ES2296834T3 - Inhibidores de la catepsina y para el desarrollo de un medicamento para el tratamiento del dolor. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para el desarrollo de un medicamento para el tratamiento del dolor que comprende el uso de una secuencia de polinucleótidos, seleccionada de SEQ ID No: 1, 2 ó 4, que codifica la Catepsina Y, o los homólogos, o la proteína/polipéptido correspondiente, que comprende la determinación de la eficiencia de un compuesto o agente en un modelo de dolor, en el que la eficiencia del compuesto o agente se determina mediante la consideración de la tasa de expresión del gen o mediante la consideración de la actividad de la proteína.
Description
Inhibidores de la catepsina y para el desarrollo
de un medicamento para el tratamiento del dolor.
La presente invención se refiere al uso de una
secuencia de polinucleótidos que codifica Catepsina Y o una
secuencia de aminoácidos de la proteína Catepsina Y, para la
caracterización o identificación de agentes terapéuticos para el
dolor, al uso de tales secuencias para el desarrollo de un
medicamento y a agentes útiles como medicamentos para el
tratamiento del dolor.
El tratamiento efectivo del dolor requiere una
comprensión de su fisiología. Es muy conocido, sin embargo, que los
estímulos que activan los receptores del dolor en un tejido podrían
no activar los receptores del dolor en otros. Por ejemplo, un
pinchazo o un corte que causan dolor en los tejidos de la piel, no
causan dolor en el estómago o en el intestino. Las causas del dolor
en el músculo esquelético, las articulaciones y las arterias pueden
diferir también. "Principles of Neurology", 6ª ed., Adams, R.
D. et al., eds. McGraw-Hill, 1997, pp.
133-134. Consecuentemente, los procedimientos útiles
para aliviar un tipo de dolor son, a menudo, menos efectivos, o
incluso inefectivos, cuando se aplican para el alivio de otros. En
general, el dolor neuropático es persistente y se caracteriza por
sensaciones de ardor, retortijones, dolor constante, punzadas o
pinchazos. Está asociado frecuentemente con hiperestesia,
hiperalgesia, alodinia e hiperpatía y en algunos casos con déficit
sensorial o disfunción autonómica. Desafortunadamente, y a
diferencia de otros tipos de dolor, el dolor neuropático tiende a
responder mal a la medicación analgésica. "Principles of
Neurology", 6ª ed., Adams, R. D. et al., eds.
McGraw-Hill, 1997, pp. 140.
Dependiendo de los nervios implicados, un
ejemplo particular de dolor neuropático se puede clasificar como
una neuropatía central o periférica. Las neuropatías centrales
surgen por lesión o enfermedad en la médula espinal, en el tallo
encefálico, talámica y cerebral, mientras que las neuropatías
periféricas surgen de la lesión o enfermedad de los nervios
periféricos. Las neuropatías periféricas incluyen, pero no se
limitan a: síndromes de obstrucción de la salida torácica;
neuropatías por compresión y atrapamiento, tales como la parálisis
del nervio ulnar, el síndrome del túnel carpiano, la parálisis del
nervio peroneal, la parálisis del nervio radial; y el síndrome de
Guillain-Barré. "The Merck Manual", 16ª ed.,
1518-1522 (1992).
El dolor neuropático, o neurogénico, surge de la
estimulación directa del tejido nervioso. El dolor neuropático
abarca una amplia variedad de trastornos que implicar un único o
múltiples nervios. Estos incluyen, pero no se limitan a, neuralgia
trigeminal y trastornos debidos a herpes zoster, diabetes y trauma
(que incluye la causalgia); aracnoiditis espinal y lesiones de la
médula espinal; y síndrome de dolor talámico de
Dejerine-Roussy. "Principles of Neurology" 6ª
ed., Adams, R. D. et al., eds. McGraw-Hill,
1997, pp. 140.
El dolor neuropático está causado por una
variedad de factores que incluyen, pero no se limitan a: trauma
causado por lesión u operación quirúrgica; tumores; hiperostosis
ósea; escayola; muletas, posturas forzadas prolongadas; hemorragia
en un nervio; exposición a frío o radicación; trastornos vasculares
del colágeno; enfermedades infeccionas, tales como la enfermedad de
Lyme y SIDA; toxinas, tales como emetina, hexobarbital, barbital,
clorobutanol, sulfonamidas, fenitoina, nitrofurantoina, los
alcaloides vinca, metales pesados, monóxido de carbono,
triortocresilfosfato, ortodinitrofenol, y otros solventes y venenos
industriales; reacciones autoinmunes; deficiencia nutricional, y en
particular deficiencia en vitamina B; y trastornos metabólicos,
tales como hipotiroidismo, porfiria, sarcoidosis, amiloidosis,
uremia y diabetes. "The Merck Manual", 16ª ed., 1518
(1992).
Debido a la existencia de tantas causa de dolor
neuropático, y debido a que éste tiende a responder mal a la
medicación analgésica, ha sido difícil el descubrimiento de fármacos
que ayuden de forma segura y efectiva a su alivio.
Mientras que el dolor agudo es generalmente
sintomático de lesión tisular o de inflamación, y sólo dura
mientras permanece la causa subyacente, el dolor crónico podría
persistir indefinidamente en ausencia, o después de la recuperación
de la patología tisular. Éste podría ocurrir como secuela de una
lesión (por ejemplo, de los nervios periféricos o de la médula
espinal), o en asociación con otros estados de enfermedad, tales
como herpes zoster o diabetes, pero, a menudo, éste surge sin causa
obvia. El dolor crónico es a menudo severo, conduciendo a una
incapacidad importante y a una alta tasa de suicidio, y es común,
con una prevalencia de aproximadamente el 1% a nivel severo. En
contraste con el dolor agudo, el dolor crónico a menudo no responde
a los fármacos analgésicos convencionales (opiaceos y NSAID), y
constituye un problema terapéutico difícil, debido a que su causa
no se puede remediar generalmente. Otras clases de fármacos
distintos (por ejemplo, antidepresivos tricíclicos, algunos
fármacos anticonvulsivos tales como la gabapentina) podrían ser
efectivos, pero la respuesta terapéutica es muy variable.
Una característica común de muchos síndromes
clínicos en los que se desarrolla dolor crónico es la existencia de
lesión nerviosa previa, que afecta a los nervios periféricos, la
médula espinal o, como en el ictus, al cerebro, y el concepto de
dolor neuropático (esto es, dolor que surge como consecuencia de una
lesión neuronal) se ha aceptado como la causa subyacente de muchas
afecciones de dolor crónicas diferentes observadas en la clínica.
Se han desarrollado varios modelos animales de dolor neuropático,
que mimetizan muchos aspectos del trastorno clínico. Estos incluyen
las lesiones del nervio ciático (constricción o sección parcial), la
sección de nervios espinales, las lesiones isquémicas de la médula
espinal, la neuropatia diabética, etc. y tales modelos se han
sometido a un estudio detallado de los cambios anatómicos,
bioquímicos y fisiológicos que acompañan al desarrollo del estado
de dolor.
En los últimos años, se han desarrollado
numerosos modelos experimentales de dolor neuropático (Bennett and
Xie (1988), Pain 33: 87-107; Seltzer et al.
(1990), Pain 43: 205-218; Kim y Chung (1992), Pain
50: 355-363; DeLeo et al., (1994) Pain 56:
9-16; Na et al., (1994), Neurosci. Lett. 177:
50-52). La disponibilidad de estos modelos
distintos proporciona una oportunidad para investigar los mecanismos
de dolor neuropático. Las características comunes encontradas en
los diferentes modelos deberían proporcionar una mejor
profundización en los mecanismos críticos del dolor neuropático, y
la comparación de los modelos debería ayudar a entender el
desarrollo y progresión del dolor.
Kim et al., compararon tres modelos
basados en los comportamientos del dolor neuropático y en los
efectos de la simpatectomia quirúrgica (Kim et al., (1997),
Exp. Brain Res. 113: 200-206). Ellos encontraron que
los modelos de Bennett, Seltzer y Kim y Chung (ver referencias
anteriores) resultan en un patrón general y en un desarrollo en el
tiempo del dolor evocado muy similar, mostrando el modelo de Bennet
los signos de comportamiento de dolor en curso mayores. Se han
mostrado los mismos resultados para los efectos de la simpatectomia
en los signos de comportamiento de dolor neuropático evocado y en
curso, respectivamente. Así, estos tres modelos se pueden usar para
descubrir las características comunes implicadas en el dolor
neuropático.
En el artículo de Walker et al., (1999),
Molecular Medicine Today 5: 319-321 se consideran
modelos animales de dolor adicionales, que comparan modelos de
diferentes tipos de dolor, que son el dolor agudo, el dolor
crónico/por inflamación y el dolor crónico/neuropático, en base a
los signos de comportamiento.
El documento WO 99/31256 revela polipéptidos de
catepsina DC, que son homólogos a los de catepsina Y según la
presente solicitud, el ácido nucleico que codifica tales
polipéptidos, las proteinasas codificadas, los anticuerpos
generados frente a estos polipéptidos, los péptidos fragmentados
derivados de estos polipéptidos, los oligonucleotidos
anti-sentido y el uso de los mencionados
anteriormente para la prognosis de cáncer humano.
Jan Deussing et al., describen en
Biochimica et Biophysica Acta (2000), 93-106, las
catepsinas Z murina y humana, el clonaje de sus cDNA, la
caracterización de los genes y la localización cromosómica. Las
catepsinas Z muestran una alta homología con sus homólogos de otras
especies, particularmente se discute la estructura tridimensional
propuesta.
Pungercar, J. e Ivanovski, G. revelan en
Pfluegers Archiv European Journal of Physiology, vol 439, No. 3
(2000), páginas R116-R118, un resumen de la
identificación y el clonaje molecular de la catepsina P, una posible
cisteinproteasa humana nueva de la familia de la papaína, que fue
parte de la "Life Science Conference 1998".
Nägler, D. y Ménard, R. discuten, en FEBS
Letters 434 (1998) 135-139, una cisteinproteasa
nueva de la familia de la papaína (catepsina X humana) con una
proregión corta e inserciones únicas, en la que se ha obtenido la
secuencia por amplificación por PCR a partir de una genoteca de cDNA
de ovario humano. Se discuten la secuencia de DNA y de la proteína
predicha, así como la homología de la catepsina X con las catepsinas
conocidas anteriormente.
En el documento WO 01/23570 se revelan nuevos
canales de sodio dependientes de voltaje, en los que la proteína es
una variante por corte y empalme de la subunidad \beta de los
canales de sodio. Estos ácidos nucleicos y proteínas se utilizan
en procedimientos de cribado para la identificación de compuestos
que modulan la expresión del ácido nucleico y de proteínas, para el
tratamiento del dolor neuropático.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar una diana para el examen y el desarrollo de un
medicamento para el tratamiento del dolor.
El objetivo se consigue mediante un
procedimiento para el desarrollo de un medicamento para el
tratamiento del dolor, que comprende el uso de una secuencia de
polinucleótidos seleccionada de SEQ ID No: 1, 2 ó 4, que codifica
la Catepsina Y, o los homólogos o fragmentos de la misma que
comprenden al menos 10 pares de bases idénticos, o la
proteína/polipéptido correspondiente, que comprende la determinación
de la eficiencia de un compuesto o agente en un modelo de dolor, en
el que la eficiencia del compuesto/agente se determina por la
consideración de la tasa de expresión del gen o por la consideración
de la actividad de la proteína.
Según la invención se ha encontrado que la
Catepsina Y se expresa diferencialmente durante el dolor,
particularmente durante el dolor neuropático. En la presente
invención se muestra que en tres modelos de rata diferentes, la
expresión de la Catepsina Y se regula positivamente durante el dolor
neuropático. Se han llevado a cabo exámenes en los modelos de
Bennett, Seltzer y Kim y Chung.
El modelo de Bennet se basa en la lesión de
constricción crónica mediante el ligamiento flojo del nervio
ciático. Por lo tanto, este modelo se designa como "modelo
CCI".
El modelo de Seltzer et al., se basa en
el ligamiento firme parcial del nervio ciático y, por lo tanto, se
designa como "modelo PSL".
El modelo de Kim y Chung se basa en el
ligamiento firme de los nervios espinales y es, por lo tanto,
designado "modelo SNL".
Estas designaciones corresponden a las
designaciones usadas en la literatura citada.
Los tres modelos se explican más detalladamente
en la literatura y en los ejemplos a continuación.
El término "secuencia de polinucleótidos" o
"secuencia de ácidos nucleicos" designa, en la presente
solicitud, cualquier secuencia de DNA o de RNA, independientemente
de la longitud. Así, este término puede describir secuencias
cortas, como los cebadores de PCR o las sondas para hibridación, así
como genes completos o cDNA de estos genes.
El término "polipéptido" o "secuencia de
aminoácidos" designa una cadena de aminoácidos,
independientemente de su longitud, pero en cualquier caso de más de
un aminoácido.
Como "homólogos" de las secuencias de
polinucleótidos se designan a las secuencias de polinucleótidos que
codifican el mismo tipo de proteína que la secuencia de
polinucleótidos descrita en este documento, particularmente una
secuencia de polinucleótidos homóloga que codifica un polipéptido
con el mismo tipo de actividad. De acuerdo con esto, se designa
como "homólogos" de un polipéptido a los polipéptidos que
tienen una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 70%,
preferentemente el 80%, más preferentemente el 90% de los
aminoácidos son idénticos a la proteína de la presente invención, y
en la que los aminoácidos que cambian están reemplazados por
aminoácidos homólogos. Se designa como aminoácidos "homólogos"
aquellos que tienen características similares respecto a la
hidrofobia, carga, características estéricas, etc. Las más
preferidas son las secuencias de aminoácidos que contienen
diferencias en la secuencia de aminoácidos que son dependientes de
la familia o de la especie. Particularmente, se designa como
secuencias "homólogas" a aquellas que corresponden a una de las
secuencias citadas en otras especies o individuos. Por ejemplo, si
en la presente invención se utiliza un modelo de rata y la
secuencia de polinucleótidos citada codifica la proteína de rata, la
secuencia de polinucleótidos y la proteína correspondientes de un
ratón en un modelo de ratón, se designan como "homólogos".
Además, las variantes por corte y empalme y los miembros de las
familias de genes se designan como homólogos.
Los "fragmentos" de una secuencia de
polinucleótidos son todas las secuencias de polinucleótidos que
tienen, al menos 10 pares de bases idénticas, en comparación con la
secuencia de polinucleótidos mostrada en la presente solicitud o
con el gen representado por esa secuencia de polinucleótidos. El
término "fragmento" incluye, por lo tanto, fragmentos tales
como los cebadores de PCR, las sondas para hibridación, los
fragmentos de DNA incluidos en vectores de DNA, como los plásmidos,
los cósmidos BAC o las construcciones virales, así como las
variantes, acortadas por corte y empalme, de los genes identificados
en este documento. Se designa como un fragmento de una proteína
(polipéptido) a las secuencias de aminoácidos que tienen, al menos
tres aminoácidos, preferentemente al menos 10 aminoácidos. Por lo
tanto, se incluyen en esta designación los fragmentos que sirven
como antígenos o como epítopos.
En la presente solicitud se utiliza el término
"secuencia" cuando se quiere designar, bien una secuencia de
polinucleótidos (= secuencia de ácidos nucleicos) o bien un
polipéptido (= secuencia de aminoácidos) o una proteína. Esto
significa que cuando el tipo de secuencia que se utiliza es
irrelevante no se designa de forma particular, si no que se utiliza
el término más común de "secuencia".
La base de los procedimientos y ensayos
descritos en la presente solicitud es el examen de la Catepsina Y
que se expresa diferencialmente durante el dolor o durante el
desarrollo del dolor. Para el examen necesario para el desarrollo
de cualquier medicamento, se puede utilizar cualquier secuencia que
permita la determinación de la tasa de expresión del gen de la
Catepsina Y o la actividad del polipéptido/proteína. Las secuencias
consideradas pueden ser las secuencias de polinucleótidos SEQ ID No
1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 4, respectivamente, o los homólogos o
fragmentos de las mismas, así como los polipéptidos codificados por
ellas (SEQ ID No. 3 o SEQ ID No. 5, respectivamente) o los
homólogos o fragmentos de los mismos.
Según la invención, se ha encontrado que el gen
de la Catepsina Y, representado por las secuencia de polinucleótidos
SEQ ID No. 2, se expresa diferencialmente en correspondencia con
los tres modelos distintos de dolor, que son los modelos descritos
anteriormente como "CCI", "PSI", "SNL".
La presente invención, por lo tanto, proporciona
una diana para el desarrollo de medicamentos para el tratamiento
del dolor, particularmente para el tratamiento del dolor
neuropático. La Catepsina Y no había sido considerada todavía en
relación al dolor.
El documento JP 2000157263 describe una
Catepsina Y humana útil en la elucidación y terapia de la enfermedad
de Alzheimer, de enfermedades neurodegenerativas, de cánceres y
similares. Sin embargo, la comparación de la secuencia del ácido
nucleico mostrado en esta publicación con las secuencias de las
bases de datos comunes, muestra que la secuencia proporcionada
corresponde a la Catepsina F, no a la Catepsina Y.
El documento WO 96/39194 ilustra que la proteína
Catepsina Y no está implicada en la secreción del péptido
\beta-amiloide (\beta-AP) de las
células, lo que resulta en el desarrollo de la enfermedad de
Alzheimer. Se proporciona la secuencia del ácido nucleico, así como
la secuencia de la proteína, de la Catepsina Y. Se propone la
inhibición de esta proteína para el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer, por lo que se examinan inhibidores de la Catepsina
Y.
Según la presente invención, se pueden utilizar
las secuencias de Catepsina Y (secuencia de polinucleótido o
polipéptido) en cualquier sistema de análisis que permita la
determinación bien de la tasa de expresión del gen o bien de la
actividad de la secuencia de polinucleótidos, o del
polipéptido/proteína.
Para la determinación y comparación de los
niveles de expresión de, al menos, uno de los genes identificados
en la presente invención, se puede utilizar cualquiera de los
procedimientos conocidos comúnmente, bien a nivel de RNA/cDNA o
bien a nivel de proteína. Por ejemplo, son procedimientos adecuados
la PCR, la hibridación, los procedimientos basados en
micromatrices, el western blot o el análisis de proteínas en geles
bidimensionales. Un procedimiento preferido es el procedimiento de
representación digital del patrón de expresión (procedimiento
DEPD), explicado en detalle en el documento WO 99/42610. El
procedimiento utilizado para la determinación de los niveles de
expresión no es restrictivo, siempre que las cantidades expresadas
se puedan cuantificar.
La actividad de la proteína Catepsina Y se puede
determinar mediante el contacto de la proteína con polipéptidos,
bajo condiciones de pH ácidas, y la determinación de la
concentración de aminoácidos libres después de la rotura. La
actividad de la proteína Catepsina Y es una actividad
carboxipeptidase. Los procedimientos para la determinación de la
actividad de la Catepsina Y se explican en detalle en la solicitud
de patente internacional WO 96/39194.
La expresión y la actividad de la Catepsina Y se
pueden determinar adicionalmente en sistemas o modelos de ensayos.
Tales sistemas de ensayo podrían ser ensayos in vivo, ex
vivo o in vitro, por ejemplo un sistema de ensayo
celular que comprenda células que expresen Catepsina Y, o un ensayo
que comprenda Catepsina Y aislada.
En cualquier ensayo o modelo, al menos, una de
las secuencias contacta con el compuesto o compuestos que se van a
analizar y se obtienen muestras, en las que se determinan los
niveles de expresión o la actividad de las secuencias y se comparan
con condiciones sin tratamiento.
Para el examen de la tasa de expresión del gen,
se pueden utilizar modelos animales. Para un modelo de este tipo,
se puede utilizar cualquier animal en el que se puedan llevar a cabo
las preparaciones necesarias, sin embargo, se prefieren los modelos
de mamíferos. Incluso más preferidos son los roedores o lagomorfos,
son particularmente preferidos las ratas, los ratones y los
conejos. El modelo animal más preferido de la presente invención es
un modelo de rata.
Dependiendo del modelo utilizado, las muestras
se pueden derivar de sangre completa, fluido cerebroespinal (CSF) o
un tejido completo, de poblaciones de células aisladas del tejido,
del fluido cerebroespinal (CSF) o de la sangre o de poblaciones de
células individuales (esto es, líneas celulares).
En una forma de realización de la invención, se
pueden utilizar ensayos celulares. Las células preferidas para los
ensayos celulares son las células eucariotas, más preferentemente
las células de mamíferos. Las más preferidas son las células de
tipo neuronal, como SHSY5Y (línea celular de neuroblastoma) o las
células COS (células de riñón del mono verde africano); las células
CHO (ovario de hamster chino); células HEK-293
(embrionarias de riñón humano).
Las secuencias de la Catepsina Y de la presente
invención se pueden utilizar para el diagnóstico de un estatus de
dolor, particularmente un estatus de dolor neuropático de un ser
humano, fuera del cuerpo vivo, mediante la determinación de los
niveles de expresión o de la actividad de las secuencias de
Catepsina Y, en comparación con el estatus sin enfermedad. Durante
el periodo de tratamiento de un paciente, también se puede usar la
expresión o la actividad de las secuencias para determinar la
eficacia del tratamiento para el dolor, fuera del cuerpo. En estos
casos, se toma una muestra de sangre, CSF o tejido del paciente y se
determina la expresión o la actividad en las muestras.
La enfermedad que se considera en la presente
invención es el dolor. Los tipos de dolor preferidos son el dolor
persistente/central, el dolor inflamatorio (agudo o crónico) o el
dolor neuropático, particularmente el dolor neuropático crónico. El
tipo más preferido es el dolor neuropático.
Los ejemplos de tales enfermedades son la
neuropatia diabética, la neuralgia post-herpética,
la neuralgia trigeminal, el dolor asociado con cáncer, la lesión de
la médula espinal, la esclerosis múltiple, el dolor fantasma, el
dolor post-ictus, el dolor asociado con SIDA, el
dolor lumbar bajo asociado con el dolor neuropático, los síndromes
complejos de dolor regional, como la distrofia del reflejo
simpático y la causalgia, los síndromes miofaciales o las
afecciones de dolor idiopáticas.
Independientemente de si se examina la eficacia
del tratamiento para el dolor o la eficiencia de un compuesto para
el tratamiento del dolor o de si se diagnostica o se caracteriza un
estado de dolor, la determinación del nivel de expresión o de la
actividad de las secuencias se lleva a cabo fuera de un cuerpo vivo.
Como se mencionó anteriormente, la detección de la expresión de los
genes se puede llevar a cabo por cualquier procedimiento conocido
en la técnica. El procedimiento de detección no limita la
invención.
Los niveles de expresión se pueden detectar bien
en base a una secuencia de polinucleótidos, o bien mediante la
detección del polipéptido correspondiente, codificado por dicha
secuencia de polinucleótidos.
Los procedimientos preferidos para la detección
y la determinación de los niveles de expresión génica, son la PCR
de un cDNA, generado por transcripción reversa de un mRNA expresado,
la hibridación de los polinucleótidos (sístemas de Northern y
Southern blot, hibridación in situ), las tecnologías basadas
en micromatrices de DNA, la detección de los péptidos o proteína
correspondientes mediante, por ejemplo, sistemas de Western blot,
análisis en geles bidimensionales, tecnologías basadas en
micromatrices de proteínas o los ensayos cuantitativos similares,
por ejemplo, a los análisis de ELISA.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El procedimiento más preferido para el análisis
cuantitativo de los niveles de expresión es el procedimiento de
representación del patrón de expresión diferencial (DEPD), descrito
en detalle en el documento WO 99/42610.
Mediante la utilización de cualquiera de las
secuencias de la Catepsina Y (secuencia de polinucleótidos o del
polipéptido/proteína) se puede analizar la eficiencia de los
compuestos para reducir la expresión o la actividad de la secuencia
de polinucleótidos o de la proteína. Por lo tanto, las secuencias de
la presente invención se pueden usar para la identificación de
agentes terapéuticos y de su eficiencia para el tratamiento del
dolor.
Por ejemplo, se puede usar un procedimiento que
comprende:
- a)
- proporcionar una población celular bajo análisis que comprende células capaces de expresar el gen o genes de la Catepsina Y, o los homólogos o fragmentos del mismo;
- b)
- poner en contacto dicha población celular bajo análisis con el agente terapéutico bajo análisis;
- c)
- detección de la expresión del gen o genes de la Catepsina Y en dicha población celular bajo análisis;
- d)
- comparación de la expresión del gen o genes en la población celular bajo análisis con la expresión del gen o genes en una población celular de referencia cuyo estado de enfermedad se conoce; y
- e)
- identificación de una diferencia en los niveles de expresión de las secuencias consideradas, si existe, entre la población celular bajo análisis y la población celular de referencia, identificando por lo tanto un agente terapéutico para el tratamiento del dolor.
Para este procedimiento se puede usar un modelo
animal o se pueden obtener las células bajo análisis de un
individuo, de un modelo animal o de cultivos celulares de células
primarias o de líneas celulares. Se podrían usar ensayos in
vitro adicionales.
Los agentes o compuestos que tienen alguna
influencia en la tasa de expresión del gen o genes de la Catepsina
Y, se podrían usar como un medicamento para el tratamiento del
dolor. Por lo tanto, se puede usar un procedimiento que examine la
tasa de expresión del gen de la Catepsina Y, para analizar los
agentes y los compuestos por su eficiencia para el tratamiento del
dolor. No es relevante que modelo se utilice, siempre que el modelo
permita determinar diferencias en las cantidades expresadas.
En este modelo, las células se ponen en contacto
con el agente o compuesto de interés y se determina la expresión
del gen de la Catepsina Y, en comparación con la expresión en
células que nunca han estado en contacto con el agente/compuesto
correspondiente. El contacto con las células se puede efectuar bien
mediante la administración del agente/compuesto a un animal, o bien
mediante el contacto de las células aisladas de un tejido o sangre,
o de células de una línea celular en cultivo, con el
agente/compuesto.
Mediante el examen de la influencia que el
agente/compuesto considerado tiene en la expresión del gen de la
Catepsina Y, se puede estimar la eficacia del agente/compuesto para
el tratamiento del dolor. Esto permite tomar la decisión
de si vale la pena desarrollar un medicamento que contenga tal agente o compuesto para el tratamiento del dolor.
de si vale la pena desarrollar un medicamento que contenga tal agente o compuesto para el tratamiento del dolor.
No es relevante si la expresión se determina en
base a la generación del mRNA (nivel de transcripción) o en base a
la generación de la proteína (nivel de traducción), siempre que se
pueda determinar la diferencia en la tasa de expresión. Por lo
tanto, la secuencia de polinucleótidos, así como el polipéptido o
proteína mostrados en la presente solicitud, se pueden usar para el
desarrollo de un medicamento.
El desarrollo de un medicamento puede ser
deseable, por ejemplo, si el agente/compuesto considerado tiene
alguna influencia en la regulación de la tasa de expresión o en la
actividad de cualquier secuencia de polinucleótidos o polipéptidos
de la presente invención. Particularmente, si el agente/compuesto
disminuye la tasa de expresión o la actividad de la Catepsina Y,
podría ser un candidato para el desarrollo de un medicamento.
La influencia mencionada de un compuesto o
agente se puede examinar mediante un procedimiento que comprende el
contacto de una muestra, que comprende la secuencia del ácido
nucleico, o de los homólogos o fragmentos del mismo, o de los
polipéptidos correspondientes de la presente invención, con un
compuesto que se une a dicha secuencia en una cantidad suficiente
para determinar si dicho compuesto modula la tasa de expresión o la
actividad de la secuencia del polinucleótido o polipéptido.
Mediante este procedimiento, se puede determinar
un compuesto o agente que module la tasa de expresión o la
actividad de la secuencia del ácido nucleico, o de los homólogos o
fragmentos del mismo, o de los polipéptidos correspondientes.
Un procedimiento para la determinación de la
eficiencia de un compuesto/agente para el tratamiento del dolor
mediante la determinación de la actividad de la proteína Catepsina Y
que comprende, por ejemplo:
- a)
- poner en contacto la proteína Catepsina Y con un compuesto/agente en presencia de un polipéptido conocido que es una diana de la Catepsina Y,
- b)
- determinación del aminoácido amino terminal del péptido o de la cantidad de aminoácidos libres en la muestra, después de incubación,
- c)
- comparación del aminoácido amino terminal del péptido o de la cantidad de aminoácidos libre con el resultado en una muestra que no contiene el compuesto/agente.
Si un compuesto/agente es capaz de disminuir o
de inhibir la actividad de la proteína Catepsina Y, podría ser útil
como un medicamento para el tratamiento del dolor.
Los ejemplos de los compuestos que pueden
disminuir la actividad de la Catepsina Y son los compuestos de
fórmula I:
en la
que:
R se selecciona entre el grupo constituido por
hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, y en el que R y
R^{2} están unidos para formar una estructura en anillo de 4 a 10
átomos de carbono,
R' se selecciona entre el grupo constituido por
hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, y en el que R' y
R^{3} están unidos para formar una estructura en anillo de 4 a 10
átomos de carbono,
R^{1} se selecciona entre el grupo constituido
por
alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, sustituido
con de 1 a 5 sustituyentes, seleccionados entre el grupo constituido
por (a) arilo de 6 a 10 átomos de carbono, (b) arilo de 6 a 10
átomos de carbono, sustituido con de 1 a 3 sustituyentes,
seleccionados entre el grupo constituido por alquilo de 1 a 6 átomos
de carbono, arilo de 6 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6
átomos de carbono, ariloxi de 6 a 10 átomos de carbono, hidroxi,
ciano, halo y amino, (c) cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono y
(d) heterociclos de 3 a 14 átomos de carbono, que tienen de 1 a 3
heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por nitrógeno,
oxígeno y azufre,
en el que dicho grupo alquilo sustituido está,
opcionalmente, sustituido adicionalmente con de 1 a 2 grupos
hidroxilo,
alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, sustituido
con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados entre el grupo constituido
por (a) arilo de 6 a 10 átomos de carbono, (b) arilo de 6 a 10
átomos de carbono, sustituido con de 1 a 3 sustituyentes
seleccionados entre el grupo constituido por alquilo de 1 a 6 átomos
de carbono, arilo de 6 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6
átomos de carbono, ariloxi de 6 a 10 átomos de carbono, hidroxi,
ciano, halo y amino, (c) cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono y
(d) heterociclos de 3 a 14 átomos de carbono, que tienen de 1 a 3
heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por nitrógeno,
oxígeno y azufre,
arilo de 6 a 10 átomos de carbono,
arilo de 6 a 10 átomos de carbono, sustituido
con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados entre el grupo constituido
por alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, arilo de 6 a 10 átomos de
carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, ariloxi de 6 a 10
átomos de carbono, hidroxi, ciano, halo y amino,
fluorofenilo,
heterociclos de 3 a 14 átomos de carbono que
tienen de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre el grupo
constituido por nitrógeno, oxígeno y azufre;
R^{2} y R^{3} son, independientemente,
cadenas laterales de aminoácidos D o L de al menos 2 átomos de
carbono, con la condición de que dichas cadenas laterales de
aminoácidos no incluyen a la cadena lateral de la prolina;
R^{4} se selecciona entre el grupo constituido
por
-C(O)CH =N=N,
\hskip0.3cm-CH_{2}OH,
\hskip0.3cm-C=NOH,
\hskip0.3cmy
\hskip0.3cm-C(O)R^{5}
en el que R^{5} es hidrógeno,
alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, haloalquilo de 1 a 6 átomos de
carbono y de 1 a 2 grupos halo, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono,
-NR^{6}R^{7}, en el que R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, y arilo de 6 a 10 átomos de
carbono, y -N
(CH_{3})OCH_{3};
\global\parskip1.000000\baselineskip
X se selecciona entre el grupo constituido por
-O-, -NR^{9}- y -S-, en el que R^{9} se selecciona entre el
grupo constituido por hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono
y arilo de 6 a 10 átomos de carbono;
Y se selecciona entre el grupo constituido por
-C(O)- y -C(S)-;
m es igual a cero o uno; y
n es igual a cero, uno o dos,
o las sales de los mismos farmacéuticamente
aceptables
con la condición de que cuando R^{1} es
1-naftilo, R^{2} es
-CH(CH_{3})_{2} (isómero L), R^{3} es
-CH_{2}- \diameter (isómero L), Y es -C(O), m es cero y n
es uno, cuando R^{4} no es -N(CH_{3})OCH_{3},
con la condición adicional de que cuando R' es difenilmetilo,
R^{2} es p-(benciloxi)bencilo (isómero L), Y es
-C(O)- y m y n son cero,
entonces
R^{4} no es
-N(CH_{3})OCH_{3}, y con, todavía, la condición de
que cuando R^{1} es (1,2 difenil)etenilo, Y es
-C(O)-, R^{2} es -CH_{2}- \diameter (isómero L) y m y n
son cero, entonces R^{4} no es
-N(CH_{3})OCH_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida
R^{1} incluye bencilo, tritilo, difenilmetilo,
4-fenilbutilo, 2-feniletilo,
naftilo, piridilo, fluorenilo, xantanililo, y similares.
R^{2} y R^{3} son, independientemente,
cadenas laterales de aminoácidos D o L que tienen, al menos, dos
átomos de carbono, con la condición de que R^{2} y R^{3} no son
prolina. Tales cadenas laterales se refieren al sustituyente
R^{8}, encontrado en aminoácidos que se presentan de forma natural
y en aminoácidos sintéticos de fórmula H_{2}NCHR^{8}COOH. Las
cadenas laterales de los aminoácidos que se presentan de forma
natural incluyen, como forma de ejemplo únicamente, aquellos en los
que R^{8} es el isómero L de (CH_{3})^{2}CH- (valina),
(CH_{3})_{2}CHCH_{2} (leucina),
CH_{3}CH_{2}CH(CH_{3})- (isoleucina),
\diameterCH_{2}- (fenilalanina),
(3-indolilo)-CH_{2}- (triptófano),
CH_{3}SCH_{2}CH_{2}- (metionina), CH_{3}CH(OH)
(treonina),
p-HO-\diameter-CH_{2}
(tirosina), H_{2}NC(O)CH_{2}- (asparagina),
H_{2}NC(O)CH_{2}CH_{2}- (glutamina),
HOC(O)CH_{2}- (ácido aspártico),
HOC(O)CH_{2}CH_{2}- (ácido glutámico),
H_{2}NCH_{2}CH_{2}CH_{2}- (lisina),
H_{2}NC(NH)NHCH_{2}CH_{2}CH_{2}- (arginina),
4-imidazolilo-CH_{2}- (histidina)
y similares.
Las cadenas laterales de los aminoácidos
sintéticos incluyen el isómero D de los aminoácidos que se presentan
de forma natural, citados anteriormente, así como aquellos en los
que R^{8} se selecciona entre el grupo constituido por alquilo
de 2 a 6 átomos de carbono (no ocurriendo el grupo alquilo en los
aminoácidos que se presentan de forma natural), cicloalquilo de 3 a
8 átomos de carbono, y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono,
sustituido con de 1 a 2 sustituyentes, seleccionados entre el grupo
constituido por
arilo de 6 a 10 átomos de carbono,
arilo de 6 a 10 átomos de carbono, sustituido
con de 1 a 3 sustituyentes, seleccionados entre el grupo constituido
por alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de
carbono, arilo de 6 a 10 átomos de carbono, y ariloxi de 6 a 10
átomos de carbono, y
heteroarilo de 3 a 14 átomos de carbono que
tienen de 1 a 3 heteroátomos, seleccionados entre el grupo
constituido por nitrógeno, oxígeno y azufre (no ocurriendo el grupo
alquilo en los aminoácidos que se presentan de forma natural).
Las cadenas de aminoácidos particularmente
preferidas incluyen a los isómeros D y L de valina, leucina,
fenilalanina, triptofano e isoleucina.
R^{4} es preferentemente -CH=N=N o
-C(O)H.
X es preferentemente -O-.
Y es preferentemente -C(O)-.
m y n son preferentemente 0 ó 1.
En la presente solicitud \diameter significa
un residuo fenilo.
Los compuestos preferidos incluyen, como forma
de ejemplo, los compuestos siguientes, definidos por la fórmula II
a continuación, que incluyen a todos los isómeros del mismo, en los
que la cadena lateral de aminoácidos de R^{2} y R^{3} se indica
debajo del sustituyente R^{2} y R^{3}:
El término "heterociclos que contienen de 3 a
14 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos, seleccionados entre
el grupo constituido por nitrógeno, oxígeno y azufre" se refiere
a grupos heterocíclicos saturados e insaturados, que cumplen el
requisito del número de átomos de carbono y los heteroátomos. Los
grupos heterocíclicos adecuados incluyen, como forma de ejemplo,
furazanilo, furilo, imidazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo,
indolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, morfolinilo (por ejemplo,
morfolino), oxazolilo, piperacinilo (por ejemplo,
1-piperacinilo), piperidilo (por ejemplo,
1-piperidilo, piperidino), piranilo, piracinilo,
pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridacinilo, piridilo,
pirimidinilo, pirrolidinilo (por ejemplo,
1-pirrolidinilo), pirrolinilo, pirrolilo,
quinoxalinilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, tiomorfolinilo (por
ejemplo, tiomorfolino), triazolilo y xantanililo.
Si en la presente solicitud se describe un grupo
químico que contiene, por ejemplo "de 1 a 6 átomos de carbono"
o "de 6 a 10 átomos de carbono" o "de 1 a 4 heteroátomos"
quiere decir que el grupo puede contener 1 ó 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6, ó 6
ó 7 u 8 ó 9 ó 10, ó 1 ó 2 ó 3 ó 4 de dichos átomos,
respectivamente.
Los grupos heterocíclicos pueden estar
sustituidos o no sustituidos. Cuando el grupo heterocíclico está
sustituido, los sustituyentes se seleccionan entre alquilo de 1 a 6
átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, arilo de 6 a
10 átomos de carbono, ariloxi de 6 a 10 átomos de carbono, y
halo.
Los heterociclos preferidos incluyen grupos
aromáticos cíclicos muy conocidos que contienen heteroátomos en la
estructura cíclica. Tales grupos incluyen, como forma de ejemplo,
furilo, imidazolilo, oxazolilo, pirazolilo, piridilo, pirimidinilo,
tiazolilo y triazolilo.
El término "alquilo" se refiere a grupos
alquilo de cadena lineal o ramificada, tales como metilo, etilo,
n-propilo, isopropilo, n-butilo,
tert-butilo, sec-butilo, isobutilo,
n-pentilo, n-hexilo,
2-metilpentilo, y similares; mientras que el
término "alcoxi" se refiere a sustituyentes
-O-alquilo.
El término "arilo" se refiere a
sustituyentes aromáticos que comprenden carbono e hidrógeno, tales
como fenilo, naftilo y similares, mientras que el término ariloxi
se refiere a sustituyentes -O-arilo en los que
arilo es como se definió anteriormente.
El término "halo" o "halógeno" se
refiere a flúor, cloro, bromo y yodo, y preferentemente a flúor y
cloro.
El término "sales farmacéuticamente
aceptables" se refiere a las sales de metales alcalinos,
alcalino-térreos y amonio,
no-tóxicas, utilizadas comúnmente en la industria
farmacéutica, que incluyen las sales de sodio, potasio, litio,
calcio, magnesio, bario, amonio y zinc protamina, que se preparan
mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. El término
incluye también sales de adición de ácido no tóxicas, que se
preparan generalmente por reacción de los compuestos de esta
invención con un ácido orgánico o inorgánico adecuado.
Las sales representativas incluyen las sales
clorhidrato, bromhidrato, sulfato, bisulfato, acetato, oxalato,
valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato,
tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato,
napsilato, y similares. La sal particular utilizada no es
crítica.
Las formas de realización particularmente
preferidas de los compuestos utilizables como un medicamento para
el tratamiento del dolor mediante la inhibición de la actividad de
la proteína Catepsina Y son los compuestos 1 a 13, como se muestra
en las fórmulas siguientes:
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\newpage
La preparación de los compuestos 1 a 12 de la
presente solicitud se explica en detalle en el documento WO
96/39194.
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La preparación del compuesto 13 se explica en
detalle en el artículo de Therrien, C. et al., Biochemistry
(2001) 40, 2702-2711.
Además, las secuencias de la presente invención
por si mismas se pueden usar como un medicamento.
Un ejemplo de este uso es el uso de una
secuencia de polinucleótidos como un agente
anti-sentido. Los agentes
anti-sentido pueden hibridar con DNA o mRNA
inhibiendo o disminuyendo la transcripción o la traducción,
respectivamente. Así, las secuencias de polinucleótidos de un gen,
cuya tasa de expresión aumenta durante el dolor, se pueden utilizar
como agentes anti-sentido para disminuir la tasa de
expresión de dicho gen. Además, tales secuencias de polinucleótidos
se pueden utilizar para terapia génica.
Una composición farmacéutica que comprende una
secuencia de polinucleótido según la presente invención puede ser
cualquier composición que pueda servir como una composición
farmacéutica. Preferentemente, estarán presentes sales o agentes
para la estabilización de la secuencia en la composición.
Para la determinación de la expresión de los
genes relevantes, las secuencias generadas se tienen que detectar.
Por lo tanto, se pueden utilizar varios reactivos, que son, por
ejemplo, las sondas específicas, radiactivas o no radiactivas (por
ejemplo, biotiniladas o fluorescentes), para detectar las secuencia
del ácido nucleico mediante hibridación, las parejas de cebadores
para la detección de una o varias de las secuencias de ácidos
nucleicos mediante PCR, micromatrices de DNA, los anticuerpos frente
a uno de los polipéptidos, o epítopos, o las micromatrices de
anticuerpos o proteínas. Tales reactivos se pueden combinar en un
kit, que se puede comercializar para llevar a cabo cualquiera de
los procedimientos descritos.
Para exámenes o experimentos adicionales, sería
deseable incluir la secuencia del ácido nucleico de la presente
invención en un vector o en una célula huésped. Por ejemplo, se
pueden desarrollar ensayos celulares por inclusión de las
secuencias en una célula huésped, en las que los genes, secuencias
de polinucleótidos y las proteínas/polipéptidos correspondientes se
puedan usar o examinar adicionalmente.
Además, las secuencias definidas en la presente
invención se pueden usar para "diseñar" nuevos animales
transgénicos como modelos de dolor. Por lo tanto, los animales
"se generan" mediante la manipulación del gen o genes que
codifican la Catepsina Y, en una forma en la que su expresión en el
animal transgénico difiere de la expresión del mismo gen o genes en
el animal de tipo silvestre. Preferentemente, la "manipulación"
resulta en un nivel de expresión diferente de la Catepsina Y en el
animal transgénico, en comparación con el animal de tipo salvaje, o
en una proteína con una actividad enzimática diferente. El que el
nivel de expresión, o la actividad de la proteína, se hagan más
altos o más bajos que en el animal de tipo salvaje, bajo las mismas
condiciones, dependerá del modelo de dolor deseado. Los
procedimientos de manipulación genética y los procedimientos para
la preparación de animales transgénicos son comúnmente conocidos por
los expertos en la técnica.
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La Figura 1 muestra los experimentos de
comparación de los tres modelos de dolor CCI, PSL y SNL. Se comparan
los niveles de expresión del gen de la Catepsina Y a lo largo de un
periodo de tiempo de 28 días, frente a controles operados de forma
ficticia. Se describe que la Catepsina Y está expresada
diferencialmente cuando su secuencia se regula positiva o
negativamente en un punto de tiempo, al menos en dos de los tres
modelos. El patrón de expresión a lo largo del tiempo se puede
determinar como, regulada positivamente en uno a cuatro puntos de
tiempo; como regulada negativamente en uno a cuatro puntos de tiempo
o regulada de forma mixta, si el tipo de regulación cambia entre
regulación positiva y negativa en diferentes puntos de tiempo.
\newpage
El eje X representa los cuatro puntos de tiempo
analizados mediante DEPD, 1 = día uno después de la operación, 2 =
día 7 después de la operación, 3 = día 14 después de la operación, 4
= día 28 después de la operación. El eje Y muestra el \Deltah que
representa la diferencia de expresión normalizada (altura del pico)
de un transcrito determinado, entre un grupo control y un grupo
tratado. La diferencia de x-veces en la expresión
del gen se calcula mediante
\frac{1 +
\Delta h}{1- \Delta
h}
0 = sin cambio respecto al control, + =
regulación positiva, - = regulación negativa; (0,2 = 1,5 veces; 0,3
= 1,86 veces; 0,4 = 2,33 veces; 0,5 = 3 veces).
Se proporcionan los ejemplos siguientes como
ilustración y no se pretende limitar la invención al ejemplo
específico proporcionado.
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La lesión del nervio se crea mediante ligaduras
constrictivas flojas alrededor del nervio ciático de rata (4
ligaduras). Las ligaduras evocan un edema intraneural, el
hinchamiento se impide mediante las ligaduras de los nervios
estrangulados. Las constricciones permanecen durante al menos un mes
(por esta razón se denomina "lesión por constricción crónica"
CCI). Se conoce que las lesiones por constricción dañan
prácticamente todos los axones largos mielinizados de los nervios;
sin embargo, un porcentaje variable, pero grande, de los axones no
mielinizados de los nervios permanecen intactos. Aunque el nervio
distal a la constricción está muy degenerado, el nervio proximal a
la constricción aparece normal, y no hay evidencia de muerte de
ninguna neurona aferente primaria. Este modelo tiene una periferia
que está enervada únicamente por fibras C y un número grandemente
reducido de fibras delta A, y una médula espinal que está enervada
por mecanorreceptores de bajo umbral beta A dañados (pero vivos),
fibras delta A (la mayoría dañadas, sólo un pequeño número intactas)
y fibras C aferentes, tanto dañadas como intactas, muchas de las
cuales son nocirreceptores. Este modelo animal provoca alodinia e
hiperalgesia, así como un dolor espontáneo. En la mayoría de los
casos de CCI se detectan evidencias de una sensación de dolor
anormal en el segundo día PO, y en prácticamente en todos los casos,
en los días 5-7 posteriores a la lesión. La
sensación de dolor anormal parece alcanzar un pico de severidad en
los días 10-14 y desaparecer en aproximadamente 2
meses, cuando el dolor se reemplaza por un estado de hiperestesia,
aparentemente permanente.
Detalladamente, ratas Lewis macho (peso corporal
de 150-350 g) se anestesiaron con pentobarbital
sódico (50 mg/kg i.p.). Posteriormente, el nervio ciático común en
el lado izquierdo, se expuso, a nivel de la mitad del muslo,
mediante disección roma a través del biceps femoral. En la región
proximal de la trifurcación ciática, se eliminó el tejido adherente
de aproximadamente 7 mm del nervio y se ataron 4 ligaduras flojas
(hilo crómico 4,0) alrededor de él, con un espaciamiento de 1 mm.
La longitud del nervio afectada fue de 4,5 mm de largo. El grado
deseado de constricción retardó, pero no paró, la circulación a
través de la vasculatura epineural superficial, y algunas veces se
produjo una pequeña y breve contracción en el músculo que está
alrededor de la zona expuesta. El grupo de animales control se
sometió a una ligadura ficticia (sólo en el lado izquierdo), que
representa el mismo procedimiento de operación que en los animales
con ligaduras, pero sin ligamiento del nervio.
Se eligieron cuatro puntos de tiempo para
analizar el perfil de la expresión génica: 1 día, 7 días, 14 días y
28 días después de la operación. Se analizó la presencia de alodinia
mecánica en los animales (análisis de von Frey) un día antes de la
cirugía y 30-60 minutos antes de la preparación del
tejido (ganglio de la raíz dorsal, médula espinal y tálamo). Los
tejidos se congelaron en nitrógeno líquido antes de la preparación
del RNA.
\vskip1.000000\baselineskip
Horas después de una lesión parcial en el nervio
ciático se inician trastornos en el comportamiento de defensa
frente a estímulos nocivos, después de un estimulo nocivo y no
nocivo, y duran hasta 7 meses.
Este modelo se caracteriza por una combinación
compleja de un inicio rápido, alodinia al tacto, hiperalgesia,
fenómeno de imagen especular y dependencia del flujo de salida
simpático. Este modelo se asemeja, por tanto, a muchos de los
síntomas descritos para la causalgia en el hombre. La rápida
iniciación de estos trastornos y su aparición contralateral
sugieren una reorganización central. Este modelo podría servir como
un modelo de dolor mantenido por el sistema simpático (SMP).
\newpage
Detalladamente, ratas Lewis (machos con un peso
corporal de 150-350 g) se anestesiaron con
pentobarbital sódico (50 mg/kg, i.p.) seguido por una exposición
del nervio ciático izquierdo, a nivel de la parte alta del muslo.
Bajo una lupa de 25x aumentos, se eliminaron cuidadosamente los
tejidos que rodeaban el dorso del nervio en un sitio cercano al
trocánter, justo distal del punto en el que el biceps semitendinoso
posterior ("PBST") se ramifica del nervio ciático común. Una
sutura de seda tratada con silicona 8-0 se insertó
en el nervio con una mini-aguja de corte reverso,
curvada 3/8, y se ligó firmemente de forma que se atrapó de 1/3 a
1/2 del grosor del nervio en la ligadura. El grupo control de
animales fue sometido a un ligamiento ficticio, que representa el
mismo procedimiento operativo que en los animales ligados pero sin
ligamiento del nervio.
Se eligieron cuatro puntos de tiempo para
analizar el perfil de la expresión génica: 1 día, 7 días, 14 días y
28 días después de la operación. Se analizó la presencia de alodinia
mecánica en los animales (análisis de von Frey) un día antes de la
cirugía y 30-60 minutos antes de la preparación del
tejido (ganglio de la raíz dorsal, médula espinal y talamo). Los
tejidos se congelaron en nitrógeno líquido antes de la preparación
del RNA.
\vskip1.000000\baselineskip
En este modelo, una ligadura firme de los
nervios espinales izquierdos L5 y L6 conduce a una hiperalgesia al
calor nocivo en la pata afectada de alta duración, durante al menos
5 semanas, Se puede observar alodinia mecánica de alta duración en
la pata afectada, durante al menos 10 semanas. Este modelo implica
una ligadura completa de los nervios espinales L5 y L6 o sólo de L5
(o L4), que es más fiable que otros modelos en los que es difícil
de controlar el número y los tipos de nervios ligados.
Detalladamente, ratas Lewis (peso corporal de
150-350 g) se anestesiaron con pentobarbital sódico
(50 mg/kg, i.p.). Posteriormente, se realizó una ligadura del
nervio ciático espinal en el nervio espinal L5, en el lado
izquierdo de los animales.
El grupo de animales control se sometió a una
ligadura ficticia (sólo en el lado izquierdo), que representaba el
mismo procedimiento operativo que en los animales ligados pero sin
ligamiento del nervio.
Se eligieron cuatro puntos de tiempo para
analizar el perfil de la expresión génica: día 1, día 7, día 14 y
día 28 posteriores a la operación. Se analizó la presencia de
alodinia mecánica en los animales (análisis de von Frey) un día
antes de la cirugía y 30-60 minutos antes de la
preparación del tejido (ganglio de la raíz dorsal, médula espinal y
talamo). Los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido antes de la
preparación del RNA.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis del perfil de expresión génica
mediante análisis por DEPD comenzó con el aislamiento de
5-10 \mug de RNA total. En una segunda etapa, se
sintetizó cDNA de doble hélice. Se generaron tres grupos de
fragmentos de DNA cortos que contenían extremos protuberantes de
hélice sencilla, mediante la digestión enzimática del cDNA con tres
tipos deferentes de enzimas de restricción IIS. Posteriormente, se
ligaron moléculas adaptadoras de DNA específicas y se realizador
dos etapas seguidas de reacciones de PCR 3072, utilizando 1024
cebadores 5' distintos sin marcar y, en la última etapa del PCR, un
cebador 3' común FAM, marcado fluorescentemente. A continuación,
los grupos de PCR 3072 se analizaron en un secuenciador automático
de electroforesis capilar. El patrón de expresión génica
diferencial de los fragmentos sencillos se determinó mediante la
comparación de los picos del cromatograma normalizados de los
grupos control y de los correspondientes a los animales
operados.
\vskip1.000000\baselineskip
Los picos expresados de forma diferencial se
confirmaron en geles de poliacrilamida utilizando un cebador 3'
marcado radiactivamente en lugar del cebador FAM fluorescente. Las
bandas expresadas diferencialmente se cortaron del gel. Después de
un etapa de elución corta en 60 \mul de 10 mM Tris pH 8, los
fragmentos se reamplificaron mediante PCR utilizando el mismo
cebador que se uso en el análisis DEPD. Los productos de PCR
resultantes se trataron con una mezcla de Exonucleasa I y fosfatasa
alcalina de gamba antes de la secuenciación directa. Las reacciones
de secuenciación se realizaron mediante la utilización de un kit de
secuenciación similar al kit de secuenciación del terminador teñido
DYE-namic ET, y a continuación se analizaron por
electroforesis capilar (Megabace 1000, Amersham).
Antes de realizar un análisis BLAST (Altschul
et al., 1997, Nucleic Acid Res. 25:
3389-3402) frente a Genbank y Unigene, se verifica
la calidad de las secuencias y se enmascaran las secuencias
redundantes o los motivos repetitivos.
Los resultados se muestran en la Tabla 1 y se
comparan frente a la secuencia humana.
La expresión del gen de la Catepsina Y a lo
largo de un periodo de tiempo de 28 días, después de la preparación
del modelo de dolor, se muestra en la figura 1.
La Catepsina Y no tienen la actividad
endopeptídica estándar asociada con las proteasas. En un esfuerzo
por identificar si la enzima tenía otra actividad proteolítica, se
incubaron varios oligopéptidos sintéticos, seleccionados al azar,
con la Catepsina Y purificada, a pH 5,5 ó 4,5. Específicamente, la
Catepsina Y purificada se incubó con los oligopéptidos sintéticos
(50\beta\mug/ml), a pH 4,5 o a 9H 5,5, durante 1 hora a
37ºC.
Las muestras se pararon por la adición de ácido
trifluoroacético a una concentración final del 1%, posteriormente
se analizaron por HPLC de fase reversa en una columna Vydac C18,
utilizando un gradiente de concentración acetonitrilo creciente en
0,1% de ácido trifluoroacético. Los picos individuales (parentales y
del producto o productos nuevos) se recogieron, se analizaron
mediante hidrólisis ácida seguida por análisis de aminoácidos.
Los resultados se resumen a continuación:
Los péptidos anteriores, así como otros péptidos
citados en este documento, se enumeran, por convención, desde el
extremo amino terminal hacia el extremo carboxilo terminal.
Los resultados de varios de estos experimentos
(no se muestran todos) sugieren que la actividad proteolítica de la
Catepsina Y consiste en una eliminación secuencias de los
aminoácidos del extremo carboxilo terminal, lo que es evidencia
directa de una actividad carboxipeptidasa. No se observaron
evidencias de ninguna actividad endopeptidasa o aminopeptidasa con
ninguno de estos sustratos. Los datos sugieren fuertemente que la
actividad proteolítica predominante manifestada por la Catepsina Y
es la actividad carboxipeptidasa.
El análisis cuantitativo de la actividad
carboxipeptidasa de la Catepsina Y se basa en la detección de nuevos
extremos amino terminales libres, generados por la rotura de un
sustrato seleccionado. Esto se lleva a cabo por reacción con el
reactivo oftalaldehído en una solución alcalina en presencia de
2-mercaptoetanol (Simons, et al., JACS, 98:
7098-7099 (1976). El péptido EGYYGNYGV se sintetizó
acetilado en su extremo amino terminal de forma que, tras la rotura
por la Catepsina Y, el único aminoácido libre del extremo amino
terminal presente en la mezcla de reacción será el residuo valina,
cortado por la actividad carboxipeptidasa de la proteasa.
Se construyó una curva patrón por incubación de
concentraciones variables de valina (0-20 \muM) en
0,25 M de borato sódico, pH 10, que contenía 0,05% de
2-mercaptoetanol y 60 \mug/ml de
o-ftalaldehído, en pocillos individuales de un
placa de microensayo de 96 pocillos. La fluorescencia resultante se
lee en un lector de placas Cytofluor (ex 340, em 460
nm). Existe un incremento lineal en la señal proporcional a la
cantidad de valina libre presente.
Con el fin de deteminar el pH óptimo de la
enzima, se establecieron mezclas de reacción con enzima y sustrato
(0,2 mg/ml) en un volumen de reacción total de 0,1 ml, en pocillos
individuales de placas de microensayo de 96 pocillos, en tampones
de acetato de sodio 20 mM, a diferentes pH, con 0,1% de
2-mercaptoetanol. Los pocillos control se
establecieron de forma idéntica excepto por la presencia de enzima.
A distintos tiempos, después de una incubación a temperatura
ambiente, las reacciones se pararon por adición de un volumen igual
de 0,45 M borato sódico, pH 10, con 0,25 mg/ml de
o-ftalaldehído, y se midió la fluorescencia. En
ausencia de enzima, no se genera fluorescencia medible por encima
del fondo, incluso con incubaciones prolongadas. En presencia de
enzima, hay un incremento en la fluorescencia dependiente del
tiempo. En base a este análisis, se determinó que el pH óptimo para
la actividad carboxipeptidasa era aproximadamente 4,5, con una
disminución de la actividad a pH más bajos y más altos.
Utilizando este ensayo a pH 4,5, se analizó la
capacidad de varios compuestos para inhibir la actividad de la
Catepsina Y, mediante la adición de la concentración deseada de
inhibidor en la mezcla de incubación junto con la enzima y el
sustrato, y midiendo la disminución en la fluorescencia (si existe
alguna) respecto al control de la enzima. Todos los compuestos, 1 a
13, analizados en este análisis mostraron inhibición de la
actividad Catepsina Y.
Claims (9)
1. Un procedimiento para el desarrollo de un
medicamento para el tratamiento del dolor que comprende el uso de
una secuencia de polinucleótidos, seleccionada de SEQ ID No: 1, 2 ó
4, que codifica la Catepsina Y, o los homólogos, o la
proteína/polipéptido correspondiente, que comprende la determinación
de la eficiencia de un compuesto o agente en un modelo de dolor, en
el que la eficiencia del compuesto o agente se determina mediante
la consideración de la tasa de expresión del gen o mediante la
consideración de la actividad de la proteína.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
que comprende
- a)
- proporcionar una población celular bajo análisis que comprende células capaces de expresar el gen de la Catepsina Y, o los homólogos o fragmentos del mismo;
- b)
- poner en contacto dicha población celular bajo análisis con el agente terapéutico bajo análisis;
- c)
- detección de la expresión del gen o genes de la Catepsina Y en dicha población celular bajo análisis;
- d)
- comparación de la expresión del gen o genes en la población celular bajo análisis con la expresión del gen o genes en una población celular de referencia cuyo estado de enfermedad se conoce; y
- e)
- identificación de una diferencia en los niveles de expresión de las secuencias consideradas, si existe, entre la población celular bajo análisis y la población celular de referencia, identificando por lo tanto un agente terapéutico para el tratamiento del dolor.
3. El procedimiento según las reivindicaciones 1
ó 2, que comprende
- a)
- poner en contacto la proteína Catepsina Y con un compuesto/agente en presencia de un polipéptido que es una diana de la Catepsina Y,
- b)
- determinación del aminoácido amino terminal del péptido o de la cantidad de aminoácidos libres en la muestra, después de incubación,
- c)
- comparación del aminoácido amino terminal del péptido o de la cantidad de aminoácidos libre con el resultado en una muestra que no contiene el compuesto/agente.
4. Un procedimiento según la reivindicación 2 ó
3, en el que la expresión génica se considera o se determina
mediante PCR del cDNA, hibridación de una muestra de DNA o por
detección de la proteína correspondiente.
5. El uso de un compuesto que regula
negativamente la actividad de la Catepsina Y, codificado por SEQ ID
No: 1, 2 ó 4, para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento del dolor, en el que el compuesto tiene la fórmula
general
en la
que:
R se selecciona entre el grupo constituido por
hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, y en el que R y
R^{2} están unidos para formar una estructura en anillo de 4 a 10
átomos de carbono,
R' se selecciona entre el grupo constituido por
hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, y en el que R' y
R^{3} están unidos para formar una estructura en anillo de 4 a 10
átomos de carbono,
R^{1} se selecciona entre el grupo constituido
por
alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, sustituido
con de 1 a 5 sustituyentes, seleccionados entre el grupo constituido
por (a) arilo de 6 a 10 átomos de carbono, (b) arilo de 6 a 10
átomos de carbono, sustituido con de 1 a 3 sustituyentes,
seleccionados entre el grupo constituido por alquilo de 1 a 6 átomos
de carbono, arilo de 6 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6
átomos de carbono, ariloxi de 6 a 10 átomos de carbono, hidroxi,
ciano, halo y amino, (c) cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono y
(d) heterociclos de 3 a 14 átomos de carbono, que tienen de 1 a 3
heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por nitrógeno,
oxígeno y azufre,
en el que dicho grupo alquilo sustituido está,
opcionalmente, sustituido adicionalmente con de 1 a 2 grupos
hidroxilo,
alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, sustituido
con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados entre el grupo constituido
por (a) arilo de 6 a 10 átomos de carbono, (b) arilo de 6 a 10
átomos de carbono, sustituido con de 1 a 3 sustituyentes,
seleccionados entre el grupo constituido por alquilo de 1 a 6 átomos
de carbono, arilo de 6 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6
átomos de carbono, ariloxi de 6 a 10 átomos de carbono, hidroxi,
ciano, halo y amino, (c) cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono y
(d) heterociclos de 3 a 14 átomos de carbono, que tienen de 1 a 3
heteroátomos seleccionados entre el grupo constituido por nitrógeno,
oxígeno y azufre,
arilo de 6 a 10 átomos de carbono,
arilo de 6 a 10 átomos de carbono, sustituido
con de 1 a 3 sustituyentes, seleccionados entre el grupo constituido
por alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, arilo de 6 a 10 átomos de
carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, ariloxi de 6 a 10
átomos de carbono, hidroxi, ciano, halo y amino,
fluorofenilo,
heterociclos de 3 a 14 átomos de carbono que
tienen de 1 a 3 heteroátomos, seleccionados entre el grupo
constituido por nitrógeno, oxígeno y azufre;
R^{2} y R^{3} son, independientemente,
cadenas laterales de aminoácidos D o L de al menos 2 átomos de
carbono, con la condición de que dichas cadenas laterales de
aminoácidos no incluyen a la cadena lateral de la prolina;
R^{4} se selecciona entre el grupo constituido
por
-C(O)CH =N=N,
\hskip0.3cm-CH_{2}OH,
\hskip0.3cm-C=NOH,
\hskip0.3cmy
\hskip0.3cm-C(O)R^{5}
en el que R^{5} es hidrógeno,
alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, haloalquilo de 1 a 6 átomos de
carbono y de 1 a 2 grupos halo, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono,
-NR^{6}R^{7}, en el que R^{6} y R^{7} se seleccionan
independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno y
alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, y arilo de 6 a 10 átomos de
carbono, y -N
(CH_{3})OCH_{3};
X se selecciona entre el grupo constituido por
-O-, -NR^{9}- y -S-, en el que R^{9} se selecciona entre el
grupo constituido por hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono
y arilo de 6 a 10 átomos de carbono;
Y se selecciona entre el grupo constituido por
-C(O)- y -C(S)-;
m es igual a cero o uno; y
n es igual a cero, uno o dos,
o las sales de los mismos farmacéuticamente
aceptables
con la condición de que cuando R^{1} es
1-naftilo, R^{2} es
-CH(CH_{3})_{2} (isómero L), R^{3} es
-CH_{2}- \diameter (isómero L), Y es -C(O), m es cero y n
es uno, cuando R^{4} no es -N(CH_{3})OCH_{3},
con la condición adicional de que cuando R' es difenilmetilo,
R^{2} es p-(benciloxi)bencilo (isómero L), Y es
-C(O)- y m y n son cero, entonces
R^{4} no es
-N(CH_{3})OCH_{3}, y con, todavía, la condición de
que cuando R^{1} es (1,2 difenil)etenilo, Y es
-C(O)-, R^{2} es -CH_{2}- \diameter (isómero L) y m y n
son cero, entonces R^{4} no es
-N(CH_{3})OCH_{3}.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que
el compuesto se selecciona entre el grupo de
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7. El procedimiento para el diagnóstico del
estado de dolor fuera de un cuerpo vivo, o para la determinación de
la eficacia del tratamiento del dolor fuera de un cuerpo vivo,
caracterizado por el uso de una secuencia de polinucleótidos
que codifica la Catepsina Y, seleccionada de SEQ ID No: 1, 2 ó 4, o
los homólogos, o el polipéptido correspondiente, que comprende la
determinación de la eficiencia de un compuesto o agente mediante la
consideración de la tasa de expresión del gen o mediante la
consideración de la actividad de la proteína.
8. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y 7, o el uso según la reivindicación 5 ó
6, en el que el dolor es un dolor neuropático.
9. Un animal transgénico, no humano, en el que
el gen que codifica la Catepsina Y, según las SEQ ID No: 1, 2 ó 4,
o los homólogos, se manipula en el animal, lo que resulta en un
nivel de expresión o en una actividad de la proteína diferente, en
comparación con el tipo salvaje.
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