ES2275924T3

ES2275924T3 - Composiciones y metodos para ensayar aa4rp.

Info

Publication number: ES2275924T3
Application number: ES02781373T
Authority: ES
Inventors: Jamila Najib; Zouher Majd
Original assignee: Genfit SA
Current assignee: Genfit SA
Priority date: 2001-09-07
Filing date: 2002-09-06
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2022-09-06
Also published as: DE60216482T2; DK1423708T3; CA2459947A1; US20040197823A1; EP1423708B1; DE60216482D1; EP1423708A1; JP2005502711A; WO2003023408A1; IL160531A0; ATE347108T1

Abstract

Péptido sintético sustancialmente puro, caracterizado porque consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 2.

Description

Composiciones y métodos para ensayar AA4RP.

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para ensayar o detectar "proteína relacionada con apolipoproteína AIV" (AA4RP). En particular, se refiere a un método que permite la detección y cuantificación directas de AA4RP. La invención también se refiere a productos sintéticos de AA4RP, a los anticuerpos correspondientes, a los kits que los contienen, y a sus usos para detectar y cuantificar AA4RP en una muestra biológica.

La elevación de los niveles de triglicéridos en plasma es uno de los factores determinantes en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares que actualmente son la causa principal de muerte en el mundo (Hokanson y Austin, 1996). Los estudios han demostrado que las alteraciones en la concentración o estructura de apolipoproteínas están relacionadas con niveles anormales de lípidos y con un riesgo creciente de aterosclerosis (Rubin, Krauss et al., 1991; Plump, Smith et al., 1992; Duverger, Tremp et al., 1996; Huang, Liu et al., 1998; Lusis, 2000; Rubin y Tall, 2000). Un ejemplo muy pertinente de la implicación de apolipoproteínas en el balance de triglicéridos en plasma es el de AA4RP. Se ha demostrado que esta apolipoproteína recientemente descubierta es un factor importante en la regulación del metabolismo de triglicéridos en ratones y en seres humanos (Pennacchio, Olivier et al., 2001). Los ratones transgénicos para AA4RP humana mostraron una reducción de tres veces de triglicéridos en plasma, en comparación con los ratones de control. Por el contrario, los ratones carentes del gen que codifica el gen de AA4RP, presentan una concentración de triglicéridos en plasma cuatro veces mayores que los ratones del control. Estas variaciones en los niveles de triglicéridos observadas en ratones transgénicos y en ratones sin AA4RP están en línea con las variaciones en los niveles de apolipoproteína CIII (Apo CIII), que se sabe que es un indicador positivo de niveles de triglicéridos debido al hecho de que esta apolipoproteína inhibe la hidrólisis de triglicéridos por lipoproteína lipasa (LpL). La concentración de apo CIII en plasma se redujo en ratones transgénicos para AA4RP humana alimentados con una dieta rica en lípidos, mientras que los niveles de apo CIII aumentaron en ratones carentes de AA4RP, indicando que uno de los mecanismos de acción de AA4RP puede ser el de regular la expresión del gen apo CIII, y confirmando de este modo el papel positivo de AA4RP en la eliminación de triglicéridos.

En el hombre, se ha demostrado que existe una correlación muy estrecha entre el polimorfismo de AA4RP y los niveles de triglicéridos. De hecho, los alelos menores de SNPs1-3, del polimorfismo de AA4RP, están asociados con niveles elevados de triglicéridos. Un resultado representativo es el incremento del 30% en el nivel de triglicéridos en individuos con uno de estos alelos, en comparación con sujetos que son homocigóticos para los alelos de tipo natural (Pennacchio, Olivier et al., 2001).

Los resultados obtenidos en ratones y en seres humanos dan a conocer claramente la importancia del papel de AA4RP en la homeostasia de los triglicéridos, y sugieren que AA4RP se puede usar como un marcador para el pronóstico o diagnóstico de hipertrigliceridemias. Por lo tanto, es de particular relevancia el desarrollo de un método mediante el cual detectar y/o cuantificar AA4RP.

Por diversas razones, es bastante difícil medir las concentraciones de AA4RP en plasma. En primer lugar, AA4RP comparte un 27% de identidad y un 48% de similitud con la apolipoproteína AIV (apo AIV). En segundo lugar, AA4RP está presente en concentraciones muy bajas en el plasma. Por lo tanto, fue esencial desarrollar un método específico y sensible para cuantificar y/o detectar esta apolipoproteína.

Dicha proteína, que comprende 366 aminoácidos, tiene la siguiente estructura primaria (SEC ID nº: 1).

100

Dicha proteína corresponde a la secuencia de la proteína RAP3 descrita previamente como implicada potencialmente en la regeneración hepática (número de acceso de Genbank: AF202889.1: Van der Vliet H. N., Groenink M., Leegwater A. C. J. y Chamuleau R. A. F. M. Enviado (09-NOV-1999) Experimental Hepatology, Academic Medical Center, Meibergdreef 9, Amsterdam, 1105 AZ, Países bajos). También corresponde a la proteína AA4RP (proteína relacionada con apolipoproteína AIV) en la solicitud de patente internacional WO 01/00803 A2 (SEC ID nº: 3 de dicha solicitud).

La presente invención proporciona una estrategia para producir un péptido sintético específico de AA4RP (que se usa para la producción de anticuerpos anti-AA4RP específicos), y un nuevo método inmunoenzimático mediante el cual detectar y cuantificar directamente esta apolipoproteína. La cuantificación de AA4RP se lleva a cabo ventajosamente mediante el método ELISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima), del tipo sándwich. El anticuerpo anti-AA4RP se reviste sobre un soporte sólido para la captura de la proteína, y después se usa el mismo anticuerpo, ahora marcado con una enzima, como anticuerpo para detectar AA4RP unida al primer anticuerpo. La fase de detección se lleva a cabo en presencia de un sustrato de la enzima, y la intensidad de la reacción que se desarrolla entre la enzima y su sustrato es directamente proporcional a la concentración de AA4RP. Para detectar, cuantificar o purificar AA4RP usando anticuerpos anti-AA4RP específicos, se pueden usar anticuerpos policlonales, o anticuerpos monoclonales, o una mezcla de los mismos.

La invención también describe dichos anticuerpos, los kits que los contienen, y sus usos para la detección, cuantificación o purificación de AA4RP en muestras, particularmente suero o plasma. Dichos anticuerpos también ofrecen un nuevo enfoque para modular la actividad de AA4RP in vitro o in vivo, y para regular el metabolismo lipídico en un sujeto.

Un primer objeto específico de la invención se refiere a un péptido sintético sustancialmente puro específico de AA4RP, que consiste en la secuencia SEC ID nº: 2.

Otro objeto de la invención se refiere a un método para producir anticuerpos anti-AA4RP, que comprende una etapa de inmunización con un péptido sintético específico de AA4RP, tal como se ha definido anteriormente. La presente invención también comprende anticuerpos preparados según dicho método, y, más generalmente, anticuerpos capaces de unirse a un péptido tal como se ha definido anteriormente, así como fragmentos o derivados de tales anticuerpos.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para detectar o ensayar AA4RP en muestras biológicas (particularmente en lipopartículas preparadas o en muestras de plasma completo o suero), con la ayuda de un anticuerpo (incluyendo un fragmento o un derivado del mismo) tal como se define aquí anteriormente.

Otro objeto de la invención se refiere a un método para detectar la presencia de una predisposición o de un riesgo de desarrollar un trastorno de metabolismo lipídico en un sujeto, que comprende detectar AA4RP in vitro, en una muestra procedente de dicho sujeto, por medio de un anticuerpo (incluyendo un fragmento o un derivado del mismo) tal como se define aquí anteriormente.

Un objeto adicional de la invención se refiere a un método para detectar o monitorizar en un sujeto la captación celular de lipoproteínas ricas en triglicéridos y de HDL, que comprende detectar in vitro partículas que contienen AA4RP, por medio de un anticuerpo (incluyendo un fragmento o un derivado del mismo) tal como se define aquí anteriormente.

Otro objeto de la invención se refiere a un método para detectar y/o monitorizar la formación, desarrollo o progresión de aterosclerosis en un sujeto, que comprende detectar in vitro, en una muestra procedente de dicho sujeto, la cantidad o nivel de AA4RP por medio de un anticuerpo (incluyendo un fragmento o un derivado del mismo) tal como se define aquí anteriormente.

El sujeto es generalmente un mamífero, preferentemente un ser humano, incluso más preferentemente un sujeto que tiene riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares ligadas a una dislipidemia (más preferentemente, una hipertrigliceridemia), tal como una enfermedad coronaria, por ejemplo.

Otro objeto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo (incluyendo un fragmento o un derivado del mismo), tal como se define aquí anteriormente, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Péptidos específicos

Tal como se ha indicado anteriormente, un aspecto de la presente invención se refiere a un péptido sintético sustancialmente puro específico de AA4RP, que comprende la secuencia SEC ID nº: 2. La expresión "sustancialmente puro" indica que el péptido está esencialmente desprovisto de secuencias de aminoácidos presentes en Apo AIV, y/o de proteínas contaminantes normalmente presentes o asociadas con lipopartículas, tales como Apo A1 en particular. El término "sintético" indica que el péptido no es una molécula obtenida naturalmente, sino más bien se ha preparado mediante un método artificial (por ejemplo, síntesis química, ensamblaje, etc.), particularmente como se describe en los ejemplos. A este respecto, el péptido sintético específico de AA4RP de la invención preferentemente no está glicosilado de forma esencial.

La presente invención demuestra ahora que los péptidos sintéticos específicos de AA4RP se pueden producir y usar para generar anticuerpos anti-AA4RP específicos. La invención demuestra además que dichos anticuerpos se pueden unir específicamente a AA4RP obtenida naturalmente o en forma de un antígeno soluble, o incluida en lipopartículas. La invención también demuestra que dichos anticuerpos se pueden unir a diferentes lipopartículas que contienen AA4RP (VLDL y HDL). Dichos péptidos sintéticos específicos de AA4RP, y sus correspondientes anticuerpos, representan así nuevos productos que son particularmente ventajosos para la detección de AA4RP, y para la cuantificación específica de dicha apolipoproteína.

SEQ ID NO: 2

101

Dicho fragmento peptídico de 95 aminoácidos corresponde a los restos 20 a 114 de la secuencia de AA4RP humana madura.

Como se ilustra en los ejemplos, dicho péptido (que comprende la secuencia SEC ID nº: 2) se puede preparar de una manera particularmente ventajosa mediante síntesis en fase sólida, más particularmente usando una estrategia Boc/Bzl (Merrifield, 1963).

El término "derivado" comprende péptidos que comprenden una o más mutaciones, sustituciones, supresiones y/o adiciones de uno o más restos de aminoácidos, y que tienen sustancialmente la misma especificidad antigénica. Los ejemplos típicos de derivados incluyen variaciones de secuencia debidas a polimorfismo de AA4RP, corte y empalme, etc. Los derivados especialmente preferidos comprenden una secuencia SEC ID nº: 2 o una secuencia modificada que comprende como máximo 5 aminoácidos diferentes de aquellos presentes en la secuencia SEC ID nº: 2. Los restos adicionales pueden ser restos de una secuencia de transporte o de unión, grupos protectores, y similares. Adicionalmente, el péptido se puede modificar, por ejemplo, mediante una vía química, física y/o enzimática, para incrementar su estabilidad, incrementar su inmunogenicidad, o aún incorporar un "marcador" o cualquier otra molécula portadora o marcador, etc. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen la glicosilación, la adición de un portador, un marcador (por ejemplo, una etiqueta radiactiva o enzimática, etc.), etc.

El término "fragmento" significa cualquier péptido que comprende de 5 a 95 restos consecutivos de la secuencia SEC ID nº: 2, preferentemente de 10 a 95. El término "fragmento" incluye cualquier porción de secuencia SEC ID nº: 2 que comprende un epítopo.

Un objeto específico de la invención se refiere a un péptido sintético específico de AA4RP, en el que comprende epítopos específicos de AA4RP, y en el que está desprovisto de epítopos desprovistos de Apo AIV, y en el que comprende la secuencia SEC ID nº: 2.

Los péptidos pueden ser solubles, se pueden purificar o complejar con una molécula portadora, tal como KLH (hemocianina de lapa californiana) o seroalbúmina, por ejemplo, o aún con cualquier otra molécula inerte (por ejemplo, sintética) tal como una perla, etc. Según una forma de realización particular de la invención, los péptidos se acoplan a una molécula portadora. En particular, este es el caso cuando se usan para la producción de anticuerpos. El acoplamiento se puede llevar a cabo según métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica (Vaitukaitis, Robbins et al., 1971) (Bassiri, 1979).

Los péptidos también se pueden conjugar o acoplar con una molécula peptídica heteróloga, tal como una molécula biológicamente activa, por ejemplo. La naturaleza heteróloga significa cualquier péptido que no se origine a partir de la molécula de AA4RP.

Un objeto específico de la invención se refiere a una composición caracterizada porque comprende un péptido sintético que comprende la secuencia SEC ID nº: 2, y en la que está desprovista de otras proteínas, y en particular de apolipoproteínas.

Los péptidos se pueden usar dentro del marco de métodos de identificación sistemática para ensayos de titulación, como controles, patrones, o para la calibración del ensayo. También se pueden usar para modular la actividad de AA4RP. También son particularmente útiles para producir anticuerpos anti-AA4RP.

Anticuerpos

A este respecto, otro objeto de la invención se refiere a cualquier anticuerpo capaz de unirse a un péptido tal como se ha definido anteriormente. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Además, el término anticuerpo incluye generalmente cualesquiera fragmentos o derivados de anticuerpos, en particular fragmentos o derivados de dichos anticuerpos monoclonales o policlonales que presentan sustancialmente la misma especificidad antigénica. Estos últimos comprenden fragmentos de anticuerpos (Fab, Fab'2, CDR, etc.), anticuerpos humanizados, anticuerpos polifuncionales, anticuerpos de una sola cadena (ScFv), etc. Los anticuerpos de la invención se pueden producir mediante métodos convencionales, que comprenden inmunizar a un animal, y recuperar el suero (policlonal) o las células del bazo (para la producción de hibridomas mediante fusión con estirpes celulares adecuadas).

Los métodos para la producción de anticuerpos monoclonales a partir de diversas especies, incluyendo ratones, roedores, primates, caballos, cerdos, conejos, aves de corral, etc., se pueden encontrar, por ejemplo, en Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis, Robbins et al., 1971). El antígeno se combina con un adyuvante (por ejemplo, el adyuvante de Freund), y se administra a un animal, típicamente mediante inyección subcutánea. Se pueden administrar inyecciones repetidas. Se recogen muestras de sangre, y se aíslan las inmunoglobulinas o el suero.

Los métodos para producir anticuerpos monoclonales a partir de especies diferentes se pueden encontrar, por ejemplo, en Harlow et al. (Harlow, 1988) o en Kohler et al. (Kohler y Milstein, 1975). Dichos métodos comprenden inmunizar a un animal con un antígeno, y después recuperar las células del bazo que se fusionan entonces con células inmortalizadas, tales como células de mieloma. Los hibridomas resultantes producen anticuerpos monoclonales, y se pueden seleccionar mediante dilución limitada para aislar clones individuales. Los anticuerpos también se pueden producir mediante selección de librerías de inmunoglobulinas combinatorias, tales como se describe, por ejemplo, en Ward et al. (Ward, Gussow et al., 1989).

Los anticuerpos de la invención preferidos se preparan mediante inmunización con un péptido sintético sustancialmente puro específico de AA4RP, tal como se describe aquí anteriormente, que comprende preferentemente la secuencia SEC ID nº: 2.

Los fragmentos Fab o Fab'2 se pueden producir mediante digestión con una proteasa, según métodos convencionales. Los anticuerpos humanizados se pueden preparar mediante uno de los métodos descritos, por ejemplo, en Riechmann et al. (Riechmann, 1988) (Jones, 1986).

La invención también se refiere a un método para producir anticuerpos anti-AA4RP, que comprende inyectar un péptido, que tiene la secuencia SEC ID nº: 2, y recuperar el anticuerpo o células productoras de anticuerpo. El método permite ventajosamente la producción de anticuerpos específicos. La especificidad se puede verificar demostrando la ausencia de una reacción cruzada con otras proteínas de la sangre circulantes. Más generalmente, la especificidad indica que los anticuerpos son capaces de unirse a AA4RP con una afinidad mayor que cualquier otro antígeno. Como se ilustra en los ejemplos, los anticuerpos policlonales de la presente invención se pueden usar para detectar y/o ensayar AA4RP con una elevada eficacia.

Los anticuerpos se pueden acoplar a fragmentos heterólogos tales como toxinas, marcadores, medicamentos o cualquier otro agente terapéutico, covalentemente o no, ya sea directamente o por medio de agentes de acoplamiento. Los marcadores se pueden seleccionar entre radiomarcadores, enzimas, agentes fluorescentes, partículas magnéticas, etc. Las toxinas preferidas son, por ejemplo, la toxina de la difteria, la toxina del botulismo, etc. Los medicamentos o agentes terapéuticos se seleccionan en particular entre linfoquinas, antibióticos, secuencias antisentido, factores de crecimiento, etc. Los métodos mediante los cuales acoplar anticuerpos con dichos fragmentos heterólogos se ilustran, por ejemplo, en la patente US 4.277.149, y en la patente US 3.996.345.

Los anticuerpos de la invención tienen muchos usos, incluyendo aplicaciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico, para purificación, detección, etc.

In vitro, se pueden usar como agentes de identificación sistemática o para purificar antígenos procedentes de diversas muestras, incluyendo diferentes muestras biológicas (por ejemplo, muestras de sangre). También se pueden usar para detectar o cuantificar la presencia o la cantidad de AA4RP en lipopartículas en una muestra recogida de un sujeto, típicamente una muestra de sangre procedente de un mamífero, o, preferentemente, procedente de un ser humano.

Detección/ensayo

A este respecto, otro objeto de la invención se refiere a un método para detectar, medir, ensayar o cuantificar AA4RP en una muestra biológica, que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo tal como se define aquí anteriormente (incluyendo fragmentos o derivados del mismo), y detectar, medir, ensayar o cuantificar (la presencia) de complejos inmunitarios de antígeno-anticuerpo. Típicamente, dicho método permite determinar niveles de AA4RP en una muestra, mediante comparación con condiciones estándares o con una curva de calibración, por ejemplo.

La determinación de los complejos inmunitarios se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales, tales como métodos inmunológicos competitivos o directos, por ejemplo el método RIA (radioinmunoensayo), EIA (electroinmunoensayo), mediante nefelometría, turbidimetría, inmunotransferencia cuantitativa, calorimetría, interferometría, resonancia superficial, medición del campo de fuerza, otros biosensores bajo desarrollo, etc. Sin embargo, un objeto especialmente preferido de la invención se refiere a un método basado en el ensayo ELISA de tipo sándwich. De hecho, como se ha indicado aquí anteriormente, los anticuerpos son específicos y pueden reconocer AA4RP en una muestra, permitiendo así un ensayo preciso, sensible y eficaz de AA4RP con un anticuerpo anti-AA4RP policlonal (o una mezcla de anticuerpos monoclonales).

Un objeto más preferido de la invención se refiere por lo tanto a un método para detectar, medir, ensayar o cuantificar AA4RP en una muestra biológica, que comprende poner en contacto la muestra (o sus diluciones) con un primer anticuerpo inmovilizado sobre un soporte, denominado anticuerpo de captura, estando dicho anticuerpo definido aquí anteriormente (incluyendo fragmentos o derivados del mismo), y dar a conocer cualesquiera complejos inmunitarios antígeno-anticuerpo formados por medio de un segundo anticuerpo marcado, denominado anticuerpo de detección, siendo dicho anticuerpo tal como se define aquí anteriormente (incluyendo fragmentos o derivados del mismo).

En una forma de realización particularmente preferida, los anticuerpos de captura y de detección son anticuerpos policlonales. Pueden ser el mismo anticuerpo policlonal. El anticuerpo de captura se puede inmovilizar sobre cualquier tipo de soporte, particularmente plástico, tal como una placa, perla, columna, gel y similar. De manera ventajosa, el soporte es una placa de múltiples pocillos. La inmovilización se logra típicamente mediante adsorción del anticuerpo sobre la superficie de los pocillos. Se entiende que se puede usar cualquier otro método de revestimiento, directo o indirecto, covalente o no. El anticuerpo de captura se usa típicamente en forma soluble. Primero se marca para permitir su detección y cuantificación. Hay diversos tipos de marcaje, tal como el marcaje radioactivo, fluorescente, enzimático, luminiscente, etc. En una forma de realización específica, el marcaje es un marcaje enzimático, y los complejos inmunitarios se dan a conocer midiendo la actividad enzimática. Un ejemplo específico de marcaje enzimático es peroxidasa, cuya actividad se puede visualizar en presencia, por ejemplo, del sustrato OPD.

Un objeto particularmente preferido de la invención se refiere a un método para detectar, medir, ensayar o cuantificar AA4RP en una muestra biológica, que comprende poner en contacto la muestra (o sus diluciones) con un soporte sobre el que se inmoviliza un anticuerpo de captura policlonal tal como se define aquí anteriormente, en condiciones que permitan la formación de complejos inmunitarios específicos, y dar a conocer los complejos inmunitarios de antígeno-anticuerpo eventualmente formados, por medio de un anticuerpo de detección policlonal marcado, definido dicho anticuerpo policlonal como antes.

El método se puede llevar a cabo en diferentes muestras biológicas, incluyendo plasma, suero, fluido intersticial, sobrenadante de cultivo celular, etc. La muestra se puede recoger a partir de un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), y se puede usar directamente en el ensayo. Como alternativa, la muestra se puede diluir y/o almacenar (por ejemplo, congelada) para el ensayo en una fecha posterior. La invención también proporciona la medición de concentraciones de AA4RP en lipopartículas a través del uso de anticuerpos anti-AA4RP específicos, con una sensibilidad, reproducibilidad y repetibilidad muy elevadas.

La detección se puede llevar a cabo en diferentes condiciones experimentales, clínicas, epidemiológicas, de pronóstico y de diagnóstico. En particular, el método se puede usar para detectar la predisposición de ciertos sujetos a desarrollar trastornos del metabolismo lipídico.

Un objeto específico de la invención se refiere de este modo a un método para detectar la presencia de una predisposición o de un riesgo de desarrollar un trastorno del metabolismo lipídico en un sujeto, que comprende detectar in vitro o medir in vitro, en una muestra extraída del sujeto, lipopartículas que contienen AA4RP, usando un anticuerpo tal como se define aquí anteriormente (incluyendo fragmentos o derivados del mismo). Los niveles de AA4RP (mediante comparación con un valor medio en sujetos normales) pueden ser característicos de un riesgo elevado de desarrollar trastornos del metabolismo lipídico.

Otro objeto de la invención se refiere a un método para detectar o monitorizar la captación celular de AA4RP y lipoproteínas ricas en triglicéridos, en un sujeto, que comprende detectar in vitro las cantidades de AA4RP en lipopartículas, usando un anticuerpo tal como se define aquí anteriormente (incluyendo fragmentos o derivados del mismo).

Otro objeto de la invención se refiere a un método para monitorizar un tratamiento para corregir trastornos del metabolismo lipídico en un sujeto, que comprende detectar niveles de AA4RP in vitro, en una muestra procedente de dicho sujeto, usando un anticuerpo tal como se define aquí anteriormente (incluyendo fragmentos o derivados del mismo), después de administrar dicho tratamiento a dicho sujeto. La eficacia del tratamiento está correlacionada con el nivel de AA4RP en el sujeto. Estos resultados se pueden correlacionar con la capacidad del tratamiento para regular los niveles o actividad de AA4RP, o la capacidad para restaurar un nivel o actividad normal de AA4RP en un sujeto.

Otro objeto de la invención se refiere a un método para evaluar el estado fisiológico de un sujeto, por ejemplo el nivel de metabolismo lipídico en un sujeto, que comprende detectar los niveles de AA4RP in vitro o ex vivo en una muestra procedente de dicho sujeto, usando un anticuerpo tal como se define aquí anteriormente (incluyendo fragmentos o derivados del mismo).

Tal como se ha indicado anteriormente, dichos métodos se pueden llevar a cabo sobre diferentes muestras (típicamente sobre plasma o suero), y mediante RIA, EIA, nefelometría, turbidimetría, inmunotransferencia cuantitativa, calorimetría, interferometría, resonancia de superficie, medición del campo de fuerzas, otros biosensores bajo desarrollo, etc., o preferentemente por medio de un ensayo ELISA de tipo sándwich.

La invención también comprende una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo tal como se define aquí anteriormente, y posiblemente un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere asimismo a un kit que comprende un péptido o un anticuerpo tal como se describe aquí anteriormente. El kit se puede usar para la detección o cuantificación de AA4RP en cualquier muestra.

Otros aspectos y ventajas de la invención se describirán en los siguientes ejemplos, que se proporcionan con fines ilustrativos y no a título limitativo.

Leyendas de las figuras Figura 1 Especificidad de los anticuerpos

Control mediante SDS PAGE de la especificidad del anticuerpo anti-AA4RP, y demostración de la distribución de AA4RP en VLDL y HDL.

Figura 2

Ensayo de ELISA sobre AA4RP

La curva de calibración se construye a partir de las OD en función de las concentraciones del péptido 20-114 (\vardiamondsuit), de un plasma procedente de sujetos normolipídicos (\pi), y HDL preparados a partir de plasma procedente de sujetos normolipídicos (\bullet), según el protocolo descrito en el ejemplo 3.

Figura 3

Concentraciones de AA4RP en plasma calculadas a partir de una serie de calibración del péptido 20-114 o de plasma reunido procedente de sujetos normolipídicos según el método de ELISA.

Figura 4

Ensayo de ELISA de AA4RP en ratones C57BL/6 no transgénicos y ratones FVB, ratones (knock-out (KO)) sin AA4RP con antecedentes genéticos de FVB, y ratones transgénicos para AA4RP humana (antecedentes genéticos de FVB).

Ejemplos Ejemplo 1 Secuencia peptídica 1. Elección de la secuencia peptídica adecuada

Se sintetizó el siguiente fragmento peptídico. Dicho fragmento se definió usando diferentes algoritmos para predecir la flexibilidad, hidrofilia, antigenicidad, y estructuras secundarias. Dicho fragmento, que contiene 95 aminoácidos, corresponde a los restos 20 a 114 de la secuencia SEC ID nº: 1.

102

2. Síntesis peptídica

El péptido se sintetizó mediante síntesis en fase sólida (Merrifield, 1963), en un sintetizador automático ABI 431 A (Applied Biosystems Inc., California, USA), usando una estrategia de Boc/Bzl en 0,5 mmoles (0,57 mmoles/g) de resina de MBHA. Cada aminoácido se acopló dos veces en presencia de diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol, sin capar los extremos. Los grupos protectores de cadena lateral fueron los siguientes: Arg(Ts), Asp(Ochex), Glu(Ochex), Lys(2-Cl-Z), His(Dnp), Ser(Bzl), Thr(Bzl), Met(O), Trp(formy) y Tyr(Br-Z).

El grupo Dnp en el resto de histidina se eliminó del péptido antes de la escisión del soporte, mediante tratamiento en presencia de 10% de \beta-mercaptoetanol, 5% de diisopropiletilamina en medio de DCM durante 2 horas, y después en medio de NMP durante 2 horas. La resina de peptidilo se trató con 50% de TFA en medio de DCM durante 20 minutos, para eliminar el Boc del aminoácido terminal. El péptido se escindió de la resina, y se desprotegió simultáneamente según un procedimiento con HF lento y rápido: la resina (1 g) se trató con HF anhidro (2,5 ml) en presencia de p-cresol (0,75 g), p-tiocresol (0,25 g) y sulfuro de dimetilo (0,5 ml), a 0ºC.

Tres horas más tarde, el fluoruro de hidrógeno y el sulfuro de dimetilo se eliminaron mediante evaporación a vacío, y se extrajeron los depuradores residuales y los subproductos secundarios con éter dietílico. Las vasijas de reacción se volvieron a cargar con p-cresol (0,75 g), p-tiocresol (0,25 g) y 10 ml de HF anhidro, y la mezcla se incubó a 0ºC durante 1,5 horas. El fluoruro de hidrógeno se eliminó por evaporación, y el residuo se mezcló en presencia de éter dietílico. El residuo se filtró, se lavó con éter dietílico y se extrajo con 200 ml de una disolución acuosa al 10% de ácido acético, y después se liofilizó.

3. Espectrometría de masas

La masa molecular se determinó en un espectrómetro de masas de electropulverización iónica. El espectro de electropulverización se obtuvo usando un aparato API (Perkin-Elmer-Sciex) en un espectrómetro de masas de pulverización iónica cuadrupolar individual, equipado con un pulverizador de iones (electropulverización asistida mediante un nebulizador) (Sciex, Toronto, Canada).

4. Inmunización

El péptido se emulsionó en adyuvante completo de Freund, y se inyectó subcutáneamente en conejos, a una dosis de 0,5 mg por inyección durante las dos primeras inyecciones, seguido de una dosis de revacunación de 0,25 mg de péptido en el mismo adyuvante, cada dos semanas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Aislamiento y caracterización de anticuerpos anti-AA4RP específicos de conejo 1. Aislamiento de anticuerpos anti-AA4RP

Los anticuerpos policlonales se aislaron mediante precipitación con sulfato de sodio al 27%, y después se purificaron mediante cromatografía de afinidad sobre gel de Sepharose 4B activado (Pharmacia, Uppsala, Suecia), acoplado con el resto peptídico de AA4RP de 20 a 114 AA (Axen, Porath et al., 1967). Las proteínas no retenidas sobre el gel antigénico se eliminaron lavando con disolución salina tamponada con fosfato (PBS:fosfato 50 mmoles/l, pH 7,2, NaCl 150 mmoles/l). Las fracciones no unidas específicamente en el gel de AA4RP se eliminaron con PBS 25 mmoles/l. Los IgG policlonales específicos de AA4RP se eluyeron con 0,2 M de glicina, pH 2,8. Los anticuerpos purificados se dializaron inmediatamente frente a PBS 10 mmoles/l, y después se concentraron mediante ultrafiltración usando un sistema Amicon (corte 100 kD) (Amicon, Dr. Bervely, MA, USA), se ensayaron para determinar el contenido de proteínas (Lowry O. H., 1951), y después se almacenaron en alícuotas de 1 ml (1 mg) a -30ºC.

2. Análisis mediante transferencia Western 2.1- Protocolo

La pureza y especificidad de los anticuerpos se analizaron mediante transferencia Western (Towbin, Staehelin et al., 1979). Las partículas de HDL, LDL y VLDL humanas se sometieron a electroforesis de SDS-PAGE desnaturalizante (5 a 24%), después se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se hicieron reaccionar con anticuerpo anti-AA4RP humana purificado. Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron con un anticuerpo policlonal anti-IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sanofi-Diagnostics Pasteur, Marnes-la-Coquette, Francia). La reacción se desarrolló mediante quimioluminiscencia (Amersham, Pharmacia, Biotec).

2.2- Resultados

Los resultados se presentan en la Figura 1. En esta figura, se puede observar que la banda específica dada a conocer por el anticuerpo anti-AA4RP está localizada entre los marcadores de pesos moleculares de 32,5 y 47,5 kDa.

2.3- Interpretación

El resultado de inmunotransferencia sobre lipoproteínas humanas diferentes muestra que AA4RP está localizada en VLDL y HDL, principalmente en HDL.

La presencia de AA4RP en VLDL explicaría el papel de esta apolipoproteína en la regulación metabólica de estas lipoproteínas ricas en triglicéridos, y de este modo la modulación de la concentración de estos lípidos aterogéni-
cos.

La localización de AA4RP en HDL está relacionada indudablemente con el papel de estas partículas en el transporte inverso de colesterol. De hecho, la mayoría de apolipoproteínas localizadas en HDL promueven la captación de colesterol derivado de células mediante HDL, y lo transfieren al hígado, en el que es eliminado.

Ejemplo 3 Ensayo mediante ELISA de AA4RP (tipo sándwich) 1. Reactivos y materiales usados para el ensayo de ELISA 1.1- Anticuerpo de captura

La disolución madre anti-AA4RP se concentró hasta 1 mg/ml, el revestimiento (fijación de anticuerpo en los pocillos de una placa de 96 pocillos) se llevó a cabo a 10 \mug/ml, y el anticuerpo se diluyó en disolución salina tamponada con fosfato (0,1 M de PBS, 0,15 M de NaCl, pH 7,2 a 7,4).

1.2- Anticuerpo de detección

El mismo anticuerpo usado para la captura se marcó con peroxidasa. Se diluyó 1:5000 en tampón de PBS 0,1 M que contiene 1% de BSA.

1.3- Patrón

El péptido 20-114 se usó para preparar la serie de puntos de calibración. La concentración de péptido fue 1 mg/ml.

Para representar gráficamente la curva de calibración, el patrón se tuvo que diluir en 0,1 M de PBS/1% de BSA según la siguiente tabla:

1

1.4- Preparación de las muestras

Se recomiendan muestras recientes para el análisis. El plasma se debería de recoger mediante procedimientos establecidos, y se debería de usar en laboratorios clínicos. Cuando sea necesario, el plasma se puede almacenar entre 2 y 8ºC durante un tiempo de hasta una semana. Las muestras que se guardan almacenadas se pueden usar durante un período más largo.

Las muestras se diluyeron según su fuente:

-: Plasma procedente de sujetos normolipídicos: 1,3 a 4 veces.

-: Plasma para sujetos hipertrigliceridémicos: de 2 a 16 veces.

-: HDL preparado a partir de plasma mediante ultracentrifugación: de 4 a 128 veces.

Las diluciones se realizaron en PBS/1% de BSA.

2. Protocolo

-: "Revestimiento": la disolución de anticuerpo de captura anti-AA4RP no marcado se incubó toda la noche a temperatura ambiente, a 100 \mul/pocillo (placa de microtitulación de 96 pocillos).

-: Lavado de la placa: los anticuerpos no unidos en la placa se eliminaron lavando la placa de microtitulación 4 veces con 0,1 M de PBS.

-: Carga de las muestras y puntos de calibración: las preparaciones de las disoluciones de calibración del péptido, el plasma humano y HDL se añadieron a 100 \mul por pocillo, y después se incubaron a 37ºC durante 2 horas.

-: Lavado: el exceso de péptido y AA4RP procedente de muestras biológicas que no se unieron a los anticuerpos de captura anti-AA4RP se eliminaron lavando sucesivamente cuatro veces la placa de microtitulación.

-: Detección: la detección se realizó con anticuerpo anti-AA4RP marcado con peroxidasa, diluido 1/5000 en PBS/1% de BSA. Se añadieron 100 \mul de preparación a cada pocillo de la placa de microtitulación. La incubación se realizó a 37ºC durante 2 horas.

-: Lavado: el exceso de anticuerpo de detección anti-AA4RP se eliminó lavando la placa 4 veces con 0,1 M de PBS.

-: Desarrollo de reacción enzimocolorimétrica: llevada a cabo añadiendo 100 \mul de sustrato de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD) por pocillo, después de lo cual la reacción se desarrolló durante 30 minutos en la oscuridad.

-: Parada de la reacción: mediante adición de 100 \mul de HCl 1 N por pocillo.

-: Lectura de la absorbancia: se efectúa en un espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda de 492 nm.

3. Resultados e interpretación 3.1- Curva de calibración

La curva de calibración se obtuvo según una función de cuatro incógnitas que representan el incremento de la densidad óptica como función de la concentración de las diferentes diluciones de los puntos de calibración. Es una curva sigmoide característica del ensayo inmunoenzimática de ELISA (Figura 2).

Las curvas representativas de diferentes diluciones del péptido 20-114, del plasma humano normolipídico y de HDL solapan, indicando que el anticuerpo anti-AA4RP tiene la misma afinidad por el péptido sintético y por la AA4RP natural en plasma o lipoproteínas humanas. Además, el ensayo de AA4RP en varios sujetos, usando una serie de puntos de calibración preparados a partir del péptido o a partir de plasma humano reunido, dio resultados significativamente similares para la concentración de AA4RP (Figura 3).

3.2- Intervalo de trabajo y límite de detección

Es de aproximadamente 2 Log, entre 1 y 62 ng/ml, lo que permite que el ensayo de las muestras tenga concentraciones de AA4RP muy diferentes. El límite de detección es aproximadamente 1 ng/ml, lo que indica que el ensayo tiene una sensibilidad muy elevada.

3.3- Valores normales

El ensayo de AA4RP en una población de sujetos normolipídicos, con niveles de triglicéridos que no superan 1 mg/ml, dio valores de concentración de apolipoproteína que oscilan desde 9,84 hasta 29,44 ng/ml.

Ejemplo 4 Correlación entre la concentración de AA4RP de los diferentes compartimientos de plasma y los niveles de triglicéridos totales 1. Protocolo

Las correlaciones entre niveles de triglicéridos en plasma y las concentraciones de AA4RP en plasma, o de AA4RP en lipoproteínas que no son HDL (VLDL, IDL y LDL), o de AA4RP en lipoproteínas de HDL, se determinaron en una población con niveles de triglicéridos comprendidos entre 0,5 y 4 mg/ml.

1.1 - Preparación de lipoproteínas HDL y no HDL

Las lipoproteínas HDL y no HDL se prepararon mediante precipitación de estas últimas por adición de ácido fosfowolfrámico y Mg2+ al plasma procedente de diferentes sujetos (precipitación selectiva de lipoproteínas que contienen apo B, es decir VLDL, IDL y LDL) (Burstein, Scholnick et al., 1970; Lopes-Virella, Stone et al., 1977). De forma breve, el plasma se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente en una disolución de fosfowolframato, después se centrifugó a 2500 rpm durante 15 minutos, y finalmente el sobrenadante que contiene HDL se separó del pelete que contiene lipoproteínas no HDL.

1.2 - Ensayo de triglicéridos

Los triglicéridos del plasma se ensayaron mediante el método enzimocolorimétrico, frente a una curva de calibración preparada con el calibrador lipídico CFAS, Ref. Nº 759350 (Boehringer Mannheim GmbH, Alemania). La curva de calibración cubrió un intervalo de concentración de 16 a 500 \mug/ml. Se depositaron 100 \mul de cada dilución de muestra o de cada patrón de calibración en cada pocillo de una placa de titulación de 96 pocillos. A continuación, se añadieron 200 \mul de reactivo de triglicérido, Ref. 701912 (Boehringer Mannheim GmbH, Alemania), a cada pocillo, y la placa se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Las densidades ópticas (OD) se leyeron en un espectrofotómetro ajustado a 492 nm. Las concentraciones de triglicéridos en cada muestra se calcularon a partir de una curva patrón representada gráficamente como una ecuación lineal y = ax + b, en la que y representa OD, y x representa la concentración de triglicéridos.

1.3 - Ensayo de AA4RP total en lipoproteínas HDL y en lipoproteínas no HDL

Las concentraciones de AA4RP total en plasma y en lipoproteínas HDL se ensayaron según el protocolo del ejemplo 3. La concentración de AA4RP en lipoproteínas no HDL se calculó como la diferencia entre la concentración de AA4RP en plasma total y la de lipoproteínas HDL.

2. - Resultados e interpretaciones

No se observó correlación entre la concentración de AA4RP en plasma y la de triglicéridos totales o triglicéridos de lipoproteínas no HDL. Por otro lado, se encontró una correlación negativa significativa entre la concentración de la proteína y la de triglicéridos en lipoproteínas HDL (r = 0,5, p < 0,001). Este hallazgo indica que cuanto mayor es el incremento de los niveles de triglicéridos, más disminuye la concentración de AA4RP en HDL, confirmando así el papel antiaterogénico de HDL y consecuentemente de AA4RP que está presente en este tipo de lipoproteína.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5

Cuantificación de AA4RP en ratones transgénicos para AA4RP humana 1.- Protocolo

La concentración de AA4RP se determinó en ratones C57BL/6 normales, ratones FVB no transgénicos, ratones carentes de AA4RP (KO, del inglés knock out) con un antecedente genético de FVB, y ratones transgénicos para AA4RP humana (antecedente genético de FVB). El protocolo de ensayo fue idéntico al descrito en el ejemplo 3.

2.- Resultados e interpretaciones:

La Figura 4 muestra que el ensayo detectó AA4RP solamente en los ratones transgénicos para AA4RP humana, demostrando la especificidad del método entre el hombre y el ratón. Esto es muy interesante, puesto que es posible cuantificar AA4RP exógena en modelos de animales modificados sin contaminación mediante la proteína endógena, permitiendo así distinguir entre el efecto de la AA4RP endógena del animal y la de origen exógeno.

Referencias

Axen, R., J. Porath, et al. (1967). "Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyanogen halides"Nature 214(95): 1302-4.

Bassiri, R. M., Dvorak J. y Utiger R.D. (1979). Thyrotrpin-releasing hormone. Methods of hormone radioimmunoassay. B. M. In: Jaffe, y Behrman H.R. (Eds). Nueva York, Nueva York Academic Press: p: 46.

Burstein, M., H. R. Scholnick, et al. (1970). "Rapid method for the isolation of lipoproteins from human serum by précipitation with polyanions."J. Lipid Res 11(6): 583-95.

Duverger, N., G. Tremp, et al. (1996). "Protection against atherogenesis in mice mediated by human apolipoprotein A-IV."Science 273(5277): 966-8.

Harlow, E. a. L., D., Ed. (1988). Antibodies: a Laboratory Manual. Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory Publications.

Hokanson, J. E. y M. A. Austin (1996). "Plasma triglyceride level is a risk factor for cardiovascular disease independent of high-density lipoprotein cholesterol level: a meta- analysis of population-based prospective studies." J Cardiovasc Risk 3(2): 213-9.

Huang, Y., X. Q. Liu, et al. (1998). "Overexpression and accumulation of apolipoprotein E as a cause of hypertriglyceridemia."J. Biol. Chem. 273(41): 26388-93.

Jones, P. T., Dear P. H., Foote J., Neuberger M. S. y Winter G. (1986). "Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse." Nature 321: 522-525.

Kohler, G. y C. Milstein (1975). "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity." Nature 256(5517): 495-7.

Lopes-Virella, M. F., P. Stone, et al. (1977). "Cholesterol determination in high-density lipoproteins separated by three different methods."Clin. Chem. 23(5): 882-4.

Lowry O.H., R. J., Farr A.L., y Randall R.J. (1951). "Protein measurement with folin phenol reagent." J. Biol. Chem. 193: 265-275.

Lusis, A. J. (2000). "Atherosclerosis."Nature 407(6801): 233-41.

Merrifield, R. B. (1963). "Solide phase peptide synthesis. The synthesis of a tetrapeptide."J. Am. Chem. Soc 85: 2149-2154.

Pennacchio, L. A., M. Olivier, et al. (2001). "An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing."Science 294(5540): 169-73.

Plump, A. S., J. D. Smith, et al. (1992). "Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein Edeficient mice created by homologous recombination in ES cells."Cell 71(2): 343-53.

Riechmann, L., Clark M., Waldmann H. y Winter G. (1988). "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma." Nature 332: 323-327.

Rubin, E. M., R. M. Krauss, et al. (1991). "Inhibition of early atherogenesis in transgenic mice by human apolipoprotein Al."Nature 353(6341): 265-7.

Rubin, E. M. y A. Tall (2000). "Perspectives for vascular genomics." Nature 407(6801): 265-9.

Towbin, H., T. Staehelin, et al. (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications."Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(9): 4350-4.

Vaitukaitis, J., J. B. Robbins, et al. (1971). "A method for producing specific antisera with small doses of immunogen."J. Clin. Endocrinol Metab. 33(6): 988-91.

Ward, E. S., D. Gussow, et al. (1989). "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli."Nature 341(6242): 544-6.

<110> GENFIT SA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Composiciones y métodos para ensayar AA4RP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> B0157WO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 366

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético AA4RP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

4

Claims

1. Péptido sintético sustancialmente puro, caracterizado porque consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 2.

2. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido es soluble o está complejado con una molécula portadora tal como KLH, seroalbúmina o una perla.

3. Anticuerpo especifico de un péptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, o fragmento o derivado de dicho anticuerpo que presenta sustancialmente la misma especificidad antigénica.

4. Anticuerpo según la reivindicación 3, caracterizado porque se produce inmunizando un animal no humano con un péptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, y recuperando los anticuerpos o las células productoras de los anticuerpos.

5. Anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque se trata de un anticuerpo policlonal.

6. Anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque se trata de un anticuerpo monoclonal.

7. Método de producción de un anticuerpo anti-AA4RP específico, que comprende administrar un péptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2 a un animal no humano, y recuperar los anticuerpos o células productoras de anticuerpos.

8. Método de detección de AA4RP en una muestra biológica, que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 a 6, o con un anticuerpo producido gracias a un método según la reivindicación 7, y detectar la presencia de complejos inmunitarios de antígeno-anticuerpo.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque la presencia de un complejo inmunitario de antígeno-anticuerpo se determina mediante EIA, RIA, nefelometría, turbidimetría, inmunotransferencia cuantitativa, calorimetría, interferometría, resonancia de superficie o medida de campo de fuerza.

10. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque la presencia de un complejo inmunitario de antígeno-anticuerpo se determina mediante un ensayo de ELISA.

11. Método de cuantificación de AA4RP en una muestra biológica, que comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 ó 6, o con un anticuerpo producido mediante un método según la reivindicación 7, y cuantificar los complejos inmunitarios de AA4RP-anticuerpo.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque la cuantificación se realiza mediante el método de ELISA.

13. Método según una de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque la muestra biológica es una muestra de sangre, de suero, un fluido intersticial o un extracto de tejido o celular.

14. Método de detección de la presencia de una predisposición o de un riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con el metabolismo de los lípidos en un sujeto, que comprende cuantificar in vitro o ex vivo los niveles de AA4RP en una muestra procedente de un sujeto, con un anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 a 6, o con un anticuerpo producido mediante un método según la reivindicación 7.

15. Método de monitorización de un tratamiento destinado a corregir trastornos relacionados con el metabolismo de lípidos en un sujeto, que comprende medir las cantidades de AA4RP in vitro o ex vivo en una muestra que proviene de dicho sujeto, con la ayuda de un anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 a 6, o de un anticuerpo producido mediante un método según la reivindicación 7.

16. Anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 a 6 o producido mediante un método según la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo se acopla a un fragmento heterólogo tal como una toxina, un marcador, un medicamento o cualquier otro agente terapéutico.

17. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 a 6 y 16, o producido mediante un método según la reivindicación 7, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Kit que comprende un péptido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, o un anticuerpo según una de las reivindicaciones 3 a 6 y 16, o producido mediante un método según la reivindicación 7.