ES2313894T3 - Diagnostico para la enfermedad de placas fragiles. - Google Patents

Diagnostico para la enfermedad de placas fragiles. Download PDF

Info

Publication number
ES2313894T3
ES2313894T3 ES00939389T ES00939389T ES2313894T3 ES 2313894 T3 ES2313894 T3 ES 2313894T3 ES 00939389 T ES00939389 T ES 00939389T ES 00939389 T ES00939389 T ES 00939389T ES 2313894 T3 ES2313894 T3 ES 2313894T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
allele
disease
disorder
gene
alleles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES00939389T
Other languages
English (en)
Inventor
Sheila E. Francis
David C. Crossman
Gordon W. Duff
Kenneth S. Kornman
Katherine Stephenson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Interleukin Genetics Inc
Original Assignee
Interleukin Genetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Interleukin Genetics Inc filed Critical Interleukin Genetics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2313894T3 publication Critical patent/ES2313894T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/912—Absidia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

Un método para determinar si un paciente tiene o está predispuesto a tener un trastorno de placas frágiles, comprendiendo el método: detectar en una muestra de ácido nucleico del paciente un alelo seleccionado entre el grupo consistente en un alelo de IL-1A (+4845) y un alelo de IL-1B (+3954), donde la detección de al menos un alelo 2 de IL-1B (+3954) o la determinación de que el sujeto es homocigoto para el alelo 2 de IL-1A (+4845) indica que el paciente tiene o está predispuesto a tener un trastorno de placas frágiles.

Description

Diagnóstico para la enfermedad de placas frágiles.
Campo técnico
La presente invención se refiere a métodos para el diagnóstico y tratamiento de trastornos cardiovasculares y, más específicamente, a métodos relacionados con el diagnóstico de trastornos asociados con patrones de genotipo de IL-1.
Antecedentes de la invención
La aterosclerosis (o arteriosclerosis) es el término usado para describir un estrechamiento progresivo de la luz y un endurecimiento de las arterias que puede producir un aneurisma, isquemia, trombosis, formación de embolia u otra insuficiencia vascular. La patología puede producirse en cualquier arteria sistémica del cuerpo humano. Por ejemplo, la aterosclerosis en las arterias que irrigan el cerebro (por ejemplo las carótidas, intracerebrales, etc.) puede ocasionar un ictus. Puede producirse gangrena cuando se bloquean las arterias periféricas, y se produce una arteriopatía coronaria cuando se ven afectadas las arterias que suministran oxígeno y nutrientes al miocardio.
La arteriopatía coronaria es una enfermedad multifactorial que tiene como resultado la deposición de placas ateromatosas y un estrechamiento progresivo de la luz de las arterias que irrigan el músculo cardiaco. El proceso de arterosclerosis implica cambios biológicos inducidos por lípidos en las paredes arteriales que tienen como resultado la alteración de mecanismos homeostáticos que mantienen la fase líquida del compartimento de la sangre separada de la pared del vaso. Como la respuesta normal a todas las lesiones es una inflamación, la lesión aterosclerótica muestra una respuesta inflamatoria crónica compleja, incluyendo infiltración de leucocitos mononucleares, proliferación y migración celular, reorganización de la matriz extracelular y neovascularización. De hecho, la placa ateromatosa consiste en una mezcla de células inflamatorias e inmunes, tejido fibroso y material graso tal como lípidos de baja densidad (LDL) y modificaciones de los mismos, y lipoproteína \alpha. El estrechamiento o bloqueo de la luz reduce la capacidad de suministrar oxígeno y nutrientes al músculo cardiaco, produciendo infarto de miocardio, angina, angina inestable y muerte isquémica repentina como fallo cardiaco. Aunque la obstrucción normalmente progresa lentamente, el suministro de sangre puede interrumpirse de forma repentina cuando una parte de la placa arterial acumulada se rompe y se coloca en algún sitio de la arteria bloqueándola temporalmente, o más habitualmente, cuando se produce trombosis dentro de la luz arterial. La ruptura de la tapa fibrosa que cubre una placa vulnerable es la causa más común de trombosis coronaria. Dependiendo del volumen del músculo distal al bloqueo durante dicho ataque puede morir una parte del tejido miocárdico, lo cual debilita el músculo cardiaco y a menudo conduce a la muerte del
individuo.
Durante muchos años, la medida más común de riesgo inminente de un "acontecimiento clínico" de cardiopatía, tal como un infarto de miocardio o muerte, era el bloqueo físico de las arterias coronarias, que se evaluaba por técnicas tales como angiografía. Durante la primera parte de los años 80, los estudios de DeWood y colaboradores (N. Engl. J. of Med. (1980) 303:1137-40) revelaron que los trombos oclusivos eran responsables de la mayoría de los casos de infarto de miocardio agudo. En ese momento, el concepto predominante era que el infarto de miocardio se producía por una obstrucción en un sitio de estenosis de alto grado. En 1988, Little et al. (Circulation (1988) 78:1157-66) demostraron que la mayoría de los infartos se producían por un bloqueo coronario que previamente había mostrado una estenosis de menos de 50% en una angiografía. Por lo tanto, la gravedad de la estenosis coronaria no predecía de forma precisa la localización de un bloqueo coronario posterior. Con estos estudios se hizo evidente la importancia de las placas ateroscleróticas vulnerables.
Ahora es evidente que la ruptura en el sito de una placa aterosclerótica vulnerable es la causa más frecuente de los síndromes coronarios agudos. Estas placas no producen estenosis de alto grado, pero pueden producir un síndrome coronario agudo tal como angina inestable, infarto de miocardio o muerte súbita. Actualmente no se dispone de ningún método que pueda identificar de forma fiable placas propensas a la ruptura. De hecho, el desarrollo de técnicas de formación de imágenes clínicamente útiles para identificar placas vulnerables es un área de investigación activa. Algunos de los métodos que se están usando para identificar estas placas incluyen, por ejemplo, termografía (las placas ateroscleróticas muestran heterogeneidad térmica), espectroscopía (usada para cuantificar la cantidad de colesterol, ésteres de colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y sales de calcio presentes en volúmenes pequeños del tejido arterial coronario), escintigrafía con radioisótopos (diversos constituyentes de placas vulnerables tales como células inflamatorias pueden plasmarse en imágenes con técnicas de radioisótopos) y detección de marcadores inflamatorios séricos tales como los niveles de proteína C reactiva.
Los sitios arteriales que muestran una ruptura de placas aguda se caracterizan por componentes inflamatorios crónicos que no se encuentra, o que se encuentran a niveles mucho menores, en placas arteriales que son estables y con poca probabilidad de producir acontecimientos clínicos (Ross R. The patogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993; 362:801-809.) (Libby P. Molecular basis of the acute coronary syndromes. Circulation 1995; 91:2844-2850). Los datos clínicos publicados actuales de muchas fuentes demuestran claramente que diversos componentes de la inflamación son fuertes influencias independientes de la gravedad y resultados clínicos de una arteriopatía coronaria (Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993; 362:801-809.) (Libby P. Molecular basis of the acute coronary syndromes. Circulation 1995; 91:2844-2850). Además, ciertos trabajos de laboratorio han demostrado que los mediadores proinflamatorios son elementos críticos en el proceso aterosclerótico (Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993; 362:801-809.) (Libby P. Molecular basis of the acute coronary syndromes. Circulation 1995; 91:2844-2850).
Las causas y mecanismos de la acumulación de placas ateromatosas no se entienden completamente, aunque existen muchas teorías. Una teoría sobre la patogénesis de la aterosclerosis implica las siguientes etapas: (1) disfunción y/o lesión de células endoteliales, (2) reclutamiento de monocitos y formación de macrófagos, (3) deposición y modificación de lípidos, (4) proliferación de células del músculo liso vascular y (5) síntesis de matriz extracelular. De acuerdo con esta teoría, la iniciación de la aterosclerosis se debe potencialmente a una forma de lesión, posiblemente por estrés mecánico o por estrés químico. La manera en la que responde el cuerpo a esta lesión después define si la lesión se deteriora hasta una lesión aterosclerótica y a cuanta velocidad lo hace. Esto, a su vez, puede ocasionar un estrechamiento de la luz arterial y lesiones en el tejido cardiaco que dependen del flujo de oxígeno y nutrientes por la sangre.
Durante muchos años, ciertos estudios epidemiológicos han indicado que la composición genética de un individuo es un factor de riesgo significativo para el desarrollo de una enfermedad vascular. Por ejemplo, una historia familiar de cardiopatía está asociada con un mayor riesgo individual de desarrollar una arteriopatía coronaria. El metabolismo de los lípidos y el colesterol se ha considerado históricamente la influencia genética principal sobre la arteriopatía coronaria. Por ejemplo, la deficiencia en receptores celulares de lípidos de baja densidad (LDL), tal como la que se produce en caso de hipercolesterolemia familiar, está asociada con altos niveles plasmáticos de LDL y un desarrollo prematuro de aterosclerosis (Brown & Goldstein, Sci., 191 (4223):150-4 (1976)).
La inflamación ahora se considera en general un componente importante del procesos patogénico de la aterosclerosis (Munro, Lab Invest., 58:249-261 (1988); Badimon, et al., Circulation, 87:3-16 (1993); Liuzzo, et al., N.E.J.M., 331(7):417-24 (1994); Alexander, N.E.J.M., 331(7):468-9 (1994)). Las lesiones en las células endoteliales que revisten los vasos conducen a una acumulación de citoquinas inflamatorias, incluyendo IL-1 y TNF\alpha, y la liberación de prostanoides y factores de crecimiento tales como prostaglandina I_{2} (PGI_{2}), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor estimulador de granulocitos-monocitos (GM-CSF). Estos factores conducen a una acumulación y regulación de células inflamatorias tales como monocitos, que se acumulan dentro de las paredes de los vasos. Los monocitos después liberan mediadores inflamatorios adicionales, incluyendo IL-1, TNF, prostaglandina E_{2} (PGE_{2}), bFGF y factores de crecimiento de transformación \alpha y \beta (TGF\alpha, TGF\beta). Todos estos mediadores inflamatorios reclutan más células inflamatorias en el área dañada, regulan el comportamiento de las células endoteliales y del músculo liso y conducen a la acumulación de placas
ateromatosas.
En lesiones ateroscleróticas o en el endotelio de arterias coronarias enfermas se han identificado varios productos inflamatorios, incluyendo IL-1\beta (Galea, et al., Ath. Thromb. Vasc. Biol., 16:1000-6 (1996)). Además, se ha descubierto que las concentraciones séricas de IL-1\beta son elevadas en pacientes con una enfermedad coronaria (Hasdai, et al., Heart, 76:24-8 (1996)). Aunque históricamente se creía que la presencia de agentes inflamatorios respondía a una lesión o activación de monocitos, también es posible que una respuesta inflamatoria anómala pueda ser la causante de la arteriopatía coronaria o crear una mayor susceptibilidad a la enfermedad.
Un problema clave en el tratamiento de las enfermedades vasculares es un diagnóstico apropiado. A menudo, el primer signo de la enfermedad es la muerte súbita. Por ejemplo, aproximadamente la mitad de los individuos que mueren por una arteriopatía coronaria mueren de manera repentina. Además, en 40-60% de los pacientes a los que se les ha diagnosticado finalmente una arteriopatía coronaria, la primera presentación de la enfermedad es un infarto de miocardio. Desafortunadamente, aproximadamente 40% de esos acontecimientos iniciales pasan desapercibidos por el paciente. Ahora se cree que la identificación y estabilización de placas vulnerables es un elemento importante en el tratamiento de la aterosclerosis coronaria. La identificación de los patrones de haplotipo en diversos sujetos permitiría el tratamiento de trastornos cardiovasculares y el tratamiento podría fijar como objetivo la estabilización de las placas en lugar de la revascularización y otros métodos más invasivos. Esto es especialmente importante porque, por diversas razones, la percepción de los síntomas por el paciente no se correlaciona bien con la carga total de arteriopatía coronaria (Anderson & Kin, Am. Heart J., 123(5):1312-23 (1992)).
Se usa angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) para tratar una arteriopatía coronaria obstructiva comprimiendo la placa ateromatosa en los lados de la pared del vaso. La PTCA se usa ampliamente con un índice de éxito inicial mayor de 90%. Sin embargo, el éxito a largo plazo de la PTCA está limitado por el reestrechamiento o reestenosis intraluminal en el sito del procedimiento. Esto se produce en los 6 meses siguientes al procedimiento en aproximadamente 30% a 40% de los pacientes que se han sometido a un procedimiento en un solo vaso y en más de 50% de los pacientes que se han sometido a una angioplastia en múltiples vasos.
La colocación de una endoprótesis vascular ha suplantado en gran medida a la angioplastia de globo porque puede restaurar más ampliamente las dimensiones intraluminales, lo cual tiene el efecto de reducir la reestenosis en aproximadamente 50%. Irónicamente, la colocación de una endoprótesis vascular realmente aumenta el crecimiento de la neoíntima en el sitio de tratamiento, pero debido a que puede conseguirse una luz de mayor tamaño con la colocación de una endoprótesis vascular, el crecimiento tisular se acomoda más fácilmente y se mantienen unas dimensiones suficientes en la luz, de forma que el índice de reestenosis se divide casi a la mitad por la colocación de una endoprótesis vascular en comparación con la angioplastia de globo sola.
Los mecanismos patofisiológicos implicados en la reestenosis no se entienden completamente. Aunque varios factores clínicos, anatómicos y técnicos se han asociado con el desarrollo de reestenosis, aún no se ha explicado al menos 50% del proceso. Sin embargo, se sabe que después de una lesión endotelial, se inicia una serie de mecanismos de reparación. A los pocos minutos de la lesión, se deposita una capa de plaquetas y fibrina sobre el endotelio dañado. En un periodo de horas a días, las células inflamatorias empiezan a infiltrarse en el área lesionada. En las 24 horas posteriores a una lesión, las células del músculo liso vascular (SMC) localizadas en el medio del vaso comienzan la síntesis de ADN. Unos pocos días después, estas SMC sintéticas activadas migran a través de la lámina elástica interna hacía la superficie luminal. Estas células forman una neoíntima por su replicación continuada y su producción de matriz extracelular. Se produce un aumento en el grosor de la íntima con una deposición de matriz en proliferación celular en curso. Cuando estos procesos de curación vascular progresan de manera excesiva, la situación patológica se denomina hiperplasia intimal o hiperplasia miointimial. La biología de la curación de la pared vascular implicada en la reestenosis, por lo tanto, incluye los procesos generales de la curación de heridas y los procesos específicos de la hiperplasia de la mioíntima. La inflamación generalmente se considera un componente importante en estos dos procesos. (Munro y Cotran (1993) Lab. Investig. 58:249-261; y Badimon et al. (1993), Supp II 87:3-6). De esta manera, la comprensión de los efectos de la inflamación aguda y crónica en la pared de los vasos sanguíneos puede sugerir métodos para el diagnóstico y tratamiento de la reestenosis y afecciones relacionadas.
En su fase inicial, la inflamación se caracteriza por la adherencia de leucocitos a la pared de los vasos. La adhesión de leucocitos a la superficie del endotelio dañado está mediada por varias glicoproteínas complejas presentes en las superficies del endotelio y de los neutrófilos. Dos de estas moléculas de unión están bien caracterizadas: la molécula de adhesión a leucocitos endoteliales-1 (ELAM-1) y la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1). Durante los estados inflamatorios, la unión de neutrófilos a las superficies de las células implicadas aumenta en gran medida, principalmente debido a la regulación positiva y mayor expresión de estas moléculas de unión. Las sustancias que se consideran mediadores principales de la respuesta inflamatoria a estas lesiones, incluyendo la interleuquina-1 (IL-1), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF), la linfotoxina y las endotoxinas bacterianas, aumentan la producción de estas sustancias de unión.
Después de la unión a la pared del vaso dañado, los leucocitos migran a su interior. Una vez en su sitio dentro de la pared del vaso, los leucocitos, en particular macrófagos activados, liberan mediadores inflamatorios adicionales incluyendo IL-1, TNF, prostaglandina E_{2} (PGE_{2}), bFGF y factores de crecimiento de transformación \alpha y \beta (TGF\alpha, TGF\beta). Todos estos mediadores inflamatorios reclutan más células inflamatorias en el área dañada y regulan la proliferación y migración adicional del músculo liso. Un factor de crecimiento bien conocido elaborado por los monocitos-macrófagos es el factor de crecimiento derivado de monocitos y macrófagos (MDGF), un estimulador de las células del músculo liso y de la proliferación de fibroblastos. Se entiende que el MDGF es similar al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); de hecho, las dos sustancias pueden ser idénticas. Por medio de la estimulación de la proliferación de células del músculo liso, la inflamación puede contribuir al desarrollo y progresión de la hiperplasia de la mioíntima.
Los leucocitos, atraídos a la pared del vaso por los mediadores químicos mencionados anteriormente de la inflamación, producen sustancias que tienen efectos directos sobre la pared de los vasos que pueden exacerbar la lesión local y prolongar la respuesta de curación. En primer lugar, los leucocitos activados por el proceso de inflamación secretan enzimas lisosomales que pueden digerir el colágeno y otras proteínas estructurales. La liberación de estas enzimas dentro de la pared de los vasos puede afectar a la integridad de su matriz extracelular, permitiendo a las SMC y otras células migratorias pasar a través de la pared con más facilidad. Por lo tanto, la liberación de estas proteasas lisosomales puede potenciar el proceso que conduce a una hiperplasia de la mioíntima. En segundo lugar, los leucocitos activados producen radicales libres por medio de la acción del sistema NADPH en sus membranas celulares. Estos radicales libres pueden dañar a los elementos celulares directamente, ocasionando una extensión de una lesión local o una prolongación del ciclo de lesión-inflamación-curación.
Sería deseable determinar los pacientes que responderían bien a tratamientos invasivos para una enfermedad vascular oclusiva tales como una angioplastia y la colocación de una endoprótesis vascular. Además sería deseable identificar a los pacientes que tienen un mayor riesgo de estenosis de forma que pudieran fijarse como objetivos para terapias apropiadas con el fin de prevenir, modular o invertir la afección. Además, sería deseable identificar a los individuos para los que la PTCA y la colocación de una endoprótesis vascular es una elección terapéutica subóptima debido al riesgo de reestenosis. Estos pacientes podrían convertirse en candidatos en etapas anteriores para procedimientos vasculares reconstructivos, posiblemente combinados con otras intervenciones farmacológicas.
Genética del agrupamiento de genes de la IL-1
El agrupamiento de genes de la IL-1 está en el brazo largo del cromosoma 2 (2q13) y contiene al menos los genes para la IL-1\alpha (IL-1A), IL-1\beta (IL-1B) y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1RN), dentro de una región de 430 Kb (Nicklin, et al. (1994) Genomics, 19: 382-4). Las moléculas agonistas, IL-1\alpha e IL-1\beta, tienen una potente actividad proinflamatoria y están en la cabeza de muchas cascadas inflamatorias. Sus acciones, a menudo a través de la inducción de otras citoquinas tales como IL-6 e IL-8, conducen a la activación y reclutamiento de leucocitos en tejidos dañados, la producción local de agentes vasoactivos, respuesta de fiebre en el cerebro y respuesta hepática en fase aguda. Las tres moléculas de IL-1 se unen a receptores de IL-1 de tipo I y de tipo II, pero sólo el receptor de tipo I transduce una señal al interior de la célula. Por el contrario, el receptor de tipo II se desprende de la membrana celular y actúa como un rece-
ptor cebo (decoy). El antagonista del receptor y el receptor de tipo II, por lo tanto, son antiinflamatorios en sus acciones.
Una producción inapropiada de IL-1 juega un papel importante en la patología de muchas enfermedades autoinmunes e inflamatorias, incluyendo artritis reumatoide, trastorno inflamatorio del intestino, psoriasis y similares. Además, hay diferencias interindividuales estables en los índices de producción de IL-1 y parte de esta variación puede justificarse por diferencias genéticas en los loci de los genes de IL-1. De esta manera, los genes de IL-1 son candidatos razonables para determinar parte de la susceptibilidad genética a enfermedades inflamatorias, teniendo la mayoría de ellas una etiología multifactorial con un componente poligénico.
Se sabe que ciertos alelos del agrupamiento de genes de la IL-1 están asociados con patologías particulares. Por ejemplo, se ha demostrado que el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) está asociado con la osteoporosis (Patente de Estados Unidos número 5.698.399), nefropatía en diabetes mellitus (Blakemore, et al. (1996) Hum. Genet. 97(3): 369-74), alopecia areata (Cork, et al., (1995) J. Invest. Dermatol. 104(5 Supp.): 15S-16S; Cork et al. (1996) Dermatol Clin 14: 671-8), enfermedad de Graves (Blakemore, et al. (1995) J. Clin Endocrinol. 80(1): 111-5), lupus eritematoso sistémico (Blakemore, et al. (1994) Arthritis Rheum. 37: 1380-85), lichen sclerosis (Clay, et al. (1994) Hum. Genet. 94: 407-10) y colitis ulcerosa (Mansfield, et al. (1994) Gastoenterol. 106(3): 637-42)).
Además, se ha descubierto que el alelo 2 de IL-1A del marcador -889 y el alelo 2 de IL-1B (TaqI) del marcador +3954 están asociados con la enfermedad periodontal (Patente de Estados Unidos número 5.686.246; Kornman y diGiovine (1998) Ann Periodon 3: 327-38; Hart y Kornman (1997) Periodontol 2000 14: 202-15; Newman (1997) Compend Contin Educ Dent 18: 881-4; Kornman et al. (1997) J. Clin Periodontol 24: 72-77). También se ha descubierto que el alelo 2 de IL-1A del marcador -889 está asociado con la artritis crónica juvenil, particularmente la iridociclitis crónica (McDowell, et al. (1995) Arthritis Rheum. 38: 221-28). También se ha descubierto que el alelo 2 de IL-1B (TaqI) del marcador +3954 de IL-1B está asociado con psoriasis y diabetes dependiente de insulina en pacientes DR3/4 (diGiovine, et al. (1995) Cytokine 7: 606; Pociot, et al. (1992) Eur J. Clin. Invest. 22: 396-402). Además, se ha descubierto que el alelo 1 de IL-1RN (VNTR) está asociado con la retinopatía diabética (véanse los documentos USSN 09/037472 y PCT/GB97/02790). Además, se ha descubierto que el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) está asociado con la colitis ulcerosa en poblaciones caucásicas de Norteamérica y Europa (Mansfield, J. et al., (1994) Gastroenterology 106: 637-42). De manera interesante, esta asociación es particularmente fuerte dentro de poblaciones de judíos asquenazíes relacionados étnicamente (documento PCT WO97/25445).
Exploración del genotipo
Los métodos tradicionales para la exploración de enfermedades heredables han dependido de la identificación de productos génicos anómalos (por ejemplo, anemia de células falciformes) o un fenotipo anómalo (por ejemplo, retraso mental). Estos métodos tienen una utilidad limitada para enfermedades heredables con un inicio tardío y fenotipos que no se pueden identificar fácilmente tales como, por ejemplo, enfermedad vascular. Con el desarrollo de una metodología de exploración genética sencilla e inexpresiva, ahora es posible identificar polimorfismos que indican una predisposición a desarrollar la enfermedad, aunque la enfermedad sea de origen poligénico. El número de enfermedades que pueden explorarse por métodos de biología molecular continúa creciendo al aumentar la comprensión de la base genética de los trastornos multifactoriales.
La exploración genética (también denominada genotipificación o exploración molecular) puede definirse en sentido amplio como el ensayo para determinar si un paciente tiene mutaciones (o alelos o polimorfismos) que producen una patología o están "asociados" con la mutación que produce una patología. La asociación se refiere al fenómeno en el que secuencias de ADN que están próximas entre si en el genoma tienen una tendencia a heredarse conjuntamente. Dos secuencias pueden estar asociadas debido a alguna ventaja selectiva de la herencia conjunta. Más típicamente, sin embargo, dos secuencias polimórficas se heredan conjuntamente debido a la infrecuencia relativa con la cual se producen acontecimientos de recombinación meiótica dentro de la región entre los dos polimorfismos. Se dice que los alelos polimórficos heredados conjuntamente están en un desequilibrio de ligamiento entre sí porque, en una población humana dada, tienden a aparecer juntos o no aparecen en absoluto en cualquier miembro particular de la población. De hecho, cuando se descubre que múltiples polimorfismos en una región cromosómica dada están en desequilibrio de ligamiento entre sí, definen un "haplotipo" genético o cuasiestable. Por el contrario, los acontecimientos de recombinación que se producen entre dos loci polimórficos hace que se separen en cromosomas homólogos distintos. Si se produce con una suficiente frecuencia una recombinación meiótica entre dos polimorfismos ligados físicamente, parecerá que los dos polimorfismos se segregan independientemente y se dice que están en un equilibrio de ligamiento.
Cuando la frecuencia de recombinación meiótica entre dos marcadores es generalmente proporcional a la distancia física entre ellos en el cromosoma, la aparición de "manchas calientes" así como de regiones de recombinación cromosómica reprimida puede ocasionar discrepancias entre la distancia física y recombinatoria entre dos marcadores. De esta manera, en ciertas regiones cromosómicas, múltiples loci polimórficos que abarcan un dominio cromosómico amplio pueden estar en desequilibrio de ligamiento entre sí y de esta manera definir un haplotipo genético de extensión amplia. Además, cuando se encuentra una mutación causante de una enfermedad dentro o en asociación con este haplotipo, uno o más alelos polimórficos del haplotipo pueden usarse como indicador de diagnóstico o pronóstico de la probabilidad de desarrollar la enfermedad. Esta asociación entre polimorfismos de otra forma benignos y un polimorfismo causante de una enfermedad tiene lugar si la mutación de la enfermedad apareció en el pasado reciente, de forma que no ha transcurrido un tiempo suficiente para conseguir el equilibrio a través de acontecimientos de recombinación. Por lo tanto, la identificación de un haplotipo humano que abarca o está ligado a un cambio mutacional causante de una enfermedad sirve como medida predictiva de la probabilidad de un individuo de haber heredado esa mutación causante de la enfermedad. De forma importante, estos procedimientos de pronóstico o diagnóstico pueden utilizarse sin necesitar la identificación y aislamiento de la lesión real causante de la enfermedad. Esto es significativo porque la determinación precisa del defecto molecular implicado en un proceso de enfermedad puede ser difícil y laboriosa, especialmente en el caso de enfermedades multifactoriales tales como trastornos inflamatorios.
De hecho, la correlación estadística entre un trastorno inflamatorio y un polimorfismo de IL-1 no necesariamente indica que el polimorfismo produce directamente el trastorno. En su lugar, el polimorfismo correlacionado puede ser una variante alélica benigna que está ligada (es decir, en desequilibrio de ligamiento) con una mutación causante de un trastorno que ha aparecido en el pasado evolutivo humano reciente, de forma que no ha transcurrido suficiente tiempo para conseguir el equilibrio por medio de acontecimientos de recombinación en el segmento cromosómico intermedio. De esta manera, para los fines de los ensayos de diagnóstico y pronóstico para una enfermedad particular, puede utilizarse la detección de un alelo polimórfico asociado con esa enfermedad sin consideración de si el polimorfismo está implicado directamente en la etiología de la enfermedad. Además, cuando un locus polimórfico benigno dado está en desequilibrio de ligamiento con un locus polimórfico causante de una enfermedad aparente, también es probable que otros loci polimórficos que están en desequilibrio de ligamiento con el locus polimórfico benigno estén en desequilibrio de ligamiento con el locus polimórfico causante de la enfermedad. De esta manera, estos otros loci polimórficos también serán de utilidad en el pronóstico o diagnóstico de la probabilidad de haber heredado el locus polimórfico causante de la enfermedad. De hecho, un haplotipo humano de extensión amplia (que describe el patrón típico de herencia conjunta de alelos de una serie de marcadores polimórficos ligados) puede fijarse como diana para fines de diagnóstico una vez que se ha determinado una asociación entre una enfermedad o afección particular y un haplotipo humano correspondiente. De esta manera, la determinación de la probabilidad de un individuo de desarrollar una enfermedad o afección particular puede realizarse caracterizando uno o más alelos polimórficos asociados con la enfermedad (o incluso uno o más haplotipos asociados con la enfermedad) sin determinar o caracterizar necesariamente la variación genética causante.
Compendio de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona nuevos métodos para determinar si un sujeto tiene un trastorno de placas frágiles. El diagnóstico de la presencia de un trastorno de placas frágiles identifica a los pacientes predispuestos al desarrollo de la enfermedad de placas frágiles, caracterizados por acontecimientos clínicos tales como infarto de miocardio e ictus. El diagnóstico de estos individuos predispuestos al desarrollo de la enfermedad de placas frágiles es especialmente importante porque el inicio de la enfermedad puede ser repentino y catastrófico, sin signos y síntomas premonitorios. La determinación de los pacientes que están en riesgo de desarrollar la enfermedad porque tienen el trastorno de esta manera abre la posibilidad de diagnosticar de forma prematura las afecciones y tratar el trastorno y la enfermedad por medio de agentes terapéuticos apropiados.
Estas y otras realizaciones de la presente invención se basan al menos en parte en el nuevo descubrimiento de que existe una asociación de patrones de alelos en cuatro loci polimórficos en el agrupamiento de genes de IL-1 con trastornos cardiovasculares. Estos patrones se denominan en la presente memoria patrones 1, 2 y 3. El patrón 1 comprende un patrón alélico que incluye el alelo 2 de IL-1A (+4845) o IL-1B (+3954) y el alelo 1 de IL-1B (-511) o IL-1RN (+2018), o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. En una realización preferida, este patrón alélico permite el diagnóstico de un trastorno de placas frágiles. El patrón 2 comprende un patrón alélico que incluye el alelo 2 de IL-1B (-511) o IL-1RN (+2018) y el alelo 1 de IL-1A (+4845) o IL-1B (+3954), o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. Este patrón alélico permite el diagnóstico de un trastorno vascular oclusivo. El patrón 3 comprende un patrón alélico que incluye el alelo 1 de IL-1A (+4845) o el alelo 1 de IL-1B (+3954), y el alelo 1 de IL-1B (-511) o el alelo 1 de IL-1RN (+2018), o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. Este patrón alélico permite el diagnóstico de un trastorno de reestenosis.
Un alelo asociado con un trastorno cardiovascular puede detectarse por cualquiera de una diversidad de técnicas disponibles, incluyendo: 1) realizar una reacción de hibridación entre una muestra de ácido nucleico y una sonda que es capaz de hibridar con el alelo; 2) secuenciar al menos una parte del alelo; o 3) determinar la movilidad electroforética del alelo o fragmentos del mismo (por ejemplo, fragmentos generados por digestión con endonucleasa). El alelo puede someterse opcionalmente a una etapa de amplificación antes de realizar la etapa de detección. Los métodos de amplificación preferidos se seleccionan entre el grupo consistente en: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación con desplazamiento de cadena (SDA), clonación y variaciones de los anteriores (por ejemplo, RT-PCR y amplificación con especificidad de alelo). Los oligonucleótidos necesarios para la amplificación pueden seleccionarse, por ejemplo, de dentro del loci de genes de IL-1, que flanquean el marcador de interés (como se requiere para la amplificación por PCR) o que solapan directamente con el marcador (como ocurre en la hibridación de ASO). En una realización particularmente preferida, la muestra se hibrida con una serie de cebadores, que hibridan en posición 5' y 3' en una secuencia con sentido o antisentido con el alelo asociado con la enfermedad vascular, y se somete a una amplificación por PCR.
Un alelo asociado con un trastorno cardiovascular también puede detectarse indirectamente, por ejemplo, analizando el producto proteico codificado por el ADN. Por ejemplo, cuando el marcador en cuestión tiene como resultado la traducción de una proteína mutante, la proteína puede detectarse por cualquiera de una diversidad de métodos de detección de proteínas. Estos métodos incluyen inmunodetección y ensayos bioquímicos, tales como fraccionamiento por tamaños, donde la proteína tiene un cambio en el peso molecular aparente por medio de truncamiento, elongación, plegamiento alterado o modificaciones postraduccionales alteradas.
También se describen kits para realizar los ensayos descritos anteriormente. El kit puede incluir un medio de recogida de muestras de ácido nucleico y un medio para determinar si un sujeto lleva un alelo asociado con un trastorno cardiovascular. El kit también puede contener una muestra de control positiva o negativa o un patrón y/o un dispositivo algorítmico para evaluar los resultados y reactivos y componentes adicionales incluyendo: reactivos de amplificación de ADN, ADN polimerasa, reactivos de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, tampones, un dispositivo de muestreo de ácidos nucleicos, dispositivo de purificación de ADN, desoxinucleótidos, oligonucleótidos (por ejemplo, sondas y cebadores) etc.
Como se ha descrito anteriormente, las muestras de control pueden ser controles positivos o negativos. Además, la muestra de control puede contener los productos positivos (o negativos) de la técnica de detección de alelos empleada. Por ejemplo, cuando la técnica de detección de alelos es amplificación por PCR, seguido por fraccionamiento por tamaños, la muestra de control puede comprender fragmentos de ADN del tamaño apropiado. De forma similar, cuando la técnica de detección de alelos implica la detección de una proteína mutada, la muestra de control puede comprender una muestra de proteína mutada. Sin embargo, se prefiere que la muestra de control comprenda el material a ensayar. Por ejemplo, los controles pueden ser una muestra de ADN genómico o una parte clonada del agrupamiento de genes de IL-1. Preferiblemente, sin embargo, la muestra de control es una muestra muy purificada de ADN genómico donde la muestra a ensayar es ADN genómico.
Los oligonucleótidos presentes en dicho kit pueden usarse para la amplificación de la región de interés o para una hibridación directa de oligonucleótidos con especificidad de alelo (ASO) con los marcadores en cuestión. De esta manera, los oligonucleótidos pueden flanquear el marcador de interés (cuando se requiera para la amplificación por PCR) o solapar directamente con el marcador (como ocurre en la hibridación de ASO).
La información obtenida usando los ensayos y kits descritos en la presente memoria (sola o junto con la información sobre un factor de riesgo, tal como una enfermedad concurrente, un defecto genético o un factor ambiental que contribuya a un trastorno vascular) es útil para determinar si un sujeto sin síntomas tiene un trastorno cardiovascular o tiene probabilidad de desarrollar una enfermedad cardiovascular. Además, la información puede permitir una estrategia más personalizada y puede permitir determinar si el curso de la acción implicaría el uso de procedimientos más invasivos o si el tratamiento debería fijarse como objetivo en la estabilización de placas. Esta información puede permitir a un médico recetar de forma más eficaz una terapia que trate la base molecular o genética del trastorno.
También se describen métodos para tratar o prevenir el desarrollo de un trastorno cardiovascular en un sujeto por medio de la administración al sujeto de un agente terapéutico apropiado, como en ensayos in vitro o in vivo para explorar compuestos de ensayo para identificar agentes terapéuticos para tratar o prevenir un trastorno cardiovascular. El ensayo puede comprender poner en contacto una célula transfectada con una mutación causante que está unida operativamente a un promotor apropiado con un compuesto de ensayo y determinar el nivel de expresión de una proteína en la célula en presencia y en ausencia del compuesto de ensayo. La mutación causante puede afectar a los niveles sistémicos de antagonista del receptor de IL-1 y puede estar asociada con un aumento de los niveles séricos de IL-1RA, de forma que la eficacia terapéutica de un compuesto particular pueda medirse por si los niveles séricos de IL-1RA se reducen en su presencia. Si la mutación causante del trastorno cardiovascular produce una mayor producción de IL-1\alpha o IL-1\beta y una menor producción de IL-1\alpha o IL-1\beta en presencia del compuesto de ensayo, indica que el compuesto es un antagonista de la actividad de IL-1\alpha o IL-1\beta. También se describen animales transgénicos no humanos y su uso en la identificación de antagonistas de la actividad de IL-1\alpha o IL-1\beta o agonistas de la actividad de IL-1RA.
Otras características y ventajas de la invención se presentan en la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa esquemáticamente una posición de genes en el cromosoma 2.
La figura 2 muestra una tabla de valores de desequilibrio dentro del agrupamiento de genes de IL-1.
La figura 3 presenta un gráfico de barras que muestra las frecuencias de patrones de haplotipo.
La figura 4 presenta una representación esquemática de los alelos en el patrón 2 de genotipo de IL-1 y ciertas de sus correlaciones clínicas.
La figura 5 muestra características de un ensayo clínico relacionado con marcadores genéticos.
La figura 6 presenta un gráfico de barras de la asociación entre un genotipo de IL-1 y estenosis en arterias coronarias.
La figura 7 presenta un gráfico de barras que muestra asociaciones entre patrones de genotipo de IL-1 y reestenosis.
La figura 8 presenta un gráfico de barras que muestra asociaciones entre patrones alélicos homocigotos y heterocigotos en el locus de IL-1RN (+2018) y reestenosis y revascularización de vasos diana (TVR).
La figura 9 presenta un diagrama de proceso esquemático de las relaciones entre los niveles de colesterol, los patrones de IL-1 y acontecimientos clínicos.
La figura 10 presenta un gráfico de barras que muestra la relación entre polimorfismos de IL-1 y el riesgo de acontecimientos clínicos de tipo de placas frágiles con diferentes niveles de colesterol total.
La figura 11 presenta una representación esquemática de los alelos en el patrón 1 del genotipo de IL-1 y ciertas de sus correlaciones clínicas.
La figura 12 muestra un gráfico de barras que relaciona el patrón 2 del genotipo de IL-1 con los niveles de Lp(a).
La figura 13 muestra un gráfico de barras que relaciona el patrón 2 del genotipo de IL-1 con los niveles de LDL.
La figura 14 muestra un gráfico de barras que ilustra las relaciones entre los genotipos de IL-1 y los niveles de proteína C reactiva.
Descripción detallada de la invención 4.1 Definiciones
Por conveniencia, a continuación se proporciona el significado de ciertos términos y frases empleadas en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.
La expresión "actividad aberrante", cuando se aplica a la actividad de un polipéptido tal como IL-1, se refiere a una actividad que difiere de la actividad de un polipéptido nativo o que difiere de la actividad del polipéptido en un sujeto sano. Una actividad de un polipéptido puede ser aberrante porque es más fuerte que la actividad de su homólogo nativo. Como alternativa, una actividad puede ser aberrante porque es más débil o está ausente con respecto a la actividad de su homólogo nativo. Una actividad aberrante también puede ser un cambio en una actividad. Por ejemplo, un polipéptido aberrante puede interaccionar con un péptido diana diferente. Una célula puede tener una actividad de IL-1 aberrante debido a la sobreexpresión o infraexpresión de un gen de locus de IL-1 que codifica un polipéptido de locus de IL-1.
El término "alelo" se refiere a las diferentes variantes de secuencia encontradas en diferentes regiones polimórficas. Por ejemplo, IL-1RN (VNTR) tiene al menos cinco alelos diferentes. Las variantes de secuencia pueden ser cambios de bases individuales o múltiples, incluyendo sin limitación inserciones, deleciones o sustituciones, o pueden ser un número variable de repeticiones de secuencia.
La expresión "patrón alélico" se refiere a la identidad de un alelo o alelos en una o más regiones polimórficas. Por ejemplo, un patrón alélico puede consistir en un solo alelo en un sitio polimórfico, como ocurre en el alelo 1 de IL-1RN (VNTR), que es un patrón alélico que tiene al menos una copia del alelo 1 de IL-1RN en el VNTR de los loci del gen de IL-1RN. Como alternativa, un patrón alélico puede consistir en un estado homocigoto o heterocigoto en un solo sitio polimórfico. Por ejemplo, el alelo 2,2 de IL-1RN (VNTR) es un patrón alélico en el que hay dos copias del segundo alelo en el marcador de VNTR de IL-1RN y que corresponde al estado del alelo 2 de IL-RN (VNTR) homocigoto. Como alternativa, un patrón alélico puede consistir en la identidad de alelos en más de un sitio polimórfico.
El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a un agente de unión que incluye un anticuerpo entero o un fragmento de unión del mismo que es reactivo específicamente con un polipéptido IL-1B. Los anticuerpos pueden fragmentarse usando técnicas convencionales y los fragmentos pueden explorarse para determinar los de utilidad de la misma manera que se ha descrito anteriormente en el caso de los anticuerpos enteros. Por ejemplo, pueden generarse fragmentos F(ab)_{2} por tratamiento de un anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)_{2} resultante puede tratarse para reducir enlaces disulfuro para producir fragmentos Fab. Se entiende que el anticuerpo de la presente invención incluye además moléculas biespecíficas, monocaternarias, quiméricas y humanizadas que tienen afinidad por un polipéptido IL-1B conferida por al menos una región CDR del anticuerpo.
"Actividad biológica" o "bioactividad" o "actividad" o "función biológica", que se usan indistintamente para los fines de la presente memoria, cuando se aplican a IL-1 significan una función efectora o antigénica que se realiza de forma directa o indirecta por un polipéptido IL-1 (tanto si está en su estado nativo como si está en su conformación desnaturalizada) o por cualquier subsecuencia (fragmento) del mismo. Una actividad biológica puede incluir la unión, la realización de la transducción de señales desde un receptor, la modulación de la expresión génica o una función efectora antigénica.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "fragmento bioactivo de un polipéptido IL-1" se refiere a un fragmento de un polipéptido IL-1 de longitud entera, donde el fragmento imita específicamente o antagoniza la actividad de un polipéptido IL-1 de tipo silvestre. El fragmento bioactivo preferiblemente es un fragmento capaz de interaccionar con un receptor de interleuquina.
"Células", "células hospedadoras" o "células hospedadoras recombinantes" son expresiones que se usan indistintamente en la presente memoria para hacer referencia no sólo a la célula objeto particular, sino también a la descendencia o posible descendencia de dicha célula. Como en generaciones sucesivas pueden producirse ciertas modificaciones debido a influencias mutacionales o ambientales, dicha descendencia, efectivamente, puede no ser idéntica a la célula parental, pero se incluye dentro del alcance de la expresión como se usa en la presente memoria.
Una "quimera", "mosaico", "mamífero quimérico" y similares se refiere a un mamífero transgénico con una construcción knock-out o knock-in en al menos algunas de sus células que contienen el genoma.
Las expresiones "control" o "muestra de control" se refieren a cualquier muestra apropiada para la técnica de detección empleada. La muestra de control puede contener los productos de la técnica de detección de alelos empleada o el material a ensayar. Además, los controles pueden ser controles positivos o negativos. A modo de ejemplo, cuando la técnica de detección de alelos es amplificación por PCR, seguida de fraccionación por tamaños, la muestra de control puede comprender fragmentos de ADN de un tamaño apropiado. De forma similar, cuando la técnica de detección de alelos implica la detección de una proteína mutada, la muestra de control puede comprender una muestra de una proteína mutante. Sin embargo, se prefiere que la muestra de control comprenda el material a ensayar. Por ejemplo, los controles pueden ser una muestra de ADN genómico o una parte clonada del agrupamiento de genes de IL-1. Sin embargo, cuando la muestra a ensayar es ADN genómico, la muestra de control preferiblemente es una muestra muy purificada de ADN genómico.
Una "enfermedad cardiovascular" es un trastorno cardiovascular, como se define en la presente memoria, caracterizado por acontecimientos clínicos que incluyen síntomas clínicos y signos clínicos. Los síntomas clínicos son las experiencias notificadas por un paciente que indican al médico la presencia de una patología. Los signos clínicos son los descubrimientos objetivos en un examen físico o de laboratorio que indican al médico la presencia de una patología. "Enfermedad cardiovascular" incluye tanto "arteriopatía coronaria" como "enfermedad vascular periférica", definiéndose ambos términos más adelante. Los síntomas clínicos de la enfermedad cardiovascular incluyen dolor torácico, falta de aliento, debilidad, síncopes, alteraciones en la consciencia, dolor de extremidades, disnea nocturna paroxismal, ataques isquémicos transitorios y otros fenómenos experimentados por el paciente. Los signos clínicos de la enfermedad cardiovascular incluyen hallazgos tales como anomalías en el EKG, pulsos periféricos alterados, murmullos arteriales, sonidos cardiacos anómalos, estertores y sibilancias, distensión venosa yugular, alteraciones neurológicas y otros descubrimientos observados por el médico. Los síntomas y signos clínicos pueden combinarse en una enfermedad cardiovascular tal como un infarto de miocardio (MI) o un ictus (también denominado "accidente cerebrovascular" o "CVA"), donde el paciente notificará ciertos fenómenos (síntomas) y el médico percibirá otros fenómenos (signos) indicativos de una patología subyacente. "Enfermedad cardiovascular" incluye las enfermedades relacionadas con los trastornos cardiovasculares de trastorno de placas frágiles, trastorno oclusivo y estenosis. Por ejemplo, una enfermedad cardiovascular resultante de un trastorno de placas frágiles, como se define dicho término más adelante, puede denominarse una "enfermedad de placas frágiles". Los acontecimientos clínicos asociados con la enfermedad de placas frágiles incluyen los signos y síntomas donde son marcas características la ruptura de una placa frágil con una trombosis aguda posterior o con una embolización distal. Los ejemplos de enfermedad de placas frágiles incluyen ciertos ictus e infartos de miocardio. Como otro ejemplo, una enfermedad cardiovascular resultante de un trastorno oclusivo puede denominarse "enfermedad oclusiva". Los acontecimientos clínicos asociados con la enfermedad oclusiva incluyen los signos y síntomas donde la oclusión progresiva de una arteria afecta a la cantidad de circulación que llega a un tejido diana. La oclusión arterial progresiva puede producir isquemia progresiva que finalmente puede progresar hasta la muerte de un tejido si la cantidad de circulación es insuficiente para mantener los tejidos. Los signos y síntomas de enfermedad oclusiva incluyen claudicación, dolor en reposo, angina y gangrena, así como hallazgos físicos y de laboratorio indicativos de estenosis de vasos y reducción de la perfusión distal. Como otro ejemplo, una enfermedad cardiovascular resultante de una reestenosis puede denominarse estenosis asociada con una endoprótesis vascular. La estenosis asociada con una endoprótesis vascular incluye los signos y síntomas resultantes del bloqueo progresivo de una endoprótesis arterial que se ha colocado como parte de un procedimiento tal como una angioplastia transluminal percutánea, donde la presencia de la endoprótesis vascular pretende ayudar a mantener el vaso en su configuración recién expandida. Los acontecimientos clínicos que acompañan a la estenosis asociada con una endoprótesis vascular son los atribuibles a la reestenosis de una arteria reconstruida.
Un "trastorno cardiovascular" se refiere, en sentido amplio, tanto a trastornos de arterias coronarias como a trastornos de arterias periféricas. La expresión "trastorno cardiovascular" puede aplicarse a cualquier anomalía de una arteria, ya sea estructural, histológica, bioquímica o cualquier otra anomalía. Esta expresión incluye los trastornos caracterizados por placas frágiles (denominados en la presente memoria "trastornos de placas frágiles"), los trastornos caracterizados por vaso-oclusión (denominados en la presente memoria "trastornos oclusivos") y los trastornos caracterizados por reestenosis. Un "trastorno cardiovascular" puede producirse en una arteria de forma primaria, es decir, antes de cualquier intervención médica o quirúrgica. Los trastornos cardiovasculares primarios incluyen, entre otros, aterosclerosis, oclusión arterial, formación de aneurismas y trombosis. Un "trastorno cardiovascular" puede aparecer en una arteria de forma secundaria, es decir, después de una intervención médica o quirúrgica. Los trastornos cardiovasculares secundarios incluyen, entre otros, formación de aneurismas postraumáticos, reestenosis y oclusión de injertos postoperatoria.
Una "mutación funcional causante de un trastorno cardiovascular" se refiere a una mutación que produce o contribuye al desarrollo de un trastorno cardiovascular en un sujeto. Las mutaciones preferidas se producen dentro del complejo de IL-1. Una mutación funcional causante de un trastorno cardiovascular que se produce dentro de un gen de IL-1 (por ejemplo IL-1A, IL-1B o IL-1RN) o un locus del gen, que está ligada al mismo, puede alterar, por ejemplo, la fase de lectura abierta o el patrón de corte y empalme del gen, dando como resultado de esta manera la formación de un producto génico inactivo o hipoactivo. Por ejemplo, una mutación que se produce en el intrón 6 del locus de IL-1A corresponde a un número variable de secuencias de 46 pb de repetición en tándem correspondientes a una cantidad de cinco a 18 unidades repetidas (Bailly, et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 1240-45). Estas secuencias repetidas contienen tres sitios de unión potenciales a factores de transcripción: un sitio SP1, un elemento potenciador viral y un elemento de respuesta a glucocorticoides; por lo tanto, los individuos que llevan alelos de VNTR del intrón 6 de IL-1A con un gran número de unidades repetidas pueden ser objeto de una regulación alterada de la transcripción del gen de IL-1A y de posteriores alteraciones de la producción de citoquinas inflamatorias. De hecho, hay indicios de que un mayor número de repeticiones en este locus de IL-1A polimórfico conduce una reducción de la síntesis de IL-1\alpha (Bailly, et al. (1996) Mol. Immunol. 33: 999-1006). Como alternativa, una mutación puede producir un producto génico hiperactivo. Por ejemplo, el alelo 2 del polimorfismo de IL-1B (G en +6912) aparece en la UTR (región no traducida) 3' del ARNm de IL-1B y está asociado con un aumento de aproximadamente cuatro veces en los niveles de estado estacionario tanto del ARNm de IL-1B como de la proteína IL-1B en comparación con los niveles asociados con el alelo 1 del gen de IL-1B en +6912). Además, existe una mutación de IL-1B (-511) cerca de un sitio de unión al promotor para un elemento de respuesta a glucocorticoides negativo (Zhang et al. (1997) DNA Cell Biol 16: 145-52). Este elemento potencia una represión de cuatro veces de la expresión de IL-1B por dexametasona y una deleción de estos elementos de respuesta negativos produce un aumento de 2,5 veces en la actividad del promotor de IL-1B. De esta manera, el polimorfismo de IL-1B (-511) puede afectar directamente a la producción de citoquinas y a las respuestas inflamatorias. Estos ejemplos demuestran que ciertas variantes genéticas que se producen en el gen de IL-1A o IL-1B pueden conducir directamente a una alteración de la producción o regulación de la actividad de la citoquina IL-1.
Un "agente terapéutico para un trastorno cardiovascular" se refiere a cualquier agente o régimen terapéutico (incluyendo medios farmacéuticos, nutracéuticos y quirúrgicos) que previene o pospone el desarrollo o reduce el grado de una anomalía constitutiva de un trastorno cardiovascular en un sujeto. Los agentes terapéuticos para los trastornos cardiovasculares pueden dirigirse al tratamiento de cualquier trastorno cardiovascular, incluyendo el trastorno de placas frágiles, trastornos oclusivos y reestenosis. En la presente memoria se proporcionan ejemplos de agentes terapéuticos dirigidos a cada categoría de trastorno cardiovascular. Se entiende que un agente terapéutico puede ser útil para más de una categoría de trastorno cardiovascular. El agente terapéutico puede ser un polipéptido, peptidomimético, ácido nucleico u otra molécula orgánica o inorgánica, preferiblemente una "molécula pequeña" incluyendo vitaminas, minerales y otros nutrientes. Preferiblemente, el agente terapéutico puede modular al menos una actividad de un polipéptido IL-1, por ejemplo, la interacción con un receptor, imitando o potenciando (agonizando) o inhibiendo (antagonizando) los efectos de un polipéptido natural. Un agonista de IL-1 puede ser una proteína de tipo silvestre o un derivado de la misma que tiene al menos una bioactividad del tipo silvestre, por ejemplo, actividad de unión a un receptor. Un agonista de IL-1 también puede ser un compuesto que regula positivamente la expresión de un gen o que aumenta al menos una bioactividad de una proteína. Un agonista de IL-1 también puede ser un compuesto que aumenta la interacción de un polipéptido con otra molécula, por ejemplo un receptor. Un antagonista de IL-1 puede ser un compuesto que inhibe o reduce la interacción entre una proteína y otra molécula, por ejemplo un receptor o un agente que bloquea la transducción de señales o el procesamiento postraduccional (por ejemplo, un inhibidor de la enzima convertidora de IL-1 (ICE)). Por consiguiente, un agonista preferido es un compuesto que inhibe o reduce la unión a un receptor y de esta manera bloquea la activación posterior del receptor. Un antagonista de IL-1 también puede ser un compuesto que regula negativamente la expresión de un gen o que reduce la cantidad de una proteína presente. El antagonista puede ser una forma dominante negativa de un polipéptido, por ejemplo, una forma de un polipéptido que es capaz de interaccionar con un péptido diana, por ejemplo un receptor, pero que no promueve la activación del receptor. El antagonista también puede ser un ácido nucleico que codifica una forma dominante negativa de un polipéptido, un ácido nucleico antisentido o una ribozima capaz de interaccionar específicamente con un ARN. Otros antagonistas son moléculas que se unen a un polipéptido e inhiben su acción. Estas moléculas incluyen péptidos, por ejemplo formas de péptidos diana que no tienen actividad biológica y que inhiben la unión a receptores. De esta manera, estos péptidos se unirán al sitio activo de una proteína e impedirán su interacción con péptidos diana. Otros antagonistas incluyen anticuerpos que interaccionan específicamente con un epítopo de una molécula, de tal forma que la unión interfiera con la función biológica del polipéptido. En otra realización preferida, el antagonista es una molécula pequeña, tal como una molécula capaz de inhibir la interacción entre un polipéptido y un receptor diana. Como alternativa, la molécula pequeña puede funcionar como un antagonista por interacción con sitios distintos del sitio de unión al receptor. Los agentes terapéuticos preferidos incluyen fármacos reductores de lípidos, agentes antiplaquetarios, agentes antiinflamatorios y agentes antihipertensivos.
"Enfermedad cerebrovascular", como se usa en la presente memoria, es un tipo de enfermedad vascular periférica (como se define más adelante) donde el vaso periférico bloqueado forma parte de la circulación cerebral. La circulación cerebral incluye la carótida y los sistemas de arterias vertebrales. Esta definición de enfermedad cerebrovascular pretende incluir específicamente una hemorragia intracraneal que no se produce como una manifestación de un bloqueo arterial. El bloqueo puede producirse de forma repentina, por mecanismos tales como ruptura de placas o embolización. El bloqueo se puede producir progresivamente, con un estrechamiento de la arteria por medio de una hiperplasia de la mioíntima y formación de placas. El bloqueo puede ser completo o parcial. Ciertos grados y duraciones de bloqueo producen isquemia cerebral, una reducción del flujo sanguíneo que dura durante varios segundos a minutos. La prolongación de la isquemia cerebral puede producir un infarto cerebral. La isquemia y el infarto pueden ser focales o generalizados. La isquemia o el infarto cerebral pueden producir un inicio brusco de un defecto neurológico focal no convulsivo, un acontecimiento clínico denominado "ictus" o "accidente cerebrovascular (CVA)". La enfermedad cerebrovascular tiene dos categorías amplias de patologías: trombosis y embolia. Los ictus trombóticos se producen sin síntomas de advertencia en 80-90% de los pacientes; entre 10 y 20% de los ictus trombóticos se anuncian por ataques isquémicos transitorios. Una enfermedad cerebrovascular puede estar asociada con un trastorno de placas frágiles. Los signos y síntomas de este tipo de enfermedad cerebrovascular son los asociados con placas frágiles, incluyendo ictus debido a un bloqueo arterial repentino con formación de trombos o coágulos. Una enfermedad cerebrovascular puede estar asociada con un trastorno oclusivo. Los signos y síntomas de este tipo de enfermedad cerebrovascular se relacionan con el bloqueo progresivo del flujo sanguíneo con una isquemia cerebral global o local. En esta situación, pueden verse cambios neurológicos, incluyendo ictus.
Un "acontecimiento clínico" es la aparición de signos clínicamente discernibles de una enfermedad o de síntomas clínicamente notificables de una enfermedad. "Clínicamente discernible" indica que el signo puede apreciarse por la persona que proporciona asistencia sanitaria. "Clínicamente notificable" indica que el síntoma es el tipo de fenómeno que puede describirse a la persona que proporciona asistencia sanitaria. Un acontecimiento clínico puede comprender síntomas clínicamente notificables incluso si el paciente particular no puede notificarlos por sí mismo, siempre que éstos sean del tipo de fenómenos que generalmente pueden describirse por un paciente a la persona que proporciona asistencia sanitaria.
Una "arteriopatía coronaria" ("CAD") se refiere a un trastorno vascular relacionado con el bloqueo de arterias que irrigan el corazón. El bloqueo puede producirse de forma repentina por mecanismos tales como una ruptura de placas o embolización. El bloqueo puede producirse progresivamente, con un estrechamiento de las arterias por hiperplasia de la mioíntima y formación de placas. Los signos y síntomas clínicos resultantes del bloqueo de arterias que irrigan el corazón son manifestaciones de arteriopatía coronaria. Las manifestaciones de arteriopatía coronaria incluyen angina, isquemia, infarto de miocardio, cardiomiopatía, insuficiencia cardiaca congestiva, arritmias y formación de aneurismas. Se entiende que una enfermedad de placas frágiles en la circulación coronaria está asociada con trombosis arterial o embolización distal que se manifiesta como infarto de miocardio. Se entiende que la enfermedad oclusiva en la circulación coronaria está asociada con estenosis arterial acompañada de síntomas de angina, una afección tratada comúnmente con intervenciones farmacológicas y con angioplastia.
Una "enfermedad" es un trastorno caracterizado por acontecimientos clínicos que incluyen signos clínicos y síntomas clínicos. Las enfermedades analizadas en la presente memoria incluyen enfermedad cardiovascular, enfermedad vascular periférica, CAD, enfermedad cerebrovascular y las enfermedades en cualquier localización anatómica asociadas con un trastorno de placas frágiles, con trastorno oclusivo o con reestenosis.
Un "alelo asociado con trastornos" o "un alelo asociado con un trastorno" se refiere aun alelo cuya presencia en un sujeto indica que el sujeto tiene o es susceptible de desarrollar un trastorno particular. Un tipo de alelo asociado con trastornos es un "alelo asociado con trastornos cardiovasculares", cuya presencia en un sujeto indica que el sujeto tiene o es susceptible de desarrollar un trastorno cardiovascular. Éstos incluyen en sentido amplio dentro de su alcance alelos que están asociados con "trastornos de placas frágiles", alelos asociados con "trastornos oclusivos" y alelos asociados con reestenosis. Los ejemplos de alelos asociados con "trastornos de placas frágiles" incluyen el alelo 2 del marcador +4825 de IL-1A; el alelo 2 del marcador +3954 de IL-1B; y el alelo 1 del marcador +2018 de IL-1RN; y el alelo 1 del marcador (-511) del gen de IL-1B o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. Los ejemplos de alelos asociados con "trastornos vasculares oclusivos" incluyen el alelo 1 del marcador +4825 de IL-1A; el alelo 1 del marcador +3954 de IL-1B; y el alelo 2 del marcador +2018 de IL-1RN; y el alelo 2 del marcador (-511) del gen de IL-1B o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. Los ejemplos de alelos asociados con reestenosis incluyen la combinación del alelo 1 del marcador +4825 de IL-1A o el alelo 1 del marcador +3954 en combinación con el alelo 1 del marcador -511 de IL-1B o el alelo 1 del marcador +2018 de IL-1RN, o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. Un "alelo asociado con un trastorno periodontal" se refiere a un alelo cuya presencia en un sujeto indica que el sujeto tiene o es susceptible de desarrollar trastornos periodontales.
Las frases "ruptura del gen" y "ruptura dirigida" o cualquier frase similar se refiere a la interrupción con especificidad de sitio de una secuencia de ADN nativa para impedir la expresión de ese gen en la célula en comparación con la copia del gen de tipo silvestre. La interrupción puede producirse por deleciones, inserciones o modificaciones en el gen, o cualquier combinación de las mismas.
Como se usan en la presente memoria, los términos "coágulo", "embolia" o "embolización" se refieren a una embolia o embolización de una arteria a otra.
"Trastorno de placas frágiles" se refiere al trastorno cardiovascular caracterizado por la formación de placas frágiles como parte del proceso arteriosclerótico dentro de una arteria. La placa frágil es propensa a la fractura, trombosis o ruptura. Cuando se altera la integridad de la placa, puede bloquear mecánicamente el vaso localmente o puede enviar fragmentos o coágulos asociados corriente abajo en el vaso produciendo un bloqueo más distalmente. Si la placa se rompe, puede ser un nido para que se forme un trombo local. El trastorno de placas frágiles está asociado con el patrón 1 de alelos en el locus de IL-1.
Un "agente terapéutico para el trastorno de placas frágiles" se refiere a cualquier agente o régimen terapéutico (incluyendo medios farmacéuticos, nutracéuticos y quirúrgicos) que previene o pospone el desarrollo o reduce el grado de una anomalía constitutiva de un trastorno de placas frágiles en un sujeto. Este término incluye ciertos agentes que funcionan estabilizando placas frágiles, ciertos agentes con efecto antitrombótico o antiplaquetario y ciertos agentes con efecto antioxidante. Los ejemplos de agentes terapéuticos asociados con el trastorno de placas frágiles incluyen fármacos de estatina, agentes antiinflamatorios con efecto anti-prostaglandina, agentes antiinflamatorios, inhibidores de citoquinas dirigidos contra IL-1 y TNF-alfa tales como Tenidap, inhibidores de metaloproteasas de matriz (MMP) incluyendo tetraciclina y agentes relacionados e inhibidores de MMP específicos, y antagonistas del receptor de IL-1 recombinante. Además, este término incluye los nutracéuticos que bloquean IL-1, agentes tales como aceites de pescado, ácidos grasos omega-3, ácidos grasos poliinsaturados y los nutracéuticos con efecto antioxidante tales como hidroxianisol butilado (BHA).
El término "haplotipo", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a una serie de alelos que se heredan conjuntamente como un grupo (están en desequilibrio de ligamiento) a niveles estadísticamente significativos (p_{corr}<0,05). Como se usa en la presente memoria, la frase "un haplotipo de IL-1" se refiere a un haplotipo en el loci IL-1.
Un "agonista de IL-1", como se usa en la presente memoria, se refiere a un agente que imita, regula positivamente (potencia o suplementa) o aumenta de otra manera la bioactividad de IL-1 o la bioactividad de un gen en una ruta biológica de IL-1. Los agonistas de IL-1 pueden actuar sobre cualquiera de una diversidad de niveles diferentes, incluyendo la regulación de la expresión del gen de IL-1 en la región del promotor, la regulación de mecanismos de corte y empalme del ARNm, estabilización del ARNm, fosforilación de proteínas para la traducción, conversión de proIL-1 en IL-1 madura y secreción de IL-1. Los agonistas que aumentan la síntesis de IL-1 incluyen: lipopolisacáridos, IL-1B, agentes inductores de AMPc, agentes activadores de NF\kappaB, agentes activadores de AP-1, TNF-\alpha, LDL oxidados, productos terminales de glicosilación avanzada (AGE), estrés de la pared arterial, hipoxia, hiperoxia, lesión de isquemia-reperfusión, histaminas, prostaglandina E2 (PGE2), IL-1, IL-3, IL-12, factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de monocitos (M-CSF), factor de células madre, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), complemento C5A, complemento C5b9, productos de degradación de fibrina, plasmina, trombina, ácido 9-hidroxioctadecaenoico, ácido 13-hidroxioctadecaenoico, factor activador de plaquetas (PAF), factor H, ácido retinoico, ácido úrico, pirofosfato cálcico, polinucleósidos, proteína c reactiva, \alpha-antitripsina, antígeno de tabaco, colágeno, integrinas \beta-1, LFA-3, anti-HLA-DR, anti-IgM, anti-CD3, fitohemaglutinina (CD2), sCD23, radiación ultravioleta B, radiación gama, sustancia P, isoproterenol, metanfetamina y melatonina. Los agonistas que estabilizan el ARNm de IL-1 incluyen la endotoxina bacteriana y la IL-1. Otros agonistas que funcionan aumentando el número de receptores de IL-1 de tipo 1 disponibles incluyen IL-1, activadores de PKC, dexametasona, IL-2, IL-4 y PGE2. Otros antagonistas preferidos interfieren o inhiben factores de transducción de señales activados por IL-1 o utilizados en una ruta de transducción de señales de IL-1 (por ejemplo, NF\kappaB y AP-1, quinasa PI3, fosfolipasa A2, proteína quinasa C, JNK-1, 5-lipoxigenasa, ciclooxigenasa 2, fosforilación de tirosina, ruta de iNOS, Rac, Ras, TRAF). Otros agonistas aumentan la bioactividad de genes cuya expresión se induce por IL-1, incluyendo: IL-1, IL-1Ra, TNF, IL-2, IL-3, IL-6, IL-12, GM-CSF, G-CSF, TGF-\beta, fibrinógeno, inhibidor de plasminógeno uroquinasa, inhibidor del activador de plasminógeno de tipo 1 y de tipo 2, p-selectina (CD62), receptor de fibrinógeno, CD-11/CD18, proteasa nexina-1, CD44, metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1), MMP-3, elastasa, colagenasas, inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), colágeno, triglicéridos que aumentan Apo CIII, apolipoproteína, ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, L-selectina, decorina, factor de células madre, factor inhibidor de leucemia, IFN\alpha,\beta,\gamma, L-8, receptor de IL-2, receptor de IL-3, receptor de IL-5, receptor de c-kit, receptor de GM-CSF, ciclooxigenasa 2 (COX-2), fosfolipasa A2 de tipo 2, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), endotelina 1-3, gama glutamil transferasa, Mn superóxido dismutasa, proteína C reactiva, fibrinógeno, amiloide sérico A, metalotioneínas, ceruloplasmina, lisozima, xantina deshidrogenasa, xantina oxidasa, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), actividad estimuladora del crecimiento de melanoma (gro-\alpha,\beta,\gamma), factor de crecimiento semejante a insulina-1 (IGF-1), activina A, pro-opiomelanocorticotropina, factor de liberación de corticotropina, precursor de B amiloide, proteína 40 de la membrana basal, laminina B1 y B2, proteína constitutiva de choque térmico p70, mitógeno P42, proteína quinasa de activación, ornitina descarboxilasa, hemo oxigenasa y subunidad \alpha de la proteína G.
Un "antagonista de IL-1", como se usa en la presente memoria, se refiere a un agente que regula negativamente o reduce de otra manera la bioactividad de la IL-1. Los antagonistas de IL-1 pueden actuar sobre cualquiera de una diversidad de niveles diferentes, incluyendo la regulación de la expresión del gen de IL-1 en la región del promotor, la regulación de mecanismos de corte y empalme del ARNm, estabilización del ARNm, fosforilación de proteínas para la traducción, conversión de proIL-1 en IL-1 madura y secreción de IL-1. Los antagonistas de la producción de IL-1 incluyen: corticosteroides, inhibidores de lipoxigenasa, inhibidores de ciclooxigenasa, interferón \gamma, IL-1, IL-10, IL-13, factor de crecimiento de transformación \beta (TGF-\beta), inhibidores de ACE, ácidos grasos n-3 poliinsaturados, antioxidantes y agentes reductores de lípidos. Los antagonistas que desestabilizan el ARNm de IL-1 incluyen agentes que promueven la desadenilación. Los antagonistas que inhiben o previenen la fosforilación de proteínas IL-1 para la traducción incluyen compuestos de piridinil-imidazol, tales como tebufelona y compuestos que inhiben la formación de microtúbulos (por ejemplo colchicina, vinblastina y vincristina). Los antagonistas que inhiben o previenen la conversión de proIL-1 en IL-1 madura incluyen inhibidores de la enzima convertidora de interleuquina (ICE), tales como isoformas \varepsilonICE, anticuerpos para las isoformas ICE \alpha, \beta y \gamma, CXrm-A, transcrito X, inhibidor de sustrato competitivo de tetrapéptido endógeno, tripsina, elastasa, quimotripsina, quimasa y otras proteasas no específicas. Los antagonistas que previenen o inhiben la secreción de IL-1 incluyen agentes que bloquean el transporte de aniones. Los antagonistas que interfieren con las interacciones del receptor de IL-1 incluyen: agentes que inhiben la glicosilación del receptor de IL-1 de tipo I, oligonucleótidos antisentido contra IL-1RI, anticuerpos contra IL-1RI y oligonucleótidos antisentido contra IL-1RacP. Otros antagonistas que funcionan reduciendo el número de receptores de IL-1 de tipo I disponibles incluyen TGF-\beta, inhibidores de COX, factores que aumentan receptores de IL-1 de tipo II, dexametasona, PGE2, IL-1 e IL-4. Otros antagonistas preferidos interfieren o inhiben factores de transducción de señales por IL-1 o utilizados en una ruta de transducción de señales de IL-1 (por ejemplo, NF\kappaB y AP-1, quinasa PI3, fosfolipasa A2, proteína quinasa C, JNK-1, 5-lipoxigenasa, ciclooxigenasa 2, fosforilación de tirosina, ruta de iNOS, Rac, Ras, TRAF). Otros antagonistas interfieren con la bioactividad de genes cuya expresión se induce por IL-1, incluyendo: IL-1, IL-1Ra, TNF, IL-2, IL-3, IL-6, IL-12, GM-CSF, G-CSF, TGF-\beta, fibrinógeno, inhibidor de plasminógeno uroquinasa, inhibidor del activador de plasminógeno de tipo 1 y de tipo 2, p-selectina (CD62), receptor de fibrinógeno, CD-11/CD18, proteasa nexina-1, CD44, metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1), MMP-3, elastasa, colagenasas, inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), colágeno, triglicéridos que aumentan Apo CIII, apolipoproteína, ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, L-selectina, decorina, factor de células madre, factor inhibidor de leucemia, IFN\alpha,\beta,\gamma, L-8, receptor de IL-2, receptor de IL-3, receptor de IL-5, receptor de c-kit, receptor de GM-CSF, ciclooxigenasa 2 (COX-2), fosfolipasa A2 de tipo 2, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), endotelina 1-3, gama glutamil transferasa, Mn superóxido dismutasa, proteína C reactiva, fibrinógeno, amiloide sérico A, metalotioneínas, ceruloplasmina, lisozima, xantina deshidrogenasa, xantina oxidasa, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), actividad estimuladora del crecimiento de melanoma (gro-\alpha,\beta,\gamma), factor de crecimiento semejante a insulina-1 (IGF-1), activina A, pro-opiomelanocorticotropina, factor de liberación de corticotropina, precursor de B amiloide, proteína 40 de la membrana basal, laminina B1 y B2, proteína constitutiva de choque térmico p70, mitógeno P42, proteína quinasa de activación, ornitina descarboxilasa, hemo oxigenasa y subunidad \alpha de la proteína G. Otros antagonistas preferidos incluyen: himenialdisina, herbimicinas (por ejemplo, herbamicina A), CK-103A y sus derivados (por ejemplo 4,6-dihidropiridazino[4,5-c]piridazin-5(1H)-ona), CK-119, CK-122, yodometacina, aflatoxina B1, leptina, heparina, imidazoles bicíclicos (por ejemplo, SB203580), PD15306 HCl, derivados del ácido podocárpico, M-20, péptido 2 semejante a glucagón humano [Gly2], FR167653, derivados de esteroides, glucocorticoides, Quercetina, teofilina, inhibidores de la NO sintetasa, RWJ 68354, Eucliptol (1,8-cineol), magnosalina, N-acetilcisteína, hormona estimuladora de alfa-melatonina (\alpha-MSH), Triclosan (2,4,4'-tricloro-2'-hidroxildifenil éter), prostaglandina E2 y ácido 4-aminopiridina etacrínico y ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico (DIDS), glucosa, lipofosfoglicano, aspirina, agentes bloqueantes del catabolismo, diacereína, agentes moduladores de tiol, cinc, morfina, inhibidores de la biosíntesis de leucotrienos (por ejemplo, MK886), antagonistas del receptor del factor de activación de plaquetas (por ejemplo, WEB 2086), amiodarona, tranilast, S-metil-L-tiocitrulina, agonistas del adrenorreceptor beta (por ejemplo, Procaterol, Clenbuterol, Fenoterol, terbutalina, ácido hialurónico, anticuerpos anti-TNF-\alpha, autoanticuerpos anti-IL-1\alpha, antagonistas del receptor de IL-1, quinasa asociada a IL-1R, receptores solubles de TNF y citoquinas antiinflamatorias (por ejemplo IL-4, IL-13, IL-10, IL-6, TGF-\beta, angiotensina II, receptor de IL-1 de tipo II soluble, receptor de IL-1 de tipo I soluble, activador de plasminógeno tisular, péptidos de IL-1 de proteína A20 de dedos de cinc (por ejemplo Thr-Lys-Pro-Arg) (Tuftsina), (Ile-Thr-Gly-Ser-Glu) IL-1-alfa, Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Phe, Val-Thr-Asp-Phe-Tyr-Phe, interferón alfa2b, interferón beta, aná-
logos de IL-1 beta (por ejemplo, tripéptido de IL-1-beta: Lys-D-Pro-Thr), IL-1-alfa glicosilada y péptidos de IL-1ra.
Las expresiones "agrupamiento de genes de IL-1" y "loci de IL-1", como se usan en esta memoria, incluyen todos los ácidos nucleicos en o cerca de la región 2q13 del cromosoma 2, incluyendo al menos los genes de IL-1A, IL-1B e IL-1RN y cualquier otra secuencia asociada. (Nicklin et al., Genomics 19: 382-84, 1994). Las expresiones "IL-1A", "IL-1B" e "IL-1RN" como se usan en esta memoria, se refieren a los genes que codifican IL-1\alpha, IL-1\beta y antagonista del receptor de IL-1, respectivamente. El número de acceso del gen para IL-1A, IL-1B e IL-1RN son X03833, X04500 y X64532, respectivamente.
"Mutación funcional de IL-1" se refiere a una mutación dentro del agrupamiento de genes de IL-1 que tiene como resultado una alteración del fenotipo (es decir, afecta a la función de un gen o la proteína IL-1). Los ejemplos incluyen: alelo 2 de IL-1A (+4845), alelo 2 de IL-1B (+3954), alelo 1 de IL-1B (-511) y alelo 1 de IL-1RN (+2018).
"Alelo Y de IL-1X (Z)" se refiere a una forma alélica particular, denominada Y, que se produce en un sitio polimórfico del locus de IL-1 en el gen X, donde X es IL-1A, B o RN o algún otro gen en los loci del gen de IL-1, y situada en o cerca del nucleótido Z, donde el nucleótido Z está numerado con respecto al sitio de inicio de la transcripción principal, que es el nucleótido +1, del gen X de IL-1 particular. Como se usa adicionalmente en la presente memoria, la expresión "alelo de IL-1X (Z)" se refiere a todos los alelos de un sitio polimórfico de IL-1 en el gen X colocados en o cerca del nucleótido Z. Por ejemplo, la expresión "alelo de IL-1RN (+2018)" se refiere a formas alternativas del gen de IL-1RN en el marcador +2018. "Alelo 1 de IL-1RN (+2018)" se refiere a una forma del gen de IL-1RN que contiene una citosina (C) en la posición +2018 de la cadena con sentido. Clay et al., Hum. Genet. 97:723-26, 1996. "Alelo 2 de IL-1RN (+2018)" se refiere a una forma del gen de IL-1RN que contiene una timina (T) en la posición +2018 de la cadena más. Cuando un sujeto tiene dos alelos de IL-1RN idénticos, se dice que el sujeto es homocigoto o tiene un estado homocigoto. Cuando un sujeto tiene dos alelos de IL-1RN diferente, se dice que el sujeto es heterocigoto o tiene el estado heterocigoto. La expresión "alelo 2,2 de IL-1RN (+2018)" se refiere al estado del alelo 2 de IL-1RN (+2018) homocigoto. Por el contrario, la expresión "alelo 1,1 de IL-1RN (+2018)" se refiere al estado del alelo 1 de IL-1RN (+2018) homocigoto. La expresión "alelo 1,2 de IL-1RN (+2018)" se refiere al estado 1 y 2 del alelo heterocigoto.
Se entiende que "relacionado con IL-1", como se usa en la presente memoria, incluye todos los genes relacionados con los genes del locus de la IL-1 humana en el cromosoma 2 humano (2q 12-14). Estos incluyen los genes de IL-1 del agrupamiento de genes de IL-1 humana localizados en el cromosoma 2 (2q 13-14) que incluyen: el gen de IL-1A que codifica interleuquina 1\alpha, el gen de IL-1B que codifica interleuquina 1\beta y el gen de IL-1RN (o IL-1ra) que codifica el antagonista del receptor de interleuquina-1. Además, estos genes relacionados con la IL-1 incluyen los genes del receptor de IL-1 humano de tipo I y de tipo II localizados en el cromosoma 2 humano (2q12) y sus homólogos de ratón localizados en el cromosoma 1 de ratón en la posición 19.5 cM. La interleuquina-1\alpha, la interleuquina-1\beta y la interleuquina-1RN están relacionadas tanto que se unen a los receptores de IL-1 de tipo 1, sin embargo sólo la interleuquina-1\alpha y la interleuquina-1\beta son ligandos agonistas que activan los receptores de IL-1 de tipo I, mientras que la interleuquina-1RN es un ligando antagonista natural. Cuando el término "IL-1" se usa haciendo referencia a un producto génico o un polipéptido, se entiende que se refiere a todos los productos génicos codificados por el locus de interleuquina-1 en el cromosoma 2 humano (2q 12-14) y sus homólogos correspondientes de otras especies o variantes funcionales del mismo. De esta manera, el término IL-1 incluye polipéptidos secretados que promueven una respuesta inflamatoria, tal como IL-1\alpha e IL-1\beta, así como un polipéptido secretado que antagoniza respuestas inflamatorias tales como el antagonista del receptor de IL-1 y el receptor de IL-1 de tipo II (cebo).
Un "receptor de IL-1" o "IL-1R" se refiere a diversos receptores de proteínas unidos a la membrana celular capaces de unirse y/o transducir una señal a partir de un ligando codificado por el locus de IL-1. El término se aplica a cualquiera de las proteínas que pueden unirse a moléculas de interleuquina-1 (IL-1) y, en su configuración nativa como proteínas de la membrana plasmática de mamíferos, presumiblemente juegan un papel en la transducción de la señal proporcionada por la IL-1 a una célula. Como se usa en la presente memoria, la expresión incluye análogos de proteínas nativas con actividad de unión a IL-1 o actividad de transducción de señales. Los ejemplos incluyen los receptores de IL-1 humanos y murinos descritos en la Patente de Estados Unidos número 4.968.607. La expresión "ácido nucleico de IL-1" se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína IL-1.
Se pretende que un "polipéptido IL-1" y una "proteína IL-1" incluyan polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de ADN genómico de IL-1 para IL-1\alpha, IL-1\beta e IL-1RN, o fragmentos de los mismos, y homólogos de los mismos, e incluyen polipéptidos agonistas y antagonistas.
``Estenosis asociada con una endoprótesis vascular se refiere a la oclusión progresiva dentro de una endoprótesis que se ha colocado durante un proceso de angioplastia. La estenosis asociada con una endoprótesis vascular es una forma de reestenosis que tiene lugar dentro de una endoprótesis arterial.
"Riesgo aumentado" se refiere a una frecuencia estadísticamente mayor de aparición de la enfermedad o trastorno en un individuo en comparación con la frecuencia de aparición de la enfermedad o trastorno en una población. Un factor que se identifica que está asociado con un mayor riesgo se denomina "factor de riesgo". Llevar un alelo polimórfico particular es un factor de riesgo para una enfermedad cardiovascular particular, y está asociado con un mayor riesgo de la enfermedad particular.
Se entiende que el término "interacción", como se usa en la presente memoria, incluye relaciones o asociaciones detectables (por ejemplo interacciones bioquímicas) entre moléculas, tales como interacciones entre proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, ácido nucleico-ácido nucleico y proteína-molécula pequeña o ácido nucleico-molécula pequeña en la naturaleza.
El término "aislado", como se usa en la presente memoria con respecto a ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADN, o ARN, respectivamente, que están presentes en la fuente natural de la macromolécula. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado que codifica uno de los polipéptidos IL-1 de la presente invención preferiblemente incluye no más de 10 kilobases (kb) de secuencia de ácido nucleico que flanquea inmediatamente de forma natural el gen de IL-1 en el ADN genómico, más preferiblemente no más de 5 kb de dichas secuencias flanqueantes naturales y aún más preferiblemente menos de 1,5 kb de dichas secuencias flanqueantes naturales. El término aislado, como se usa en la presente memoria, también se refiere a un ácido nucleico o péptido que carece sustancialmente de material celular, material viral o medio de cultivo cuando se produce por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente. Además, se entiende que un "ácido nucleico aislado" incluye fragmentos de ácido nucleico que no se producen de forma natural como fragmentos y no se encontrarían en el estado natural. El término "aislado" también se usa en la presente memoria para hacer referencia a polipéptidos que están aislados de otras proteínas celulares y se entiende que incluyen tanto polipéptidos purificados como polipéptidos recombinantes.
"Desequilibrio de ligamiento" se refiere a la herencia conjunta de dos alelos a frecuencias mayores que las que se esperarían por las frecuencias separadas de aparición de cada alelo en una población de control dada. La frecuencia de aparición esperada de dos alelos que se heredan independientemente es la frecuencia del primer alelo multiplicada por la frecuencia del segundo alelo. Se dice que los alelos que aparecen conjuntamente a frecuencias esperadas están en "desequilibrio de ligamiento". La causa del desequilibrio de ligamiento a menudo no está clara. Puede deberse a la selección de ciertas combinaciones de alelos o a una mezcla reciente de poblaciones genéticamente heterogéneas. Además, en el caso de marcadores que están muy ligados a un gen de una enfermedad, se espera una asociación de un alelo (o grupo de alelos ligados) con el gen de la enfermedad si la mutación de la enfermedad se produjo en un pasado reciente, de forma que no haya transcurrido un periodo de tiempo suficiente para conseguir el equilibrio por medio de acontecimientos de recombinación en la región cromosómica específica. Cuando se hace referencia a patrones alélicos que comprenden más de un alelo, un primer patrón alélico está en desequilibrio de ligamiento con un segundo patrón alélico si todos los alelos que constituyen el primer patrón alélico están en desequilibrio de ligamiento con al menos uno de los alelos del segundo patrón alélico. Un ejemplo de desequilibrio de ligamiento es el que se produce entre los alelos en los sitios polimórficos IL-1RN (+2018) e IL-1RN (VNTR). Los dos alelos en IL-1RN (+2018) están 100% en desequilibrio de ligamiento con los dos alelos más frecuentes de IL-1RN (VNTR), que son el alelo 1 y el alelo 2.
El término "marcador" se refiere a una secuencia en el genoma que se sabe que varía entre los individuos. Por ejemplo, el gen de IL-1RN tiene un marcador que consiste en un número variable de repeticiones en tándem (VNTR).
"Modular" se refiere a la capacidad de una sustancia de regular la bioactividad. Cuando se aplica a una bioactividad de IL-1, un agonista o antagonista puede modular la bioactividad, por ejemplo, agonizando o antagonizando la síntesis de IL-1, la interacción con el receptor o el mecanismo de transducción de señales mediado por IL-1.
Un "gen mutado" o "mutación" o "mutación funcional" se refiere a una forma alélica de un gen que es capaz de alterar el fenotipo de un sujeto que tiene el gen mutado con respecto a un sujeto que no tiene el gen mutado. El fenotipo alterado producido por una mutación puede corregirse o compensarse por ciertos agentes. Si un sujeto tiene que ser homocigoto para esta mutación para tener un fenotipo alterado, se dice que la mutación es recesiva. Si una copia del gen mutado es suficiente para alterar el fenotipo del sujeto, se dice que la mutación es dominante. Si un sujeto tiene una copia del gen mutado y tiene un fenotipo que es intermedio entre el de un sujeto homocigoto y el de un sujeto heterocigoto (para ese gen), se dice que la mutación es codominante.
Un "animal no humano" incluye mamíferos tales como roedores, primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, etc., anfibios, tales como miembros del género Xenopus y aves transgénicas (por ejemplo, pollos, pájaros, etc.). La expresión "animal quimérico" se usa en la presente memoria para hacer referencia a animales en los que se encuentra el gen recombinante, o en los que el gen recombinante se expresa en algunas pero no todas las células del animal. La expresión "animal quimérico con especificidad de tejido" indica que uno de los genes de IL-1 recombinante está presente y/o se expresa o está alterado en algunos tejidos pero no en otros. La expresión "mamífero no humano" se refiere a cualquier miembro de la clase Mammalia, con la excepción de los seres humanos.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos u oligonucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). Debe entenderse que la expresión también incluye, como equivalentes, análogos de ARN o ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos (por ejemplo, ácidos peptidonucleicos) y cuando es aplicable a la realización que se describe, polinucleótidos mono- (con sentido o anti sentido) y bicatenarios.
"Trastorno oclusivo", como se usa en la presente memoria indistintamente con la expresión "trastorno vascular oclusivo", se refiere al trastorno cardiovascular caracterizado por el engrosamiento progresivo de una pared arterial, asociado con la presencia de una lesión aterosclerótica en la íntima dentro de una arteria. El trastorno oclusivo conduce a un bloqueo progresivo de la arteria. Con una progresión suficiente, el trastorno oclusivo puede reducir el flujo en la arteria hasta el punto de que se produzcan signos y síntomas clínicos en los tejidos perfundidos por la arteria. Estos acontecimientos clínicos se refieren a una isquemia de los tejidos perfundidos. Cuando es severa, la isquemia va acompañada de la muerte del tejido, lo que recibe el nombre de infarto o gangrena. El trastorno oclusivo está asociado con el patrón 2 de alelos en el locus de IL-1.
Un "agente terapéutico de un trastorno oclusivo" se refiere a cualquier agente o régimen terapéutico (incluyendo medios farmacéuticos, nutracéuticos y quirúrgicos) que previene o pospone el desarrollo o reduce el grado de una anomalía constitutiva de un trastorno oclusivo en un sujeto. Los ejemplos de agentes terapéuticos de trastornos oclusivos incluyen los agentes que son antioxidantes, los que reducen los lípidos en suero, los que bloquean la acción de lípidos oxidados y otros agentes que influyen en el metabolismo de los lípidos o que de otra manera tienen efectos activos sobre los lípidos.
Una "enfermedad vascular periférica" ("PVD") es una enfermedad cardiovascular resultante del bloqueo de las arterias periféricas (es decir, no coronarias). El bloqueo se puede producir de forma repentina, por mecanismos tales como ruptura de placas o embolización, como ocurre en la enfermedad de placas frágiles. El bloqueo se puede producir progresivamente, con un estrechamiento de la arteria a través de una hiperplasia de la mioíntima y formación de placas, como en la enfermedad oclusiva. El bloqueo puede ser completo o parcial. Los signos y síntomas clínicos debidos al bloqueo de las arterias periféricas son manifestaciones de una enfermedad vascular periférica. Las manifestaciones de enfermedades vasculares periféricas incluyen, entre otras, claudicación, isquemia, angina intestinal, insuficiencia renal de base vascular, ataques isquémicos transitorios, formación de aneurismas, embolización periférica e ictus. La enfermedad cerebrovascular isquémica es un tipo de enfermedad vascular periférica.
El término "polimorfismo" se refiere a la coexistencia de más de una forma de un gen o parte (por ejemplo, variante alélica) del mismo. Una parte de un gen del que hay al menos dos formas diferentes, es decir, dos secuencias de nucleótidos diferentes, se denomina "región polimórfica de un gen". Una secuencia genética específica en una región polimórfica de un gen es un alelo. Una región polimórfica puede ser un solo nucleótido, cuya identidad difiere en diferentes alelos. Una región polimórfica también puede tener varios nucleótidos de longitud.
La expresión "propensión a una enfermedad", también "predisposición" o "susceptibilidad" a una enfermedad o cualquier frase similar, significa que se ha descubierto que ciertos alelos están asociados o son predictivos de la incidencia de un sujeto de desarrollar una enfermedad particular (en la presente memoria, una enfermedad cardiovascular). De esta manera, los alelos están sobrerrepresentados en frecuencia en individuos con la enfermedad en comparación con los individuos sanos. De esta manera, estos alelos pueden usarse para predecir enfermedades incluso en individuos presintomáticos o preenfermos. Se entiende que estos alelos se relacionan con el trastorno subyacente a la enfermedad.
El término "reestenosis" se refiere a cualquier lesión preoclusiva que se desarrolla después de un procedimiento reconstructivo en un vaso sanguíneo enfermo. El término no sólo se aplica a la recurrencia de una estenosis preexistente, sino también a vasos previamente normales, tales como injertos venosos, que se han obstruido parcialmente después de un bypass vascular. Reestenosis se refiere a cualquier estrechamiento luminal que se produce después de una intervención terapéutica dirigida a una arteria. Por lo tanto, las lesiones que producen reestenosis pueden incluir traumatismo en una lesión aterosclerótica (observado con angioplastia), una resección de una lesión (observada con endarterectomía), un traumatismo externo (por ejemplo, una lesión producida por pinzamiento transversal) o una anastomosis quirúrgica. La reestenosis puede producirse como resultado de cualquier momento de reconstrucción vascular, tanto si está en la vasculatura coronaria como si está en la periferia (Colburn y Moore (1998) Myointimal Hyperplasia pp. 690-709 in Vascular Surgery: A Comprehensive Review (Philadelphia: Saunders, 1998)). Por ejemplo, ciertos estudios han notificado índices de reestenosis sintomática de 30-50% después de angioplastias coronarias (véase Berk y Harris (1995) Adv. Intern. Med. 40:455-501). Después de endarterectomías de carótida, como ejemplo adicional, 20% de los pacientes estudiados tuvieron un estrechamiento luminal mayor de 50% (Clagett et al. (1986) J. Vasc. Surg. 3:10-23). Se ve otro ejemplo de reestenosis en bypasses vasculares Infrainguinales, donde 40-60% de los injertos protésicos y 20-40% de los injertos venosos están obstruidos a los tres años (Dalman y Taylor (1990) Ann. Vasc. Surg. 3:109-312, Szilagyi et al. (1973) Ann. Surg. 178:232-246). Diferentes grados de sintomatología acompañan a las lesiones preoclusivas en diferentes localizaciones anatómicas, debido a una combinación de factores que incluyen los diferentes calibres de los vasos implicados, el grado de enfermedad residual y la hemodinámica local. La estenosis asociada con una endoprótesis vascular es un tipo de reestenosis. La reestenosis está asociada con el patrón 3 de alelos en el locus de IL-1.
Un "agente terapéutico para un trastorno de reestenosis" se refiere a cualquier agente o régimen terapéutico (incluyendo medios farmacéuticos, nutracéuticos y quirúrgicos) que previene o pospone el desarrollo o reduce el grado de una anomalía constitutiva de un trastorno de reestenosis en un paciente. Se entiende que la reestenosis comprende 3 fases. La primera fase se caracteriza por una respuesta inflamatoria que implica el reclutamiento de leucocitos en el sitio de la lesión y por la formación de trombos durante las primeras 48 horas. El endotelio se activa con la expresión de moléculas de adhesión ICAM-1, E-selectina, P-selectina y VCAM-1. Al mismo tiempo, los macrófagos y fibroblastos empiezan a migrar al interior del sitio de la lesión por medio de una regulación positiva de integrinas. La segunda fase se caracteriza por la proliferación de células de músculo liso en la media de la pared de los vasos y la migración de estas células a la íntima donde migran. Los factores de crecimiento y las citoquinas que regulan la proliferación y migración de células del músculo liso se liberan por las plaquetas, leucocitos y células del músculo liso. La última fase incluye la fase secretora de la matriz extracelular desde células del músculo liso. Los agentes terapéuticos para los trastornos de reestenosis pueden actuar afectando a cualquiera de estos procesos en la modulación del curso de la reestenosis. Los agentes terapéuticos para los trastornos de reestenosis pueden incluir los agentes que influyen en los procesos de síntesis de NO, tales como troglitazona y tranilast. Los agentes terapéuticos para trastornos de reestenosis incluyen intervenciones físicas tales como radioterapia que influye en la progresión de la reestenosis o de la reestenosis asociada con una endoprótesis vascular. Los agentes terapéuticos para trastornos de reestenosis incluyen técnicas de modificación de endoprótesis vasculares tales como endoprótesis vasculares de siembra con células endoteliales modificadas genéticamente, endoprótesis vasculares de recubrimiento con heparina o agentes relacionados, que proporcionan endoprótesis vasculares poliméricas cargadas con fármaco, endoprótesis vasculares recubiertas con polímeros de construcción que eluyen anticuerpos para el receptor de glicoproteínas de plaquetas u otras modificaciones de endoprótesis vasculares. Los agentes terapéuticos para trastornos de reestenosis incluyen técnicas de ingeniería genética, por ejemplo, las que implican la transferencia de genes terapéuticos y las que implican la incorporación de ADN plasmídico en dispositivos médicos recubiertos con hidrogel. Los agentes terapéuticos para trastornos de reestenosis también incluyen manipulaciones quirúrgicas o partes de planes de tratamiento quirúrgicos destinados a minimizar la incidencia de la reestenosis o evitarla. Se entiende que los trastornos de reestenosis aparecen en todas las arterias nativas sometidas a una manipulación endovascular y en venas autógenas usadas como injertos vasculares. Por ejemplo, la hiperplasia de la íntima de la anastomosis proximal o distal o del propio injerto de la vena continúa siendo la causa principal de los fallos posteriores de las reconstrucciones vasculares infrainguinales. En reconstrucciones de injertos protésicos, estos problemas son extremadamente inusuales. El diagnóstico de una predisposición a un trastorno oclusivo podría guiar al cirujano en la selección del tipo de material de injerto a usar para una reconstrucción vascular, o podría influir sobre la elección de los agentes farmacológicos a usar como adyuvantes al procedimiento.
Un "factor de riesgo" es un factor que, según se ha identificado, está asociado con un mayor riesgo. Un factor de riesgo para un trastorno cardiovascular o una enfermedad cardiovascular es cualquier factor que, según se ha identificado, está asociado con un mayor riesgo de desarrollar esas afecciones o de empeorar esas afecciones. Un factor de riesgo también puede estar asociado con un mayor riesgo de un acontecimiento clínico adverso o un resultado clínico adverso en un paciente con un trastorno cardiovascular. Los factores de riesgo para enfermedades cardiovasculares incluyen el hábito de fumar, perfiles lipídicos adversos, niveles elevados de lípidos o colesterol, diabetes, hipertensión, estados hipercoagulables, niveles de homocisteína elevados, y falta de ejercicio. Llevar un alelo polimórfico particular es un factor de riesgo para un trastorno cardiovascular particular y está asociado con un mayor riesgo del trastorno particular.
Se entiende que "molécula pequeña", como se usa en la presente memoria, se refiere a una composición que tiene un peso molecular menor de aproximadamente 5 kD y, más preferiblemente, menor de aproximadamente 4 kD. Las moléculas pequeñas pueden ser ácido nucleicos, péptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "hibrida específicamente" o "detecta específicamente" se refiere a la capacidad de una molécula de ácido nucleico de hibridar con al menos aproximadamente 6 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico de una muestra.
"Estenosis", como se entiende en la presente memoria, se refiere a un estrechamiento de una arteria como se ve en un trastorno oclusivo o en una reestenosis. La estenosis puede ir acompañada de síntomas que reflejan una reducción en el flujo sanguíneo pasado el segmento arterial estrechado, en cuyo caso el trastorno que da lugar a la estenosis recibe el nombre de enfermedad (es decir, enfermedad oclusiva o enfermedad de reestenosis). La estenosis puede existir asintomáticamente en un vaso, detectándose únicamente por una intervención de diagnóstico tal como una angiografía o un estudio vascular de laboratorio.
"Secuencia reguladora de la transcripción" es una expresión genérica usada a lo largo de la memoria descriptiva para hacer referencia a secuencias de ADN, tales como señales de iniciación, potenciadores y promotores, que inducen o controlan la transcripción de secuencias codificantes de proteínas con las que están unidas de forma funcional.
El término "tratamiento", como se usa en la presente memoria, pretende incluir la curación así como la mejoría de al menos un síntoma de una enfermedad o al menos una anomalía asociada con un trastorno. El tratamiento de un trastorno cardiovascular puede realizarse por medio de la administración de un agente terapéutico para un trastorno cardiovascular. El tratamiento de un trastorno cardiovascular también puede realizarse modificando factores de riesgo que están relacionados con el trastorno cardiovascular.
Un "plan de tratamiento" se refiere a al menos una intervención emprendida para modificar el efecto de un factor de riesgo sobre un paciente. Un plan de tratamiento para un trastorno o enfermedad cardiovascular puede dirigirse a los factores de riesgo que están relacionados con trastornos o enfermedades cardiovasculares. Un plan de tratamiento puede incluir una intervención que se centra en cambiar el comportamiento de un paciente, tal como dejar de fumar. Un plan de tratamiento puede incluir una intervención en la que un agente terapéutico se administra a un paciente. Como ejemplos, los niveles de colesterol pueden reducirse con una medicación apropiada y la diabetes puede controlarse con insulina. La adicción a la nicotina puede tratarse con medicaciones para el síndrome de abstinencia. Un plan de tratamiento puede incluir una intervención que sea diagnóstica. La presencia del factor de riesgo de hipertensión, por ejemplo, puede dar lugar a una intervención de diagnóstico mediante la cual se determina la etiología de la hipertensión. Después de identificar la razón de la hipertensión, pueden administrarse tratamientos adicionales.
El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico con el que se ha unido. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de realizar una replicación extracromosómica. Son vectores preferidos los capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que se unen. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que se unen de forma funcional se denominan en este documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de "plásmidos", término que se refiere en general a bucles de ADN bicatenario circular que, en su forma de vector no están unidos al cromosoma. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan indistintamente ya que el plásmido es la forma usada más comúnmente de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión que tienen funciones equivalentes y que se conocerán en la técnica posteriormente.
La expresión "alelo de tipo silvestre" se refiere a un alelo de un gen que, cuando está presente en dos copias en un sujeto, produce un fenotipo de tipo silvestre. Puede haber varios alelos de tipo silvestre diferentes de un gen específico, ya que ciertos cambios de nucleótidos en un gen pueden no afectar al fenotipo de un sujeto que tiene dos copias del gen con los cambios de nucleótidos.
4.2 General
Los métodos de la presente invención se basan al menos en parte en el nuevo descubrimiento de que hay una asociación de patrones de alelos en cuatro loci polimórficos en el agrupamiento de genes de IL-1 con trastornos cardiovasculares. Estos patrones se denominan en la presente memoria patrones 1, 2 y 3. El patrón 1 comprende un patrón alélico que incluye el alelo 2 de IL-1A (+4845) o IL-1B (+3954) y el alelo 1 de IL-1B (-511) o IL-1RN (+2018), o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. En una realización preferida, este patrón alélico permite el diagnóstico de un trastorno de placas frágiles. El patrón 2 comprende un patrón alélico que incluye el alelo 2 de IL-1B (-511) o IL-1RN (+2018) y el alelo 1 de IL-1A (+4845) o IL-1B (+3954), o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. Este patrón alélico permite el diagnóstico de un trastorno oclusivo. El patrón 3 comprende un patrón alélico que incluye el alelo 1 de IL-1A (+4845) o el alelo 1 de IL-1B (+3954), y el alelo 1 de IL-1B (-511) o el alelo 1 de IL-1RN (+2018), o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. Este patrón alélico permite el diagnóstico de un trastorno de reestenosis. En un aspecto, la invención describe un método para determinar si un sujeto tiene un trastorno de placas frágiles.
Los genes para IL-1\alpha, IL-1\beta e IL-1RN se localizan en un agrupamiento en el cromosoma 2, como se muestra en la figura 1. Se entiende que ciertos genes en el locus de IL-1 están en desequilibrio de ligamiento, como se muestra en la figura 2. Además, como ilustra la figura 3, pueden identificarse patrones de haplotipos y pueden averiguarse sus frecuencias en poblaciones. Los tres patrones de haplotipos, patrones 1, 2 y 3, pueden definirse por cuatro loci polimórficos en el agrupamiento de genes de IL-1 como se muestra en la tabla 1.
TABLA 1
1
El patrón 1 de haplotipo está asociado con trastornos de placas frágiles. El patrón 2 de haplotipo está asociado con trastornos oclusivos. El patrón 3 de haplotipo está asociado con trastornos de reestenosis. Como se ha descrito anteriormente, como estos alelos están en desequilibrio de ligamiento con otros alelos, la detección de estos otros alelos ligados también puede indicar que el sujeto tiene o está predispuesto al desarrollo de un trastorno cardiovascular.
La placa aterosclerótica que es propensa a una ruptura (placa frágil, como se ve en los trastornos de placas frágiles) tiene ciertas características estructurales, celulares y moleculares. La ruptura de la capa fibrosa que recubre una placa vulnerable es la causa más común de trombosis coronaria. Típicamente, la placa frágil tiene un núcleo lipídico grande y una capa fibrosa fina que a menudo tiene células inflamatorias infiltradas. La naturaleza del lípido que forma el núcleo también es significativa; por ejemplo, los lípidos en forma de éster de colesterol reblandecen la placa y el colesterol cristalino puede tener el efecto opuesto. Además, se observa que un infiltrado de células inflamatorias es un marcador de vulnerabilidad de las placas. Varios factores tales como lipoproteínas oxidadas, agentes infecciosos o autoantígenos, tales como proteínas de choque térmico, pueden incitar una respuesta inflamatoria crónica en una placa aterosclerótica. A esto le sigue la entrada de macrófagos activados y linfocitos T en la placa, con la posterior entrada de citoquinas y proteínas de degradación de la matriz, lo cual conduce al debilitamiento de la estructura de tejido conectivo de la placa. Las metaloproteinasas de matriz y ciertas citoquinas son factores importantes en la patogénesis de la vulnerabilidad de las placas. Después del diagnóstico de un trastorno de placas frágiles, pueden aconsejarse agentes terapéuticos para solucionar características de las placas frágiles tales como las mencionadas
anteriormente.
Se entiende que puede haber una relación entre los efectos de ciertos factores de riesgo en un paciente que padece uno de los trastornos cardiovasculares mencionados anteriormente y el desarrollo de la enfermedad relacionada, y puede haber una relación entre los efectos de los factores de riesgo y la progresión de la enfermedad relacionada. El diagnóstico del patrón de haplotipo subyacente puede guiar al médico para realizar recomendaciones o para diseñar intervenciones para reducir el impacto de los factores de riesgo sobre el trastorno o la enfermedad particular.
Por ejemplo, el patrón de genotipo de IL-1 en un paciente puede estar relacionado con el efecto de los niveles de colesterol total sobre trastornos y enfermedades cardiovasculares. La presencia de un cierto nivel de colesterol en suero en presencia de un cierto patrón de genotipo de IL-1 está asociada con un riesgo determinable estadísticamente de enfermedad oclusiva coronaria y enfermedad de placas frágiles. Estas asociaciones se ilustran esquemáticamente en la figura 9. La figura 10 resume algunos de los datos que confirman las asociaciones. Los datos indican que la presencia del patrón 1, incluso en presencia de bajos niveles de colesterol en suero, es un fuerte agente de predicción del riesgo de acontecimientos del tipo de placas frágiles. También se observan acontecimientos del tipo de placas frágiles en pacientes con el patrón 2, aunque hay una fuerte correlación con el nivel sérico de colesterol. Las asociaciones generales del patrón 2 del genotipo de IL-1 se resumen esquemáticamente en la figura 11.
Usando los métodos y kits descritos en la presente memoria, el patrón del genotipo de IL-1 puede relacionarse con el nivel de Lp(a) en un sujeto para determinar una razón de posibilidades (odds ratio) para una CAD oclusiva. Se entiende que el colesterol se transporta en fluidos corporales en forma de partículas de lipoproteína. El componente proteico de estos agregados tiene capacidades específicas de dirección a las células. Cada partícula de lipoproteína se clasifica por la densidad y contiene 1) una especie principal de lípidos que es núcleo y 2) una apolipoproteína específica que está en la cubierta de la partícula. El LDL, por ejemplo, tiene un núcleo de colesterol con una cubierta de apolipoproteína B-100. La lipoproteína (a) [Lp(a)] es una lipoproteína que contiene LDL y una cadena de proteína que imita al plasminógeno. La Lp(a) parece tener efectos aterogénicos y protrombóticos que interfieren con el plasminógeno y la unión de tPA a fibrina y estimulan la síntesis del inhibidor del activador de plasminógeno (PAI). Ciertos estudios han demostrado una relación entre LP(a) y la arteriopatía coronaria (CAD). Una determinación del patrón del genotipo de IL-2 frente a la concentración de Lp(a) muestra la relación entre la estenosis sintomática de la arteria coronaria y los niveles de Lp(a) en pacientes con el patrón 2, una relación ilustrada en la figura 12. Los pacientes homocigotos para el alelo 2 de IL-B (-511) tienen un riesgo mucho mayor de estenosis sintomática, a pesar de los bajos niveles de Lp(a). La figura 13 muestra la relación entre la elevación de los niveles de LDL y el riesgo de oclusión en las arterias coronarias, lo que indica la interrelación entre el patrón 2 y la elevación de los niveles de lípidos en suero.
\newpage
Los métodos y kits descritos en la presente memoria pueden usarse para relacionar el nivel de proteína C reactiva (CRP) con el patrón de genotipo de IL-1. Se descubrió que más de 50% de los sujetos con el patrón 1 que eran homocigotos para el alelo 2 en IL-1B (+3954) tenían un nivel de CRP mayor de 0,20, mientras que los sujetos con patrón 2 homocigotos para el alelo 1 en IL-1B (+3954) tenían un nivel de CRP mayor de 0,20 sólo aproximadamente 28% del tiempo. Estos datos se ilustran en la figura 14.
\vskip1.000000\baselineskip
4.3 Medicina predictiva 4.3.1. Polimorfismos asociados con trastornos cardiovasculares
La presente invención se basa, al menos en parte, en la identificación de alelos que están asociados (en una medida estadísticamente significativa) con el desarrollo de trastornos cardiovasculares en sujetos. Por lo tanto, la detección de estos alelos, solos o junto con otros medios en un sujeto, indica que el sujeto tiene o está predispuesto al desarrollo de un trastorno cardiovascular. Por ejemplo, como se muestra en los siguientes ejemplos, los alelos polimórficos de IL-1 que están asociados con una propensión al desarrollo de un trastorno de arterias coronarias u otros trastornos vasculares producidos por oclusión vascular incluyen el alelo 2 de IL-1B (-511), el alelo 2 de IL-1RN (VNTR), el alelo 2 de IL-1RN (+2018), el alelo 1 de IL-1A (+4845) o el alelo 1 de IL-1B (+3954) o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente.
La presente invención también describe alelos polimórficos de IL-1 que están asociados con una propensión o un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular producida debido a la ruptura de placas frágiles. Estos incluyen el alelo 2 de IL-1A (+4845), el alelo 2 de IL-1B (+3954), el alelo 1 de IL-1B (-511) y el alelo de IL-1RN (+2018) o un alelo que está en desequilibrio de ligamiento con uno de los alelos mencionados anteriormente. Este patrón también está asociado con un mayor riesgo de desarrollar periodontitis adulta severa.
Por ejemplo, el alelo 2 de IL-1B (-511) y el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) están en desequilibrio de ligamiento entre si y con varios otros polimorfismos de IL-1 que definen el haplotipo de IL-1 (44112332) (Cox, et al. (1998) Am. J. Hum. Genet. 62: 1180-88). Específicamente, el haplotipo de 44112332 comprende el siguiente genotipo:
2
Además, se sabe que el alelo 2 del polimorfismo de IL-1RN (+2018) (Clay et al. (1996) Hum Genet 97: 723-26), también denominado exón 2 (8006) (GenBank:X64532 en 8006) está en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus polimórfico de IL-1RN (VNTR), que a su vez forma parte del haplotipo humano de 44112332. De esta manera, el alelo 2 del locus de IL-1RN (+2018) (es decir C en +2018) es una variante alélica asociada con el haplotipo de 44112332 y por lo tanto proporciona una diana alternativa para el análisis de genotipificación de pronóstico para determinar la probabilidad de un individuo de desarrollar un trastorno vascular. De forma similar, otros tres polimorfismos en un exón alternativo de IL-1RN (exón lic, que produce una forma intracelular del producto génico) también está en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) (Clay et al. (1996) Hum Genet 97: 723-26). Éstos incluyen: el polimorfismo del exón lic (1812) de IL-1RN (GenBank:X77090 en 1812); el polimorfismo del exón lic (1868) de IL-1RN (GenBank:X77090 en 1868); y el polimorfismo del exón lic (1887) de IL-1RN (GenBank:X77090 en 1887). Además, otro polimorfismo en el promotor para la forma intracelular procesada de forma alternativa del gen, el polimorfismo Pic (1731) (GenBank:X77090 en 1731), también está en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus polimórfico de IL-1RN (VNTR) (Clay et al. (1996) Hum Genet 97: 723-26). Las alteraciones de secuencia correspondientes para cada uno de estos loci polimórficos de IL-1RN se muestran a continuación.
3 
\vskip1.000000\baselineskip
Para cada uno de estos loci polimórficos, se ha determinado que la variante de la secuencia del alelo 2 está en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus de IL-1RN (VNTR) (Clay et al. (1996) Hum Genet 97:
723-26).
De forma similar, el 33221461, que está asociado con un mayor riesgo de desarrollar enfermedades de placas frágiles, comprende el siguiente genotipo:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\hskip0.45cm
alelo 1 de +2018 de IL-1RN 
\hskip0.45cm
alelo 2 de +4845 de IL-1A
5 
\vskip1.000000\baselineskip
Puede determinarse el análisis de genotipificación en el marcador -889 de IL-1A, el marcador gaat.p33330 de la región intergénica IL-1B/IL-1RN, el marcador Y31 de la región intergénica IL-1B/IL-1RN, y la presencia del alelo 1 del marcador -899 de IL-1A, el alelo 4 del marcador gaat.p33330 o el alelo 6 del marcador Y31 es indicativa de trastornos cardiovasculares, particularmente de un mayor riesgo de trastornos de placas frágiles. Se entiende que estos trastornos conducen a acontecimientos clínicos por medio de trombosis y embolización. A menudo, el acontecimiento clínico no se anuncia por signos previos de isquemia. La isquemia crónica, como se describe en la presente memoria, está asociada con una enfermedad cardiovascular oclusiva en lugar de con una enfermedad de placas frágiles. La detección precoz de la predisposición a un acontecimiento clínico catastrófico sería una adición significativa al arsenal de diagnóstico actual. Un acontecimiento clínico de placas frágiles en la circulación cerebrovascular puede producir un ictus o CVA bloqueando los vasos cerebrales y provocando una isquemia aguda que puede conducir a un infarto cerebral irreversible. Un acontecimiento clínico de placas frágiles en la circulación del miocardio puede producir un infarto de miocardio bloqueando los vasos coronarios y produciendo una isquemia aguda que puede producir lesiones miocárdicas irreversibles. Un acontecimiento clínico de placas frágiles en la vasculatura periférica no cerebral puede conducir a un inicio repentino de isquemia que conduce a gangrena y pérdida de tejidos. Como estos acontecimientos clínicos de placas frágiles pueden producirse sin advertencia previa, la identificación del genotipo asociado con el mayor riesgo puede llevar a un mayor control clínico en esos sujetos con riesgo, con un diagnóstico anterior y más extensivo o intervenciones terapéuticas. También indican un mayor riesgo del desarrollo de periodontitis adulta severa. La presencia de periodontitis adulta severa es indicativa de un mayor riesgo de enfermedad de placas
frágiles.
Además de los patrones alélicos descritos anteriormente, como se describe en la presente memoria, un especialista en la técnica puede identificar fácilmente otros alelos (incluyendo polimorfismos y mutaciones) que están en desequilibrio de ligamiento con un alelo asociado con un trastorno cardiovascular. Por ejemplo, puede recogerse una muestra de ácido nucleico de un primer grupo de sujetos sin un trastorno cardiovascular, así como ADN de un segundo grupo de sujetos con un trastorno cardiovascular. La muestra de ácido nucleico después puede compararse para identificar los alelos que están sobrerrepresentados en el segundo grupo en comparación con el primer grupo, donde dichos alelos supuestamente están asociados con un trastorno cardiovascular. Como alternativa, pueden identificarse alelos que están en desequilibrio de ligamiento con un alelo asociado con un trastorno cardiovascular, por ejemplo, por medio de la genotipificación de una población grande y la realización de análisis estadísticos para determinar los alelos que aparecen más comúnmente juntos de lo que era de esperar. Preferiblemente, se elige el grupo para que esté compuesto de individuos genéticamente relacionados. Los individuos genéticamente relacionados incluyen individuos de la misma raza, el mismo grupo étnico o incluso la misma familia. Según aumenta el grado de relación genética entre un grupo de control y un grupo de ensayo, también lo hace el valor predictivo de alelos polimórficos que están asociados incluso más distantemente con un alelo causante de una enfermedad. Esto se debe a que ha pasado menos tiempo evolutivo para permitir que polimorfismos que están asociados a lo largo de un cromosoma en una población fundadora se redistribuyan a través de acontecimientos de cruces genéticos. De esta manera pueden crearse ensayos de genotipificación de diagnóstico con especificidad de raza, especificidad étnica e incluso especificidad de familia para permitir la detección de alelos de enfermedad que se producen en tiempos incluso más recientes en la evolución humana, por ejemplo, después de la divergencia de las razas humanas principales, después de la separación de poblaciones humanas en grupos étnicos distintos e incluso dentro de la historia reciente de una línea familiar particular.
El desequilibrio de ligamiento entre dos marcadores polimórficos o entre un marcador polimórfico y una mutación causante de una enfermedad es un estado metaestable. En ausencia de presión selectiva o reaparición asociada esporádica de acontecimientos mutacionales subyacentes, los polimorfismos finalmente estarán desasociados por acontecimientos de recombinación cromosómica y, por lo tanto, alcanzarán un equilibrio de ligamiento a lo largo del transcurso de la evolución humana. De esta manera, la probabilidad de encontrar un alelo polimórfico en desequilibrio de ligamiento con una enfermedad o afección puede aumentar con cambios en al menos dos factores: reducción de la distancia física entre el marcador polimórfico y la mutación causante de la enfermedad y reducción del número de generaciones meióticas disponibles para la disociación del par ligado. La consideración de este último factor sugiere que, cuanto más relacionados están dos individuos, más probabilidad tendrán de compartir un cromosoma o región cromosómica parental común que contiene los polimorfismos ligados y menos probabilidad habrá de que este para ligado se desligue por medio de acontecimientos de cruces meióticos que se producen en cada generación. Como resultado, cuanto más relacionados están dos individuos, más probabilidad hay de que puedan heredarse conjuntamente polimorfismos ampliamente separados. De esta manera, para individuos relacionados por raza, etnicidad o familia común, podemos basarnos en la fiabilidad de loci polimórficos separados incluso más distantemente como indicador de la herencia de una mutación causante de una enfermedad asociada.
Los oligonucleótidos descritos en la presente memoria pueden usarse para la amplificación de la región de interés o para la hibridación directa de oligonucleótidos con especificidad de alelo (ASO) a los marcadores en cuestión. De esta manera, los oligonucleótidos pueden flanquear el marcador de interés (como se requiere para la amplificación por PCR) o solapar directamente con el marcador (como en hibridación ASO). Los ejemplos de cebadores apropiados para uso en los métodos de detección descritos anteriormente incluyen:
5'-CTCAGCAACACTCCTAT-3' (SEC ID Nº 1);
5'-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3' (SEC ID Nº 2);
que pueden usarse para amplificar y tipificar el locus polimórfico de IL-1RN (VNTR) humano;
5'-CTA TCT GAG GAA CAA CCA ACT AGT AGC-3' (SEC ID Nº 3);
5'-TAG GAC ATT GCA CCT AGG GTT TGT-3' (SEC ID Nº4);
que pueden usarse para amplificar y tipificar el locus polimórfico de IL-1RN (+2018) humano;
5' TGGCATTGATCTGGTTCATC 3' (SEC ID Nº: 5);
5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3' (SEC ID Nº: 6);
que pueden usarse para amplificar y tipificar el locus polimórfico de IL-1B (-511) humano;
5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3' (SEC ID Nº: 7);
5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3' (SEC ID Nº: 8)
que pueden usarse para amplificar y tipificar el locus polimórfico de IL-1B (+3954) humano y
5' ATG GTT TTA GAA ATC ATC AAG CCT AGG GCA 3' (SEC ID Nº: 9)
3' AAT GAA AGG AGG GGA GGA TGA CAG AAA TGT 3' (SEC ID Nº: 10)
que pueden usarse para amplificar y tipificar el locus polimórfico de IL-1A (+4845).
Pueden diseñarse sondas apropiadas para hibridar con un gen específico del locus de IL-1, tal como IL-1A, IL-1B o IL-1RN o un gen relacionado. Como alternativa, estas sondas pueden incorporar otras regiones del locus genómico relevante, incluyendo secuencias intergénicas. De hecho, la región de IL-1 del cromosoma 2 humano incluye unos 400.000 pares de bases y, asumiendo una media de un polimorfismo de un solo nucleótido cada 1.000 pares de bases, incluye unos 400 loci de SNP individuales. Se pueden obtener otros polimorfismos disponibles para uso con la presente invención a partir de diversas fuentes públicas. Por ejemplo, la base de datos del genoma humano recoge SNP intragénicos, se puede buscar por secuencia y actualmente contiene aproximadamente 2.700 entradas (http://hgbase.interactiva.de). También se dispone de una base de datos de polimorfismos humanos mantenida por el Massachusetts Institute of Technology (base de datos MIT SNP (http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/
index.html)). A partir de estas fuentes pueden encontrarse SNP así como otros polimorfismos humanos.
Por ejemplo, el examen de la región de IL-1 del genoma humano en una cualquiera de estas bases de datos revela que los genes del locus de IL-1 están flanqueados por un marcador polimórfico proximal al centrómero denominado marcador microsatélite AFM220ze3 en 127,4 cM (centiMorgans) (véase GenBank número de acceso Z17008) y un marcador polimórfico distal denominado marcador de anclaje microsatélite AFM087xa1 a 127,9 cM (véase GenBank número de acceso Z16545). Estos loci polimórficos humanos son polimorfismos de microsatélite de repetición dinucleotídicos CA y, como tales, muestran un alto grado de heterocigosidad en poblaciones humanas. Por ejemplo, un alelo de AFM220ze3 genera un producto de amplificación de PCR de 211 pb con un cebador 5' de la secuencia TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC (SEC ID Nº 14) y un cebador 3' de la secuencia TGGCCTCCAGAAACCTCCAA (SEC ID Nº 15). Además, un alelo de AFM087xa1 general un producto de amplificación de PCR de 177 pb con un cebador 5' de la secuencia GCTGATATTCTGGTGGGAAA (SEC ID Nº 16) y un cebador 3' de la secuencia GGCAAGAGCAAAACTCTGTC (SEC ID Nº 17). Para el especialista en la técnica serán evidentes cebadores equivalentes correspondientes a secuencias únicas que aparecen en posición 5' y 3' con respecto a estos polimorfismos de repetición dinucleotídicos de CA del cromosoma 2 humano. Los cebadores equivalentes razonables incluyen los que hibridan dentro de aproximadamente 1 kb del cebador designado, y que además están en cualquier sitio desde aproximadamente 17 pb a aproximadamente 27 pb de longitud. Una pauta general para diseñar cebadores para la amplificación de secuencias genómicas cromosómicas humanas únicas es que poseen una temperatura de fusión de al menos aproximadamente 50ºC, pudiéndose estimar la temperatura de fusión aproximada usando la fórmula T_{fusión}=[2 x (nº de A o T) + 4 x (nº de G o C)].
Entre estos dos polimorfismos de repetición dinucleotídicos de CA existen varios loci polimórficos humanos distintos y proporcionan dianas adicionales para la determinación de un alelo de pronóstico de un trastorno cardiovascular en una familia u otro grupo de individuos relacionados genéticamente. Por ejemplo, la página web del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/) indica varios marcadores de polimorfismo en la región del locus de IL-1 y proporciona pautas para diseñar cebadores apropiados para la amplificación y análisis de estos marcadores.
Por consiguiente, los segmentos de nucleótidos descritos en la presente memoria pueden usarse por su capacidad de formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios del cromosoma humano 2 q 12-13 o ADNc de esa región para proporcionar cebadores para la amplificación de ADN o ADNc a partir de esta región. El diseño de sondas apropiadas para este fin requiere la consideración de varios factores. Por ejemplo, los fragmentos que tienen una longitud comprendida entre 10, 15 ó 18 nucleótidos y aproximadamente 20 o aproximadamente 30 nucleótidos encontrarán una utilidad particular. Son incluso más preferidas para ciertas realizaciones secuencias mayores, por ejemplo, de 40, 50, 80, 90, 100 o incluso de hasta longitud completa. Las longitudes de oligonucleótidos de al menos aproximadamente 18 a 20 nucleótidos están bien aceptadas por los especialistas en la técnica como suficientes para permitir una hibridación suficientemente específica para ser útil como sonda molecular. Además, dependiendo de la aplicación prevista, se deseará emplear condiciones de hibridación variables para conseguir diversos grados de selectividad de sonda hacia la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren alta selectividad, típicamente se deseará emplear condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos. Por ejemplo, son útiles condiciones de concentración de sal relativamente baja y/o temperatura alta, tales como las proporcionadas por NaCl 0,02 M-0,15 M a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Estas condiciones selectivas pueden tolerar pocos desacoplamientos, si toleran alguno, entre la sonda y la plantilla o cadena diana.
En un sujeto pueden detectarse o controlarse otros alelos u otros indicios de trastorno vascular junto con la detección de los alelos descritos anteriormente, por ejemplo, la identificación de un engrosamiento de la pared de un vaso (por ejemplo, medido por ultrasonidos) o si el sujeto fuma, bebe, tiene sobrepeso o está sometido a estrés, tiene niveles elevados de colesterol o tiene niveles bajos de colesterol, tiene niveles elevados de Lp(a) o realiza ejercicio.
4.3.2 Detección de alelos
Se dispone de muchos métodos para detectar alelos específicos en loci polimórficos humanos. El método preferido para detectar un alelo polimórfico específico dependerá, en parte, de la naturaleza molecular del polimorfismo. Por ejemplo, las diversas formas alélicas del locus polimórfico pueden diferir por un solo par de bases del ADN. Estos polimorfismos de un solo nucleótido (o SNP) son los contribuyentes principales a la variación genética, comprendiendo algunos 80% de todos los polimorfismos conocidos, y se estima que su densidad en el genoma humano es, en promedio, de 1 por 1.000 pares de bases. Los SNP son la mayoría de las veces bialélicos, produciéndose únicamente en dos formas diferentes (aunque teóricamente son posibles hasta cuatro formas diferentes de un SNP, correspondientes a las cuatro bases de nucleótidos diferentes que aparecen en el ADN). Sin embargo, los SNP son mutacionalmente más estables que otros polimorfismos, haciendo que sean adecuados para estudios de asociación en los que se usa un desequilibrio de ligamiento entre marcadores y una variante desconocida para localizar mutaciones causantes de enfermedades. Además, como los SNP típicamente tienen sólo dos alelos, pueden genotipificarse por un ensayo sencillo más/menos en lugar de una medición de la longitud, lo cual hace que sean más susceptibles de automatización.
Se dispone de una diversidad de métodos para detectar la presencia de un alelo polimórfico de un solo nucleótido particular en un individuo. Los avances en este campo han proporcionado una genotipificación de SNP a gran escala precisa, fácil y barata. Más recientemente, por ejemplo, se han descrito varias técnicas nuevas incluyendo hibridación dinámica con especificidad de alelo (DASH), electroforesis en gel diagonal con matriz en microplacas (MADGE), pirosecuenciación, ligamiento con especificidad de oligonucleótido, el sistema TaqMan, así como diversas tecnologías de "chip" de ADN tales como los chips de SNP Affymetrix. Estos métodos requieren la amplificación de la región genética diana, típicamente por PCR. Otros métodos recién desarrollados, basados en la generación de moléculas señal pequeñas por escisión invasiva seguida de espectrometría de masas o sondas padlock inmovilizadas y amplificación por círculo rodante podrían eliminar finalmente la necesidad de PCR. Varios de los métodos conocidos en la técnica para detectar polimorfismos de un solo nucleótido específicos se resumen más adelante. Se entiende que el método de la presente invención incluye todos los métodos disponibles.
Se han creado varios métodos para facilitar el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido. En una realización, el polimorfismo de una sola base puede detectarse usando un nucleótido resistente a exonucleasas especializado, como se describe, por ejemplo, en Mundy, C.R. (Patente de Estados Unidos número 4.656.127). De acuerdo con el método, un cebador complementario a la secuencia alélica inmediatamente 3' al sitio polimórfico se deja hibridar con una molécula diana obtenida a partir de un animal o humano particular. Si el sitio polimórfico en la molécula diana contiene un nucleótido que es complementario al derivado de nucleótido resistente a una exonucleasa particular presente, entonces ese derivado se incorporará en el extremo del cebador hibridado. Esta incorporación hace que el cebador sea resistente a la exonucleasa y de esta manera permite su detección. Como se conoce la identidad del derivado resistente a la exonucleasa de la muestra, el descubrimiento de que el cebador se ha vuelto resistente a exonucleasas revela que el nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana era complementario al del derivado nucleotídico usado en la reacción. Este método tiene la ventaja de que no requiere la determinación de grandes cantidades de datos de secuencia extraños.
En otra realización de la invención, se usa un método basado en solución para determinar la identidad del nucleótido de un sitio polimórfico. Cohen, D. et al. (Patente francesa 2.650.840; solicitud PCT número WO91/02087). Como en el método de Mundy de la Patente de Estados Unidos número 4.656.127, se emplea un cebador que es complementario a secuencias alélicas inmediatamente 3' a un sitio polimórfico. El método determina la identidad del nucleótido de ese sitio usando derivados didesoxinucleotídicos marcados que, si son complementarios al nucleótido del sitio polimórfico, se incorporarán en el extremo del cebador.
Goelet, P. et. al. (solicitud PCT número 92/15712) describen un método alternativo, conocido como Genetic Bit Analysis o GBA^{TM}. El método de Goelet, P. et. al. usa mezclas de terminadores marcados y un cebador que es complementario a la secuencia 3' con respecto a un sitio polimórfico. El terminador marcado que se incorpora de esta manera se determina por y es complementario al nucleótido presente en el sitio polimórfico de la molécula diana que se está evaluando. A diferencia del método de Cohen et al. (Patente francesa 2.650.840; solicitud PCT número WO91/02087) el método de Goelet, P. et al. preferiblemente es un ensayo en fase heterogénea, en el que el cebador o la molécula diana se inmoviliza en una fase sólida.
Recientemente se han descrito varios procedimientos de incorporación de nucleótidos guiados por cebador para ensayar sitios polimórficos en el ADN (Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B.P., Nucl. Acids. Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A. -C., et al., Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). Estos métodos difieren del GBA^{TM} ya que se basan en la incorporación de desoxinucleótidos marcados para discriminar entre bases en un sitio polimórfico. En dicho formato, como la señal es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados, los polimorfismos que se producen en procesos del mismo nucleótido pueden producir señales que son proporcionales a la longitud del ensayo (Syvanen, A. -C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).
Para mutaciones que producen la terminación prematura de la traducción de la proteína, el ensayo de truncamiento de proteínas (PTT) ofrece una estrategia de diagnóstico eficaz (Roest, et. al., (1993) Hum. Mol. Genet. 2:1719-21; van der Luijt, et. al., (1994) Genomics 20:1-4). En el caso del PTT, se aísla inicialmente ARN a partir del tejido disponible y se transcribe de forma inversa, y el segmento de interés se amplifica por PCR. Los productos de la PCR de transcripción inversa después se usan como plantilla para la amplificación por PCR anidada con un cebador que contiene un promotor de la ARN polimerasa y una secuencia para iniciar la traducción eucariótica. Después de la amplificación de la región de interés, los motivos únicos incorporados en el cebador permiten la transcripción secuencial in vitro y la traducción de los productos de PCR. Después de la electroforesis en dodecil sulfato sódico-poliacrilamida de los productos de traducción, la aparición de polipéptidos truncados señala la presencia de una mutación que ocasiona la terminación prematura de la traducción. En una variación de esta técnica, se usa ADN (en lugar de ARN) como plantilla de PCR cuando la región diana de interés procede de un solo exón.
Puede utilizarse cualquier tipo celular o tejido para obtener muestras de ácido nucleico para uso en los diagnósticos descritos en la presente memoria. En una realización preferida, la muestra de ADN se obtiene a partir de un fluido corporal, por ejemplo sangre, obtenida por técnicas conocidas (por ejemplo, punción venosa) o saliva. Como alternativa, pueden realizarse ensayos de ácido nucleico en muestras secas (por ejemplo de cabello o piel). Cuando se usa ARN o proteínas, las células o tejidos que pueden utilizarse deben expresar un gen de IL-1.
También pueden realizarse procedimientos de diagnóstico in situ directamente sobre secciones tisulares (fijadas y/o congeladas) de tejido de pacientes obtenido a partir de biopsias o resecciones, de tal forma que no sea necesaria la purificación de ácidos nucleicos. Pueden usarse reactivos de ácido nucleico como sondas y/o cebadores para estos procedimientos in situ (véase, por ejemplo, Nuovo, G.J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY).
Además de los métodos que se centran principalmente en la detección de una secuencia de ácido nucleico, también pueden evaluarse perfiles en estos esquemas de detección. Pueden generarse perfiles de huellas digitales, por ejemplo, utilizando un procedimiento de presentación diferencial, análisis de Northern y/o RT-PCR.
Un método de detección preferido es la hibridación con especificidad de alelo usando sondas que solapan con una región de al menos un alelo de un haplotipo proinflamatorio de IL-1 y que tienen aproximadamente 5, 10, 20, 25 ó 30 nucleótidos alrededor de la mutación o región polimórfica. En una realización preferida de la invención, varias sondas capaces de hibridar específicamente con otras variantes alélicas implicadas en un trastorno cardiovascular se unen a un soporte en fase sólida, por ejemplo, un "chip" (que puede albergar aproximadamente 250.000 oligonucleótidos). Los oligonucleótidos pueden unirse a un soporte sólido por una diversidad de procesos, incluyendo litografía. El análisis de detección de mutación usando estos chips que comprenden oligonucleótidos, también denominados "matrices de sondas de ADN" se describe, por ejemplo, en Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244. En una realización, un chip comprende todas las variantes alélicas de al menos una región polimórfica de un gen. El soporte en fase sólida después se pone en contacto con un ácido nucleico de ensayo y se detecta la hibridación con las sondas específicas. Por consiguiente, puede identificarse la identidad de numerosas variantes alélicas de uno o más genes en un experimento de hibridación sencillo.
Estas técnicas también pueden comprender la etapa de amplificar el ácido nucleico antes del análisis. Los especialistas en la técnica conocen técnicas de amplificación e incluyen, pero sin limitación, clonación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa de alelos específicos (ASA), reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción en cadena de la polimerasa anidada, replicación de secuencias autosostenida (Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), y Q-beta replicasa (Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology 6:1197).
Los productos de amplificación pueden ensayarse en una diversidad de formas, incluyendo análisis por tamaños, digestión de restricción seguida de análisis por tamaños, detección de cebadores oligonucleotídicos marcados específicos en los productos de reacción, hibridación de oligonucleótidos con especificidad de alelo (ASO), detección de 5' exonucleasa con especificidad de alelo, secuenciación, hibridación y similares.
Los medios de detección basados en PCR pueden incluir amplificación múltiple de una pluralidad de marcadores de forma simultánea. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica seleccionar cebadores de PCR para generar productos de PCR que no solapan en tamaño y pueden analizarse simultáneamente. Como alternativa, es posible amplificar diferentes marcadores con cebadores que están marcados de forma diferente y, por lo tanto, pueden detectarse de forma diferencial. Por supuesto, los medios de detección basados en hibridación permiten la detección diferencial de múltiples productos de PCR en una muestra. En la técnica se conocen otros métodos que permiten múltiples análisis de una pluralidad de marcadores.
En una realización meramente ilustrativa, el método incluye las etapas (i) recoger una muestra de células a partir de un paciente, (ii) aislar ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) a partir de las células de la muestra, (iii) poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que hibridan específicamente en posición 5' y 3' con al menos un alelo de un haplotipo proinflamatorio de IL-1 en condiciones tales que se produzca la hibridación y amplificación del alelo, y (iv) detectar el producto de amplificación. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si estas moléculas están presentes en números muy bajos.
En una realización preferida del presente ensayo, el alelo de un haplotipo proinflamatorio de IL-1 se identifica por alteraciones en patrones de escisión de enzimas de restricción. Por ejemplo, se aísla ADN de la muestra y de control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción y se determinan los tamaños de longitudes de los fragmentos por electroforesis en gel.
En otra realización, puede usarse cualquiera de una diversidad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente el alelo. Los ejemplos de reacciones de secuenciación incluyen los basados en técnicas desarrolladas por Maxam y Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci USA 74:560) o Sanger (Sanger et al., (1977) Proc. Nat. Acad. Sci USA 74:5463). También se contempla que puede utilizarse cualquiera de una diversidad de procedimientos de secuenciación automática cuando se realizan los ensayos de la presente invención (véase, por ejemplo Biotechniques (1995) 19:448), incluyendo la secuenciación por espectrometría de masas (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO94/16101; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36:127-162; y Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147-159). Será evidente para un especialista en la técnica que, para ciertas realizaciones, necesita determinarse la aparición de sólo una, dos o tres de las bases de ácido nucleico en la reacción de secuenciación. Por ejemplo, puede realizarse la técnica "A-track" o similar, por ejemplo, cuando sólo se detecta un ácido nucleico.
En otra realización, puede usarse protección frente a agentes de escisión (tales como una nucleasa, hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina) para detectar bases desacopladas en heterodúplex de ARN/ARN o ARN/ADN o ADN/ADN (Myers, et al. (1985) Science 230:1242). En general, la técnica de este campo de "escisión de desacoplamiento" empieza proporcionando heterodúplex formados por hibridación de ARN o ADN (marcados) que contienen el alelo de tipo silvestre con la muestra. Los dúplex bicatenarios se tratan con un agente que escinde regiones monocatenarias de los dúplex tal como los que existirán debido a los desacoplamientos de pares de bases entre las cadenas de control y de muestra. Por ejemplo, pueden tratarse dúplex de ARN/ADN con RNasa y los híbridos de ADN/ADN pueden tratarse con la nucleasa S1 para digerir enzimáticamente las regiones desacopladas. En otras realizaciones, pueden tratarse dúplex de ADN/ADN o ARN/ADN con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina para digerir regiones desacopladas. Después de la digestión de las regiones desacopladas, el material resultante se separa por tamaños o geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el sitio de mutación. Véase, por ejemplo, Cotton et al (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; y Saleeba et al (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. En una realización preferida, el ADN o ARN de control puede marcarse para la detección.
En otra realización, la reacción de escisión de desacoplamiento emplea una o más proteínas que reconocen pares de bases desacoplados en el ADN bicatenario (también denominadas enzimas de "reparación de desacoplamientos de ADN"). Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde la A en desacoplamientos G/A y la timidina ADN glicosilasa de las células HeLa escinde la T en desacoplamientos G/T (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). De acuerdo con una realización ilustrativa, una sonda basada en un alelo de un haplotipo del locus de IL-1 se hibrida con un ADNc u otro producto de ADN procedente de una o más células de ensayo. El dúplex se trata con una enzima de reparación de desacoplamientos de ADN y los productos de escisión, si los hay, pueden detectarse por protocolos de electroforesis o similares. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos número 5.459.039.
En otras realizaciones, se usarán alteraciones en la movilidad electroforética para identificar un alelo del locus de IL-1. Por ejemplo, puede usarse un polimorfismo de conformación de una sola cadena (SSCP) para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y de tipo silvestre (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766, véase también Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; y Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). Se desnaturalizan fragmentos de ADN monocatenarios de alelos del locus de IL-1 de muestra y de control y se dejan renaturalizar. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos monocatenarios varía de acuerdo con la secuencia, la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección de incluso un cambio en una sola base. Los fragmentos de ADN pueden marcarse o detectarse con sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede mejorarse usando ARN (en lugar de ADN) en el que la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida, el método de la presente invención utiliza un análisis de heterodúplex para separar moléculas heterodúplex bicatenarias basándose en cambios en la movilidad electroforética (Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).
En otra realización, el movimiento de alelos en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalizante se ensaya usando electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Cuando se usa DGGE como método de análisis, el ADN se modificará para asegurar que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo, añadiendo una abrazadera de GC de aproximadamente 40 pb de ADN rico en GC de alta fusión por PCR. En otra realización, se usa un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente de agente desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad del ADN de control y de muestra (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).
Los ejemplos de otras técnicas para detectar alelos incluyen, pero sin limitación, hibridación selectiva de oligonucleótidos, amplificación selectiva o extensión selectiva de cebadores. Por ejemplo, pueden prepararse cebadores oligonucleotídicos en los que la mutación o diferencia de nucleótidos conocida (por ejemplo, en variantes alélicas) se coloca centralmente y después se hibrida con un ADN diana en condiciones que permiten la hibridación únicamente si se encuentra un acoplamiento perfecto (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6230). Estas técnicas de hibridación de oligonucleótidos con especificidad de alelo pueden usarse para ensayar una mutación o región polimórfica por reacción cuando los oligonucleótidos se hibridan con ADN diana amplificado por PCR o varias mutaciones o regiones polimórficas diferentes cuando los oligonucleótidos se unen a la membrana de hibridación y se hibridan con el ADN diana marcado.
Como alternativa, puede usarse una tecnología de amplificación con especificidad de alelo que depende de la amplificación selectiva por PCR junto con la presente invención. Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación específica pueden llevar la mutación o la región polimórfica de interés en el centro de la molécula (de forma que la amplificación depende de la hibridación diferencial) (Gibbs et al (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) o en el extremo 3' de un cebador donde, en condiciones apropiadas, un desacoplamiento puede prevenir o reducir la extensión con la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Además, puede ser deseable introducir un nuevo sitio de restricción en la región de la mutación para crear una detección basada en la escisión (Gasparini et al (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Se prevé que en ciertas realizaciones la amplificación también puede realizarse usando Taq ligasa para la amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). En estos casos, sólo se producirá ligamiento si hay un acoplamiento perfecto en el extremo 3' de la secuencia 5' que hace posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de amplificación.
En otra realización, la identificación de la variante alélica se realiza usando un ensayo de ligamiento de oligonucleótidos (OLA), como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos número 4.998.617 y en Landegren, U. et al. ((1988) Science 241:1077-1080). El protocolo OLA usa dos oligonucleótidos que están diseñados para ser capaces de hibridar con secuencias contiguas de una sola cadena de una diana. Uno de los oligonucleótidos se une a un marcador de separación, por ejemplo, biotinilado y el otro se marca de forma detectable. Si la secuencia complementaria precisa se encuentra en una molécula diana, los oligonucleótidos hibridarán de tal forma que sus extremos estén contiguos y se crea un sustrato de ligamiento. El ligamiento después permite que el oligonucleótido marcado se recupere usando avidina u otro ligando de biotina. Nickerson, D. A. et al. han descrito un ensayo de detección de ácidos nucleicos que combina atributos de PCR y OLA (Nickerson, D. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-27). En este método, se usa PCR para conseguir la amplificación exponencial del ADN diana, que después se detecta usando OLA.
Se han creado varias técnicas basadas en este método OLA y pueden usarse para detectar alelos de un haplotipo del locus de IL-1. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos número 5.593.826 describe un OLA que usa un oligonucleótido que tiene un grupo amino 3' y un oligonucleótido fosforilado 5' para formar un conjugado que tiene un enlace fosforamidato. En otra variación de OLA descrita en Tobe et al. ((1996) Nucleic Acids Res 24: 3728), OLA combinado con PCR permite la tipificación de dos alelos en un solo pocillo de microtitulación. Marcando cada uno de los cebadores con especificidad de alelo con un solo hapteno, es decir digoxigenina y fluoresceína, cada reacción de OLA puede detectarse usando anticuerpos con especificidad de hapteno que están marcados con diferentes indicadores enzimáticos, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. Este sistema permite la detección de los dos alelos usando un formato de alto rendimiento que conduce a la producción de dos colores diferentes.
También se describen kits para detectar una predisposición a desarrollar un trastorno cardiovascular, debido a la oclusión de una arteria o debido a la formación de placas frágiles, o debido a la formación de reestenosis. Este kit puede contener uno o más oligonucleótidos, incluyendo oligonucleótidos 5' y 3' que hibridan en posición 5' y 3' con al menos una alelo de un haplotipo del locus de IL-1. Los oligonucleótidos de amplificación de PCR deben hibridar dejando una distancia comprendida entre 25 y 2.500 pares de bases, preferiblemente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 500 bases, para producir un producto de PCR de tamaño conveniente para el análisis posterior.
Los cebadores particularmente preferidos para uso en el método de diagnóstico de la invención incluyen las SEC ID Nº 7-10.
El diseño de oligonucleótidos adicionales para uso en la amplificación y detección de alelos polimórficos de IL-1 por el método de la invención se facilita por la disponibilidad de información de secuencia actualizada del cromosoma 2q13 humano - que contiene el locus de IL-1 humana, e información actualizada de polimorfismos humanos disponibles para este locus. Pueden diseñarse fácilmente cebadores adecuados para la detección de un polimorfismo humano en estos genes usando esta información de secuencia y técnicas convencionales conocidas en este campo para el diseño y optimización de secuencias de cebadores. El diseño óptimo de estas secuencias de cebadores puede conseguirse, por ejemplo, por medio del uso de programas de selección de cebadores disponibles en el mercado tales como Primer 2.1, Primer 3 o GeneFisher (véase también Nicklin M.H.J., Weith A. Duff G.W., "A Physical Map of the Region Encompassing the Human Interleukin-1\alpha, interleukin-1\beta, and Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes" Genomics 19: 382 (1995); Nothwang H.G., et al. "Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Map in the Region of Chromosome 2q13" Genomics 41: 370 (1997); Clark, et al. (1986) Nucl. Acids. Res., 14: 7897-7914 [aparecen erratas publicadas en Nucleic Acids Res., 15:868 (1987) y el proyecto Genome Database (GDB) en la URL http://www.gdb.org).
Para uso en un kit, los oligonucleótidos pueden ser de una diversidad de composiciones naturales y/o sintéticas tales como oligonucleótidos sintéticos, fragmentos de restricción, ADNc, ácidos peptidonucleicos (PNA) sintéticos y similares. El kit y método de ensayo también puede emplear oligonucleótidos marcados para facilitar la identificación en los ensayos. Los ejemplos de marcadores que pueden emplearse incluye radiomarcadores, enzimas, compuestos fluorescentes, estreptavidina, avidina, biotina, restos magnéticos, restos de unión a metales, restos de antígeno o anticuerpo y similares.
Opcionalmente, el kit también puede incluir un medio de muestreo de ADN. Los medios de muestreo de ADN son bien conocidos por un especialista en la técnica y pueden incluir, pero sin limitación, sustratos, tales como papeles de filtro, el AmpliCard^{TM} (University of Sheffield, Sheffield, England S10 2JF; Tarlow, JW, et al., J. of Invest Dermatol. 103:387-389 (1994)) y similares; reactivos de purificación de ADN tales como kits Nucleon^{TM}, tampones de lisis, soluciones de proteinasa y similares; reactivos de PCR tales como tampones de reacción 10x, polimerasa termoestable, dNTP y similares; y medios de detección de alelos tales como la enzima de restricción HinfI, oligonucleótidos con especificidad de alelo y cebadores oligonucleotídicos degenerados para PCR anidada procedentes de sangre seca.
4.3.3. Farmacogenómica
El conocimiento de los alelos particulares asociados con la susceptibilidad de desarrollar un trastorno cardiovascular, solo o junto con la información sobre otros defectos genéticos que contribuyen a un trastorno cardiovascular, permite una personalización de la prevención o tratamiento de acuerdo con el perfil genético individual, el objetivo de la "farmacogenómica".
Una estrategia para la prevención y tratamiento de una enfermedad cardiovascular se refiere a la identificación de factores de riesgo para la enfermedad particular.
Por ejemplo, los sujetos que tienen un alelo 2 de cualquiera de los siguientes marcadores: IL-1A +4845 o IL-1B (+3954), o el alelo 1 de los siguientes marcadores: IL-1B (-511) o IL-RN (+2018) o cualquier secuencia de ácido nucleico en desequilibrio de ligamiento con cualquiera de estos alelos, pueden tener o estar predispuestos a desarrollar un trastorno cardiovascular caracterizado por la formación de placas frágiles, pueden estar predispuestos a un mayor riesgo de infarto de miocardio, ictus, bloqueo vascular periférico agudo y formación de aneurismas en arterias de intermedias a grandes. Estos pacientes también están predispuestos a desarrollar periodontitis adulta severa.
Otra estrategia para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares se refiere a la interferencia con la progresión del trastorno subyacente, la mejoría de los síntomas y signos de la enfermedad o la protección de un tejido diana de forma que la presencia de un trastorno cardiovascular que afecta a la circulación del tejido no ocasione el desarrollo de síntomas y signos clínico relacionados con ese tejido diana.
Como ejemplo, ciertos fármacos tienen un efecto estabilizador sobre placas arteroscleróticas u otros efectos beneficiosos sobre las secuelas de la enfermedad de placas frágiles. Como ejemplo, los bloqueantes de los receptores \beta adrenérgicos reducen la reaparición de infarto de miocardio, los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina reducen la incidencia de infarto de miocardio, ciertos antibióticos y antioxidantes también han demostrado ser eficaces en la estabilización de las placas. Ciertos fármacos que tienen la capacidad de reducir los lípidos, tales como inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa (estatinas) también son importantes. Basándose en la descripción del genotipo de IL-1 de patrón 1 descrito en la presente memoria, estos pacientes pueden responder mejor a agentes terapéuticos destinados a la estabilización de las placas en lugar de utilizar una revascularización u otra técnica invasiva.
A nivel celular, la reducción del colesterol en suero conduce a una reducción en las células inflamatorias dentro de las placas arteroscleróticas. A nivel molecular, se ha demostrado que la reducción de lípidos reduce la actividad metaloproteinasa en estas placas.
Pueden usarse técnicas tales como terapia génica para estabilizar placas vulnerables, por ejemplo, esto podría incluir la sobreexpresión de inhibidores tisulares de metaloproteinasas de matriz y métodos antisentido para bloquear moléculas proinflamatorias.
Por otra parte, los sujetos que tienen un alelo 1 de cualquiera de los siguientes marcadores: IL-1A +4845 o IL-1B (+3954), o el alelo 2 de los siguientes marcadores: IL-1B (-511) o IL-1RN (+2018) pueden responder mejor a métodos particulares tales como revascularización, o los métodos que alteran la progresión del engrosamiento de la capa íntima-media arterial.
Otra estrategia más para el tratamiento de trastornos y enfermedades cardiovasculares comprende el tratamiento de afecciones que aumentan el riesgo de trastornos cardiovasculares.
Los factores asociados con la progresión de la aterosclerosis incluyen diabetes mellitus, hipertensión, hipercolesterolemia, altos niveles de lipoproteína a, obesidad y hábito de fumar. De éstos, los factores susceptibles de intervención farmacológica incluyen: i) diabetes, ii) hipertensión y iii) dislipidemias. Los ejemplos de fármacos reductores de lípidos incluyen: resinas de intercambio aniónico tales como colestiramina, colestipol; inhibidores de la HMG CoA reductasa o (estatinas) tales como simvastatina, pracastatina, cerivastatina, fluvastatina, atorvastatina, lovastatina; fibratos tales como fenofibrato, bezafibrato, gemfibrozil, clofibrato, ciprofibrato; ácido nicotínico y análogos: acipimox, nicofuranosa; Probucol que aumenta la eliminación de LDL no mediada por receptor y reduce la oxidación de LDL; aceites de pescado tales como maxepa, omacor; e inhibidores de la absorción de colesterol tales como pamaqueside y tiqueiside.
Por consiguiente, pueden desarrollarse agentes terapéuticos que se dirijan a la base molecular particular de la enfermedad en el sujeto basándose en dicho análisis del genotipo. De esta manera, la comparación del perfil de IL-1 de un individuo con el perfil de la población para un trastorno cardiovascular permite la selección o diseño de fármacos u otros regimenes terapéuticos que se consideren seguros y eficaces para un paciente o población de pacientes particular (es decir, un grupo de pacientes que tienen la misma alteración genética).
Además, la capacidad de poblaciones diana que se espera que muestren el mayor beneficio clínico, basándose en el perfil genético, puede permitir: 1) la reposición de fármacos ya comercializados para la prevención o tratamiento de un trastorno cardiovascular; 2) el rescate de fármacos candidatos cuyo desarrollo clínico se ha interrumpido como resultado de las limitaciones de seguridad o eficacia, que son específicos para subgrupos de pacientes; y 3) un desarrollo acelerado y menos costoso de agentes terapéuticos candidatos y un etiquetado más óptimo de los fármacos (por ejemplo, ya que la medición del efecto de diversas dosis de un agente sobre una mutación causante de un trastorno vascular es útil para optimizar la dosis eficaz).
El tratamiento de un individuo con un agente terapéutico particular puede controlarse determinando el nivel de proteína (por ejemplo IL-1\alpha, IL-1\beta o IL-1Ra), de ARNm y/o de transcripción. Dependiendo del nivel detectado, el régimen terapéutico puede mantenerse o ajustarse (aumentarse o reducirse la dosis). La eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente puede comprender las etapas de: (i) obtener una muestra previa a la administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel o cantidad de un proteína, ARNm o ADN genómico en la muestra previa a la administración; (iii) obtener una o más muestras posteriores a la administración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad de la proteína, ARNm o ADN genómico en la muestra posterior a la administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de la proteína, ARNm o ADN genómico en la muestra previa a la administración con la proteína, ARNm o ADN genómico correspondiente en la muestra posterior a la administración, respectivamente; y (vi) alterar la administración del agente al sujeto de acuerdo con esto.
También pueden obtenerse células de un sujeto antes y después de la administración de un agente terapéutico para detectar el nivel de expresión de genes distintos de un gen de IL-1 para verificar que el agente terapéutico no aumenta o reduce la expresión de genes que podrían ser perjudiciales. Esto puede realizarse, por ejemplo, usando el método de perfilado transcripcional. De esta manera, el ARNm de células expuestas in vivo a un agente terapéutico y el ARNm del mismo tipo de células que no se expusieron al agente terapéutico podrían transcribirse de forma inversa e hibridar con un chip que contiene ADN de numerosos genes, para comparar de esta manera la expresión de los genes en las células tratadas y no tratadas con el agente terapéutico.
4.4 Agentes terapéuticos para trastornos y enfermedades cardiovasculares
Los moduladores de IL-1 (por ejemplo IL-1\alpha, IL-1\beta o antagonista del receptor de IL-1) o una proteína codificada por un gen que está en desequilibrio de ligamiento con un gen de IL-1 pueden comprender cualquier tipo de compuesto, incluyendo una proteína, péptido, peptidomimético, molécula pequeña o ácido nucleico. Los agonistas preferidos incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, que codifican una proteína IL-1 o un gen que está regulado positiva o negativamente por una proteína IL-1), proteínas (por ejemplo, proteínas IL-1 o una proteína que está regulada positiva o negativamente por ésta) o una molécula pequeña (por ejemplo, que regula la expresión o la unión de una proteína IL-1). Los antagonistas preferidos que pueden identificarse, por ejemplo, usando los ensayos descritos en la presente memoria incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN sencillo (antisentido) o bicatenario (tríplex) o APN y ribozimas), proteínas (por ejemplo anticuerpos) y moléculas pequeñas que actúan para reprimir o inhibir la transcripción y de IL-1 y/o la actividad de la proteína.
La presente invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitantes de forma alguna.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales que están dentro de la experiencia de la técnica. Estas técnicas se explican con más detalles en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, (2nd ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Patente de Estados Unidos número 4.683.195; Patente de Estados Unidos número 4.683.202; y Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds., 1984).
5. Ejemplos Ejemplo 1 Marcadores para una arteriopatía coronaria de un solo vaso
El objetivo de este estudio fue determinar si pacientes con una forma temprana de aterosclerosis en la arteria coronaria, es decir, arteriopatía coronaria de un solo vaso, tenían más probabilidad de tener alelos específicos en los siguientes genes: IL-1A (marcador -889), IL-1B (marcadores -511 y +3954), IL-1RN (marcador VNTR) o TNF\alpha (marcador -308). La enfermedad de múltiples vasos generalmente representa un estadio posterior de la enfermedad que pude implicar muchos factores que podrían complicar la interpretación de los datos. Por lo tanto, los pacientes que se quejaban de dolor torácico se evaluaron por un cardiólogo y los que tenían un indicio angiográfico de una aterosclerosis significativa en más de una arteria coronaria se excluyeron del análisis.
Cohortes de pacientes: Se realizó una angiografía de la arteria femoral o braquial usando técnicas convencionales. De los pacientes examinados, ochenta y cinco (85) no habían tenido irregularidades luminales evidentes según la angiografía y se clasificaron como controles que tenían arterias coronarias angiográficamente normales. Un paciente se clasificaba como un paciente con una enfermedad de un solo vaso si uno de tres vasos coronarios epicárdicos contenía una estenosis epicárdica que producía una reducción de 50% en el diámetro luminal, evaluada visualmente. Se descubrió que cincuenta y ocho (58) pacientes tenían una arteriopatía coronaria de un solo vaso. Se excluyeron los pacientes con la enfermedad en múltiples vasos. Los grupos de enfermedad de un solo vaso y de control tenían edades medias comparables, 57,6 \pm 10,4 años y 56,4 \pm 9,4 años, respectivamente. La relación entre hombres y mujeres en el grupo de control fue de 1:1,7 y 2,6:1 en el grupo con la enfermedad.
Métodos generales: Las reacciones y manipulaciones que implicaban técnicas de ácidos nucleicos, a menos que se indique otra cosa, se realizaron como se describe en general en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó en general como se describe en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990). La metodología de genotipificación fue como se describe en general en las Patentes de Estados Unidos número 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659; y 5.272.057 y McDowell, et al., Arthritis & Rheumatism, 38(2): 221-8 (1995).
Preparación de ADN: Se extrajo ADN de sangre entera usando una modificación de un método de extracción salina (Nucleon II^{TM}, Scotlab, UK).
Genotipificación de IL-1RN: Los alelos asociados con el gen de IL-1RN se describieron previamente por Tarlow, et al., Human Genetics, 91:403-4 (1993). Las enzimas usadas en la PCR procedían de Promega (UK) y los aparatos de ciclos térmicos eran MJ Research DNA Engine o Biometra. En un sintetizador de ADN ABI se produjeron los siguientes cebadores:
5' CTCAGCAACACTCCTAT 3' (SEC ID Nº 1)
5' TCCTGGTCTGCAGGTAA 3' (SEC ID Nº 2)
La amplificación por PCR se realizó con una concentración final de magnesio de 1,75 mM y un protocolo de ciclos de 1 ciclo a 96ºC durante 1 minuto; 30 ciclos de [94ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 1 minuto y 70ºC durante 1 minuto]; y un ciclo a 70ºC durante 2 minutos. Después de la PCR los diferentes alelos se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio y se visualizaron e identificaron con luz uv. En cada experimento se realizaron controles negativos sin ADN.
El intrón 2 del gen de IL-1RN contiene una región de repetición en tándem de número variable (VNTR) que da lugar a los cinco (5) alelos que se indican a continuación:
El alelo 1 contiene cuatro repeticiones y presenta un producto de PCR de 412 pb;
El alelo 2 contiene dos repeticiones y presenta un producto de PCR de 240 pb;
El alelo 3 contiene tres repeticiones y presenta un producto de PCR de 326 pb;
El alelo 4 contiene cuatro repeticiones y presenta un producto de PCR de 498 pb;
El alelo 5 contiene cuatro repeticiones y presenta un producto de PCR de 584 pb.
\vskip1.000000\baselineskip
Genotipificación de IL-1B (-511)
El marcador -511 de IL-1B se describió por diGiovine, Hum. Molec. Genet., 1(6):450 (1992). El marcador de variación de una sola base (C/T) en la base -511 de IL-1B se identificó basándose en un sitio AvaI en el alelo 1(C), y un sitio Bsu36I en el alelo 2(T). Se realizó una PCR con un ciclo a 95ºC durante 2 minutos, 35 ciclos a [95ºC durante 1 minuto, 53ºC durante 1 minuto y 74ºC durante 1 minuto] y un ciclo a 74ºC durante 4 minutos. El análisis de los productos de PCR se realizó por digestión con enzimas de restricción AvaI y Bsu36I a 37ºC durante 8 horas seguido de análisis por tamaños con PAGE al 8%. Los siguientes cebadores se produjeron en un sintetizador de ADN ABI (Clark, et al., Nucl. Acids. Res., 14:7897-7914 (1986) [aparecen erratas publicadas en Nucleic Acids Res., 15(2):868 (1987)]; GENBANK X04500)
5' TGGCATTGATCTGGTTCATC 3' (-702/-682) (SEC ID Nº: 5)
5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3' (-417/-397) (SEC ID Nº: 6)
Resultados: No hubo ninguna diferencia significativa entre los pacientes de control y enfermos en la frecuencia de los diferentes alelos en los genes para IL-1A (marcador -889), IL-1B (marcador +3954) o TNF\alpha (marcador -308). Sin embargo, el alelo 2 del marcador VNTR en el gen de IL-1RN estaba significativamente sobrerrepresentado en los pacientes con la enfermedad de un solo vaso, 41% frente a 22% en los controles. Se estima que los individuos con al menos una copia del alelo 2 tienen una probabilidad 2,44 veces mayor de tener la arteriopatía coronaria de un solo vaso en comparación con los que son negativos para el alelo 2 (razón de posibilidades = 2,44, p = 0,003, intervalo de confianza 95% = 1,35-4,43).
Además, los individuos que tenían dos copias, es decir, eran homocigotos para el alelo 2 en IL-1RN, tenían una probabilidad 5,36 veces mayor de tener la arteriopatía coronaria de un solo vaso en comparación con los que eran negativos para el alelo 2 (razón de posibilidades = 5,36, p = 0,005, intervalo de confianza 95% = 1,6-17,97).
El porte una copia del alelo 2 del marcador -511 del gen de IL-1B estaba aumentado en la enfermedad coronaria de un solo vaso a 52% en comparación con el valor de 38% en los controles. Se estima que los individuos con al menos una copia del alelo 2 tienen una probabilidad 1,74 veces mayor de tener la enfermedad de un solo vaso que los que son negativos para el alelo 2 (razón de posibilidades = 1,74, p = 0,1, intervalo de confianza de 95% = 0,86-3,52).
Estos descubrimientos indican que el alelo 2 del gen de IL-1RN es un marcador para la susceptibilidad al desarrollo de una enfermedad oclusiva de arterias coronarias, manifestada como estenosis de un solo vaso. Este alelo está asociado con un mayor riesgo de arteriopatía coronaria de 2,4 a 5,4 veces, dependiendo de si hay una copia (heterocigoto) o dos copias (homocigoto) del alelo asociado con la enfermedad. La influencia de este alelo sobre el riesgo de arteriopatía coronaria se muestra en la tabla 1 con respecto a otros factores de riesgo comunes.
Además, se descubrió que un alelo para el gen de IL-1B estaba asociado con la arteriopatía coronaria de un solo vaso. Este alelo está asociado con un riesgo de arteriopatía coronaria 1,74 veces mayor.
TABLA 2
6
Ejemplo 2 Marcadores de arteriopatía coronaria de múltiples vasos
El objetivo de este estudio fue determinar si pacientes con una forma de aterosclerosis en la arteria coronaria posterior o más difusa, es decir, arteriopatía coronaría de múltiples vasos, tenía más probabilidad de tener alelos específicos en los genes del agrupamiento de genes de IL-1 o TNF\alpha.
Cohortes de pacientes: Las cohortes de pacientes se determinaron como en el ejemplo 1 con la excepción de que un paciente se clasificaba como un paciente que tenía la enfermedad en múltiples vasos si más de un vaso coronario epicárdico contenía una estenosis epicárdica que producía una reducción >50% en el diámetro luminal, evaluado visualmente. De los pacientes examinados, 86 se clasificaron como controles que tenían arterias coronarias angiográficamente normales y se consideró que 315 pacientes tenían arteriopatía coronaria en múltiples vasos. Los grupos de enfermedad de un solo vaso y los controles tenían edades medias comparables, 57,6 \pm 10,4 años y 60,8 \pm 1,13 años, respectivamente. La relación entre sexo masculino y sexo femenino en el grupo de control fue de 1:1,7 y de 3,7:1 en el grupo de la enfermedad.
Métodos generales: Las reacciones y los métodos fueron como en el ejemplo 1.
Resultados
No hubo ninguna diferencia significativa entre los pacientes de control y enfermos en la frecuencia de los diferentes alelos en los genes para IL-1A (marcador -889), IL-1B (marcador +3954) e IL-1RN (marcador VNTR). Sin embargo, el porte de una copia del alelo Bsu36I (alelo 2) del marcador -511 del gen de IL-1B estaba aumentado en los pacientes con la enfermedad en múltiples vasos, 54% frente a 38% en los controles. Se estima que los individuos con al menos una copia del alelo 2 del marcador -511 tienen una probabilidad 1,92 veces mayor de tener arteriopatía coronaria en múltiples vasos que los que son negativos para el alelo 2 (razón de posibilidades + 1,92, p = 0,009, intervalo de confianza 95% = 1,17-3,16). No parece haber un efecto relacionado con la dosis, al menos en esta población, para el marcador -511.
En resumen, se descubrió que un alelo para el gen de IL-1B estaba asociado con la arteriopatía coronaria en múltiples vasos. Este alelo está asociado con un riesgo de arteriopatía coronaria 1,92 veces mayor.
La arteriopatía coronaria de un solo vaso y de múltiples vasos parecen estar ligadas con diferentes genes del agrupamiento de genes de IL-1. Esto puede plantearse como una verdadera distinción biológica, donde IL-1RA modula los efectos de IL-1\beta de tal forma que produce el fenotipo de un solo vaso. Como alternativa, es posible que los dos genes estén efectivamente asociados con la arteriopatía coronaria como un conjunto y que las asociaciones observadas aquí se deban a la forma en que esta población particular presentaba arteriopatía coronaria. Con cualquier interpretación, se ha establecido una fuerte asociación entre la biología de la IL-1 y la arteriopatía coronaria.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Asociación de variantes del gen de la interleuquina-1 y el engrosamiento de la pared de la arteria carótida
Se investigó la asociación entre el engrosamiento de la pared íntima-media de la carótida (IMT) y cuatro marcadores bialélicos básicos (IL-1A (+4845), IL-1B (+3954), IL-1RN (+2018)) en el agrupamiento de genes de interlequina 1 (IL-1) en el cromosoma 2 entre participantes en el estudio del riesgo de aterosclerosis en comunidades (ARIC), una cohorte de 15.792 hombres y mujeres con edades de 45-64 años seleccionados a partir de cuatro comunidades estadounidenses. Se midió el grosor de la pared distal por ultrasonidos de modo B y se analizó usando un punto de corte para un IMT medio elevado (\geq 1 mm) elegido a priori para identificar individuos con mayor riesgo de enfermedad cardiovascular. Después de excluir a los pacientes con una historia de enfermedad cardiovascular, se genotipificó una muestra aleatoria estratificada de 252 afroamericanos y 942 pacientes caucásicos. Entre los afroamericanos, los portadores del alelo menos común (alelo 2) de IL-1RN (+2018) tenían más probabilidad que los no portadores de tener una IMT media \geq 1 mm (16% frente a 5% p = 0,04) en un modelo básico de ajuste por edad, sexo y centro de estudio. Entre los pacientes caucásicos, la proporción ajustada de individuos con un IMT elevado también era mayor en los que llevaban el alelo 2 de IL-1RN (+2018) (9% frente a 6%), pero esta diferencia no era estadísticamente significativa (p = 0,10). No hubo asociaciones entre las variantes de IL-1A (+4848), IL-1B (+3954) o IL-1B (-511) y el IMT de la carótida en ningún grupo étnico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Genotipos de IL-1 asociados con la formación de placas y una mayor fragilidad de las placas
Los polimorfismos en el gen para el antagonista del receptor de IL-1 y el gen de Il-1B (-511) asociado están muy relacionados con la presencia de grandes placas (>50% de oclusión del vaso) en las arterias coronarias y cambios ateroscleróticos tempranos en la pared de la arteria carótida (datos ARIC). Estos datos sugieren que el patrón de polimorfismo genético que implica al alelo 2 de IL-1RN (+2018) y/o el alelo 2 de IL-1B (-511) es predictivo de grandes placas que pueden producir obstrucciones.
Ciertos genotipos de IL-1 están asociados con un mayor riesgo de acontecimientos clínicos tales como trombosis y embolia. Los presentes inventores propusieron que sería de esperar que el alelo 2 en uno cualquiera o en los dos loci de IL-1A (+4845) e IL-1B (+3954) aumentara la respuesta inflamatoria y por lo tanto aumentara la fragilidad de las placas y el riesgo de acontecimientos clínicos tales como trombosis y embolia. Este riesgo puede ser el máximo en individuos con bajos niveles de colesterol, ya que sería de esperar que los mayores niveles activaran la respuesta inflamatoria máxima incluso en los tipos silvestres de IL-1 (por ejemplo IL-1A (+4845) = 1,1 e IL-1B
(+3954) = 1,1).
Se propuso que los genotipos asociados con placas oclusivas de mayor tamaño, es decir, el alelo 2 de IL-1RN (+2018) o el alelo 2 de IL-1B (-511) serían predictivos de un menor riesgo de fragilidad de las placas.
De aproximadamente 15.000 individuos sanos sometidos a un seguimiento longitudinal para evaluar los acontecimientos clínicos (ARIC), se documentaron 370 acontecimientos trombóticos o embólicos. Se seleccionó un grupo de aproximadamente 900 controles estratificados aleatorios para la comparación.
\newpage
El alelo 2 en IL-1A(+4845) e IL-1B(+3954) influye en acontecimientos clínicos relacionados con placas frágiles:
\bullet Para casos con LDL<130 (n = 535)
\quad
IL-1A(+4845) genotipo 2.2: Razón de posibilidades (OR + IC 95%) para acontecimiento clínico = 3,03 (0,96-9,1); p = 0,059
\bullet Para casos con colesterol total <200 (n = 425)
\quad
IL-1A(+4845) genotipo 2.2: OR = 6,25 (1,69-20,00); p = 0,006
\quad
IL-1B(+3954) genotipo 1.2 ó 2.2: OR = 2,58 (1,25-5,31); p = 0,010
\vskip1.000000\baselineskip
El alelo 2 de IL-1RN(+2018) está relacionado inversamente con acontecimientos clínicos relacionados con placas frágiles, sugiriendo de esta manera una estabilización de la placa aterosclerótica:
\bullet Para todos los casos (n = 1214)
\quad
IL-1RN(+2018) genotipo 1.2 ó 2.2: OR = 0,65 (0,43-0,96); p = 0,031
\bullet Para LDL > 160 (n = 343)
\quad
IL-1RN(+2018) genotipo 1.2 ó 2.2: OR = 0,33 (0,14-0,73); p = 0,058
\bullet Para el colesterol total > 240 (n = 307)
\quad
IL-1RN(+2018) genotipo 1.2 ó 2.2: OR = 0,28 (0,11-0,68); p = 0,054
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 El genotipo compuesto de IL-1 que es coherente con el patrón 1 de haplotipo está asociado con periodontitis y el genotipo de IL-1 que es coherente con el patrón 2 de haplotipo está asociado con la enfermedad cardiovascular oclusiva
Se investigó la asociación entre periodontitis, enfermedad cardiovascular y cuatro marcadores bialélicos básicos (IL-1A (+4845), IL-1B (+3954), IL-1B (-511) e IL-1RN (+2018)) en el agrupamiento de genes de la interleuquina-1 (IL-1) en el cromosoma 2.
Pueden definirse dos patrones de haplotipo por 4 loci polimórficos en el agrupamiento de genes de IL-1 como se muestra en la tabla 2 (IL-1A (+4845), IL-1B (+3954), IL-1B (-511), e IL-1RN (+2018)). Un patrón incluye el alelo 2 tanto en el locus de IL-1A (+4845) como en el locus de IL-1B (+3954). El otro patrón incluye el alelo 2 tanto en el locus de IL-1B (-511) como en el locus de IL-1RN (+2018).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
7
El patrón de haplotipo indica que cuando el alelo 2 se encuentra en un locus, es muy probable que se encuentre en otros loci. Los datos previos (Cox et al. (1998) Am. J. Hum. Genet. 62:1180-1188) indican que cuando el alelo 2 se encuentra en el locus de IL-1A (+4845) el alelo 2 también estará presente en el locus de IL-1B (+3954) aproximadamente 80% de las veces. Los patrones de haplotipo sólo son relevantes para una sola copia de un cromosoma. Como hay dos copias del cromosoma 2 y los procedimientos de genotipificación convencionales no pueden identificar en qué copia del cromosoma se encuentra un alelo específico, se usan programas estadísticos especiales para deducir patrones de haplotipo a partir del patrón de genotipo que se determina.
La distribución de estos patrones genéticos se evaluó en una nueva población que era parte de un estudio de aterosclerosis (Pankow et al. (1999) The ARIC study. European Atherosclerosis Society Annual Meeting, Abstract, #646). En esta población (N=1.368), se encontró el genotipo 2.2 de IL-1A (+4845) en 10,2% de los sujetos. Sin embargo, en los sujetos con genotipo IL-1B (+3954) = 2.2 (N = 95), se encontró el genotipo 2.2 de IL-1A (+4845) en 71,6% de los sujetos. Esto indica que el alelo 2 en IL-1A (+4845) se hereda junto con el alelo 2 en IL-1B (3954) en una proporción mucho mayor de lo que cabría esperar dada la distribución de cada uno de estos marcadores en la población. Existen datos similares para el alelo 2 en los dos loci que son característicos del patrón 2. Además, cuando se encuentra el patrón 1 de genotipo, es muy poco probable que el alelo 2 esté presente cualquiera de los loci que son característicos del otro patrón.
Los dos patrones de genotipo también están asociados con diferencias específicas en la biología funcional de la interleuquina-1. Por ejemplo, monocitos periféricos de individuos con una o dos copias del alelo 2 en IL-1B (+3954) produjeron de 2 a 4 veces la cantidad de IL1-\beta cuando se estimularon con LPS en comparación con los monocitos de individuos que tienen el patrón de genotipo de IL1-B (+3954) = 1.1 (DiGiovini, FS et al. (1995) Cytokine, 7:606). Recientemente se han publicado datos similares para leucocitos polimorfonucleares de sangre periférica aislados a partir de individuos con periodontitis severa (Gore, EA et al. (1998) J. Clin. Periodontol., 25:781). Además, el fluido de grietas gingivales (GCF) de sujetos con los genotipos compuestos indicativos del patrón 1 tienen niveles de IL1-\beta de 2 a 3 veces mayores que el GCF de individuos que son negativos para esos genotipos (Engelbretson, SP et al. (1991) J. Periodontol, en prensa). También hay datos que indican que para el patrón 2, el alelo 2 en IL-1RN +2018 está asociado con una reducción de los niveles de la proteína antagonista del receptor de IL-1. De esta manera, los genotipos del patrón 1 parecen estar asociados con un aumento de agonistas de IL-1, y el patrón 2 parece estar asociado con la reducción de los niveles de antagonista del receptor de IL-1.
Los genotipos de IL-1 compuestos que son coherentes con el patrón 1 están asociados con una mayor susceptibilidad a la periodontitis adulta severa (Kornman, KS et al. (1997), supra; Gore, EA et al. (1998), supra; McGuire, MK et al. (1999) J. Periodontol., en prensa; McDevitt, MJ et al. (1999) J. Periodontol., en prensa). Un aspecto de la influencia del genotipo de IL-1 sobre la periodontitis parece ser un aumento de los niveles subgingivales de complejos bacterianos específicos que incluyen patógenos periodontales aceptados (Socransky, SS et al. (1999) LADR Annual Meeting, Abstract#3600). Sin embargo, los genotipos del patrón 1 no estaban asociados con un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular oclusiva. En datos del estudio de riesgo de aterosclerosis en comunidades (ARIC) que se presentaron por Pankow y colaboradores (véase Pankow et al., supra), se compararon individuos con mediciones ultrasónicas del grosor de la íntima-media de la pared de la carótida (IMT) que eran indicativas de trastornos cardiovasculares oclusivos con una población de control aleatoria estratificada para polimorfismos del gen de IL-1. Ni IL-1A (+4845) ni IL-1B (+3954) mostraron ninguna asociación con el riesgo de una elevada IMT.
Los genotipos que son característicos del patrón 2 recientemente se han asociado con una mayor susceptibilidad a una arteriopatía coronaria oclusiva, pero no a un mayor riesgo de periodontitis. En un informe sobre la arteriopatía coronaria, pacientes con pruebas angiográficas de estenosis coronarias tenían significativamente más probabilidad de ser portadores del alelo 2 en el locus de IL-1RN (+2818) o el locus de IL-1B (-511) (véase Francis et al., supra). Los dos loci son característicos del patrón 2 del haplotipo. En el estudio ARIC, como se ha descrito anteriormente, el porte del alelo 2 de IL-1RN (+2018) en afroamericanos con mediciones de alto IMT fue significativamente mayor que en los controles étnicamente correspondientes. En individuos caucásicos con altas mediciones de IMT el porte de una copia del alelo 2 de IL-1RN (+2018) fue significativamente mayor que en los controles, sin embargo, los individuos homocigotos en este locus no eran diferentes de los controles. Debe tenerse en cuenta que la prevalencia de individuos homocigotos para el alelo 2 en IL-1RN (+2018) en individuos caucásicos en el estudio era sustancialmente menor que el observado en otras poblaciones.
Cuando se evaluaron individuos con periodontitis y con encías sanas con respecto a los patrones de genotipo consistentes con el patrón 1 y el patrón 2, se descubrió que los individuos con periodontitis adulta severa tenían una predominancia de genotipos consistentes con el patrón 1, mientras que los individuos con una situación periodontal sana tenían patrones de genotipo que no se dominaban ni por el patrón 1 ni por el patrón 2. Por lo tanto, parece ser que los genotipos de IL-1 consistentes con el haplotipo patrón 1 están asociados con la periodontitis severa y trastornos de fragilidad de placas y enfermedades cardiovasculares no oclusivas mientras que los genotipos de IL-1 consistentes con el haplotipo patrón 2 están asociados con enfermedades cardiovasculares oclusivas pero no con periodontitis o fragilidad de placas. Un mecanismo puede ser que el patrón 1 del genotipo de IL-1 influye directamente en la fragilidad de las placas; otro mecanismo puede ser que el patrón 1 influye sobre la periodontitis directamente, lo cual puede llevar a influencias indirectas sobre la enfermedad cardiovascular a través de los microorganismos periodontales encontrados como parte del proceso inflamatorio crónico oral. Otro mecanismo puede ser que el patrón 2 del genotipo de IL-1 influya directamente sobre trastornos oclusivos cardiovasculares pero no tenga ninguna influencia sobre la periodontitis. De esta manera, es probable que los polimorfismos genéticos de IL-1 puedan influir tanto sobre la enfermedad cardiovascular como sobre la periodontitis severa, por un mecanismo subyacente común que altera directamente las respuestas inmunoinflamatorias en las dos enfermedades de una manera idéntica y por un mecanismo indirecto que aumenta la carga de bacterias orales y entonces influye en la enfermedad cardiovascular. Los genotipos de IL-1 que son consistentes con el patrón 1 de haplotipo pueden influir en la asociación entre la periodontitis y la enfermedad cardiovascular en un segmento de la población amplificando tanto la respuesta inmunoinflamatoria como la carga bacteriana subgingival.
Ejemplo 5 El Estudio Clínico de Mayo
Diseño del estudio. Para este estudio se consideraron pacientes de 18 a 75 años de edad sometidos a una angiografía coronaria indicada clínicamente en Mayo Clinic, Rochester, Minnesota. Los pacientes no podían elegirse para la inclusión si tenían diabetes mellitus que requiriera terapia, una historia de hábito de fumar >50 paquetes al año, un trasplante de órganos previo o planeado, embarazo, revascularización coronaria quirúrgica o percutánea previa, hemorragia activa o un nivel de hemoglobina menor de 8 g/dl, recepción de una transfusión sanguínea en los 30 días previos, inestabilidad hemodinámica, infección con el virus de la inmunodeficiencia humana, insuficiencia renal que requiriera diálisis y una historia de terapia de radiación en el tórax. Los 504 pacientes representan >90% de los pacientes elegibles para este estudio que se sometieron a una angiografía coronaria durante este periodo.
Análisis angiográfico. Se analizaron angiogramas coronarios con calibres manuales o análisis visual y se dividieron en los que revelaban coronarias normales (arterias uniformes sin estenosis o con estenosis \leq10%), enfermedad leve (arterias coronarias con una reducción en el diámetro luminal entre 10 y 50%), enfermedad de un solo vaso (\geq50% en una sola arteria coronaria o sus ramificaciones principales), arteriopatía coronaria de dos vasos (estenosis del diámetro luminal \geq50% en dos arterias coronarias) y enfermedad en tres vasos (estenosis de diámetro luminal \geq50% en tres arterias coronarias). Los angiogramas se analizaron con un diseño ciego en cuanto a los factores de riesgo de los pacientes y los análisis genéticos.
Análisis de laboratorio. Se realizaron análisis de apolipoproteína A_{1}, apolipoproteína B, Lp(a) y fibrinógeno en el sistema COBAS MIRA. Los intervalos normales para estos análisis son: apolipoproteína A1, 115-190 mg/dl, apolipoproteína B, 70-160 mg/dl; y Lp (a), 2,5-7,0 mg/dl; no se indica un intervalo normal de fibrinógeno. Se midió la homocisteína plasmática total.
Definiciones. Se consideró que estaba presente una historia familiar de enfermedad coronaria si un pariente de primer grado del paciente que no fumaba ni tenía diabetes mellitus había desarrollado una enfermedad coronaria cuando tenía \leq55 años de edad. La hiperlipidemia se definió como un nivel de colesterol total \geq250 mg/dl o un nivel de LDL \geq150 mg/dl, o un tratamiento en curso con agentes reductores de lípidos en pacientes en los que se desconocían los valores de lípidos antes del tratamiento. La angina y el fallo cardiaco se clasificaron de acuerdo con la asociación cardiaca canadiense y los esquemas de clasificación del Estado de Nueva York respectivamente.
Métodos estadísticos. Los valores se expresan como porcentajes y como medias \pm una desviación típica. Para las razones de posibilidades, se presentan entre paréntesis los intervalos de confianza de 95%.
En análisis preliminares para determinar correlaciones de enfermedad coronaria, primero se realizaron ensayos chi-cuadrado y ANOVAs de una vía para ensayar la asociación de diversos factores de riesgo tradicionales y emergentes, así como variantes alélicas entre los genes del agrupamiento de IL-1, entre pacientes sin enfermedad, con enfermedad leve, enfermedad de un vaso, enfermedad de dos vasos y enfermedad de tres vasos. Después se volvió a clasificar la arteriopatía coronaria para comparar pacientes sin enfermedad o enfermedad leve con pacientes con estenosis en uno, dos o tres vasos. Los pacientes con algún bloqueo pero con estenosis coronaria \leq50% se consideraron pacientes que tenían la enfermedad coronaria leve y se agruparon con los pacientes sin bloqueo (sin enfermedad), mientras que los pacientes con estenosis \geq50% en una, dos o tres arterias coronarias se agruparon conjuntamente para un análisis adicional, ya que se consideraba que estos pacientes tenían un grado significativo de estenosis de arteria coronaria. Se usó el ensayo exacto de tendencias para ensayar las tendencias en la proporción de pacientes con los polimorfismos.
Se ajustaron modelos de regresión logística para los diversos factores de riesgo de acuerdo con cuartiles y terciles presentando las razones de posibilidades para los niveles crecientes de cuartil y tercil dados. Para analizar adicionalmente la asociación de variantes alélicas de los genes del agrupamiento de IL-1 con la arteriopatía coronaria, se ajustaron múltiples modelos de regresión logística incluyendo en cada modelo factores de confusión estadísticamente significativos. Para la inclusión en el modelo se consideraron todos los factores de riesgo tradicionales y emergentes, y el modelo se ajustó por etapas para obtener el mejor modelo de ajuste en el que todos los factores incluidos en el modelo eran estadísticamente significativos. Además, se consideró la inclusión en el modelo de posibles modificadores del efecto. La respuesta para los múltiples modelos de regresión logística fue la presencia o ausencia de estenosis significativa de arterias coronarias definida anteriormente.
Además de analizar a todos los sujetos incluidos en el estudio, se realizaron análisis estadísticos adicionales en sujetos \leq60 años de edad y sujetos >60 años de edad por separado. El análisis por edad se consideró apropiado, ya que se ha demostrado que la edad es un factor de riesgo importante para la arteriopatía coronaria y porque se cree que las influencias genéticas en enfermedades multifactoriales son más evidentes en casos de inicio temprano. Además, como la epistasis puede determinar que influencias genéticas tengan diferentes resultados en hombres y mujeres, también se consideró que eran importantes análisis de subseries por sexo y se trataron por separado en algunos de los análisis los hombres y las mujeres.
Ejemplo 6 El Estudio de Munich Métodos Pacientes
El Estudio incluía 1.850 pacientes caucásicos consecutivos con arteriopatía coronaria sintomática que se sometieron a una implantación de una endoprótesis vascular coronaria en Deutsches Herzzentrum München y 1. Medizinische Klinik rechts der Isar der Technischen Universität München. Todos los pacientes se programaron para un seguimiento angiográfico a los 6 meses. Todos los pacientes que participaron en este estudio proporcionaron un consentimiento informado por escrito para la intervención, la angiografía de seguimiento y la determinación del genotipo. El protocolo del estudio estaba de acuerdo con la Declaración de Helsinki y se aprobó por el comité de ética institucional.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 Características clínicas basales
8
El protocolo de colocación de endoprótesis vascular y la terapia posterior a la colocación de la endoprótesis serán conocidos para los especialistas en la técnica. La mayoría de las endoprótesis vasculares se implantaron montadas de manera manual en globos de angioplastia convencionales. La terapia posterior al procedimiento consistía en aspirina (100 mg dos veces al día, indefinidamente) y ticlopidina (250 mg dos veces al día durante 4 semanas). Los pacientes con resultados subóptimos debidos a trombos residuales o a disección con pérdida de flujo después de la implantación de la endoprótesis vascular recibieron una terapia adicional con abciximab administrada como una inyección en embolada durante el procedimiento de inserción de la endoprótesis vascular y como una infusión continua de 12 horas posteriormente. La decisión de administrar abciximab se dejó a la discreción del operador.
Determinación del Genotipo de IL-1RN
Se extrajo ADN genómico de 200 ml de leucocitos de sangre periférica con el Kit QIAamp Blood (Qiagen, Hilden, Germany) y el Kit de Preparación de Plantillas de PCR de Alta Pureza (Boehringer, Mannheim, Mannheim, Germany).
La genotipificación de IL-1RN se realizó con el Sistema de Detección de Secuencias ABI Prism (PE Applied Biosystems, Witerstadt, Germany). El uso de sondas fluorogénicas con especificidad de alelo en la reacción de la nucleasa 5' combina la amplificación del ADN y la determinación del genotipo en un solo ensayo 33. IL-1RN (+2018), un polimorfismo de un solo par de bases en el exón 2, era el polimorfismo tipificado para este estudio 26. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores y sondas fueron las siguientes: cebador director 5' GGG ATG TTA ACC AGA AGA CCT TCT ATC T 3', cebador inverso 5' CAA CCA CTC ACC TTC TAA ATT GAC ATT 3', sonda 5' del alelo 1 AAC AAC CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CAA 3', sonda 5' del alelo 2 ACA ACC AAC TAG TTG CCG GAT ACT TGC 3'. Las sondas para el alelo 1 se marcaron con el colorante fluorescente 6-carboxi-fluoresceína (FAM) y para el alelo 2 con el colorante fluorescente tetracloro-6-carboxi-fluoresceína (TET) en el extremo 5'. Las dos sondas se marcaron con el inactivador 6-carboxi-tetrametil-rodamina (TAMRA) en sus extremos 3'. El protocolo de ciclos térmicos consistía en 40 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 15 segundos y templado/extensión a 64ºC durante 1 minuto. La validación del genotipo se realizó repitiendo la determinación en 20% de los pacientes usando una muestra de ADN duplicada con un nuevo código de sujeto no relacionado con el código de sujeto original. Hubo una correspondencia de 100% entre los 2 resultados.
Evaluación Angiográfica
Se clasificaron lesiones coronarias de acuerdo con el Sistema de Clasificación modificado del Colegio Americano de Cardiología/Asociación Cardiaca Americana. La función del ventrículo izquierdo se evaluó cualitativamente basándose en angiogramas biplanos usando una división de 7 segmentos; el diagnóstico de reducción de la función del ventrículo izquierdo se estableció en presencia de al menos dos segmentos hipocinéticos en el angiograma de contraste. Se realizó un análisis angiográfico asistido por ordenador cuantitativo off-line sobre los angiogramas obtenidos justo antes de la colocación de la endoprótesis vascular, inmediatamente después de la colocación de la endoprótesis vascular y en el seguimiento usando el sistema de detección automática de bordes CMS (Medis Medical Imaging Systems, Nuenen, The Netherlands). Los operadores desconocían el genotipo de IL-1RN del paciente. Se usaron proyecciones idénticas de la lesión diana para todos los angiogramas evaluados. Los parámetros angiográficos obtenidos con este sistema de análisis fueron el diámetro mínimo del lumen, el diámetro de referencia interpolado, la estenosis del diámetro, la longitud de la lesión y el diámetro del balón inflado al máximo. El aumento del lumen agudo se calculó como la diferencia entre el diámetro mínimo del lumen al final de la intervención y el diámetro mínimo del lumen antes de la intervención. La pérdida posterior de lumen se calculó como la diferencia entre el diámetro mínimo del lumen al final de la intervención y el diámetro mínimo del lumen en el momento de la angiografía de seguimiento. El índice de pérdida se calculó como la relación entre la pérdida de lumen posterior y el aumento de lumen agudo.
Definiciones y Criterios de Valoración del Estudio
El criterio de valoración principal del estudio fue la reestenosis. Se evaluaron dos medidas de reestenosis: la incidencia de reestenosis angiográfica definida como estenosis del diámetro de 50% en la angiografía de seguimiento a los 6 meses y la necesidad de revascularización del vaso diana (PTCA o cirugía de bypass aortocoronaria [CABG]) debido a síntomas o signos de isquemia en presencia de reestenosis angiográfica en el sitio de la endoprótesis vascular transcurrido 1 año desde la intervención. Otros acontecimientos adversos importantes evaluados fueron: muerte por cualquier causa e infarto de miocardio. Todas las muertes se consideraron debidas a causas cardiacas a menos que una autopsia estableciera una causa no cardiaca. El diagnóstico de infarto de miocardio agudo se basó en los criterios aplicados en el ensayo EPISTENT (nuevas ondas Q patológicas o un valor de creatina quinasa [CK] o su isoenzima MB al menos 3 veces por encima del límite superior) 35. La CK se determinó sistemáticamente durante las 48 horas posteriores al procedimiento de colocación de la endoprótesis vascular. Los acontecimientos clínicos se controlaron a lo largo de todo el periodo de seguimiento de 1 año. La evaluación se realizó basándose en la información proporcionada por los registros de readmisión del hospital, por el médico a cargo del paciente o por entrevista telefónica con el paciente. Para todos los pacientes que revelaron síntomas cardiacos durante la entrevista, se realizó al menos una comprobación clínica y electrocardiográfica en la clínica de pacientes externos o por el médico a cargo del caso.
Análisis Estadístico
Las variables discretas se expresan como cantidades o porcentajes y se comparan con el ensayo exacto de Fisher o Chi-cuadrado, según sea apropiado. Las variables continuas se expresan como media SD y se comparan por medio del ensayo bilateral de datos no pareados o análisis de varianza para más de 2 grupos. El análisis del riesgo se realizó calculando la razón de posibilidades y el intervalo de confianza de 95%. El análisis principal consistía en comparar portadores heterocigotos y homocigotos combinados del alelo IL-11RN*2 con portadores homocigotos del alelo IL-11RN*1. Además, la asociación entre el genotipo de IL-1RN y la reestenosis se evaluó en un modelo de regresión logística multivariante que incluía también las características clínicas y relacionadas con la lesión para las que la comparación entre portadores y no portadores del alelo IL-1RN*2 mostraba un valor de P de 0,30. En este modelo multivariante se ensayó la posible interacción entre el genotipo de IL-1RN y la edad. Como la contribución relativa de factores genéticos a procesos multifactoriales tales como la reestenosis puede reducirse con la edad, se realizó un análisis adicional para subgrupo pre-especificado de pacientes <60 años. Sucesivamente, se usó el ensayo de tendencias para evaluar el efecto dosis-gen, es decir, una respuesta fenotípica creciente por etapas con la presencia de 0, 1 ó 2 supuestos alelos. Se aceptó significado estadístico para valores de P de 0,05.
Resultados Características de los Pacientes
Los genotipos de IL-1RN observados en la población de estudio fueron 1/1 en 954 (51,6%), 1/2 en 742 (40,1%) y 2/2 en 154 (8,3%). De esta manera, la frecuencia del alelo 2 fue de 0,28. La distribución observaba cumplía con el equilibrio de Hardy-Weinberg. Las características basales principales de los pacientes se indican en la Tabla 1 y se compararon entre portadores y no portadores del alelo IL-1RN*2. Hubo una tendencia a una mayor frecuencia de diabetes y reducción de la función del ventrículo izquierdo entre los portadores del alelo IL-1RN*2. Las otras características se distribuyeron uniformemente entre los 2 grupos. Las características angiográficas y de procedimiento en el momento de la intervención se indican en la Tabla 2 y no muestran diferencias significativas entre portadores y no portadores del alelo IL-1RN*2.
TABLA 5 Lesión y características de procedimiento en el momento de la intervención
9
LAD indica arteria coronaria descendente anterior izquierda; LCx, arteria coronaria circunfleja izquierda; RCA, arteria coronaria derecha; las lesiones complejas se definieron como tipos de lesiones ACC/AHA de B2 y C, de acuerdo con el sistema de calificación del Colegio Americano de Cardiología/Asociación Cardiaca Americana.
Polimorfismo de IL-1ra, mortalidad e infarto de miocardio después de la colocación de una endoprótesis vascular
La Tabla 3 muestra los acontecimientos clínicos adversos observados en los primeros 30 días después de la colocación de una endoprótesis vascular coronaria en portadores y no portadores del alelo IL-1RN*2. No hubo asociación entre la presencia del alelo IL-1RN*2 y la muerte, infarto de miocardio o revascularización del vaso diana, sin mostrar ninguna influencia significativa del polimorfismo en el gen de IL-1ra en el riesgo de acontecimientos trombóticos tempranos después de la colocación de la endoprótesis vascular coronaria.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 6 Incidencia de acontecimientos adversos registrados durante los primeros 30 días
10 
\vskip1.000000\baselineskip
El seguimiento de un año también indicó que no había correlación entre la presencia del alelo IL-1RN*2 y la mortalidad o incidencia de infarto de miocardio después de la intervención. Durante el periodo de 1 año, el índice de mortalidad fue de 2,8% en el grupo combinado de IL-1RN 1/2 e IL-1RN 2/2 y de 2,2% en los placientes IL-1 1/1 (P=0,42), produciendo una razón de posibilidades de 1,28 (intervalo de confianza de 95%, 0,71-2,29). La incidencia de infarto de miocardio no falta fue de 3,5% en los portadores del alelo IL-1RN*2 y 3,9% en portadores homocigotos del alelo IL1RN*1 (P=0,54), y la razón de posibilidades respectiva fue de 0,86 (0,53-1,4).
Polimorfismo de IL-1ra y reestenosis después de la colocación de una endoprótesis vascular
Se realizó una angiografía de control en 84% de los pacientes después de una mediana de 188 días (intervalo intercuartil, 171-205 días). La proporción de pacientes con angiografía de control fue similar en los 2 grupos definidos por la presencia o ausencia del alelo IL-1RN*2. La Tabla 4 indica los resultados de la valoración cuantitativa de los angiogramas de 6 meses.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 7 Resultados de la angiografía de seguimiento
11 
\vskip1.000000\baselineskip
Debe tenerse en cuenta que el índice de pérdida, que refleja la respuesta hiperplásica después de la colocación de la endoprótesis vascular, fue significativamente menor en pacientes que llevaban el alelo IL-1RN*2. La incidencia de reestenosis angiográfica también fue significativamente menor en portadores del alelo IL-1RN*2, con 30,2% frente a 35,6% en pacientes del genotipo IL-1RN 1/1. De esta manera, la presencia del alelo IL-1RN*2 estaba asociada con una reducción de 22% en el índice de reestenosis (razón de posibilidades, 0,78 [0,63-0,97]). La reestenosis clínica expresa como la necesidad de revascularización del vaso diana también fue significativamente menor, con 17,7% en los portadores del alelo IL-1RN*2 frente a 22,7% en pacientes homocigotos para el alelo IL-1RN*1 (P=0,026), produciendo una razón de posibilidades de 0,73 (0,58-0,92).
En el modelo multivariante para la reestenosis angiográfica se incluyeron la edad, sexo, la presencia o ausencia de diabetes, el hábito de fumar, función reducida del ventrículo izquierdo y lesiones reestenóticas, tamaño de los vasos (difiriendo todas las variables en análisis univariante por un valor de P de 0,30) junto con la presencia o ausencia del alelo IL-1RN*2. La edad avanzada (P=0,005), la presencia de diabetes (P<0,001), la lesión reestenótica (P<0,001) y un tamaño pequeño del vaso (P<0,001) se correlacionaron independiente con un mayor riesgo de reestenosis. Por el contrario, la presencia del alelo IL-1RN*2 se correlacionaba independientemente (P<0,001) con un menor riesgo de reestenosis con una razón de posibilidades ajustada de 0,81 (0,71-0,92). Además, hubo una interacción significativa entre la presencia del alelo IL-1RN*2 y la edad (P=0,009) como se refleja por un efecto protector progresivamente más fuerte de este alelo en pacientes más jóvenes.
Los resultados del análisis en el subgrupo pre-especificado de pacientes <60 años (n=696) se presentan en la Tabla 5. Durante el periodo de seguimiento de 1 año, 17,1% de los portadores del alelo IL-1RN*2 y 24,9% de los portadores del alelo IL-1RN*1 homocigotos necesitaron revascularización del vaso diana (P=0,013). De esta manera, la presencia del alelo IL-1RN*2 estaba asociada con una reducción de 37% (razón de posibilidades: 0,63 [0,43-0,91] de la necesidad de reintervenciones dirigidas por isquemia. En la Tabla 5 se presentan datos angiográficos cuantitativos obtenidos para el estudio de control a los 6 meses (realizado en 590 u 85% de pacientes <60 años).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 8 Resultados de angiografía de seguimiento en pacientes <60 años
12
La incidencia de reestenosis angiográfica fue de 25,6% en el grupo combinado de pacientes IL-1RN 1/2 e IL-1RN 2/2 y de 38,5% entre los pacientes IL-1RN 1/1 (P<0,001), que corresponde a una reducción de 45% (razón de posibilidades: 0,55 [0,39-0,78]). La incidencia de reestenosis se redujo progresivamente con la heterocigosidad y homocigosidad para el alelo IL-1RN*2. El índice de reestenosis angiográfica fue de 38,5% en los pacientes IL-1RN 1/1, de 26,3% en los pacientes IL-1RN 1/2 y de 22,4% en los pacientes IL-1RN 2/2 (P=0,001, ensayo de tendencias). El índice de revascularización del vaso diana fue de 24,9% en los pacientes IL-1RN 1/1, de 17,9% en los pacientes IL-1RN 1/2 y de 13,2% en los pacientes IL-1RN 2/2 (P=0,01, ensayo de tendencias).

Claims (7)

1. Un método para determinar si un paciente tiene o está predispuesto a tener un trastorno de placas frágiles, comprendiendo el método: detectar en una muestra de ácido nucleico del paciente un alelo seleccionado entre el grupo consistente en un alelo de IL-1A (+4845) y un alelo de IL-1B (+3954), donde la detección de al menos un alelo 2 de IL-1B (+3954) o la determinación de que el sujeto es homocigoto para el alelo 2 de IL-1A (+4845) indica que el paciente tiene o está predispuesto a tener un trastorno de placas frágiles.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende además detectar uno o más alelos adicionales seleccionados entre el grupo consistente en IL-1B (-511) e IL-1RN (+2018).
3. El método de la reivindicación 1, donde dicha etapa de detección es un procedimiento seleccionado entre el grupo consistente en:
a) hibridación de oligonucleótidos con especificidad de alelo;
b) análisis por tamaños;
c) secuenciación;
d) hibridación;
e) digestión con nucleasa 5';
f) polimorfismo de conformación de una sola cadena;
g) hibridación con especificidad de alelo;
h) extensión específica de cebador; y
j) ensayo de ligamiento de oligonucleótidos.
4. El método de la reivindicación 3, donde dicho análisis por tamaños va precedido de una digestión con enzimas de restricción.
5. El método de la reivindicación 4, donde dicha digestión con enzimas de restricción usa una enzima de restricción apropiada seleccionada entre el grupo consistente en Alu I, Msp I, Nco I, Fnu 4HI, Ava I, Bsu 36 I, y Taq I.
6. El método de la reivindicación 1, que comprende además amplificar la muestra de ácido nucleico.
7. El método de la reivindicación 6, donde la amplificación de la muestra de ácido nucleico emplea un par de cebadores seleccionados entre 5' CTG AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3' y 5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3'; o 5' ATG GTT TTA GAA ATC ATC AAG CCT AGG GCA 3' y 5' AAT GAA AGG AGG GGA GGA TGA CAG AAA TGT 3'.
ES00939389T 1999-05-26 2000-05-26 Diagnostico para la enfermedad de placas fragiles. Expired - Lifetime ES2313894T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32039599A 1999-05-26 1999-05-26
US320395 1999-05-26
US09/431,352 US6524795B1 (en) 1997-03-10 1999-11-01 Diagnostics for cardiovascular disorders
US431352 1999-11-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2313894T3 true ES2313894T3 (es) 2009-03-16

Family

ID=26982474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES00939389T Expired - Lifetime ES2313894T3 (es) 1999-05-26 2000-05-26 Diagnostico para la enfermedad de placas fragiles.

Country Status (10)

Country Link
US (2) US6524795B1 (es)
EP (2) EP1192279B1 (es)
JP (1) JP2003500071A (es)
AT (1) ATE407221T1 (es)
AU (1) AU780318B2 (es)
CA (1) CA2374916C (es)
DE (1) DE60040150D1 (es)
ES (1) ES2313894T3 (es)
IL (1) IL146631A0 (es)
WO (1) WO2000072015A2 (es)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6524795B1 (en) * 1997-03-10 2003-02-25 Interleukin Genetics, Inc. Diagnostics for cardiovascular disorders
US7820383B2 (en) * 1997-03-10 2010-10-26 Interleukin Genetics, Inc. Method for diagnosing myocardial infarction
US20050032077A1 (en) * 1998-03-10 2005-02-10 Duff Gordon W. Detecting genetic predisposition to sight-threatening diabetic retinopathy
US6291180B1 (en) * 1999-09-29 2001-09-18 American Registry Of Pathology Ultrasound-mediated high-speed biological reaction and tissue processing
WO2002000933A2 (en) * 2000-06-23 2002-01-03 Interleukin Genetics, Inc. Screening assays for identifying modulators of the inflammatory or immune responses
US20060235366A1 (en) * 2000-12-20 2006-10-19 Fox Hollow Technologies, Inc. Method of evaluating a treatment for vascular disease
US20050154407A1 (en) * 2000-12-20 2005-07-14 Fox Hollow Technologies, Inc. Method of evaluating drug efficacy for treating atherosclerosis
US20060032508A1 (en) * 2000-12-20 2006-02-16 Fox Hollow Technologies, Inc. Method of evaluating a treatment for vascular disease
US20050003041A1 (en) * 2001-05-01 2005-01-06 Gerhard Kamil Application of fluid bed technology in brewing
WO2002103031A2 (en) * 2001-06-15 2002-12-27 Interleukin Genetics, Inc. Methods for detecting and treating the early onset of aging-related conditions
US20040137066A1 (en) * 2001-11-26 2004-07-15 Swaminathan Jayaraman Rationally designed therapeutic intravascular implant coating
US20080311581A1 (en) * 2001-11-19 2008-12-18 David Wyllie Functional polymorphisms of the interleukin-1 locus affecting transcription and susceptibility to inflammatory and infectious diseases
WO2003044176A2 (en) 2001-11-19 2003-05-30 Interleukin Genetics, Inc. Functional polymorphisms of the interleukin-1 locus affecting transcription and susceptibility to inflammatory and infectious diseases
EP1572899A4 (en) * 2002-01-25 2006-10-11 Interleukin Genetics Inc BATTERY OF IL-1 GENES AND ASSOCIATED INFLAMMATORY POLYMORPHISMS AND HAPLOTYPES
US20070264645A1 (en) * 2002-01-25 2007-11-15 Kenneth Kornman IL-1 gene cluster and associated inflammatory polymorphisms and haplotypes
US20040148013A1 (en) * 2002-04-18 2004-07-29 Epstein Stephen E Stent-based delivery statins to prevent restenosis
US20030220556A1 (en) * 2002-05-20 2003-11-27 Vespro Ltd. Method, system and device for tissue characterization
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
BR0314552A (pt) * 2002-09-30 2005-08-09 Novartis Ag Métodos para prognosticar elevações de colesterol durante terapia imunossupressora
US6979294B1 (en) * 2002-12-13 2005-12-27 California Institute Of Technology Split-screen display system and standardized methods for ultrasound image acquisition and processing for improved measurements of vascular structures
US20050108045A1 (en) * 2003-11-17 2005-05-19 Jiao Gong Method of network hospital of reclassification of diseases that have been made a diagnosis
WO2005110039A2 (en) * 2004-05-07 2005-11-24 Applera Corporation Genetic polymorphisms associated with vascular diseases, methods of detection and uses thereof
US8034553B2 (en) * 2004-06-24 2011-10-11 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Biomarkers for wound healing
US7560227B2 (en) * 2005-02-28 2009-07-14 University Of Massachusetts Biomarkers of vulnerable atherosclerotic plaques and methods of use
US7794413B2 (en) * 2005-04-19 2010-09-14 Ev3, Inc. Libraries and data structures of materials removed by debulking catheters
US20060293709A1 (en) * 2005-06-24 2006-12-28 Bojarski Raymond A Tissue repair device
US20070099239A1 (en) * 2005-06-24 2007-05-03 Raymond Tabibiazar Methods and compositions for diagnosis and monitoring of atherosclerotic cardiovascular disease
CA2617637C (en) * 2005-08-02 2017-07-18 Xbiotech Inc. Diagnosis, treatment, and prevention of vascular disorders using il-1.alpha. autoantibodies
WO2007050794A2 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Interleuken Genetics, Inc. The il-1 gene cluster and associated inflammatory polymorphisms and haplotypes
EP2089538B1 (en) * 2006-11-15 2013-08-21 Interleukin Genetics, Inc. The il-1 gene cluster and insulin resistance: associated polymorphisms, haplotypes and methods of using same
US20110245283A1 (en) * 2009-12-21 2011-10-06 Murata Glen H Methods for predicting the response to statins
US8906613B2 (en) * 2012-02-14 2014-12-09 Lasse Folkersen Method and kit for performing profiling of endarterectomy patients
RU2557916C1 (ru) * 2013-12-27 2015-07-27 государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики окклюзирующих поражений сосудов у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями
WO2016054079A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Zyomed Corp. Systems and methods for blood glucose and other analyte detection and measurement using collision computing
WO2017123696A1 (en) 2016-01-12 2017-07-20 Interleukin Genetics, Inc. Methods for predicting response to treatment
US9554738B1 (en) 2016-03-30 2017-01-31 Zyomed Corp. Spectroscopic tomography systems and methods for noninvasive detection and measurement of analytes using collision computing
US10329620B2 (en) 2017-01-12 2019-06-25 Cardioforecast Ltd. Methods and kits for treating cardiovascular disease
CA3142662A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Sitokine Limited Compositions and methods for treating lung, colorectal and breast cancer
WO2021028469A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Sitokine Limited Compositions and methods for treating cytokine release syndrome and neurotoxicity
WO2021205013A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Sitokine Limited Compositions and methods for treating covid-19

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582788A (en) 1982-01-22 1986-04-15 Cetus Corporation HLA typing method and cDNA probes used therein
US5110920A (en) 1982-01-22 1992-05-05 Cetus Corporation HLA typing method and DNA probes used therein
US4623619A (en) 1982-03-03 1986-11-18 Nordisk Insulinlaboratorium Method for the determination of liability in human individuals to develop atherosclerosis
GB8311018D0 (en) 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US4833080A (en) 1985-12-12 1989-05-23 President And Fellows Of Harvard College Regulation of eucaryotic gene expression
US4998617A (en) 1986-09-15 1991-03-12 Laura Lupton Inc Facial cosmetic liquid make up kit
US5268267A (en) 1987-08-21 1993-12-07 The General Hospital Corporation Method for diagnosing small cell carcinoma
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
FR2650840B1 (fr) 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
WO1992015694A1 (en) 1991-03-08 1992-09-17 The Salk Institute For Biological Studies Flp-mediated gene modification in mammalian cells, and compositions and cells useful therefor
ATE267877T1 (de) 1993-01-07 2004-06-15 Sequenom Inc Dns - sequenzierung durch massenspektronomie
GB9301453D0 (en) 1993-01-26 1993-03-17 Clonit Spa Nucleotide proves
US5593826A (en) 1993-03-22 1997-01-14 Perkin-Elmer Corporation, Applied Biosystems, Inc. Enzymatic ligation of 3'amino-substituted oligonucleotides
US5658729A (en) * 1994-10-11 1997-08-19 The University Of British Columbia Method, reagent and kit for evaluating susceptibility to premature atherosclerosis
US5686246A (en) * 1995-08-03 1997-11-11 Kornman; Kenneth S. Detecting genetic predisposition to periodontal disease
US5942390A (en) 1996-01-12 1999-08-24 Cedars-Sinai Medical Center Method of diagnosing predisposition for ulcerative colitis in Jewish population by detection of interleukin-1 receptor antagonist polymorphism
US5698399A (en) * 1996-04-05 1997-12-16 Duff; Gordon W. Detecting genetic predisposition for osteoporosis
GB9621129D0 (en) 1996-10-10 1996-11-27 Duff Gordon W Detecting genetic predisposition to sight-threatening diabetic retinopathy
US6720141B1 (en) * 1999-11-01 2004-04-13 Interleukin Genetics, Inc. Diagnostics and therapeutics for restenosis
US6524795B1 (en) * 1997-03-10 2003-02-25 Interleukin Genetics, Inc. Diagnostics for cardiovascular disorders
US6210877B1 (en) 1997-03-10 2001-04-03 Interleukin Genetics, Inc. Prediction of coronary artery disease
GB9723553D0 (en) * 1997-11-07 1998-01-07 Duff Gordon W Prediction of the risk of chronic obstructive airway disease
GB9711040D0 (en) * 1997-05-29 1997-07-23 Duff Gordon W Prediction of inflammatory disease
AU769949B2 (en) * 1998-04-21 2004-02-12 Interleukin Genetics, Inc. Fetal testing for prediction of low birth weight
DE60039760D1 (de) * 1999-05-24 2008-09-18 Interleukin Genetics Inc Diagnose von Restenose

Also Published As

Publication number Publication date
AU780318B2 (en) 2005-03-17
WO2000072015A2 (en) 2000-11-30
IL146631A0 (en) 2002-07-25
EP2071040A2 (en) 2009-06-17
WO2000072015A3 (en) 2002-02-07
US6524795B1 (en) 2003-02-25
ATE407221T1 (de) 2008-09-15
DE60040150D1 (de) 2008-10-16
EP1192279B1 (en) 2008-09-03
CA2374916A1 (en) 2000-11-30
AU5448000A (en) 2000-12-12
EP2071040A3 (en) 2009-06-24
EP1192279A2 (en) 2002-04-03
CA2374916C (en) 2011-11-01
US20030175764A1 (en) 2003-09-18
JP2003500071A (ja) 2003-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2313894T3 (es) Diagnostico para la enfermedad de placas fragiles.
US7820383B2 (en) Method for diagnosing myocardial infarction
US20230100271A1 (en) Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
AU779772B2 (en) Diagnostic and therapeutics for sepsis
US20090093396A1 (en) Diagnostics and therapeutics for restenosis
US20060099610A1 (en) Method and kit for detecting a risk of acute myocardial infarction
ES2431671T3 (es) El complejo génico de IL-1 y resistencia a la insulina: polimorfismos asociados, haplotipos y métodos para usarlos
ES2261239T3 (es) Diagnostico y terapia para la osteoporosis.
Bashour et al. The Role of Interleukin‐1 Genotype in the Association between Coronary Heart Disease and Periodontitis in a Syrian Population
AU782836B2 (en) Diagnostics and therapeutics for restenosis
Rallidis et al. G-455A polymorphism of β-fibrinogen gene and the risk of premature myocardial infarction in Greece
US20030044810A1 (en) Methods, compositions, and kits relating to cardiovascular disease
Colonna Identification of High Risk Coronary Artery Disease patient by Molecular Techiniques: the MEF-2A paradigm