorción de las partículas víricas.

La invención da a conocer asimismo otro descubrimiento inesperado, principalmente que BoNT no sólo induce un aumento en el número de neuronas transducidas, sino que también da lugar a una expresión transgénica más intensa en el interior de estas neuronas.

Otra forma de realización de la presente invención es un producto (i) que comprende un vector vírico que incluye un transgén (ii) y un compuesto que causa el "disparo" de las sinapsis nerviosas, para utilización secuencial, para suministrar dicho transgén a neuronas mediante inyección intramuscular o intracerebral y transporte retrógrado, siendo dicho compuesto una toxina botulínica.

Los compuestos y vectores según la presente invención pueden administrarse preferentemente mediante inyección intramuscular o intracerebral.

En el caso de una inyección intramuscular, la administración puede llevarse a cabo en los músculos de las extremidades superiores (bíceps, tríceps). Esto hace posible transferir un gen a las neuronas motoras a nivel cervical. La administración en los músculos del tórax (músculos pectorales) hace posible transferir un gen a las neuronas motoras a nivel torácico; la administración en los músculos de las extremidades inferiores (músculos gemelos) hace posible transferir un gen a las neuronas motoras a niveles lumbares y sacros. Pueden utilizarse, por supuesto, otros músculos para la administración a estas neuronas motoras, pudiendo constituir también un objetivo otras neuronas motoras.

Las neuronas seleccionadas pueden ser cualquier tipo de neuronas. En una forma de realización, estas neuronas son colinérgicas o dopaminérgicas, por ejemplo.

Muy preferentemente, el compuesto (o compuestos), el producto (o productos) y el vector (o vectores) se administran esencialmente en el mismo sitio o dentro del mismo tejido. Pueden utilizarse diversos protocolos para la administración, tales como la simultánea o secuencial, la única o repetida, etc, que puede ajustarse por el experto en la materia. Preferentemente, el compuesto que provoca el disparo de las sinapsis nerviosas es administrado antes que el vector, por ejemplo, entre 5 horas y 2 semanas antes que el vector, típicamente entre 1 día y una semana antes que el vector. Las dosis del compuesto y del vector pueden ajustarse por el experto en la materia, dependiendo de la vía de administración, tejido, vector, compuesto, etc.

Típicamente, se utilizan entre 10^{4}-10^{12} pfu del vector vírico, preferentemente entre 10^{5}-10^{10} pfu, e incluso más preferentemente entre 5x10^{5} y 5x10^{9} pfu aproximadamente.

El virus puede purificarse e inyectarse como una suspensión en cualquier composición apropiada o tampón, que comprende excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables (PBS, sales, solución isotónica, agentes estabilizantes, etc).

Los compuestos pueden inyectarse a varias dosis, y seleccionarse y/o ajustarse por el experto en la materia. La selección comprende la determinación de la dosis efectiva para producir el disparo sináptico sin provocar esencialmente toxicidad. Como ejemplo, la toxina botulínica puede inyectarse a dosis comprendidas entre 1-500 pg aproximadamente, preferentemente entre 10-300 pg, más preferentemente entre 10-150 pg, todavía, más preferentemente entre
10-100 pg.

Los compuestos se formulan preferentemente en una suspensión líquida, con soluciones isotónicas o excipientes, tal como se ha descrito anteriormente.

La inyección de los vectores génicos que se transportan retrógadamente, constituye un enfoque terapéutico que puede valorarse en diversas enfermedades neurológicas tal como epilepsia, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer, y también en accidentes musculares que impliquen daño neuronal. El suministro génico según la presente invención puede también utilizarse para investigación experimental, investigación clínica, diagnóstico u otros propósitos (estudios animales, etc).

Los ejemplos siguientes ilustran la presente solicitud.

Ejemplos 1. Materiales y métodos 1.1 Adenovirus recombinantes

Ad-N12PGK-luc contiene 12 secuencias NRSE con respecto al promotor de la fosfogliceratoquinasa (PGK) del ratón, para dirigir la expresión de la enzima luciferasa a las neuronas. Ad-RSV-\betagal contiene el largo promotor terminal de repetición (RSV-LTR) del virus del sarcoma de Rous y codifica una \beta-galactosidasa dirigida al núcleo mediante la señal de localización nuclear SV40 (Stratford-Perricaudet et al., 1992). Estos adenovirus recombinantes de primera generación se generaron mediante recombinación homóloga (Stratford-Perricaudet et al., 1992). Se prepararon los reservorios víricos en 293 células utilizando procedimientos estándares de amplificación. Los títulos víricos se midieron mediante densidad óptica y se evaluaron utilizando el procedimiento de ensayo en placa.

Ambos reservorios víricos presentaban un título de 1.10^{8} unidades formadoras de placa (pfu).\mul^{-1}.

1.2 Animales y procedimientos de inyección

Se proporcionaron ratones C57BL6 por parte de Charles River (Francia). Todos los animales se mantuvieron y trataron según las normas de la Comunidad Europea. Antes de las inyecciones intramusculares, se anestesiaron profundamente los ratones con Rompun (Bayer)/Quetamina(UVA). Se diluyeron dosis de 1,25 a 250 pg de BoNT de tipo A (Sigma), en 10 \mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se inyectaron en 4 sitios en la lengua de los animales en una proporción de 2,5 \mul.mn^{-1}. Los animales de control se inyectaron con PBS. Después de las inyecciones, los animales recibieron sedimentos alimenticios estándar machacados en agua, ad libitum. Una semana después del tratamiento con BoNT o PBS, se inyectaron a 9 ratones 10 pfu de Ad-N12PGK-luc, o AD-RSV-\betagal diluido en PBS, tal como se ha descrito anteriormente. Las inyecciones en los músculos tibial y gemelos se administraron mediante un procedimiento similar: 10 \mul de PBS que contenían 12,5 pg de BoNT se administraron en dos lugares en el músculo.

1.3 Medición de la actividad luciferásica

Se mataron ratones mediante una sobredosis de pentobarbital (Sanofi), 8 días después de la inyección de adenovirus. Se extrajeron los troncos encefálicos y las lenguas, se disociaron en tampón de lisis, evaluándose la actividad luciferásica utilizando un luminómetro LUMAT LB9501 (Berthold), tal como se ha descrito previamente (Millecamps et al, 1999). Los valores de la luciferasa se normalizaron de acuerdo con la cantidad de proteína en los extractos celulares determinada mediante el ensayo Bio-Rad (Laboratorios Bio-RAd).

1.4 Detección de la actividad \beta-galactosidasa

Una semana después de las inyecciones intralinguales de Ad-RSV-\betagal, se anestesiaron los ratones con pentobarbital y se perfundieron con PBS que contenía paraformaldehido al 4% (PFA). Se extrajeron los cerebros y las médulas espinales, se fijaron después durante 2 horas en solución PFA, se crioprotegieron en sacarosa al 30% durante la noche, se empaparon en Tejido Tek y se congelaron mediante inmersión en isopentano a 40ºC. Se realizaron cortes cerebrales transversales y longitudinales de la médula espinal (16 \mum) mediante un crióstato, y se incubaron durante 12 horas en PBS que contenía el substrato 5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-galactosidasa (X-Gal, 0,4 mg/ml, Appligene) con 4 mM ferricianida de potasio (Sigma), 4 mM ferrocianida de potasio (Merck) y 2 mM MgCl_{2} (Merck) para la detección de la actividad \beta-galactosidásica. Los cortes se enjuagaron entonces en PBS, se trataron con tinción de contraste rojo neutro y se montaron.

1.5 Contaje celular

Neuronas motoras positivas X-Gal se contaron en cada cuarto corte del núcleo hipogloso y de la médula espinal ventral. Se contaron las neuronas motoras teñidas con rojo neutro en el núcleo hipogloso en cada cuarto corte del tronco encefálico. Los valores en bruto se corrigieron según la fórmula de Abercombrie (Abercombrie, 1946).

2. Resultados 2.1 BoNT aumenta la expresión de la luciferasa del tronco encefálico después de la inyección intralingual de un vector adenovírico que codifica la luciferasa

Para comprobar si BoNT podría aumentar la transferencia génica en las neuronas motoras, se inyectaron varias concentraciones de BoNT en los músculos, una semana antes de la inoculación intramuscular de adenovirus. Se investigó la eficacia del transporte axónico retrógrado al soma de las neuronas motoras, midiendo la expresión de la luciferasa en el tronco cefálico de ratones tratados con BoNT. Para restringir la expresión del gen de la luciferasa a las neuronas motoras, se utilizó el promotor combinado NRSE-PGK (Ad-N12PGK-luc). Se utilizó un análisis bi-factorial de varianza (ANOVA) para analizar las diferencias en la actividad luciferásica según la dosis de BoNT y el sitio de expresión. La interacción entre los dos factores fue significativa (p=0,0001), indicando que el efecto del tratamiento con BoNT en la expresión de la luciferasa era distinta entre la lengua y el tronco cefálico. Se utilizó un ensayo Student para la comparación intergrupo (BoNT/PBS) de la actividad de la luciferasa en el tronco cefálico y en la lengua. En el tronco cefálico, la actividad luciferásica fue significativamente mayor en los ratones tratados con dosis de BoNT de entre 12,5 pg y 250 pg (la dosis más alta que se probó) que en los tratados con PBS (Fig 1).

Aumentó sorprendentemente con la dosis de BoNT (hasta 10 veces con 12,5 pg), hasta un máximo con 25 pg (hasta 30 veces). Con dosis de BoNT superiores a 125 pg, la expresión luciferásica fue menor. Al contrario que en esto, la actividad de la luciferasa en la lengua fue la misma para todas las concentraciones de BoNT en todos los grupos
(Fig 1).

Se investigó además si el aumento en la transferencia génica a las neuronas motoras se debió al disparo sináptico inducido por BoNT o a la presencia de la toxina en la lengua. La inyección simultánea con 25 pg de BoNT y 10^{9} pfu de Ad-N12-PGK-luc, no modificó el nivel de expresión transgénica en el tronco encefálico. La actividad luciferásica en los ratones tratados con BoNT/Ad-N12-PGK-luc fue similar a la de los animales tratados con PBS (1,97 rlu/\mug proteína contra 3,04 +/- 0,9 rlu/\mug proteína para el grupo tratado con PBS) y mucho menor que la de los ratones tratados con la toxina 8 días antes de la inoculación adenovírica (93,05 +/-3,62 rlu/ \mug proteína). El aumento inducido por BoNT en la expresión génica de las neuronas motoras, no es, por lo tanto, consecuencia de la presencia de BoNT, sino que se debe al disparo sináptico causado por la toxina.

2.2 BoNT aumenta el número de neuronas motoras transducidas en el núcleo hipogloso después de la inyección intralingual de un adenovirus que codifica \beta-galactosidasa

Para analizar el efecto de la preinyección de BoNT sobre el número de neuronas motoras transducidas en el tronco encefálico, 12,5 o 25 pg de BoNT se inyectaron en la lengua, 8 días antes de la inoculación con un adenovirus que expresaba una \beta-galactosidasa dirigida al núcleo bajo el control del promotor RSV. Una semana después de la inyección del adenovirus, se observó una intensa expresión de la \beta-galactosidasa en las neuronas motoras del núcleo hipogloso de los animales tratados con BoNT (Fig 2). El número de neuronas motoras transducidas fue significativamente más alto en el núcleo hipogloso de los ratones tratados con 25 pg de BoNT (10 veces), que en el de los ratones de control tratados con PBS (p=0,0001) (Tabla).

Los cortes de los núcleos hipoglosos de estos animales se tiñeron con rojo neutro y se contaron las neuronas motoras.

Los grupos tratados con BoNT-(2351.3+/-50.1) y con PBS (2332.8+/-59.7) presentaban números parecidos de neuronas motoras, lo que indicaba que el tratamiento con 25 pg de BoNT no fue tóxico para estas células. El número de células transducidas por 100 neuronas motoras en el núcleo hipogloso fue, por tanto, notablemente más alto en los ratones tratados con 25 pg de BoNT (40%)que en los tratados con PBS (4%).

Además, el nivel de la expresión transgénica en las neuronas motoras transducidas fue más alto en los animales tratados con BoTN:la expresión \beta-galactosidásica fue tan intensa que no sólo fue detectada en el núcleo de la neurona motora transducida, sino que también lo fue en el citoplasma y en los axones que forman la raíz del nervio hipogloso (figura 2).

2.3 El pretratamiento con BoNT aumenta la transferencia génica a las neuronas motoras, después de la inyección adenovírica en diversos grupos de músculos

Se ensayó si el pretratamiento con BoNT promovía la transducción de las neuronas motoras en otros grupos musculares. A los ratones se les inyectó en los músculos tibiales izquierdos y en los gemelos derechos con 12,5 pg de BoNT o con PBS, una semana antes de la inoculación de Ad-RSV-\betagal. Se evaluó la expresión de la \beta-galactosidasa en la médula espinal y en los niveles cervical y lumbar, respectivamente. Se observó la expresión intensa de la \beta-galactosidasa tanto en las neuronas motoras cervicales como lumbares en todos los animales pretratados con BoNT. Como en el núcleo hipogloso, también se detectó la tinción X-gal fuera del núcleo, en el soma y en las neuritas (Fig 3). Todas las células transducidas se localizaron en la médula espinal ventral ipsilateral al sitio de la inyección. El número promedio de neuronas motoras transducido fue de hasta 3,2 veces superior en la médula espinal lumbar y hasta 2,5 veces superior en la médula espinal cervical en los animales tratados con BoNT que en los animales tratados con PBS, después de la inyección en los músculos tibiales y gemelos, respectivamente.

1

La inyección de BoNT en la lengua antes de la inoculación de Ad-N12-PKG-luc en el mismo sitio de la inyección, dio lugar a un gran aumento en la actividad luciferásica del tronco cefálico. La expresión transgénica medida en el tronco cefálico fue más alta que la de la lengua, si se inyectaban más de 12,5 pg de BoNT antes de la administración de un vector adenovírico diseñado específicamente para expresar transgenes en neuronas. Se obtuvo un aumento significativo en la transducción de las neuronas motoras con dosis de BoNT de 12,5 y 25 pg (10 y 30 veces de aumento, respectivamente). Las concentraciones crecientes de BoNT no mejoraron posteriormente el nivel de la transducción de las neuronas motoras. En efecto, se observó incluso una expresión luciferásica ligeramente más baja con dosis de BoNT superiores a 25 pg, debido probablemente a la toxicidad sistémica de dosis altas de la toxina (250 pg corresponden a una LD_{50} doble del ratón, medida mediante inyección intraperitoneal).

De modo similar, la inyección de 25 pg de BoNT antes de la inoculación intralingual con Ad-RSV-\betagal dio lugar a un aumento de 10 veces en la transducción de las neuronas motoras. La invención indica que BoNT no sólo induce un aumento en el número de neuronas motoras transducidas, sino que da lugar asimismo a una expresión transgénica más intensa en el interior de estas neuronas motoras. En total, existió un aumento de 30 veces en la expresión de la luciferasa después de la inyección de Ad-N12PGK-luc debido al tratamiento con 25 pg de BoNT. Este aumento parece estar compuesto por un aumento de 10 veces en la tasa de transducción y de 3 veces en la expresión transgénica en cada neurona motora transducida. Estos hallazgos utilizando \beta-galactosidasa como marcador después del tratamiento con BoNT, están de acuerdo con los de la luciferasa.

El aumento inducido por BoNT en la transferencia génica no fue dependiente de la presencia simultánea de la toxina y del vector, pues no se observó un aumento en la transferencia génica de las neuronas motoras cuando el virus y la toxina se administraron juntos. BoNT induce el disparo de las placas terminales uniones neuromusculares, comenzando a los 6 días después de la inyección de la toxina en la lengua (Watson, 1969). La presente invención muestra que BoNT o factores neurotrópicos mejora la transferencia génica retrógrada, estimulando el disparo sináptico en las uniones neuromusculares.

En conclusión, la presente invención demuestra notablemente que la preinyección intramuscular de BoNT aumenta mucho la transferencia génica a las neuronas motoras, mediante inyección intramuscular de vectores adenovíricos. Este procedimiento es particularmente importante para una situación en la que el transporte axónico retrógrado de los vectores génicos constituye la única forma de proporcionar un número significativo de neuronas motoras con el factor terapéutico. Al contrario de los vectores que expresan proteínas que pueden ser secretadas y difusibles (como los factores de crecimiento), los vectores que expresan proteínas que no son secretables, como las antiapópticas, antioxidativas o tamponadas-cálcicas), pueden inyectarse en muchos sitios a lo largo del parénquima medular, para transducir un número significativo de neuronas motoras. El aspecto invasivo, y el riesgo de infección asociado con inyecciones que se llevan a cabo en muchos sitios en la médula espinal, limitan las aplicaciones clínicas de este procedimiento.

El transporte axónico retrógrado de los vectores génicos víricos supera estos problemas: las inyecciones intramusculares mucho menos invasivas permiten la producción de las proteínas terapéuticas en el interior de las neuronas motoras, aumentando la eficacia de este procedimiento de suministro génico utilizando agentes, como BoNT, por ejemplo, que estimula el proceso de "disparo" sináptico, es de gran valor terapéutico para ALS y otros MND. Esta estrategia puede utilizarse clínicamente, ya que esta toxina se utiliza ya con éxito como un tratamiento sin dolor para diversos trastornos neurológicos (Bentioglio y Albanese, 1999; Naumann et al, 1999) y con diversas finalidades dermatológicas (Odderson, 1998, Carruthers y Carruthers, 1998).

Claims (9)

1. Producto que comprende (i) un vector vírico que comprende un transgén y (ii) una toxina botulínica, particularmente la neurotoxina A botulínica, para la utilización simultánea o secuencial para suministrar dicho transgén a neuronas mediante inyección intramuscular o intracerebral y transporte retrógrado.

2. Producto según la reivindicación 1, en el que el vector vírico es un vector adenovírico.

3. Utilización de un producto según la reivindicación 1 ó 2, para la preparación de una composición farmacológicamente activa destinada al tratamiento del cuerpo humano en particular para el tratamiento de un trastorno neurológico tal como esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidentes o traumas musculares.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que la neurotoxina A botulínica se administra antes que el vector vírico.

5. Utilización según la reivindicación 3 ó 4, en la que el transgén codifica un factor de crecimiento, una citoquina, una linfoquina o un factor neurotrófico.

6. Utilización de una toxina botulínica, particularmente la neurotoxina A botulínica, en combinación con un vector que comprende un transgén, un polipéptido o un ácido nucleico, para la preparación de una composición farmacológicamente activa para el tratamiento de un trastorno neurológico tal como esclerosis lateral amiotrófica, epilepsia, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidentes o traumas musculares.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que el vector vírico es un vector adenovírico.

8. Utilización según la reivindicación 6 ó 7, en la que la neurotoxina A botulínica se administra antes que el vector, polipéptido o ácido nucleico.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que el transgén codifica o el polipéptido es un factor de crecimiento, una citoquina, una linfoquina o un factor neurotrófico.