ES2291188T3

ES2291188T3 - Utilizacion de e5564 para el tratamiento de la sepsis por infusion intravenosa.

Info

Publication number: ES2291188T3
Application number: ES00904375T
Authority: ES
Inventors: Daniel P. Rossignol; Melvyn Lynn; William D. Kerns
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 1999-01-14
Filing date: 2000-01-14
Publication date: 2008-03-01
Anticipated expiration: 2020-01-14
Also published as: EP1158990B1; WO2000041703A1; DE60045750D1; EP2298326A2; DK1158990T3; EP1158990A1; EP1867336A2; EP1867336A3; DE60036790T2; ATE375798T1; EP2298326A3; PT1158990E; AU2614400A; CY1108039T1; EP1158990A4; CA2359478A1; ATE501760T1; EP1867336B1; DE60036790D1; JP2002534471A

Abstract

Utilización de un compuesto de fórmula a-D-glucopiranosa, 3-O-decil-2-desoxi-6-O-[2-desoxi-3-O-[(3R)-3-metoxidecil]-6-O-metil-2-[[(11Z)-1-oxo-11-octadecenil]amino]-4-O-fosfono-a-D-glucopiranosil]-2-[(1, 3-dioxotetradecil)amino]-1-(dihidrogenofosfato) para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un paciente que sufre un estado médico receptivo al tratamiento con dicho compuesto, en la que la composición se administra por infusión intravenosa a lo largo de un período de 12-100 horas, seleccionándose el estado médico de entre el grupo constituido por endotoxemia, sepsis y choque séptico.

Description

Utilización de E5564 para el tratamiento de la sepsis por infusión intravenosa.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un régimen de administración de un fármaco antiendotoxina.

Desde 1930, la utilización creciente de terapias inmunosupresoras y dispositivos invasivos, así como la incidencia creciente de resistencia a antibióticos en bacterias han conducido a un aumento gradual de los casos de sepsis y choque séptico. Actualmente, los casos de sepsis y choque séptico estimados en USA son de 400.000 y 200.000 pacientes/año, respectivamente. Esto produce aproximadamente 100.000 muertes/año, lo que hace del choque séptico la causa de muerte no coronaria más frecuente en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) de los hospitales. Actualmente, la terapia en UCI para choques sépticos se limita a terapia con antibióticos, resucitación cardiovascular, terapia vasopresora/ionotrópica y asistencia ventilatoria. Estos cuidados en UCI pueden comportar costes de hasta 1.500 dólares/día, y en promedio suponen un total de entre 13.000 y 30.000 dólares por paciente. Sin duda, tendrá un gran valor cualquier terapia que pueda reducir la morbidez y, en consecuencia, los costes de los cuidados en caso de sepsis/choque séptico.

Es probable que los propios antibióticos empeoren la morbidez asociada con la sepsis; su acción bactericida puede conllevar la liberación de endotoxinas por parte de bacterias Gram negativas, de las que se cree que inducen muchos fenómenos patofisiológicos, tales como fiebre, choque, coagulación intravascular diseminada (CID) e hipotensión. En consecuencia, desde hace tiempo se ha deseado disponer de medicinas para el tratamiento de sepsis Gram negativas, particularmente fármacos capaces de bloquear las endotoxinas o citoquinas derivadas de la estimulación celular mediada por endotoxinas. Con este objetivo, diversas estrategias de tratamiento han incluido anticuerpos contra LPS o citoquinas, tales como TNF-\alpha e interleucina-1. Estos enfoques han fracasado por razones diversas.

Mientras que la endotoxina en sí es una molécula altamente heterogénea, la expresión de muchas de las propiedades tóxicas de la endotoxina se atribuye a una porción de lípido A hidrofóbica altamente conservada. Un fármaco eficaz que actúa como antagonista de esta estructura conservada se conoce como E5564 (también conocido como compuesto 1287 y SGEA). Este fármaco se describe como compuesto 1 en la patente US nº 5.681.824. El E5564 presenta la siguiente fórmula:

(\alpha-D-glucopiranosa, 3-O-decil-2-desoxi-6-O-[2-desoxi-3-O-[(3R)-3-metoxidecil]-6-O-metil-2-[[(11Z)-1-oxo-11-octadecenil]amino]-4-O-fosfono-\beta-D-glucopiranosil]-2-[(1,3-dioxotetradecil)amino]-1-(dihidrogenofosfato)

y el mismo puede suministrarse como sal tetrasódica. El E5564 tiene un peso molecular de 1.401,6.

Sumario de la invención

Los solicitantes han descubierto que la administración de E5564 por infusión continua a lo largo de un período de 12-100 horas supera una vida media farmacodinámica del fármaco inesperadamente corta, lo que se ha observado sorprendentemente a pesar de que el E5564 muestra una vida media farmacocinética larga en circulación sanguínea.

Consecuentemente, la invención muestra la utilización de E5564 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar a un paciente afectado por endotoxemia (por ejemplo, endotoxemia relacionada con cirugía), sepsis o choque séptico.

En las utilizaciones según la invención, el E5564 se administra a pacientes por infusión intravenosa a lo largo de un período de 12-100 horas, preferentemente de 60-80 horas, y más preferentemente de 72 horas. La actividad en la UCI suele ser intensa, y las variaciones menores en el período de tiempo de infusión del fármaco están incluidas en el alcance de la invención.

Preferentemente, la velocidad de dosificación de infusión es de 0,001-0,5 mg/kg de peso corporal/hora, más preferentemente de 0,01-0,2 mg/kg de peso corporal/hora, y todavía más preferentemente 0,03-0,1 mg/kg de peso corporal/hora. Si se desea, la infusión del E5564 puede ir precedida por una inyección en bolo de E5564; preferentemente, dicha inyección en bolo se administra con una dosificación de 0,001-0,5 mg/kg. Preferentemente, la cantidad total de E5564 administrada a un paciente es de 50-600 mg de fármaco, más preferentemente de 150-500 mg, por infusión a lo largo de un período de 60-80 horas.

Ventajosamente, la dosificación total de fármaco es bastante alta, dando lugar a un efecto terapéutico máximo, pero sorprendentemente no da lugar a una toxicidad inaceptable. Particularmente, tal como se describe posteriormente, se ha descubierto que, aunque el E5564 inyectado o infundido permanece presente en la sangre durante un período de tiempo relativamente prolongado (es decir, el E5564 presenta una vida media farmacocinética relativamente larga), el período durante el cual es activo (es decir, su vida media farmacodinámica) es relativamente corto. De este modo, resulta ventajoso administrar el fármaco por infusión continua a lo largo de un período de tiempo prolongado.

La invención también incluye la utilización de E5564 en las dosis indicadas anteriormente para el tratamiento de los estados mencionados anteriormente, así como la utilización de E5564 en las dosis indicadas anteriormente para la preparación de medicamentos para tratar dichos estados.

Resultó inesperado que fuera posible una administración tan prolongada, ya que un compuesto antiendotoxina relacionado, de tres a diez veces menos activo, el B531 (patente US nº 5.530.113) no pudo administrarse de este modo y de manera segura a los pacientes debido a su toxicidad. Sorprendentemente, el E5564 es aproximadamente veinte veces menos tóxico que el B531 y, de este modo, puede administrarse a niveles relativamente altos durante períodos relativamente prolongados de tiempo, según los procedimientos de la invención. De este modo, los procedimientos según la invención proporcionan beneficios terapéuticos significativos, con una toxicidad aceptablemente baja. Otra ventaja de las utilizaciones según la invención es que se llevan a cabo fácilmente, ya que muchos de los pacientes tratados según los procedimientos de la invención ya tienen líneas intravenosas insertadas como parte de su tratamiento en la UCI.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada, de los dibujos y de las reivindicaciones siguientes.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que muestra la actividad antiendotoxina de E5564 tras una única inyección en bolo. Se inyectó intravenosamente endotoxina LPS (300 ng/kg) a perros no tratados (\medcirc), o simultáneamente con 0,1 mg/kg de E5564 (\Delta) una hora tras la administración de E5564 (\square) o tres horas después de la administración de E5564 (\bullet). Se extrajo sangre y se analizó su concentración de TNF-\alpha por bioensayo, tal como se describe en el apéndice. Cada valor representa el valor promedio \pm E.E.M. de cuatro animales.

La figura 2 es un gráfico que muestra la inducción de IL-6 en sangre de perro ex vivo; respuesta de dosis a LPS en muestras de sangre antes de la aplicación de la dosis. Se extrajeron muestras de sangre de los perros macho #101 (\medcirc) y #201 (\bullet) y de los perros hembra #151 (\square) y #251 (\blacksquare) antes de la aplicación de la dosis, se trataron con la cantidad indicada de LPS durante 3 horas y se analizó la liberación de IL-6 (ver apéndice).

La figura 3 es un gráfico que muestra los niveles de E5564 en plasma después de una única inyección en bolo. Tras la administración en bolo de 0,1 mg/kg de E5564 (\medcirc), 0,3 mg/kg de E5564 (\square) y 1 mg/kg de E5564 (\blacksquare), se extrajo sangre y se analizó la concentración de E5564 mediante extracción y análisis por HPLC. Cada valor representa el valor promedio \pm E.E.M. de tres animales. No se detectó fármaco en las muestras extraídas antes de administrar la dosis.

La figura 4 es un gráfico que muestra los niveles de E5564 en plasma durante y después de 72 horas de infusión intravenosa. Se determinaron los niveles en plasma de E5564 durante y después de 72 horas de infusión intravenosa de 0,03 mg/kg/h de E5564 (O, \bullet), 0,1 mg/kg/h de E5564 (\square, \blacksquare) y 1 mg/kg/h de E5564 (\Delta, \ding{115}) en perros beagle hembra (símbolos cerrados) o macho (símbolos abiertos). En los tiempos indicados, se extrajo sangre y se analizó la concentración de E5564 mediante extracción y análisis por HPLC. Cada valor representa el valor promedio \pm E.E.M. de tres animales. No se detectó fármaco en las muestras extraídas antes de administrar la dosis.

La figura 5 representa dos gráficos que muestran al análisis ex vivo de E5564 activo durante la infusión intravenosa. La actividad del E5564 se determinó durante la infusión intravenosa de 0,24 mg/kg/h de E5564 (\square, \medcirc) ó 2,4 mg/kg/h de E5564 (\blacksquare, \bullet) en perros beagle hembra (panel superior) o macho (panel inferior). En los tiempos indicados, se extrajo sangre y se analizó la concentración de E5564 añadiendo 1 ng/ml de LPS, incubando durante tres horas a 37ºC y analizando la fracción en plasma de IL-6 mediante bioensayo, tal como se describe en el apéndice. Cada valor representa el valor promedio \pm desviación estándar de las muestras analizadas por duplicado de cada animal. La muestra de hora cero se tomó antes de la infusión.

La figura 6 representa dos gráficos que muestran al análisis ex vivo de E5564 activo durante la infusión intravenosa. La actividad del E5564 se determinó durante la infusión intravenosa de 0,24 mg/kg/h de E5564 (\square, \medcirc) o 2,4 mg/kg/h de E5564 (\blacksquare, \bullet) en perros beagle hembra (panel superior) o macho (panel inferior). En los tiempos indicados, se extrajo sangre y se analizó la concentración de E5564 añadiendo 10 ng/ml de LPS, incubando durante tres horas a 37ºC y analizando la fracción en plasma de IL-6 mediante bioensayo, tal como se describe en el apéndice. Cada valor representa el valor promedio \pm desviación estándar de las muestras analizadas por duplicado de cada animal. La muestra de hora cero se tomó antes de la infusión.

La figura 7 son dos gráficos que muestran el análisis ex vivo de E5564 activo durante la infusión intravenosa. La actividad del E5564 se determinó durante la infusión intravenosa de 0,24 mg/kg/h de E5564 (\square, \medcirc) ó 2,4 mg/kg/h de E5564 (\blacksquare, \bullet) en perros beagle hembra (panel superior) o macho (panel inferior). En los tiempos indicados, se extrajo sangre y se analizó la concentración de E5564 añadiendo 100 ng/ml de LPS, incubando durante tres horas a 37ºC y analizando la fracción en plasma de IL-6 mediante bioensayo, tal como se describe en el apéndice. Cada valor representa el valor promedio \pm desviación estándar de las muestras analizadas por duplicado de cada animal. La muestra de hora cero se tomó antes de la infusión.

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Descripción detallada

Tal como se ha indicado anteriormente, los solicitantes han descubierto que la administración de E5564 por infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo relativamente largo supera una vida media farmacodinámica del fármaco inesperadamente corta, que sorprendentemente se ha observado a pesar de que el E5564 muestra una vida media farmacocinética larga en circulación sanguínea. Las utilizaciones de la invención, así como los datos experimentales relacionados con dichas utilizaciones, se describen a continuación.

Análisis de actividad del fármaco antiendotoxina

Muchos de los signos y síntomas de la sepsis pueden reproducirse in vivo mediante la administración de endotoxina a un sistema de modelo animal. Los efectos fisiológicos de la endotoxina pueden variar según la dosis, la ruta de administración y las especies analizadas, pero generalmente incluyen síntomas tales como temperatura elevada (fiebre), hipotensión, cambios en la composición celular de la sangre (descenso de leucocitos, etc.), y aumento de citoquinas proinflamatorias, tales como TNF-\alpha e IL-6, y algunas citoquinas antiinflamatorias. La actividad de un fármaco diseñado para contrarrestar los efectos de la endotoxina puede analizarse en estudios de modelos animales, determinando si el mismo bloquea alguno o todos estos marcadores fisiológicos de la actividad de la endotoxina.

En general, el antagonista candidato se administra a una especie de animal de ensayo, y se administra una dosis apropiada de endotoxina (lipopolisacárido (LPS)) con el fin de analizar la capacidad del antagonista candidato de bloquear los efectos de la endotoxina. Algunos de los experimentos descritos a continuación utilizan una carga in vivo de LPS administrada por vía intravenosa tanto durante como después de la infusión intravenosa de E5564. La actividad de un antagonista también puede analizarse ex vivo extrayendo muestras de sangre de animales tratados con el antagonista candidato y analizando dicha sangre con el fin de determinar si el fármaco está activo y/o presente en cantidades suficientes para inhibir la activación celular por LPS. En los dos ensayos, la actividad del antagonista se cuantifica mediante el análisis de las citoquinas inducidas por la administración de LPS. Además, otros síntomas fisiológicos del envenenamiento por endotoxina pueden utilizarse como lectura de la actividad. Los estudios descritos en el presente documento utilizan TNF-\alpha y/o IL-6 como lecturas de la activación celular, pero pueden utilizarse con este objetivo una variedad de otras citoquinas y mediadores celulares.

Análisis farmacodinámico de E5564 in vivo

Tal como se muestra en la figura 1 y en la tabla 1, el suministro de 300 ng/kg de LPS en perros beagle ("control" en la figura 1) da lugar a una respuesta intensa y reproducible, tal como se mide por los niveles de TNF-\alpha plasmático. La administración de 0,1 mg/kg de E5564 es completamente eficaz con el fin de bloquear esta carga de LPS cuando se administra al mismo tiempo que el LPS (compárese el control con la administración simultánea en la figura 1). Se obtienen resultados similares cuando se administra LPS una hora después de la administración del fármaco. Sorprendentemente, sin embargo, posteriormente disminuyó la eficacia del E5564. Es decir, si se administra esta misma carga de endotoxina tres horas después de la administración de la dosis de E5564 (E5564 3 horas antes de la administración de LPS), la actividad del antagonista de endotoxina disminuye significativamente, hasta aproximadamente el 48% de su actividad inicial. Esta vida media de actividad corta (es decir, la vida media farmacodinámica) es un resultado inesperado, ya que comparativamente la vida media farmacocinética del E5564 es extremadamente prolongada (véase a continuación). De este modo, mientras que el fármaco sin modificar (no metabolizado) parece mantenerse en circulación durante un período de tiempo relativamente largo, el mismo pierde actividad. Debido a este descubrimiento inesperado, los solicitantes han optado por administrar el E5564 por infusión.

Análisis farmacocinético in vivo de E5564 después de inyección en bolo

Tal como se muestra en las figuras 3 y 4 y en las tablas 2 y 3, el E5564 exhibe una vida media relativamente larga en sangre tras la inyección en bolo (figura 3 y tabla 2) o tras la infusión (figura 4 y tabla 3). Este análisis de los niveles de E5564 indica que el E5564 permanece en la sangre (o plasma) y no se elimina o se hace "desaparecer" rápidamente por parte de órganos tales como el hígado, los pulmones, los riñones, etc. Inicialmente, esta presencia prolongada de E5564 no modificado en sangre llevó a los solicitantes a creer que el fármaco activo estaba probablemente presente durante períodos muy largos de tiempo después de finalizar la administración del fármaco. Tal como demostraron los experimentos sucesivos, esta razonable suposición inicial resultó equivocada.

Análisis farmacocinético in vivo de E5564 durante la infusión

Para evaluar la actividad del E5564 a lo largo de múltiples instantes en un único animal tratado, los solicitantes utilizaron un ensayo ex vivo, tal como se ha mencionado anteriormente, con el fin de analizar el fármaco activo en muestras de sangre extraída de un animal tratado. Se extrajeron muestras de sangre de perros beagle infundidos con E5564 a lo largo de un período de 24 horas. Se sometió a ensayo un perro de cada sexo bajo cada uno de los dos regímenes de dosificación: una dosis baja de 0,24 mg/kg/h y una dosis alta de 2,4 mg/kg/h.

Se tomaron muestras de sangre de estos perros antes de administrar la dosis, 4 horas después de iniciarse la infusión y 24 horas después de iniciarse la infusión. Las muestras de sangre se cargaron con 0, 1, 10 ó 100 ng/ml de LPS, y a continuación se incubaron durante tres horas. A continuación se analizó la activación por LPS en las muestras, utilizando como lectura la inducción de respuesta por citoquinas. Tal como se muestra en las figuras 5-7, el E5564 inhibió la respuesta a LPS en función de la dosis de un modo dependiente del tiempo.

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Inhibición de liberación de IL-6 inducida por LPS en muestras de sangre ex vivo por infusión intravenosa de E5564 en perros beagle Efecto de la infusión de E5564 a 0,24 mg/kg/h

Tal como se muestra en las figuras 5-7, el E5564 infundido a 0,24 mg/kg/h inhibió la respuesta a LPS en muestras de sangre ex vivo en comparación con los niveles anteriores a la administración de la dosis. Se observaron las diferencias en la actividad inhibidora del E5564 con respecto a la cantidad de LPS añadido. Se observó una inhibición casi completa (\geq 98%) de la respuesta a 1 ng/ml de LPS en muestras de sangre ensayadas ex vivo 4 horas después del inicio de la infusión (véase figura 5). Al final de la infusión, la inhibición de una carga de LPS de 1 ng/ml fue completa en muestras obtenidas a partir de los dos perros tratados con dosis baja de LPS. Cuando se cargaron las muestras de sangre con 10 ng/ml de LPS, se observó una inhibición comprendida entre el 29 y el 70% a las 4 horas (figura 5) y una inhibición del \sim85% al finalizar la infusión. Las cargas de 100 ng/ml de LPS fueron pobremente inhibidas por esta velocidad de infusión de fármaco; la inhibición máxima fue del 34-52% (figura 7) al finalizar la infusión.

Efecto de la infusión de E5564 a 2,4 mg/kg/h

Tal como se muestra en la figura 5, las muestras tomadas 4 horas después de iniciarse la infusión de 2,4 mg/kg/h de E5564 mostraron una inhibición completa de la respuesta a 1 ng/ml de LPS, en comparación con las muestras tomadas antes de iniciarse la infusión, y una inhibición casi completa de las cargas de 10 y 100 ng/ml de LPS. Al finalizar la infusión (24 horas), la inhibición fue completa para las cargas de 1 y 10 ng/ml de LPS, y fue > 90% para la carga mayor de 100 ng/ml de LPS.

Estos resultados muestran que la infusión de E5564 en una dosis de 0,24 mg/kg/h ó 2,4 mg/kg/h inhibe la respuesta a LPS en sangre a lo largo del período de la infusión. La inhibición de la respuesta a LPS es dependiente de la dosis tanto para el E5564 como para la concentración de LPS utilizada como carga.

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TABLA 1 Análisis farmacodinámico de E5564 después de una única inyección intravenosa en bolo a perros

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TABLA 2 Parámetros farmacocinéticos para E5564 en plasma después de una única inyección intravenosa en bolo a perros

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TABLA 3 Parámetros farmacocinéticos para E5564 en plasma después de 72 horas de infusión intravenosa en perros

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Apéndice (1) Ensayos in vivo (1.1) Reactivos

El E5564 fue sintetizado por Eisai Research Institute of Boston, Andover, MA, USA. El producto farmacéutico de E5564 fue preparado en el Eisai Preclinical Laboratory (Tsukuba, Japón) disolviendo 35,4 mg de sustancia activa en 52,1 ml de NaOH 0,01 N, agitando durante una hora a temperatura ambiente y diluyendo en lactosa tamponada con fosfato. Después de ajustar el pH a 7,3 y diluir hasta una concentración final de 0,1 mg/ml de E5564, la solución se esterilizó por filtración y se liofilizó.

La formulación del fármaco en ampollas de 1 ml se muestra a continuación.

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Se adquirió LPS de Escherichia coli (serotipo 0111:B4; extraído con fenol, Cat. # L-2630) a través de Sigma Chem. Co. Ltd., St. Louis, MO, USA Se disolvió E5564 liofilizado en 5 ml de agua estéril (Otsuka Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japón). Se pesó el LPS con una precisión de 1/10 mg y se disolvió en 5% de glucosa (Otsuka Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japón). La solución de LPS se sonicó con un sonicador de tipo baño durante 15 minutos tras lo cual las alícuotas se prepararon y almacenaron inmediatamente a -20ºC. Antes de su utilización, la solución se sonicó durante uno a dos minutos, y las diluciones se prepararon a continuación en glucosa al 5%.

(1.2) Animales

Se obtuvieron perros beagle de nueve meses a través de Kawashima-shoji Co. Ltd. (Gifu, Japón) y se alojaron en jaulas de cable de acero (800 mm de ancho X 680 mm de profundidad X 680 mm de altura; un perro por jaula) dentro de un espacio con una temperatura constante de 20-24ºC, una humedad del 45-65% y 12 horas de ciclo diurno-nocturno. Se suministró a los animales comida en pastillas (DS, Oriental Yeast Co., Tokio, Japón) y agua según demanda. Se inyectó endotoxina LPS (300 ng/0,1 ml/kg) en la vena de la pata delantera derecha a una velocidad de 1-2 ml/min, y se inyectó E5564 en la vena de la pata delantera izquierda a una velocidad de 10-20 ml/min.

(1.3) Recogida de sangre y tratamiento

Inmediatamente antes ó 1, 2 ó 4 horas de la inyección intravenosa de LPS y E5564, se extrajeron 1,5 ml de sangre a través de la vena cefálica izquierda. Se transfirió un mililitro a un tubo que contenía 10 U de heparina (Mochida Pharm. Co. Ltd., Tokio, Japón), se centrifugó (2.000 x g, 5 minutos, 4ºC), y el plasma se utilizó en bioensayos para detección de TNF-\alpha e IL-6.

(1.4) Bioensayo de TNF

Se analizó el TNF en alícuotas del plasma mediante un bioensayo basado en la muerte celular dependiente de TNF de las células L-P3 en presencia de actinomicina D. La línea celular L-P3 es más sensible a la muerte celular inducida por TNF que la línea celular L-929, que se utiliza más habitualmente.

Se cultivaron células L-P3 en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, 100 U/ml de penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina. Las muestras de plasma objeto de análisis se diluyeron 5-100 veces, y se diluyeron en serie 0,1 ml de cada una de ellas en placas de cultivo de 96 pocillos. Se añadieron
7 x 10^{4} células L-P3 en 100 \mul de medio que contenía 1 \mug/ml de actinomicina D manitol (Sigma Chem. Co. Ltd., St. Louis, MO, USA) a cada pocillo que contenía las muestras de plasma, y se incubaron durante 15 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. La toxicidad celular inducida por TNF se midió utilizando azul de metileno tal como sigue. Los pocillos se lavaron con agua, por lo menos, 5 veces con el fin de eliminar las células muertas, después de lo cual las células se fijaron con 50 \mul de glutaraldehído y se tiñeron con 0,1 ml de una solución al 0,05% de azul de metileno en agua durante 15 minutos. El azul de metileno en exceso se eliminó lavando, por lo menos, 5 veces, después de lo cual se secó la placa. A continuación se reextrajo el azul de metileno de las células por adición de 0,2 ml de HCl 0,33 N a cada pocillo, y se midió la absorbancia con las longitudes de onda duales \lambda1^{405} y \lambda2^{660} nm en un lector de microplaca (ImmunoReader NJ-2000; Japan InterMed Co. Ltd., Tokio, Japón).

(1.5) Bioensayo de IL-6

Se analizó la actividad de IL-6 en alícuotas del plasma midiendo la proliferación dependiente de IL-6 de la línea celular del linfoma derivado de ratones, B9. Se cultivaron células en medio RPMI 1640 que contenía un 10% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, 2-mercaptoetanol 50 \muM, 100 U/ml de penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina y glutamato 2 mM. Se añadieron muestras de plasma diluidas diez veces o 500 pg/ml de estándar de IL-6 (IL-6 recombinante humana; Genzyme Corporation, Boston, MA) a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos, y a continuación se diluyeron en serie. Se añadieron a cada pocillo 1,5 x 10^{3} células B9 en 50 \mul de medio y las placas se incubaron durante tres días a 37ºC en 5% de CO_{2}.

Se midió la proliferación de células B9 por el método de tinción MTT, bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA). Se añadieron veinte microlitros de 6 mg/ml de MTT en solución salina Dulbecco tamponada con fosfato a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 3 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. A continuación, se añadieron 100 \mul/pocillo de SDS 10% (dodecilsulfato sódico; Nacalai Tesque Co. Ltd., Kyoto, Japón) en NH_{4}OH 1 mM, y las células se diluyeron durante una noche. Se determinó la absorbancia de cada pocillo mediante un lector de placa (Model 3550, Bio-Rad Labs, Richmond, CA, USA) con longitudes de onda duales \lambda1^{540} y \lambda2^{660} nm. Una unidad/ml de IL-6 humana es equivalente a 100 pg/ml.

(2) Ensayos ex vivo (2.1) Reactivos

Se adquirió LPS de Escherichia coli (0111:B4) a través de List Biologicals (Campbell, CA). El LPS se diluyó en agua estéril a 1 mg/ml y se almacenó a -20ºC. Antes de su utilización, el LPS se sonicó en un sonicador de baño (VW-380; Heat Systems-Ultrasonics Inc., Farmingdale, NY) durante 1-2 minutos inmediatamente antes de su utilización y se diluyó en solución salina de Hanks libre de Ca^{2+} y Mg^{2+} (HBSS; Sigma).

(2.2) Origen de las muestras y diseño del estudio

Se trataron perros con E5564 (0,24 ó 2,4 mg/kg/h) disuelto en una mezcla de solución de placebo (10% de lactosa monohidratada; 0,045% de Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,035% de NaH_{2}PO_{4}\cdotH_{2}O, 0,006% de NaOH; pH 7,4 \pm 0,3) y 5% de dextrosa (1:4) mediante infusión intravenosa a través de un catéter interno durante 24 horas a una velocidad de
2 mg/kg/h. El diseño del estudio se muestra en la tabla siguiente:

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(2.3) Análisis de actividad de E5564 en sangre entera de perro

Antes de la infusión de E5564, y durante la misma, se extrajo sangre en jeringas heparinizadas y, o bien se redujo asépticamente a plasma por centrifugación y se congeló a -80ºC (para muestras de tiempo cero), o bien se incubó con las concentraciones indicadas de LPS durante tres horas. A continuación se preparó el plasma y se congeló inmediatamente a -80ºC. Las muestras se almacenaron a -80ºC hasta su análisis.

(2.4) Bioensayo para IL-6

Se obtuvieron células B9 por donación de la Dra. Mary Rodrick (Beth Israel Deaconess Hospital, Boston, MA). Se cultivaron en medio DMEM de Iscove que contenía un 5% de suero bovino fetal (FBS), 2-mercaptoetanol 20 mM, L-glutamina 2 mM y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Para mantener el crecimiento, estas células se mantuvieron en medio de crecimiento que contenía 50 U/ml (ó 1 ng/ml) de IL-6 recombinante humana (Genzyme). Para la dependencia del crecimiento de IL-6 (bioensayo de IL-6), se lavaron las células B9 tres veces en medio de ensayo y se contaron, se ajustó la concentración celular a 4 x 10^{5}/ml (2 x 10^{4}/50 \mul) en el medio de ensayo, y se añadieron 50 \mul de medio a cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos.

A la suspensión celular descrita anteriormente se le añadieron 50 \mul de estándar o de muestra en cada pocillo, y las células se cultivaron durante 68-72 horas a 37ºC/5% de CO_{2}. Las muestras de plasma de perro se añadieron al ensayo en una dilución de 1:20 (10 \mul + 190 \mul) en medio de ensayo (por duplicado), y a continuación se diluyeron en serie a 1:4 (hasta una disolución final de 1:327.680) en placas de microtitulación de 96 pocillos. A continuación se transfirieron cincuenta microlitros de cada dilución a una placa de microtitulación de ensayo apropiadamente etiquetada. Se prepararon curvas estándar (2-4 filas/placa, dependiendo del espacio de la placa) utilizando rIL-6 humana como estándar (10 \mug/ml), diluida a 1:100, y a continuación diluida otra vez a 1:10 hasta 10 ng/ml. Se añadieron doscientos microlitros de esta disolución a una placa de dilución, y a continuación se diluyó cada una de ellas en serie a 1:4, recibiendo 2 pocillos, como blanco, 50 \mul de medio de ensayo. Después del periodo de cultivo, se cuantificaron las células de metabolización activa añadiendo 10 \mul de una solución de 5 mg/ml de MTT, bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio en PBS estéril a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 4-5 horas a 37ºC, se añadió ácido-isopropanol (150 \mul de HCl 40 mM en isopropanol) a cada pocillo, se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC, a continuación se trituraron repetidamente con el fin de disolver los cristales y se realizó la lectura de la absorbancia a 540 y a 690 nm (absorbancia de fondo). La concentración de IL-6 se determinó mediante el cálculo de una relación lineal para la respuesta a los estándares de IL-6, con lo que se obtuvo la mayor región dosis-respuesta de la curva estándar. (En general, este intervalo está comprendido entre 0,016 y 0,063 ng/ml de IL-6, obteniéndose absorbancias netas entre \sim0,3 y 0,4 para la dosis baja y entre \sim0,8 y 1,0 para la dosis alta). Sólo se utilizaron las absorbancias que se encontraban dentro de los valores mencionados anteriormente para los estándares (ó \pm 0,05 AU) para calcular la IL-6
por interpolación a partir de la curva lineal dibujada por el programa Four Parameter Curve Fit (Delta Soft) a través de los puntos estándar.

(2.5) Inducción de IL-6 mediante carga de LPS en muestras de sangre ex vivo

Para obtener valores de línea de base para la estimulación de LPS, se extrajeron muestras de sangre aproximadamente una hora antes del inicio de la administración (predosis). Aunque los solicitantes no analizaron minuciosamente la relación dosis-respuesta de la sangre de perro al LPS, utilizaron 1, 10 y 100 ng/ml de LPS para asegurar que podía generarse una respuesta medible. Las respuestas a LPS en estas muestras resultaron entre 6.000 pg/ml de IL-6 hasta 40.000 pg/ml de IL-6 en respuesta a 100 ng/ml de LPS en los cuatro perros. Algunas muestras (particularmente de los dos perros hembra) exhibieron una respuesta más escalonada a las tres concentraciones diferentes de LPS. Sin embargo, todas las muestras de predosis cargadas con LPS generaron entre 3.000 pg/ml de IL-6 y 32.000 pg/ml de IL-6.
La sangre de los beagle macho respondió más vigorosamente que la sangre de las hembras.

Claims

1. Utilización de un compuesto de fórmula \alpha-D-glucopiranosa, 3-O-decil-2-desoxi-6-O-[2-desoxi-3-O-[(3R)-3-metoxidecil]-6-O-metil-2-[[(11Z)-1-oxo-11-octadecenil]amino]-4-O-fosfono-\beta-D-glucopiranosil]-2-[(1,3-dioxotetradecil)amino]-1-(dihidrogenofosfato) para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un paciente que sufre un estado médico receptivo al tratamiento con dicho compuesto, en la que la composición se administra por infusión intravenosa a lo largo de un período de 12-100 horas, seleccionándose el estado médico de entre el grupo constituido por endotoxemia, sepsis y choque séptico.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la infusión se lleva a cabo a lo largo de un período de 60-80 horas.

3. Utilización según la reivindicación 2, en la que la infusión se lleva a cabo a lo largo de un período de 72 horas.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que la velocidad de infusión/dosificación es de 0,001-0,5 mg/kg de peso corporal/hora.

5. Utilización según la reivindicación 4, en la que la velocidad de infusión/dosificación es de 0,01-0,2 mg/kg de peso corporal/hora.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que la velocidad de infusión/dosificación es de 0,03-0,1 mg/kg de peso corporal/hora.

7. Utilización según la reivindicación 1, en la que dicha infusión está precedida por una inyección en bolo de dicho compuesto.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que dicha inyección en bolo es a una dosificación de 0,001-0,5 mg/kg de peso corporal.

9. Utilización según la reivindicación 1, en la que la cantidad total de dicho compuesto administrada al paciente es de 50-600 mg de fármaco.

10. Utilización según la reivindicación 9, en la que la cantidad de fármaco administrada es de 150-500 mg a lo largo de un período de 60-80 horas.

11. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicha endotoxemia es una endotoxemia relacionada con cirugía.