ES2303452B1 - STICH ROLLING SACCHAROMYCES CEREVISIAE AND METHOD FOR DETECTING ANTIFUNGIC SUBSTANCES WITH ACTIVITY ON THE CELL WALL. - Google Patents
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Abstract
Estirpe de la levadura Saccharomyces cerevisiae y método para la detección de sustancias antifúngicas con actividad sobre la pared celular. Saccharomyces cerevisiae yeast strain and method for the detection of antifungal substances with activity on the cell wall.
En la presente invención se presenta el desarrollo y utilización de una estirpe, genéticamente modificada, de la levadura Saccharomyces cerevisiae, como sistema biológico dirigido a la identificación de sustancias capaces de interferir con los procesos de construcción y/o mantenimiento de la integridad de la pared celular de dicho organismo. Así mismo, se presenta un método de screening/rastreo de dichas sustancias utilizando la citada estirpe testigo/indicadora.In the present invention, the development and use of a genetically modified strain of Saccharomyces cerevisiae yeast is presented as a biological system aimed at the identification of substances capable of interfering with the processes of construction and / or maintenance of the integrity of the wall cell of said organism. Likewise, a screening / screening method of these substances is presented using the aforementioned control / indicator lineage.
Description
Estirpe de la levadura Saccharomyces cerevisiae y método para la detección de sustancias antifúngicas con actividad sobre la pared celular. Saccharomyces cerevisiae yeast strain and method for the detection of antifungal substances with activity on the cell wall.
En la presente invención se presenta el desarrollo y utilización de una estirpe, genéticamente modificada, de la levadura Saccharomyces cerevisiae, como sistema biológico dirigido a la identificación de sustancias capaces de interferir con los procesos de construcción y/o mantenimiento de la integridad de la pared celular de dicho organismo. Así mismo, se presenta un método de screening/rastreo de dichas sustancias utilizando la citada estirpe testigo/indicadora.In the present invention, the development and use of a genetically modified strain of Saccharomyces cerevisiae yeast is presented as a biological system aimed at the identification of substances capable of interfering with the processes of construction and / or maintenance of the integrity of the wall cell of said organism. Likewise, a screening / screening method of these substances is presented using the aforementioned control / indicator lineage.
La invención se encuadra en el sector técnico de procesos biotecnológicos, más concretamente en lo relativo al empleo de microoganismos modelo, genéticamente modificados, para su utilización como biosensores de diferentes procesos biológicos, y en este caso, específicamente en el campo de detección de sustancias con actividad antifúngica.The invention falls within the technical sector of biotechnological processes, more specifically in relation to use of genetically modified model microorganisms for use as biosensors of different biological processes, and in this case, specifically in the field of substance detection with antifungal activity.
Las infecciones fúngicas en humanos se han incrementado de forma significativa durante las últimas décadas, aumentando su prevalencia como causas de enfermedad y mortalidad (Sandven, 2000, Rev Iberoam Micol, 17:73-81; Bille, et al., 2005, Curr Opin Infect Dis, 18:314-9; Almirante, et al., 2005, J Clin Microbiol, 43:1829-35). El problema se ha agravado por el incremento de pacientes inmunocomprometidos, debido fundamentalmente a la pandemia del SIDA, el aumento en el número de trasplantes de órganos y el uso de terapias anticancerosas más agresivas (Sussman et al., 2004, Eukaryotic Cell, 3:932-43; Levin, 2005, Microbiol Mol Biol Rev, 69:262-91). El incremento en la morbilidad, junto con la pérdida de eficiencia de los fármacos disponibles así como los efectos adversos ocasionados por muchas de las moléculas integrantes del arsenal terapéutico actual (Prentice and Donnelly, 2001, Blood Rev, 15:1-8; Vicente et al., 2003, Clin Microbiol Infect, 9:15-32; Akins, 2005, Med Mycol, 43:285-318; Chandrasekar, 2005, Med Mycol, 43:S295-8) hacen muy necesario el desarrollo de nuevos fármacos antifúngicos.Fungal infections in humans have increased significantly in recent decades, increasing their prevalence as causes of disease and mortality (Sandven, 2000, Rev Iberoam Micol, 17: 73-81; Bille, et al ., 2005, Curr Opin Infect Dis, 18: 314-9; Almirante, et al ., 2005, J Clin Microbiol, 43: 1829-35). The problem has been aggravated by the increase in immunocompromised patients, mainly due to the AIDS pandemic, the increase in the number of organ transplants and the use of more aggressive anticancer therapies (Sussman et al ., 2004, Eukaryotic Cell, 3: 932-43; Levin, 2005, Microbiol Mol Biol Rev, 69: 262-91). The increase in morbidity, together with the loss of efficiency of the available drugs as well as the adverse effects caused by many of the molecules that are part of the current therapeutic arsenal (Prentice and Donnelly, 2001, Blood Rev, 15: 1-8; Vicente et al ., 2003, Clin Microbiol Infect, 9: 15-32; Akins, 2005, Med Mycol, 43: 285-318; Chandrasekar, 2005, Med Mycol, 43: S295-8) make the development of new antifungal drugs very necessary .
El sistema tradicionalmente utilizado para el descubrimiento de nuevas sustancias antifúngicas potenciales se basa en utilizar métodos celulares, es decir, identificar nuevos compuestos activos frente a la propia célula fúngica (Willins et al., 2002, Curr Pharm Des, 8:1137-54) con capacidad para detener su crecimiento o producir su muerte. Con este sistema se tiene la seguridad de que las sustancias identificadas han sido capaces de penetrar en la célula para ejercer su acción, lo cual es ventajoso frente a otros sistemas de rastreo como los sistemas libres de células. Sin embargo, su principal inconveniente es que el método detecta productos que actúan sobre cualquier diana de la célula, sin que el procedimiento introduzca ninguna especificidad en el modo de acción. Con los referidos procedimientos inespecíficos, una vez detectado cualquier compuesto activo, es preciso continuar la búsqueda para la selección de aquellas sustancias que sean selectivas, es decir capaces de inhibir o afectar a funciones del patógeno que estén ausentes en el hospedador, o que, al menos, sean lo suficientemente distintas de modo que el metabolismo del hospedador se vea mínimamente afectado.The system traditionally used for the discovery of potential new antifungal substances is based on using cellular methods, that is, identifying new active compounds against the fungal cell itself (Willins et al ., 2002, Curr Pharm Des, 8: 1137-54) with capacity to stop its growth or produce its death. With this system it is certain that the identified substances have been able to penetrate the cell to exert their action, which is advantageous compared to other tracking systems such as cell-free systems. However, its main drawback is that the method detects products that act on any target of the cell, without the procedure introducing any specificity in the mode of action. With the aforementioned non-specific procedures, once any active compound has been detected, it is necessary to continue the search for the selection of those substances that are selective, that is, capable of inhibiting or affecting functions of the pathogen that are absent in the host, or that, at less, be sufficiently different so that the host metabolism is minimally affected.
Otros métodos de rastreo de sustancias antifúngicas se han centrado en la inhibición de la expresión de genes esenciales de Saccharomyces cerevisiae (EP0972847) o en la modulación de la expresión de determinados genes potencialmente interesantes (US2006088859) (muchos de ellos de función no completamente caracterizada). En estos casos, el gen seleccionado se sustituye por un gen marcador, transformando la correspondiente estirpe con un plásmido que incluye el gen esencial bajo el control de un promotor regulable. Las células así modificadas se incuban en presencia de la sustancia cuya actividad se desea analizar y se determina el efecto inhibidor del crecimiento que ejerce dicha sustancia sobre la célula modificada dependiendo de los niveles de expresión del gen esencial.Other methods of tracking antifungal substances have focused on the inhibition of expression of essential Saccharomyces cerevisiae genes (EP0972847) or on the modulation of the expression of certain potentially interesting genes (US2006088859) (many of them not fully characterized) . In these cases, the selected gene is replaced by a marker gene, transforming the corresponding strain with a plasmid that includes the essential gene under the control of an adjustable promoter. The cells thus modified are incubated in the presence of the substance whose activity is to be analyzed and the growth inhibitory effect exerted by said substance on the modified cell is determined depending on the expression levels of the essential gene.
De entre los blancos útiles para seleccionar sustancias selectivas, la pared celular fúngica se ha postulado como una diana ideal (más bien un conjunto de dianas) ya que no existe en las células de mamíferos y, por tanto, permite la deseada selectividad del efecto tóxico de los antifúngicos. Además, la pared celular constituye una estructura compleja, con múltiples funciones para su desarrollo, que tiene un papel fundamental en la estabilidad de la célula fúngica y la supervivencia del agente infeccioso en cualquier ambiente, siendo, por tanto, muy atractivo el descubrimiento de este tipo de antifúngicos para su uso futuro en clínica humana.Among the useful targets to select selective substances, the fungal cell wall has been postulated as an ideal target (rather a set of targets) since no exists in mammalian cells and therefore allows the desired selectivity of the toxic effect of antifungals. In addition, the wall Cellular constitutes a complex structure, with multiple functions for its development, which has a fundamental role in the fungal cell stability and agent survival Infectious in any environment, being therefore very attractive the discovery of this type of antifungal for future use In human clinic.
En este contexto, se han descrito métodos de
rastreo de sustancias con posible actividad antifúngica sobre la
pared celular de hongos filamentosos (WO03020922), aunque en cierto
modo aún limitados por el incipiente nivel de conocimiento de los
mecanismos implicados en la regulación de esta estructura en este
tipo de organismos y por la consabida dificultad que conlleva la
obtención de crecimientos reproducibles en medio líquido de
hongos
filamentosos.In this context, methods of tracking substances with possible antifungal activity on the cell wall of filamentous fungi (WO03020922) have been described, although in some ways still limited by the incipient level of knowledge of the mechanisms involved in the regulation of this structure in this type of organisms and due to the usual difficulty involved in obtaining reproducible growths in fungal liquid medium
filamentous
Es importante remarcar que la levadura unicelular Saccharomyces cerevisiae constituye un organismo eucariótico modelo, por excelencia, para muchos estudios fundamentales. La información que aportan muchos de los trabajos realizados sobre la pared celular de esta especie es verdaderamente notable y han llevado a un nivel de conocimiento de esta estructura realmente significativo (Cid et al., 1995, Microbiol Rev, 59:345-86; Klis, et al., 2002, FEMS Microbiol Rev, 26:239-56; Lesage and Bussey, 2006, Microbiol Mol Biol Rev, 70:317-43), en contraposición con la información disponible en otros hongos patógenos donde en todo caso es mucho menor debido fundamentalmente a la carencia de herramientas genéticas para la manipulación de estos microorganismos y a la patogenicidad inherente a los hongos de interés clínico que dificulta su manejo en laboratorios estándar. Por tanto, en muchos casos la información disponible en relación con la pared celular está supeditada a los datos previamente obtenidos utilizando S. cerevisiae. Esta estructura constituye un elemento esencial para la viabilidad del organismo. De hecho cuando se le enfrenta a sustancias que interfieren con la correcta formación de la pared celular la viabilidad de la levadura se afecta seriamente.It is important to note that the single-celled yeast Saccharomyces cerevisiae constitutes a model eukaryotic organism, par excellence, for many fundamental studies. The information provided by many of the works carried out on the cell wall of this species is truly remarkable and has led to a level of knowledge of this really significant structure (Cid et al ., 1995, Microbiol Rev, 59: 345-86; Klis , et al ., 2002, FEMS Microbiol Rev, 26: 239-56; Lesage and Bussey, 2006, Microbiol Mol Biol Rev, 70: 317-43), in contrast to the information available in other pathogenic fungi where in any case it is much lower due mainly to the lack of genetic tools for the manipulation of these microorganisms and to the pathogenicity inherent to fungi of clinical interest that hinders their management in standard laboratories. Therefore, in many cases the information available in relation to the cell wall is subject to the data previously obtained using S. cerevisiae . This structure constitutes an essential element for the viability of the organism. In fact, when faced with substances that interfere with the correct formation of the cell wall, the viability of the yeast is seriously affected.
En los últimos años se ha identificado y caracterizado un mecanismo celular de respuesta a diferentes tipos de estreses que afectan a la estabilidad de la pared celular. Las funciones que se activan como consecuencia de este mecanismo, al que se ha denominado "mecanismo compensatorio", están controladas y moduladas por una ruta de transducción de señales denominada como "ruta de integridad celular". Esta respuesta se desencadena mediante la activación por fosforilación en cascada de un bloque de MAP quinasas, activando, mediante fosforilación y cuando procede, el factor de transcripción Rlm1p, responsable final del incremento en la expresión de un grupo específico de genes (revisado en Levin, 2005, Microbiol Mol Biol Rev, 69:262-91).In recent years it has been identified and characterized a cellular mechanism of response to different types of stresses that affect the stability of the cell wall. The functions that are activated as a result of this mechanism, to which It has been called "compensatory mechanism", they are controlled and modulated by a signal transduction path called as "cellular integrity path". This response is triggered. by activation by cascade phosphorylation of a block of MAP kinases, activating, by phosphorylation and when appropriate, the Rlm1p transcription factor, ultimately responsible for the increase in the expression of a specific group of genes (reviewed in Levin, 2005, Microbiol Mol Biol Rev, 69: 262-91).
Es primordial destacar la semejanza estructural de la pared celular de S. cerevisiae con la de otros hongos, incluidos los patógenos con especial relevancia clínica como Candida albicans o Aspergillus fumigatus (Beauvais and Latge, 2001, Drug Resist Updat, 4:38-49; Klis, et al., 2002, FEMS Microbiol Rev, 26:239-56), por lo que cabe asumir que las sustancias activas frente a S. cerevisiae, también afecten a otros géneros y especies de hongos patógenos.It is essential to highlight the structural similarity of the S. cerevisiae cell wall with that of other fungi, including pathogens with special clinical relevance such as Candida albicans or Aspergillus fumigatus (Beauvais and Latge, 2001, Drug Resist Updat, 4: 38-49; Klis, et al ., 2002, FEMS Microbiol Rev, 26: 239-56), so it can be assumed that the active substances against S. cerevisiae also affect other genera and species of pathogenic fungi.
En conclusión, es necesario descubrir nuevos agentes antifúngicos, para combatir la infecciones del hombre y los animales causadas por hongos, así como las contaminaciones por este tipo de organismos.In conclusion, it is necessary to discover new antifungal agents, to fight infection of man and animals caused by fungi, as well as contamination by this type of organisms.
Para dar respuesta a este problema, la presente invención incluye una nueva estirpe de levadura, modificada genéticamente, que permite identificar moléculas que interfieren con la biogénesis de la pared celular de los hongos, lo que facilita la identificación de un conjunto de dianas de acción farmacológica de gran relevancia, especificidad y selectividad.To respond to this problem, the present invention includes a new strain of yeast, modified genetically, which allows to identify molecules that interfere with the biogenesis of the fungal cell wall, which facilitates the identification of a set of pharmacological action targets of great relevance, specificity and selectivity.
La estirpe modificada genéticamente de la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae (estirpe BY4741; Euroscarf, Alemania), ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (Burjassot, Valencia) donde ha recibido el número de depósito 12033. Esta estirpe permite la identificación de sustancias que interfieren, directa o indirectamente, con la generación fisiológica y el mantenimiento estable de la pared celular.The genetically modified yeast strain of Saccharomyces cerevisiae model (strain BY4741; Euroscarf, Germany) has been deposited in the Spanish Type Culture Collection (Burjassot, Valencia) where he received the deposit number 12033. This strain allows the identification of substances that interfere, directly or indirectly, with the physiological generation and stable maintenance of the cell wall.
Para construir la estirpe CECT 12033 se realizó una construcción genética incluida en un vector plasmídico, preferentemente en un plásmido multicopia y, más preferentemente, en un plásmido bifuncional con capacidad para replicarse tanto en Saccharomyces cerevisiae como en Escherichia coli. Dicha construcción incluye la región promotora del gen YKL161C de S. cerevisiae, un gen marcador y la región terminadora del gen YKL161C de S. cerevisiae.To construct the CECT 12033 lineage, a genetic construction included in a plasmid vector was carried out, preferably in a multicopy plasmid and, more preferably, in a bifunctional plasmid capable of replicating both Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli . Said construction includes the promoter region of the YKL161C gene of S. cerevisiae , a marker gene and the terminator region of the YKL161C gene of S. cerevisiae .
En una realización de la invención el gen marcador confiere resistencia a un antibiótico de manera que las sustancias que afectan a la pared celular de S. cerevisiae provocan una mayor capacidad de crecimiento de la levadura en presencia de ese antibiótico. Según una realización preferida de la invención ese antibiótico es la nourseotricina.In one embodiment of the invention, the marker gene confers resistance to an antibiotic so that substances that affect the S. cerevisiae cell wall cause a greater capacity for yeast growth in the presence of that antibiotic. According to a preferred embodiment of the invention that antibiotic is nourseotricin.
Un aspecto más de la invención se refiere a la inclusión en la construcción genética del gen HIS5 que permite a la levadura crecer en ausencia del aminoácido histidina.A further aspect of the invention relates to the inclusion in the genetic construction of the HIS5 gene that allows yeast to grow in the absence of the amino acid histidine.
La invención incluye una construcción genética elaborada, siguiendo estrategias tradicionales de biología molecular, sobre un plásmido de alto número de copias de S. cerevisiae, YEp352 (Hill, et al., 1986, Yeast, 2:163-167). Como se describe en la Figura 1, en los extremos de la construcción se localizan 1189 pares de bases de la región promotora (corriente arriba del codón de iniciación) y 406 pares de bases de la región terminadora (corriente abajo del codón de terminación) del gen YKL161C, respectivamente. También se incluye la secuencia codificante del gen de resistencia al antibiótico aminoglucosidico nourseotricina (gen nat1 (Goldstein and McCusker, 1999, Yeast, 15:1541-53), aislado de la especie Streptomyces noursei), seguido del módulo heterólogo de expresión constitutiva del gen HIS5 de Schizosaccharomyces pombe procedente del plásmido pFA6a-HIS3MX6 (Wach et. al., 1997, Yeast, 13:1065-75) como marcador de selección.The invention includes a genetic construct that , according to traditional molecular biology strategies, on a plasmid copy number of high S. cerevisiae, YEp352 (Hill, et al, 1986, Yeast, 2:. 163-167). As described in Figure 1, 1189 base pairs of the promoter region (upstream of the initiation codon) and 406 base pairs of the terminator region (downstream of the termination codon) are located at the ends of the construction YKL161C gene, respectively. Followed by constitutive heterologous gene expression cassette: the coding sequence of the resistance gene aminoglycoside antibiotic nourseothricin (1541-53), isolated from Streptomyces noursei species NAT1 gene (Goldstein and McCusker, 1999, Yeast, 15) is also included HIS5 of Schizosaccharomyces pombe pFA6a from plasmid-HIS3MX6 (Wach et al, 1997, Yeast, 13:.. 1065 to 1075) as selection marker.
Como consecuencia de todo ello, la expresión del
gen de resistencia a nourseotricina queda bajo el control del
promotor del gen YKL161C, mientras que la expresión
constitutiva del gen HIS5 permite el crecimiento de la
levadura en medio de cultivo carente del aminoácido histidina. El
crecimiento en medio sin histidina posibilita la selección de
estirpes transformadas, que lleven esta construcción, las cuales se
diferencian fácilmente de la estirpe silvestre (BY4741) portadora de
una mutación en el gen HIS3 e incapaz, por tanto, de crecer
en ausencia del citado amino-
ácido.As a consequence of all this, the expression of the nourseotricin resistance gene is under the control of the promoter of the YKL161C gene, while the constitutive expression of the HIS5 gene allows the growth of yeast in culture medium lacking the amino acid histidine. Growth in a medium without histidine allows the selection of transformed lines, which carry this construction, which are easily differentiated from the wild lineage (BY4741) that carry a mutation in the HIS3 gene and, therefore, unable to grow in the absence of that Not me-
acid.
Esta invención comprende la sustitución, en la levadura S. cerevisiae, del gen YKL161C por la construcción genética incluida en el plásmido descrito anteriormente. El hecho de incorporar en sus extremos la región promotora y la terminadora del gen, permite la integración de la citada construcción en el locus del gen YKL161C mediante recombinación homóloga.This invention comprises the replacement, in S. cerevisiae yeast, of the YKL161C gene by the genetic construct included in the plasmid described above. The fact of incorporating at its ends the promoter and terminator region of the gene, allows the integration of said construction in the locus of the YKL161C gene by homologous recombination.
En la estirpe CECT 12033, el gen YKL161C ha sido sustituido por la construcción genética aquí descrita lo que permite la identificación de sustancias que interfieren, directa o indirectamente, con la generación fisiológica y el mantenimiento estable de la pared celular en presencia del antibiótico nourseotricina.In the CECT 12033 lineage, the YKL161C gene has been replaced by the genetic construction described herein which allows the identification of substances that interfere, directly or indirectly, with the physiological generation and stable maintenance of the cell wall in the presence of the nourseotricin antibiotic.
Como se comentó en el apartado sobre el estado de la técnica de la presente memoria, la transcripción del gen YKL161C se induce por parte de agentes capaces de activar la respuesta de la célula fúngica frente a perturbaciones que afectan a la estabilidad de su envoltura externa, que constituye la pared celular. Los agentes indicados pueden ser de diversos tipos, incluyendo los que perturban la estructura, degradan componentes de la misma o inhiben la biosíntesis de algunos de ellos. La principal ventaja de esta invención, frente a otros sistemas desarrollados anteriormente, es la posibilidad de rastrear, de forma específica y dirigida, en busca de sustancias con actividad antifúngica que actúan frente a la pared celular, utilizando métodos de rastreo tradicionales (a priori inespecíficos), cuya puesta a punto resulta sencilla. Además, el método de rastreo se encuentra enormemente facilitado al utilizar un organismo absolutamente carente de patogenicidad y con métodos y características de crecimiento perfectamente establecidos y caracterizados. Eventualmente, otra ventaja de utilizar S. cerevisiae consiste en que, debido a que es el organismo donde los procesos de homeostasis de la pared celular están mejor definidos y caracterizados, la información obtenida de los rastreos planteados podrá ser más fácilmente asociada a dianas específicas en la célula que faciliten en mayor medida su posible aplicación en terapéutica.As discussed in the section on the state of the art herein, the transcription of the YKL161C gene is induced by agents capable of activating the response of the fungal cell against disturbances that affect the stability of its outer envelope, which constitutes the cell wall. The agents indicated can be of various types, including those that disturb the structure, degrade components thereof or inhibit the biosynthesis of some of them. The main advantage of this invention, compared to other systems previously developed, is the possibility of tracking, specifically and directed, in search of substances with antifungal activity that act in front of the cell wall, using traditional ( a priori nonspecific tracking methods) ), whose tuning is simple. In addition, the tracking method is greatly facilitated by using an organism absolutely devoid of pathogenicity and with perfectly established and characterized methods and growth characteristics. Eventually, another advantage of using S. cerevisiae is that, because it is the organism where the cell wall homeostasis processes are better defined and characterized, the information obtained from the raised traces may be more easily associated with specific targets in the cell that facilitates to a greater extent its possible application in therapeutics.
El efecto detectado es la inducción de la expresión del gen YKL161C en presencia de agentes que perturban la pared celular. En la estirpe CECT 12033, dado que el gen YKL161C está sustituido por un gen marcador, para detectar sustancias antifúngicas con actividad sobre la pared celular se realiza la detección de la expresión de ese marcador. Con el sistema utilizado, esto se traduce en un incremento de la concentración mínima inhibitoria (CMI) para el antibiótico nourseotricina. Es decir, la estirpe recombinante CECT 12033 es incapaz de crecer en un medio de cultivo al que se le añada una determinada cantidad del antibiótico nourseotricina (ligeramente superior a la CMI en las condiciones particulares que se establezcan). Sin embargo, en presencia de una sustancia capaz de alterar la pared celular de la levadura, a una concentración subletal, la levadura crece como consecuencia de la activación del citado gen YKL161C en esta estirpe recombinante, produciéndose también la inducción de la resistencia a nourseotricina (Figura 2) debida a la expresión del gen de resistencia a este antibiótico bajo el promotor del gen YKL161C.The effect detected is the induction of YKL161C gene expression in the presence of agents that disturb the cell wall. In strain CECT 12033, since the YKL161C gene is replaced by a marker gene, the expression of that marker is detected to detect antifungal substances with activity on the cell wall. With the system used, this translates into an increase in the minimum inhibitory concentration (MIC) for the antibiotic nourseotricin. That is, the CECT 12033 recombinant strain is unable to grow in a culture medium to which a certain amount of the nourseotricin antibiotic is added (slightly higher than the MIC in the particular conditions established). However, in the presence of a substance capable of altering the yeast cell wall, at a sublethal concentration, the yeast grows as a result of the activation of the aforementioned YKL161C gene in this recombinant lineage, also inducing the induction of nourseotricin resistance ( Figure 2) due to the expression of the resistance gene to this antibiotic under the promoter of the YKL161C gene.
Figura 1. Esquema de los diferentes fragmentos genéticos que forman parte del módulo integrado en S. cerevisiae para obtener la estirpe recombinante CECT 12033.Figure 1. Scheme of the different genetic fragments that are part of the module integrated in S. cerevisiae to obtain the recombinant strain CECT 12033.
Figura 2. Niveles de crecimiento e incremento de la CMI de la estirpe CECT 12033 frente al antibiótico nourseotricina cuando se cultiva en presencia de Zimoliasa utilizando un método de microdilución.Figure 2. Growth levels and increase of the MIC of the CECT 12033 line against the antibiotic nourseotricin when grown in the presence of Zimoliasa using a microdilution method.
Figura 3. Ausencia de efecto en los niveles de sensibilidad/resistencia de la estirpe CECT 12033 en presencia de sustancias sin actividad sobre la estabilidad de la pared celular, utilizando metodología idéntica a la descrita en la Figura 2.Figure 3. Absence of effect on the levels of sensitivity / resistance of the CECT 12033 line in the presence of substances without activity on the stability of the cell wall, using methodology identical to that described in Figure 2.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no son limitativos de su alcance, que viene definido exclusivamente por la nota reivindicatoria adjunta.The present invention is further illustrated. through the following examples, which are not limiting of its scope, which is defined exclusively by the note attached claim.
Ejemplo 1Example one
En primer lugar se realizó, en un plásmido, la construcción que contenía la región promotora del gen YKLI61C, el gen de resistencia a nourseotricina, el módulo del gen HIS5 y la región terminadora del gen YKL161C.First, the construction containing the promoter region of the YKLI61C gene, the nourseotricin resistance gene, the modulus of the HIS5 gene and the terminator region of the YKL161C gene was performed on a plasmid.
Inicialmente se procedió a amplificar la región promotora del gen YKL161C desde la posición -1189 hasta la posición -1 con respecto al inicio de la secuencia codificante de dicho gen, mediante el uso de la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) utilizando una Taq DNA polimerasa con baja tasa de error. Se emplearon a tal efecto los cebadores descritos en SEQ ID NO: 1 y 2 que llevaban incluido en su extremo 5' los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción EcoRI y BamHI, respectivamente. Como molde de la reacción se utilizó DNA genómico procedente de la estirpe de levadura BY4741.Initially, the promoter region of the YKL161C gene was amplified from position -1189 to position -1 with respect to the start of the coding sequence of said gene, using the PCR technique (polymerase chain reaction) using a Taq DNA polymerase with low error rate. To this end, the primers described in SEQ ID NO: 1 and 2 were used, with the recognition sites for restriction enzymes EcoRI and Bam HI, respectively, included at their 5 'end. Genomic DNA from the yeast line BY4741 was used as the reaction template.
El producto de PCR generado fue digerido con las enzimas de restricción anteriormente referidas y clonado en el sitio de clonación múltiple del plásmido YEp352 previamente digerido con las mismas enzimas. Este plásmido es capaz de replicarse tanto en Escherichia coli como en Saccharomyces cerevisiae, y además porta como marcadores de selección los genes de resistencia a ampicilina (para E. coli) y URA3 (S. cerevisiae). De esta forma se obtuvo el plásmido pJS01.The generated PCR product was digested with the restriction enzymes referred to above and cloned into the multiple cloning site of plasmid YEp352 previously digested with the same enzymes. This plasmid is able to replicate in both Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae , and also carries as selection markers the resistance genes to ampicillin (for E. coli ) and URA3 ( S. cerevisiae ). In this way plasmid pJS01 was obtained.
A continuación, y siguiendo una estrategia idéntica a la descrita previamente, se procedió a amplificar mediante PCR el fragmento de 406 pb situado entre las posiciones +3 y +409 a partir del codón de terminación del gen YKL161C. Los cebadores utilizados fueron los descritos en SEQ ID NO: 3 y 4 que presentaban incorporados en sus extremos 5' los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción XbaI y HindIII, respectivamente. El producto de PCR obtenido fue clonado en los sitios XbaI y HindIII presentes en el plásmido pJS01 dando lugar al plásmido pJS02, de tal forma que en dicho plásmido se encontraban las secuencias correspondientes al promotor y al terminador del gen YKL161C de forma contigua en ausencia de la secuencia que codifica dicho gen.Then, and following a strategy identical to that described previously, the 406 bp fragment located between positions +3 and +409 was amplified by PCR from the termination codon of the YKL161C gene. The primers used were those described in SEQ ID NO: 3 and 4 which had the recognition sites for restriction enzymes Xba I and Hind III incorporated at their 5 'ends, respectively. The PCR product obtained was cloned into the Xba I and Hind III sites present in plasmid pJS01 giving rise to plasmid pJS02, so that said plasmid contained the sequences corresponding to the promoter and terminator of the YKL161C gene contiguously in absence of the sequence encoding said gene.
Posteriormente, entre ambas secuencias correspondientes a las regiones reguladoras del gen YKL161C, y utilizando un sitio BamHI, se procedió a donar un fragmento NcoI/ScaI de 583 pb procedente del plásmido pAG25 (Goldstein and McCusker, 1999, Yeast, 15:1541-15) que contiene el marco abierto de lectura de 573 pb correspondiente al gen de resistencia a nourseotricina (nat1). Para llevar a cabo esta clonación, al tratarse de enzimas de restricción que dejan extremos tras la digestión no compatibles, se procedió, previamente a la etapa de ligación, a la generación de extremos romos (y por tanto compatibles) utilizando la enzima Klenow tanto para el tratamiento de la digestión con BamHI como la de NcoI (téngase en cuenta que la digestión con ScaI genera extremos romos directamente). En síntesis, el plásmido obtenido (denominado pJS03) contiene la siguiente secuencia de fragmentos: región promotora del gen YKL161C-secuencia codificante del gen nat1-región terminadora de YKL161C. Es importante destacar que todas las construcciones descritas fueron verificadas mediante secuenciación automática.Subsequently, between both sequences corresponding to the regulatory regions of the YKL161C gene, and using a Bam HI site, a 583 bp Nco I / Sca I fragment from the plasmid pAG25 was donated (Goldstein and McCusker, 1999, Yeast, 15: 1541-15) containing the open reading frame of 573 bp corresponding to the nourseotricin resistance gene ( nat 1). To carry out this cloning, as they are restriction enzymes that leave extremes after digestion that are not compatible, we proceeded, prior to the ligation stage, to generate blunt (and therefore compatible) ends using the Klenow enzyme for both the treatment of digestion with Bam HI like that of Nco I (keep in mind that digestion with Sca I generates blunt ends directly). Briefly, the plasmid obtained (called pJS03) contains the following sequence fragments: gene promoter -sequence YKL161C encoding gene terminator region NAT1-YKL161C. It is important to note that all the constructions described were verified by automatic sequencing.
A continuación se digirió el plásmido pJS03 con la enzima XbaI (sitio único de corte situado entre nat1 y la región terminadora de YKL161C) para proceder, tras el correspondiente tratamiento con la enzima Klenow, a la donación del fragmento SmaI/PmeI procedente del plásmido pFA6a-HIS3MX6 que contiene el módulo heterólogo de expresión constitutiva del gen HIS5 de Schizosaccharomyces pombe (Wach et. al., 1997, Yeast, 13:1065-75) como marcador de selección. En dicho módulo la secuencia codificante del gen HIS5 se encuentra flanqueada por las secuencias reguladoras del gen TEF del hongo filamentoso Ashbya gossypii permitiendo crecer a estirpes mutantes de S. cerevisiae delecionadas en el gen HIS3 (como es el caso de la estirpe BY4741 utilizada en esta invención) en medios de cultivo carentes del aminoácido histidina como se ha descrito anteriormente en esta memoria. El plásmido así obtenido se denominó pJS04.Plasmid pJS03 was then digested with the enzyme Xba I (single cutting site located between nat 1 and the terminating region of YKL161C ) to proceed, after the corresponding treatment with the Klenow enzyme, to the donation of the Sma I / Pme I fragment from plasmid pFA6a-HIS3MX6 which contains the heterologous module of constitutive expression of the HIS5 gene of Schizosaccharomyces pombe (Wach et. al ., 1997, Yeast, 13: 1065-75) as a selection marker. In this module the coding sequence HIS5 gene is flanked by regulatory sequences TEF gene of the filamentous fungus Ashbya gossypii allowing growth to mutant strains S. cerevisiae HIS3 gene deleted in (such as BY4741 strain of used in this invention) in culture media lacking the amino acid histidine as described hereinbefore. The plasmid thus obtained was named pJS04.
Ejemplo 2Example 2
Para obtener la estirpe recombinante CECT 12033, el inserto EcoRI/HindIII del plásmido pJS04 se introdujo mediante transformación, siguiendo el método del acetato de litio (Gietz and Woods, 1994, Molecular genetics of yeast: a practical approach, pp. 121-134, UK IRL Press), en la cepa silvestre BY4741. Los transformantes con el gen YKLI61C sustituido por la construcción genética, debido a la elevada eficacia en el proceso de recombinación homóloga en S. cerevisiae, se seleccionaron por su capacidad para crecer en medio de cultivo carente del aminoácido histidina.For the CECT 12033 recombinant line, the insert Eco RI / Hind III plasmid pJS04 was introduced by transformation following the lithium acetate method (Gietz and Woods, 1994, Molecular genetics of yeast: a practical approach, pp 121-. 134, UK IRL Press), in the wild strain BY4741. The transformants with the YKLI61C gene substituted by the genetic construct, due to the high efficiency in the homologous recombination process in S. cerevisiae , were selected for their ability to grow in culture medium lacking the amino acid histidine.
Ejemplo 3Example 3
A modo de ejemplo de la aplicabilidad de la presente invención, a continuación se muestran los resultados de crecimiento celular (es decir de la determinación de la concentración mínima inhibitoria o CMI) obtenidos tras el tratamiento de la estirpe CECT 12033 con un agente de efecto conocido sobre la pared celular (Figura 2) y que, por tanto, constituye un control positivo del funcionamiento del sistema.As an example of the applicability of the present invention, the results of cell growth (i.e. the determination of minimum inhibitory concentration or MIC) obtained after treatment of the CECT 12033 line with an effect agent known on the cell wall (Figure 2) and that, therefore, It constitutes a positive control of the operation of the system.
El ejemplo que se muestra en la Figura 2 corresponde al tratamiento con Zimoliasa, una mezcla compleja de enzimas en la que la actividad \beta-1,3-Glucanásica es mayoritaria (MP Biomedicals, Inc.) y que por tanto produce daño en la pared celular al actuar sobre su armazón polisacaridico. En la Figura 2 se representa en el eje de ordenadas la densidad óptica alcanzada por el cultivo presente en cada pocillo de la placa multipocillo medida a una longitud de onda de 655 nm. En el eje de abscisas se indica de forma creciente la concentración de nourseotricina presente en cada pocillo en microgramos por mililitro. Los cuadrados corresponden a la estirpe CECT 12033 creciendo en medio YEDP (un medio de cultivo estándar para S. cerevisiae (Guthrie and Fink, 1991, Methods in Enzimology, 194:13, Academic Press Inc.), en presencia de Zimoliasa 20T a una concentración final de 5 Unidades por mililitro. Los asteriscos corresponden a los datos de crecimiento de la misma estirpe en idénticas condiciones de cultivo pero en ausencia de Zimoliasa. Los resultados demuestran que la CMI frente a nourseotricina de la estirpe CECT 12033 se incrementa aproximadamente 16 veces en presencia de este compuesto.The example shown in Figure 2 corresponds to treatment with Zimoliase, a complex mixture of enzymes in which the β-1,3-Glucanase activity is the majority (MP Biomedicals, Inc.) and therefore produces damage in the cell wall when acting on its polysaccharide framework. The optical density reached by the culture present in each well of the multiwell plate measured at a wavelength of 655 nm is shown in Figure 2. The concentration of nourseotricin present in each well in micrograms per milliliter is increasingly indicated on the abscissa axis. The squares correspond to the CECT 12033 line growing in YEDP medium (a standard culture medium for S. cerevisiae (Guthrie and Fink, 1991, Methods in Enzimology, 194: 13, Academic Press Inc.), in the presence of Zimoliasa 20T at a final concentration of 5 Units per milliliter The asterisks correspond to the growth data of the same lineage under identical cultivation conditions but in the absence of Zimoliase.The results show that the MIC against nourseotricin of the CECT 12033 line is increased approximately 16 times in the presence of this compound.
Ejemplo 4Example 4
Con este ejemplo se muestra la especificidad del sistema, ya que en presencia de un agente químico cuyo mecanismo de acción sobre la célula fúngica no afecta a la pared celular, como es el peróxido de hidrógeno, no hay efecto alguno sobre la CMI dado que la capacidad de crecimiento de la estirpe CECT 12033 es la misma en presencia o ausencia de esta sustancia (Figura 3). En la Figura 3 se representa en el eje de ordenadas la densidad óptica alcanzada por el cultivo presente en cada pocillo de la placa multipocillo medida a una longitud de onda de 655 nm. En el eje de abscisas se indica de forma creciente la concentración de nourseotricina presente en cada pocillo en microgramos por mililitro. Los cuadrados corresponden a la estirpe CECT 12033 creciendo en medio YEDP en presencia de peróxido de hidrógeno (Panreac) a una concentración final de 0,5 mM. Los asteriscos corresponden a los datos de crecimiento de la misma estirpe en ausencia de peróxido de hidrógeno.This example shows the specificity of the system, since in the presence of a chemical agent whose mechanism of action on the fungal cell does not affect the cell wall, as it is hydrogen peroxide, there is no effect on the given MIC that the growth capacity of the CECT 12033 lineage is the same in the presence or absence of this substance (Figure 3). In the figure 3 the optical density reached is plotted on the ordinate axis by the culture present in each well of the multiwell plate measured at a wavelength of 655 nm. On the axis of abscissa is increasingly indicates the concentration of nourseotricin present in each well in micrograms per milliliter. The squares correspond to the CECT 12033 line growing in the middle YEDP in the presence of hydrogen peroxide (Panreac) at a final concentration of 0.5 mM. The asterisks correspond to the growth data of the same strain in the absence of peroxide hydrogen.
En síntesis, como se puede observar en los ejemplos 3 y 4, la estirpe CECT 12033 es capaz de crecer en presencia de concentraciones superiores de nourseotricina cuando se añaden al medio sustancias que alteran la pared celular, un efecto que no se aprecia cuando la sustancia ensayada no presenta esta actividad específica de alteración de dicha pared que rodea a la célula fúngíca.In short, as can be seen in the Examples 3 and 4, the CECT 12033 line is capable of growing in presence of higher concentrations of nourseotricin when add substances that alter the cell wall to the environment, an effect which is not appreciated when the substance tested does not present this specific activity of alteration of said wall surrounding the fungal cell
Ejemplo 5Example 5
- - Preparación del cultivo de S. cerevisiae CECT 12033:- - Preparation of the cultivation ofS. cerevisiae CECT 12033:
- a)to)
- Inicialmente se procedió a cultivar la estirpe CECT 12033 en medio líquido YEPD, en agitación a 24ºC durante 16-18 horas.Initially we proceeded to cultivate the line CECT 12033 in YEPD liquid medium, under stirring at 24 ° C for 16-18 hours.
- b)b)
- Posteriormente, con el fin de conseguir células en fase exponencial de crecimiento, se procedió a diluir el cultivo anterior en medio fresco a una densidad óptica de 0,2-0,4, medida a 600 nm en un espectrofotómetro, para proseguir con el cultivo incubando durante 2 horas en las condiciones anteriormente descritas.Subsequently, in order to get exponentially growing cells, we proceeded to dilute the previous culture in fresh medium at an optical density of 0.2-0.4, measured at 600 nm in a spectrophotometer, to continue the culture by incubating for 2 hours in the conditions described above.
- c)C)
- Finalmente se preparó una suspensión celular, en agua destilada estéril, a una densidad óptica de 600 nm de 0,13, que equivale a una concentración de 2x10^{6} células/ml.Finally a suspension was prepared cell, in sterile distilled water, at an optical density of 600 nm of 0.13, which is equivalent to a concentration of 2x10 6 cells / ml.
- - Ensayo de resistencia en placa multipocillo: Para determinar el efecto de la Zimoliasa sobre la pared celular se procedió a realizar dicha determinación en placas multipocillo formato 96 (NUNCLON^{TM}). Este formato, por tanto, permitiria el ensayo de 96 sustancias diferentes de forma simultánea. En el ejemplo concreto que se describe se utilizó 100 \mul de medio de cultivo YEPD en el pocillo, incluyendo 5U por mililitro de Zimoliasa 20T, además de una concentración de nourseotricina (6,25 microgramos por mililitro), previamente observada como inhibidora del crecimiento de la estirpe CECT 12033 (CMI) creciendo en YEPD. Por último, se inocularon en el volumen de medio anteriormente citado aproximadamente 10000 células (5 \mul de la suspensión final citada en el punto anterior).- - Plate resistance test multiwell: To determine the effect of Zimoliase on the cell wall this determination was made on plates multiwell 96 format (NUNCLON ™). This format, therefore, would allow testing of 96 different substances in a way simultaneous. In the specific example described, 100 µL of YEPD culture medium in the well, including 5U per milliliter of Zimoliasa 20T, in addition to a concentration of nourseotricin (6.25 micrograms per milliliter), previously observed as a growth inhibitor of the CECT 12033 line (CMI) growing in YEPD. Finally, they were inoculated in the volume of above-mentioned medium approximately 10,000 cells (5 µl of the final suspension mentioned in the previous point).
- - Lectura de resultados: después de 28 horas de incubación en estufa a 30ºC, sin agitación, se procedió a la cuantificación del crecimiento mediante lectura de la absorbancia (\lambda = 655 nm) en lector de placas (Model 680, BioRad). Se pudo observar que la estirpe CECT 12033 creciendo en presencia de Zimoliasa presentaba un crecimiento significativo a 6,25 microgramos por mililitro de nourseotricina (es decir un incremento de la CMI en estas condiciones), indicando por tanto la actividad de dicha sustancia a nivel de la integridad de la pared celular.- - Reading results: after 28 hours of incubation in an oven at 30 ° C, without stirring, we proceeded to the quantification of growth by reading the absorbance (λ = 655 nm) in plate reader (Model 680, BioRad). It was observed that the CECT 12033 line growing in The presence of Zimoliasa showed significant growth at 6.25 micrograms per milliliter of nourseotricin (i.e. a increase of the CMI in these conditions), thus indicating the activity of said substance at the level of wall integrity mobile.
Claims (14)
- a.to.
- una estirpe de Saccharomyces cerevisiae donde el gen YKL161C está reemplazado por un gen marcador que queda bajo el control del promotor del gen YKL161C que ha sido sustituido;a strain of Saccharomyces cerevisiae where the YKL161C gene is replaced by a marker gene that is under the control of the YKL161C gene promoter that has been replaced;
- b.b.
- la incubación de la estirpe en presencia de concentraciones subletales de una sustancia con potencial para afectar a la pared celular de la levadura;the lineage incubation in the presence of sublethal concentrations of a substance with potential to affect the cell wall of the yeast;
- c.C.
- la medición de la expresión del gen marcador.the Measurement of marker gene expression.
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