ES2312311T3 - Metodo par la seleccion de cepas adhesivas de lactobacilos que presentan propidades terapeuticas y cepas obtenidas mediante dicho metodo. - Google Patents
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Abstract
Cepas seleccionadas de: Lb. plantarum, 29.11.1996 LMG-P-17630 Lb. acidophilus, 15.01.1999 LMG-P-18806 Lb. delbreuckii, 15.01.1999 LMG-P-18805 Str. thermophilus, 15.01.1999 LMG-P-18807.
Description
Método para la selección de cepas adhesivas de
lactobacilos que presentan propiedades terapéuticas y cepas
obtenidas mediante dicho método.
La presente invención se refiere a nuevas cepas
de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus delbrueckii, Streptococcus
thermophilus, a su uso y a composiciones farmacéuticas que las
contienen.
Las bacterias lácticas están ampliamente
distribuidas en la naturaleza. Varias especies están presentes en
productos alimenticios (leche, yogurt, frutas, vegetales y muchos
otros), mientras que solamente algunas cepas son saprofitos
eubióticos habituales de la flora intestinal y/o genitourinaria.
Las bacterias lácticas generalmente conocidas,
cuando se administran por vía oral o vaginal o por otras vías,
reestablecen la flora bacteriana fisiológica.
Con el fin de ejercer su actividad durante un
largo tiempo, las lactobacterias deben poder adherirse a las
células epiteliales de la mucosa con las que entran en contacto de
modo que forman una biopelícula que, fijada sobre las células
epiteliales, constituye una barrera real entre el epitelio y las
posibles bacterias patógenas.
Dicha evidencia muestra que la capacidad de
adhesión de las bacterias lácticas, recuperadas de diversos hábitats
en seres humanos, es un requisito esencial para que éstas ejerzan
su actividad beneficiosa profiláctica ya que, además de mejorar la
capacidad para ejercer su acción, pueden impedir infecciones por
toxinógenos evitando la adhesión de patógenos a la superficie
tisular.
Se reconoce habitualmente que la adhesión
bacteriana a la mucosa epitelial representa un requisito importante
para la colonización bacteriana de sitios específicos en plantas y
animales, concretamente ejerciendo un papel principal en la
fisiología de la flora bacteriana normal humana y en la patogenia de
infecciones humanas producidas por bacterias patógenas.
La especificidad de la interacción entre
bacterias y tejido huésped se confirma mediante la especificidad de
especie de la ubicación, en particular sitios para el huésped, de la
flora saprofítica normal y de algunas infecciones bacterianas.
La capacidad de los microorganismos para
adherirse a las células epiteliales es además también específica de
huésped: de hecho, se ha verificado que cepas particulares de
bacterias lácticas son colonizadoras específicas de algunas
especies de animales y no de otras.
Boris S y otros, en Infection and Immunity,
American Society for Microbiology, Washington, EE.UU., vol. 66, nº
5, mayo de 1998, páginas 1985-1989 dan a conocer
pruebas de competición entre lactobacilos y patógenos bien
conocidos.
Reid G y otros, en Journal of Industrial
Microbiology, vol. 15, nº 3, 1995, páginas 248-253,
y Raid Gregor y otros, International Biodeterioration and
Biodegradation, vol. 34, nº 1, 1994 páginas 73-83,
informan sobre el efecto de la incubación conjunta de lactobacilos
y patógenos.
Kotarski SF y otros, en Infection and Immunity,
vol. 26, nº 3, 1979, páginas 966-975, dan a conocer
la técnica de centelleo líquido para contar el número de
lactobacilos adheridos in vitro a células gástricas
murinas.
Kalantzopoulos G, 1997, en Biosis Database nº de
acceso XP002264967 da a conocer algunas de las especies bacterianas
usadas como agentes probióticos, entre otros especies de
estreptococos, lactobacilos y bifidobacterias.
El documento US 5.032.399 da a conocer por
ejemplo una cepa particular de Lactobacillus acidophilus
aislada a partir de la flora intestinal normal, citada como
Lactobacillus GG, y posteriormente clasificada de nuevo como
Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus, de la que se informa,
además de otras características, de la capacidad de dicha cepa para
adherirse a células de la mucosa intestinal humanas.
En la patente mencionada anteriormente se da a
conocer un método adecuado para evaluar "in vitro" si la
cepa sometida a prueba presenta la capacidad de adherirse a células
de la mucosa intestinal aisladas.
Más en general, la evaluación de la capacidad
para colonizar y/o para adherirse a epitelios se lleva a cabo o
bien mediante sistemas in vitro (adhesión a líneas celulares
y a cultivos de órganos) o mediante la administración de las cepas
que van a examinarse a voluntarios sanos. En la bibliografía, se ha
informado de estudios que muestran una confirmación adicional del
hecho de que la capacidad de adhesión diferente es típica de una
única cepa y no de especies, ya que se considera que es importante
desde un punto de vista general, en el mecanismo de adhesión, la
naturaleza de la superficie sobre la que debe adherirse el
microorganismo, pero sobre todo, las características fisiológicas,
bioquímicas y genéticas del microorganismo en cuestión.
\global\parskip0.900000\baselineskip
De ese modo puede predecirse cómo seleccionar en
la población tomada en cuenta cepas que muestran principalmente que
presentan dicha capacidad de adhesión. El mecanismo y los factores
que regulan la capacidad de adhesión no se han esclarecido aún
completamente. Algunos autores afirman que en el mecanismo de
adhesión son importantes los enlaces químicos entre superficies;
otros autores dan a conocer que capas de hidratos de carbono, que
cubren las células bacterianas, median la fijación; otros prevén la
presencia de mucopolisacáridos ácidos o macromoléculas complejas
que contienen ácido teicoico o polímero exocelulares; otros dan a
conocer además, como factor clave para la adhesión, la presencia de
antígenos bacterianos superficiales conocidos como adhesinas, con
frecuencia constituidos por proyecciones filamentosas hechas de
pilosidades o fimbrias que parten de la capa de hidrato de carbono
que rodea las células bacterianas.
En conclusión, los microorganismos que se
adhieren a la superficie del epitelio representan un elemento
importante para la salud y el bienestar ya que constituyen una
barrera entre el epitelio y los patógenos.
Por esta razón, la selección de las cepas de
bacterias lácticas que presentan capacidad adhesiva permite que las
cepas seleccionadas ejerzan una actividad profiláctica o
reestablecedora.
Algunas cepas de bacterias lácticas aisladas a
partir de un hábitat intestinal y/o genitourinario, tras la
selección en una escala de laboratorio, aunque muestran propiedades
adhesivas in vitro, no pueden adherirse in vivo a
epitelios fisiológicos. Esto se debe a la posibilidad de la
presencia adicional de patógenos ya instalados (o no instalados aún
pero con una alta capacidad de adhesión para el tipo de epitelio
considerado), evitando la adhesión y la posterior colonización de
bacterias lácticas.
Por tanto, para asegurarse de que se está
tratando con bacterias lácticas que pueden ejercer su actividad
terapéutica, las cepas deben seleccionarse previamente con el fin de
identificar aquéllas que pueden garantizar in vivo la
capacidad para competir con patógenos.
En la actualidad se ha encontrado un
procedimiento que permite seleccionar cepas de bacterias lácticas,
útiles en el tratamiento de trastornos del tubo digestivo y aparato
genitourinario en el hombre y la mujer. El método incluye una
prueba de adhesión de cepas de bacterias lácticas previamente
aisladas y caracterizadas, posiblemente también liofilizadas y
rehidratadas en mezcla con cepas patógenas, (en una tasa de desde
1:10 hasta 10:1) y la posterior selección de las colonias
bacterianas únicas que muestran una fuerte capacidad de adhesión
compitiendo con el patógeno.
La cepa de lactobacilos que va a someterse a
este tratamiento proviene de la flora bacteriana normal,
preferiblemente intestinal y/o uro-vaginal, de un
sujeto humano sano, y se obtienen normalmente de muestras biológicas
que contienen varias especies bacterianas, aisladas mediante
técnicas convencionales.
Antes de someterse al método, tales muestras se
someten generalmente a tratamientos previos adecuados, según
métodos convencionales, que permiten la conservación de las cepas
hasta el momento de su uso.
Se mezclan lactobacterias, opcionalmente
sometidas previamente a pruebas de adhesión convencionales, como
por ejemplo la dada a conocer en la patente estadounidense
5.032.399, con cepas de patógenos incubándolas junto con células
intestinales aisladas.
Entonces se resuspenden, filtran y lavan
bacterias lácticas y cepas patógenas adheridas a células
intestinales. Después se procede al recuento y a la identificación
de las bacterias lácticas adheridas.
Se incuban cepas bacterianas que van a someterse
al presente procedimiento, preferiblemente procedentes de la flora
saprofítica normal de sujetos sanos, con un medio nutriente y se
caracterizan las cepas seleccionadas tras la incubación y se
mantienen en una caja adecuada para entonces someterse opcionalmente
a los métodos de selección dados a conocer en el documento EP A
0861905.
Entonces se lleva a cabo una prueba de adhesión
aislando en primer lugar células humanas adecuadas, por ejemplo
células gastrointestinales o vaginales, según métodos
convencionales.
A modo de ejemplo, se da a conocer en el
presente documento un método de análisis para evaluar la adhesión
bacteriana in vitro. Tal método implica la recogida de
efluente de un paciente con una ileostomía que funciona bien
mediante lavado con solución salina.
Se recoge el efluente de solución salina en
tampón I 1/10 frío (gelatina al 0,1%, glucosa al 1%, fosfato de
sodio 500 mM, pH 7,4). Entonces se filtra esta disolución a través
de un tamiz que tiene un diámetro de 25 para eliminar grumos y
residuos después de recoger las células de la mucosa del intestino
delgado (íleo) centrifugando a 100 x g durante 10 min. Entonces se
lavan las células con tampón II (NaCl al 0,45%, glucosa al 0,1%,
gelatina al 0,01%, fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4) usando las
mismas condiciones de centrifugación. Entonces se resuspenden las
células en tampón II, se añade algo de medio de cultivo tisular y
finalmente se almacenan las células a 4ºC hasta el momento de su
uso.
Se determinan el número y la viabilidad de las
células ileales mediante tinción con azul trípano. Las células
humanas ileales pueden congelarse en nitrógeno líquido tras la
adición de glicerol al 10% (v/v).
Se hacen crecer las bacterias lácticas durante
18 horas a las temperaturas óptimas relativas (comprendidas entre
+37 y +42ºC) en caldo MRS o M17 u otro medio adecuado, con adición
de de ^{3}H-alanina y
^{3}H-leucina. Entonces se lavan las bacterias
lácticas en 5 volúmenes de solución salina tamponada con fosfato, se
resuspenden en tampón II y se filtran a través de filtros de
policarbonato de 2,0 \mu para eliminar los grumos. Se mezclan las
bacterias lácticas con los patógenos en una tasa de 1:1, entonces se
mezcla la mezcla con las células intestinales aisladas y se incuba
a temperaturas adecuadas (37-42ºC), durante un
periodo comprendido entre 1 y 10 minutos, preferiblemente durante
aproximadamente 5 minutos. Se colocan las muestras sobre un filtro
de policarbonato de 2,0 \mu y se elimina el líquido en exceso
mediante succión débil. Entonces se enjuagan los filtros, en primer
lugar con 2 ml luego con 5 ml de solución salina tamponada con
fosfato (pH 7,4). Usando estos filtros se retienen las células
ileales y bacterias lácticas y los patógenos adheridos a las mismas,
mientras que las bacterias libres pasan a su través. Los controles
incluyen la mezcla de reacción sin células ileales humanas. Se
evalúa la radioactividad retenida mediante centelleo líquido.
Se determina la actividad específica de
bacterias lácticas a partir de las unidades formadoras de colonia
calculadas a partir de la densidad óptica a 550 nm y a partir de la
radioactividad retenida por los filtros de 2,0 \mu. La actividad
específica bacteriana se usa para calcular el número de bacterias
encontradas. Se considera que las cepas que están unidas a una tasa
de 50, y más preferiblemente de 100, bacterias por células
gastrointestinal satisfacen el criterio de selección.
El presente procedimiento permite seleccionar
bacterias lácticas, tales como las cepas depositadas en el LMG de
Gent tal como se cita a continuación en el presente documento,
dotadas con una alta capacidad de adhesión a epitelios fisiológicos
humanos; particularmente las cepas así seleccionadas presentan la
propiedad ventajosa de poder pegarse a los tejidos de la mucosa
compitiendo con los patógenos.
Además, las cepas obtenidas con el procedimiento
están dotadas de manera inesperada de la capacidad para desplazar,
in vivo, patógenos ya instalados en los tejidos
fisiológicos.
Se han depositado muestras de cepas de bacterias
seleccionadas mediante el método anterior según el Tratado de
Budapest en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos -
BCCM/Colección LMG con los siguientes números de registro:
\global\parskip1.000000\baselineskip
Lb. plantarum, aislada a partir de vagina
humana: LMG-P-17630 del
29.11.1996
Lb. acidophilus, aislada a partir de
intestino humano: LMG-P-18806 del
15.01.1999
Lb. delbreuckii, aislada a partir de
intestino humano: LMG-P-18805 del
15.01.1999
Str. thermophilus,
LMG-P-18807 del 15.01.1999
Tales cepas constituyen un aspecto del contenido
de la invención, gracias a su alta capacidad de adhesión, en
competición con bacterias patógenas, a epitelios humanos.
Se llevó a cabo la caracterización taxonómica
usando métodos convencionales tales como pruebas de fermentación de
hidratos de carbono de (API 50 CHL®, Biomerieux), análisis de
morfología celular, reacciones de oxidasa, catalasa y Gram,
análisis SDS-PAGE y "análisis de
conglomerados".
A continuación en el presente documento se
informa de algunas características de las cepas de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos in vitro pueden
reproducirse in vivo administrando los cultivos de dichos
lactobacilos, liofilizados según técnicas conocidas, obtenidos según
el método dado a conocer anteriormente.
Los lactobacilos según la presente invención,
pueden administrarse como tal o añadirse a un vehículo
farmacéuticamente o al menos fisiológicamente aceptable, obteniendo
por tanto diversos tipos de preparaciones o formulaciones, tales
como composiciones farmacéuticas, que son objetos adicionales de la
presente invención.
Por tanto, por ejemplo, las cepas bacterianas
reivindicadas pueden administrarse mediante formulaciones
ginecológicas (por ejemplo, cápsulas vaginales, comprimidos
vaginales, lavados, etc.) o para su uso intestinal (por ejemplo,
polvo dividido en pequeños sobres, cápsulas, comprimidos etc.).
Las formulaciones de la invención contienen una
o más cepas de bacterias lácticas de la invención, en una cantidad
eficaz para el tratamiento terapéutico o profiláctico
pretendido.
Las cepas de bacterias lácticas reivindicadas
son útiles en el tratamiento local de patologías que derivan de la
proliferación anómala de patógenos tales como por ejemplo diarrea
y/o vaginitis bacteriana.
Claims (4)
1. Cepas seleccionadas de:
- Lb. plantarum, 29.11.1996 LMG-P-17630
- Lb. acidophilus, 15.01.1999 LMG-P-18806
- Lb. delbreuckii, 15.01.1999 LMG-P-18805
- Str. thermophilus, 15.01.1999 LMG-P-18807.
2. Composiciones farmacéuticas que contienen
como principio activo una o más cepas según la reivindicación 1.
3. Composiciones según la reivindicación 2, en
forma de formulaciones ginecológicas o intestinales.
4. Uso de las cepas según la reivindicación 1,
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diarrea
y/o vaginitis bacteriana.
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