ES2289385T3 - Microscopio confocal de exploracion rapida por laser de lineas multiples. - Google Patents
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Abstract
Un microscopio de exploración confocal por láser, que comprende: un medio, incluyendo una fuente (1) de luz de láser, para emitir haces de luz de láser en diferentes longitudes de onda; una trayectoria de haces para dirigir los citados haces de luz de láser desde el citado medio de emisión de haces de luz de láser a un portaobjetos que soporta un objeto, incluyendo la citada trayectoria: un primer deflector, incluyendo un deflector acústico - óptico (5) para efectuar la exploración de líneas, al menos un objetivo (9) para enfocar los haces de luz de láser sobre el objeto en el citado portaobjetos, un segundo deflector(7) situado entre el citado deflector acústico - óptico (5) y el citado al menos un objetivo (9), para efectuar la exploración de marcos, estando situados el citado segundo deflector (7) y el citado al menos un objetivo (9) de manera que los haces (19) de luz de retorno desde el objeto sigan la misma trayectoria que los haces de luz de láser enfocados sobre el objeto, hasta e incluyendo el segundo deflector (7), al menos un detector (15; 26) situado en la trayectoria de haces de luz de retorno aguas abajo del citado segundo deflector (7), para detectar los haces de luz de retorno desde el objeto, estando adaptado el objeto para ser explorado por los haces de luz de láser desde el medio de emisión de haces de luz de láser y estando adaptadas las mediciones para realizarse con el citado al menos un detector (15; 26) con los del fin de obtener imágenes del objeto, y un sistema electrónico de control y formación de imágenes adaptado para controlar el medio de emisión de haces de luz de láser para emitir haces de luz de láser individuales secuencialmente en longitudes de onda seleccionadas y adaptado para ajustar dinámicamente los parámetros de accionamiento del citado deflector acústico - óptico (5) controlando dinámicamente la frecuencia de inicio y la frecuencia final del deflector acústico - óptico de manera que mantenga una posición de exploración de líneas constante en todas las longitudes de onda del haz de entrada, y controlando dinámicamente la velocidad de cambio de frecuencia de la señal de accionamiento al deflector acústico - óptico de manera que se obtenga un efecto de lenticularidad constante en todas las longitudes de onda del haz de entrada, para mantener la alineación de las líneas de exploración de la imagen en todas las longitudes de onda.
Description
Microscopio confocal de exploración rápida por
láser de líneas múltiples.
La inclusión de un deflector acústico-óptico
para realizar la exploración de líneas de un punto de láser en un
microscopio confocal de láser produce una unidad que puede funcionar
con alta velocidad y flexibilidad, es decir, con amplitud de
exploración variable y adecuada para los distintos tipos de
microscopia confocal. Como resultado de la exploración rápida de
líneas y marcos, será entonces posible en un espacio muy corto de
tiempo, combinar electrónicamente un número de secciones delgadas de
imágenes para formar una imagen con una profundidad focal
incrementada. Tales colecciones de secciones de imágenes se pueden
convertir fácilmente en una reconstrucción en tres dimensiones del
volumen del objeto original, con lo cual las relaciones espaciales
entre los componentes del objeto pueden ser visualizadas y medidas
rápidamente.
La figura 1 muestra un ejemplo de un microscopio
confocal de exploración por láser en el cual se utiliza un
deflector acústico-óptico para proporcionar la exploración de líneas
de un punto de láser. Tal microscopio de exploración confocal por
láser se muestra en el documento
EP-A-0 284 136.
Un haz 1 de luz de láser pasa por un sistema
óptico 2 y 3 de expansión de haces, seguido por un divisor 4 de
haces, un deflector 5 acústico-óptico que tiene una lente 5.1
cilíndrica plana y una lente 5.2 convexa plana, ambas en el lado de
entrada y de salida, una lente 6, un deflector 7 que puede ser un
galvanómetro de espejo, una lente 8, una placa 16 de cuarto de
onda, y un objetivo 9 para enfocar el haz de láser 18 sobre un
objeto. Es un plano 10 de objeto, un objeto, no mostrado, se coloca
adicionalmente sobre un portaobjetos estacionario. La luz reflejada
19 recorre una trayectoria de retorno idéntica a la trayectoria
hacia fuera hasta el divisor 4 de haces, después de lo cual se
divide por un filtro 11 de polarización, un objetivo 13 adicional,
un filtro espacial 14, una lente 17, un filtro 12 de paso de banda o
de corte, y finalmente, un detector 15.
La figura 2 ilustra otro ejemplo. Un espejo 20
dicromático se ha incorporado en la trayectoria de luz entre la
lente 5.1 plana cilíndrica y la lente 6. Tal espejo transmite la luz
de láser (onda corta) y refleja la luz de retorno de onda larga,
que se origina, por ejemplo, por fluorescencia. Se hace notar que un
simple cambio en la geometría permitirá el uso de un espejo
dicromático que refleje la luz de láser (onda corta) y transmita la
luz de retorno de onda larga. Esta luz pasa a través de una lente 21
de corrección y es enfocada con un objetivo 22 en un filtro
espacial 23 que es un filtro de ranura, como resultado de lo cual
este sistema tiene características confocales. De esta manera, se
forma un detector de líneas con una lente 24 posterior y un
detector 26. Entre la lente 24 y el detector 26 se han incorporado
uno o más filtros 25 de paso de banda o de corte que tienen la
misma función que la del filtro 12 de paso de panda o de corte. Con
esta realización, la luz de retorno que tiene una longitud de onda
distinta a la de la luz saliente puede ser examinada ventajosamente
si el detector acústico-óptico tiene una eficiencia demasiado baja
para la citada luz, es decir, produce una atenuación demasiado
grande.
En los objetos biológicos que son auto
fluorescentes, o que han sido etiquetados con sondas fluorescentes,
un requisito frecuente es extraer imágenes de componentes multi
espectrales del objeto que permitan que se estudien las relaciones
espaciales entre los distintos componentes etiquetados que van a ser
estudiados. Los objetos biológicos vivos contienen ciertos procesos
dinámicos que puede ser etiquetados fluorescentemente, de manera
que repitiendo la misma exploración multi espectral del objeto, las
dinámicas temporales de estos procesos también puede ser
estudiadas. En todos estos tipos de experimentos es importante tener
la capacidad de conmutar rápidamente las longitudes de onda de
excitación durante el proceso de exploración y la invención esta
dirigida a proporcionar un procedimiento para conseguir la
exploración rápida con longitudes de ondas múltiples en un
microscopio de exploración confocal por láser basado en un deflector
acústico-óptico que proporciona la exploración rápida con múltiples
longitudes de onda.
El documento US-B- 6.449.039 se
refiere a un microscopio de exploración confocal por láser de dos
fotones o multi fotón basado en la tecnología de exploración AOD
que utiliza fuentes de láser de impulsos cortos. En este tipo de
microscopios, la rotación del AOD (y del espejo/prisma) es requerida
para conseguir una transferencia eficiente de la iluminación a
través del AOD en las longitudes de onda próximas al IR requeridas
para este tipo de microscopia confocal. Con los impulsos cortos
utilizados en este tipo de de microscopio no son posibles la
conmutación rápida o los cambios en longitudes de onda de entrada y
como consecuencia, el efecto de lenticularidad no está solucionado
en esta referencia.
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La presente invención proporciona un microscopio
de exploración confocal por láser como se define en la
reivindicación 1 o en la reivindicación 2, y un procedimiento para
conseguir la exploración rápida con múltiples longitudes de ondas en
un microscopio de exploración confocal por láser basado en un
deflector acústico-óptico como se define en las reivindicaciones 18
ó 19. Realizaciones preferentes se definen en las reivindicaciones
dependientes.
La figura 1 muestra un ejemplo de un microscopio
confocal de exploración por láser de la técnica anterior, en el cual
se utiliza un deflector acústico-óptico para proporcionar la
exploración de líneas de un punto láser;
La figura 2 muestra otro ejemplo de un
microscopio confocal de exploración por láser de la técnica
anterior;
La figura 3 es un diagrama que explica el rango
de ángulos de deflexión utilizables disponibles del deflector
acústico-óptico (AOD) utilizado en un microscopio confocal de
exploración por láser de acuerdo con la presente invención.
La figura 4 es un diagrama que explica la mejora
en el rango de exploración angular cuando un deflector
acústico-óptico es girado mecánicamente respecto a su eje central de
acuerdo con la presente invención.
Cuando se utiliza un deflector acústico-óptico
como un elemento de deflexión en un sistema de exploración, hay un
número de desventajas que deben ser consideradas.
Como resultado de la naturaleza dispersiva del
deflector acústico-óptico, la luz de retorno de una longitud de
onda (por ejemplo, fluorescente) distinta a la de la luz de láser ya
no pasa a través el filtro espacial. El filtro espacial puede ser
desplazado por tres cristales piezo eléctricos, uno para cada uno de
los tres ejes de sistema de coordenadas XYZ y ser controlado de una
manera que elimine este efecto.
Debido al tiempo de tránsito a través de la
abertura del deflector acústico-óptico de un cambio en la frecuencia
de la onda acústica, un deflector acústico-óptico produce un efecto
de "lenticularidad" cilíndrica producida por la diferencia en
los ángulos de deflexión de la longitud de onda incidente en los dos
extremos de la abertura del deflector acústico-óptico. La
diferencia en el ángulo de deflexión entre los extremos de la
abertura del deflector acústico-óptico se incrementa con las
velocidades de exploración por deflexión incrementadas puesto que
el tiempo de tránsito a través de la abertura del deflector
acústico-óptico es constante.
La ecuación de Bragg (longitud de onda = 2 x
frecuencia acústica x sen(ángulo de deflexión)) describe como el
ángulo de deflexión depende de la longitud de onda de un haz de luz
que pasa a través de un deflector acústico-óptico. El ángulo de
deflexión absoluto y la diferencia en los ángulos de deflexión del
haz de luz en los extremos de la abertura del deflector
acústico-óptico se incrementa con la longitud de onda creciente del
haz de luz cuando un oscilador que acciona el deflector
acústico-óptico sigue un patrón repetitivo constante de barridos de
frecuencia.
Sin intención de corregir los efectos de la
lenticularidad descritos más arriba, los cambios en la longitud de
onda del haz de luz de iluminación y los cambios en la velocidad de
exploración afectarán la posición y el tamaño del área barrida de
la muestra y también degradarán la calidad de la imagen debido a la
introducción de astigmatismo en la trayectoria óptica. La invención
ofrece varios procedimientos para compensar el efecto de la
lenticularidad.
De acuerdo con una primera realización, un
procedimiento para conseguir una exploración rápida en longitudes
de onda múltiples en un microscopio de exploración confocal por
láser basado en un deflector acústico-óptico de acuerdo con la
invención comprende ajustar dinámicamente una trayectoria óptica del
citado microscopio confocal basado en un deflector óptico acústico
por medios mecánicos de acuerdo con una longitud de onda
seleccionada de un haz de luz de láser, ajustando la posición de
una lente de compensación de astigmatismo asociada con el deflector
acústico-óptico y la posición de una lente de colimación, de manera
que el movimiento de la lente de compensación de astigmatismo
contrarreste el astigmatismo inducido por los cambios en la longitud
de onda del haz de entrada o la velocidad de exploración por
deflexión y el movimiento de la lente de colimación contrarreste
cualquier cambio de foco debido al reposicionado de la lente de
compensación de astigmatismo, compensando de esta manera el
astigmatismo y los cambios de colimación producidos por el cambio de
la longitud de onda del haz de entrada y modificando las imágenes
detectadas de un objeto por medios electrónicos para mantener la
alineación de las líneas de exploración de la imagen en todas las
longitudes de onda.
Un microscopio de exploración confocal por láser
de acuerdo con esta realización de la invención comprende: un
medio, que incluye una fuente de luz de láser, para emitir haces de
luz de láser en diferentes longitudes de onda, una trayectoria de
haces para dirigir los citados haces de luz de láser del citado
medio de emisión de haz de luz de láser a un portaobjetos que
soporta un objeto, incluyendo la citada trayectoria de haces un
primer deflector que incluye un deflector acústico-óptico para
efectuar la exploración de líneas y una lente de compensación de
astigmatismo asociada con el deflector acústico-óptico, al menos un
objetivo para enfocar los haces de luz de láser sobre el objeto en
el citado portaobjetos, un segundo deflector situado entre el
citado deflector acústico-óptico y el citado al menos un objetivo,
para efectuar la exploración de marcos, estando situados el citado
segundo deflector y el citado al menos un objetivo de manera que los
haces de luz de retorno del objeto sigan la misma trayectoria de
haces que los haces de luz de láser enfocados sobre el objeto hasta
e incluyendo el segundo deflector, una lente de colimación situada
entre el primer deflector y el segundo deflector, estando situado
al menos un detector en la trayectoria de haces de luz de retorno
aguas abajo del citado segundo deflector, para detectar la luz los
haces de luz de retorno desde el objeto, estando adaptado el objeto
para ser explorado por los haces de luz de láser desde el medio de
emisión de haces de luz de láser y estando adaptadas las mediciones
para realizarse con el citado al menos un detector con el fin de
obtener imágenes del objeto, y un sistema electrónico de control y
formación de imágenes adaptado para controlar el medio de emisión
de haces de luz de láser para emitir haces de luz de láser de
diferentes longitudes de onda seleccionadas y adaptado para ajustar
dinámicamente la trayectoria óptica por medios mecánicos de acuerdo
con la longitud de onda seleccionada de los haces de luz de láser
ajustando la posición de la lente de compensación de astigmatismo y
la posición de la lente de colimación, de manera que el movimiento
de la lente de compensación de astigmatismo contrarreste el
astigmatismo inducido por los cambios en la longitud de onda del
haz de entrada o la velocidad de exploración por deflexión y el
movimiento de la lente de colimación equilibre cualquier cambio de
foco debido al posicionado de la lente de compensación de
astigmatismo, contrarrestando de esta manera el astigmatismo y los
cambios de colimación producidos por los cambios en la longitud de
onda del haz de entrada y/o la velocidad de exploración por
deflexión, y adaptado para modificar las imágenes obtenidas del
objeto por medios electrónicos para mantener la alineación de las
líneas de exploración de la imagen en todas las longitudes de
onda.
De esta manera, una primera realización describe
la compensación del astigmatismo entre los efectos de enfoque que
se han descrito previamente utilizando un medio mecánico para
cambiar la posición de los componentes ópticos de corrección dentro
de la trayectoria óptica. Una lente de astigmatismo se mueve a una
posición para corregir los cambios de astigmatismo y una lente de
colimación se mueve para asegurar que el haz que entra en un
objetivo final está enfocado por ese objetivo al mismo plano focal
en el objeto que está siendo explorado. Los cambios restantes en la
posición de la imagen producidos por los cambios en la posición de
la línea de exploración en el objeto, debido a los cambios de
ángulos de deflexión con los cambios de la longitud de onda, son
compensados utilizando desplazamiento, zoom y corte de software de
los datos de la imagen registrada para mantener el tamaño y
posición idénticos de las imágenes en todas las longitudes de
onda.
La corrección del astigmatismo y de la
colimación por medios mecánicos a menudo es demasiado lenta para
permitir la conmutación rápida de las longitudes de onda del haz de
entrada deseadas en la investigación biológica. Para el estudio de
las dinámicas en los objetos biológicos es preferible realizar la
conmutación de la longitud de onda en base a línea de exploración
por línea de exploración, manteniéndose las frecuencias de la línea
de exploración típicamente en el rango de las decenas de
kilohercios.
De acuerdo con una secunda realización, un
procedimiento para conseguir una exploración rápida en longitudes
de onda múltiples en un microscopio de exploración confocal por
láser basado en un deflector acústico-óptico de acuerdo con la
presente invención comprende controlar dinámicamente la frecuencia
de inicio y la frecuencia final del deflector acústico-óptico de
manera que mantenga una posición de exploración de líneas constante
en todas las longitudes de onda del haz de entrada, y controlar
dinámicamente la velocidad del cambio de frecuencia de la señal de
accionamiento del deflector acústico-óptico de manera que se obtenga
un efecto de lenticularidad constante en todas las longitudes de
onda del haz de entrada, para mantener la alineación de las líneas
de exploración de una imagen de un objeto en todas las longitudes
de onda.
Un microscopio de exploración confocal por láser
de acuerdo con esta realización de la invención comprende: un
medio, incluyendo una fuente de haces de luz de láser, para emitir
haces de luz de láser en diferentes longitudes de onda, una
trayectoria de haces para dirigir los citados haces de luz de láser
desde el citado medio de emisión de haces de luz de láser a un
portaobjetos que soporta un objeto, incluyendo la citada trayectoria
de haces un primer deflector que incluye un deflector
acústico-óptico para efectuar la exploración de líneas, al menos un
objetivo para enfocar los haces de luz de láser sobre el objeto en
el citado portaobjetos, un segundo deflector situado entre el
citado deflector acústico-óptico y el citado al menos un objetivo,
para efectuar la exploración de marcos, estando situados el citado
segundo deflector y el citado al menos un objetivo de manera que
los haces de luz de retorno del objeto sigan la misma trayectoria de
haces que los haces de luz de láser enfocados sobre el objeto hasta
e incluyendo el segundo deflector, al menos un detector situado en
la trayectoria de haces de luz de retorno aguas abajo del citado
segundo deflector, para detectar los haces de luz de retorno del
objeto, estando adaptado el objeto para ser explorado por los haces
de luz de láser desde el citado medio emisor de haces de luz de
láser y estando adaptadas las mediciones para ser realizadas con el
citado al menos un detector con el fin de obtener imágenes de ese
objeto, y un sistema electrónico de control y formación de imágenes
adaptado para controlar el medio de emisión de haces de luz de láser
para emitir los haces de luz de láser individuales secuencialmente
en unas longitudes de onda seleccionadas y adaptado para ajustar
dinámicamente los parámetros de accionamiento del citado deflector
acústico-óptico controlando dinámicamente la frecuencia de inicio y
la frecuencia final del deflector acústico-óptico, de manera que
mantenga una posición de exploración de líneas constante en todas
las longitudes de onda de haces de entrada, y controlando
dinámicamente la velocidad del cambio de frecuencia de la señal de
accionamiento del deflector acústico-óptico de manera que se
obtenga un efecto de lenticularidad constante en todas las
longitudes de onda de haces de entrada, para mantener la alineación
de las líneas de exploración de la imagen en todas las longitudes de
onda.
La segunda realización descrita de esta manera
describe un procedimiento para conseguir las correcciones rápidas
del efecto de lenticularidad en un deflector acústico-óptico
permitiendo la conmutación rápida de las longitudes de onda de los
haces de entrada de manera que las exploraciones sucesivas a lo
largo de una línea en el objeto podrán realizarse con diferentes
longitudes de onda sin reducir la frecuencia de exploración.
El rango de deflexión para un haz de entrada
particular depende de la longitud de onda, explorando las longitudes
de onda más largas un rango más amplio de ángulos de deflexión de
acuerdo con las ecuaciones de Bragg. Si un experimento requiere el
uso de un rango amplio de longitudes de onda de iluminación, el
campo de vista utilizable puede ser limitado por este efecto.
\global\parskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una tercera realización que está
basada en las realizaciones primera y segunda, un procedimiento
para realizar una exploración rápida en longitudes de onda múltiples
en un microscopio de exploración confocal por láser basado en un
deflector acústico-óptico de acuerdo con la presente invención
comprende un sistema electrónico de control y formación de imágenes
adaptado para ajustar dinámicamente los parámetros de accionamiento
del citado deflector acústico-óptico de acuerdo con una longitud de
onda seleccionada de un haz de luz de láser, para mantener la
alineación de las líneas de exploración de la imagen en todas las
longitudes de onda, y un pivotamiento mecánico del deflector
acústico-óptico respecto a su eje central para compensar los
diferentes ángulos de deflexión y los rangos de las longitudes de
onda de iluminación utilizadas.
Un microscopio de exploración confocal por láser
de acuerdo con esta realización de la invención comprende, además
de las características de las realizaciones primera y segunda, un
espejo 27 situado para dirigir la luz incidente sobre la abertura
de entrada del deflector acústico-óptico 5. El espejo 27 y el
deflector acústico-óptico 5 están montados sobre una base común 28
y dispuestos de manera que puedan rotar conjuntamente respecto al
eje central del deflector acústico-óptico 5 como se muestra en la
figura 4. El eje central de pivotamiento del deflector
acústico-óptico 5 es ortogonal al plano en el cual el haz de luz
incidente es deflectado por el deflector acústico-óptico.
El sistema electrónico de control y formación de
imágenes de esta realización está adaptado adicionalmente para
controlar un medio mecánico para efectuar el pivotamiento del
deflector acústico-óptico respecto al eje de pivotamiento central
para realinear las exploraciones en longitudes de ondas
diferentes.
De esta manera, la tercera realización describe
un procedimiento para conseguir correcciones rápidas del efecto de
lenticularidad en el deflector acústico-óptico que permite una
conmutación rápida de las longitudes de onda del haz de entrada de
manera que se podrán realizar exploraciones sucesivas a lo largo de
una línea en el objeto en diferentes longitudes de onda sin reducir
la frecuencia de exploración, y un procedimiento para incrementar
el rango utilizable de deflexión del deflector acústico-óptico en un
rango en longitudes de onda de iluminación pivotando el deflector
acústico-óptico junto con el espejo 27.
En la primera realización se utilizan medios
mecánicos para mover una lente de astigmatismo y de colimación a
posiciones predeterminadas en cada longitud de onda del haz de
entrada por medio del sistema electrónico de control. Tal medio
mecánico puede estar provisto por motores eléctricos de distintos
tipos, incluyendo tipos de CA, CC y escalonados, o por actuadores
electromecánicos tales como cristales piezo eléctricos. La posición
de la lente de astigmatismo tiene una relación casi lineal con la
longitud de onda del haz de entrada cuando corrige el cambio en los
ángulos de deflexión producidos por cambios en la longitud de onda
del haz de entrada. La posición de la lente de colimación está
determinada experimentalmente para cada longitud de onda puesto que
esta lente compensa cualquier cambio en el enfoque de los cambios en
la posición de los elementos de compensación óptica.
El sistema electrónico de control también puede
calcular las señales de control adecuadas para sincronizar la
selección de la longitud de onda del haz de entrada y también para
sincronizar una modulación de intensidad y/o el vaciado del haz de
entrada durante cualquier porción elegida del patrón de exploración.
Los cambios posicionales en la imagen son corregidos por
desplazamiento, zoom y corte de los datos de imágenes registrados
por software del sistema asociado de formación de imágenes.
En la segunda realización, un sistema
electrónico de control proporciona control dinámico de la frecuencia
de inicio, frecuencia final y velocidad de cambio de frecuencia de
la señal de accionamiento al deflector acústico-óptico, de manera
que se mantenga la posición de exploración de líneas constante y un
efecto de lenticularidad constante en todas las longitudes de onda
del haz de entrada.
Por medio de la ecuación de Bragg se sabe que
para mantener el mismo ángulo de deflexión en cualquier longitud de
onda del haz de entrada la separación de la rejilla acústica debe
cambiar proporcionalmente, esto se consigue cambiando la frecuencia
de un oscilador que acciona el deflector acústico-óptico. La
frecuencia del oscilador de accionamiento es barrida en un rango de
valores para efectuar la exploración del haz de láser a lo largo de
una línea. Ajustando el rango de frecuencias de exploración de
acuerdo con la ecuación de Bragg en cada longitud de onda del haz
de entrada permite una línea idéntica de posiciones de puntos que se
van a explorar con cualquiera de estas longitudes de onda.
Las frecuencias de inicio y final del oscilador
de accionamiento se calculan a partir de características de
deflexión conocidas del deflector acústico-óptico en las longitudes
de onda del haz de entrada y se eligen dinámicamente para mantener
un exploración óptica idéntica en cada longitud de onda del haz de
entrada, y por lo tanto mantienen un efecto de lenticularidad
constante en cada longitud de onda de los haces de entrada. De esta
manera, el sistema óptico se puede optimizar para una condición de
lenticularidad, manteniéndose esta condición dinámicamente en todas
las velocidades de exploración y longitudes de onda del haz de
entrada por medio del control de software de ordenador de los
parámetros de accionamiento del deflector acústico-óptico.
Para mantener una velocidad de exploración
idéntica en cada pixel situado idénticamente en el objeto explorado
en cualquier longitud de onda del haz de entrada, se requiere que
los ángulos de deflexión de un deflector acústico-óptico al inicio
y al final de cada exploración sean los mismos en todas las
longitudes de onda del haz de entrada.
\newpage
A partir de la ecuación de Bragg es obvio que el
ángulo de deflexión de la luz que pasa a través de un deflector
acústico-óptico se incrementa directamente en proporción a las
longitudes de onda de ese haz de luz cuando la frecuencia de
accionamiento acústico, y por lo tanto la longitud de onda acústica,
se mantienen constantes.
Si se define la frecuencia acústica máxima
disponible para accionar el deflector acústico-óptico (AOD) que
proporciona la máxima deflexión (correspondiéndose a un borde, por
ejemplo el derecha, del área explorada) para la longitud de onda de
luz más corta que debe ser deflectada, y de manera similar se define
la frecuencia acústica mínima disponible para accionar el AOD
proporcionando la mínima deflexión (correspondiéndose al otro
borde, por ejemplo el izquierdo, del área explorada) para la
longitud de onda de luz más larga que debe ser deflectada, entonces
cualquier rango de longitudes de líneas exploradas, entre los
citados bordes izquierdo y derecho del área explorada, se pueden
duplicar a estas o cualquier longitud de onda intermedias. Las
frecuencias acústicas necesarias para proporcionar una longitud de
línea de exploración requerida y una posición en el interior del
citado rango en cualquier longitud de onda requerida se pueden
calcular en proporción a la longitud de onda de la luz que va a ser
deflectada.
Haciendo referencia a la figura 3, Lambda 1 es
la longitud de onda de luz más larga que va a ser deflectada y
Lambda 2 es la longitud de onda de luz más corta que va a ser
deflectada. f1 es la frecuencia acústica máxima disponible para el
oscilador de accionamiento AOD y f2 es la frecuencia acústica mínima
disponible para el oscilador de accionamiento AOD.
En cualquier longitud de onda de luz intermedia
que va a ser deflectada (Lambda N), el ángulo de deflexión para el
borde derecho (a la frecuencia acústica f1) es proporcional a Lambda
N/Lambda 2, y el ángulo de deflexión para el borde izquierdo (a la
frecuencia acústica f2) es proporcional a Lambda N/Lambda 1.
El rango de ángulos de deflexión utilizables
común al rango de longitudes de onda de luz se mantiene entre los
ángulos de deflexión \Phi1 y \Phi2. Por lo tanto, la frecuencia
acústica para accionar una longitud de onda de luz seleccionada
Lambda N. al borde izquierdo es proporcional a la relación de
(longitud de onda máxima Lambda 1/longitud de onda elegida Lambda
N.).
De manera similar, la frecuencia acústica para
accionar una longitud de onda de luz elegida al borde derecho es
proporcional a la relación (longitud de onda mínima Lambda
2)/(longitud de onda elegida Lambda N).
El conocimiento del voltaje de control para
accionar acústicamente las características de transferencia de
frecuencias del oscilador de accionamiento para el AOD permite que
el procesador electrónico calcule y produzca como salida los
voltajes de control de exploración necesarios para crear los
barridos de frecuencia requeridos que controlan la deflexión del
haz de luz en el AOD. El procesador electrónico también puede
calcular las señales de control adecuadas para sincronizar la
selección de la longitud de onda del haz de entrada y también para
sincronizar la modulación o vaciado del haz de entrada durante
cualquier porción elegida de la forma de onda de exploración.
La invención ofrece la capacidad de controlar la
posición de la exploración óptica de líneas muy rápidamente,
permitiendo exploraciones de marcos sucesivos e incluso
exploraciones de líneas sucesivas que se realizan en diferentes
longitudes de onda del haz de entrada. Esto permite que se realicen
exploraciones multicolores rápidas cuando las longitudes de onda
del haz de entrada se conmutan secuencialmente en exploraciones
repetitivas de la misma línea de exploración, y a continuación
repitiendo la misma, o diferente, secuencia en longitudes de onda
del haz de entrada en las líneas de exploración siguiente y
posteriores. Para vistas incluso más rápidas de la muestra bajo la
exploración del haz de entrada multicolor, las longitudes de onda
del haz de entrada pueden conmutar secuencialmente las líneas de
exploración adyacentes, sin embargo este incremento adicional en la
velocidad de captura de imágenes se obtiene con la pérdida de la
resolución espacial y del registro de las imágenes en cada longitud
de onda del haz de entrada.
En una realización ventajosa, un generador
programable de rampa del voltaje acciona una entrada de control de
un oscilador de frecuencia controlada por voltaje que acciona el
deflector acústico-óptico. De esta manera, definiendo el voltaje de
entrada, el voltaje de salida y la velocidad de cambio de voltaje de
(típicamente) una forma de onda en dientes de tierra clásica, el
generador programable de rampa de voltaje proporciona la señal
apropiada de oscilador al deflector acústico-óptico para explorar
con el haz de láser un objeto. Estos parámetros de voltaje pueden
ser alterados dinámicamente en cualquier momento de manera que los
cambios de deflexión debidos a los cambios en la longitud de onda
del haz de entrada se puedan compensar en el tiempo práctico más
corto, solamente limitado por la velocidad de propagación de la onda
acústica en el deflector acústico-óptico y por las dimensiones de
la abertura del deflector acústico-óptico. Estos cambios pueden
sincronizarse, o pueden ser sincronizados por sucesos externos tales
como la conmutación de la longitud de onda del haz de entrada. Por
ejemplo, un filtro sintonizable óptico acústico (AOTF) en la salida
de un láser de líneas múltiples puede estar sincronizado con el
período de retorno de la forma de onda en dientes de sierra. La
utilización de un AOTF también proporciona un medio simple y
eficiente de modular o vaciar la intensidad del láser durante el
periodo de tiempo durante el cual la señal de accionamiento del
deflector acústico-óptico está cambiando a una nueva condición de
exploración, típicamente pero no exclusivamente durante el tiempo
de retorno del inicio de una nueva línea de exploración o de un
nuevo marco de exploración. Puesto que los tres sectores
acústico-ópticos (AOD) también tienen la capacidad de modular la
intensidad del haz de luz de entrada cuando pasa a través del AOD,
el AOD también se puede utilizar como un medio para modular y vaciar
la intensidad del haz de entrada.
\newpage
En la tercera realización, el sistema
electrónico de control proporciona control dinámico de la frecuencia
de inicio, frecuencia final y velocidad de cambio de frecuencia de
la señal de accionamiento al deflector óptico acústico, de tal
manera que mantenga un efecto de lenticularidad constante en todas
las longitudes de onda del haz de entrada. El deflector
acústico-óptico y el haz incidente sobre su cara son girados
respecto al eje central del deflector acústico-óptico,
incrementando de esta manera el solapamiento en las exploraciones
entre diferentes longitudes de onda de iluminación.
Con referencia a la figura 3, se puede ver que
la exploración resultante para las longitudes de onda Lambda 1
explora un rango más amplio de ángulos y tiene una desviación
angular cuando se compara con la relación resultante de las
longitudes de onda Lambda 2 sobre el mismo rango de frecuencia
acústica. Si un experimento requiere el uso de un rango amplio en
longitudes de onda de iluminación, se debe utilizar el rango de
exploración común en todas las longitudes de onda de iluminación,
produciendo de esta manera un rango total de exploración
reducido.
Con el fin de incrementar el rango de
exploración solapada, la trayectoria del haz a través del deflector
acústico-óptico puede ser girada respecto a su eje central. Con el
fin de conseguir esta rotación, la luz incidente sobre el deflector
acústico-óptico 5 es dirigida por un espejo 27 orientado con un
ángulo de 45 grados respecto a la abertura de entrada del deflector
acústico-óptico. Este espejo está unido a la misma montura 28 que
el deflector acústico-óptico 5 o conectado directamente o articulado
de otra manera al deflector y ambos pueden ser pivotados respecto
al eje central del deflector acústico-óptico.
Con referencia a la figura 4, la parte (a)
ilustra el problema original cuando luz de dos longitudes de onda
diferentes está deflectada por el mismo rango de frecuencias
acústicas, produciendo dos rangos de deflexión que están
desplazados y que difieren en rango angular uno con respecto al
otro. La parte (b) ilustra un sistema en el que la luz incidente
sobre el deflector acústico-óptico está dirigida por un espejo. La
rotación de la montura que incorpora este espejo y el deflector
acústico-óptico produce una desviación angular de la luz que sale
del deflector acústico-óptico. Un medio mecánico de este tipo está
proporcionado por motores eléctricos de varios tipos, incluyendo
tipos de CA, CC y escalonado, o por actuadores electromecánicos
tales como cristales piezo eléctricos. La parte 26 (c) ilustra como
se puede utilizar esta rotación para incrementar la región solapada
de las dos longitudes de onda diferentes ilustradas en la parte
(a).
Con referencia a la figura 4, parte (c), se
puede ver que la rotación mecánica del espejo y del deflector
acústico-óptico produce un incremento en la región solapada de las
dos longitudes de onda de iluminación, sin embargo, el rango total
de exploración de cada longitud de onda no es el mismo, por lo tanto
una combinación de rotación mecánica y un ajuste de los barridos de
frecuencia en cada longitud de onda, como se utiliza en la segunda
realización, son requeridos para ejecutar la misma exploración en
cada longitud de onda de iluminación.
Cualquiera de las tres realizaciones descritas
puede ser adaptada adicionalmente aguas abajo desde la separación
de la trayectoria del haz de retorno desde la trayectoria de haces
de entrada por el divisor (4) de haces, o el espejo (20)
dicromático, para dividir la trayectoria del haz de luz de retorno
por medio de divisores de haces (4) adicionales o del espejo (20)
dicromático, o combinaciones de ambos. Cada haz resultante está
adaptado para dirigirse a uno de una pluralidad de detectores,
teniendo cada detector un filtro espacial, un objetivo, y una lente
que duplica la trayectoria de haz único del detector que se muestra
en las figuras 1 y 2, excepto porque un filtro de paso de banda o
de corte puede ser diferente para cada trayectoria del detector,
por lo tanto esta pluralidad de detectores puede utilizarse para
extraer información espectral del haz de luz de retorno.
Ventajas adicionales esta intención también
pueden incluir las que siguen:
el área explorada de un objeto es idéntica en
todas las longitudes de onda, de manera que no hay exploración del
objeto fuera del área de interés para producir
foto-decoloración en las áreas adyacentes del
objeto.
los píxeles tomados del mismo objeto en
diferentes longitudes de onda del haz de entrada tienen idénticas
posiciones y tiempos de permanencia, lo cual simplifica la
aplicación de la microscopia confocal a técnicas tales como FRET
(Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente), FLIM
(Formación de Imágenes de Vida Fluorescente), FRAP
(Fotodecoloración Después de la Recuperación Fluorescente),
racionamiento de imágenes, etc.
Claims (20)
1. Un microscopio de exploración confocal por
láser, que comprende: un medio, incluyendo una fuente (1) de luz
de láser, para emitir haces de luz de láser en diferentes longitudes
de onda;
una trayectoria de haces para dirigir los
citados haces de luz de láser desde el citado medio de emisión de
haces de luz de láser a un portaobjetos que soporta un objeto,
incluyendo la citada trayectoria:
- un primer deflector, incluyendo un deflector acústico-óptico (5) para efectuar la exploración de líneas,
- al menos un objetivo (9) para enfocar los haces de luz de láser sobre el objeto en el citado portaobjetos,
- un segundo deflector(7) situado entre el citado deflector acústico-óptico (5) y el citado al menos un objetivo (9), para efectuar la exploración de marcos,
- estando situados el citado segundo deflector (7) y el citado al menos un objetivo (9) de manera que los haces (19) de luz de retorno desde el objeto sigan la misma trayectoria que los haces de luz de láser enfocados sobre el objeto, hasta e incluyendo el segundo deflector (7),
- al menos un detector (15; 26) situado en la trayectoria de haces de luz de retorno aguas abajo del citado segundo deflector (7), para detectar los haces de luz de retorno desde el objeto, estando adaptado el objeto para ser explorado por los haces de luz de láser desde el medio de emisión de haces de luz de láser y estando adaptadas las mediciones para realizarse con el citado al menos un detector (15; 26) con los del fin de obtener imágenes del objeto, y
un sistema electrónico de control y formación de
imágenes adaptado para controlar el medio de emisión de haces de
luz de láser para emitir haces de luz de láser individuales
secuencialmente en longitudes de onda seleccionadas y adaptado para
ajustar dinámicamente los parámetros de accionamiento del citado
deflector acústico-óptico (5) controlando dinámicamente la
frecuencia de inicio y la frecuencia final del deflector
acústico-óptico de manera que mantenga una posición de exploración
de líneas constante en todas las longitudes de onda del haz de
entrada, y controlando dinámicamente la velocidad de cambio de
frecuencia de la señal de accionamiento al deflector
acústico-óptico de manera que se obtenga un efecto de lenticularidad
constante en todas las longitudes de onda del haz de entrada, para
mantener la alineación de las líneas de exploración de la imagen en
todas las longitudes de onda.
2. Un microscopio de exploración confocal por
láser que comprende: un medio, incluyendo una fuente (1) de luz
de láser para emitir haces de luz de láser en diferentes longitudes
de onda;
una trayectoria de haces para dirigir los
citados haces de luz de láser desde el citado medio de emisión de
haces de luz de láser a un portaobjetos que soporta un objeto,
incluyendo la citada trayectoria de haces
- un primer deflector, incluyendo un deflector acústico-óptico (5) para efectuar la exploración de líneas y una lente (5.2) de compensación de astigmatismo asociada con el deflector acústico-óptico(5),
- al menos un objetivo (9) para enfocar los haces de luz de láser sobre el objeto en el citado portaobjetos,
- un segundo deflector (7) situado entre el citado deflector acústico-óptico (5) y el citado al menos un objetivo (9), para efectuar la exploración de marcos,
- estando situados el citado segundo deflector (7) y el citado al menos un objetivo (9) de manera que los haces(19) de luz de retorno desde el objeto sigan la misma trayectoria de haces que los haces de luz de láser enfocados sobre el objeto hasta e incluyendo el segundo deflector (7),
- una lente (6) de colimación situada entre el primer deflector y el segundo deflector (7);
- al menos un detector (15; 26) situado en la trayectoria de haces de luz de retorno aguas abajo del citado segundo detector (7) para detectar los haces de luz de retorno desde el objeto, estando adaptado el objeto para ser explorado por los haces de luz de láser desde el medio de emisión de haces de luz de láser, y estando adaptadas las mediciones para ser realizadas con el citado al menos un detector (15; 26) con el fin de obtener imágenes del objeto, y
un sistema electrónico de control y formación de
imágenes adaptado para controlar el medio de emisión de haces de
luz de láser para emitir haces de luz de láser en diferentes
longitudes de onda seleccionadas y adaptado para ajustar
dinámicamente la trayectoria óptica por medios mecánicos de acuerdo
con la longitud de onda seleccionada de los haces de luz de láser
ajustando la posición de la lente (5.2) de compensación de
astigmatismo y la posición de la lente (6) de colimación, de manera
que el movimiento de la lente (5.2) de compensación de astigmatismo
contrarreste el astigmatismo inducido por cambios en la longitud de
onda del haz de entrada o en la velocidad de exploración por
deflexión y movimiento de la lente (6) de colimación contrarreste
cualquier cambio de enfoque debido al reposicionamiento de la lente
(5.2) de compensación de astigmatismo, compensando de esta manera
el astigmatismo y los cambios de colimación debidos a cambios en la
longitud de onda del haz de entrada y/o la velocidad de exploración
por deflexión, y adaptados para modificar las imágenes obtenidas del
objeto por medios electrónicos para mantener la alineación de las
líneas exploración de la imagen en todas las longitudes de onda.
3. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con la reivindicación1 ó la 2, que comprende,
además:
un espejo (27) situado para dirigir la luz
incidente dentro de la abertura de entrada del citado deflector
acústico-óptico (5), estando montados y dispuestos el espejo (27) y
el deflector acústico-óptico (5) de manera que puedan girar
respecto al eje central del deflector acústico-óptico (5), y el
citado sistema electrónico de control y formación de imágenes está
adaptado adicionalmente parar pivotar el citado espejo (27) y el
citado deflector acústico-óptico (5) de acuerdo con la longitud de
onda seleccionada de los haces de luz de láser, para incrementar el
solapamiento en los ángulos de deflexión entre diferentes longitudes
de onda de iluminación.
4. El microscopio de relación confocal por láser
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
incluyendo adicionalmente la citada trayectoria:
una lente (8) situada entre el citado objetivo
(9) y el citado deflector (7) para dirigir los haces de luz desde
el citado objetivo (9) sobre el citado segundo deflector (7), y
al menos un filtro espacial (14; 23) situado en
la trayectoria de haces de luz de retorno entre el citado segundo
deflector (7) y el citado al menos un detector (15; 26) para
efectuar la formación de imágenes confocal,
por medio de lo cual que un movimiento de
exploración de marcos introducido por el citado segundo deflector
(7) está adaptado para ser eliminado como resultado de lo cual la
luz de retorno puede ser enfocada sobre el citado al menos un
filtro espacial (14; 23).
5. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
en el que un primer divisor (4) de haces o un espejo dicromático
está incorporado en la trayectoria de haces entre el citado
deflector acústico-óptico (5) y el citado medio emisor de haces de
luz de láser, para dividirle el haz de luz de retorno y para
dirigirlo al citado al menos un detector (15), en el que la citada
trayectoria de haces está construida de manera que el haz de luz de
retorno siga la misma trayectoria óptica que el haz de luz de láser
hasta el citado primer divisor (4) de haces o espejo dicromático,
con lo cual el movimiento de exploración de líneas introducido por
el citado deflector acústico-óptico (5) es eliminado.
6. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5
para utilizarse en microscopia fluorescente u otras formas de
microscopia en las cuales la longitud de onda del haz de retorno
(19) es diferente de aquella de los haces de luz de láser (18)
emitidos por el citado medio de emisión de haces de luz de láser,
en el que se monta un filtro espacial (14) en un conjunto de tres
cristales piezo eléctricos y como consecuencia se puede mover en un
sistema de coordenadas de tres dimensiones, como resultado de lo
cual el efecto de la naturaleza dispersiva del deflector
acústico-óptico (5) en la luz de retorno en una longitud de onda
diferente, que está reflectada en un ángulo distinto de la luz de
láser reflejada, es eliminada y en el que un filtro de paso de
banda o de corte (12) correspondiente se incorpora en la trayectoria
de haces de luz de retorno para filtrar la luz de láser
reflejada.
7. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a 6 para
utilizarse en microscopia fluorescente u otras formas de
microscopia, en el cual la longitud de onda del haz de retorno (19)
es diferente de aquella del haz de luz de láser (18), en el que se
incorpora un espejo (20) dicromático en la trayectoria de haces
entre el deflector acústico-óptico (5) y el segundo deflector (7)
con el fin de deflectar el haz de luz de retorno de diferentes
longitudes de onda aguas abajo del segundo deflector y dirigirlo
por medio de un objetivo (22) y un filtro espacial posterior (23) a
un detector (26) posterior, siendo el filtro espacial posterior
(23) un filtro de ranura que forma un detector de líneas con el
detector posterior (26).
8. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 7, en el que el haz
de luz de retorno está adaptado para ser dividido en una pluralidad
de haces de luz por medio de un divisor de haces adicional o espejo
dicromático o por una pluralidad de divisores de haces adicionales o
espejos dicromáticos insertados en la trayectoria de haces de
retorno después de que la trayectoria de haces de retorno se haya
separado de la trayectoria de haces de entrada por el primer divisor
(4) de haces o espejo dicromático (20), estando adaptado cada haz
resultante para ser dirigido a uno o más detectores, teniendo cada
detector un filtro espacial, objetivo y lente que duplica la
trayectoria de haz de detector único, excepto porque un filtro de
paso de banda o de corte puede ser diferente en cada detector.
9. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
en el que el citado sistema electrónico de control y formación de
imágenes está adaptado para proporcionar sincronización de la
longitud de onda del haz de luz de láser seleccionado a un punto de
tiempo de retorno u otro punto de tiempo seleccionado en las
exploraciones de líneas aplicando señales de control a un medio de
selección de longitud de onda montado aguas abajo de la citada
fuente (1) de luz de láser, de manera que los haces de luz de láser
que pasan a través del citado medio de selección de longitud de onda
en su paso al interior o a través de la trayectoria del haz están
controlados de manera que solamente se permite que la longitud de
onda seleccionada pase a través de la trayectoria de haces.
10. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
en el que el citado sistema electrónico de control y formación de
imágenes está adaptado para proporcionar sincronización de la
modulación de intensidad o el vaciado del haz de la fuente de luz
del láser al retorno inversa u otro punto de tiempo seleccionado en
las exploraciones de líneas aplicando señales de control a un medio
de modulación de intensidad montado aguas abajo de la citada fuente
(1) de luz de láser, de manera que los haces de luz de láser que
pasan a través de citado medio de modulación de intensidad en su
paso dentro o a través de la trayectoria de haces estén controlados
de manera que la intensidad de los haces de luz pueda ser modulada
o vaciada.
11. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el citado medio
de selección de longitud de onda comprende un filtro acústico-óptico
sintonizable (AOTF).
12. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el citado
medio de modulación de intensidad comprende un filtro (AOTF)
acústico-óptico sintonizable y/o el citado deflector
acústico-óptico (5).
13. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
en el que el citado sistema electrónico de control y formación de
imágenes está compuesto por una lógica cableada, un procesador
digital de señales, un microprocesador, un ordenador o sistema
similar de computación.
14. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 1 a 13, en
el que la citada fuente (1) de luz de láser incluye un láser de
líneas múltiples, un láser sintonizable y/o una agrupación de
láseres que emiten en longitudes de onda distintas y una
configuración óptica que proporciona haces de láser colineales.
15. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14,
en el que el citado segundo deflector (7) comprende un galvanómetro
de espejo.
16. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15,
en el que los haces de luz están acoplados a la trayectoria de haces
por medio de una guía óptica flexible de luz.
17. El microscopio de exploración confocal por
láser de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la guía óptica
de luz es una fibra óptica.
18. Un procedimiento para conseguir exploración
rápida en longitudes de onda múltiples en un microscopio de
exploración confocal por láser basado en un deflector
acústico-óptico de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo
el procedimiento los pasos de:
controlar dinámicamente la frecuencia de inicio
y la frecuencia final del deflector acústico-óptico de manera que
se mantenga una posición de exploración de líneas constante en todas
las longitudes de onda del haz de entrada y controlar dinámicamente
la velocidad del cambio de frecuencia de la señal de accionamiento
al deflector acústico-óptico de manera que se obtenga un efecto de
lenticularidad constante en todas las longitudes de onda del haz de
entrada, para mantener la alineación de las líneas de exploración
de una imagen de un objeto en todas las longitudes de onda.
19. Un procedimiento para conseguir exploración
rápida en longitudes de onda múltiples en un microscopio de
exploración confocal por láser basado en un deflector
acústico-óptico de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo
el procedimiento los pasos de:
ajustar dinámicamente una trayectoria óptica del
citado un microscopio confocal basado en un deflector
acústico-óptico por medios mecánicos de acuerdo con una longitud de
onda seleccionada de un haz de luz de láser, ajustando la posición
de una lente (5.2) de compensación de astigmatismo asociada con el
deflector acústico-óptico y la posición de una lente (6) de
colimación, de manera que el movimiento de la lente (5.2) de
compensación de astigmatismo contrarreste el astigmatismo inducido
por los cambios en la longitud de onda del haz de entrada o en la
velocidad de exploración por deflexión y los movimientos de la
lente (6) de colimación contrarrestan cualquier cambio de enfoque
debido al reposicionamiento de la lente (5.2) de compensación de
astigmatismo, compensando de esta manera el astigmatismo y los
cambios de colimación producidos por el cambio en la longitud de
onda del haz de entrada y modificando las imágenes detectadas de un
objeto por medios electrónicos para mantener la alineación de las
líneas de exploración de la imagen en todas las longitudes de
onda.
20. Un procedimiento para conseguir la
exploración rápida en longitudes de onda múltiples en un microscopio
de exploración confocal por láser basado en un deflector
acústico-óptico de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19, que
comprende, además:
pivotar mecánicamente el deflector
acústico-óptico respecto a su eje central para compensar los
diferentes ángulos de deflexión y los rangos de las longitudes de
onda de iluminación utilizadas.
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