ES2280218T3 - Medios de deteccion y tratamiento de patologias asociadas a fgfr3. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar carcinomas en una muestra biológica, que comprende la identificación de mutaciones de FGFR3.
Description
Medios de detección y tratamiento de patologías
asociadas a FGFR3.
La invención se refiere a medios, es decir,
procedimiento y fármacos, para la detección y el tratamiento,
respectivamente, de patologías asociadas a FGFR3 y/o a la ruta del
FGFR3.
El receptor del factor de crecimiento de
fibroblastos 3 (FGFR3) pertenece a una familia de receptores de
tirosina cinasa relacionados estructuralmente (FGFR
1-4) codificados por cuatro genes diferentes. Estos
receptores son glucoproteínas compuestos de dos o tres dominios
extracelulares similares a inmunoglobulina (Ig), un dominio
transmembranal y un dominio tirosina cinasa dividido. Un ayuste
alternativo del ARNm da lugar a muchas variantes de receptores
diferentes. Las isoformas FGFR3-IIIb y
FGFR3-IIIc son el resultado de un suceso de ayuste
mutuamente exclusivo en el que la segunda mitad del dominio
yuxtamembranal similar a Ig está codificado por los 151 nucleótidos
de longitud del exón 8 (variante IIIb) o los 145 nucleótidos de
longitud del exón 9 (variante IIIc).
Mutaciones puntuales específicas en el gen
FGFR3 que afectan a dominios diferentes de la proteína se
asocian con trastornos dominantes autosómicos del esqueleto humano,
tales como hipocondroplasia, acondroplasia, acondroplasia grave con
retraso del desarrollo y acantosis nigricans (SADDAN) y displasia
tanatofórica. Varias publicaciones han demostrado que estas
mutaciones llevan a la activación constitutiva del receptor.
Teniendo en cuenta este resultado, junto con el crecimiento
exagerado del esqueleto observado en ratones homocigóticos de alelos
nulos de Fgfr3, FGFR3 aparece como un regulador negativo del
crecimiento óseo.
En contraste con esta función inhibitoria, se ha
propuesto un papel oncogénico para FGFR3 en el desarrollo
del mieloma múltiple (MM). En esta proliferación maligna de células
plasmáticas, se presenta una translocación cromosómica
t(4;14) (p16.3;q32.3) en el 20-25% de los
casos con un punto de rotura localizado de 50 a 100 kb centromérico
con respecto a FGFR3 y se asocia con la sobreexpresión de
FGFR3.
En casos muy raros (2 de 12 líneas celulares de
MM y 1 de 85 tumores primarios de MM), se han encontrado mutaciones
que activan FGFR3 identificadas previamente en trastornos del
esqueleto humano, pero siempre acompañados por la translocación
t(4;14) (p16.3;q32.3).
Sorprendentemente, investigando diversos
cánceres, los inventores han encontrado una función para FGFR3 en
cánceres originarios de tejidos epiteliales, los carcinomas.
La implicación de FGFR3 en el desarrollo de
estos tumores sólidos se asocia a una activación constitutiva:
puede activarse mediante un bucle autocrino (autoproducción de
ligando) y/o mediante la activación de mutaciones en FGFR3.
Sorprendentemente, estas mutaciones se encuentran en tumores
primarios y son mutaciones somáticas (mutaciones del ADN
genómico).
Hasta el momento, la única isoforma de
FGRF3 que se ha identificado en el epitelio es la isoforma
FGRF3-IIIb.
De este modo, la invención se refiere a un
procedimiento y a kits para la detección de carcinomas.
Según otro aspecto, la invención también se
refiere a la producción de fármacos capaces de tratar
carcinomas.
Según otro aspecto más, se refiere a animales
transgénicos que posibilitan ensayar la eficiencia de estos
fármacos.
El procedimiento de la invención para la
detección de carcinomas en una muestra biológica comprende la
identificación de mutaciones de FGFR3.
Pueden aplicarse procedimientos convencionales
para esta identificación, tales como inmunohistoquímica, o la
detección del ARN, ADN y la proteína codificada correspondiente
contenidos en dicha muestra, especialmente después de la extracción
de la misma. Una forma común para esta detección comprende la
amplificación mediante PCR, RT-PCR o
RT-PCR- SSCP (polimorfismo de conformación de
cadenas sencillas) con cebadores específicos de FGFR3 y el
revelado de los productos amplificados según los procedimientos
habituales. En los ejemplos dados a continuación en este documento
se explica una realización correspondiente. Otra forma común
comprende el uso de antibióticos y la detección de la reacción
antígeno- anticuerpo con el marcaje apropiado.
La función de activación de una mutación puede
determinarse mediante la observación de señales de activación, tal
como la fosforilación del receptor, la proliferación celular (por
ejemplo, incorporación de timidina) o efectos indirectos, tales
como el flujo de calcio o la fosforilación de secuencias diana.
Más en particular, dicha identificación
comprenden la detección sistemática de una mutación o mutaciones de
un único nucleótido en el ADN genómico y/o en sus productos, es
decir, ARN, proteína, el término "producto" también abarca el
ADNc.
Especialmente, dicho procedimiento comprende la
detección sistemática de mutaciones que crean restos de cisteína en
los dominios extracelular y transmembranal del receptor.
Alternativamente, o en combinación con la
realización anterior, comprende la detección sistemática de
mutaciones que dan lugar al menos a la sustitución de un aminoácido
en el dominio cinasa del receptor.
Especialmente comprende la detección sistemática
de una mutación o mutaciones que activan FGFR3, en particular,
tales como las descritas anteriormente.
Más en particular, el procedimiento de la
invención comprende la detección sistemática de una mutación o
mutaciones en el exón 7, que codifica la unión entre los dominios
II y III similares a inmunoglobulina de FGFR3, en el exón 10, que
codifica el dominio transmembranal, en el exón 15, que codifica el
dominio I tirosina cinasa y/o en el exón que codifica la parte
C-terminal.
De forma ventajosa, el procedimiento de la
invención comprende la detección sistemática de mutaciones de
aminoácido, tales como las implicadas en la displasia tanatofórica,
NSC, acondroplasia, SADDAN o hipocondroplasia.
Estas mutaciones de FGFR3, en particular,
comprenden R248C, S249C, G372C, S373C, Y375C, K652E, K652M, J809G,
J809C, J809R, J809L, P250R, G377C, G382R, A393E, N542K (los codones
se han numerado según el ADNc de la fase de lectura abierta del
FGFR3-IIIb).
Se identificarán especialmente las siguientes
mutaciones de FGFR3: R248C, S249C, G372C, K652E e Y375C.
Dicha muestra biológica usada en el
procedimiento de la invención comprenderá, de forma ventajosa, un
tejido, medula ósea o un fluido, tal como sangre u orina, que
derivan de animales de sangre caliente y, más especialmente, de un
humano.
Dicho procedimiento es especialmente útil para
detectar carcinomas, tales como carcinomas humanos de vejiga y de
cuello uterino. Una cuestión principal en el cáncer superficial de
vejiga es distinguir los tumores que progresarán de los que no lo
harán. Se espera que la comprensión de las alteraciones genéticas y
epigenéticas implicadas en el cáncer de vejiga proporcione
información útil que facilite esta distinción. A este respecto, la
invención proporciona medios para resolver el dilema entre una
estrategia que converse la vejiga frente a una cistectomía, y
contribuirá a una política de instilación intravesical
individualizada y a un seguimiento endoscópico.
De hecho, como muestran los resultados dados en
los ejemplos, FGFR3 parece ser un oncogén principal en los
carcinomas de vejiga Ta y T1. Parece que las mutaciones de
FGFR3 se asocian frecuentemente con tumores que no
progresan. El análisis multivariante mostraba que la posición de la
mutación de FGFR3 permanecía como un elemento de predicción
estadísticamente significativo de buena respuesta. De este modo, las
mutaciones de FGFR3 proporcionan una información clara, que
puede complementar el estadio y el grado. Entonces, el uso de estas
mutaciones solas y/o en combinación con otros elementos de
predicción de la agresividad del tumor proporcionará información
importante para el pronóstico.
Dicho procedimiento, también se usará para la
detección, por ejemplo, de cánceres de pulmón, mama, colon y
piel.
El procedimiento de detección según la invención
se aplica al diagnóstico de carcinomas, así como al pronóstico o al
seguimiento de la eficacia de una terapia.
Dicho procedimiento se realizará de forma
ventajosa usando kits que comprendan los reactivos apropiados y una
indicación de uso.
Según otro aspecto, la invención se refiere a la
fabricación de fármacos que tienen un efecto antiproliferativo
sobre las células del carcinoma. Estos fármacos comprenden como
principio o principios activos, un agente o agentes que actúan
inhibiendo la síntesis del ADN de FGFR3 o mediante la inhibición de
sus subproductos de expresión (ARN, proteínas). Especialmente, estos
fármacos contienen inhibidores de la tirosina cinasa específicos
para FGFR3.
Otros inhibidores apropiados comprenden
anticuerpos dirigidos frente a FGFR3 y, especialmente, frente a al
menos un dominio extracelular similar a Ig del mismo. De forma
ventajosa, dichos anticuerpos son específicos para
FGFR3-IIIb. Los anticuerpos preferidos son los
monoclonales y, especialmente, anticuerpos modificados para que, de
ese modo, no induzcan reacciones inmunogénicas en un organismo
humano (por ejemplo, anticuerpos
humanizados).
humanizados).
Otros inhibidores apropiados comprenden
oligonucleótidos complementarios dirigidos frente a una isoforma de
FGFR3 natural o mutada.
Un experto en la materia determinará la
administración y la dosificación de dichos inhibidores dependiendo
del carcinoma que se va a tratar, el peso y la edad del paciente.
Por ejemplo, los anticuerpos se administrarán mediante
inyección.
De este modo, la invención proporciona medios
muy interesantes para detectar y tratar carcinomas teniendo en
cuenta el hecho de que estos cánceres que se originan a partir de
tejidos epiteliales (carcinomas) representan aproximadamente el 90%
de los neoplasmas malignos.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Se describen líneas celulares capaces de
expresar formas mutadas de FGFR3. Especialmente, se describen
formas mutadas S249C de FGFR3. De este modo se han obtenido las
líneas celulares T24 que expresan constitutivamente las formas
mutadas S249C de FGFR3 y las líneas celulares HeLa que expresan
formas mutadas S249C de FGFR3 de forma inducible (por ejemplo,
véase la ref. (6)).
Inyectando estas líneas celulares en ratones
desnudos, se observó un aumento de la tumorigenicidad.
Estas líneas celulares son útiles in
vitro (seguimiento de la fosforilación del receptor) o in
vivo (examen de la tumorigenicidad de ratones desnudos) para
estudiar el efecto inhibidor frente a FGFR3.
Las líneas celulares transfectadas con FGFR2,
FGFR1 o FGFR4 son especialmente útiles para estudiar la
especificidad de los inhibidores que se van a ensayar.
Según aún otro objeto, la invención se refiere a
construcciones capaces de expresar por transgénesis una forma
mutada de FGFR3 en el epitelio y los animales transgénicos
obtenidos de este modo se caracterizan por el hecho de que
comprenden estas construcciones.
Ejemplos de construcciones que se pretende
inyectar en células germinales del animal comprenden un promotor de
la queratina, especialmente el promotor 14 de la queratina, y el
ADNc de FGFR3 mutado.
Otras ventajas y características de la invención
se proporcionarán en los ejemplos siguientes en los que se hará
referencia a las
- figuras 1A-1B que proporcionan
mutaciones que activan el gen FGFR3-IIIb en tumores
primarios,
- figuras 2A-2E que se refieren
a las secuencias de FGFR3-IIIb natural (2A) y
prooncogénicas mutadas (2B-2T). Se apreciará que
las secuencias de las figuras 2B a 2T, por tanto, están dentro del
alcance de la invención. Puede haber polimorfismos silentes a lo
largo de la secuencia, de modo que puede haber, de hecho, varias
secuencias posibles para cada mutante y
- figuras 3a y 3b que representan,
respectivamente, a) curvas de supervivencia sin progresión de la
enfermedad de Kaplan-Meier según las mutaciones
FGFR3 (línea de puntos: FGFR3 mutado, línea continua:
FGFR3 no mutado; prueba de rango logarítmico p=0,014); b)
curvas de supervivencia específicas de enfermedad de
Kaplan-Meier según las mutaciones de FGFR3
(línea de puntos: FGFR3 mutado, línea continua: FGFR3
no mutada; prueba de rango logarítmico p=0,007).
Se examinaron los niveles de transcripciones
FGFR3-IIIb y
FGFR3-IIIc mediante reacción en cadena
de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR)
en 76 carcinomas primarios de vejiga y 29 carcinomas primarios de
cuello uterino invasivos.
FGFR3-IIIb, la única
isoforma que se va a expresar significativamente, se detectó en 72
de los 76 (94%) carcinomas de vejiga y 27 de los 29 (93%)
carcinomas de cuello uterino.
A continuación, se realizó un análisis por
PCR-SSCP tanto en el ARN transcrito de forma
inversa como en el ADN genómico para analizar las variantes que
secuencia de FGFR3 codificadas en 26 cánceres de vejiga y 12
de cuello uterino que expresan el gen. Los resultados se ilustran en
las figuras 1a y 1b que proporcionan la identificación de las
mutaciones del gen FGFR3 en carcinomas humanos:
- a: proporciona la identificación de mutaciones
somáticas mediante secuenciación directa de los productos de PCR.
ADN constitutivo normal; Tumor, ADN del tumor.
- b: proporciona mutaciones de FGFR3 asociadas
con trastornos del esqueleto y con cánceres.
Se representa la estructura esquemática de FGFR3
(Ig I-III, dominios similares a inmunoglobulina;
TM, dominio transmembranal; TK-1 y -2, dominios
tirosina cinasa) y se indican las localizaciones de las mutaciones
de aminoácido humanas conocidas asociadas con displasia
tanatofórica (TD) y acondroplasia grave (SADDAN), carcinomas de
vejiga y de cuello uterino (carc.) y mieloma múltiple (MM). Las
abreviaturas de los aminoácidos normales se usan para señalar la
mutación encontrada en cada situación patológica. En las mutaciones
en el codón 807 implicadas en TD, se sustituye un codón de parada
(J) por el de un aminoácido (G, C, R o L) y, de este modo, el ARNm
continua traduciéndose hasta que se alcanza otro codón de parada en
fase 423 nucleótidos secuencia arriba, lo que da lugar a una
proteína 141 aminoácidos más larga.
Se observaron bandas que migraban de forma
anómala en algunas muestras (Fig. 1a) y la secuenciación directa de
los productos de PCR reveló sustituciones de un único nucleótido en
9 de 26 (35%) carcinomas de vejiga y en 3 de 12 (25%) carcinomas de
cuello uterino (Fig. 1b y tabla 1).
\global\parskip0.990000\baselineskip
Se encontraron mutaciones en los siguientes
exones:
- -
- exón 7, que codifica la unión entre los dominios II y III similares a inmunoglobulina de FGFR3 (una transición de C a T en el codón 248 en el paciente 745.1 y una sustitución de C por G en el codón 249 en el paciente 1447);
- -
- exón 10, que codifica el dominio transmembranal (una transversión de G a T en el codón 372 en el paciente 813).
- -
- exón 15, que codifica el dominio tirosina cinasa II (una transición de A a G en el codón 652 en el paciente 1084).
El análisis de coincidencia del ADN constitutivo
de los pacientes de los que se disponía de este material (n=8)
demostró la naturaleza somática de estas mutaciones de FGFR3
(Figura 1).
Sorprendentemente, cada una de las mutaciones de
aminoácido de FGFR3 identificadas en este documento, es
decir, R248C, S249C, G372C y K652E están implicadas en la displasia
tanatofórica (TD). Debido a la presencia de dos aminoácidos
adicionales en la isoforma IIIb expresada en cánceres epiteliales
en comparación con la isoforma IIIc expresada en hueso, las
mutaciones G372C y K652E son, de hecho, equivalentes a las
mutaciones G370C y K650E, responsables de la TD.
La mutación S249C era la que se observaba más
frecuentemente, afectando a 5 de 9 (55%) cánceres de vejiga y a
todos los cánceres de cuello uterino (3 de 3, 100%) en los que
hasta el momento se han identificado alteraciones del gen
FGFR3.
Las mutaciones R248C, S249C y G372/370C crean
restos de cisteína en los dominios extracelular o transmembranal
del receptor y las mutaciones K652/650E dan lugar a una sustitución
de aminoácido en el dominio cinasa del receptor.
Una manera de probar los diferentes inhibidores
de FGFR3 comprende transfectar líneas celulares de modo que
expresen las formas mutadas de FGFR3, el FGRF3 natural, o sólo el
gen de resistencia a la neomicina o a higromicina bajo el control
de un potente promotor, tal como promotores CMV, RSV o SV40. A
continuación, las propiedades tumorigénicas de estas líneas
celulares pueden compararse in vitro o in vivo en
ratones desnudos. Se ensayarán los diferentes inhibidores in
vitro o in vivo, usando estas diferentes líneas
celulares. Se medirán la fosforilación, la proliferación o los
efectos indirectos de FGFR3, tal como el flujo de calcio. De este
modo, pueden derivarse de éstas ratones transgénicos que expresen
el FGFR3 mutado en diversos epitelios. Estos ratones que
desarrollan tumores son herramientas útiles para probar la eficacia
de los fármacos candidatos. Estos animales transgénicos también se
incluyen dentro del alcance de la presente invención.
El cáncer de vejiga es una enfermedad con una
gama de formas y es muy impredecible. En el momento del diagnóstico
inicial, aproximadamente el 80% de los pacientes presenta un tumor
superficial. Los cánceres de vejiga superficial incluyen carcinomas
in situ (Tis) y lesiones Ta y T1 (clasificación TNM). Las
lesiones Ta/T1 son principalmente carcinomas uroteliales papilares:
las lesiones Ta no invaden la membrana basal, mientras que las
lesiones T1 invaden la lámina propia, pero no invaden el músculo
detrusor de la pared de la vejiga. El carcinoma in situ es
un carcinoma plano, citológicamente de alto grado, confinado al
urotelio. El carcinoma primario aislado in situ es una
entidad muy rara y más normalmente asociada con lesiones Ta/T1. A
pesar de la resección transuretral sola o combinada con terapias
intravesicales adyuvantes, más de la mitad de los pacientes con
tumores Ta/T1 sufren recurrencias. En la mayoría de los casos, las
recurrencias también son superficiales, pero aproximadamente el 5%
de tumores Ta y 30-50% de los T1, progresan de
forma impredecible invadiendo el músculo con un alto riesgo de
desarrollar metástasis y de muerte por cáncer de vejiga.
El tratamiento del cáncer superficial de vejiga
se basa en parámetros clinicopatológicos. Pueden definirse tres
grupos de tumores, de bajo, intermedio y alto riesgo, según su
potencial para presentar recurrencia y progresar. Esta
clasificación se usa en terapias intravesicales adyuvantes
recomendadas y en el seguimiento de la vejiga, pero no es una forma
de discriminación suficientemente sensible para su uso en la
determinación del tratamiento apropiado y del modo de vigilancia de
un paciente determinado. Aunque la terapia del bacilo
Calmette-Guerin (BCG) parece ser el régimen más
eficaz para el grupo de alto riesgo, los resultados a largo plazo
indican que la progresión tiene lugar en el 40% a 10 años yen más
del 50% a 15 años. Para algunos investigadores, estos hallazgos
justifican el uso de cistectomía radical de entrada en carcinomas
uroteliales superficiales de alto riesgo, a pesar del riesgo de
sobretratamiento de un número significativo de pacientes. El
seguimiento de los cánceres superficiales de vejiga Ta y T1
constituye la mayor cantidad de trabajo de los urólogos que se
ocupan del tratamiento del cáncer de vejiga. La estrategia actual
se basa en evaluaciones cistoscópicas frecuentes usando un programa
que es, en gran medida empírico, sin considerar las características
individuales del tumor.
Las limitaciones del tratamiento actual del
cáncer de vejiga demuestran la necesidad de marcadores para el
pronóstico, haciendo posible el uso de tratamientos agresivos
selectivos para pacientes con alto riesgo de progresión mientras
que los pacientes de bajo riesgo escapan a procedimientos
innecesarios. Se ha implicado a varios loci cromosómicos y genes
específicos en la tumorigénesis de la vejiga. Las pérdidas de todo o
parte del cromosoma 9 en muchos de los tumores TaG1 sugieren que la
inactivación de un gen o genes en el cromosoma 9 puede ser un
acontecimiento temprano en la transformación urotelial. El
significado para el pronóstico de las pérdidas en el cromosoma 9 no
está clara. Se han delimitado claramente alteraciones de los genes
P53 y RB que controlan la fase G1 del ciclo celular y
se han asociado con la agresividad de tumores superficiales e
invasivos de vejiga. A pesar de estas recientes incursiones en los
mecanismos moleculares de la progresión del carcinoma de vejiga,
estos marcadores aún no han tenido ningún impacto en la práctica
clínica.
Se han realizado los siguientes ensayos para
valorar la fiabilidad, como marcadores, de las mutaciones
FGFR3.
Se obtuvieron setenta y cuatro muestras de
carcinomas superficiales de vejiga Ta y T1 a partir de 74 pacientes
mediante resección transuretral realizada en el Hospital Henri
Mondor, Créteil, Francia, de enero de 1988 a diciembre de 1998. Los
tumores se clasificaron según la clasificación TNM (1) y se
distribuyeron por grados según los criterios recomendados por la
Organización Mundial de la Salud (2). Esta serie está compuesta de
25 tumores pTa y 49 pT1, con 28 tumores de grado G1, 33 de grado G2
y 13 de grado G3. Los 64 hombres y las 10 mujeres tenían una media
de edad de 64 años (intervalo: de 29 a 94 años). Ninguno de los
pacientes tenía ninguna metástasis distante detectable en el
momento de la resección transuretral. Los pacientes se trataron
sólo con resección transuretral (TUR) (n=5), TUR seguida de
instilación de mitomicina C (n=10) o TUR y BCG (n=39) según las
recomendaciones del Comité Francés de Oncología Urológica (CCAFU).
No hubo cambio en el sistema de tratamiento del cáncer superficial
de vejiga durante el periodo de estudio. La progresión se definió
como el desarrollo de un estadio pT2 o superior, o la aparición de
invasión o metástasis de ganglios linfáticos o muerte debida al
cáncer. Las curvas de supervivencia específicas de la enfermedad se
dibujaron usando como punto final la muerte debido al cáncer
urotelial. El seguimiento se basó en la cistoscopia sistémica y en
la citología y en estudios de imagenología sólo cuando estaba
indicada. Todas las visitas ambulatorias y las admisiones
hospitalarias se registraron en una base de datos a partir de la
cual se calcularon los datos del estudio.
El ADN del tumor se extrajo a partir de tejidos
fijados con formalina e incluidos en parafina, o de muestras
congeladas frescas en nitrógeno líquido (4). Se dispuso de muestras
de ADN normal de sangre periférica de 27 pacientes.
Las mutaciones en el gen FGFR3 se
detectaron mediante análisis SSCP. Se analizaron los exones 7, 10,
15 y 20 del gen FGFR3 porque en estos exones se localizan
todas las mutaciones previamente identificadas en carcinomas de
vejiga y en displasia tanatofórica. Todas las mutaciones detectadas
mediante análisis SSCP se confirmaron mediante secuenciación
bidireccional directa del ADN genómico del tumor. Se secuenciaron
ambas cadenas del ADN normal coincidente, si se disponía de él,
para demostrar la naturaleza somática de estas mutaciones.
Las asociaciones entre la posición de la
mutación de FGFR3 y otros datos (sexo, edad, estadio y
grado) se ensayaron usando las pruebas de la \chi^{2} y de
Student. Las curvas de supervivencia sin progresión y específica de
la enfermedad se representaron usando las estimaciones de
Kaplan-Meier. Las distribuciones de supervivencia
se compararon usando la prueba de rango logarítmico. El modelo de
regresión de riesgos proporcionales de Cox se usó para ensayar el
efecto de las mutaciones, mientras que simultáneamente se tenían en
cuenta las características iniciales del paciente y del tumor. La
influencia de las covariantes en el efecto de la mutación de
FGFR3 se valoró en un análisis multivariante que implica un
procedimiento secuencial de inclusión y un procedimiento secuencial
de exclusión, usando un procedimiento MPRL (proporción de
probabilidad parcial máxima). El límite para introducir un término
era 0,15 y el límite para eliminar un término era 0,10. Los
análisis estadísticos se realizaron usando el software BMDP® y
S-Plus®.
Las mutaciones de aminoácido de FGFR3 se
observaron en 41 de los 74 (55%) tumores de vejiga Ta y T1. Las
mutaciones encontradas en FGFR3 se describen en la Tabla 2 a
continuación:
La mutación más común era S249C y se encontró en
16 de los 21 (76%) tumores Ta mutados y en 12 de los 20 (60%)
tumores T1 mutados. Los ADN constitutivos coincidentes, disponibles
en 15 de los casos de tumores con mutaciones, contenían secuencias
de tipo natural, lo que demostraba la naturaleza somática de estas
mutaciones.
La correlación entre edad, sexo, estadio, grado
y posición de la mutación de FGFR3 se da en la tabla 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Se observaron correlaciones estadísticamente
significativas entre las mutaciones de FGFR3 y un estadio
bajo (p=0,001) y un grado bajo (p=0,0003), pero no entre estas
mutaciones y la edad o el sexo (Tabla 2).
Con un seguimiento medio de 4,3 años (intervalo:
de 6 meses a 11 años), en el grupo de tumores mutados (n=41
pacientes) 3 pacientes progresaron y uno, murió mientras que en el
grupo de tumores no mutados (n=33 pacientes) progresaron diez
pacientes y murieron ocho. El seguimiento medio fue de 5,6 años
(intervalo: de 7 meses a 11 años) en el grupo de no mutados y de
4,1 años (intervalo: de 6 meses a 9 años) en el grupo de
mutados.
Para examinar las mutaciones de FGFR3
como marcadores de la respuesta del paciente, se calcularon las
curvas de probabilidad de supervivencia sin progresión y de
supervivencia específica de la enfermedad de
Kaplan-Meier de los dos grupos de pacientes y se
examinaron las diferencias usando la prueba de rango logarítmico.
La supervivencia sin progresión y la específica de la enfermedad
indicaban que las mutaciones de FGFR3 se asociaban con un
riesgo menor de progresión (p=0,014) y con una supervivencia más
prolongada (p=0,007) (Figura 3). Se ensayaron diversas variables
(edad, sexo, estadio, grado), pero sólo el estadio estaba asociado
de forma significativa con la progresión y la supervivencia en un
análisis univariante. Si sólo se analizaban los pacientes con T1,
la correlación seguía siendo significativa para la supervivencia
específica de la enfermedad (p=0,03) y próxima a la significancia
para la supervivencia sin progresión (p=0,052).
Se usó un análisis multivariante para determinar
si la correlación entre la posición de la mutación de FGFR3
y la supervivencia sin progresión o la supervivencia específica de
la enfermedad era independiente de otros elementos de predicción de
la respuesta. Para la supervivencia sin progresión, se introdujeron
las siguientes covariantes en el modelo Cox: mutación, estadio,
grado y sexo. Para la supervivencia específica de la enfermedad, las
únicas covariantes introducidas en el modelo fueron la mutación y
el grado, ya que no se observaron muertes relacionadas con la
enfermedad entre las hembras o en los pacientes en Ta. Si se
introducía en el modelo la posición en FGFR3, ni el estadio
ni en grado proporcionaban ningún valor pronóstico adicional para la
progresión del tumor. En el análisis de supervivencia específica de
la enfermedad, la mutación de FGFR3 también fue la única
covariable que se introdujo en el modelo, ya que el grado no
proporcionó ninguna información adicional al pronóstico. En la
tabla 4 se muestran los riesgos relativos y sus intervalos de
confianza del 95% (IC).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los carcinomas que tenían un receptor
mutado, expresaban dicho receptor a niveles similares o por encima
de los observados en tejidos normales. A continuación, los
procedimientos inmunohistoquímicos se usarán de forma ventajosa
para mostrar el receptor.
Parece que la detección de la mutación FGFR3 en
carcinomas de vejiga es un buen pronóstico, dando por tanto a los
clínicos medios válidos para el tratamiento y observación de
carcinomas que representan un problema médico debido a la alta
frecuencia de recurrencias.
Usando SSCP o PCR conjugados con una enzima de
restricción específica de la mutación S249C (que represente el 75%
de las mutaciones) en pacientes que tienen carcinomas de vejiga con
la mutación S249C, la mutación podría detectarse en la orina en el
60% de los casos.
El ADN genómico se extrajo de las muestras de
orina de los pacientes y se amplificó mediante PCR, en presencia de
dCTP marcado con ^{32}P, usando procedimientos convencionales. Se
usaron los siguientes cebadores para detectar la mutación
S249C:
- 5'-CAG CAC CGC CGT CTG GTT GG-3' y 5'-AGT GGC GGT GGT GGT GAG GGA G-3'.
se realizan 30 ciclos de PCR.
Los productos de amplificación se digieren con
Cac81. Se crea un sitio adicional por la mutación de
FGFR3 y se observa una banda correspondiente en un gel de
electroforesis.
De forma similar, pueden usarse los siguientes
cebadores y enzimas para detectar:
La mutación R248C:
- Cebadores:
- 5'-TGT GCG TCA CTG TAC ACC TTG CAG-3' y 5'-AGT GGC GGT GGT GGT GAG GGA G-3'
- Enzima:
- Bsi HKA I
\vskip1.000000\baselineskip
La mutación K652E:
- Cebadores:
- 5'-TGG TGA CCG AGG ACA ACG TGA TG-3' y 5'-AGG GTG TGG GAA GGC GGT GTT G-3'
- Enzima:
- Bsm A I
\vskip1.000000\baselineskip
La mutación G372C
- Cebadores:
- 5'-CCT CAA CGC CCA TGT CTT TTC AGC-3' y 5'-CTT GAG CGG GAA GCG GGA GAT CTT G-3'
- Enzima:
- Pst I
\vskip1.000000\baselineskip
La mutación Y375C:
- Cebadores:
- 5'-CCT CAA CGC CCA TGT CTT TTC AGC-3' y 5'-CTT GAG CGG GAA GCG GGA GAT CTT G-3'
- Enzima:
- Bsg I
\vskip1.000000\baselineskip
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\global\parskip0.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP00/04591
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
04-05-2000
\vskip0.400000\baselineskip
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<151>
05-05-1999
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<160> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
FGFR3-IIIb de tipo natural:
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 2.427
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante R248C de FGFR3-IIIb:
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<400> 2
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante S249C de FGFR3-IIIb:
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
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<211> 2.427
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante G372C de FGFR3-IIIb:
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<400> 4
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante K652E de FGFR3-IIIb:
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<400> 5
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante S373C de FGFR3-IIIb:
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<400> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante Y375C de FGFR3-IIIb:
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante K652M de FGFR3-IIIb:
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante X809C de FGFR3-IIIb:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante X809G de FGFR3-IIIb: (Mutante
1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante X809G de FGFR3-IIIb: (Mutante
2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante X809G de FGFR3-IIIb: (Mutante
3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante X809L de FGFR3-IIIb:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante N542K de FGFR3-IIIb: (Mutante
1)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante N542K de FGFR3-IIIb: (Mutante
2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante G382R de FGFR3-IIIb: (Mutante
1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\newpage
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<210> 17
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<211> 2.427
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante G382R de FGFR3-IIIb: (Mutante
2)
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<400> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante G377C de FGFR3-IIIb:
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Mutante A393E de FGFR3-IIIb:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.427
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: MutanteP25OR de FGFR3-IIIb:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Un procedimiento para detectar carcinomas en
una muestra biológica, que comprende la identificación de
mutaciones de FGFR3.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende la detección sistemática de una mutación o mutaciones de
un único nucleótido en ácidos nucleicos del grupo que comprende ADN
genómico, ARN o ADNc.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende la detección sistemática de una única mutación o
mutaciones en las proteínas.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende la detección sistemática de mutaciones para crear restos
de cisteína en los dominios extracelular o transmembranal del
receptor.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende la detección sistemática de mutaciones que dan lugar a
una sustitución de al menos un aminoácido en el dominio cinasa del
receptor.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, que
comprende la detección sistemática de una mutación o mutaciones que
activan el FGFR3.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, que
comprende la detección sistemática de una mutación o mutaciones que
activan FGFR3-IIIb.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende la detección sistemática de una mutación o mutaciones en
el grupo que comprende el exón 7, que codifica la unión entre los
dominios II y III similares a inmunoglobulina de FGFR3, el exón 10,
que codifica el dominio transmembranal, el exón 15, que codifica el
dominio 1 tirosina cinasa y el exón que codifica la parte
C-terminal.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende la detección sistemática de mutaciones de aminoácido,
tales como las implicadas en la displasia tanatofórica, NSC,
acondroplasia, SADDAN o hipocondroplasia.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que las mutaciones comprenden R248C, S249C, G372C, S373C, Y375C,
K652E, K652M, J809G, J809C, J809R, J809L, P250R, G377C, G382R,
A393E y N542K.
11. El procedimiento de la reivindicación 9, que
comprende la detección sistemática de las mutaciones R248C, S249C,
G372C, K652E e Y375C.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la muestra biológica se selecciona entre el grupo que
comprende por un tejido, médula ósea o un fluido corporal.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que dicho fluido corporal se selecciona entre el grupo que
comprende por sangre y orina de un animal de sangre caliente.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que dicho fluido corporal es de un humano.
15. El procedimiento de la reivindicación 1 para
la detección de carcinomas humanos de vejiga y de cuello
uterino.
16. El procedimiento de la reivindicación 1,
para la detección de cánceres de pulmón, mama, colon y piel.
17. Uso de un anticuerpo dirigido frente a FGFR3
para la fabricación de un medicamento para tratar carcinomas.
18. Uso según la reivindicación 17 en el que el
anticuerpo es monoclonal.
19. Uso según la reivindicación 17 en el que el
anticuerpo está humanizado.
20. Uso de oligonucleótidos complementarios
dirigidos frente a una isoforma de FGFR3 de tipo natural o
mutado para la fabricación de un medicamento para tratar
carcinomas.
21. Uso según las reivindicaciones 17 a 20, en
el que dichos carcinomas son carcinomas de cuello uterino o de
vejiga.
22. Un animal transgénico excluyendo a humanos,
que comprende una construcción compuesta por un promotor de
queratina y el ADNc de FGFR3 mutado, permitiendo la expresión
dirigida de un FGFR3 mutado en epitelio.
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