ES2310513T3 - Plantas para controlar el daño producido por inserctos que se alimentan de ellas. - Google Patents
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Abstract
Planta transformada con al menos una molécula de polinucleótido que comprende una(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifica(n) para fusolina o una proteína de tipo fusolina, estando dicha(s) secuencia(s) de nucleótidos operativamente unida(s) a una(s) secuencia(s) de promotor adecuada(s), en la que dicha planta transformada expresa dicha fusolina o una proteína de tipo fusolina en, al menos, un tejido vegetal o tejidos vegetales propenso(s) a dañarse por insectos que se alimentan de ella, y en la que dicha proteína de tipo fusolina comprende al menos un 35% de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína fusolina de EPV de Heliothis armigera (HaEPV) y que incluye las secuencias siguientes: motivos HGX (en la que X es un residuo aromático), motivos ARQ cerca del extremo Nterminal y VRWQR (SEQ ID NO:1) en otro lugar.
Description
Plantas para controlar el daño producido por
insectos que se alimentan de ellas.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere al problema del
daño producido a plantas (por ejemplo, plantas de cultivo) por
insectos que se alimentan de ellas tales como lepidópteros y
coleópteros. Más particularmente, la presente invención se refiere
a una planta que puede expresar, en un tejido o tejidos
propenso(s) a dañarse por insectos que se alimentan de ella,
una(s) proteína(s) exógena(s) que
puede(n) reducir el daño a la planta inhibiendo la
alimentación, el crecimiento y/o el desarrollo de insectos.
Los entomopoxvirus (EPV) son miembros
específicos de insectos de la familia Poxviridae (Murphy
et al., 1995) que infectan colectivamente huéspedes tales
como orugas, escarabajos y langostas (Arif, 1995). Al igual que
otros miembros de la familia de los poxvirus (es decir, los
chordopoxvirus; ChPV), los EPV tienen genomas de ADN bicatenario
grande, producen viriones complejos y se replican en el citoplasma
de células infectadas (Moss, 1996). Aunque éstas y otras
características moleculares confirman sus afinidades con los
poxvirus (Osborne et al., 1996), otros rasgos notables
diferencian a los EPV de los ChPV, y les asocian en cambio con
grupos no relacionados de virus que infectan insectos. El más
importante entre estos rasgos es la producción de estructuras
proteináceas distintivas conocidas como esferoides y cuerpos
fusiformes.
Los esferoides se desarrollan en el citoplasma
de células infectadas por EPV en el sitio de la morfogénesis viral,
y cuando están maduros, ocluyen un gran número de viriones
infecciosos (Goodwin et al., 1991). Son el agente de
transmisión horizontal de EPV, y aunque su principal proteína
constituyente de la matriz (esferoidina; Hall & Moyer, 1991) no
tiene homólogo conocido fuera del taxón, se supone que los propios
cuerpos protegen a los viriones de factores medioambientales
perjudiciales tales como desecación y exposición a luz UV. A este
respecto, son funcionalmente análogos a los cuerpos poliédricos que
ocluyen los viriones de miembros de la familia de baculovirus y el
grupo de reovirus de la poliedrosis citoplásmica.
La mayoría de los EPV también codifican para y
producen una proteína conocida como fusolina, que se ha demostrado
que es el constituyente principal de estructuras conocidas como
cuerpos fusiformes (SB; Dall et al., 1993); estas
estructuras se han descrito en muchos, pero no todos, los miembros
de los géneros A y B de EPV que infectan larvas de orugas y
escarabajos (Goodwin et al., 1991). En el EPV de Heliotlis
armigera (HaEPV) (Fernon et al., 1995), la proteína
fusolina tiene una M calculada de 40132, y la forma madura de la
proteína tiene un tamaño aparente de 50 K cuando se analiza
mediante SDS-PAGE (Dall et al., 1993). Se ha
encontrado que la proteína se acumula en estructuras vesiculares
derivadas del retículo endoplasmático celular, en las que
finalmente se agrega y cristaliza en SB (Lai-Fook y
Dall, en prensa). Aunque se sabe que se localizan conjuntamente
otras proteínas en los SB (por ejemplo, la proteína chaperona
específica del RE (retículo endoplasmático), BiP;
Lai-Fook y Dall, en prensa), los análisis de
preparaciones purificadas de SB muestran que la fusolina, en sus
formas monoméricas y multiméricas (Dall et al., 1993), es con
mucho el constituyente más abundante.
También se han descrito los genes que codifican
para homólogos de la proteína fusolina, en este contexto conocidos
de forma muy diversa como "gp37", "proteína 37K",
"SLP" (proteína de tipo fusiforme), etc., de varios baculovirus
de la poliedrosis nuclear (NPV), incluyendo los NPV de
Autographa californica, Bombyx mori, Choristoneura
fumiferana, Lymantria dispar, Orgyia pseudotsugata
y los GV de Xestia c-nigrum (AcMNPV, BmMIVPV,
CfMNPV, LdMNPV, OpMNPV y XcGV, respectivamente; Ayres et
al., 1994; Gomi et al., 1999; Liu y Carstens, 1996;
Kuzio et al., 1999; Ahrens et al., 1997; Hayakawa
et al., 1999). En algunos de éstos (por ejemplo, OpNPV;
Gross et al., 1993), se ha observado la proteína dentro de
cuerpos de tipo fusiforme (SLB) en el citoplasma de células
infectadas. También se han observado SLB en el citoplasma de células
infectadas con otros NPV (por ejemplo, en NPV de Cadra
cautella, Adams y Wilcox 1968; véase también Adams y McClintock,
1991; Cunningham, 1971; Huger y Kreig, 1968; Smirnoff, 1970).
Todos los miembros del grupo de proteínas de
fusolina, independientemente de su familia viral de origen, están
unidos por una conservación absoluta de residuos de aminoácidos en
varias posiciones en sus secuencias, en particular en las regiones
N-terminal y central de la molécula. Estos residuos
conservados incluyen motivos HGX (código de aminoácidos
convencional de una letra, en el que X es un aminoácido aromático) y
ARQ cerca del extremo N-terminal de la secuencia
proteica deducida (tabla 1), y por ejemplo, una secuencia VRWQR (SEQ
ID NO: 1) en otro lugar dentro de la secuencia de aminoácidos
deducida (figura 1). Esta conservación de elementos de secuencia,
como la de la ubicación intracelular de la proteína, tal como se
describió anteriormente, sugiere que todos los miembros del grupo
también comparten un papel común en el ciclo de replicación e
infección del virus, que influye quizá en la relación de los virus
con sus huéspedes (Sriskantha et al., 1997). No obstante,
la(s) función/funciones de los miembros de este grupo de
proteínas, y las estructuras de SB/SLB que forman, sigue(n)
siendo un tema de investigación en curso.
Estudios realizados por Xu y Hukuhara (1992,
1994) sugerían que un factor asociado con las preparaciones de EPV
de Pseudaletia separata (PsEPV), e identificado
posteriormente como fusolina (Hayakawa et al., 1996), podía
potenciar la infectividad de un virus de la poliedrosis nuclear
heterólogo (NPV de P. unipunctata). Estudios adicionales han
demostrado que puede observarse un efecto similar en plantas de
arroz transgénicas en las que se ha expresado esta proteína
(Hukuhara et al., 1999). De manera similar, se ha demostrado
que los SB del gusano blanco cuproso (Anomala cuprea) pueden
actuar de la misma manera (Mitsuhashi et al., 1998). Sin
embargo, el/los papel(es) de la proteína fusolina en el
contexto de los sistemas homólogos de EPV no se ha(n)
sometido anteriormente a una investigación detallada.
A través de experimentos que implican bioensayos
que usan SB de EPV de Heliothis armigera (HaEPV) y EPV de
Dermolepida albohirtum (DaEPVR), los presentes solicitantes
han determinado, inesperadamente, que el consumo de cuerpos
fusiformes solos puede afectar a la alimentación, el crecimiento y
el desarrollo de larvas de insecto. Además, a través de
experimentos realizados usando EPV recombinantes, en los que se ha
sustituido el gen de fusolina por un marcador de
\beta-galactosidasa (es decir, para convertir la
fusolina de EPV recombinantes en negativa [fus^{(-)}]), los
presentes solicitantes también han podido proporcionar pruebas para
demostrar que el componente proteico fusolina de los SB es el
responsable de estos efectos. Además, estos últimos experimentos
han indicado que la fusolina potencia la infectividad de los virus
EPV homólogos. Como resultado, se ha comprendido que los SB, SLB y
las proteínas constituyentes de estas estructuras pueden usarse
ventajosamente en estrategias diseñadas para reducir el daño
producido a plantas por insectos que se alimentan de ellas.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona una planta transformada con al menos una molécula de
polinucleótido que comprende una(s) secuencia(s) de
nucleótidos que codifica(n) para una o más proteína(s)
constituyente(s) de cuerpos fusiformes o cuerpos de tipo
fusiforme de un virus de insecto que es fusolina o una proteína de
tipo fusolina, operativamente unida(s) a una(s)
secuencia(s) de promotor adecuada(s), en la que dicha
planta transformada expresa dicha(s) proteína(s) en,
al menos, un tejido vegetal o tejidos vegetales propenso(s)
a dañarse por insectos que se alimentan de ella, y en la que dicha
proteína de tipo fusolina comprende al menos un 35% de identidad de
secuencia de aminoácidos con la proteína fusolina de EPV de
Heliothis armigera (HaEPV) y que incluye las secuencias
siguientes: motivos HGX (en la que X es un residuo aromático), ARQ
cerca del extremo N-terminal y VRWQR (SEQ ID NO:1)
en otro lugar.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona un método de control o prevención del daño producido a
una planta según la invención por insectos que se alimentan de ella,
comprendiendo dicho método aplicar a dicha planta un agente químico
y/o biológico insecticida.
Tal como se mencionó anteriormente, la invención
proporciona una planta que puede expresar una o más proteí-
na(s) constituyente(s) de SB/SLB que es fusolina o una proteína de tipo fusolina en tejidos (por ejemplo, tejido de la hoja o un tejido de producto tal como tejido del fruto) propensos a dañarse por insectos que se alimentan de ella. Por tanto, cuando los insectos que se alimentan de plantas se alimentan de una planta según la invención, ingerirán, junto con el tejido vegetal, la(s) proteína(s) constituyente(s) expresada(s) de SB/SLB. Dado que los SB/SLB parecen inhibir la alimentación, el crecimiento y/o el desarrollo de los insectos y, potencialmente, aumentar la propensión a la infección por agentes patógenos del insecto (y, de ese modo, a la muerte del insecto), la ingestión de una o más de
la(s) proteína(s) constituyente(s) de SB/SLB por insectos que se alimentan de plantas puede reducir el daño adicional para la planta. Además, se cree que la inhibición de la alimentación, el crecimiento y/o el desarrollo de los insectos también aumenta la probabilidad de la muerte del insecto que resulta de, por ejemplo, condiciones medioambientales adversas, depredadores y agentes químicos y otros agentes biológicos (por ejemplo, bacterias patógenas).
na(s) constituyente(s) de SB/SLB que es fusolina o una proteína de tipo fusolina en tejidos (por ejemplo, tejido de la hoja o un tejido de producto tal como tejido del fruto) propensos a dañarse por insectos que se alimentan de ella. Por tanto, cuando los insectos que se alimentan de plantas se alimentan de una planta según la invención, ingerirán, junto con el tejido vegetal, la(s) proteína(s) constituyente(s) expresada(s) de SB/SLB. Dado que los SB/SLB parecen inhibir la alimentación, el crecimiento y/o el desarrollo de los insectos y, potencialmente, aumentar la propensión a la infección por agentes patógenos del insecto (y, de ese modo, a la muerte del insecto), la ingestión de una o más de
la(s) proteína(s) constituyente(s) de SB/SLB por insectos que se alimentan de plantas puede reducir el daño adicional para la planta. Además, se cree que la inhibición de la alimentación, el crecimiento y/o el desarrollo de los insectos también aumenta la probabilidad de la muerte del insecto que resulta de, por ejemplo, condiciones medioambientales adversas, depredadores y agentes químicos y otros agentes biológicos (por ejemplo, bacterias patógenas).
La planta según la invención puede ser cualquier
planta de valor agrícola, arborícola, hortícola u ornamental que es
propensa a dañarse por insectos que se alimentan de ella.
Preferiblemente, la planta se selecciona de plantas de valor
agrícola tales como cereales (por ejemplo, trigo y cebada),
hortalizas (por ejemplo, tomate y patata) y árboles frutales (por
ejemplo, limoneros y manzanos). Otras plantas preferidas incluyen
tabaco y algodón.
La(s) molécula(s) de
polinucleótido que comprende(n) una secuencia de nucleótido
que codifica para una o más proteína(s)
constituyente(s) de SB/SLB que es fusolina o una proteína de
tipo fusolina operativamente unida(s) a una(s)
secuencia(s) de promotor adecuada(s), puede(n)
ser cualquier/cualesquiera molécula(s) de polinucleótido
que
puede(n) segregarse y conservarse establemente en las células hijas. Preferiblemente, la(s) molécula(s) de polinucleótido está(n) integrada(s) establemente en un sitio no esencial dentro del genoma de la planta (tal como puede lograrse mediante la técnica bien conocida de recombinación homóloga).
puede(n) segregarse y conservarse establemente en las células hijas. Preferiblemente, la(s) molécula(s) de polinucleótido está(n) integrada(s) establemente en un sitio no esencial dentro del genoma de la planta (tal como puede lograrse mediante la técnica bien conocida de recombinación homóloga).
Las proteínas constituyentes de SB/SLB son
fusolinas, proteínas de tipo fusolina y homólogos de las mismas.
Las proteínas fusolinas preferidas incluyen las
de HaEPV, EPV de Pseudaletia separata (PsEPV), EPV de
Choristoneura biennis (CbEPV) y EPV de Dermolepida
albohirtum (aislado Stone River; DaEPV_{SR}; Dall et
al, no publicado). La más preferida es la fusolina de HaEPV tal
como se describe en la patente australiana de los presentes
solicitantes número 668734.
La expresión "proteína de tipo fusolina" se
refiere a todas las proteínas de virus de insecto y a fragmentos
funcionales de las mismas que pueden inhibir la alimentación, el
crecimiento y/o el desarrollo de al menos una especie de insecto, y
que preferiblemente también aumentan la propensión en al menos una
especie de insecto a la infección por al menos un virus patógeno
(por ejemplo, un virus). Como tal, la expresión incluye todas las
proteínas (y los fragmentos funcionales de las mismas) de
entomopoxvirus (EPV), baculovirus de la poliedrosis nuclear (NPV) y
de la granulosis (GV) y todos los otros virus de insectos, que
demuestran una identidad de secuencia de aminoácidos \geq 35%
(tal como se calcula mediante el algoritmo GAP de GCG; Devereux
et al., 1984) con la proteína fusolina de HaEPV y que
incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos parciales:
motivos HGX (código de aminoácidos convencional de una letra, en la
que X es un residuo aromático) y ARQ cerca del extremo
N-terminal, y VRWQR (SEQ ID NO:1) en otro lugar. Las
proteínas preferidas de tipo fusolina incluyen las de AcMNPV,
BmMNPV, CfMNPV, LdMNPV, OpMNPV y XcGV.
Cuando la planta expresa más de una proteína
constituyente de SB/SLB, la planta puede transformarse con una
única molécula de polinucleótido de manera que las proteínas se
expresan a partir de ARN mensajero sencillo o multicistrónico.
Alternativamente, las proteínas podrían expresarse a partir de dos o
más moléculas de polinucleótido cotransformadas en la planta.
Cuando la planta expresa toda(s)
la(s) proteína(s) constituyente(s) de SB/SLB de
un virus de insecto, la(s) proteí-
na(s) puede(n) estar presente(s) en los tejidos vegetales en forma de estructuras de SB/SLB.
na(s) puede(n) estar presente(s) en los tejidos vegetales en forma de estructuras de SB/SLB.
La(s) secuencia(s) de promotor
adecuada(s) para la expresión de la(s)
secuencia(s) de nucleótido que codifica(n) para
la(s) proteína(s) constituyente(s) de SB/SLB
pueden seleccionarse de cualquier secuencia de promotor que es
funcional en plantas. Las secuencias de promotor preferidas incluyen
las de plantas, virus de plantas y viroides de plantas. Las
secuencias de promotor particularmente preferidas incluyen el
elemento promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) y
los elementos promotores del virus de atrofia del trébol
subterráneo (SCSV).
Las plantas según la presente invención también
pueden expresar una toxina exógena u otro agente exógeno que es
nocivo para los insectos. Por ejemplo, la planta también puede
expresar una \delta-toxina de Bacillus
thuringiensis, una neurohormona de insecto o una ribozima o ARN
antisentido dirigidos contra una función celular esencial. La
toxina heteróloga o el agente nocivo pueden codificarse por una
secuencia de nucleótidos (operativamente unida a una secuencia de
promotor adecuada) portada en la(s) molécula(s) de
polinucleótido que codifica(n) para la una o más
proteína(s) constituyente(s) de SB/SLB o pueden
portarse en una molécula de polinucleótido adicional que se ha
cotransformado en la planta.
La transformación de la planta con la(s)
molécula(s) de polinucleótido puede lograrse mediante
cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica incluyendo
electroporación y transformación de Agrobacterium.
Tal como se apreciará, los beneficios logrados
mediante la expresión de una o más proteína(s)
constituyente(s) de SB/SLB en plantas también podría
lograrse mediante la producción de cebos que comprenden cuerpos
fusiformes o cuerpos de tipo fusiforme de un virus de insecto, o
una o más proteína(s) constituyente(s) de dichos
cuerpos fusiformes o cuerpos de tipo fusiforme. Así, las
composiciones de cebo comprenden una o más proteína(s)
constituyente(s) seleccionada(s) de fusolina o una
proteína de tipo fusolina de cuerpos fusiformes o cuerpos de tipo
fusiforme de un virus de insecto junto con un vehículo aceptable en
agricultura.
Las composiciones de cebo pueden estar en forma
líquida o de gel, pero más preferiblemente están en forma sólida.
Los cuerpos fusiformes, los cuerpos de tipo fusiforme o la(s)
proteína(s) constituyente(s) de SB/SLB pueden
comprender del 0,05 al 15,0% (en peso) de la composición. Además de
los cuerpos fusiformes, los cuerpos de tipo fusiforme o
la(s) proteína(s) constituyente(s) de SB/SLB y
el vehículo aceptable en agricultura, la composición de cebo puede
comprender además una(s) feromona(s) u otro atrayente
químico para los insectos. Para las formulaciones líquidas, los
vehículos aceptables en agricultura pueden seleccionarse de
componentes tales como arcillas moleteadas o sustancias de vehículo
comestibles tales como materiales vegetales, melaza o azúcar sin
refinar, y microorganismos tales como levaduras u otros hongos,
algas o bacterias. Para las composiciones de cebo sólidas, los
vehículos aceptables en agricultura pueden seleccionarse de
materiales vegetales fragmentados o molidos y otros materiales tal
como se describió anteriormente, procesados hasta obtener una forma
apropiada. Las composiciones de cebo sólidas pueden proporcionarse
como gránulos y aplicarse echándolas sobre un área que contiene una
planta para la que se desea protección frente al daño producido por
insectos que se alimentan de ella. Las composiciones de cebo
líquidas o gelificadas pueden aplicarse a una planta mediante
pulverización.
Los cuerpos fusiformes, los cuerpos de tipo
fusiforme o la(s) proteína(s) constituyente(s)
de SB/SLB incluidos en la composición de cebo pueden aislarse de
fuentes naturales o, más convenientemente, producirse de manera
recombinante, por ejemplo, en cultivos de células de bacterias,
levaduras, insectos o mamíferos.
Puede esperarse que los insectos que han
ingerido cuerpos fusiformes, cuerpos de tipo fusiforme o
proteína(s) constituyente(s) de SB/SLB
seleccionada(s) de fusolina o una proteína de tipo fusolina
como resultado de haberse alimentado en una planta según la
presente invención, tal como se mencionó anteriormente, produzcan un
daño reducido a plantas o bien como resultado de la alimentación/el
crecimiento reducidos y/o de tiempos de vida reducidos como
resultado de un aumento de la propensión a condiciones
medioambientales adversas o agentes químicos y biológicos. En
consecuencia, la presente invención se extiende adicionalmente a los
métodos en los que se trata una planta según el primer aspecto o
una planta a la que se ha aplicado una composición de cebo según el
segundo aspecto, con un agente químico y/o biológico insecticida, y
especialmente a uno cuya actividad se ha demostrado que es superior
frente a larvas de insecto más pequeñas, en comparación con las más
grandes. Los agentes químicos adecuados incluyen compuestos de
organofosfato y los agentes biológicos adecuados incluyen bacterias
y virus de insectos patógenos (especialmente Bacillus
thuringiensis [Bt] y baculovirus de la poliedrosis nuclear).
Estos agentes pueden aplicarse mediante cualquiera de los métodos
bien conocidos en la técnica y, lo más convenientemente, mediante
pulverización. Preferiblemente, el agente químico o biológico se
aplica en forma de una composición que comprende un vehículo
aceptable en agricultura. Cuando se usan con una composición de
cebo, debe entenderse que la composición de cebo también podría
aplicarse a la planta antes, después o simultáneamente con el
agente químico y/o biológico.
Se pretende que los términos "comprenden",
"comprende" y "que comprende" tal como se usan a lo largo
de la memoria descriptiva se refieran a la inclusión de un
componente, característica o etapa o grupo de componentes,
características o etapas establecidos con o sin la inclusión de un
componente, característica o etapa o grupo de componentes,
características o etapas adicionales.
La invención se describe a continuación en el
presente documento con referencia a las figuras adjuntas y a los
siguientes ejemplos no limitativos.
Figura 1: Proporciona una comparación de una
secuencia de aminoácidos parcial de la proteína fusolina del
entomopoxvirus de Dermolepida albohirtum (aislado Stone
River; DaEPV_{SR}) con regiones correspondientes de la misma
proteína de otros entomopoxvirus y baculovirus seleccionados. El
texto recuadrado muestra la secuencia de fusolina de DaEPV_{SR}
tal como se determina mediante el análisis de los aminoácidos del
extremo N-terminal (negrita) o la traducción
conceptual de la secuencia de nucleótidos codificante. Los
asteriscos sobre la secuencia de DaEPV_{SR} recuadrada muestran
residuos que difieren de otros EPV derivados del escarabajo (MmEPV y
AcEPV); los situados por debajo de la alineación muestran los
residuos conservados a través de las proteínas conceptuales de EPV,
NPV y Gv. (MmEPV: EPV de Melolontha melolontha; AcEPV: EPV de
Anomala cuprea; CbEPV: EPV de Choristoneura biennnis;
HaEPV: EPV de Heliothis armigera; BmNPV: virus de la
poliedrosis nuclear [NPV] de Bombyx mori; CFNPV: NPV de
Choristoneura fumiferanae; XcGV: virus de la granulosis de
Xestia c-nigrum).
Figura 2: Proporciona una reproducción de un gel
de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de cuerpos
fusiformes fraccionados de HaEPV y DaEPV_{SR}.
Figura 3: Proporciona un mapa para el vector de
transferencia pEPAS3.
Figura 4: Muestra los constituyentes proteicos
de aislados [fus^{(-)}] de tipo natural y recombinantes de
IIaEPV, visualizados (a) mediante tinción con azul de Coomassie o
(b) mediante inmunotransferencia de tipo Western con antisuero
frente a fusolina de HaEPV. Las flechas indican las posiciones de la
proteína fusolina.
Figura 5: Infectividad de aislados [fus^{(-)}]
de tipo natural y recombinantes de HaEPV para larvas de
Helicoverpa armigera de 48 h de edad.
Figura 6: Muestra los perfiles de aumento de
peso de larvas de Helicoverpa ormigera de 48 h de edad tras
alimentación de 7 días con dieta contaminada con aislados
[fus^{(-)}] de tipo natural y recombinantes de HaEPV.
Figura 7: Muestra el alcance de desarrollo de
larvas de Helicoverpa armigera de 48 h de edad tras
alimentación de 21 días con dieta contaminada con aislados
[fus^{(-)}] de tipo natural y recombinante de HaEPV.
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Ejemplo
1
Se prepararon preparaciones de esferoides y
cuerpos fusiformes (SB) de entomopoxvirus de Heliothis
armigera (HaEPV) y entomopoxvirus de Dermolepida
albohirtum (DaEPV_{SR}) a partir de cadáveres macerados de
larvas de Spodoptera litura (Lep: Noctuidae) y
Dermolepida albohirtum (Col: Melolonthinae),
respectivamente, usando un procedimiento de centrifugación
diferencial repetida. Se colocaron por capas estas preparaciones
sobre una solución al 36% (p/p) de CsCl y se centrifugó durante la
noche a 27000 rpm en un rotor Beckman SW41. Se recogieron
fracciones que contenían números altos de cuerpos fusiformes y se
agruparon, y se repitió el procedimiento hasta que se obtuvo un
grado suficiente de pureza. Se lavaron las preparaciones purificadas
de SB tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS),
entonces se almacenaron a 5ºC en la misma solución hasta su
uso.
Se analizaron las preparaciones mediante
microscopía óptica (MO) y mediante examen de la composición de
proteínas mediante SDS-PAGE, usando este último
técnicas descritas previamente (Dall et al., 1993). Estos
protocolos mostraron que pudo lograrse un nivel de pureza muy alto
para HaEPV (figura 2, carril 2) y que pudo obtenerse un grado de
pureza satisfactorio para DaEPV_{SR} (figura 2, carril 4).
Se separaron constituyentes de proteínas de
preparaciones de DaEPV_{SR} mediante SDS-PAGE y se
inmovilizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western sobre
una membrana PVDF (Dall et al., 1993). Se aisló una banda
correspondiente a una proteína de aproximadamente 50 K de
M_{r}, y que representaba por tanto la supuesta proteína
fusolina de DaEPV_{SR}, y se obtuvo la secuencia de aminoácidos
N-terminal de la proteína inmovilizada mediante el
uso de un secuenciador Procise de Applied Biosystems.
Se comparó la secuencia de aminoácidos
resultante (HGYITFPIARQRR (SEQ ID NO: 2); código de una letra
convencional) con otras en GenBank usando el algoritmo Blast de
NCBI (Altschul et al., 1990). Éste y otros análisis (usando
el algoritmo Gap de GCG) mostraron que esta secuencia correspondía a
las conocidas de las proteínas de fusolina/gp37 a partir de
baculovirus (virus de la poliedrosis nuclear y la granulosis; NPV y
GV, respectivamente), y otros EPV, y que era una de las formas más
estrechamente apareadas de la proteína identificada previamente de
aislados de EPV a partir de huéspedes de coleópteros (a saber, EPV
de Melolontha melolontha [número de registro de GenBank
X77616], con la que era idéntica, y EPV de Anomala cuprea
[AB000780]; tabla 1).
Se preparó ADN genómico de DaEPV_{SR} mediante
disolución de preparaciones purificadas de esferoides/SB en un
tampón carbonato a pH alto que contenía ácido tioglicólico 40 mM.
Después de que se completase esencialmente la disolución de
esferoides/SB (tal como se evaluó mediante examen con MO), se
neutralizó la solución mediante la adición de tampón Tris 10 mM, pH
8,0, se digirió con proteasa K durante 3 h, se llevó a ebullición
durante 10 minutos, entonces se centrifugó a 15K g durante 10
minutos para eliminar los residuos restantes. Se recogió el ADN
genómico viral con el sobrenadante y se almacenó a -20ºC. Se usó ADN
genómico viral como molde en protocolos de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleotídicos a medida
(oligos).
Se amplificó un segmento del gen que codifica
para fusolina de DaEPV_{SR} mediante el uso de oligos a medida
NFUS1 y EPSP6. Se diseñó el oligo NFUS1 mediante traducción inversa
de la secuencia de aminoácidos N-terminal de
DaEPV_{SR} descrita anteriormente, y comprendía la secuencia:
(NFUS1) 5'-cay ggw tat atr can
ttt cct ata gc-3' (SEQ ID NO: 9), en la que n
representa cualquier nucleótido, r = a o g, w = a o t, e y = c o
t.
Se diseñó el oligo EPSP6 para unirse a una
región que se sabe que está altamente conservada en otras formas
del gen, ubicada unos 700 nucleótidos en sentido 3' del codón de
iniciación de la traducción, y comprendía la secuencia:
(EPSP6) 5'-aca rtt rta raa wcc
ttc wcc yac-3' (SEQ ID NO: 10), en la que n
representa cualquier nucleótido, r = a o g, w = a o t, e y = c o
t.
Amplificaciones por PCR usando el par de oligos
NFUS1 y EPSP6 y ADN de DaEPV_{SR} dieron lugar a un producto de
aproximadamente 700 pb, tal como se evaluó mediante electroforesis
en gel de agarosa. Se clonó este producto en plásmido
pGem-TEasy (Promega), con el fin de permitir la
caracterización de su secuencia de nucleótidos constituyente. Se
replicó el plásmido en la cepa DH10\beta de Escherichia
coli y se purificó con un reactivo/protocolo comercial (Wizard
Prep; Promega).
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El análisis de la secuencia de nucleótidos
amplificada usó oligonucleótidos directos e inversos universales,
con mezcla de reacción "Big Dye" de Elmer Perkin y metodología
de secuencias de ciclo de PCR tal como recomendó el proveedor. Se
analizaron los productos de la reacción de secuenciación en un
secuenciador de ADN ABA377. Se analizó la secuencia de ADN obtenida
usando los algoritmos Translate y Map de GCG (Devereux et
al., 1984); se obtuvieron secuencias relacionadas a partir de
GenBank usando el algoritmo Blast de NCBI.
El análisis de secuencias comparativo usó
algoritmos PileUp y Gap de GCG (Devereux et al., 1984). Tal
como se muestra en la tabla 1, la secuencia de aminoácidos de
fusolina de DaEPV_{SR} disponible muestra las relaciones más
estrechas con regiones análogas (tal como se interpreta mediante la
alineación de los extremos N-terminales de las
formas maduras) de proteínas fusolinas de EPV de huéspedes
coleópteros (MmEPV y AcEPV), pero también muestra niveles
significativos de identidad de secuencia con otras proteínas
fusolinas y gp37 de EPV y baculovirus, respectivamente, de
huéspedes lepidópteros.
La alineación de secuencias de aminoácidos
conceptuales (figura 1) muestra que la fusolina de DaEPV_{SR}
tiene una única secuencia (tal como se indica mediante asteriscos
por encima de la línea, que muestran posiciones que difieren con
respecto a otras secuencias de origen de EPV de coleópteros), pero
también que conserva los mismos agrupamientos de residuos
conservados hallados en proteínas relacionadas de otros EPV y
baculovirus de orígenes de coleópteros y lepidópteros (asteriscos
por debajo de la alineación). Tal como se muestra en la tabla 2,
las identidades en porcentaje entre las secuencias de fusolina
seleccionadas oscilan desde el 38,0 hasta el 89,7% para HaEPV
(molécula completa) y desde el 45,2 hasta el 81,8% para DaEPV_{SR}
(regiones correspondientes).
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Se incorporaron SB purificados de HaEPV y
DaEPV_{SR} a la dieta artificial de insecto mediante adición y
mezclado cuando la preparación estaba a una temperatura justo por
encima de la temperatura de solidificación. Entonces se dejó
solidificar la dieta y se administró a larvas recién nacidas de
Helicoverpa armigera y Spodoptera litura. Se alojaron
individualmente las larvas y se criaron en oscuridad a una
temperatura constante de 28ºC. Se evaluaron periódicamente los
pesos y el estado de desarrollo de las larvas; se almacenaron las
crisálidas resultantes a 5ºC antes de su examen (véase a
continuación).
Se tuvo cuidado de excluir cualquier
contribución de infección por virus contaminante para los resultados
de los experimentos. En el caso de experimentos usando HaEPV, se
incluyeron los pesos y tiempos de desarrollo de larvas individuales
en los análisis sólo cuando (1) la larva individual se convirtió en
crisálida satisfactoriamente y mostró una morfología de crisálida
normal, y (2) se evaluó que la crisálida resultante no estaba
infectada por virus, tal como se evaluó mediante el examen de
tejido por microscopía óptica. Por tanto, en estos experimentos se
examinó cada crisálida individual antes de incluir los datos
asociados en los análisis. En el caso de experimentos usando
DaEPV_{SR}, el trabajo previo ha mostrado que ninguna especie de
oruga usada en bioensayos en el presente documento es susceptible
de infección con este patógeno derivado de escarabajo. No obstante,
tal como anteriormente, sólo se incluyeron los datos en los
análisis en los casos en los que las larvas individuales se
convirtieron en crisálida satisfactoriamente y mostraron una
morfología de crisálida normal; sin embargo, en estos experimentos
sólo se evaluaron las crisálidas de las larvas expuestas a la
dosificación más alta de cuerpos fusiformes de DaEPV_{SR} en
cualquier experimento dado para determinar la presencia de virus.
Se diseñó esta metodología para garantizar en primer lugar la
validez de los estudios anteriores, tal como se indicó
anteriormente, y, en segundo lugar, para impedir la posibilidad de
contaminación accidental de larvas o inóculo experimental con virus
de otras fuentes. No se observó ningún caso de replicación de
DaEPV_{SR}.
DaEPV_{SR}.
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El experimento tiene la finalidad de determinar
si el consumo de SB de EPV y proteína fusolina asociada daría como
resultado tasas de crecimiento reducidas de orugas Helicoverpa
armigera. Por consiguiente, se expusieron larvas recién nacidas
de H. armigera a tres tasas de dosis de fusolina en SB de
HaEPV y DaEPV_{SR} (dosificaciones de 5, 50 y 100 \mug de
fusolina/cc de dieta), y se evaluaron tal como se describió
anteriormente. Siete días tras el comienzo del experimento, los
pesos de larvas "cualificadas" posteriormente (véase
anteriormente) eran tal como se muestra en la tabla 3 a
continuación:
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El examen de los datos mediante el análisis de
la varianza (ANOVA) no mostró diferencia entre los pesos medios de
las larvas en el grupo control y las alimentadas con preparaciones
de SB de DaEPV_{SR} (P = 0,2285), pero mostró que tras la
exposición de siete días, las larvas alimentadas con SB de HaEPV
eran significativamente más pequeñas que las del grupo control (P =
0,0201). El análisis de la respuesta de las larvas a diferentes
dosificaciones de SB de HaEPV no pudo mostrar pruebas (P = 0,0632)
de una relación significativa a un nivel de confianza del 5%.
Estos datos indican que la exposición a corto
plazo de larvas de H. armigera a los constituyentes de SB de
HaEPV puede conducir a reducciones significativas en el crecimiento
del animal.
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El experimento tiene la finalidad de determinar
si el consumo de SB de DaEPV_{SR} afectaría al crecimiento de
larvas de Helicoverpa armigera si se continúa durante un
periodo más prolongado, o si el consumo durante un periodo inicial
de siete días (tal como se sometió a prueba anteriormente en el
experimento A) tendría un efecto observable tras un periodo de
desarrollo más largo. Por consiguiente, se expusieron larvas recién
nacidas de Helicoverpa armigera a tres dosificaciones de
fusolina de DaEPV_{SR} en SB, y entonces se evaluaron tal como se
describió anteriormente. Tras siete días de alimentación, se pesaron
las larvas, y para cada régimen de dosificación, entonces se
permitió a un subgrupo alimentarse con dieta normal ("exp. de 7
d/normal de 7 d"), mientras el otro continuó alimentándose con
una dieta que contenía SB ("exp. de 14 d"). Tras 7 días, no se
observó diferencia significativa entre los pesos medios de las
larvas control y las expuestas a SB de DaEPV_{SR} (P = 0,7791);
este resultado es consecuente con el notificado en el experimento A
anteriormente. Tras 14 días, volvieron a pesarse todas las larvas,
con resultados tal como se muestran en la tabla 4 a
continuación.
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El examen de los datos mediante el análisis de
la varianza (ANOVA) no mostró diferencia entre los pesos medios de
las larvas en el grupo control y las alimentadas con preparaciones
de SB de DaEPV_{SR} durante 7 días antes de la alimentación
posterior durante 7 días adicionales con dieta normal (P = 0,3857).
Por el contrario, eran evidentes diferencias altamente
significativas entre los pesos medios de las larvas en el grupo
control y las alimentadas continuamente con preparaciones de SB de
DaEPV_{SR} durante 14 días (P = 0,0000), y entre los pesos medios
de los grupos de "exposición de 7 días/dieta normal de 7 días"
y los grupos de "exposición continua de 14 días" (P=
0,0000).
Por tanto este experimento indica que la
exposición a corto plazo de larvas de H. armigera a los
constituyentes de SB de DaEPV_{SR} no tiene consecuencias ni a
corto plazo ni a largo plazo, pero la exposición continua durante
periodos más largos (por ejemplo 14 días) provoca una reducción
altamente significativa en el crecimiento. Tomado a través de todas
las dosificaciones de DaEPV_{SR}, el peso medio de las orugas era
de 0,2588 g tras la exposición de 14 días, en comparación con un
peso medio de 0,4605 g para animales no expuestos, representando
una reducción en el crecimiento del 44%.
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El fin de este experimento era determinar si el
consumo de SB de o bien HaEPV o bien DaEPV_{SR} y proteína
fusolina asociada afectaría al crecimiento de orugas Spodoptera
litura, o bien tras un periodo de exposición de 7 días, una
exposición de 7 días seguida de acceso a dieta normal de 5 días, o
bien exposición continua durante un periodo de 12 días. Por
consiguiente, se expusieron larvas recién nacidas de S.
litura a una dosis de SB y fusolina asociada de HaEPV (5 \mug
de fusolina/cc de dieta) y a dos tasas de dosis de SB de
DaEPV_{SR} y fusolina asociada (5 y 50 \mug de fusolina/cc de
dieta).
Se pesaron las larvas tras siete días de
alimentación, y para cada régimen de dosificación, entonces se
permitió a un subgrupo alimentarse con dieta normal ("exp. de 7
d/normal de 5 d"), mientras que el otro continuó alimentándose
con dieta que contenía SB ("exp. de 12 d"). Tras 7 días de
actividad de alimentación, no se observaron diferencias
significativas entre los pesos medios de las larvas control y las
expuestas a diversas dosificaciones de SB/fusolina. Tras un total
de 12 días de alimentación, se volvieron a pesar las larvas, con
resultados tal como se muestran en la tabla 5 a continuación.
El examen de los datos mediante el análisis de
la varianza (ANOVA) no mostró diferencia entre los pesos medios de
las larvas en el grupo control y las alimentadas con preparaciones
de SB de o bien HaEPV o DaEPV_{SR} durante 7 días antes de la
alimentación posterior durante 5 días adicionales con dieta normal
(P = 0,2973). Por el contrario, eran evidentes diferencias
altamente significativas entre los pesos medios de las larvas en el
grupo control y las alimentadas continuamente con preparaciones de
SB de HaEPV durante 12 días (P = 0,0000), o SB de DaEPV_{SR}
durante 12 días (P = 0,0000). Asimismo, eran evidentes diferencias
altamente significativas entre los pesos medios de las larvas en el
grupo alimentado con SB de HaEPV durante siete días sólo antes de
la alimentación durante 5 días con dieta no contaminada, y las
alimentadas continuamente con preparaciones de SB de HaEPV durante
12 días (P = 0,0000). De manera similar, los pesos para la misma
comparación a cada tasa de dosis de SB de DaEPV_{SR} eran
altamente significativos (P = 0,0000 para ambas tasas de dosis).
Estos datos indican que la exposición a corto
plazo (es decir, hasta 7 días) de larvas de S. litura a los
constituyentes de SB de HaEPV y DaEPV_{SR} no tiene consecuencias
ni a corto plazo ni a largo plazo, pero que la exposición continua
durante periodos más largos (por ejemplo 12 días) provoca una
reducción altamente significativa en el crecimiento.
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Ejemplo
2
En este ejemplo, se usó el vector de
transferencia pEPAS3 (figura 3), que contiene un gen lacZ bacteriano
insertado inmediatamente en sentido 5' de la secuencia que codifica
para la fusolina de HaEPV, de manera que evita la expresión de esta
última, junto con HaEPV de tipo natural, para producir formas
recombinantes de HaEPV en las que se sustituyó la producción de
fusolina por la producción de la proteína marcadora de
\beta-galactosidasa. Posteriormente se encontró
que las reservas amplificadas de ese HaEPV recombinante contenían
formas del virus que no producían ni el marcador de
\beta-galactosidasa ni la proteína fusolina, tal
como se evaluó por la ausencia de SB en preparaciones observadas
mediante microscopía óptica. Se aislaron dos de tales variantes
(pp5 y pp7) mediante purificación en placa repetida y posterior
reamplificación en cultivos de células de insectos. Entonces se
alimentaron larvas de la polilla Helicoverpa armigera con
preparaciones recogidas de células infectadas con estos virus,
estableciendo, a su vez, infecciones en los insectos. Se trataron
los insectos infectados para recuperar los productos de estas
infecciones para su uso en investigaciones biológicas posteriores,
y por último se seleccionaron preparaciones de reservas de virus
conocidas como pp7T6 y pp7S22 (o, tras un segundo pase en insectos,
pp7T6/5 y pp7S22/13) para una caracterización más detallada.
Se llevaron en paralelo reservas del aislado
clonal de tipo natural wt nº 2/011293 (Osborne et al., 1996),
que se usó como forma parental para la producción del recombinante
que expresa \beta-galactosidasa original, a
través de purificación en placa, reamplificación y alimentación para
la recuperación de huéspedes de insecto H. armigera. Líneas
seleccionadas a partir de estas reservas (2C1 y 2D8, o 2C1/11 y
2D8/17) sirvieron como controles en las investigaciones descritas a
continuación.
Se usaron microscopía óptica y microscopía
electrónica de barrido para examinar la composición y morfología de
preparaciones de las reservas pp7T6, pp7S22, 2C1 y 2D8. Tal como se
esperaba, se observó que las preparaciones de los virus de tipo
natural 2C1 y 2D8 contenían tanto esferoides de virus como SB,
mientras que se observó que las preparaciones de los recombinantes
pp7T6 y pp7S22 sólo contenían esferoides. Los esferoides de las
cuatro reservas parecían ser morfológicamente idénticos.
Se examinó la composición molecular de las
preparaciones de estas reservas de virus usando los protocolos de
laboratorio convencionales de SDS-PAGE e
inmunotransferencia de tipo Western (véase, por ejemplo, Sambrook
et al., 1989). Tal como se muestra en la figura 4(a),
la tinción con azul de Coomassie de los constituyentes de proteínas
separados de las cuatro preparaciones mostró una banda prominente de
aproximadamente 115 kDa, que correspondía a la proteína esferoide
principal de la matriz (esferoidina; Hall & Moyer, 1991;
Sriskantha et al., 1997), y otras numerosas bandas menos
intensas aparentemente comunes para cada una. Las preparaciones de
las dos reservas de tipo natural también mostraron una banda de
proteína con una movilidad de aproximadamente 50 kDa, (figura
4[a], flecha) que correspondía a la forma monomérica de la
proteína fusolina (Dall et al., 1993), que no era evidente
en las preparaciones de pp7T6 y pp7S22. Entonces se usaron un
antisuero policlonal frente a proteína fusolina de HaEPV (Dall
et al., 1993) y protocolos de inmunotransferencia de tipo
Western para caracterizar adicionalmente estas reservas de virus.
Tal como se muestra en la figura 4(b), ambas preparaciones
de virus de tipo natural produjeron bandas inmunorreactivas muy
prominentes en una posición que correspondía a un peso molecular de
aproximadamente 50kDa (flecha), que, tal como se esperaba, no eran
evidentes en preparaciones de las dos formas recombinantes
negativas para fusolina [fus^{(-)}].
Entonces se seleccionaron un aislado de tipo
natural (2D8) y uno recombinante (pp7T6) para una caracterización
biológica más detallada. Se expusieron larvas de H. armigera
de 48 horas de edad alojadas individualmente a un intervalo de
cantidades de cada uno de los virus colocándolas sobre dieta
artificial esparcida con alícuotas de series de dilución de los
virus. Después de siete días ("tras la infección"; 7 dti), se
pesó cada larva y a 21 dti se recogieron todas las larvas, se
registró su fase de desarrollo y se determinó su estado con
respecto a la infección viral (es decir, infectadas o no infectadas)
mediante examen de frotis de cuerpos grasos mediante microscopía
óptica. En todos los casos, se excluyeron del ensayo las larvas que
murieron a o antes de los 7 dti, mientras que las que murieron a
los 21 dti se consideraron positivas (es decir, infectadas).
Tal como se muestra en la figura 5, estos
experimentos demostraron que el aislado de virus de tipo natural
2D8 era sustancialmente más infeccioso que el pp7T6 recombinante
fus^{(-)}, teniendo el primero una IG_{50} (siendo esta la
cantidad de virus requerida para infectar el 50% de las larvas
expuestas) estimada de 0,2 esferoides/mm^{2} de dieta
(esf/mm^{2}), mientras que para el pp7T6 era de 35 esf/mm^{2}.
Los resultados de investigaciones menos detalladas con aislados de
virus 2C1 y pp7S22 también eran consecuentes con estos
resultados.
Análisis adicionales de los resultados han
revelado, además, otro fenómeno asociado a la fusolina que no se
había reconocido previamente, concretamente, que la presencia de
fusolina está asociada con el retraso de las tasas de crecimiento y
desarrollo de las larvas de insecto expuestas. Por tanto, la figura
6 muestra sólo los pesos medios de insectos infectados, tomados a
los 7 dti, y calculados como una proporción del peso de larvas no
infectadas a partir de la misma cohorte (es decir como un % del peso
de controles experimentales). Tal como puede observarse, cuando se
analizaron los resultados de esta manera, era evidente que en
presencia de fusolina, el aumento de peso de las larvas se redujo
mucho. Por tanto, este análisis tiene en cuenta la observación
descrita anteriormente (es decir, que la presencia de fusolina
mejora la infectividad del virus), y además muestra que cuando se
usa la infectividad intrínseca de una dosis particular como base de
comparación, puede observarse este efecto anteriormente no
reconocido de la fusolina sobre el crecimiento del insecto.
De manera similar, y tal como se muestra en la
figura 7, cuando se evaluó el alcance del desarrollo de los mismos
insectos infectados, ahora unificados en tres "categorías" de
tasas de infección, a 21 dti, se observó que una proporción muy
reducida de larvas continuaba hasta la conversión en crisálida en
muestras expuestas a preparaciones del virus de tipo natural que
contenían la proteína fusolina.
Los ejemplos anteriores demuestran la viabilidad
de estrategias diseñadas para efectuar la ingestión oral de
proteína(s) constituyente(s) de SB/SLB tal(es)
como fusolina por insectos que se alimentan de plantas como medio
para inhibir la alimentación, el crecimiento y/o el desarrollo de
tales insectos. Por tanto, tales estrategias pueden ser de un valor
significativo con respecto a la limitación de las pérdidas de
materiales de productos básicos que resultan de la actividad de
alimentación de los insectos. Esto es, puede apreciarse que los
insectos pequeños provocan menos daño por alimentación a las
plantas que los grandes y que, retrasando el crecimiento y/o
desarrollo de los insectos aumentará el periodo de tiempo durante el
cual factores tales como condiciones ambientales adversas,
depredadores y/o agentes químicos y biológicos aplicados
artificialmente pueden lograr su control. Además, se reconoce
ampliamente que insectos en un estadio prematuro (es decir, más
pequeños) son intrínsicamente más susceptibles a la infección con,
o a la actividad de, una variedad de agentes de control químicos y
biológicos tales como la bacteria Bacillus thuringiensis
("Bt").
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<110> Commonwealth Scientific and
Industrial Research Organisation
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Plantas y cebos para controlar el
daño de insectos que se alimentan de plantas
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<160> 18
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia conservada de proteínas fusolinas
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<400>4
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Entomopoxvirus de Dermolepida
albohirtum y entomopoxvirus de Melolontha melolontha
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<400> 2
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\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Entomopoxvirus de Anomala
cuprea
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<400> 3
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<212> PRT
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<213> Entomopoxvirus de Choristoneura
biennis, entomopoxvirus de Helicoverpa armigera y
entomopoxvirus de Pseudaletia separata
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<400> 4
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<212> PRT
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<213> Virus de la poliedrosis nuclear de
Bombyx mori
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<400> 5
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<213> Virus de la poliedrosis nuclear de
Choristoneura fumiferana
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<400> 6
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Virus de la poliedrosis nuclear de
Mamestra brassica
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<400> 7
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<210> 8
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<212> PRT
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<213> GV de Xestria
c-nigrum
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<400> 8
\hskip1cm
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<210> 9
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de PCR
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<400> 10
\hskip1cm
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<210> 11
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<211> 220
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<212> PRT
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<213> Entomopoxvirus de Dermolepida
albohirtum
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<400>11
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<210> 12
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<211> 220
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<213> Entomopoxvirus de Melolontha
melolontha
\newpage
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Entomopoxvirus de Anomala
cuprea
\newpage
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<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
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<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Entomopoxvirus de Choristoneura
biennis
\newpage
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<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Entomopoxvirus de Helicoverpa
armigera
\newpage
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<210> 16
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<211> 217
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<213> Virus de la poliedrosis nuclear de
Bombyx mori
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 217
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<213> Virus de la poliedrosis nuclear de
Choristoneura fumiferana
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> GV de Xestria
c-nigrum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Planta transformada con al menos una molécula
de polinucleótido que comprende una(s) secuencia(s) de
nucleótidos que codifica(n) para fusolina o una proteína de
tipo fusolina, estando dicha(s) secuencia(s) de
nucleótidos operativamente unida(s) a una(s)
secuencia(s) de promotor adecuada(s), en la que dicha
planta transformada expresa dicha fusolina o una proteína de tipo
fusolina en, al menos, un tejido vegetal o tejidos vegetales
propenso(s) a dañarse por insectos que se alimentan de ella,
y en la que dicha proteína de tipo fusolina comprende al menos un
35% de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína
fusolina de EPV de Heliothis armigera (HaEPV) y que incluye
las secuencias siguientes: motivos HGX (en la que X es un residuo
aromático), motivos ARQ cerca del extremo
N-terminal y VRWQR (SEQ ID NO:1) en otro lugar.
2. Planta según la reivindicación 1, en la que
la proteína fusolina se selecciona de fusolinas de EPV de
Heliothis armigera (HaEPV), EPV de Pseudaletia
separata (PsEPV), EPV de Choristoneura biennis (CbEPV) y
EPV de Dermolepida albohirtum.
3. Planta según la reivindicación 1, en la que
la proteína de tipo fusolina se selecciona de proteínas de tipo
fusolina de NPV de Autographa californica (AcMNPV), Bombyx
mori (BmMNPV), Choristoneura fumiferana (CfMNPV),
Lymantria dispar (LdMNPV), Orgyia pseudotsugata
(OpMNPV) y GV de Xestia c-nigrum (XcGV).
4. Planta según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que expresa además una toxina exógena
u otro agente que es nocivo para los insectos.
5. Planta según la reivindicación 4, en la que
la toxina exógena se selecciona de \delta-toxina
de Bacillus thuringiensis y neurohormonas de insectos.
6. Método de control o prevención del daño
producido a una planta según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5 por insectos que se alimentan de ella, comprendiendo dicho
método aplicar a dicha planta un agente químico y/o biológico
insecticida.
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