ES2312565T3 - Peptidos antimicrobianos derivados de virus. - Google Patents

Abstract

Péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: RVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:4) RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:5); VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:6); RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:7); RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:8); RVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:9); RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10); VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:11); y RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV (SEQ ID NO:12).

Description

Péptidos antimicrobianos derivados de virus.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de agentes antimicrobianos ha conducido a una disminución significativa en la morbimortalidad de enfermedades infecciosas en este siglo. Esta contribución importante a la salud pública se ha debido en gran parte al uso extendido de antibióticos que seleccionan como diana rutas biosintéticas de proteínas, ARN, ADN, pared celular, nutriente específicas que son características de bacterias patógenas. Sin embargo, en los últimos años la capacidad de controlar enfermedades infecciosas se ha visto amenazada por la aparición de cepas bacterianas que ya no son susceptibles frente a agentes antimicrobianos actualmente disponibles (véase Files, 1999, Chest. 115:3S-8S). El mantenimiento de la salud pública exige la necesidad de desarrollar nuevos agentes antimicrobianos para contraatacar a estas bacterias resistentes emergentes con el fin de que sigan utilizándose los procedimientos eficaces de control de enfermedades infecciosas.

Un grupo heterogéneo de péptidos antimicrobianos derivados de huésped han llamado la atención como posibles nuevos agentes terapéuticos (véase Hancock, R.E., 1999, Drugs 57:469-473). Estos péptidos desempeñan un papel importante en la inmunidad innata de vertebrados contra la infección. Por ejemplo, los péptidos antimicrobianos catiónicos constituyen tanto como el 18% en peso de la proteína neutrófila total. También se encuentran en altas concentraciones en superficies de la mucosa dañadas. En general, estos péptidos catiónicos derivados de huésped se encuentran en una de las cuatro categorías: (i) estructuras de lámina \beta que se estabilizan mediante múltiples enlaces disulfuro (por ejemplo, defensina-1 humana), (ii) estructuras de bucle estabilizadas covalentemente (por ejemplo, bactenecina), (iii) péptidos helicoidales extendidos, ricos en triptófano (Trp) (por ejemplo, indolicidina) y (iv) hélices \alpha anfipáticas (por ejemplo, las magaininas y cecropinas) (véase Hwang y Vogel, 1998, Biochemistry & Cell Biology 76:235-246). Recientemente se ha descrito una nueva clase de péptidos antimicrobianos, las catelicidinas, que utilizan todos estos motivos estructurales y son claramente importantes en la defensa del huésped contra la infección (Ganz y Lehrer, 1997, Current Opinion in Hematology 4:53-58).

Las catelicidinas son una colección de moléculas notablemente diversa que se derivan de prepropéptidos que comparten un segmento de propéptido N-terminal altamente conservado que se han descrito en seres humanos, reses, ovejas, conejos, ratones y cerdos (véase Hwang y Vogel, 1998, Biochemistry & Cell Biology 76:235-246). El segmento de propéptido conservado de aproximadamente 100 aminoácidos comparte similitud de secuencia con la proteína porcina catelina, un supuesto inhibidor de la cisteína proteasa, de ahí el nombre de la familia. El dominio C-terminal codifica para un motivo de péptido antimicrobiano similar a uno de los descritos anteriormente, dependiendo del huésped y del tejido asociado con él. Las catelicidinas se almacenan en gránulos neutrófilos como propéptidos (que carecen de actividad antimicrobiana en esta forma), conduciendo la activación neutrófila a la escisión endoproteolítica mediada por la elastasa y a la generación del péptido antimicrobiano C-terminal. La catelicidina humana, denominada alternativamente FALL-39, hCAP18, LL-37 o CAMP, en su forma procesada (activa) es un péptido catiónico \alpha-helicoidal anfifílico de 37 aminoácidos (véase Zanetti, Gennaro y Romeo, 1995, FEBS Letters 374:1-5). Se ha detectado la expresión de LL-37 en neutrófilos humanos, células testiculares, epitelios respiratorios y en queratinocitos en los sitios de inflamación.

Los péptidos catiónicos anfipáticos de la clase \alpha-helicoidal muestran concentraciones bactericidas mínimas (CBM) en el intervalo de \mug/ml (niveles equivalentes a otros agentes antimicrobianos) y pueden destruir una amplia gama de patógenos bacterianos Gram negativos y Gram positivos, incluyendo los que son altamente resistentes a múltiples antibióticos (véase Hancock, R.E., 1999, Drugs 57:469-473). El mecanismo mediante el cual estos péptidos destruyen bacterias procede en un proceso de dos etapas uniéndose en primer lugar a la superficie bacteriana cargada negativamente y conduciendo estos péptidos unidos hacia la membrana bacteriana, perturbando de ese modo su integridad estructural. Para microorganismos Gram negativos, los péptidos antimicrobianos catiónicos tienen la ventaja añadida de unirse a lipopolisacárido (LPS), eliminando de ese modo la toxicidad de su actividad endotóxica (véase Scott, Yan y Hancock, 1999, Infection & Immunity 67:2005-2009). El distintivo de los péptidos antimicrobianos \alpha-helicoidales catiónicos anfipáticos es su capacidad para plegarse en una estructura secundaria anfipática que presenta una cara hidrófila con una carga neta positiva de al menos +2. Varias combinaciones de secuencias de aminoácidos diferentes permiten que un péptido alcance esta estructura característica. Por consiguiente, cientos de péptidos \alpha-helicoidales catiónicos anfipáticos derivados de huésped se han descrito hasta la fecha, mostrando todos homología de secuencia limitada al ni-
vel de comparación de secuencia primaria (véase Hwang y Vogel, 1998, Biochemistry & Cell Biology 76:235-246).

Al contrario de los péptidos antimicrobianos derivados de huésped, que han evolucionado con el fin expreso de destruir bacterias, se ha descrito una clase novedosa de péptidos antimicrobianos derivados de segmentos diferenciados de la cola citoplasmática de la proteína transmembrana (TM) lentiviral que no han evolucionado para el mismo fin que los péptidos derivados de huésped (véase Beary et al., 1998, Journal of Peptide Research 51:75-79; Comardelle et al., 1997, AIDS Research & Human Retroviruses 11:1525-1532; Miller et al., 1993, AIDS Research & Human Retroviruses 9:1057-1066; Miller et al., 1993, Virology 196: 89-1000; Tencza et al., 1995, Virology 69:5199-5202; Tencza et al., 1997, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 41: 2394-2398; Tencza et al., 1997, AIDS Research & Human Retroviruses 13:263-269; Yuan et al., 1995, Biochemistry 34:10690-10696). Estos péptidos se denominan péptidos líticos lentivirales (LLP, lentiviral lytic peptide) siendo el LLP prototípico LLP1 (aminoácidos 828-856 del aislado viral del VIH-1 HXB2R Env). LLP1 se deriva de los 28 residuos codificados por la parte C-terminal de la proteína TM del VIH-1 que, cuando toma el modelo de una hélice \alpha, demuestra carácter anfipático con caras hidrófoba y catiónica claramente delineadas. Entre los muchos péptidos antimicrobianos descritos actualmente en la bibliografía, LLP1 es lo más homólogo químicamente a las magaininas y la catelicidina humana, LL37.

Se ha estudiado LLP1 para determinar su unión a calmodulina y sus propiedades antibacterianas. LLP1 se une a la calmodulina saturada con Ca2+ de célula huésped con afinidad próxima a nanomolar y esta propiedad se ha correlacionado con la inhibición de la activación de células T, lo que sugiere que estos péptidos pueden reducir una respuesta inflamatoria (véase Beary et al., 1998, Journal of Peptide Research 51:75-79; Miller et al., 1993, AIDS Research & Human Retroviruses 9:1057-1066; Tencza et al., 1995, Virology 69:5199-5202; Tencza et al., 1997, AIDS Research & Human Retroviruses 13:263-269; Yuan et al., 1995, Biochemistry 34:10690-10696). Se ha investigado la actividad antibacteriana de LLP1 reconociendo diversos aislados bacterianos Gram negativos y Gram positivos. Este análisis demuestra que LLP1 tiene actividad antibacteriana que es igual a, o más potente que magainina-2. Estos aislados incluían cepas resistentes a meticilina y vancomicina así como otras cepas que eran altamente resistentes a múltiples antibióticos (véase Tencza et al., 1997, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 41:2394-2398). La lisis de bacterias mediante LLP1 es rápida, casi esterilizando una suspensión de 1x10^{5} unidades formadoras de colonias de Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus en el plazo de 60 segundos de exposición (véase Tencza et al., 1997. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 41:2394-2398). Se cree que el mecanismo de acción de LLP1 altera a las membranas bacterianas cargadas negativamente, y en menor grado, a las membranas de células de mamífero neutras. La predilección del péptido por las células bacterianas con respecto a las membranas de células de mamífero forma la base de su toxicidad selectiva.

Cambios de aminoácidos individuales en el LLP1 afecta profundamente a su actividad antibacteriana y de unión a calmodulina (véase Tencza et al., 1995, Virology 69:5199-5202; Tencza et al., 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41). En general, las sustituciones de aminoácidos en la secuencia de LLP1 original de residuos básicos por residuos ácidos disminuyen tanto las actividades bactericidas como de unión a calmodulina. De manera similar, la alteración de residuos hidrófobos individuales a residuos hidrófilos también disminuía estas dos actividades. Además, la dimerización a través de la formación de enlace disulfuro de una Cys individual encontrada dentro de la secuencia original de LLP1 aumentó significativamente su actividad para S. aureus (véase Tencza et al., 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41). Finalmente, la disminución de la longitud del dímero de LLP1 hasta 21 residuos (péptido bis-TL1) redujo su actividad de lisis de eritrocitos sin reducir significativamente su actividad antibacteriana (véase Tencza et al., 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41). Estos datos sugieren que la secuencia original de LLP1 puede modificarse mediante ingeniería genética para aumentar la potencia y la selectividad. El potencial de esta modificación mediante ingeniería genética forma la base de esta invención.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a péptidos que tienen actividad antimicrobiana ("péptidos antimicrobianos"). La actividad antimicrobiana de otros análogos de péptido LLP1 se has descrito anteriormente (véase Tencza et al., 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41, patente estadounidense número 5.714.577 concedida a Montelaro et al. y patente estadounidense número 5.945.507 concedida a Montelaro et al.).

En una realización de la invención, se proporcionan los péptidos antimicrobianos que son análogos de LLP1 que tienen modificaciones basadas en los siguientes principios: (i) optimización de la anfipaticidad, (ii) sustitución de arginina (Arg) en la cara cargada y/o valina (Val) o triptófano (Trp) en la cara hidrófoba por otro aminoácido, y (iii) aumento de la longitud del péptido (denominado de manera colectiva en el presente documento péptidos LBU, por ejemplo LBU-2, SEQ ID NO:4; LBU-3, SEQ ID NO:5; LBU-3.5, SEQ ID NO:6; LBU-4, SEQ ID NO:7; WLBU-1, SEQ ID NO:8, WLBU-2, SEQ ID NO:9, WLBU-3, SEQ ID NO:10; y WLBU-4, SEQ ID NO:11; véase la tabla 1). Los 52 péptidos LBU se desvían mucho del LLP1 original, por ejemplo, LBU-2 y LBU-3 se desvían de la secuencia de LLP1 original en más del 90%.

TABLA 1

1

2

Los péptidos LBU (denominados en el presente documento "LLP modificados mediante ingeniería genética" (eLLP)) de la presente invención tienen un amplio espectro de actividad (es decir, la capacidad para destruir bacterias sumamente resistentes) y aumento de potencia (es decir, disminución de la concentración molar requerida para destruir bacterias) cuando se comparan con los análogos de LLP1 descritos anteriormente. Los eLLP de la presente invención son altamente inhibidores frente a microorganismos en concentraciones de sal fisiológica, actúan en presencia de líquido sinovial y demuestran sólo una toxicidad mínima en modelos animales. Como resultado, los eLLP pueden definirse como agentes antimicrobianos selectivos. Además, los péptidos de la presente invención actúan perturbando membranas bacterianas y son activos cuando se unen a una fase sólida. La capacidad de estos péptidos para mantener la actividad cuando se unen a una fase sólida es una ventaja significativa con respecto a los antibióticos convencionales porque estos péptidos pueden ser útiles como recubrimientos sobre dispositivos estériles tales como prótesis o catéteres en los que sería ventajoso evitar la nucleación de biopelículas bacterianas.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención puede entenderse mejor con referencia a los dibujos adjuntos de los que

La figura 2 muestra las secuencias de los péptidos LBU modificados mediante ingeniería genética (SEQ ID NO:4-12).

Descripción detallada

Desde la notificación de la actividad antibacteriana del LLP1 (véase Tencza et al., 1997, Antimicrobial Agents & Chemotherapy 41:2394-2398), se han preparado varios análogos de LLP1 diferentes (véase, por ejemplo la patente estadounidense número 5.714.577 concedida a Montelaro et al. y la patente estadounidense número 5.945.507 concedida a Montelaro et al. y Tencza et al., 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33041) manipulando la secuencia original para aumentar la potencia (es decir, aumentar su actividad de destrucción bacteriana molar) y ampliar el espectro de actividad contra aislados clínicos. Esto se ha alcanzado optimizando las caras hidrófilas e hidrófobas de la hélice \alpha tomada como modelo. La presente invención se refiere a péptidos antimicrobianos que son análogos de LLP1 que tienen modificaciones basadas en los siguientes principios: (i) optimización de la anfipaticidad, (ii) sustitución por Arg en la cara cargada y Val en la cara hidrófoba, (iii) aumento de la longitud del péptido, y (iv) sustitución de manera periódica de Val por Trp (denominado de manera colectiva en el presente documento péptidos LBU, por ejemplo LBU-1 (SEQ ID NO:4) LBU-2, SEQ ID NO:5; LBU-3, SEQ ID NO:6; LBU-3.5, SEQ ID NO:7; LBU-4, SEQ ID NO:8; WLBU-1, SEQ ID NO:9; WLBU-2, SEQ ID NO:10; WLBU-3, SEQ ID NO:11; y WLBU-4, SEQ ID NO:12, véase la tabla 1). Los péptidos LBU de la presente invención se denominan en el presente documento eLLP. La composición de LBU-4 (SEQ ID NO:7) y WLBU-4 (SEQ ID NO:12) se describe en la figura 2 con respecto a sus secuencias primarias cuando se toma como modelo una estructura \alpha-helicoidal.

La presente invención se refiere a péptidos que comprenden modificaciones basadas en los siguientes principios: (i) optimización de la anfipaticidad, (ii) sustitución por Arg en la cara cargada y Val en la cara hidrófoba, (iii) aumento de la longitud del péptido, y (iv) sustitución de manera periódica de Val por Trp. Los péptidos modificados según estos principios se denominan en el presente documento los péptidos de unidad de base lítica (LBU, Lytic Base Unit). Por ejemplo, los péptidos LBU-2 y LBU-3 se formularon como un polímero de residuos Arg y Val diseñado para crear el carácter \alpha-helicoidal anfipático máximo con una longitud de al menos 24 residuos.

La actividad antimicrobiana de los péptidos de la presente invención se trata a continuación en los ejemplos.

Los péptidos antimicrobianos de la presente invención son únicos en sus secuencias. Los péptidos LBU están completamente modificados mediante ingeniería genética y no se basan en ninguna secuencia nativa.

La actividad de los eLLP, LBU-1 (SEQ ID NO:4); LBU-2 (SEQ ID NO:5), LBU-3 (SEQ ID NO:6), LBU-3 (SEQ ID NO:7), LBU-4(SEQ ID NO:8), WLBU-1 (SEQ ID NO:9), WLBU-2 (SEQ ID NO:10), WLBU-3 (SEQ ID NO:11) y WLBU-4 (SEQ ID NO:12) contra una gama de bacterias incluyendo Staphylococcus aureus, S. aureus resistente a meticilina, y Pseudomonas aeruginosa se resume en la tabla 2 a continuación.

La tabla 2 indica las CBM de péptidos expresados en concentraciones nanomolares. Estos resultados demuestran la potencia antimicrobiana de estos eLLP. La actividad de estos péptidos se compara favorablemente con otros péptidos antibacterianos que pueden tener una actividad igual o disminuida (tal como se indica por una concentración bactericida mínima superior, CBM.). La tabla 2 indica las CBM de los eLLP contra diferentes microorganismos y a diferentes condiciones de sal (expresadas en nanomolar).

TABLA 2

3

Los péptidos antimicrobianos de la presente invención, denominados de manera colectiva en el presente documento "eLLP", muestran actividad antimicrobiana contra diversos microorganismos. Los eLLP comprenden secuencias ricas en Arg, que cuando se modelan para dar una estructura secundaria, presentan alta anfipaticidad y momento hidrófobo. Los eLLP son altamente inhibidores frente a microorganismos, pero significativamente menos tóxicos frente a células de mamífero. Como resultado, estos péptidos pueden caracterizarse como agentes antimicrobianos selectivos. Los eLLP de la presente invención comprenden modificaciones basadas en los siguientes principios: (i) optimización de la anfipaticidad, (ii) sustitución de Arg en la cara cargada y/o Val o Trp en la cara hidrófoba, y (iii) aumento de la longitud del péptido, y se denominan de manera colectiva en el presente documento péptidos LBU.

Tal como se usa en el presente documento, el término "antimicrobiano" se refiere a la capacidad de los péptidos de la invención para evitar, inhibir o destruir el crecimiento de microbios tales como bacterias, hongos, protozoos y virus. Tal como se usa en el presente documento, el término "péptido" se refiere a un olígomero de al menos dos aminoácidos contiguos, unidos entre sí mediante un enlace peptídico.

Los eLLP son ricos en residuos cargados positivamente y se predice que forman una hélice \alpha anfipática. La hélice \alpha anfipática confiere una actividad microbiana única y potente a los péptidos de la presente invención. Las propiedades estructurales que definen los péptidos antimicrobianos de la invención incluyen, entre otras, la capacidad para formar estructuras \alpha-helicoidales anfipáticas tridimensionales (Eisenberg y Wesson, 1990, Biopolymers 29:171-177). La estructura \alpha-helicoidal anfipática comprende residuos dispuestos de modo que 3,6 residuos de aminoácidos completan una vuelta de la hélice. Basándose en esta disposición, que se basa en restricciones de plegamiento de proteínas bien conocidas, puede realizarse una estimación de la anfipaticidad mediante examen de la secuencia de aminoácidos.

En una realización de la invención, la optimización de este motivo \alpha-helicoidal anfipático "ideal" es uno de los principios usados para generar los eLLP de esta invención. En otra realización de la invención, la sustitución de residuos de Arg en la cara hidrófila y residuos de Trp o Val en la cara hidrófoba es uno de los principios usados para generar los eLLP de la presente invención. Los péptidos antimicrobianos de la invención pueden contener además Ala, Gly, Ile o Phe y otros residuos de aminoácido que pueden tolerarse dentro de una estructura \alpha-helicoidal anfipática general. Estos residuos pueden conferir una estructura, que promueve la potencia y selectividad de un péptido de una manera que sólo puede determinarse empíricamente. Algunos eLLP de la invención contienen una Cys que, en virtud de su capacidad para formar un enlace disulfuro, puede conferir un aumento de potencia a un péptido que contiene un residuo de este tipo como un péptido dimérico unido mediante disulfuro (por ejemplo, bis-eLLP). La posición de la Cys se encuentra en interfase de las caras hidrófila e hidrófoba de la estructura \alpha-helicoidal anfipática cuando se modelan como tal. La ubicación de tales residuos de Cys no sería obvia para alguien experto en la técnica y debe determinarse empíricamente. Esto puede realizarse por un experto en la técnica sin experimentación excesiva, por ejemplo usando una modelización por ordenador de la estructura peptídica. Por ejemplo, pueden usarse programas de modelización por ordenador tales como "Helical Wheel" (Genetics Computer Group, Madison, Wis.) para diseñar los péptidos de la presente invención. En una realización adicional, la longitud de los péptidos de la presente invención puede aumentarse para mejorar su actividad antimicrobiana.

Los eLLP de la presente invención son únicos en sus propiedades funcionales. La estructura única de los péptidos antimicrobianos confiere alta potencia mientras que mantiene la selectividad por bacterias. La potencia de los péptidos antimicrobianos se compara muy favorablemente con la de magainina o catelicidina. Los eLLP destruyen rápidamente tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas, demostrando un amplio espectro de actividad incluyendo, pero sin limitarse a, bacterias Gram positivas tales como Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis (incluyendo cepas sensibles a vancomicina (VSEF) y resistentes a vancomicina (VREF)), Enterococcus faecium (incluyendo cepas sensibles a vancomicina (VSEF) y resistentes a vancomicina (VREF)), Staphylococcus aureus (incluyendo cepas sensibles a meticilina (MSSA) y resistentes a meticilina (MRSA)), Staphylococcus epidermidis (incluyendo cepas sensibles a meticilina (MSSE) y resistentes a meticilina (MRSE)), Staphylococcus salivarius, Corynebacterium minutissium, Corynebacterium pseudodiphtheriae, Corynebacterium stratium, Corynebacterium grupo G1, Corynebacterium grupo G2, Streptococcus pneumonia (incluyendo cepas resistentes a penicilina (PSRP)), Streptococcus mitis y Streptococcus sanguis; bacterias Gram negativas incluyendo Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Serratia marcescens, Haemophilus influenzae, Moraxella sp., Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella typhimurium, Actinomyces spp., Porphyromonas spp., Prevotella melaninogenicus, Helicobacter pylori, Helicobacter felis y Campylobacter jejuni. Las propiedades funcionales incluyen también la actividad antimicrobiana selectiva con toxicidad mínima para células de mamífero. Por tanto, basándose en las enseñanzas y directrices en el presente documento, un experto en la técnica puede diseñar fácilmente estos eLLP dentro del alcance la invención, que tienen una selectividad y potencia deseadas.

Análogos de péptidos antimicrobianos y/o otros péptidos citolíticos particulares están dentro del alcance de la presente invención. Los análogos conservan las propiedades estructurales y funcionales descritas en el presente documento. En otra realización de la invención, pueden usarse D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos y pueden proporcionar un aumento de la estabilidad metabólica, puesto que los péptidos que contienen D-aminoácidos son resistentes frente a proteasas de mamífero, que generalmente escinden péptidos compuestos por L-aminoácidos. Por ejemplo, análogos de cecropina que contienen D-aminoácidos muestran actividad antibacteriana (Merrifield et al., Antimicrobial Peptides, Ciba Foundation Symposium, Wiley, Chichester, 5-26, 1994). Tal como se trató anteriormente, la inclusión de un residuo de Cys en un péptido antimicrobiano es útil para facilitar la formación de enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares que pueden estabilizar un péptido dimérico y mejora la potencia antimicrobiana contra determinados patógenos microbianos tales como S. aureus.

Los péptidos antimicrobianos de la presente invención pueden ser sumamente activos en condiciones de alto contenido en sal y en fluidos biológicos. La capacidad de los péptidos para mantener la actividad en concentraciones de NaCl fisiológicas permite que los péptidos muestren actividad antimicrobiana dentro de fluidos fisiológicos de huéspedes vertebrados.

Los péptidos de esta invención pueden sintetizarse mediante técnicas clásicas de síntesis en fase sólida de Merrifield, usando procedimientos manuales o automatizados conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe por Miller et al. (AIDS Research & Human Retroviruses 7:511-519 (1991), usando un modelo 200 de Advanced Chemtech (Advanced Chemtech, Louisville, Ky.), o usando un sintetizador automatizado 9050+ de Millipore (Millipore, Bedford, Mass.) con protocolos de síntesis de Fmoc (véase Fontenot et al., 1991, Peptide Research 4:19-25), u otra instrumentación disponible. Tras la escisión y desprotección, los péptidos sintéticos pueden purificarse mediante, por ejemplo, cromatografía de filtración en gel y cualquier sistema de HPLC/con columna de fase inversa conocido para el experto en el técnica. También pueden prepararse péptidos mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica para el diseño de péptidos a base de nucleótidos (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Nueva York, 1995). Puede usarse la síntesis de oligonucleótidos o la mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, para preparar análogos de péptido a partir de péptidos originales. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos también pueden confirmarse e identificarse mediante análisis de composición de aminoácidos así como la degradación de Edman manual y automatizada y la determinación de cada aminoácido, análisis de HPLC o espectrometría de masas. El aminoácido N-terminal de los péptidos puede contener un grupo amino libre o puede estar acetilado y el aminoácido C-terminal del péptido puede estar amidado, lipidado o comprender un grupo carboxilo libre. Otras modificaciones de los extremos terminales del péptido conocidos para los expertos en la técnica están dentro del alcance de la invención.

La trascendencia de los residuos de aminoácidos particulares en un péptido puede someterse a prueba alterando o sustituyendo el residuo de interés. Por ejemplo, el requisito para un residuo de Cys, que puede estar implicado en la formación de enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares, puede someterse a prueba mediante mutagénesis de la Cys para dar otro aminoácido, por ejemplo, tirosina, que no puede formar un enlace de este tipo. Puede alterarse químicamente una Cys de modo que prevenga la formación de un enlace disulfuro mediante, por ejemplo, reducción y carboxiamidación, en las que se añade un grupo amida al átomo de azufre de la cisteína (Creighton, T. E., ed., Protein Structure: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989). De manera inversa, un residuo de Cys en un péptido puede mantenerse en un estado oxidado (es decir, en forma de un enlace disulfuro) con el fin de evaluar si tales enlaces están implicados en la actividad antimicrobiana de un péptido. Tal oxidación puede realizarse mediante, por ejemplo, un procedimiento de oxidación con aire (Ellman, G. L., Arch. Biochem. 82: 70-77, 1959), o mediante oxidación con DMSO (Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 6657-6662, 1991). De manera similar, los residuos de Trp pueden sustituirse en la cara hidrófoba (por ejemplo, el péptido WLSA-5 (SEQ ID NO:3)).

La modelización por ordenador es útil para diseñar péptidos antimicrobianos de la presente invención basándose en sus propiedades estructurales preferidas. Un método convencional conocido en la técnica para predecir la estructura helicoidal anfipática a partir de una secuencia lineal es el algoritmo de Eisenberg (Eisenberg et al., Biopolymers 27: 171-177, 1990) y es útil para obtener un modelo de los péptidos de la presente invención. Las secuencias peptídicas se analizan para obtener la estructura secundaria, el momento hidrófobo y la anfipaticidad predichos usando programas disponibles para los expertos en la técnica (por ejemplo, pueden obtenerse a partir de internet). Pueden usarse estos programas que generalmente usan algoritmos que son predictivos de una estructura secundaria (Chou et al., Adv. Enz. 47: 45-146, 1978; Gamier et al., J. Mol. Biol. 120: 97, 1978) o un momento hidrófobo (Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 140-144, 1984).

La concentración peptídica se cuantifica usando un ensayo colorimétrico con ninhidrina convencional (véase el ejemplo 1 a continuación). Se genera una curva patrón usando un patrón de Leu leyendo la absorbancia espectrofotométrica a 570 nm de volúmenes crecientes de disoluciones madre de leucina combinadas con los reactivos de ninhidrina disponibles comercialmente (Dupont) en un espectrofotómetro. Las lecturas de muestras peptídicas se comparan con la curva patrón de leucina para cuantificar la cantidad de péptido en cada muestra. Alternativamente, si el péptido contiene Trp en su secuencia puede determinarse la concentración peptídica mediante espectroscopia UV usando un coeficiente de extinción molar \varepsilon_{280} = 5500^{-1} m\cdotcm^{-1}.

El efecto de los péptidos antimicrobianos de la presente invención sobre la viabilidad de células procariotas y eucariotas puede someterse a ensayo mediante cualquier método que determine la supervivencia tras el tratamiento o la exposición a los péptidos. Para fines de selección, se usan ensayos de dilución de caldo bacteriano convencionales y pueden compararse con ensayos de lisis de eritrocitos (véase Tencza et al., 1999, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:33-41). Sin embargo, en última instancia esta comparación de toxicidad selectividad debe realizarse cuando se exponen células tanto procariotas como eucariotas al péptido durante una incubación conjunta (es decir, en condiciones idénticas). Además, el efecto de los péptidos antimicrobianos sobre la viabilidad de otros patógenos, incluyendo levaduras, micoplasmas y virus, también puede someterse a prueba.

Las propiedades antibacterianas de los péptidos de la presente invención pueden determinarse, por ejemplo, a partir de un ensayo de lisis bacteriana (Ejemplo 1), así como mediante otros métodos, incluyendo, entre otros, ensayos de inhibición del crecimiento (Blondelie et al., Biochemistry 31:12688, 1992), ensayos de viabilidad bacteriana basados en fluorescencia (por ejemplo, BacLight de Molecular Probes), análisis de citometría de flujo (Arroyo et al., J. Virol. 69: 4095-4102, 1995), y otros ensayos convencionales conocidos para los expertos en la técnica.

La determinación de las propiedades antifúngicas de los péptidos de la invención puede realizarse mediante técnicas bien conocidas en la técnica (Selitrennikoff, C., Screening for Antifungal Drugs, in Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., ed., Butterworth-Heinemann, Boston, 1992). La determinación de las propiedades antivirales de los péptidos de la invención puede realizarse mediante técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica, por ejemplo mediante la capacidad de un péptido para inhibir la formación de placas virales en ensayos in vitro convencionales, reconocidos en la técnica (por ejemplo, Wild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10537-10541, 1992).

Los ensayos para determinar la inhibición del crecimiento de una diana microbinana pueden usarse para obtener un valor de concentración bactericida mínima (CBM) para el péptido, es decir, la concentración de péptido requerida para destruir el 99,9% de la muestra microbiana que está sometiéndose a prueba. Los expertos en la técnica conocen bien este valor como representativo de la eficacia de un agente antimicrobiano particular (por ejemplo, un antibiótico) contra un organismo particular o un grupo de organismos. En ensayos para detectar la CBM de un péptido, la inhibición del crecimiento de una población bacteriana puede medirse también con respecto al número de unidades formadoras de colonias (ufc) tras la exposición a un péptido en relación con un experimento control sin un péptido.

Otro parámetro útil para identificar y medir la eficacia de los péptidos antimicrobianos de la invención es la determinación de la cinética de la actividad antimicrobiana de un péptido. Una determinación de este tipo puede hacerse realizando cualquiera de los ensayos de la invención y determinando la actividad antimicrobiana como función del tiempo. En una realización preferida, los péptidos presentan una cinética que da como resultado la destrucción eficaz de un microorganismo.

Los péptidos antimicrobianos de la invención presentan toxicidad selectiva frente a microorganismos diana y toxicidad mínima frente a células de mamífero. La determinación de la toxicidad de los péptidos reivindicados en esta invención sobre células de mamífero se realiza preferiblemente usando ensayos de cultivo de tejidos. Para las células de mamífero, tales métodos de ensayo incluyen, entre otros, ensayos de MTT y de exclusión con azul trípano (véase Moore et al., 1994, Peptide Research 7:265-269). Cuando un tipo de célula específico puede liberar un metabolito específico tras los cambios en la permeabilidad de membrana, el metabolito puede someterse a ensayo, por ejemplo, la liberación de hemoglobina tras la lisis de eritrocitos (véase Srinivas et al., 1992, Journal of Biological Chemistry 267:7121-7127). Además, puede monitorizarse la alteración de la resistencia transepitelial (Rte) de una monocapa celular que ha formado uniones estrechas. Los péptidos de la invención se someten a prueba preferiblemente contra células primarias, por ejemplo, usando células del epitelio bronquial humano (HBE) en cultivo polarizado u otros cultivos de células primarias usados rutinariamente por los expertos en la técnica. También pueden usarse líneas celulares transformadas permanentemente, por ejemplo, células Jurkat.

Para determinar el potencial terapéutico de un eLLP, una CBM inferior para muestras bacterianas, fúngicas, protozoarias o virales en relación con el observado para células de mamífero define una antimicrobiana de manera selectiva. La caracterización de la actividad antimicrobiana de los péptidos de la invención puede realizarse usando cualquier microorganismo que puede cultivarse y someterse a ensayo, tal como anteriormente, incluyendo bacterias, hongos, protozoos o virus.

Los ensayos antibacterianos para los péptidos de la invención pueden realizarse para determinar la actividad de destrucción bacteriana hacia microorganismos tanto Gram positivos como Gram negativos. E. coli y P. aeruginosa son ejemplos de microorganismos Gram negativos. S. aureus puede usarse como modelo de un microorganismo Gram positivo, y éste es una diana clínica significativa puesto que la mayoría de las cepas no responden a la mayoría de tratamientos con antibióticos sistémicos. Puede usarse S. aureus resistente a meticilina como microorganismo modelo resistente a antibiótico. Puede someterse a ensayo E. faecalis, y en particular, los aislados resistentes a vancomicina encontrados en la práctica clínica, por ejemplo hospitales. S. marcescens es una fuente de infecciones oftálmicas y otras infecciones tópicas, y puede someterse a ensayo fácilmente. Los péptidos pueden usarse en el tratamiento de infecciones del oído externo (otitis externa), o en el tratamiento de enfermedades transmitidas sexualmente tales como las provocadas por Neisseria gonorrhoeae. Otros patógenos bacterianos, con frecuencia encontrados extracelularmente en superficies de la mucosa, que pueden ser dianas para los péptidos de la presente invención incluyen, pero no limitan a, Streptococcus pneumonia, Streptococcus pyogenes, estreptococos de grupo B, Gardnerella vaginalis, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter spp., Haemophilus aegyptius, Haemophilus influenzae, S. epidermis, Propionibacterium acnes y patógenos orales tales como Actinomyces spp., Porphyromonas spp. y Prevotella melaninogenicus. Otros patógenos microbianos también pueden seleccionarse como diana para estos péptidos y estos patógenos microbianos, y las infecciones que provocan, los conocen bien los expertos en la técnica.

Los micoplasmas pertenecen a la clase Mollicutes, eubacterias que parece que han evolucionado de manera regresiva mediante la reducción genómica desde antecesores Gram positivos. A diferencia de las bacterias clásicas, no tienen pared celular sino que en su lugar están delimitadas por una única membrana de tres capas y pueden susceptibles a determinados péptidos de la presente invención. Pueden realizarse ensayos antimicoplasma para someter a prueba la actividad antimicoplasma de los péptidos de la presente invención. Los patógenos humanos de micoplasma incluyen Mycoplasma pneumoniae (una patógeno respiratorio), Mycoplasma hominis (un patógeno genitourinario) y Ureaplasma urealyticum (un patógeno genitourinario). Los péptidos de la presente invención pueden usarse para tratar enfermedades relacionadas con infección por micoplasma. Además, la contaminación por micoplasma es un problema frecuente en el cultivo de células in vitro y es muy difícil de eliminar eficazmente. Por tanto, los péptidos de la presente invención pueden ser útiles para eliminar selectivamente la contaminación por micoplasma en cultivo de
tejidos.

Los hongos también pueden ser susceptibles a péptidos específicos de la invención debido a que sus membranas contienen ergosterol, que no se encuentra en células humanas. Esta diferenciación puede aprovecharse en aplicaciones terapéuticas de modo se diseñen péptidos de la invención, que inhiben selectivamente hongos, pero que no interfieren con la función de membrana de mamífero o de ser humano. Un precedente de un mecanismo de selección como diana de membrana antifúngica selectiva se encuentra, por ejemplo, en el uso del agente antifúngico, anfotericina B, que se une a ergosterol y forma poros en la membrana (Goodman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Macmillan Publishing, Nueva York, 1985). Todos los hongos pueden considerarse como posibles dianas de estos péptidos, incluyendo, pero sin limitarse a, dermatofitos, levaduras, hongos dimórficos y mohos filamentosos. Los patógenos fúngicos específicos que pueden ser dianas para los péptidos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Microsporum spp., Epidermophyton spp., Candida albicans, Cryptoccus neoformans, Trichophyton spp., Sporothrix schenkii y Aspergillus fumigatus, así como otros patógenos conocidos para los expertos en la técnica.

Los virus tanto de ADN como de ARN pueden ser dianas de los péptidos antimicrobianos de la invención. En una realización particular de la invención, un virus con envuelta puede ser susceptible al efecto antiviral de los péptidos debido a su capacidad para seleccionar como diana y alterar las estructuras de membrana. Aunque todos los virus son posibles dianas, los virus con envuelta, tales poxvirus, herpesvirus, hepadnavirus, baculovirus, ortomixovirus, paramixovirus, retrovirus, togavirus, rabdovirus, buniavirus y flavivirus, por ejemplo, pueden ser particularmente susceptibles a los péptidos antimicrobianos de la invención. En una realización preferida de la presente invención, el virus se selecciona del grupo que consiste en lentivirus, tales como VIH-1, herpes virus, tales como VHS, u ortomixovirus, tales como el virus influenza. En una realización particularmente preferida, el virus es VIH-1 debido a la asociación con proliferación sobre una superficie de la mucosa que podría manipularse mediante la administración tópica de un microbicida tal como un péptido sintético que es activo contra el VIH-1 y otros patógenos de enfermedades transmitidas sexualmente.

Adicionalmente, la aclaración adicional del mecanismo de los péptidos y sus dianas bioquímicas puede proceder del uso de mutantes isogénicos de bacterias, hongos, micoplasmas y virus que tienen alterado el contenido de membrana de pared externa y/o citoplásmica. Pueden someterse a prueba específicamente análogos de péptido de la invención contra estos mutantes para identificar diseños específicos que son inhibidores óptimamente contra constituyentes particulares de la membrana.

Los péptidos de la presente invención pueden ser útiles para inhibir o tratar una infección microbiana particular, tal como, pero sin limitarse a, infección pulmonar por fibrosis quística (véase el ejemplo 3 a continuación), septicemia de articulación (véase el ejemplo 4 a continuación), infecciones oculares, enfermedad periodontal, ETS, otitis externa, infecciones cutáneas, infecciones por quemaduras, infecciones vaginales y úlceras diabéticas en el pie.

Además, los péptidos de la presente invención pueden ser útiles para inhibir la colonización microbiana. Por ejemplo, los péptidos pueden suministrarse y expresarse mediante células eucariotas in vivo, mediante transfección usando vectores virales. La expresión continua de los péptidos en las células y la secreción en su entorno puede interferir con la colonización de microbios y prevenir la infección microbiana. Esto puede ser útil para prevenir la fibrosis quística suministrando los péptidos de la presente invención a las células epiteliales de las vías respiratorias que pueden inhibir la colonización de bacterias implicadas en la fibrosis quística. Las células que expresan los péptidos puede poder combatir de manera continua la colonización de una gama de microbios patógenos.

La evaluación de un péptido antimicrobiano de la invención para inhibir o tratar una infección microbiana particular puede también implicar el uso de modelos animales de infección que los expertos en la técnica reconocen como que son relevantes para tales infecciones en un ser humano u otro mamífero.

Las ventajas del uso de los eLLP como antibióticos incluyen la posibilidad de que puede ser más difícil para un microorganismo desarrollar un mecanismo de resistencia contra un antibiótico que selecciona como diana una estructura de membrana. El hecho de que otros patógenos microbianos no se han expuesto nunca a estos agentes (al contrario que los antibióticos convencionales) es una ventaja adicional. En vista de las propiedades indicadas anteriormente de los péptidos de la invención, se contempla que los péptidos antimicrobianos de la invención pueden usarse para tratar un proceso infeccioso en un huésped provocado por un microorganismo.

La administración sistémica de los péptidos de la presente invención puede inducir una respuesta inmunogénica en un huésped. Por tanto, pueden emplearse técnicas conocidas en la técnica, tales aplicar una capa de polietilenglicol, para reducir la inmunogenicidad de los péptidos cuando se administran sistémicamente.

Otra realización de esta invención es el mecanismo de acción tensioactivo de estos péptidos que les permite actuar mientras están unidos a un sustrato en fase sólida a través de su grupo amino N-terminal. Los péptidos de la presente invención son activos cuando están unidos a un sustrato en fase sólida. Por tanto, los péptidos de la presente invención son útiles como recubrimientos en dispositivos implantados, tales como prótesis, por ejemplo extremidades y articulaciones protésicas. Los péptidos también pueden ser útiles como recubrimientos sobre órganos artificiales y lentes intraoculares.

Los eLLP de la presente invención pueden tener un solo grupo amino y un grupo sulfhidrilo libre. Estos grupos funcionales permiten la unión específica a una superficie derivatizada. Por ejemplo, puede usarse la química de N-hidroxisuccinimida (NHS) para unir una superficie derivatizada de manera apropiada al grupo amino N-terminal de los eLLP de la presente invención. Alternativamente, una superficie derivatizada con grupos carboxilo libres podría reticurlarse con el grupo sulfhidrilo libre sobre el residuo de Cys de eLLP usando el éster de m-maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida (MBS, Pierce Chemical. Rorkford, IL). Los expertos en la técnica conocen otros métodos para acoplar péptidos a superficies derivatizadas.

Además, los eLLP de la presente invención se refieren a un complejo de péptido-carga en el que los péptidos de la presente invención pueden estar unidos a una carga para permitir el suministro de la carga en un microorganismo diana. La carga puede comprender un factor que tiene actividad antimicrobiana y puede mejorar la potencia y/o aumentar la actividad antimicrobiana de los eLLP de la presente invención. Por ejemplo, los eLLP pueden reticularse con enzimas bacterianas tales como lisozima o antibióticos, tales como penicilina, para aumentar su potencia. Otros métodos para unir los péptidos de la presente invención a la carga se conocen bien en la técnica.

Otro aspecto de la invención se refiere a métodos para eliminar un proceso infeccioso administrando los péptidos de la presente invención a un paciente durante un tiempo y en condiciones para promover la curación. En un aspecto particular de la invención, la alta potencia y la rápida actividad bactericida de estos péptidos los hacen candidatos atractivos para su uso en tratamientos preventivos, tales como la esterilización de vendas antes de la sutura, así como la esterilización de instrumentos antes de su uso en cirugía u otros procedimientos invasivos. Su especificidad microbiana hace que los péptidos de la invención sean particularmente útiles para inhibir el crecimiento microbiano no deseado en cultivo de tejidos, especialmente los usados para la producción de vectores o proteínas recombinantes para su uso en terapia génica. En otra realización de la invención, los péptidos pueden usarse en formulaciones de combinación con uno o más de otros fármacos para facilitar la administración de un fármaco en un microorganismo o célula huésped.

La invención se refiere también a composiciones fisiológicas que contienen uno o más de los péptidos antimicrobianos como principio activo que puede administrarse a un huésped en una cantidad terapéuticamente eficaz, una cantidad del péptido (o combinaciones de péptidos) suficiente para minimizar o eliminar el microorganismo diana de un cultivo celular, o huésped individual.

Las composiciones fisiológicas contienen una dosificación terapéuticamente eficaz de al menos uno de los péptidos antimicrobianos según La presente invención, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención se refiere también a métodos para tratar una infección microbiana en un huésped usando las composiciones de la invención. Tal tratamiento comprende la administración de una composición fisiológica en una cantidad terapéuticamente eficaz a un individuo que necesita tal tratamiento. Las composiciones pueden administrarse por vía parenteral mediante las vías intramuscular o intravenosa pero lo más probablemente tendrían la máxima utilidad cuando se administran mediante aerosolización, administración subcutánea o administración oral, tópica e intranasal. Preferiblemente, las composiciones fisiológicas que contienen los péptidos de la invención se aplican por vía tópica para la eliminación de infecciones superficiales provocadas por microorganismos. Cuando se usa en una composición farmacéutica tópica, el principio activo de péptido puede usarse a una concentración del 0,001 al 20% (p/v) de la composición.

Cuando se aplican por vía tópica, las composiciones peptídicas pueden combinarse con otros componentes, tales como vehículos y/o adyuvantes. Los péptidos también pueden unirse covalentemente a un vehículo de proteína, tal como la albúmina, o a un implante protésico de modo que se minimice la difusión de los péptidos. No existen limitaciones sobre la naturaleza de tales otros componentes, excepto que deben ser farmacéuticamente aceptables, eficaces para la administración pretendida y no pueden degradar a los principios activos de las composiciones. Cuando las composiciones peptídicas de esta invención se aplican a un sitio de infección tópica, pueden actuar como un agente irritante (que estimularía el influjo de células eliminadoras de impurezas). Las composiciones peptídicas también pueden estar en forma de pomadas o suspensiones, preferiblemente en combinación con colágeno purificado. Las composiciones peptídicas también pueden impregnarse en parches transdérmicos, apósitos y vendas, preferiblemente en forma líquida o semilíquida.

Los péptidos de la invención también pueden administrarse sistémicamente para promover la curación de un proceso infeccioso. Cuando se aplican sistémicamente, las composiciones peptídicas pueden formularse como líquidos, pastillas, comprimidos, pastillas para chupar o similares, para la administración entérica, o en forma líquida para la inyección parenteral. Los péptidos (o conjugados de péptido-proteína) pueden combinarse con otros componentes tales como vehículos y/o adyuvantes conocidos por los expertos en la técnica. No existen limitaciones sobre la naturaleza de tales otros componentes, excepto que deben ser fisiológicamente aceptables, eficaces para su administración pretendida y no pueden degradar a los principios activos de las composiciones. Las formas fisiológicas adecuadas para la inyección incluyen dispersiones o disoluciones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o disoluciones inyectables estériles. En todos los casos, la forma de disolución final debe ser estéril y fluida. Los vehículos típicos conocidos en la técnica incluyen un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, disoluciones acuosas tamponadas con agua (es decir, tampones biocompatibles), etanol, poliol tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, mezclas adecuadas de los mismos, tensioactivos o aceites vegetales. La esterilización puede lograrse mediante una técnica reconocida en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, filtración o adición de agentes antibacterianos o antifúngicos, por ejemplo, parabeno clorobutanol, fenol, ácido sórbico o timerosal. Además, pueden incorporarse agentes isotónicos tales como azúcares, por ejemplo, en las composiciones objeto. La producción de disoluciones inyectables estériles que contienen los péptidos objeto se realiza incorporando estos compuestos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos componentes enumerados anteriormente, si se necesitan, seguido por esterilización, preferiblemente esterilización por filtración.

Cuando los péptidos de la invención se administran por vía oral, las composiciones fisiológicas de los mismos que contienen una dosificación eficaz del péptido también pueden contener un diluyente inerte, un vehículo comestible, asimilable y similares, pueden estar en cápsulas de gelatina de vaina blanda o dura, pueden comprimirse para dar comprimidos, o pueden estar en un elixir, suspensión, jarabe o similares. Por tanto, los péptidos objeto están compuestos para la administración eficaz y conveniente en cantidades farmacéuticamente eficaces con un vehículo farmacéuticamente aceptables en una dosificación terapéuticamente eficaz.

La cantidad eficaz precisa de péptidos que va a usarse en los métodos de esta invención para controlar la infección puede determinarse sin experimentación excesiva por los expertos en la técnica, quienes entienden la naturaleza de la actividad de los antibióticos y la naturaleza de un proceso infeccioso. La cantidad de un péptido antibiótico (tal como los péptidos de esta invención) que deben utilizarse puede variar con la magnitud de la infección y el microorganismo que va a tratarse. La cantidad de péptido de la invención por unidad de volumen de la medicación combinada para la administración también puede determinarse sin experimentación excesiva por los expertos en la técnica. Sin embargo, puede establecerse generalmente que los péptidos deben estar presentes preferiblemente en una cantidad de al menos aproximadamente 1,0 nanogramo por mililitro de composición combinada, más preferiblemente en una cantidad de hasta aproximadamente 1,0 miligramo por mililitro. Las dosificaciones sistémicas también dependen de la edad, del peso y el estado del paciente y de la vía de administración. Por ejemplo, una dosificación adecuada para la administración a seres humanos adultos puede oscilar desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal. La dosificación preferida puede oscilar desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5,0 mg por kilogramo de peso corporal. Tal como se usa en el presente documento, un vehículo fisiológicamente aceptable incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos y similares. El uso de tales medios y agentes se conoce bien en la técnica.

\newpage

Debido a que las composiciones de péptidos antimicrobianos de esta invención están diseñadas para eliminar un proceso infeccioso en curso, puede indicarse y preferirse una aplicación continua o nueva aplicación periódica de las composiciones. La práctica de la invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de la química orgánica sintética, química de proteínas, biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante y farmacología, que se encuentran dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía (véase, por ejemplo, Scopes, R K. Protein Purification: Principles and Practice, 2ª edición, Springer-Verlag, 1987; Methods in Enzymology, S. Colwick y N. Kaplan, editores, Academic Press; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York, 1995; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985).

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero no pretenden limitar la misma.

Ejemplos Ejemplo 1 Diseño y síntesis de eLLP Diseño de eLLP

Para LBU-2 (SEQ ID NO:5) y LBU-3 (SEQ ID NO:6), se diseñaron una estructura \alpha-helicoidal anfipática idealizada que consistía en residuos de Arg y residuos de Val en las caras hidrófila e hidrófoba, respectivamente, y se describen en la figura 2.

Síntesis de péptidos. Se sintetizaron péptidos tal como se describió anteriormente (véase Miller, Jaynes y Montelaro, AIDS Research & Human Retroviruses 7:511-519 y Fontenot et al., Péptido Research 4:19-25) usando o bien un sintetizador de péptidos automatizado modelo 200 de Advanced Chemtech (Advanced Chemtech, Louisville, Ky.), o bien un sintetizador de péptidos automatizado 9050+ de Millipore (Millipore, Bedford, Mass.) con protocolos de síntesis de Fmoc. Tras la escisión y desprotección, se caracterizaron los péptidos sintéticos y se purificaron mediante HPLC de fase inversa en columnas Vydac C18 o C4 (The Separations Group, Hesperia, Calif.). Se confirmó la identidad de cada péptido mediante espectrometría de masas (Universidad de Pittsburg, Protein & Peptide Core Facility).

Cuantificación de péptidos. Se determinaron las concentraciones peptídicas mediante ensayo cuantitativo de ninhidrina. En resumen, a muestras que contenían 5-60 nmoles de péptido se le añadieron reactivos A, B, y C de ninhidrina preparados tal como se describe por Sarin et al., (Analytical Biochemistry 117:147-157). Se preparó una disolución patrón de leucina, calibrada mediante análisis rutinario de composición de aminoácidos, que consistía en 0-60 nmoles de leucina y en paralelo se generó una curva patrón. Se cuantificó el color púrpura formado tras la incubación a 100ºC durante 10 min. mediante dilución en isopropanol/agua 1:1, se transfirió a pocillos por triplicado de una placa de 96 pocillos, y se midió la Abs_{570} en un lector de placas de micropocillos (Dynatech, Chantilly, Va.). Se determinó la concentración de péptido mediante una comparación con la curva patrón y se corrigió mediante el número de grupos amino libres que estaban asociados a cada péptido.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Evaluación de péptidos usando ensayos de lisis bacteriana In Vitro

Muestras de prueba. Los péptidos usados para este estudio se describen y se preparan tal como se indicó anteriormente. El panel de aislados bacterianos usados para estos experimentos incluían tanto aislados clínicos Gram positivos como Gram negativos. Se preparó un aislado bacteriano dado tal como se describe a continuación y se expuso a un eLLP dado tal como se describe a continuación.

Ensayo de lisis bacteriana. Se realizó la lisis bacteriana de una manera similar a la descrita anteriormente (Lehrer, R. I., M. E. Selsted, D. Szklarek, y F. J. 1983. Infect. Immun. 42: 10-4, 1983; Miller, M. A., R. F. Garry, J. M. Jaynes, y R. C. Montelaro, AIDS Res Hum Retroviruses 7: 511-519, 1991). Se cultivaron suspensiones bacterianas en caldo Luria-Bertani Broth hasta la fase semilogarítmica de crecimiento y se lavaron mediante dos ciclos de centrifugación y suspensión en tampón fosfato 10 mM. Se ajustó la Abs_{600} de la suspensión con tampón fosfato 10 mM de modo que, tras la dilución, se tratarían 5-10x10^{5} ufc/ml en el ensayo. Se incubaron las bacterias durante 1 h con diluciones de dos veces de péptidos (de 100 \muM a 100 nM) en placas de 96 pocillos usando tampón fosfato 10 mM, pH 7,2, como diluyente. Se realizaron diluciones de diez veces de bacterias hasta 1:1000; se extendió una alícuota de 100 \mul de cada condición sobre la superficie de placas de agar de soja tríptica (Difco, Detroit, Mich.) que se incubaron durante la noche. Se contaron las colonias de bacterias supervivientes (ufc, unidades formadoras de colonias) y se compararon con los controles sin tratar para determinar la cantidad de destrucción inducida por péptido en cada condición. La destrucción logarítmica se define como el logaritmo de la razón de ufc presentes antes y después del tratamiento con péptido. La concentración bactericida mínima, CBM, es la concentración peptídica a la que se consigue una destrucción del 99,9% (logaritmo de tres) (Pearson et al., Antimicrob. Agents Chemother. 18: 699-708, 1980).

Resultados. Se usaron aislados clínicos Gram positivo (S. aureus) y Gram negativo (P. aeruginosa) representativos como bacteria indicadora para reconocer los péptidos descritos en esta invención.

Una limitación de muchos péptidos antimicrobianos derivados de huésped es su actividad disminuida a concentración fisiológica de NaCl (150 mM). Véase Friedrich et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43:1542-1548. Se comparó la actividad de los eLLP y LBU de esta invención con una lista ampliada de aislados bacterianos clínicos. Éstos se resumen en la tabla 2 mediante la comparación de sus CBM en tampón fosfato solo (bajo contenido en sal) y tampón fosfato que contenía NaCl 150 mM (condiciones fisiológicas). La inspección de esta tabla llevará a un experto en la técnica a concluir que la actividad de los eLLP y LBU se comparan favorablemente con los péptidos antimicrobianos derivados de huésped ya que se refiere al espectro y la potencia de la actividad antimicrobiana.

Ejemplo 3 Modelo de cultivo de células de fibrosis quística de toxicidad selectiva

Preparación de células bacterianas. Se obtuvieron aislados de Burkholderia cepacia y P. aeruginosa de laboratorios de microbiología clínica y se sometieron a ensayo usando el método de dilución de caldo tal como se describió en el ejemplo 2.

Preparación de células eucariotas. Se prepararon cultivos de células primaras diferenciadas de células del epitelio bronquial humano (HBE) (FQ y no FQ) en una interfase aire-líquido en medios libres de antibiótico. Véase Zabner, J. et al., 1996, J. Virol. 70:6994-7003. Se incubaron estos filtros con P. aeruginosa seguido de lavado para eliminar las bacterias no adheridas. A continuación se expusieron los filtros individuales a péptido a concentraciones crecientes. Con el fin de liberar las bacterias viables, se añadió tripsina/EDTA y se cultivaron en placa estas preparaciones en medios bacteriológicos convencionales para cuantificar la supervivencia bacteriana. Se monitorizaron células preparadas de manera similar para determinar la toxicidad del péptido midiendo la resistencia transepitelial. La ventaja de este modelo es
que puede medir la toxicidad selectiva del péptido por la bacteria frente a las células huésped en condiciones idénticas.

Resultados. Se sometieron a prueba LLP-1 y sus derivados, SA-5 (SEQ ID NO:1), LSA-5 (SEQ ID NO:2)y WLSA-5 (SEQ ID NO:3) para determinar su actividad bacteriana contra patógenos asociados normalmente a la enfermedad de las vías respiratorias por FQ, concretamente, S. aureus, P. aeruginosa, y B. cepacia. Se usaron concentraciones bajas (tampón fosfato 10 mM (TF)) y sal fisiológica (TF 10 mM que contenía NaCl 150 mM) como condiciones variables en las que se sometió a prueba la actividad peptídica usando el ensayo de dilución de caldo convencional descrito en el ejemplo 2. Se generaron curvas de destrucción similares a las mostradas en las figuras 3-6 y se determinaron los valores de CBM tal como se describió anteriormente. Los valores de CBM para S. aureus y P. aeruginosa se resumen en la tabla 2. De los péptidos sometidos a prueba, WLSA-5 (SEQ ID NO:3) mantuvo su actividad en condiciones de bajo contenido en sal y sal fisiológica contra estas dos cepas indicadoras.

Se sometió a prueba WLSA-5 (SEQ ID NO:3) y se comparó con LSA-5 (SEQ ID NO:2) para determinar la actividad contra B. cepacia, un patógeno bacteriano importante asociado a enfermedad de las vías respiratorias por FQ. Tal como se muestra en la figura 7, WLSA-5 (SEQ ID NO:3) era significativamente más activo que LSA-5 (SEQ ID NO:2) contra B. cepacia. En general se ha informado de que este organismo es resistente a la actividad de la mayoría de los péptidos antimicrobianos y así el hallazgo de que WLSA-5 (SEQ ID NO:3) demostró una actividad in vitro significativa. Para someter a prueba si esta actividad era específica para el aislado clínico de B. cepacia sometido a prueba en la figura 7 o aplicable en general a diversos aislados de B. cepacia, se diseñó un estudio de reconocimiento. Para este estudio se obtuvo una colección de genomovares de B. cepacia bien caracterizados y se sometió a prueba para determinar la susceptibilidad a la destrucción mediante WLSA-5 25 \muM (SEQ ID NO:3). Esto se comparó con el péptido antimicrobiano de huésped, LL37, a la concentración idéntica. Los datos mostrados en la figura 8 se representan como el número de organismos que sobreviven tras el tratamiento en estas condiciones. Los resultados demostraron que WLSA-5 (SEQ ID NO:3) era igual o mejor que LL-37 para destruir todas las cepas bacterianas dentro de esta colección. Este hallazgo sugiere que WLSA-5 (SEQ ID NO:3) puede ser eficaz cuando se administra en un entorno de FQ en el que B. cepacia es el principal agente etiológico que precipita la enfermedad pulmonar en pacientes con FQ.

Basándose en los hallazgos in vitro anteriores, WLSA-5 (SEQ ID NO:3) se sometió a prueba en un escenario que evaluaba más exactamente su toxicidad selectiva. Para este ensayo, se estableció un modelo de cultivo celular de adherencia bacteriana que utilizaba células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias diferenciadas. Se expusieron estas células a un inóculo convencional de P. aeruginosa y se trataron las bacterias y células epiteliales en cultivo conjunto con diferentes concentraciones de péptido de prueba. La capacidad del péptido para destruir bacterias se monitoriza como una función de las bacterias viables asociadas a las células epiteliales tras la exposición al péptido. Con el fin de evaluar la toxicidad de las células epiteliales, se realizaron mediciones de la resistencia transepitelial. Las células epiteliales de las vías respiratorias diferenciadas en cultivo forman uniones estrechas que no responden a la corriente eléctrica a menos que se altere la monocapa mediante un acontecimiento tal como daño de células epiteliales. Por tanto, la medición de la resistencia transepitelial puede usarse como una medida sensible de la toxicidad del péptido. La figura 9 representa los resultados de un experimento en el que se añadieron concentraciones crecientes de WLSA-5 (SEQ ID NO:3) a células epiteliales y de P. aeruginosa unidas en cultivo conjunto. Se demostró una disminución en la viabilidad bacteriana y un aumento en la resistencia transepitelial (Rte) como una función de la concentración peptídica. Una disminución en los recuentos bacterianos en dos órdenes de magnitud dio como resultado un cambio en la resistencia transepitelial inferior al 50%. Además, el efecto de WLSA-5 (SEQ ID NO:3) sobre la resistencia transepitelial era transitorio y no significativamente diferente de LL-37. Estos datos sugieren que WLSA-5 (SEQ ID NO:3) demuestra una toxicidad bacteriana selectiva en un entorno de FQ.

Ejemplo 4 Modelo de articulación de conejo de artritis séptica

Se ha demostrado que LSA-5 (SEQ ID NO:2) es altamente activo contra S. aureus (tabla 2) y S. epidermidis in vitro, dos causas comunes de las infecciones articulares, y puede actuar en presencia de fluidos biológicos tales como el derivado del sinovio de articulación (figura 10), aunque la presencia de líquido sinovial confiere claramente la actividad de LSA-5 (SEQ ID NO:2). Se han extendido estos hallazgos hasta un modelo animal de artritis séptica. En este estudio se indujo septicemia de la articulación inoculando una rodilla de un conejo blanco de Nueva Zelanda de 2,5 kg con 1x10^{5} unidades formadoras de colonias de un asilado de S. aureus clínico, una cepa resistente a penicilina pero sensible a meticilina, cefalosporinas y clindamicina. Usando este modelo, se monitorizaron los síntomas de la artritis séptica (por ejemplo, degradación del sinovio) y puede evaluarse la capacidad de los agentes antimicrobianos para limitar la degeneración de la articulación posterior a la infección. En esta aplicación se deja que se establezca la infección bacteriana durante 1 h. En este punto se accedió a la articulación y se administraron concentraciones crecientes de LSA-5 (SEQ ID NO:2) (0, 50, 100 y 200 \muM) en tampón fosfato (TF) por vía intraarticular. Se estableció la concentración de bacterias asociadas al líquido de la articulación en el tiempo 0 y 1 h posterior a la instilación de LSA-5 (SEQ ID NO:2) cultivando en placas diluciones de líquido sinovial en LB agar. Los resultados de este experimento demostraron una disminución dependiente de la dosis en las unidades formadoras de colonias en comparación con la articulación sin tratar con péptido cuando se examinaba tras 1 h (figura 11).

Con el fin de demostrar que dosis sucesivas de LSA-5 (SEQ ID NO:2) pueden ser eficaces para limitar la carga bacteriana en este modelo de conejo, se evaluó la administración de dos tratamientos peptídicos de LSA-5 150 \muM (SEQ ID NO:2) en los tiempos 0 y 1 h. La medición de la carga bacteriana 1 h posterior al tratamiento demostró una disminución significativa en las articulaciones tratadas con péptido en comparación con las articulaciones tratadas con tampón fosfato en ausencia de péptido. Esto se comparó con inyecciones múltiples de un patrón de neomicina al 0,35% o una combinación de neomicina y LSA-5 (SEQ ID NO:2). Se realizó la administración de cada una de estas formulaciones por vía intraarticular en los tiempos 0, 1 y 2 h. Los resultados de este experimento demostraron que cuando se comparaban con los grupos tratados con LSA-5 (SEQ ID NO:2) o neomicina sola, se recuperaban sustancialmente menos bacterias de la articulación tratada con la combinación de LSA-5/neomicina (figura 12). Además, en todos estos experimentos con animales no se observó toxicidad adversa cuando se administraba el péptido solo. Estos datos imitan
la infección crónica asociada a la artritis séptica y sugieren que el tratamiento tópico puede ser inicialmente eficaz.

Una aplicación potencialmente importante para el eLLP cuando se refiere a artritis séptica es su actividad cuando se une a un sustrato en fase sólida tal como una articulación protésica. Para dirigir esto, el grupo amino terminal de LSA-5 (SEQ ID NO:2) se unió covalentemente a una resina Affigel^{TM} 15 (BioRad, Hercules, CA). Se colocó este soporte sólido permeable en una columna pequeña y se expuso a 1 ml de suspensión de a x 10^{6} bacterias/ml. Se dejó que la disolución pasara por gravedad a través de la columna y se recogió el eluato y se cuantificó para determinar el número de bacterias viables. Como control negativo se preparó una columna idéntica excepto porque se unió un péptido no antimicrobiano en lugar de LSA-5 (SEQ ID NO:2). Los resultados se resumen en la tabla 3 a continuación y demuestran que o bien una suspensión de P. aeruginosa o bien S. aureus se esterilizaban completamente mediante exposición a la columna. Por el contrario, no se observó ninguna reducción en las bacterias viables tras la exposición a la columna control con péptido no-antimicrobiano. Además, podía exponerse repetidamente la misma columna con LSA-5 (SEQ ID NO:2) a suspensiones bacterianas y mantenía su actividad durante hasta 6 pases. Estos datos sugieren la posibilidad de que las articulaciones protésicas podrían recubrirse con los eLLP de la presente invención para inhibir la nucleación de formación de biopelículas observada en cirugía de artroplastia, lo que conduce a artritis séptica.

TABLA 3

4

Ejemplo 5 Supresión de la infectividad del VIH-1

Basándose en la observación de que los péptidos de esta invención eran activos contra ciertas membranas de células eucariotas (por ejemplo, demostraron lisar eritrocitos) se razonó que los péptidos de esta invención pueden ser activos para suprimir la infectividad de virus con envuelta. Prueba de este concepto se obtuvo estudiando la capacidad de un péptido LLP1, LSA-5 (SEQ ID NO:2) para inhibir la infectividad del VIH-1 similar a la mostrada previamente para péptidos antimicrobianos derivados de huésped catiónicos (Wachinger, M., et al. (1998) Journal of General Virology 79: 731-40; Wachinger, M., T. Saermark y V. Erfle (1992) FEBS Letters 309:235-41; Robinson, W.E., Jr., B. McDougall, D. Tran y M.E. Selsted 1(998) Journal of Leukocyte Biology 63:94-100; Yasin, B. et al. (2000) European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases 19:187-94).

En este ejemplo se obtuvieron monocitos de sangre periférica humana (PBMC) de voluntarios sanos y se mantuvieron en cultivo a una concentración de 1 x 10^{5} células viables por ml de medio. Se estimularon estas células mediante la adición de fitohemaglutinina (PHA). Para esto se añadió un título normalizado de viriones de VIH-1 (cepa IIIB) purificados a las PBMC para generar una señal de antígeno p24 de 14.000 pg/ml cinco días tras la exposición al virus.

Con el fin de someter a prueba si el péptido LLP, LSA-5 (SEQ ID NO:2) podía suprimir la actividad del VIH-1, se incubó LSA-5 a concentraciones que oscilaban entre 0,1 y 100 \muM con el título de virus patrón determinado tal como anteriormente durante 30 min. Se aislaron los viriones que sobrevivieron a la exposición al péptido mediante ultracentrifugación a 100.000 x g durante 60 min. Se usaron los sedimentos virales para infectar PBMC estimuladas con PHA preparadas tal como se describió anteriormente. Cinco días tras la infección se determinó el nivel de antígeno p24 y se comparó con un control sin tratar con péptido. Los datos se expresaron como la razón de antígeno p24 asociado a células infectadas con VIH-1 tratadas con péptido frente a sin tratar con péptido para obtener un valor denominado porcentaje de supresión.

Tal como se muestra en la figura 13, los viriones tratados con LSA-5 solos a 100 \muM reducían la infectividad del VIH-1 en casi el 100%. A 10 \muM, se redujo la infectividad del VIH-1 en el 75%. A 1 y 0,1 \muM hay una caída de esta actividad inhibidora de LSA-5. Experimentos no descritos en el presente documento que empleaban otros péptidos descritos por esta invención demuestran que aquellos péptidos que se observó que tenían una alta actividad hemolítica por los glóbulos rojos eran más activos en una base molar contra viriones del VIH-1 que aquéllos con una baja actividad homolítica. Estos datos demuestran que los péptidos LLP de la presente invención son activos contra virus con envuelta, y particularmente, VIH-1, y pueden modificarse mediante ingeniería genética para obtener una potencia aumentada en este entorno.

<110> Ronald C. Montelaro

\hskip1cm

Timothy A. Mietzner

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS DERIVADOS DE VIRUS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> A34001-PCT/072396.0223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 09/785.058

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 16/02/01

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 09/785.059

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 16/02/01

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> WO/por anunciar

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 15/02/02

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido artificial derivado del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptidos artificiales derivados del VIH-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

16

Claims (20)

1. Péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

RVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:4) RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:5); VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:6); RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:7); RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:8); RVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:9); RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10); VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:11); y RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV (SEQ ID NO:12).

\vskip1.000000\baselineskip

2. Péptido según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos

RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10).

\vskip1.000000\baselineskip

3. Composición que comprende el péptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un vehículo.

4. Péptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, teniendo dicho péptido actividad antimicrobiana, por ejemplo en bajo contenido en sal o sal fisiológica.

5. Sustrato en fase sólida que comprende al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en:

RVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:4;) RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:5); VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:6); RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:7); RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:8); RVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:9); RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10); VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:11);

y RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV (SEQ ID NO:12).

\vskip1.000000\baselineskip

6. Sustrato sólido según la reivindicación 5, que comprende el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos:

RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10).

\vskip1.000000\baselineskip

7. Sustrato en fase sólida según la reivindicación 5 o la reivindicación 6, siendo dicho sustrato en fase sólida un dispositivo protésico, por ejemplo una articulación protésica.

8. Complejo de péptido-carga que comprende una carga y un péptido seleccionado del grupo que consiste en:

RVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:4); RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:5); VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:6); RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:7); RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:8); RVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:9); RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10); VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:11); y RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV (SEQ ID NO:12).

\vskip1.000000\baselineskip

9. Complejo de péptido-carga según la reivindicación 8, que comprende una carga y un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos

RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10).

10. Complejo de péptido-carga según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, teniendo dicho péptido actividad antimicrobiana y aumentando dicha carga la actividad antimicrobiana de dicho péptido.

11. Uso de al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en:

RVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:4); RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:5); VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:6); RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:7); RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:8);

RVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:9); RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10); VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:11); y RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV (SEQ ID NO:12)

para la preparación de una composición para inhibir el crecimiento de un microbio.

\vskip1.000000\baselineskip

12. Uso del péptido que tiene la secuencia de aminoácidos

RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10);

para la preparación de una composición para inhibir el crecimiento de un microbio.

\vskip1.000000\baselineskip

13. Uso según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en el que el microbio se selecciona del grupo que consiste en bacterias, hongos y virus.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que el virus es un virus con envuelta.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que el virus con envuelta se selecciona del grupo que consiste en retrovirus, herpesvirus, poxvirus, hepadnavirus, baculovirus, ortomixovirus, paramixovirus, togavirus, rabdovirus, buniavirus y flavivirus.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que el retrovirus es el lentivirus VIH-1.

17. Uso según la reivindicación 15, en el que el herpesvirus es VHS.

18. Uso de al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en:

RVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:4); RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:5); VRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:6); RRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:7); RVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRRVRRVVRRVVRVVRRVVRR (SEQ ID NO:8); RVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:9); RRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:10); VRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRR (SEQ ID NO:11); y RVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWVRRVRRVWRRVVRVVRRWRVV (SEQ ID NO:12)

para la preparación de una composición de medicamento para suprimir la infección por VIH-1.

\vskip1.000000\baselineskip

19. Uso según la reivindicación 11, en el que dicha composición se administra por vía enteral, por vía parenteral o por vía tópica.

20. Uso según la reivindicación 11 ó 18, en el que dicha composición está unida a un sustrato en fase sólida.