ES2311763T3 - Uso de los inhibidores de la histona de acetilasa para incrementar la ganancia terapeutica en radioterapia y quimioterapia. - Google Patents

Abstract

Uso de un agente de histona hiperacetilado para la fabricación de un medicamento, para el tratamiento tópico de enfermedades malignas o no-malignas proliferantes mientras que se asegura una alta probabilidad de un control del tumor y el incremento de la ganancia terapéutica en quimioterapia y/o radioterapia y que reduce simultáneamente la frecuencia de secuelas de la terapia en donde la ganancia terapéutica incrementa, simultáneamente se mejora la radiosensibilización del tumor o sensibilización del tumor a la quimioterapia, el incremento a la inhibición del crecimiento del tumor, que promueve la cicatrización de la herida en mucositis y dermatitis, evitando/reduciendo la severidad del síndrome plantar-palmar, disminuyendo la fibrosis del tejido, protegiendo el tejido normal de una muerte celular, evitando la xerostomía, y suprimiendo la tumorigénesis.

Description

Uso de los inhibidores de la histona de acetilasa para incrementar la ganancia terapéutica en radioterapia y quimioterapia.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el tratamiento de lesiones inducidas por la radiación- y/o quimioterapia. Más particularmente, la presente invención se relaciona con un método y composición farmacéutica para incrementar la ganancia terapéutica en radioterapia y quimioterapia.

Descripción del oficio relacionado

La radioterapia con o sin quimioterapia concurrente o secuencial es una modalidad eficaz para cánceres de la cabeza y cuello, pecho, piel, anogenital, y ciertas enfermedades no-malignas tales como queloide, tumor desmoide, hemangioma, malformación arteriovenosa, y histocitosis X. Sin embargo, el beneficio terapéutico se limita por las lesiones del epitelio de la mucosa inducidas por radiación- y quimioterapia- y síndrome de radiación cutánea (CRS), que incluye reacciones agudas de hinchazón del tejido, mucositis, dermatitis, descamación, y ulceración, y efectos a largo plazo de la fibrosis del tejido/piel, necrosis, y el desarrollo de secuelas que amenazan la vida de sarcoma, carcinoma de células escamosas y basales carcinoma (Peter, R. U. The cutaneous radiation syndrome. Advances in the treatment of radiation injuries, pp. 237-240. Oxford: lsevier, 1996). De hecho, la piel se afecta en cada forma de la radioterapia externa de órganos internos, y la mucositis puede ocurrir en la cavidad oral, esófago, tracto gastrointestinal, vejiga, vagina, recto, pulmón, cavidad nasal, oído y orbita como un efecto secundario de la quimioterapia y radioterapia. La aplicación de anti-inflamatorios esteroidales o no-esteroidales, es el tratamiento más común para la lesión del tejido inducida por la radiación y quimioterapia, pero los resultados no son satisfactorios. Un método para reducir selectivamente la morbilidad de la piel sin comprometer los efectos de radioterapia y quimioterapia que matan el tumor es un objetivo buscado durante mucho tiempo en radiación y oncología médica.

Los medicamentos que han sido previamente probados en el manejo del daño inducido por la radiación- y quimioterapia incluyen antioxidantes (vitamina E y superóxido dismutasa), agentes anti-inflamatorios (corticosteroides, colchicinas, D-penicilamina, y TNF-\alpha, anticuerpos antagonistas), y agentes anti-fibrogénicos (interferón, TGF-\beta antagonista, e inhibidores de la enzima que convierten la angiotensina). Ninguno de estos son capaces de mejorar simultáneamente la dermatitis aguda y la mucositis, prevenir la aparición de fibrosis, y reducir la tumorigénesis tardía; además, la toxicidad, efectos secundarios, posibilidades de protección del tumor, y una carencia de efectos antitumorales son problemáticos.

US-A-5 939 455 revela un método para el aumento de la actividad terapéutica de los compuestos que contienen oxialquileno administrando un inhibidor de la \beta-oxidación de los ácidos grasos. El documento no proporciona los métodos para administrar grandes dosis de quimio- y/o radioterapia a un paciente utilizando inhibidores de la histona deacetilasa.

WO 02/060430 A1 se refiere a los métodos para la inhibición del crecimiento de tumores sólidos administrando a un animal una cantidad efectiva de un inhibidor de la histona deacetilasa y un retinoide. El documento no describe métodos que hacen posible la administración de la dosis más alta de quimio- o radioterapia a un paciente con necesidad de este.

VIGUSHIN DAVID M ET AL ["Histone deacetylase inhibitors in cancer treatment", ANTI-CANCER DRUGS, vol. 13, no. 1, 2002, pages 1-13] se refiere a la inducción de la remisión de un paciente que sufre de leucemia mieloide, mediante la administración de sodio fenilbutirato en combinación con todo el ácido trans-retinóico. El documento no revela un método que hace posible la administración de dosis más altas de quimio- o radioterapia a un paciente con necesidad de este.

ZARNEGAR RASA ET AL ["Increasing the effectiveness of radioactive iodine therapy in the treatment of thyroid cancer using Tricostatina A, a histone deacetylase inhibitor", SURGERY, vol. 132, no. 6, 2002, pages 984-990] solo se refiere al aumento del efecto anti-cáncer en terapia de yodo.

BIADE S ET AL ["Chemical agentes that promote chromatin compaction radiosensitize tumor cells", INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION BIOLOGY, vol. 77, no. 10, 2001, pages 1033-1042] se refiere a la Tricostatina A que induce la radiosensibilización de células de carcinoma de colon humano expuesto a los rayos gamma.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método y composición farmacéutica para incrementar la ganancia terapéutica en radioterapia y/o quimioterapia, produciendo una alta probabilidad de control del tumor con baja frecuencia de complicaciones o secuelas de la terapia en un sujeto con necesidad de esta. La composición farmacéutica comprende un tratamiento con una cantidad efectiva de un agente de histona hiperacetilado y un portador farmacéuticamente aceptable o una sal farmacéuticamente aceptable de este. El método comprende la administración de la composición farmacéutica a un sujeto con necesidad.

El propósito del método y la composición farmacéutica de la presente invención incluye simultáneamente (1) el aumento de la represión del tumor o proliferación del crecimiento celular en un huésped con necesidad de radioterapia y/o quimioterapia, y (2) evitando la aparición de o mejora de las complicaciones o secuelas inducidas por la radiación- y/o quimioterapia de la mucositis, dermatitis, ulceración, fibrosis, xerostomía, síndrome plantar-palmar, y tumorigénesis.

De acuerdo con la presente invención, se encontró sorprendentemente que la composición farmacéutica que contiene el inhibidor de la histona deacetilasa redujo la fibrosis del tejido normal inducida por la radiación, estimuló la cicatrización de la herida en la mucositis y dermatitis inducida por la radiación, estimuló la necrosis del tejido inducida por la quimioterapia, evitó la tumorigénesis relacionada con la radiación, mostró un efecto antitumoral directo, mejoró la radiosensibilización del tumor, e inhibió sinérgicamente el crecimiento celular del tumor con radioterapia y otros agentes anti-cáncer.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar vía intravenosa, vía enteral, parental, intramuscular, intranasal, subcutánea, tópica u oral. Las cantidades de dosificación se basan en la concentración efectiva observada en estudios in vitro e in vivo. La utilidad variada y eficaz de los compuestos de la presente invención además se ilustra, por el descubrimiento de que también puede ser administrado concomitantemente o en combinación con una citoquina, una interleucina, un agente anti-cáncer o un agente anti-neoplástico, un agente anti-angiogénesis, un agente quimioterapéutico, un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un estimulante inmune, un antibiótico, ácido retinóico, un inhibidor de la tirosina quinasa, un antagonista de hormona o un estimulante de crecimiento.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se entiende más a fondo y otras ventajas llegaran a ser aparentes cuando se hace referencia a la siguiente descripción de la invención y los dibujos acompañantes en los cuales:

Fig. 1A muestra estudios farmacocinéticos de entrega de diferentes formulaciones de PB a través de la piel.

Fig. 1B muestra un análisis western blot para H3 acetilado en la piel irradiada (fracción sencilla de 40 Gy) tratado con o sin crema de fenilbutirato (PB) por 6 horas después de la irradiación. 1, Piel normal sin irradiación; 2, piel irradiada sin ningún tratamiento; 3, piel irradiada tratada con el vehículo; 4, piel irradiada tratada con el 1% de crema de PB.

Figs. 1C-1F muestran la tinción de inmunofluorescencia del H3 acetilado en la piel irradiada tratada con o sin la crema de fenilbutirato (PB) por 6 horas después de la irradiación. Fig. 1C muestra piel normal sin irradiación; Fig. 1D muestra piel irradiada sin ningún tratamiento; Fig. 1E muestra piel irradiada tratada con el vehículo; y Fig. 1F muestra piel irradiada tratada con el 1% de crema de PB.

Fig. 2 es un diagrama de calificación de la reacción de la piel aguda, que muestra el transcurso del tiempo de la calificación de la piel promedio después de 40Gy de la irradiación.

Figs. 3A-3L son las fotografías de la histología H&E que muestran que los inhibidores de la histona deacetilasa tópicos tienen efectos sobre la represión del daño inducido por la radiación en la piel. 3A, 3D, 3G, y 3J son la histología H&E en un campo 40x; 3B, 3E, 3H, y 3K son histología H&E en un campo 100; 3C, 3F, 3I, y 3L son histología H&E en un campo 200. Figs. 3A-3C son de piel normal. Figs. 3D-3F son de la reacción aguda en el Día 7 después de la irradiación, que muestra hinchazón subepitelial (flecha blanca). Figs. 3G-3I son del grupo vehículo en el Día 180, que muestra epitelio más delgado, hinchazón del subepitelio, aumento del vaso y densidad del apéndice de la piel, y dermis gruesa con más deposición del colágeno. La punta de flecha negra indica que la capa grasa subcutánea en el grupo vehículo se reemplazó por tejido fibroso y anexos cutáneos.

Figs. 3J-3L son del inhibidor del grupo tratado con la histona deacetilasa en el Día 180, que muestra epidermis más gruesa con 10-30 capas de células (flecha negra), menos hinchazón subepitelial, una dermis más delgada con menos deposición del colágeno, y pocos anexos cutáneos.

Figs. 4A-4D muestran los niveles de expresión de TGF-\beta y TNF-\alpha, después de la irradiación tratada con o sin el inhibidor de HDAC tópico. La variación temporal en los niveles de mARN de TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, y TNF-\alpha, en piel después de la irradiación se normaliza con el control interno GAPDH y se expresa como una proporción a niveles en muestras control no-irradiadas. Cada punto representa el promedio de niveles de mARN de 5 muestras en el mismo grupo de Vaselina, vehículo, o fenilbutirato (PB). La flecha indica que el tratamiento del medicamento se suspendió después del Día 90 (*p < 0.05, **p < 0.001 en comparación con los grupos vehículo y tratados con PB). Fig. 4A muestra los cambios de los niveles TGF-\beta1 después de la irradiación tratada con o sin el fenilbutirato tópico (PB). Fig. 4B muestra los cambios de los niveles de TGF-\beta2 después de la irradiación tratada con o sin el fenilbutirato tópico (PB). Fig. 4C muestra los cambios de los niveles de TGF-\beta3 después de la irradiación tratado con o sin el fenilbutirato tópico (PB). Fig. 4D muestra los cambios de los niveles de TNF-\alpha después de la irradiación tratado con o sin el fenilbutirato tópico (PB).

Figs. 5A-5D son fotografías de inmunofluorescencia con los anticuerpos anti-TGF-beta 1, 2 que muestran que la expresión de TGF-beta, el factor de crecimiento fibrogénico, se suprime por el inhibidor de la histona deacetilasa en el ejemplo 4.

Fig. 5A es de piel normal teñida con el TGF-beta. Fig. 5B es una foto de dermatitis aguda en el Día 7 después de la irradiación sin ningún tratamiento del medicamento, mostrando que el TGF-beta se expresó. Fig. 5C es del grupo vehículo en el Día 180 después de la irradiación, mostrando que la expresión del TGF-beta se aumentó con el tiempo, se expresa persistente y altamente en la piel fibrogénica tanto en los queratinocitos de la epidermis y en miofibroblastos de la dermis.

Fig. 5D es del grupo tratado con PB en el Día 180 después de la irradiación, mostrando que el PG tópico suprimió la expresión TGF-beta efectivamente, que se correlaciona bien con menos acumulación de fibra de colágeno en la dermis y más capas de células en el epitelio dado que proliferación de fibroblastos activa el TGF-beta pero inhibe el crecimiento celular epitelial.

Figs. 6A-6D son fotografías de inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-TNF-\alpha mostrando que la expresión del TNF-\alpha, una citoquina proinflamatoria, se suprime por el inhibidor de la histona deacetilasa. Fig. 6A es de piel normal para la tinción del TNF-alfa. Fig. 6B es del grupo tratado con PB en el Día 270 después de la irradiación, mostrando que el inhibidor de la histona deacetilasa suprimió la expresión del TNF-\alpha efectivamente, lo que se correlaciona bien con menos infiltración de las células inflamatoria y sin ulceración crónica. Fig. 6C es una piel irradiada tratado con Vaselina, mostrando que el TNF-\alpha se expresó en el tejido subcutáneo con ulceraciones en el Día 270 (la flecha indica la flecha necrótica). Fig. 6D es una piel irradiada tratada con vehículo, mostrando que el TNF-\alpha se expresó en el tejido subcutáneo con masivos infiltrados de células inflamatorias en el Día 270.

Fig. 7 muestra la represión de la tumorigénesis en la piel después de la irradiación por el inhibidor de HDAC. Tumores cutáneos o de la piel desarrollados recientemente, aumentados con el tiempo después de la radiación, después de 50 semanas en el grupo control que no recibió tratamiento con PB, pero no se desarrollaron tumores en el grupo tratado con PB.

Figs. 8A-8F muestran que el fenilbutirato tópico (PB) inhibe directamente el crecimiento del tumor. Fig. 8A muestra el análisis en el transcurso del tiempo de los niveles expresados de la proteína p21Cip1, un inhibidor del ciclo celular, en células de carcinoma BNL 1MEA7R.1 y CT-26 durante el tratamiento con 4 mM de PB. Figs. BB-8C muestra la inhibición de la curva de crecimiento. Figs. 8D-8F muestra la inhibición del crecimiento del tumor in vivo; Fig. 8D muestra un tamaño del tumor inicial de 1MEA7R.1 por debajo de la piel aproximadamente 0.5 cm en dimensión antes del tratamiento; Fig. 8E es de tumor tratado con el vehículo o placebo en las 4 semanas; Fig. 8F es de un tumor tratado con PB a las 4 semanas.

Fig. 9 es un análisis de northern blot mostrando que la expresión del TGF-\beta1, 2, y la expresión del TNF-\alpha en piel después de la irradiación se suprimió, por los inhibidores HDAC no-relacionados estructuralmente (tricostatina A y ácido valproico).

Fig. 10 muestra la mejora de la radiosensibilización del tumor mediante el Ácido valproico. Los puntos representan el promedio de dos diferentes experimentos realizados por triplicado; SD inferior al 10%.

Figs. 11A-11B muestran que las células del linfoma de Daudi (EBV)-positivas del virus Epstein-Barr se destruyeron selectivamente pero las células de leucemia HL-60 EBV-negativas no, por la baja dosis de la combinación del inhibidor de HDAC, antibiótico y radiación. Fig. 11A muestra TSA 1 nM por 48 horas expresada de la actividad de la EBV timidina quinasa en células Daudi EBV-positivas. Fig. 11B muestra que la combinación de TSA, GCV, y la radiación produce, la muerte máxima de las células EBV-positivas. Las barras representan el promedio de tres experimentos diferentes realizados por triplicado.

Descripción detallada de la invención

Después de que los agentes de radiación y/o quimioterapia inducen las lesiones, la liberación de las citoquinas (tales como factor de necrosis del tumor (TNF-\alpha)) y factores de crecimiento (tal como factor transformante del crecimiento (TGF-\beta)) en tejidos afectados, prolonga y aumenta la respuesta inflamatoria, mientras que promueve regeneración y proliferación del fibroblasto pero inhibe el crecimiento celular epitelial (Hill et al, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 49: 353-365, 2001; Seong et al, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 46: 639-643, 2000;Wang et al, Am. J. Pathol., 153: 1531-1540, 1998; Fedorocko et al, Int. J. Radiat. Biol., 78: 305-313, 2002; Martin et al, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 47: 277-290, 2000; Randall et al, Int. J. Radiat. Biol., 70: 351-360, 1996; Border et al, N. Engl. J. Med., 331: 1286-1292, 1994; Singer et al, N. Engl. J. Med., 341: 738-746, 1999). Especialmente, la respuesta de la lesión amplificada a la radiación por la secreción persistente de la TNF-\alpha y TGF-\beta de las células epiteliales, endoteliales, y del tejido conectivo, que posiblemente se produce por una modificación en el programación genética de la diferenciación y proliferación celular, conduce a las modificaciones histológicas que caracteriza CRS (Zhou et al, Int. J. Radiat. Biol., 77: 763-772, 2001; Skwarchuk et al, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 42: 169-178, 1998; Sivan et al, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 53: 385-393, 2002; Delanian et al, Radiother. Oncol., 47: 255-261, 1998). La activación crónica de la senda del TGF-\beta también estimula la tumorigénesis tardía (Wieser et al, Curr. Opin. Oncol., 13: 70-77, 2001; Massague et al, Cell, 103: 295-309, 2000). De esta manera, CRS y carcinogénesis inducida por la radiación se podría estimar como un desorden genético del proceso de cicatrización de la herida después de exposición a la
radiación.

Un compuesto de la clase de moduladores de genes, inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC), activa y reprime un subconjunto de genes, por remoldeo de la estructura de la cromatina vía el estado alterado en la acetilación de la histona (Marks et al, J. Natl.Cancer Inst., 92: 1210-1216, 2000; Kramer et al, Trends Endocrinol. Metab., 12: 294-300, 2001). La hiperacetilación de la histona resulta en la expresión del inhibidores del ciclo celular (p21Cip1, p27Kip1, y p16INK4), la inhibición de los oncogenes (Myc y Bcl-2), la represión de las citoquinas inflamatorias (interleucina (IL)-1, IL-8, TNF-\alpha, y TGF-\beta), o ningún cambio (GAPDH y \gamma-actina) (Lagger et al, EMBO J., 21: 2672-2681, 2002; Richon et al, Clin. Cancer Res., 8: 662-667, 2002; Richon et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97: 10014-10019, 2000; Van Lint et al, Gene Expr., 5: 245-243, 1996; Huang et al, Cytokine, 9: 27-36, 1997; Mishra et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 98: 2628-2633, 2001; Stockhammer et al, J. Neurosurg., 83: 672-681, 1995; Segain et al, Gut, 47: 397-403, 2000; Leoni et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 2995-3000, 2002). Además para inducir la hiperacetilación de la histona, los inhibidores de HDAC también inducen la hiperacetilación de las proteínas no-histonas tales como S3 ribosómico, p53 o la subunidad Rel-A de NF-\kappaB, modula la actividad de la proteína quinasa C (PKC), inhibe la isoprenilación de la proteína, disminuye la metilación del ADN, y se une a los receptores nucleares (Webb et al, J. Biol. Chem., 274: 14280-14287, 1999; Chen et al, Science, 293: 1653-1657, 2001). Los inhibidores de HDAC han mostrado propiedades en la inducción de la detención del ciclo celular, diferenciación celular, y muerte celular apoptótica en células tumorales y en la disminución de la inflamación y fibrosis en enfermedades inflamatorias (Warrell et al, J. Natl. Cancer Inst., 90: 1621-1625, 1998; Vigushin et al, Clin. Cancer Res., 7: 971-976, 2001; Saunders et al, Cancer Res., 59: 399-404, 1999; Gottlicher et al, EMBO J., 20: 6969-6978, 2001; Rombouts et al, Acta Gastroenterol. Belg., 64: 239-246, 2001). Aunque los efectos de inhibidores de HDAC inducen la acetilación de la histona a granel, resultaran en la muerte celular apoptótica, diferenciación terminal, y detención del crecimiento en células tumorales pero sin toxicidad en las células normales (Garber et al, J. Natl. Cancer Inst., 94: 793-795, 2002). Además, la modulación de la conformación de la cromatina por los inhibidores de HDAC pueden adicionalmente radiosensibilizar los tumores cuyas células son radioresistentes intrinsicamente, y también sensibilizar la células tumorales a la quimioterapia (Ferrandina et al, Oncol. Res., 12: 429-440, 2001; Miller et al, Int. J. Radiat. Biol., 72: 211-218, 1997; Biade et al, Int. J. Radiat. Biol., 77: 1033-1042, 2001).

De esta manera, con base en las habilidades en forma simultánea, coordinada, selectiva, y epigenéticamente manipulando la expresión de los supresores del tumor, oncogenes, citoquinas pro-inflamatorias (TNF-\alpha), y factores de crecimiento fibrogénico (TGF-\beta) por remoldeo diferencial de las cromatinas en células tumorales y normales, una composición farmacéutica que comprende el inhibidor de HDAC puede proporcionar un tratamiento efectivo no solo para disminuir el daño en la piel/mucosa inducida por la radiación- y/o quimioterapia, sino también para mejorar los efectos anti-tumor para maximizar la eficacia terapéutica de la radioterapia y/o quimioterapia.

Los compuestos activos utilizados para realizar la presente invención son, en general, agentes de hiperacetilación de la histona, tales como inhibidores de la histona deacetilasa. Numerosos de dichos compuestos se conocen. Ver, por ejemplo, P. Dulski, Histone Deacetylase as Target for Antiprotozoal Agents, PCT Application WO 97/11366 (Mar. 27, 1997). Ejemplos de dichos compuestos incluyen, pero no limitan a:

A. Tricostatina A y sus análogos tales como: Tricostatina A (TSA); y Tricostatina C (Koghe et al. 1998. Biochem. Pharmacol. 56:1359-1364) (Tricostatina B se ha aislado pero no se demostró como un inhibidor de HDAC).

B. Péptidos, tales como: Oxamflatin, ácido [(2E)-5-[3-[(fenilsulfonil) aminol fenil1]-pent-2-en-4-inohidroxámico (Kim et al. Oncogene, 18:2461-2470 (1999)); Trapoxin A (TPX)--Terapéptido Cíclico (ciclo-(L-fenilalanil-L-fenilalanil- D-pipecolinil-L-2-amino-8-oxo-9,10-epoxi-decanoil)) (Kijima et al., J. Biol. Chem. 268, 22429-22435 (1993)); FR901228, Depsipéptido (Nakajima et al., Ex. Cell Res. 241, 126-133 (1998)); FR225497, Terapéptido Cíclico (H. Mori et al., Aplicación PCT WO 00/08048 (Feb. 17, 2000)); Apicidina, Terapéptido Cíclico [ciclo(N--O-metil-L-triptofenil- L-isoleucinil-D-pipecolini 1-L-2-amino-8- -oxodecanoil)] (Darkin-Rattray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13143-13147 (1996)); Apicidina 1a, Apicidina Ib, Apicidina Ic, Apicidina IIa, y Apicidina IIb (P. Dulski et al., Aplicación PCT WO 97/11366); HC-Toxin, Terapéptido Cíclico (Bosch et al., Plant Cell 7, 1941-1950 (1995)); WF27082, Terapéptido Cíclico (Aplicación PCT WO 98/48825); y clamidocina (Bosch et al., supra).

C. Ácido hidroxámico-Basado en Compuestos Polares Híbridos (HPCs), tales como: Ácido Salicilihidroxámico (SBHA) (Andrews et al., International J. Parasitology 30, 761-768 (2000)); Ácido Salicilihidroxámico Suberoilanilida (SAHA) (Richon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3003-3007 (1998)); Ácido Bishidroxámico Azelaico (ABHA) (Andrews et al., supra); Azelaic-1-Hidroxamato-9-Anilida (AAHA) (Qiu et al., Mol. Biol Cell 11, 2069-2083 (2000)); Ácido Bishidroxámico M-Carboxicinámico (CBHA) (Ricon et al., supra); 6-(3-Chlorofenilureido) Ácido hidroxámico carpoico(3-Cl-UCHA) (Richon et al., supra); MW2796 (Andrews et al., supra); y MW2996 (Andrews et al., supra). Se debe observar que los análogos no efectivos como Inhibidores de HDAC son: Hexametileno bisacetamida (HBMA) (Richon et al. 1998, PNAS, 95:3003-3007); y Dietil bis(pentametileno-N,N-dimetilcarboxamida) malonato (EMBA) (Richon et al. 1998, PNAS, 95: 3003-3007).

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D. Compuestos de Ácidos Grasos de Cadena Corta (SCFA), tales como: Butirato de Sodio (Cousens et al., J. Biol. Chem. 254, 1716-1723 (1979)); Isovalerato (McBain et al., Biochem. Pharm. 53:1357-1368 (1997)); Ácido valproico; Valerato (McBain et al., supra); 4-Fenilbutirato (4-PBA) (Lea and Tulsyan, Anticancer Research, 15, 879-873 (1995)); Fenilbutirato (PB) (Wang et al., Cancer Research, 59, 2766-2799 (1999)); Propionato (McBain et al., supra); Butiramida (Lea and Tulsyan, supra); Isobutiramida (Lea and Tulsyan, supra); Fenilacetato (Lea and Tulsyan, supra); 3-Bromopropionato (Lea and Tulsyan, supra); y Tributirin (Guan et al., Cancer Research, 60, 749-755
(2000)).

E. Derivados de la Benzamida, tales como: MS-27-275 [N-(2-aminofenil)-4-[N-(piridin-3-il-metoxicarbonil) aminometil] benzamida] (Saito et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4592-4597 (1999)); y derivado del 3'-amino de MS- 27-275 (Saito et al., supra). F. Otros inhibidores, tales como: Depudecin [sus análogos (mono-MTM-depudecin y depudecin-biséter) no inhiben HDAC] (Kwon et al. 1998. PNAS 95:3356-3361); and Scriptaid (Su et al. 2000 Cancer Research, 60:3137-3142).

La descripción en esta aplicación en particular se dirige al ácido valproico, tricostatina A, y fenilbutirato para incrementar la ganancia terapéutica en radioterapia y quimioterapia para las enfermedades malignas o no-malignas proliferantes, para producir una alta probabilidad de control del tumor con baja frecuencia de secuelas de terapia, como ejemplos no-limitantes y no tiene la intención de limitar el alcance de la invención. También se revelan, las formulaciones farmacéuticas y el uso de compuestos de ácido valproico, tricostatina A y fenilbutirato.

En el curso de los experimentos, se descubrió que el ácido valproico, la tricostatina A y el fenilbutirato como inhibidores de la histona deacetilasa, tienen fuertes efectos no solo disminuyendo la hinchazón de la piel, aumento de la descamación cicatrización en mucositis y dermatitis, reducción de la fibrosis, y prevención de la tumorigénesis en tejido/piel irradiada, sino también la inhibición del crecimiento celular del tumor, y la mejora de la radiosensibilización del tumor.

El inhibidor de los agentes de la histona deacetilasa se pueden llevar en la forma de sales farmacéuticamente aceptables. Como sales farmacéuticamente aceptables se pueden utilizar a condición de que afecten adversamente los efectos farmacológicos deseados de los compuestos. La selección y producción se pueden realizar por aquellos de habilidad en el oficio. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de metales alcalinos tales como sal de sodio o una sal de potasio, sales de metal alcalinotérreo tales como sal de calcio o una sal de magnesio, sales con una base orgánica tales como una sal de amonio, o una sal con una base orgánica tal como una sal de trietilamina o una sal de etanolamina.

El inhibidor de los agentes de la histona deacetilasa de la presente invención puede ser administrada oral o no-oralmente. En el caso de la administración oral, puede ser administrada en la forma de cápsulas de gelatina dura y suave, tabletas, gránulos, polvos, soluciones, suspensiones, enjuagues bucales o similares. En el caso de la administración no-oral, se pueden administrar en la forma de cremas, ungüentos, geles, lociones, parches, supositorios, formaciones del liposoma, solución de inyección, formulaciones de infusión a gota, enema o similares por lo cual la absorción de la membrana continua se puede mantener en la forma de sólido, líquido viscoso, o suspensión. La selección del método para la preparación de estas formulaciones y los vehículos, desintegradores o agentes de suspensión, se puede hacer fácilmente por aquellos de habilidad en el oficio. El inhibidor de los agentes de la histona deacetilasa de la presente invención puede contener otra composición que tiene una actividad anti-inflamatoria o anti-tumor, además al ácido valproico, la tricostatina A, o fenilbutirato, u otros agentes de hiperacetilación y un portador farmacéuticamente aceptable o una sal farmacéuticamente aceptable de este.

Como se reconoce por aquellos de habilidad en el oficio, la dosis efectiva varía dependiendo de la ruta de administración, excipiente usado, y la posibilidad de co-uso con otros tratamientos terapéuticos tales como el uso de una citoquina, una interleucina, un agente anti-cáncer o un agente anti-neoplástico, un agente anti-angiogénesis, un agente quimioterapéutico, un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un estimulante inmune, un antibiótico, ácido retinóico, un inhibidor de la tirosina quinasa, un antagonista de hormona o un estimulante de crecimiento. Las cantidades efectivas y los regímenes de tratamiento para cualquier sujeto particular (por ejemplo, humano, perro, o gato) también dependerá de una variedad de otros factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, edad, peso corporal, estado general de salud, sexo, dieta, tiempo de administración, velocidad de excreción, severidad y curso de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad, pero son generalmente de 0.001% a 100% en peso de la composición sin consideración al modo de administración. Los compuestos activos de la presente invención se pueden administrar opcionalmente en conjunto con otros compuestos útiles en el incremento de la ganancia terapéutica en radioterapia y/o quimioterapia Para una enfermedad maligna o no-maligna proliferante. Los otros compuestos se pueden administrar opcionalmente al mismo tiempo. Como se utiliza aquí, la palabra "al mismo tiempo" significa suficientemente cerca en tiempo para producir un efecto combinado (que es, al mismo tiempo puede ser simultáneamente, o puede tener dos o más eventos que ocurren dentro de un periodo de tiempo corto antes de o después del otro). Como se utiliza aquí, la administración de dos o más compuestos "al mismo tiempo" o "en combinación" significa que los dos compuestos se administran bastante cerca en tiempo que la presencia de uno altera los efectos biológicos del otro. Los dos compuestos se pueden administrar simultánea o secuencialmente. La administración simultánea se puede llevar a cabo mezclando los compuestos antes de la administración, o administrando los compuestos en el mismo punto en tiempo pero en diferentes sitios anatómicos o utilizando diferentes rutas de administración.

Como se utiliza aquí, la enfermedad maligna proliferante comprende melanoma, sarcoma de kaposi, osteosarcoma, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Ewing, sarcoma de tejido blando, cáncer en la piel, linfoma, leucemia, cáncer del seno, tumor de las células germinales, tumor neuroectodérmico primitivo, glioma del cerebro, meningioma cerebral, cáncer de cuello y cabeza, cáncer de tiroides, cáncer del timo, cáncer cervical, cáncer del ano, cáncer colorectal, cáncer de la próstata, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, cáncer del estómago, cáncer pancreático, cáncer de esófago, tumores asociados con virus, y enfermedad a partir de un trasplante de la médula ósea.

Como se utiliza aquí, las enfermedades no-malignas comprenden pterigión, oftalmopatía de Graves, seudotumor orbital, degeneración macular, queloide, verruga, queratoacantoma, hemangioma, malformación arteriovenosa, bursitis, tendinitis, tumor desmoide, enfermedad de Peyronie, estenosis vascular, ameloblastoma, quiste óseo aneurismático, formación ósea heterotópica, ginecomastia, castración ovárica, parotiditis, eczema, dermatitis atópica, psoriasis, periartritis humeroescapular, epicondilitis, artrosis de la rodilla, hidrosadenitis, panadizo, artritis inflamatoria autoinmune, histocitosis X, y enfermedad a partir de un trasplante de órganos.

Con el fin de que la invención descrita aquí se pueda entender más fácilmente, los siguientes ejemplos se publican. Se debería entender que estos ejemplos son solamente para propósitos ilustrativos y no se construyeron como limitantes de esta invención de ninguna manera.

Ejemplos Ejemplo 1 Varias Composiciones Tópicas-Ungüento Oleaginoso, Crema, y Gel A. Preparación de un ungüento oleaginoso del fenilbutirato

470 g de vaselina neutra blanca (Riedel-de Haen), 25 g de cera de parafina 50/52 (proveedor local), y 5 g de 4-fenilbutirato (Merck) se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC para formar una pasta. La pasta se agitó a 400 rpm por 1 hora, y luego se enfrió a temperatura ambiente.

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B. Preparación de un ungüento oleaginoso de fenilbutirato

65 g de vaselina neutra blanca (Riedel-de Haen), 15 g de alcohol cetílico (Riedel-de Haen), 260 g de parafina suave (Merck), 155 g de parafina líquida (Merck), y 5 g de 4-fenilbutirato (Merck) se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC para formar una pasta. La pasta se agitó a 400 rpm por 1 hora, y luego se enfrió a temperatura ambiente.

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C. Preparación de la crema de fenilbutirato

Parte I: 70 g de Tefose 63®, 20 g de Superpolystate®, 10 g de Coster 5000®, 15 g de Myriyol 318®, 15 g de Coster 5088®, y 15 g de GMS SE® (todos comercialmente disponibles de un proveedor local) se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC.

Parte II: 5.739 g de sodio 4-fenilbutirato (Triple Crown America, Inc.), 0.125 g de metilparabeno (Merck), 0.075 g de propilparabeno (Merck), y 149.061 g de agua desionizada se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC.

La parte II se adicionó lentamente en la parte I y se agitó continuamente a 400 rpm por 5 minutos para formar una mezcla. 2% Stabileze QM® (preparado disolviendo 2 g de Stabileze QM® en 98 g de agua desionizada, calentando y agitando a 70ºC para formar una pasta, y enfriando a temperatura ambiente) se adicionó en la mezcla y se agitó por 5 minutos. El pH de la mezcla se ajustó a 5.34 con 0.85% de ácido fosfórico (Merck), y se agitó a 600 rpm por 20 minutos. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente.

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D. Preparación de gel de fenilbutirato

Parte I: 10 g de Stabileze QM® y 232.035 g de agua desionizada se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC.

Parte II: 5.739 g de sodio 4-fenilbutirato (Triple Crown America, Inc.), 0.125 g de metilparabeno (Merck), 0.075 g de propilparabeno (Merck), 232.035 g de agua desionizada, y 20 g de NaOH al 10% se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC.

La parte II se adicionó lentamente en la parte I y se agitó continuamente a 400 rpm por 20 minutos para formar una mezcla. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente.

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E. Preparación del gel de fenilbutirato

Parte I: 10 g de Stabileze QM® y 380.561 g de agua desionizada se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC.

Parte II: 5.739 g de sodio 4-fenilbutirato (Triple Crown America, Inc.), 0.125 g de metilparabeno (Merck), 0.075 g de propilparabeno (Merck), 83.5 g de 1,2-propandiol, y 20 g de NaOH al 10% se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC.

La parte II se adicionó lentamente en la parte I y se agitó continuamente a 400 rpm por 20 minutos para formar una mezcla. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente.

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F: Preparación de formulaciones de fenilbutirato de liberación controlada

Dos formulaciones se prepararon de acuerdo con las composiciones enumeradas en la Tabla 1.

TABLA 1 Composiciones de dos formulaciones de liberación controlada

1

G: Preparación de la formulación liposomal de fenilbutirato

En esta formulación liposomal, fosfatidilcolina de huevo (EPC) y colesterol se utilizaron en concentraciones equi- o diferente- molar como componentes lípidos primarios. Varios liposomas localizados con el 4-fenilbutirato se obtuvieron variando la proporción lípido:fenilbutirato. Los liposomas se prepararon por hidratación de la película delgada, clasificada por membrana de extrusión, y se evalúo físicamente.

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H: Preparación de un ungüento de tricostatina A

472.5 g de vaselina neutra blanca (Riedel-de Haen), 27 g de cera de parafina 50/52 (proveedor local), y 0.5 g de tricostatina A (sigma) se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC para formar una pasta. La pasta se agitó a 400 rpm por 1 hora, y luego se enfrió a temperatura ambiente.

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I. Preparación de un ungüento oleaginoso de tricostatina A

67.5 g de vaselina neutra blanca (Riedel-de Haen), 16 g de alcohol cetílico (Riedel-de Haen), 260.5 g de parafina suave (Merck), 155.5 g de parafina líquida (Merck), y 0.5 g de tricostatina A (sigma) se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC para formar una pasta. La pasta se agitó a 400 rpm por 1 hora, y luego se enfrió a temperatura ambiente.

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J. Preparación de una crema de ácido valproico

Parte I: 70 g de Tefose 63®, 20 g de Superpolystate®, 10 g de Coster 5000®, 15 g de Myriyol 318®, 15 g de Coster 5088®, y 15 g de GMS SE® (todos comercialmente disponibles de un proveedor local) se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC.

Parte II: 5.739 g de ácido valproico (sigma), 0.125 g de metilparabeno (Merck), 0.075 g de propilparabeno (Merck), y 149.061 g de agua desionizada se mezclaron en un vaso de precipitado y se calentaron a 70ºC.

La parte II se adicionó lentamente en la parte I y se agitó continuamente a 400 rpm por 5 minutos para formar una mezcla. 2% Stabileze QM® (preparado disolviendo 2 g de Stabileze QM® en 98 g de agua desionizada, calentando y agitando a 70ºC para formar una pasta, y enfriando a temperatura ambiente) se adicionó en la mezcla y se agitó por 5 minutos. El pH de la mezcla se ajustó a 5.34 con Ácido fosfórico 0.85% (Merck), y se agitó a 600 rpm por 20 minutos. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente.

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Ejemplo 2 Tratamiento de fenilbutirato (PB) tópico induce la hiperacetilación de la histona in vivo.

Como se muestra en la Tabla 2, varias formulaciones de fenilbutirato (PB) se caracterizaron.

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TABLA 2 Características de la Formulación y parámetros farmacocinéticos

3

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Entre las diferentes formulaciones, la crema de PB (Tri-c-02-3), que mostraron buena estabilidad, bajos índices de irritación de la piel, una larga vida útil, y un alto índice de penetración en la piel, se seleccionó para la prueba (Fig. 1A). Para determinar que dosificación de PG tópico fue apropiada para tratar la piel irradiada, la cantidad de hiperacetilación de la histona en los núcleos se utilizó como un marcador para demostrar la magnitud de la penetración del medicamento y para indicar si, la concentración local del medicamento fue suficiente para ejercer los efectos biológicos. El análisis de western blot para las histonas acetiladas en la piel irradiada 6 horas después de la irradiación (40 Gy fracción sencilla), mostró que la forma acetilada de la histona H3 se aumentó suavemente en los grupos control y tratados con el vehículo pero se aumentó notablemente con el tratamiento tópico de 1% de crema de PB a una dosis de 200 mg/superficie de piel irradiada inmediatamente después de la irradiación (Fig. 1B). Las secciones de gel teñidas con azul de coomassie demostraron la equivalencia de la carga de proteínas. La tinción de inmunofluorescencia además demostró que la hiperacetilación de la histona en la piel irradiada, fue visualmente evidente profunda en la capa subcutánea a las 6 horas después del tratamiento del medicamento (i.e., coincidente con el pico de la concentración del medicamento en la prueba de la piel) (Figs. 1A, y 1C-1F). La H3 acetilada en el núcleo se utilizó como un marcador indicando la magnitud de penetración del medicamento.

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Ejemplo 3 Inhibidores de la histona deacetilasa son efectivos para reducir el daño agudo inducido por la radiación del tejido normal

Las ratas Sprague Dawley (SD) hembras adultas, se adquirieron del centro de animales de la National Science Council de Taiwán, y pesaron 250-300 g en el tiempo de la irradiación. Cada rata se confinó a una jaula sola y se le dio comida y agua. Se anestesiaron con pentobarbital 50 mg/kg i.p. antes de la irradiación. La piel sobre el área del glúteo se afeitó completamente y el campo de radiación con 2-cm de diámetro se marcó con un bolígrafo marcador justo antes de la irradiación. Se utilizó un rayo de electrones con una energía de 6MeV producida por un acelerador lineal. La dosis se entrega en el Día 0 a 4Gy/min hasta 40Gy en el área preparada. Cada grupo tratado con un inhibidor de la histona deacetilasa además se dividió en tres subgrupos de animales (5 cada uno): un subgrupo tratado con irradiación de la piel seguido por el vehículo, otro con irradiación de la piel seguida por un inhibidor de la histona deacetilasa, y el tercero con solo irradiación de la piel. Luego se aplicaron, la vaselina (control negativo), ungüento madecassol (control positivo), o cualquier vehículo o la crema de fenilbutirato al 1%, crema de ácido valproico al 1%, o el ungüento de tricostatina A al 0.1%, tópicamente a la piel irradiada dos veces diariamente a partir del Día 1 al Día 90 después de la irradiación. La dosificación promedio para cada tratamiento en los grupos respectivos fue 16 mg de vaselina por cm^{2} de piel, 16 mg de madecassol por cm^{2} de piel, 50 mg de fenilbutirato por cm^{2} de piel, 50 mg de ácido valproico por cm^{2} de piel, 5 mg de tricostatina A por cm^{2} de piel, y una cantidad equivalente de la base del vehículo para los grupos control. Las reacciones graves de la piel se evaluaron en todas las ratas. Las reacciones agudas de la piel se evaluaron y se clasificaron cada día hasta el 90º día después de la irradiación utilizando el sistema de puntuación de la piel modificado (Abe Y. and Urano M. Fraction size-dependent acute skin reaction of mice after multiple twice-a-day doses. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 18(2):359-64, 1990): 0=normal, 0.5=depilación ligera, 1.0=depilación en aproximadamente 50% del área irradiada, 1.5=depilación en más del 50% del área, 2.0=depilación completa, 2.5=depilación completa con edema definitivo o descamación seca en más del 50% del área, 3.0=descamación húmeda en un área pequeña, 3.5=descamación húmeda en la mayor parte del área.

La puntuación de la piel aumenta con la reacción más severa de la piel. Las puntuaciones promedio de la reacción de la piel en cada grupo se muestran en la Fig. 2. En el Día 11, la piel reacciona en los grupos tratados con madecassol (control positivo) o los inhibidores de la histona deacetilasa se marcaron menos que aquellos en los grupos control negativos o vehículo. En el día 21, la depilación en los grupos negativos o vehículos han progresado a descamación húmeda en la mayoría de las áreas mientras que en los grupos madecassol o inhibidor de la histona deacetilasa, mejoró, y la cicatrización del epitelio ha comenzado rápidamente.

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Ejemplo 4 La histología H&E de piel irradiada se correlaciona con el aumento de la cicatrización de la herida por el inhibidor de HDAC

El ácido valproico, la tricostatina A, y el fenilbutirato son inhibidores de la histona deacetilasa, no-relacionados estructuralmente, y todos tienen efectos similares sobre la represión del daño inducido por la radiación de la piel, incluyendo la dermatitis aguda y la descamación, y fibrosis tardía, ulceración y necrosis. Como se muestra en la Fig. 3, los grupos tratados con inhibidores de la histona deacetilasa por 180 días tienen epidermis más gruesas con más capas de células pero tienen dermis más delgada (medidas de la epidermis a la capa grasa subcutánea) con menos deposición del colágeno cuando se compara con el grupo vehículo en el Día 180 y los grupos control (piel normal y reacción aguda en el Día 7).

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Ejemplo 5 Los cambios en la histología inducida por la radiación después del tratamiento con el inhibidor de HDAC se correlacionan con la represión en las expresiones de la citoquina inflamatoria y fibrogénica

Debido a que el desarrollo del daño inducido por la radiación se ha atribuido al inducir la radiación por cambios temporales y la expresión persistente de citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-\alpha y los factores de crecimiento fibrogénico tales como TGF-\beta1 y \beta2, se demuestra que, la represión del daño inducido por la radiación por el inhibidor de HDAC se correlaciona con la supresión de la expresión de TNF-\alpha y TGF-\beta.

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El momento de la aparición de los niveles pico de expresión de TGF-\beta1, TGF-\beta2, y TNF-\alpha inducida por la radiación correlacionada con el inicio del desarrollo del daño inducido por la radiación (Fig. 4). Los niveles del mARN de TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, y TNF\alpha se evaluaron utilizando un kit de análisis de protección de la citoquina RNase múltiple (Riboquant; Pharmingen, San Diego, CA) que contiene un conjunto de plantillas para permitir la generación de un set de sondas de ARN antisentido 32P-marcadas que hibridizan con el mARN diana para TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TNF-\alpha, y control interno GAPDH. Después de la hibridación de la sonda marcada con el ARN diana, el ARN desprotegido se digirió por una ribonucleasa (RNase), y fragmentos de ARN protegidos se determinaron en un gel de poliacrilamida al 6% y se registra por imagen por fosforilación (Molecular Dynamics Corp., Sunnyvale, CA). La densitometría se utilizó para cuantificar la cantidad de cada uno de las especies de mARN y se normalizó con el control interno GAPDH.

Se calcularon, los promedios de las puntuaciones de la piel para las reacciones de la piel a partir de cinco ratas en cada grupo. Los niveles promedio de citoquina/factor de crecimiento del mARN a partir de tres muestras de piel en cada grupo se normalizaron con el control interno GAPDH y se expresan como una proporción con el nivel promedio en los grupos control tiempo-coincidente. La prueba Mann-Whitney (Stata Statistical Software, College Station, TX) se utilizó para determinar la significación estadística en el nivel p < 0.05 para diferencias en las puntuaciones de los promedios de la piel y en niveles promedio de mARN, respectivamente, entre ratas control y tratadas.

En el grupo tratado con fenilbutirato (PB), la oleada más alta de TGF-\beta1, TGF-\beta2, y TNF-\alpha apareció a las 6 horas después de la irradiación, pero los niveles se suprimieron posteriormente después del Día 14. La represión aún persistió a los 12 meses, aún cuando el tratamiento tópico de PG se suspendió en el Día 90. En los grupos control de Vaselina y vehículo, los niveles de mARN de TGF-\beta1, TGF-\beta2, y TNF-\alpha en la piel irradiada aumentan y fluctúan arriba de los niveles control no-irradiados durante un periodo de 1 año y alcanzaron el primer pico de 2-3-veces, por encima de los niveles control no-irradiados a las 6 horas después de la irradiación, el segundo pico de 10.5-16-veces alrededor de 14-28 días después de la irradiación, y el tercer pico de 13-14-veces a los 9 meses después de la irradiación; los niveles luego declinaron a 2-3-veces niveles normales por 12 meses después de la irradiación. Aunque los niveles de mARN de TGF-\beta1, TGF-\beta2, y TNF-\alpha en el primer pico a las 6 horas en el grupo PB fueron más altos que aquellos en los grupos control de Vaselina y vehículo, disminuyeron a los niveles más bajos que aquellos en los grupos de Vaselina y vehículo en el Día 14 y regresó a los niveles control no-irradiados en el Día 28-35.

TGF-\beta1 y TGF-\beta2 tienen efectos celulares similares en inhibir el crecimiento celular epitelial y que promueve la proliferación de fibroblastos dérmicos, pero TGF-\beta3 tiene el efecto contrario. Se encontró que el cambio de nivel de TGF-\beta3 mARN mostró un ligero aumento, transitorio de 2-veces en todos los grupos irradiados a los 14 días, luego disminuye progresivamente al nivel control no-irradiado o inferior. No se observó ninguna diferencia significante en los niveles de mARN del TGF-\beta3 entre los grupos irradiados tratados con la Vaselina, el vehículo, o el PB.

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Ejemplo 6 Inmunofluorescencia de TGF-beta, un factor de crecimiento fibrogénico, en la piel irradiada se suprimió por el inhibidor de la histona deacetilasa

Las mismas secciones patológicas en el ejemplo 4 se sometieron a inmunofluorescencia con los anticuerpos anti-TGF-beta1, 2. Como se muestra en la Fig. 5, la proteína del TGF-beta, un factor fibrogénico fuerte, se expresó por irradiación, y se expresa altamente en la piel fibrogénica tanto en queratinocitos de la epidermis y en miofibroblastos de la dermis en el Día 7 y Día 180 en la reacción aguda y el grupo tratado con vehículo, respectivamente, pero la expresión de TGF-beta se suprime efectivamente en el grupo tratado con PB en el Día 180.

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Ejemplo 7 Inmunohistoquímica de TNF-alfa, una citoquina proinflamatoria, en piel irradiada se suprimió por el inhibidor de la histona deacetilasa

En el día 270, tres de cinco ratas en el grupo tratado con Vaselina y cuatro de cinco ratas en el grupo tratado con vehículo, se compara con cero de cinco ratas en el grupo tratado con PB, mostraron ulceración crónica, necrosis, formación de ampolla, e infiltración de células inflamatorias. La disminución en el daño tardío en la piel inducido por la radiación mediante el PG tópico fue consistente con la represión de la expresión del TNF-\alpha (Fig. 6).

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Ejemplo 8 El tratamiento tópico con el fenilbutirato (PB) previene la formación tardía del tumor de la piel inducido por la radiación

Muchos estudios han demostrado que la sobre-expresión crónica del TGF-\beta estimula el crecimiento neoplástico. La disminución de la expresión del TGF-\beta causada por el tratamiento con PB podría disminuir la incidencia de tumorigénesis tardía inducida por la radiación. Se encontró que los tumores cutáneos o de la piel desarrollados recientemente incrementan con el tiempo después de 50 semanas en el grupo control irradiado que no recibió tratamiento con PB, pero ningún tumor se vio en el grupo irradiado tratado con PB (Fig. 7). A las 90 semanas, un tumor acumulativo incidente del 15% (6 de 39) se observó en el grupo irradiado sin tratamiento con PB, se compara con 0% (0 de 42) en los grupos irradiados con el tratamiento con PB. La histología de los tumores inducidos por la radiación incluye fibroma, sarcoma de célula fusiforme, carcinoma de célula basal, y carcinoma de célula escamosa.

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Ejemplo 9 El fenilbutirato (PB) tópico muestra un efecto antitumoral directo sobre el crecimiento del tumor cutáneo

Las células singénicas del carcinoma 1MEA7R.1 y CT-26 (comprado de American Type Culture Collection, Manassas, VA) se inyectaron subcutáneamente en las áreas del flanco de ratones BALB/c hembras. El tumor se dejó a una dimensión máxima de 0.5 cm. Los inhibidores tópicos de HDAC o el vehículo se aplicaron a una dosis de 200 mg/ratón para cubrir la superficie total del tumor y la piel circundante dos veces por día por 4 semanas. El tamaño del tumor se calculó semanalmente con un calibrador de acuerdo con la fórmula ab2/2, donde a y b son los diámetros más grandes y pequeños (en centímetros), respectivamente.

Se demostró que la formulación PG tópica tiene efectos antitumorales. Las células de carcinoma BNL 1MEA7R.1 y CT-26, que mostraron la inhibición del crecimiento por PB in vitro por la expresión de p21Cip1 (Fig. 8A), se inocularon en la espalda de los ratones singénicos. Los tumores cutáneos se dejaron crecer a la dimensión más grande 0. 5 cm (Fig. 8D), y se aplicó tópicamente PB a la superficie del tumor a 200 mg/ratón dos veces por día. Por 4 semanas, el tamaño de los tumores de los carcinomas 1MEA7R.1 y CT-26 en los grupos de placebo fueron casi 6- y 1.6-veces más grandes que aquellos en los grupos tratados con PB, respectivamente (Figs. 8B-8C). Los tumores cutáneos en los grupos tratados con PB crecieron lentamente sin ulceración en la piel (Fig. 8F), mientras que los tumores en el grupo control o placebo crecieron rápidamente y mostraron una apariencia necrótica y de ulceración en la piel (Fig. 8E). Después de 5 semanas de tratamiento, el retiro de PG tópico resultó en una pérdida de la inhibición del crecimiento del tumor, y estos tumores luego alcanzaron el mismo tamaño como aquellos en el grupo control o placebo dentro de 2 semanas.

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Ejemplo 10 Efectos similares de Inhibidores de HDAC antitumor estructuralmente no-relacionados en el tratamiento del daño del tejido normal inducido por la radiación y evitando la tumorigénesis tardía inducida por la radiación

Además del PB, otros inhibidores de HDAC antitumor estructuralmente no-relacionados, tales como tricostatina A (un agente antifúngico) y ácido valproico (un agente anticomicial), también mejoraron el desarrollo del daño y la tumorigénesis inducida por la radiación y disminuyó la expresión de TGF-\beta1, TGF-\beta2, y TNF-\alpha inducida por la radiación (Fig. 9 y Tabla 3).

El ARN Total se aisló a partir de muestras de piel congeladas utilizando Trigent (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH). El ARN total (30 \mug) se sometió a electroforesis en un gel de agarosa-formaldehído desnaturalizado, se transfirió en Hybond N (Amersham, Amersham, UK), y se fijó por irradiación ultravioleta (UV). La membrana se incubó con sondas marcadas con 32P, como se describe a continuación, en solución reguladora Rapid-hyb (Amersham). Para preparar sondas para rata TGF-\beta1 y TGF-\beta2, sus secuencias de codificación de cuerpo entero, se amplificaron por reacción en cadena de polimerasa de transcripción-reversa utilizando los siguientes cebadores específicos (TGF-\beta1, 5'-CGGGTGGCAGGCGAGAGC-3' y TGF-\beta2, 5'-CATGCACTACTGTGTGCT-3') y reversa (TGF-\beta1, 5'-GGAATTGTTGCTATATTTCTGC- 3' y TGF-\beta2, 5'-CCGAGGACTTTAGCTGCA-3'). Un conjunto de plantillas de TNF-\alpha y GAPDH a partir del kit de pruebas de protección de RNase (Riboquant; Pharmingen) se utilizó para generar sondas ARN antisentido 32P-marcadas que hibridizan con el mARN para TNF-\alpha y GAPDH.

TABLA 3 Resumen de los hallazgos histológicos en piel irradiada tratada con diferentes inhibidores de HDAC

5

Los hallazgos histológicos sobre las muestras de piel a partir de 5 ratas irradiadas en cada grupo se representan como sigue: A, hinchazón subepitelial. B, descamación seca en más del 50% del área. C, descamación húmeda en más del 50% del área. D, atrofia de la epidermis en la mayoría de las áreas. E, atrofia de anéxos cutáneos en la mayoría de las áreas. F, aumento del grosor de epitelio con más capas de células. G, aumento de la deposición del colágeno, mayor densidad del vaso, y aumento grosor de la dermis. H, ulceración crónica, necrosis, formación de ampolla, e infiltrado de más células inflamatorias. I, inhibición de TGF- \beta1, 2, y TNF-\alpha. J, prevención de tumorigénesis tardía inducida por la radiación. K, Demostración del efecto antitumoral directo sobre el crecimiento del tumor cutáneo.
El "+" a "+++++" significa muestras de una a cinco ratas mostraron la reacción o el efecto como se indica.

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Ejemplo 11 El ácido valproico mejora la radiosensibilización del tumor

La relación de mejora de la radiación (RER) se utiliza para calcular la relación de la dosis de radiación que da el mismo efecto. RER= (Dosis de radiación sin tratamiento del medicamento a una fracción del 10% de supervivencia)/(Dosis de radiación con tratamiento del medicamento a una fracción del 10% de supervivencia).

Se adicionó ácido valproico (0.1 mM o 0.5 mM) en células de carcinoma nasofaríngeo CNE2 60 minutos antes de la radiación con dosis de radiación de 2 a 16 Gy, luego se lavó. Después de una semana, se contaron las colonias que contienen más de 50 células. La eficiencia del revestimiento fue la misma en el control y en el grupo tratado con PB. La relación de mejora de la radiación (RER) de ácido valproico 0.1 mM o 0.5 mM aumentó en la 10% supervivencia hasta 1.2 y 1.7, respectivamente (Fig. 10).

Ejemplo 12 La co-administración de tricostatina A (TSA), ganciclovir (GCV), y radiación (RT) selectivamente mata las células de carcinoma infectadas con el virus Epstein-Barr (EBV)

El inhibidor de HDAC como un gen modulador puede expresar la actividad de la timidina quinasa EBV para suministrar un tumor asociado con EBV que mata con el ganciclovir (GCV), que puede ser fosforilado por la EBV timidina quinasa para inhibir la polimerasa de ADN celular, para causar la muerte celular en la fase S del ciclo celular. Porque el inhibidor de HDAC también actúa como un agente antiproliferativo y radiosensibilizador, las terapias de combinación de TSA, GCV y radiación (RT) pueden tener beneficios terapéuticos sobre los tumores asociados con EBV tales como carcinoma nasofaringeo, linfoma de Hodgkin, enfermedad linfoproliferativa ligada a X, linfoma de no-Hodgkin relacionado con el SIDA, y tumores en el músculo liso en niños inmunosuprimidos.

Para el ensayo de actividad de la timidina quinasa de EBV, una cantidad igual de la fracción de citosol se incubó con la solución reguladora de reacción (Tris-HCl 50 mM pH 7.4, 1 mg/ml de BSA, 3 mM fosfato de creatina, 11.2U/ml fosfoquinasa de creatina, 0.1 \mum [3H-8]-GCV (actividad específica 13.5 Ci/mmol), ATP 2.5 mM, MgCl_{2} 2.5 mM, NaF 10 mM, DTT 10 mM) a 37ºC por 30 min. Las mezclas de reacción se adicionaron sobre papeles de cromatografía de intercambio iónico WhatmanR DE-81, que luego se lavaron con NH_{4}COOH 1.5 mM tres veces para retirar la forma no-fosforilada de [3H-8]-GCV. Después de secarlos al aire, estos papeles se incubaron con cóctel de centelleo líquido durante la noche. La forma de fosforilación del [3H-8]-GCV se une sobre un papel de cromatografía de intercambio iónico WhatmanR DE-81 se midió mediante un contador de centelleo LS6500 (Beckman).

Como se muestra en la Fig. 11A, la actividad de la timidina quinasa de EBV se expresó por el tratamiento de TSA 1nM por 48 horas. La combinación de TSA, GCV y la radiación produjo selectivamente máxima muerte en las células positivas EBV, pero no en las células negativas EBV (Fig. 11B). Las células Daudi (EBV+) y HL-60 (EBV-) se trataron con ganciclovir (GCV) (10 \mug/ml) y /o tricostatina A (TSA) (1 nM) por 48 horas, luego se irradiaron con o sin 1 Gy de radiación (RT). Las células viables se contaron 1 semana más tarde.

Ejemplo 13 Modelo de animal del tratamiento de la mucositis inducida por la radiación con fenilbutirato tópico

Los modelos de hámster de mucositis inducida por la quimioterapia y mucositis inducida por la radiación han sido desarrollados. La reproducibilidad del modelo ha sido validada, con la apariencia consistente de mucositis ulcerativa entre 12 y 15 días después de la radiación. Utilizando este modelo, la eficacia del gel y la solución de fenilbutirato tópico ha sido probada por sus habilidades para modificar el curso de mucositis inducida por la radiación. Una dosis aguda de radiación de 40 Gy en el día 0 se administró con el fin de producir mucositis severa alrededor del día 15. El uso de la radiación aguda para inducir mucositis fue preferible para el uso de cualquier radiación o quimioterapia fraccionada para estos estudios iniciales. El modelo agudo tuvo poca toxicidad sistémica, resultando en menor número de animales muertos. Este hecho permitió el uso de grupos más pequeños en los estudios iniciales. El modelo agudo ha sido utilizado exitosamente para demostrar la presencia o ausencia de eficiencia para un gran número de compuestos. El modelo de radiación aguda es, por tanto, apropiado como un protocolo para la detección de diversas familias de compuestos.

La mucositis se indujo utilizando un protocolo de radiación aguda. Una única dosis de radiación (40Gy/dosis) se administró a todos los animales en el Día 0. La radiación se generó con una fuente 250 kilovoltio potencial (15 mA) en una distancia focal de 50cm, endurecida con un sistema de filtración de Cu de 0.35 mm. Se dirigió la irradiación a la mucosa de la bolsa bucal izquierda a una velocidad de 121.5cGy/minuto. Antes de la irradiación, los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de sodio pentobarbital (80 mg/kg). La bolsa bucal izquierda se revirtió, se fijó, y se aisló utilizando un peto de plomo.

Este estudio utilizó veinte hámsters que se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de cinco animales por grupo. A cada grupo se le asignó un tratamiento diferente de la siguiente manera: Animales grupo 1: 20 \mul de PBS/hámster; Animales grupo 2: 200 \mug de sodio fenilbutirato/20 \mul de PBS/hámster; Animales grupo 3: 20 mg de placebo (gel base)/hámster; Animales grupo 4: 20 mg de fenilbutirato gel/hámster. Las sustancias se aplicaron tópicamente al área de mucositis inducida por la radiación de los hámsters de prueba una vez diariamente por 10 días consecutivos desde el Día 15. El área de herida de mucositis, trazada sobre las láminas de plástico transparentes en el Día 15, 17, 19, 21, 23, y 25, se cuantificó, utilizando un Analizador de imagen (Life Science Resources VISTA, Version 30). El área de herida de mucositis tiempo de finalización-medio (CT50) se determinó por regresión lineal utilizando GraphPad Prism (Graph Pad Software USA) y se aplicó el test de Student para datos no apareados para la comparación entre el grupo tratado y el placebo en cada punto de los tiempos de medición. Las diferencias se consideraron estadísticamente significante a p < 0.05.

Como se muestra en la Tabla 4, el aumento significativo (p < 0.01) en la finalización de la herida de mucositis se observó en el Grupo 2 (200 \mug de sodio fenilbutirato/20 \mul de PBS/hámster) en el Día 21, 23 y 25, y en el Grupo 4 (20 mg de fenilbutirato gel/hámster) en el Día 17, 19, 21, 23 y 25. CT50 también se redujo significantemente (p < 0.01) a 6.5 \pm 0.2 días en el Grupo 2 (relativo a 7.7 \pm 0.2 días en el Grupo 1), y a 8. 9 \pm 0.2 días en el Grupo 4 (relativo a
10.5 \pm 1.3 días en el Grupo 3).

TABLA 4 Cicatrización de la herida de mucositis tratada con fenilbutirato (PB)

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.

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Claims (19)

1. Uso de un agente de histona hiperacetilado para la fabricación de un medicamento, para el tratamiento tópico de enfermedades malignas o no-malignas proliferantes mientras que se asegura una alta probabilidad de un control del tumor y el incremento de la ganancia terapéutica en quimioterapia y/o radioterapia y que reduce simultáneamente la frecuencia de secuelas de la terapia en donde la ganancia terapéutica incrementa, simultáneamente se mejora la radiosensibilización del tumor o sensibilización del tumor a la quimioterapia, el incremento a la inhibición del crecimiento del tumor, que promueve la cicatrización de la herida en mucositis y dermatitis, evitando/reduciendo la severidad del síndrome plantar-palmar, disminuyendo la fibrosis del tejido, protegiendo el tejido normal de una muerte celular, evitando la xerostomía, y suprimiendo la tumorigénesis.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el agente de hiperacetilación es un inhibidor de la histona deacetilasa.

3. El uso de la reivindicación 1, en donde el agente de histona hiperacetilado es la tricostatina A o tricostatina C.

4. El uso de la reivindicación 1, en donde el agente de histona hiperacetilado se selecciona de un grupo constituido por la oxamflatina, trapoxina A, FR901228, apicidina, HC-Toxina, WF27082, y clamidocina.

5. El uso de la reivindicación 1, en donde el agente de histona hiperacetilado se selecciona de un grupo que consiste de ácido salicilihidroxámico, ácido hidroxámico suberoilanilida, y ácido azelaico-bishidroxámico.

6. El uso de la reivindicación 1, en donde el agente de histona hiperacetilado se selecciona de un grupo que consiste de azelaic-1-hidroxamato-9-anilida, M-ácido carboxicinnamico bishidroxamida, ácido 6-(3-clorofenilureido)carpoico hidroxámico, MW2796, y MW2996.

7. El uso de la reivindicación 1, en donde el agente de histona hiperacetilado se selecciona de un grupo que consiste de butirato de sodio, isovalerato, valerato, 4-fenilbutirato, fenilbutirato de sodio, propionato, butiramida, isobutiramida, fenilacetato, 3-bromopropionato, ácido valproico, y tributirina.

8. El uso de la reivindicación 1, en donde el agente de histona hiperacetilado es el MS-27-275 o los derivados 3'-amino de este.

9. El uso de la reivindicación 1, en donde el agente de histona hiperacetilado es el depudecin o scriptaid.

10. El uso de la reivindicación 1, en donde la radioterapia es la teleterapia, braquiterapia, o radiación ionizante.

11. El uso de la reivindicación 1, en donde la enfermedad maligna proliferante se selecciona de un grupo que consiste de melanoma, sarcoma de kaposi, osteosarcoma, neuroblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de Ewing, sarcoma de tejido blando, cáncer en la piel, linfoma, leucemia, cáncer del seno, tumor de las células germinales, tumor neuroectodérmico primitivo, glioma del cerebro, meningioma cerebral, cáncer de cuello y cabeza, cáncer de tiroides, cáncer del timo, cáncer cervical, cáncer del ano, cáncer colorectal, cáncer de la próstata, cáncer de pulmón, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, cáncer del estómago, cáncer pancreático, cáncer de esófago, tumores asociados con virus, y enfermedad después de recibir un trasplante de la médula ósea.

12. El uso de la reivindicación 1, en donde las enfermedades no-malignas se seleccionan de un grupo que consiste de pterigión, oftalmopatía de Graves, seudotumor orbital, degeneración macular, queloide, verruga, queratoacantoma, hemangioma, malformación arteriovenosa, bursitis, tendinitis, tumor desmoide, enfermedad de Peyronie, estenosis vascular, ameloblastoma, quiste óseo aneurismático, formación ósea heterotópica, ginecomastia, castración ovárica, parotiditis, eczema, dermatitis atópica, psoriasis, periartritis humeroescapular, epicondilitis, artrosis de la rodilla, hidrosadenitis, panadizo, artritis inflamatoria autoinmune, histocitosis X, y enfermedad por recibir un trasplante de órganos.

13. El uso de la reivindicación 1, en donde el medicamento es una crema, un ungüento, un gel, una pasta, un polvo, una loción, un parche, un supositorio, un formación de lioposoma, una suspensión, un enjuague bucal, un enema, una solución de inyección, o una infusión a gota.

14. El uso de la reivindicación 1, en donde el medicamento esta presente en una cantidad del agente de hiperacetilación entre 0.001% y 100% en peso de la composición.

15. El uso de la reivindicación 1, en donde el medicamento además comprende un segundo agente seleccionado de un grupo que consiste de una citoquina, una interleucina, un agente anti-cáncer o un agente anti-neoplástico, un agente anti-angiogénesis, un agente quimioterapéutico, un anticuerpo, un anticuerpo conjugado, un estimulante inmune, un antibiótico, ácido retinóico, un inhibidor de la tirosina quinasa, un antagonista de hormona, y un estimulante de crecimiento.

16. El uso de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo conjugado se selecciona de un grupo que consiste de Trastuzumab, c225, Rituximab, y Cetuximab.

17. El uso de la reivindicación 15, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona de un grupo que consiste de un agente alquilante, un análogo de purina, un análogo de pirimidina, un alcaloide de la vinca, un alcaloide similar al de la vinca, etopósido, un medicamento similar al etopósido, un corticosteroide, una úrea nitrosa, un antimetabolito, un medicamento citotóxico basado en el platino, un anti-andrógeno, y un antiestrógeno.

18. El uso de la reivindicación 15, en donde el agente anti-angiogénesis se selecciona de un grupo que consiste de talidomida, SU5416, SU6668, Trombospondin-1, endostatina, y angiostatina.

19. El uso de la reivindicación 15, en donde el antibiótico se selecciona de un grupo que consiste de Ganciclovir, Aciclovir, y Famciclovir.