ES2301439B1 - Uso de aminoacido tipo micosporina (m-gly) como antioxidante o aditivo en productos alimentarios. - Google Patents
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Abstract
Uso de aminoácido tipo micosporina
(M-gly) como antioxidante o aditivo en productos
alimentarios. La presente invención se encuadra en el sector
biotecnológico y describe el potencial uso de un aminoácido tipo
micosporina, concretamente de M-gly aislado del
liquen marino Lichyna pygmaea, como potencial antioxidante o
aditivo en la preparación de productos de la industria alimentaria
tales como preparados nutracáuticos o alimentos funcionales.
Description
Uso de aminoácido tipo micosporina
(M-gly) como antioxidante o aditivo en productos
alimentarios.
La presente invención se encuadra en el sector
biotecnológico y describe el potencial uso de un aminoácido tipo
micosporina, concretamente de M-gly aislado del
liquen marino Lichyna pygmaea, como potencial antioxidante o
aditivo en la preparación de productos de la industria alimentaria
tales como preparados nutracéuticos o alimentos funcionales.
La radiación ultravioleta es uno de factores
biológicos que limitan la supervivencia, fisiología y crecimiento
de muchos organismos. Algunos de los múltiples efectos dañinos de la
radiación UV incluye la alteración de moléculas de ADN y proteínas,
inactivación de enzimas y a la formación de radicales libres, los
cuales atacan a membranas celulares y otras moléculas diana
alterando su funcionalidad. Todos los organismos aerobios disponen
de una gran variedad de sistemas de defensa antioxidante tanto
enzimáticos como no enzimáticos que se coordinan cooperativamente y
protegen al organismo de los riesgos que conlleva el estrés
oxidativo. Entre ellos destacan las actividades enzimáticas de la
superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPX) y catalana
(CAT); además del ácido ascórbico (vitamina C),
\alpha-tocoferol (vitamina E), glutatión (GSH),
\beta-caroteno, vitamina A, flavonoides y ácidos
fenólicos entre otros.
Se entiende por radical libre a cualquier
especie química que contiene uno o más electrones desapareados en
sus orbitales externos de manera que un compuesto puede convertirse
en radical libre captando o perdiendo un electrón. Aunque existen
radicales libres de muy distinta naturaleza, son las especies que
derivan de la molécula de oxígeno (ROS) las más abundantes en los
organismos aerobios destacando productos de la ruptura o la
excitación del O_{2} como el oxígeno singlete ^{1}O_{2} y
especies de oxígeno que están parcialmente reducidas como el
radical hidroxilo (OH\bullet), aniones superóxido (O_{2}^{-})
y peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}). Estas moléculas
inestables recorren el organismo tornando electrones con lo que
recuperan su estabilidad electroquímica, esto las hace muy
peligrosas porque para conseguirlo atacan moléculas estables. Una
vez que el radical libre ha conseguido tomar el electrón que
necesita para emparejar su electrón libre, la otra molécula se
convierte a su vez en un radical libre, iniciándose así un ciclo
destructivo para nuestras células.
Los radicales libres dan lugar a alteraciones
importantes en moléculas como ADN, lípidos y proteínas, alterando
gravemente el ciclo y la funcionalidad celular. El ADN puede sufrir
pérdida de bases así como la ruptura de una o de ambas hebras del
material genético, alteraciones que pueden traducirse en mutaciones
irreversibles. Muchas proteínas son capaces de absorber una gran
cantidad de oxidaciones sin que aparentemente se vea afectada su
función. Sin embargo, es indudable que las consecuencias de las
alteraciones en algunas funciones, por ejemplo, la recepción y
transmisión de señales, el transporte de iones, la duplicación y
reparación del ADN, las respuestas a condiciones de tensión y el
metabolismo energético, la transcripción y traducción pueden ser
críticas para la célula. Los daños producidos por el OH\bullet y
el ^{1}O_{2} son irreversibles y en términos generales marcan
las proteínas para su degradación. Las membranas celulares también
pueden resultar seriamente dañadas en situación de estrés oxidativo
ya que fosfolípidos que tienen ácidos grasos con varios dobles
enlaces son muy susceptibles a la oxidación por pérdida de un
hidrógeno (alílico).Una vez generado el radical carbono en un ácido
graso, éste reacciona con el oxígeno molecular formando un radical
peroxilo. El radical peroxilo puede tomar un hidrógeno alílico a
otro metileno con lo cual se propaga la reacción. Los
hidroperóxidos, que son compuestos estables, si entran en contacto
con iones metálicos de transición producirán más radicales libres
que iniciarán y propagarán otras reacciones en cadena. Así, las
membranas resultan seriamente dañadas y por tanto su funcionalidad
se ve
alterada.
alterada.
Los radicales libres se asocian con un amplio
rango de patologías y enfermedades como el Alzheimer o el Parkinson
y afecciones relacionadas con la exposición solar como la aparición
de cataratas, fotoenvejecimiento, episodios inflamatorios y
neoplasias. También son los responsables de la oxidación de las
grasas de los alimentos, que es la forma de deterioro más
importante después de las alteraciones producidas por
microorganismos. Con la oxidación, aparecen olores y sabores a
rancio, se altera el color y la textura, y desciende el valor
nutritivo al perderse algunas vitaminas y ácidos grasos
poliinsaturados. Además, los productos formados en la oxidación
pueden llegar a ser nocivos para la salud.
Los aminoácidos tipo micosporina están
constituidos por un anillo de ciclohexenona o de ciclohexenimina,
conjugado con un sustituyente nitrogenado de un aminoácido o su
aminoalcohol que actúa como cromóforo permitiendo la absorción de
determinada radiación de onda corta. Los metabolitos que se aíslan
en hongos presentan un rango de absorción entre 310 y 320 nm y
poseen anillos de ciclohexenona exclusivamente, conociéndoseles por
el nombre de micosporinas en referencia a su origen. Por el
contrario, los metabolitos que se aíslan de organismos marinos y
algas contienen anillos de ciclohexenimina, con absorciones máximas
entre 310 y 360 nm y se les conoce con el nombre de aminoácidos
tipo micosporina ó MAAs. Aún así, la
mycosporine-glycine (M-gly) y la
mycosporine taurine son aminociclohexenonas aisladas de organismos
marinos. En la actualidad hay descritas 13 micosporinas distintas en
hongos y 23 MAAs en organismos marinos. Son moléculas pequeñas, con
pesos moleculares que rondan los 330 Da y presentan una alta
fotoestabilidad. Se comportan como moléculas anfóteras, similares a
los aminoácidos, de manera que presentan cargas positivas y
negativas en la misma molécula. Muestran características
físico-químicas propias de compuestos iónicos por
ejemplo alto punto de efusión y alta solubilidad en
agua.
agua.
Son muchas las funciones que se les ha atribuido
a estas moléculas en el organismo: desde osmolito orgánico en
comunidades cianobacterianas Chlorogloeopsis, pigmentos
accesorios fotosintéticos o precursores de estos, a moléculas
determinantes en procesos reproductivos de algunas especies de
peces, sin embargo es el papel fotoprotector frente a la radiación
UV el más aceptado y documentado ya que al parecer actúan
protegiendo parcialmente a los componentes celulares y procesos
fisiológicos. Un número de trabajos han evaluado este tipo de
moléculas por sus actividad como fotoprotectores de uso tópico
vehiculizando extractos naturales con un alto porcentaje de MAAs y
viendo su FPS y su potencial fotoprotector en células vegetales,
queratinocitos humanos, etc. (Patente US 6787147; Patente WO
02/39974; Patente WO 03/020236). También se han publicado trabajos
que hacen referencia a las propiedades antioxidativas de extractos
obtenidos de algas y corales.
Dunlap y Yamamoto en 1995 (Comp. Biochem.
Physiol. 112: 105-114) apuntaron a una posible
actividad antioxidante de mycosporine-glycine
mediante ensayos in vitro de peroxidación lipídica (método
de la fosfatidilcolina) a partir de extractos de organismos marinos
que contenían MAAs, mientras que otras iminoMAAs como porphyra 334,
shinorine, palythine, asterine 330 y palythinol se mostraban
oxidativamente robustas y no participaban en reacciones de
oxidación-reducción. No obstante, como se ha
indicado, dichos ensayos fueron realizados con extractos algales
que contenían además de MAAs un alto porcentaje de otros componentes
celulares como polisacáridos, enzimas, etc., por lo que no es
posible afirmar firmemente la actividad antioxidante de
mycosporine-glycine (o M-gly) en
base a dicho trabajo.
Nakayama y colaboradores en 1999 (J. Am. Oil
Chem. Soc., 76: 649-653) aislaron un nuevo
aminoácido tipo micosporina del alga roja Porphyra yezoensis
llamado usujilene, ya identificado en Palmaria palmata pero
no en ninguna especie de Porphyra. Sus resultados indicaban
que tal MAA mostraba actividad antioxidante frente a la autoxidación
del ácido linoleico (Métodos del ácido tiobarbitúrico y tiocianato
férrico), donando determinados hidrógenos a radicales lipídicos
LOO- y dando lugar a moléculas de MAAs estabilizadas por resonancia
al igual que el
\alpha-tocoferol.
\alpha-tocoferol.
Suh y colaboradores en 2003 (Photochem.
Photobiol. 78: 109-113) sugieren también la función
antioxidante de la M-gly, pero probablemente
actuando junto con otros MAAs activos. La M-gly,
entre otros, podría jugar un importante papel participando en la
eliminación de O_{2}^{-} generado por sistemas
fotosintetizadores endógenos.
Yakovleva y colaboradores en 2004 (Comp.
Biochem. Physiol., 139: 721-739 examinaron la
importancia de la M-gly como antioxidante funcional
frente a estrés térmico en dos corales, Platygyra
ryukyuensis y Stylophora pistillata, en base a la
correlación entre el grado de susceptibilidad y la concentración
endógena de M-gly.
También la patente US2004228875 hace referencia
a las propiedades antioxidativas de extractos obtenidos a partir de
algas del género Porphyra, aunque sin concluir sobre el
posible papel jugado por MAAs.
Publicaciones más recientes analizan las
propiedades antioxidativas de extractos obtenidos a partir de algas
pero sin concretar la participación de MAAs (Yuan y colaboradores,
2005, Food Chem. Toxicol., 43: 1073-1081; Duda y
colaboradores, 2005, J. Food Compos. Anal., 18:
625-633).
Se puede concluir, por tanto, que el papel
antioxidante de los iminoMAAs como tales, es decir, purificados o
aislados en un alto grado de pureza, no se conoce bien, como tampoco
su comportamiento a nivel de secuestro de radicales libres
hidrosolubles.
Un antioxidante se define como una sustancia que
en bajas concentraciones comparado con un substrato oxidable,
retrasa o previene su oxidación. La presente invención describe la
potencialidad del MAA M-gly aislado de Lichina
pygmaea como secuestrador de radicales e inhibidor de la
peroxidación lipídica. En los ensayos realizados, el nuevo
antioxidante es comparado con otro antioxidante ya conocido, el
\alpha-tocoferol. El compuesto descrito podría
utilizarse en aplicaciones terapeúticas, y en aplicaciones no
médicas para la estabilización de compuestos susceptibles del
deterioro oxidativo, en la preservación de alimentos o productos
relacionados, y en complementos nutricionales, nutracéuticos,
alimentos funcionales o de parafarmacia por sus propiedades
antioxidantes para prevenir el estrés
oxidativo.
oxidativo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención presenta un compuesto
aislado de Lichina pygmaea con la siguiente estructura y de
utilidad como antioxidante y secuestrador de radicales libres.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han purificado compuestos del tipo
aminoácidos tipo micosporina en fase acuosa partiendo de Lichyna
pygmaea. Los compuestos se han detectado y caracterizado por
HPLC. Se empleó un detector UV-visible (detector de
fotodiodos 996), que medía la absorbancia para cada muestra entre
los 290 y 400 nm. Una vez extraído el cromatograma a 330 nm, se
identificaron los picos por co-cromatografia según
sus espectros y tiempos de retención, comparándose con estándares
de MAAs.
La extracción a escala preparativa se realizó
disolviendo 60-80 g (PF) de material biológico en 1
litro de metanol al 20% v/v e incubándose en un baño termostático a
45ºC durante 2 horas. Posteriormente se centrifuga el extracto a
14000 rpm durante 15 min y rotavaporación a 45ºC para eliminar
parte del metanol de la muestra.
La purificación se realizó en tres pasos
consecutivos en los que se combinan técnicas cromatográficas de
absorción mediante la aplicación de carbono activo, precipitación de
polisacáridos al añadir a la muestra metanol 100% y separación
final mediante cromatografía de intercambio iónico. Finalmente se
obtuvieron soluciones acuosas de MAA en alto grado de pureza en
concentraciones del orden de mM.
Para medir la actividad como secuestrador de
radicales hidrosolubles se ha utilizado el método de la ABTS
pe-
roxidasa, el cual permite determinar la actividad antioxidante total (TAA) de una muestra entendida como un parámetro que permite cuantificar la capacidad de una muestra, natural o procesada, de secuestrar radicales libres presentes en una solución acuosa.
roxidasa, el cual permite determinar la actividad antioxidante total (TAA) de una muestra entendida como un parámetro que permite cuantificar la capacidad de una muestra, natural o procesada, de secuestrar radicales libres presentes en una solución acuosa.
M-gly aislado de Lichina
pygmaea inhibe la producción de radicales libres hidrosolubles
(ABTS^{+}). La capacidad de inhición de M-gly
aislado de Lichina pygmaea es dependiente del pH del medio de
reacción, alcanzando los mejores resultados a pH 8, al contrario que
el ácido ascórbico, que pierde actividad al alcalinizarse el medio.
M-gly aislado de Lichina pygmaea podría
utilizarse como inhibidor de procesos oxidativos en medios básicos,
complementando a otros antioxidantes que pierden efectividad a tal
pH.
M-gly aislado de Lichina
pygmaea se estudió como inhibidor de la peroxidación lipídica
in vitro mediante la técnica de decoloración del
\beta-caroteno. El método de decoloración del
\beta-caroteno es ampliamente utilizado para la
determinación de la capacidad antioxidante de diversas sustancias
en medio lipofilico, la mayoría de ellas extraídas de frutas,
vegetales y demás productos destinados a consumo alimentario para
poder determinar su mayor o menor grado de autoconservación en
estado natural. En este ensayo, como control positivo se utilizó el
\alpha-tocoferol
(\alpha-TOC).
M-gly aislado de Lichina
pygmaea muestra actividad antioxidante baja a nivel de
inhibición de la peroxidación lipídica. Se constituye, pues, como un
antioxidante de actividad baja in vitro.
El protocolo que se llevó a cabo fue basado en
Marklund & Marklund (1974, Eur. j. Biochem., 47:
469-474) con algunas modificaciones. Relaciones de
dosis-respuesta para las MAAs objeto de estudio se
determinaron a diferentes concentraciones.
M-gly aislado de Lichina
pygmaea no inhibe la cinética de oxidación del pirogalol.
M-gly aislado de Lichina
pygmaea, en extractos o preparados que lo contengan, podría
utilizarse en preparados o formulaciones farmaceúticas para la
prevención y el tratamiento terapéutico de enfermedades o
afecciones relacionadas con los radicales libres hidrosolubles, en
productos de parafarmacia, en alimentos funcionales, complementos
nutricionales y preparados nutracéuticos, y en la industria
alimentaria (aditivo).
Figura 1. Área (%) de picos eluídos y
concentraciones expresadas en mg g^{-1} PS de diferentes MAAs
presentes en extractos metanólicos de las algas Porphyra
leuwosticta, Gymnogongrus devoniensis, Gelidium
sesquipedale y del liquen Lichina pygmaea. Se observa la
presencia de un tipo de MAA mayoritario en cada organismo (> 66%)
junto con otras MAAs minoritarias y trazas de sustancias no
identificadas.
Figura 2. Cromatograma de un extracto acuoso de
M-gly aislado de Lichyna pygmaea eluído de
la columna cargada con resina DOWEX.
Figura 3. Porcentaje de inhibición de la
cinética de generación del radical ABTS^{+} por
M-gly a distintos pH y a distintas concentraciones
de ensayo. Se compara con L-ascórbico. Se observa
que a medida que aumenta el pH del medio aumenta la efectividad de
la molécula al contrario que el L-ascórbico.
Figura 4. Tabla. Dosis (\muM) - respuesta de
la actividad antioxidante (%) de M-gly aislado de
Lichyna pygmaea con respecto a 10 \muM de
\alpha-tocoferol por el método de decoloración
del \beta-caroteno. Los valores representan los
valores medios y desviación estándar de 3 experimentos.
Se ha purificado compuestos del tipo aminoácidos
tipo micosporina en fase acuosa partiendo de Lichina
pygmaea. Los compuestos se han detectado y caracterizado por
HPLC (Waters 600). La columna empleada para la separación de los
MAAs en el HPLC fue una C_{8} (Sphereclone^{TM}, Phenomenex,
Aschaffenburg, Alemania), empaquetada con micropartículas porosas
de silica de 5 mm de diámetro con superficie derivatizada con una
cadena alifática de 8 átomos de carbono (octadecil silano). Su
tamaño era de 250 x 4.6 mm. Se empleó una precolumna (Phenomenex,
Aschaffenburg, Alemania) afin a la columna empleada. La fase móvil
que se empleó fue metanol al 2.5% (v/v, calidad HPLC) más 0.1% de
ácido acético (v/v) bombeada isocráticamente a una velocidad de
flujo de 0.5 ml min^{-1}. Se empleó un detector
UV-visible (detector de fotodiodos 996), que medía
la absorbancia para cada muestra entre los 290 y 400 nm. En la
figura 1 vienen recogidos los porcentajes en área de los picos
cromatografiados de distintos extractos algales, algunos
identificados como MAAs y otros desconocidos. El objetivo de la
purificación fue aislar en fase acuosa el MAA mayoritario en
Lichina pygmaea además de eliminar trazas y otro tipos de
compuestos no identificados.
Una vez extraído el cromatograma a 330 nm, se
identificaron los picos por co-cromatografía según
sus espectros y tiempos de retención, comparándose con estándares de
MAAs, proporcionados por el profesor Dr. Ulf Karsten (Universidad de
Rostock, Alemania) extraídos de distintos organismos marinos:
Mastocarpus stellatus (shinorine), Porphyra yezoensis
(porphyra-334), Bostrychia scorpioides
(palythine), los ojos de la trucha del coral Plectropomus
leopardus (asterine 330) y el liquen Lichina pygmaea
recolectado en Francia (M-gly). El cromatograma de
los extractos recogidos después del paso por la columna de
intercambio iónico DOWEX50 se muestran en la figura 2.
M-gly apareció en un alto grado de pureza,
observándose la ausencia de compuestos desconocidos con picos de
absorción entre los 320 - 330 nm.
La extracción a escala preparativa se realizó
disolviendo 60-80 g (PF) de material biológico en 1
litro de metanol al 20% v/v e incubándose en un baño termostático a
45ºC durante 2 horas. Posteriormente se centrifuga el extracto a
14000 rpm durante 15 min y rotavaporación a 45ºC para eliminar
parte del metanol de la muestra.
La purificación se realiza en tres pasos
consecutivos en los que se combinan técnicas cromatográficas de
absorción mediante la aplicación de carbono activo, precipitación de
polisacáridos al añadir a la muestra metanol 100% y separación
final mediante cromatografia de intercambio iónico (resina Dowex 50
W x 8-100). Para la elución del aminoácido tipo
micosporina M-gly se utilizó como eluyente agua
bidestilada, con un pH ligeramente alcalino (7.2). Finalmente se
obtuvieron soluciones acuosas de MAA en alto grado de pureza en
concentraciones del orden de mM.
Para medir la actividad como secuestradores de
radicales hidrosolubles se ha utilizado el método de la ABTS
pe-
roxidasa, el cual permite determinar la actividad antioxidante total (TAA) de una muestra entendida como un parámetro que permite cuantificar la capacidad de una muestra, natural o procesada, de secuestrar radicales libres presentes en una solución acuosa. Este parámetro está orientado a dar información de la actividad antioxidante que puede presentar una muestra concreta con independencia de las actividades parciales que puedan presentar cada uno de sus componentes o los efectos de sinergismo que pudiesen establecerse.
roxidasa, el cual permite determinar la actividad antioxidante total (TAA) de una muestra entendida como un parámetro que permite cuantificar la capacidad de una muestra, natural o procesada, de secuestrar radicales libres presentes en una solución acuosa. Este parámetro está orientado a dar información de la actividad antioxidante que puede presentar una muestra concreta con independencia de las actividades parciales que puedan presentar cada uno de sus componentes o los efectos de sinergismo que pudiesen establecerse.
El
2,2'-Azino-bis-(3-etil-benzotiazolina-6-ácido
sulfónico) o ABTS es un compuesto que presenta gran estabilidad
química, alta solubilidad en agua y un máximo de absorción en la
banda del UVA a 342 nm. Este compuesto en presencia de
H_{2}O_{2} y enzimas peroxidasas deriva a un radical
metaestable (ABTS^{+}) con un espectro de absorción característico
y diferente al ABTS, presentando máximos de absorción en la región
espectral del UV y visible a 413, 645, 727 y 811 nm.
El ABTS es un producto que presenta gran
estabilidad en un amplio rango de pH, mostrando el mismo espectro
de absorbancia a pH 4 y pH 8.5. Así mismo, la formación del radical
ABTS^{+} también se lleva a cabo en ese rango de pH pero la
actividad enzimática de la peroxidasa sí que es dependiente del pH
del medio de reacción de manera que al alcalinizarse éste la
actividad disminuye, aumentando así el periodo de retardo o "lag
time". La actividad de nuestra enzima se podría ajustar a una
curva exponencial de manera que es máxima a pH 4.5 y deja de ser
activa a pH superiores a 10. Nuestros ensayos discurrirán a pH
6-8.5 de manera que aseguramos la actividad de la
enzima.
La cuantificación de la capacidad de secuestro
de radicales libres de una muestra se llevan a cabo mediante
ensayos de decoloración en los cuales la formación de ABTS^{+} da
lugar a una coloración característica que disminuirá de manera
proporcional a la cantidad de sustancias con capacidad de atrapar
estos radicales que se le añadan al volumen de reacción. Esta
pérdida de color puede medirse mediante seguimientos cinéticos de
pérdida de absorbancia a 413 nm (longitud de onda que no interfiere
con otras moléculas) a lo largo de un minuto utilizando como
peroxidasa la HRP y como control negativo el ácido ascórbico
(L-ASC). El medio de reacción se compone de tampón
fosfato 50 mM pH 6, 7.5, 8, H_{2}O_{2} 2 mM, ABTS 2 mM, enzima
HRP 0.25 \muM y muestra a concentraciones crecientes.
El cálculo de TAA se establece según la relación
entre las pendientes (Abs/min) de ensayos enzimáticos en los cuales
el curso de la reacción es estimado en ausencia de antioxidantes
(control positivo), y en presencia de diferentes concentraciones de
sustancias con posible actividad antioxidante. De este modo, la
pendiente de la cinética control correspondería a una TAA del cero
por ciento, calculándose en base a ésta los
\hbox{porcentajes de inhibición de las demás curvas.}
La peroxidación lipídica es un mecanismo bien
establecido de daño celular en plantas y animales, así como de
deterioro de alimentos (enranciamiento). Este proceso conduce a la
producción de peróxidos lipídicos y aldehídos de degradación que
conlleva pérdida de la función de la membrana celular y de su
integridad. M-gly aislado de Lichina pygmaea
se estudió como inhibidor de la peroxidación lipídica in
vitro mediante la técnica de decoloración del
\beta-caroteno.
El método de decoloración del
\beta-caroteno es ampliamente utilizado para la
determinación de la capacidad antioxidante de diversas sustancias en
medio lipofílico, la mayoría de ellas extraídas de frutas,
vegetales y demás productos destinados a consumo alimentario para
poder determinar su mayor o menor grado de autoconservación en
estado natural. Se trata de un método espectrofotométrico que mide
la inhibición que causa un antioxidante sobre la decoloración del
\beta-caroteno en un sistema acuoso emulsificado
con Tween 20 y ácido linoleico.
El ácido linoleico se autoxida a una alta
velocidad ante la presencia de átomos de hidrógeno especialmente
activados. El \beta-caroteno, precursor de la
vitamina A, también es conocido como antioxidante lipofílico que
previene de la peroxidación lipídica en membranas secuestrando
moléculas de oxígeno singlete y radicales lipidicos peroxilos. El
\beta-caroteno, cuando se encuentra en presencia
de ácido linoleico, cede electrones retardando la etapa de
iniciación del proceso de autooxidación del ácido linoleico así como
limitando la fase de propagación del daño al eliminar
simultáneamente radicales peróxidos formados. Si añadimos una nueva
sustancia con posible capacidad antioxidante al medio de reacción
que contiene ácido linoleico y \beta-caroteno,
ésta nueva sustancia tenderá a oxidarse ella preferentemente al
\beta-caroteno, compitiendo con este por el
secuestro de estos radicales.
El \beta-caroteno presenta un
máximo de absorción a 470 nm. Este máximo varía cuando la molécula
se oxida ya que pierde dobles enlaces y la estructura del cromóforo
de la molécula se ve alterada, perdiendo así su característico
color naranja y pudiendo ser detectado espectrofotométricamente. La
absorbancia del medio de reacción permanecerá invariable a lo largo
del tiempo en presencia de sustancias antioxidantes, advirtiéndose
una caída en la absorbancia de la muestra cuando se mida en
ausencia de antioxidantes. Así pues, la medida de la capacidad
antioxidante de una sustancia será inversamente proporcional a la
caída de pendiente de la curva que describe la oxidación del
\beta-caroteno (medida a longitud de onda de 470
nm).
En este ensayo, como control positivo se utilizó
el \alpha-tocoferol
(\alpha-TOC).
La actividad de la solución se evaluó según el
grado de decoloración del \beta-caroteno,
aplicando la fórmula propuesta por Hidalgo y colaboradores (1994,
Phytochemistry, 37: 158-1587) con algunas
modificaciones:
AA = [P\
muestra - P\ control / P\ Patrón - P\ control] \cdot
100
P hace referencia a las pendientes de las curvas
de decoloración obtenidas (Abs/tiempo). Para ello ajustamos mediante
regresión lineal la parte de la curva cinética que describe un
comportamiento lineal. Los coeficientes de correlación para cada
réplica de cada muestra eran todos superiores a 0.98.
Los radicales superóxidos (O_{2}^{-}) son
mediadores de reacciones de autooxidación de algunos compuestos. La
mayoría de las veces estos compuestos oxidados se caracterizan por
poseer un espectro de absorción característico y cuantificable por
espectrofotometría.
El pirogalol
(1,2,3-benzenotriol) es una sustancia que se
autooxida rápidamente en presencia de oxígeno especialmente en
soluciones alcalinas. A pH 7.9 la SOD inhibe el 99% de la reacción
indicando una participación prácticamente total del anión superóxido
O_{2}^{-} en la reacción. El pirogalol oxidado presenta un
máximo de absorción a 420 nm de manera que la capacidad de las MAAs
para secuestrar radicales superóxido fue medida como pérdida de
absorbancia de ensayos cinéticos monitorizados
espectrofotométricamente (Shimadzu UV 1603) durante un minuto de
reacción. El protocolo que se llevó a cabo fue basado en Marklund
& Marklund (1974, Eur. j. Biochem., 47:
469-474) con algunas modificaciones. La mezcla
reacción contenía 0.4 mM de pirogalol y el MAA a diferentes
concentraciones en 50 mM de tampón fosfato a pH 8.2, conteniendo 1
mM de ácido dietilenotriaminopentaacético en un volumen final de
incubación de 1 ml. La temperatura se mantuvo estable a 20 \pm
1ºC. El control positivo fue la curva cinética de generación de
radicales de pirogalol oxidado en ausencia de antioxidantes para
compararlos con distintas concentraciones de SOD como antioxidante
conocido. Relaciones de dosis-respuesta para las
MAAs objeto de estudio se determinaron a diferentes concentraciones.
La capacidad de secuestro de radicales superóxido de los extractos
purificados se evaluó siguiendo la siguiente fórmula:
AA= 100 - [P\
muestra \cdot 100/ P\
control]
P hace referencia a las pendientes de las curvas
cinéticas de oxidación del pirogalol (Abs/tiempo).
Claims (1)
1. Uso del extracto de aminoácido tipo
micosporina M-gly extraído del liquen marino
Lichina pygmaea como potencial antioxidante o aditivo en la
preparación de productos de la industria alimentaria tales como
preparados nutracéuticos o alimentos funcionales.
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