ES2312393T3

ES2312393T3 - Procedimiento mejorado para la ppreparacion de reactivos de marcado de indocianina asimetrica monofuncionalizada y compuestos obtenidos.

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Publication number: ES2312393T3
Application number: ES01127884T
Authority: ES
Inventors: Giuseppe Caputo; Leopoldo Della Ciana
Original assignee: Visen Medical Inc
Current assignee: Visen Medical Inc
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2001-11-23
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2021-11-23
Also published as: EP1209205A1; AU783884B2; DE60135296D1; ATE404637T1; US6740755B2; CA2363896A1; US20050245734A1; AU9344001A; US20020065421A1

Abstract

Un procedimiento para preparar un colorante de indocianina asimétrica que comprende las etapas de: a) hacer reaccionar una primera indolenina cuaternizada o indolenina sustituida con un compuesto de fórmula (II) (Ver fórmula) o un clorhidrato del mismo, en la que n es 0 ó 1 Ph es fenilo o fenilo sustituido X es hidrógeno, halógeno o alquilo, en un disolvente seleccionado entre el grupo constituido por ácido acético, anhídrido acético y mezclas de los mismos en presencia de cloruro de acetilo, para obtener una hemicianina intermedia, y b) hacer reaccionar adicionalmente dicha hemicianina intermedia con una segunda indolenina cuaternizada o indolenina sustituida diferente de dicha primera indolenina.

Description

Procedimiento mejorado para la preparación de reactivos de marcado de indocianina asimétrica monofuncionalizada y compuestos obtenidos.

Los colorantes de indocianina se adaptan a la fórmula generalizada:

1

donde R_{11}, R_{12}, R_{13}, R_{14}, R_{21}, R_{22}, R_{23} y R_{24} son hidrógenos o sustituyentes; los pares de sustituyentes R_{13}, R_{14} y/o R_{23}, R_{24} pueden formar un anillo de benceno condensado, que a su vez lleva sustituyentes; n = 1-3; L_{n1}, L_{n2} son metinos (C-H) o metinos sustituidos (C-R).

Revisiones extensivas respecto a colorantes de indocianina las han escrito Frances M. Hamer, "The Chemistry of Heterocyclic Compounds", vol. 18, "The Cyanine Dyes and Related Compounds", Weissberger Ed., Wiley Interscience, Nueva York, (1964); D. M. Sturmer, "The Chemistry of Heterocyclic Compounds", "Special Topics in Heterocyclic Chemistry", capítulo VIII, "Synthesis and Properties of Cyanine and Related Dyes", Weissberger Ed., Wiley, Nueva York, (1977); "The Kirk-Othmer Enciclopaedia of Chemical Technology" vol. 7, p. 782, "Cyanine Dyes", Wiley, Nueva York, (1993).

El documento DE19921234 describe colorantes de cianina que tienen grupos sulfoarilo y N-sulfoalquilo y un grupo reactivo para unirse a sustancias de soporte.

Durante muchos años, los colorantes de indocianina han sido muy útiles como sensibilizadores en fotografía, especialmente en las regiones del rojo e infrarrojo cercano del espectro. Sin embargo, en los últimos años, ha habido un fuerte aumento de nuevos usos de estos colorantes en áreas tecnológicas innovadoras, tales como aplicaciones láser y electro-ópticas, medios de grabación ópticos, médicas, biológicas y para diagnóstico. Estas nuevas aplicaciones de colorantes de indocianina suponen altas demandas sobre el grado de pureza requerido y la reproducibilidad de los procedimientos sintéticos y las etapas de purificación es muy importante. Estos requisitos son especialmente rigurosos para colorantes diseñados para mejorar la detección de ácido ribonucleico (ARN), ácido desoxirribonucleico (ADN) y de antígenos en inmunoensayos. En estos campos, la tendencia hacia aumentar la miniaturización va acompañada de un aumento de la demanda sobre la sensibilidad de las moléculas informadoras o marcadores. Una forma de aumentar la sensibilidad de un procedimiento de fluorescencia convencional es usar fuentes láser para la excitación. Sin embargo, los marcadores fluorescentes tradicionales basados en fluoresceínas o rodaminas requieren láseres caros y/o voluminosos. Además, su fluorescencia ocurre en las regiones del azul-verde a verde del espectro visible, donde es más probable que ocurra la interferencia de la matriz de la muestra. Los colorantes de indocianina no experimentan estas limitaciones. Pueden excitarse eficazmente mediante pequeños dispositivos en estado sólido tales como diodos láser o diodos emisores de luz, con coeficientes de extinción a menudo varias veces mayores que las fluoresceínas y rodaminas; emiten en las regiones del rojo e infrarrojo cercano del espectro, donde la fluorescencia no específica de la muestra es baja o inexistente; otras fuentes, ruido Raman, se hacen más pequeñas con la cuarta potencia inversa de la longitud de onda.

Para ser útil como marcador, un colorante tiene que estar provisto con una cadena lateral adecuada que contenga un grupo funcional. Aunque la parte principal de la estructura de colorante generalmente se conoce de solicitudes anteriores, la introducción de un grupo funcional en la estructura con el fin de conjugación, o de unión a otra molécula, representa la etapa innovadora en las invenciones respecto al uso del colorante como reactivo de marcado. En general, es preferible solo una ramificación lateral funcionalizada, para evitar problemas de reticulación o de purificación. Con unas pocas excepciones, limitadas a colorantes de heptametino, el procedimiento convencional en el diseño de reactivos de indocianina marcados ha sido unir la ramificación lateral funcionalizada a uno de los núcleos heterocíclicos del colorante:

HET_{1} - HET_{2} - Z

Véase, por ejemplo: J. S. Lindsey, P. A. Brown, y D. A. Siesel, "Visible Light-Harvesting in Covalently-Linked Porphyrin-Cyanine Dyes", Tetrahedron, 45, 4845, (1989); R. B. Mujumdar, L. A. Ernst, Swati R. Mujumdar, C. J. Lewis, y A. S. Waggoner, "Cyanine Dye Labelling Reagents: Sulfoindocyanine Succinimidyl Esters", Bioconjugate Chemistry, 4, 105, (1993); G. Mank, H.T.C. van der Laan, H. Lingeman, Cees Goojer, U. A. Th. Brinkman, y N.H. Velthorst, "Visible Diode Laser-Induced Fluorescence Detection in Liquid Chromatography after Pre-column Derivatization of Amines", Anal. Chem., 67, 1742, (1995).

La estrategia sintética general necesaria para preparar estos reactivos de marcado es la siguiente. En primer lugar, se prepara un heterociclo de nitrógeno cuaternizado HET_{1}. Después, este heterocíclico base se hace reaccionar con un reactivo electrófilo tal como PhNH-(CH=CH)_{n}-CH=NHPh\cdotHCl o RO-(CH=CH)_{n}-CH(OR)_{2}, donde Ph es un anillo de fenilo y R un grupo metilo o etilo, para obtener lo que se denomina colorante de hemicianina, HET_{1}-(CH=CH)_{n}
NHPh/HET_{1}-(CH=CH)_{n}NAcPh, donde Ac es el radical acetilo o HET_{1}-(CH=CH)_{n}-OR. Estos intermedios se hacen reaccionar después con un heterociclo de nitrógeno cuaternario diferente, HET_{2}. La ramificación lateral funcionalizada puede unirse al primer o al segundo heterociclo de nitrógeno cuaternizado. El resultado final es un reactivo de marcado de polimetino asimétrico, HET_{1}-(CH=CH)_{n} -HET_{2}-Z.

Desafortunadamente, los intermedios de hemicianina son muy difíciles de obtener con buenos rendimientos y/o en una forma pura. Por ejemplo, se dice que la condensación de yoduro de N-metil-2,3,3-trimetil[3H]indolio con monoclorhidrato de dianil malonaldehído en anhídrido acético (Piggott y Rodd, GB 355.693/1930) da lugar a un intermedio verde, que indica una fuerte contaminación del intermedio de hemicianina amarillo deseado (amarillo) con colorante de indocianina simétrica azul, Figura 2. Además, cuando F. M. Hamer, en "Some Unsymmetrical Pentametincyanine Dyes and their Tetrametin Intermediates" J. Chem. Soc, 22, 32, (1949) trataron de preparar una muestra pura del mismo intermedio de hemicianina, se obtuvo con un rendimiento del 8%, después de un procedimiento prolongado y antieconómico basado en múltiples extracciones y precipitaciones. Más recientemente, R. B. Mujumdar, L. A. Ernst, Swati R. Mujumdar, C. J. Lewis, y A. S. Waggoner, en "Cyanine Dye Labelling Reagents: Sulfoindocyanine Succinimidyl Esters", Bioconjugate Chemistry, 4, 105, (1993) describen la síntesis de intermedios de hemicianina para la preparación de ésteres activos de colorantes de sulfoindocianina, útiles como reactivos de marcado. Un intermedio se obtuvo condensando [3H]indolio-5-sulfonato de 1-etil-2,3,3-trimetilo con N,N'-difenilformamidina en ácido acético durante cuatro horas. Aunque el rendimiento presentado por el compuesto bruto era del 30%, los colorantes de carboindocianina preparados a partir del mismo se obtuvieron únicamente con rendimientos del 25% y 5%, después de una cara purificación por cromatografía HPLC de fase inversa. Análogamente, la condensación de 1-etil-2,3,3-trimetil[3H]indolio-5-sulfonato con clorhidrato de dianil malonaldehído en una mezcla de ácido acético y anhídrido acético a reflujo durante cuatro horas se dice que produce el intermedio de hemicianina correspondiente con un rendimiento no indicado. De nuevo, los rendimientos de los colorantes de dicarboindocianina obtenidos a partir de estos intermedios eran muy bajos (5%). De hecho, cuando Mank (Anal. Chem., 67, 1744) trató de sintetizar el mismo marcador de dicarbocianina descrito en la referencia anterior, obtuvo un rendimiento total del 18% de dicarbocianinas, a partir de las cuales el producto deseado era difícil de separar. Ideó entonces un procedimiento alternativo basado en 1,3,3-trimetoxipropeno. Desafortunadamente, este compuesto químico ya no está disponible en el mercado. Nosotros encontramos dificultades similares cuando tratamos de repetir las síntesis indicadas anteriormente.

Por estas razones, se hizo necesario investigar más cuidadosamente la técnica empleada para preparar los intermedios de hemicianina requeridos y las propiedades de estos últimos. Se descubrieron, por lo tanto, dos fuentes de problemas principales. La primera era la formación de colorante de indocianina simétrica en cantidades variables y a menudo imprevisibles en la etapa de condensación. La otra complicación surgió de la reversibilidad de esta reacción. Por ejemplo, cuando una muestra pura del intermedio de hemicianina se expuso a las mismas condiciones usadas para la formación del colorante de cianina asimétrica, en concreto a una base tal como acetato, piridina o trietilamina, se observó la formación de colorante simétrico. Este fenómeno era más evidente con las indoleninas cuaternizadas más reactivas.

Las etapas que se realizaron para tratar estos problemas se describen en detalle en la siguiente sección.

Descripción detallada de la invención

Cuando una indolenina cuaternizada se hace reaccionar con N,N'-difenil-formamidina en ácido acético, o ácido acético anhídrido, o una mezcla de estos dos disolventes se forma una hemicianina. Esta hemicianina puede estar presente en dos formas, una en la que el grupo arilo terminal (NH-fenil) es libre y la otra donde está acetilado, NAc-fenilo, Figura 3. Las dos formas tienen diferentes absorciones UV-visible y pueden diferenciarse fácilmente. Incluso cuando se usa anhídrido acético solo, a menudo se forma algo de hemicianina no acetilada. Se aplican observaciones similares a la reacción de indolenina cuaternizada con los vinílogos de N,N-difenilformamidina, por ejemplo dianil malonaldehído. El objetivo inicial en la optimización de esta reacción era la obtención de sólo una de las dos formas de hemicianina, la forma acetilada. Se pensó que la adición de un agente acetilante más fuerte, tal como cloruro de acetilo, al disolvente de anhídrido acético sería más eficaz para conseguir la acetilación completa de la hemicianina. Sorprendentemente, no solo esta suposición resultó correcta, sino lo que es más importante, la adición de cloruro de acetilo inhibió completamente la formación de colorante de cianina simétrica. Por lo tanto, un aspecto de nuestra invención resulta ser la adición de cantidades variables de cloruro de acetilo al disolvente de anhídrido acético usado para la preparación de hemicianina. La cantidad de cloruro de acetilo puede variar del 0,5% al 50%, con un intervalo preferido del 1% al 20%.

En un aspecto más de nuestra invención, se desarrolló un procedimiento de purificación de la hemicianina intermedia mediante la extracción continua del producto bruto con un disolvente adecuado. Dicho disolvente debería extraer dicha N,N-difenilformamidina o dianil malonaldehído no reaccionados o derivados sustituidos de los mismos, sin disolución contemporánea de la hemicianina. Los disolventes preferidos son acetato de etilo, cloruro de metileno, cloroformo, 1,1,1-tricloroetano y otros disolventes clorados. Los procedimientos para la extracción continua incluyen extracción Soxhlet o extracciones líquido-sólido similares, o extractor líquido-líquido; esta última puede ser en cualquiera de dos formas, en concreto, el líquido de extracción puede ser más ligero o más pesado que el líquido que contiene la hemicianina a purificar, en solución o en una suspensión. Cuando la hemicianina está presente en una suspensión, la densidad de la hemicianina debería ser menor que la del disolvente de extracción.

En otro aspecto más de nuestra invención, se diseñó una estrategia general para la síntesis de colorantes de cianina asimétrica a usar como reactivos de marcado. Como ya se ha visto previamente, una de las complicaciones presentes en estas síntesis es la reversibilidad de las hemicianinas intermedias, especialmente cuando la segunda indolenina cuaternizada es menos reactiva que la primera. En este caso, una gran cantidad de hemicianina simétrica, de forma HET_{1} - HET_{1}, contamina el producto deseado HET_{1} - HET_{2}. La separación de los dos productos a menudo es difícil de conseguir, especialmente cuando los núcleos de indolenina son similares. De las diferentes indoleninas empleadas en estas síntesis, las más reactivas son aquellas que no llevan grupos aceptores de electrones en el anillo de benceno y con cadenas de alquilo sencillas unidas al nitrógeno cuaternario. Se observa una disminución de la reactividad cuando estas cianinas llevan cadenas de carboxilalquilo o sulfonatoalquilo o grupos aceptores de electrones en el anillo de benceno, tales como grupos sulfónico o carboxílico. Una disminución similar en la reactividad se observa también con cianinas que llevan anillos de benceno condensados adicionales. Las cianinas menos reactivas son aquellas con anillos de benceno condensados adicionales que llevan grupos sulfónicos y están cuaternizadas con grupos sulfoalquilo o carboxilalquilo. A la vista de este comportamiento se adoptó la siguiente estrategia. En primer lugar, se sintetizó la hemicianina con la indolenina menos reactiva de acuerdo con los procedimientos mejorados ilustrados previamente. Estos intermedios se purificaron después, cuando fue posible, por extracción de las impurezas en un extractor sólido-líquido o líquido-líquido. El intermedio de hemicianina purificada se hizo reaccionar después con la indolenina más reactiva. De esta manera, la reacción que conducía al producto de cianina deseado era relativamente rápida comparada con la disociación de la hemicianina de vuelta a sus materiales de partida. Los productos obtenidos de esta manera eran mucho más puros y sus rendimientos aumentaron también significativamente. Se encontró especialmente útil la combinación de una hemicianina hecha a partir de un grupo sulfónico que lleva una benzoindolenina y cuaternizada con una cadena de carboxilalquilo y una indolenina con grupos sulfónicos, aunque cuaternizada únicamente con cadenas de alquilo sencillas. Este esquema es el opuesto de los utilizados de acuerdo con procedimientos conocidos, especialmente aquellos descritos en las referencias mencionadas anteriormente, donde el intermedio de indocianina se sintetiza siempre a partir de la indolenina más reactiva, mientras que la indolenina menos reactiva se añadió en la etapa de formación de cianina.

En una extensión adicional de esta estrategia, se empleó un reactivo de dianil malonaldehído más reactivo, clorhidrato de dianil 2-cloromalonaldehído, especialmente cuando la indolenina que tenía que reaccionar con él tenía una reactividad muy reducida.

El objeto de la invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

En las reivindicaciones, el término "fenilo sustituido" pretende incluir preferiblemente fenilo con uno o más sustituyentes seleccionados entre alquilo y átomos de halógeno. Alquilo en las reivindicaciones es preferiblemente alquilo C_{1}-C_{6}.

Los siguientes ejemplos son simplemente para ilustrar adicionalmente aplicaciones específicas de la presente y no pretenden considerarse como que definen o limitan el alcance de la invención.

En los dibujos:

- La Figura 1 es una fórmula general de colorantes de indocianina;

- La Figura 2 es un esquema del procedimiento de la técnica anterior para preparar indocianinas;

- La Figura 3 es un esquema del procedimiento de la técnica anterior para preparar hemiindocianinas; y

- Las Figuras 4-11 muestran las estructuras y esquemas de reacciones relativos a los compuestos de los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1a

Un matraz de tres bocas de 100 ml, que contenía 1,00 g de yoduro de 1-etil-2,3,3-trimetilindoleninio (3,17 mmol), 0,62 g de N,N-difenilformamidina, (3,17 mmol), 12 ml de anhídrido acético y 1 ml de cloruro de acetilo se calentó a 120ºC durante 45 minutos. La solución de color rojo anaranjado se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en diclorometano El producto deseado se aisló por precipitación en un gran volumen de éter agitado rápidamente. El producto se purifica adicionalmente por cromatografía ultrarrápida, por elución con CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH (99:1). El producto puro tiene una \lambda_{max} en MeOH a 378 nm y sin absorción máxima en la región visible. El rendimiento de 1a fue del 76%. Cuando se omite el cloruro de acetilo, se forma una banda a 545 nm. Esta banda pertenece al colorante indocarbocianina simétrica.

Ejemplo 1b

Un matraz de tres bocas de 100 ml, que contenía 1,00 g de yoduro de 3-(4'-acetoxibutil)-1,1,2-trimetilbenzo[e]indoleninio (2,44 mmol), 0,48 g de N,N-difenilformamidina (2,74 mmol), 12 ml de anhídrido acético y 1 ml de cloruro de acetilo se calentó a 120ºC durante 60 minutos. La solución de color rojo anaranjado se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en diclorometano. El producto deseado se aisló por precipitación en un gran volumen de éter agitado rápidamente. El producto es cromatográficamente puro, con \lambda_{max} en MeOH a 409 nm y sin absorción en la región visible. El rendimiento de 1b fue del 90%. Cuando se omite el cloruro de acetilo se forma una banda a 572 nm. Esta banda pertenece al colorante indodicarbocianina simétrica.

Ejemplo 1c

2,50 g de sal monosódica de 6,8-disulfonato de 3-(5'-carboxipentil)-1,1,2-trimetilbenzo[e]indoleninio (5,5 mmol), 1,2 g de N,N-difenilformamidina (6 mmol), 15 ml de anhídrido acético y 2 ml de cloruro de acetilo en un matraz de 100 ml de tres bocas se calentaron a 120ºC durante 2 h. La solución de color rojo anaranjado se evaporó hasta obtener una goma oscura, se disolvió en metanol y se volvió a precipitar en un gran volumen de éter. Este procedimiento se repitió dos veces más, hasta que el producto se purificó totalmente. El rendimiento de 1c fue del 65% con \lambda_{max} (MeOH) a 415 nm y sin absorción en la región visible. Sin la adición de cloruro de acetilo se forma una indocianina simétrica con \lambda_{max} (MeOH) a 580 nm.

Ejemplo 2a

Un matraz de tres bocas de 100 ml, que contenía 1,00 g de yoduro de 3-etil-2,3,3-trimetilindoleninio (3,17 mmol), 0,82 g de monoclorhidrato de dianil malonaldehído (3,17 mmol), 12 ml de anhídrido acético y 1 ml de cloruro de acetilo se calentó a 110ºC durante 30 minutos. La solución de color rojo anaranjado se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en diclorometano. El producto deseado se aisló por precipitación en un gran volumen de éter agitado rápidamente. El producto se purifica por cromatografía ultrarrápida, eluyendo con CH_{2}Cl_{2}/CHOH, (99:1). El producto puro 2a tiene una \lambda_{max} en MeOH a 437 nm y sin absorción a longitudes de onda mayores. Rendimiento = 80%.

Ejemplo 2c

2,00 g de sal 1-etil-2,3,3-trimetilindoleninio-5-sulfonato (6,53 mmol), 2,20 g de monoclorhidrato de dianil malonaldehído (8,50 mmol), 20 ml de anhídrido acético y 5 ml de cloruro de acetilo se calentaron a 100ºC durante 1 h. El producto se volvió a precipitar en un gran exceso de éter o acetona. El polvo bruto se cargó en un extractor Soxhlet y se extrajo con acetato de etilo. El producto purificado 2c tiene una \lambda_{max} en MeOH a 437 nm y sin absorción a longitudes de onda mayores. Rendimiento: 81%.

Ejemplo 3a

Un matraz que contenía 1,00 g de hemicianina 1b (1,68 mmol), 1,24 g de yoduro de 1-etil-2,3,3-trimetil-indoleninio (3,94 mmol), 0,28 g de acetato potásico (2,9 mmol) y 40 ml de anhídrido acético se calentó a 135ºC durante 60 minutos. La solución de color morado rojizo se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió agua destilada (50 ml) y la mezcla resultante se extrajo tres veces con diclorometano. La fase orgánica se lavó con agua destilada, se secó con CaCl_{2} y se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió en una pequeña cantidad de diclorometano y precipitó en éter de petróleo (p.e. 40-60ºC). El sólido morado resultante (0,57 g) tenía una \lambda_{max} de absorción a 565 nm en MeOH. No se purificó, sino que se usó tal cual en la siguiente etapa (hidrólisis del grupo protector acetato). Un matraz de 250 ml se cargó con la cianina bruta, 40 ml de metanol y 15 ml de ácido clorhídrico concentrado. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas y después se evaporó a presión reducida. Se añadió agua destilada al residuo. La solución acuosa se extrajo con diclorometano, y el extracto se lavó con agua destilada y se secó con CaCl_{2}. El disolvente se evaporó de nuevo a presión reducida y después se disolvió en una pequeña cantidad de diclorometano y después precipitó con un gran volumen de éter. El alcohol de cianina bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida usando un gradiente de diclorometano/metanol, del 100% al 90:10. El alcohol de cianina purificado se convirtió después en su fosforamidita de la siguiente manera. El alcohol de cianina (0,550 g, 0,91 mmol) se secó en un horno de vacío a 40ºC durante cinco horas y después se cargó en un matraz de 3 bocas seco, de 100 ml. Se añadieron 40 ml de acetonitrilo anhidro en atmósfera de argón, seguido de 0,17 ml de una solución 0,5 M de tetrazol en acetonitrilo y 0,42 ml de 2-cianoetil tetraisopropilfosforodiamidita (1,327 mmol). La solución se agitó en atmósfera de argón durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después de este periodo de tiempo, se evaporó al vacío. El residuo se re-disolvió en acetonitrilo y precipitó con éter anhidro, con refrigeración a 0ºC.

El precipitado se lavó con éter seco y se secó. Se almacenó a -20ºC. El rendimiento de 3a fue del 90%.

Ejemplo 4a

0,500 g de hemicianina 1c (0,767 mmol), 0,243 g de 5-sulfonato de 1-etil-2,3,3-trimetilindoleninio (0,767 mmol), y 1 ml de trietilamina se disolvieron en 7 ml de anhídrido acético. La mezcla se calentó a reflujo a 120-130ºC durante dos horas. Después de unos pocos minutos la reacción se volvió de color morado rojizo. La mezcla se enfrió y se añadió lentamente a un gran volumen de éter agitado rápidamente. El precipitado rojo se recogió en un filtro, se lavó con acetato de etilo y se secó. El producto se purificó por cromatografía líquida a presión media con acetonitrilo/agua 50:50 como eluyente. El rendimiento del producto purificado fue del 73%; su \lambda_{max} en MeOH fue 570 nm. Para preparar el éster activo, se disolvieron 50 mg del ácido en un vial de microsíntesis con 25,6 mg de N,N'-diciclohexil carbodiimida (124 mmol), 14,3 mg de N-hidroxisuccinimida (1324 mmol) en 2 ml de DMF seca. La mezcla de reacción se agitó durante una noche a aproximadamente 50ºC. El éster activo se precipitó con éter seco. El precipitado se recogió sobre un filtro de vidrio y se lavó varias veces con éter seco. El éster secado 4a se almacena a -20ºC. Rendimiento de éster activo a partir del ácido: 98%.

Ejemplo 4b

0,500 g de hemicianina 2c (1,14 mmol), 0,85 g de 3-(5'-carboxipentil)-1,12-trimetil-benzo[e]-indoleninio-6-sulfonato (2,46 mmol), 0,18 g de acetato potásico (1,82 mmol) se disolvieron en 30 ml de anhídrido acético. La mezcla de reacción se calentó a reflujo en un baño de aceite a aproximadamente 120-130ºC durante 60 minutos. Después de unos pocos minutos el color de la mezcla se volvió azul. La mezcla se enfrió y después se añadió lentamente a un gran volumen de éter agitado rápidamente. El precipitado azul se recogió en un filtro, se lavó con éter y se secó. El colorante de cianina se purificó por cromatografía líquida a presión media, usando la mezcla acetonitrilo/agua 60:40. El rendimiento del ácido purificado fue del 65%; su \lambda_{max} en MeOH es de 660 nm. El ácido se convirtió después en su éster de N-hidroxisuccinimida. 50 mg (67 \mummol) del ácido se disolvieron en un vial de microsíntesis con 27,6 mg de N,N'-diciclohexil carbodiimida (134 \mummol), 15,4 mg de N-hidroxisuccinimida (134 \mummol) y 2 ml de DMF seca. Todos los objetos de cristal y reactivos deben ser anhidros. La solución se agitó durante una noche a 50ºC. El éster activo 4b se precipitó con éter, se recogió en un filtro de vidrio y se lavó cinco veces con éter, se secó y almacenó a -20ºC. Rendimiento de éster a partir del ácido: 90%.

Ejemplos 5a y 5b

Se usó el mismo protocolo para los dos conjugados 5a y 5b. Se disolvieron 2 \mummol de 5-alilamino-dUTP en 1,2 ml de tampón borato 0,1 M pH 8, se añadieron 10 \mummol de éster activo 4a o 4b disuelto en 300 \mummol de DMF a la solución de 5-alilamino-dUTP y la mezcla se agitó en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se controló por RP-HPLC (columna: Waters Novapack 3,9 x 150 mm; bucle: 20 ml; caudal: 1 ml/min; programa: 15' gradiente lineal de 100% A a 50% A/50% B, 5' 50% A/50% B, 5' gradiente de vuelta a 100% A, con A = agua con ácido trifluoroacético al 0,1% y B = acetonitrilo). La solución de conjugado bruto se pre-purificó por cromatografía de filtración de gel en una columna Sephadex G-10 de 1,5 x 30 cm, con agua como eluyente. La purificación final fue por cromatografía líquida a presión media en una columna Lichroprep RP-18, de 20 x 300, con agua/acetonitrilo 70:30 como eluyente. La eficacia de acoplamiento fue del 90% para 5a y del 80% para 5b. Absorción máxima en MeOH: 570 nm para 5a y 660 nm para 5b. Los conjugados 5a y 5b se almacenaron a -20ºC.

Ejemplo 6a

10 g de 2,3,3-trimetil-5-carboxiindolenina se cuaterniazaron calentándola en un exceso de cuatro veces de 4-butanosulfona a 120ºC durante cuatro horas. La solución parda se enfrió y se añadió lentamente a un gran volumen de éter agitado rápidamente. Un sólido de color pardo claro se separó y se secó al vacío. Rendimiento de 6a 89%.

Ejemplo 6b

0,5 g de 1-(8-sulfonatobutil)-2,3,3-trimetil-5-carboxiindoleninio, (compuesto 6a) (1,47 mmol), 645 mg de hemicianina 2c (1,47 mmol), 1 ml de trietilamina y 25 ml de anhídrido acético se calentaron a reflujo durante 30 minutos. El colorante azul resultante se precipitó en éter. El colorante bruto se purificó por cromatografía a presión media en fase inversa sobre LiChroprep R-18, \lambda_{max} en MeOH era de 646 nm. Este compuesto se activó con trietilcloroformiato a su forma anhídrido mixta. El terc-butil éster de ácido 6-aminocaproico en piridina se añadió al anhídrido mixto y la mezcla se calentó a reflujo durante 30 minutos. El producto se aisló por precipitación con éter. Después de la hidrólisis en ácido clorhídrico diluido, el ácido bruto se purificó por cromatografía líquida a presión media RP. El compuesto ácido puro (6a-1) se convirtió después en su éster de N-hidroxisuccinimida, compuesto 6b, como se ha descrito previamente.

Ejemplo 7a

2-Acetil-2-metil-suberato de dietilo. Se añadió 2-metilacetoacetato de etilo (7,9 g, 60 mmol) a una solución agitada de 1,44 g de hidruro sódico (60 mmol) en 80 ml de tolueno durante un periodo de 30 minutos. La solución resultante se calentó a reflujo durante dos horas, se enfrió ligeramente y se trató con 5-bromohexanoato de etilo durante un periodo de 30 minutos. La mezcla resultante se calentó después a reflujo durante doce horas, se enfrió y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo, un aceite amarillo se usó tal cual en la siguiente etapa.

Ácido 7-metil-8-oxo-nonanoico. La hidrólisis del 2-acetil-2-metil-suberato de dietilo bruto con ácido clorhídrico concentrado dio un rendimiento cuantitativo de ácido 7-metil-8-oxo-nonanoico.

10,0 g de ácido 4-hidrazino-bencenosulfónico (53 mmol) y 9,87 g de ácido 7-metil-8-oxo-nonanoico (53 mmol) en 50 ml de ácido acético se calentaron a reflujo durante 3 horas. La mezcla se enfrió durante varias horas y el sólido rosa precipitado se recogió en un filtro y se lavó con éter. El sólido cristalino resultante se secó en un desecador sobre KOH sólido durante 2 días. Finalmente, el indol bruto se cuaternizó calentándolo con un exceso de cuatro veces de yoduro de etilo en sulfolano a 120ºC durante doce horas. La precipitación con un gran volumen de éter produjo el compuesto 7a en forma de un polvo rojizo. Rendimiento 68%.

Compuesto 7b

El ácido 7a, (1,5 mmol), hemicianina 2c (1,5 mmol), 1 ml de trietilamina y 30 ml de anhídrido acético se calentaron a reflujo durante 30 minutos. El colorante azul resultante se precipitó en éter. El colorante bruto se purificó por cromatografía a presión media en fase inversa sobre LiChroprep R-18, \lambda_{max} en MeOH fue de 665 nm. Se convirtió en su éster de N-hidroxisuccinimida 7b como se ha descrito anteriormente.

Compuesto 8a

10 g de 5-bromofenilhidrazina (53,5 mmol), 20 ml de 3-metil-2-butanona y 100 ml de ácido acético se calentaron a reflujo durante 4 horas en atmósfera de nitrógeno. Después de retirar el disolvente, el aceite rojo se trituró con hexano hasta que solidificó en un sólido rosa. El material bruto se disolvió en diclorometano y se re-precipitó en un gran exceso de éter. Este procedimiento se repitió dos veces. El rendimiento de indol purificado fue del 90%. En la siguiente etapa, el indol (11,43 g; 48,0 mmol), 4,90 g de ácido 4-pentinoico (50,0 mmol) y 10 ml de pirrolidina se agitaron en 100 ml de N,N-dimetilformamida en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Bis(trifenilfosfina)cloruro de paladio (II), 0,35 g de yoduro de cobre (I) se añadieron después a la mezcla agitada. Después de tres horas, el disolvente y los componentes volátiles se evaporaron a presión reducida. El alquinil indol bruto se cuaternizó calentándolo con un exceso de cuatro veces de 1,4-butanosulfona a 130ºC durante 3 h. El rendimiento global de 8a a partir de 5-bromo-2,3,3-trimetilindolenina fue del 65%.

Compuesto 8b

El ácido 8a (1,5 mmol), hemicianina 2c (1,5 mmol), 1 ml de trietilamina y 30 ml de anhídrido acético se calentaron a reflujo durante 30 minutos. El colorante de cianina resultante se precipitó en éter. El colorante bruto se purificó por cromatografía a presión media en fase inversa sobre LiChroprep R-18, \lambda_{max} en MeOH fue de 664 nm. Se convirtió en su éster de N-hidroxisuccinimida 8b como se ha descrito anteriormente.

Claims

1. Un procedimiento para preparar un colorante de indocianina asimétrica que comprende las etapas de:

a): hacer reaccionar una primera indolenina cuaternizada o indolenina sustituida con un compuesto de fórmula (II)

2

: o un clorhidrato del mismo, en la que n es 0 ó 1

: Ph es fenilo o fenilo sustituido

: X es hidrógeno, halógeno o alquilo, en un disolvente seleccionado entre el grupo constituido por ácido acético, anhídrido acético y mezclas de los mismos en presencia de cloruro de acetilo, para obtener una hemicianina intermedia, y

b): hacer reaccionar adicionalmente dicha hemicianina intermedia con una segunda indolenina cuaternizada o indolenina sustituida diferente de dicha primera indolenina.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la cantidad de cloruro de acetilo es del 0,5 al 50% v/v, respeto al disolvente de ácido acético/anhídrido acético.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicha primera indolenina es menos reactiva que dicha segunda indolenina.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha primera indolenina lleva grupos aceptores de electrones en el anillo de benceno.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en el que dicha primera indolenina tiene anillos de benceno condensados adicionales.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicha primera indolenina tiene anillos de benceno condensados adicionales que llevan grupos sulfónicos o están cuaternizados con grupos sulfoalquilo o carboxialquilo.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la hemicianina intermedia de la etapa a) se purifica por extracción con un disolvente adecuado para extraer los compuestos de fórmula (II) no reaccionados sin una disolución sustancial de la hemicianina.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho disolvente se selecciona entre el grupo constituido por acetato de etilo y disolventes orgánicos clorados y mezclas de los mismos.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho disolvente se selecciona entre el grupo constituido por cloruro de metileno, cloroformo, 1,1,1-tricloro etano y mezclas de los mismos.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para preparar un colorante de indocianina asimétrica de fórmula:

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3

en la que

Q es un puente de metino con 3 o 5 átomos de carbono

R_{1} es hidrógeno, SO_{3}^{-} o -COOH,

R_{2} y R_{3} independientemente son H o SO_{3}^{-} M^{+}

M es un metal monovalente

R_{4} es alquilo C_{1}-C_{12}, o (CH_{2})_{m}SO_{3}^{-}, con m = 1 a 12,

W es alquileno que tiene de 1 a 18 átomos de carbono, o es (CH_{2}-CH_{2}-O)_{n} CH_{2}-CH_{2}- en la que n es de 1 a 5 y

R_{5} es un grupo funcional seleccionado entre carboxilo, carbonil(aldehído), hidroxilo, amino, sulfidrilo, glicidilo, maleimida, imidazolil carbamoílo, sucinimidil éster, fosforamidita, isotiocianato, anhídrido, haloacetamido, haluro de sulfonilo, haluro de ácido, hidrazida, ftalimidil éster y naftalimidil éster.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para preparar un colorante de indocianina asimétrica seleccionado entre el grupo constituido por:

4

5

6

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7

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8

9

12. Un procedimiento para preparar una hemicianina, que comprende la etapa de:

-: hacer reaccionar una indolenina cuaternizada o indolenina sustituida con un compuesto de fórmula (II)

10

: o el clorhidrato del mismo,

: en la que n es 0 ó 1

: Ph es fenilo o fenilo sustituido

: X es hidrógeno, halógeno o alquilo, en un disolvente seleccionado entre el grupo constituido por ácido acético, anhídrido acético y mezclas de los mismos en presencia de cloruro de acetilo.

13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 12, en el que x es cloro.

14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la cantidad de cloruro de acetilo es del 1% al 20% v/v, referido al disolvente de ácido acético/anhídrido acético.

15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que R_{4} es alquilo C_{1}-C_{4}.

16. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que R_{4} es (CH_{2})_{m}SO_{3}^{-} con m = 1 a 4.

17. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10, 15 o 16, en el que W es alquileno que tiene de 1 a 5 átomos de carbono.

18. Una indocianina asimétrica que tiene la fórmula 5a, 5b, 6a-1, 6b, 7b o 8b, como se muestra en la reivindicación 11.