ES2274514T5 - Eotaxina = citocina quimiotáctica de eosinófilos - Google Patents

Description

Eotaxina = citocina quimiotáctica de eosinófilos.

La presente invención se refiere a una citocina quimiotáctica.

La acumulación de leucocitos eosinófilos es una propiedad característica de las reacciones alérgicas mediadas por IgE tales como el asma alérgica, la rinitis y el eccema. La acumulación eosinófila también se produce en el asma no alérgica. La broncoconstricción inmediata en respuesta a un estímulo de provocación en el asmático implica la activación de los mastocitos y la liberación de mediadores constrictores. Esto va acompañado después de varias horas en algunos individuos por una respuesta broncoconstrictora tardía asociada a una entrada masiva de eosinófilos (1). La provocación repetida produce la inflamación crónica en las vías respiratorias y una hipersensibilidad notable a los mediadores constrictores. La magnitud tanto de la respuesta tardía como de la hipersensibilidad crónica se correlaciona con el número de eosinófilos presentes en los pulmones (2, 3).

La presente invención proporciona una proteína quimioatrayente susceptible de atraer a los eosinófilos y de provocar la acumulación eosinófila in vitro e in vivo. La proteína quimioatrayente de la presente invención se denomina “eotaxina”.

Con mayor detalle, según un aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína quimioatrayente aislada capaz de atraer los eosinófilos y de producir acumulación eosinófila in vitro e in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto atractivo para los neutrófilos in vivo, que consiste en una secuencia de aminoácidos o que comprende la misma tal como se expone en la SEC. ID nº: 1, o un fragmento de dicha proteína quimiatrayente que conserva sus actividades biológicas.

Las eotaxinas son proteínas del ramal C-C de la superfamilia del factor 4 de plaquetas de citocinas quimiotácticas. Dentro del ramal C-C de la superfamilia del factor 4 de plaquetas de las citocinas quimiotácticas o quimiocinas, algunos miembros tienen la propiedad de atraer los eosinófilos in vitro y algunos pueden producir la acumulación eosinófila in vivo. Por ejemplo, las quimiocinas RANTES y MIP-1a atraen a los eosinófilos in vitro mientras que MCP1 y MIP-1� no. (“RANTES” significa Reguladas en la Activación en linfocitos T Normales Expresados y Segregados, “MIP” significa Proteína Inflamatoria del Macrófago y “MCP” significa Proteína Quimioatrayente de Monocitos)

Las citocinas naturales en la superfamilia del factor 4 de plaquetas de las citocinas quimiotácticas pueden presentar variaciones interespecies notables en la longitud de la molécula de la proteína, en la secuencia de aminoácidos de la proteína, y en las modificaciones del carbohidrato de la proteína, mientras que se conservan las mismas propiedades funcionales características. Similares variaciones en la estructura pueden producirse en las citocinas obtenidas a partir de diferentes individuos dentro de la misma especie. Muchas quimiocinas dentro del ramal C-C de la superfamilia del factor 4 de plaquetas presentan promiscuidad de la fijación del receptor, y la capacidad de las diferentes quimiocinas para fijarse al mismo receptor no depende necesariamente del alto grado de homología a nivel de aminoácidos. Por consiguiente, tanto las variaciones interespecie como intraespecie en la longitud de las proteínas, la secuencia de aminoácidos y en las modificaciones del carbohidrato son de esperar generalmente en las eotaxinas.

La aptitud para atraer eosinófilos y para producir la acumulación eosinófila y/o la activación in vitro e in vivo es una propiedad característica de las eotaxinas. Además, las eotaxinas generalmente no presentan sustancialmente ningún efecto atractivo para los neutrófilos in vivo. El efecto quimioatrayente eosinófilo puede ser un efecto entre las especies, por ejemplo, la eotaxina del cobaya parece ser potente para producir quimiotaxia de los eosinófilos humanos in vitro.

Aunque no forme parte de la invención, puede obtenerse una eotaxina a partir de un fluido corporal apropiado, por ejemplo, del fluido del lavado broncoalveolar obtenido de un ser humano o de un individuo no humano, particularmente un individuo alérgico después de una prueba de provocación con alérgeno, ya sea provocada experimentalmente o contraída de forma natural. Otras fuentes de eotaxinas son, por ejemplo, los fluidos del exudado inflamatorio y los cultivos in vitro de macrófagos, linfocitos, neutrófilos, mastocitos, células epiteliales de las vías respiratorias, células de tejido conectivo, células endoteliales vasculares y los propios eosinófilos.

Por ejemplo, una eotaxina puede obtenerse a partir de un cobaya sensibilizado tras la prueba de provocación con alérgeno. Los modelos de cobaya son útiles ya que comparten muchas propiedades comunes con la respuesta asmática en el hombre. La eotaxina que puede obtenerse del fluido del lavado broncoalveolar de un cobaya sensibilizado mediante purificación sucesiva por HPLC presenta generalmente un peso molecular comprendido en el intervalo entre 6 y 16 kDa. (Como se indicó anteriormente, las variaciones del peso molecular intraespecie de este orden de magnitud se observan en los miembros de la superfamilia del factor 4 de plaquetas).

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para la producción de una proteína quimioatrayente de la presente invención, que comprende el cultivo in vitro de macrófagos, linfocitos, neutrófilos, mastocitos, células epiteliales de las vías respiratorias, células de tejido conectivo, y el aislamiento de las células o

del fluido del cultivo celular de una fracción que demuestra la actividad quimiotáctica eosinófila in vitro e in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto atractivo para los neutrófilos in vivo.

La secuencia de aminoácidos de la eotaxina del cobaya esta expuesta en la SEC. ID nº: 1, SEC. ID nº: 2 y en las Figuras 7 y 8 de los dibujos adjuntos. Otras eotaxinas de cobaya generalmente tendrán por lo menos el 40 o el 50% de homología total con el listado de secuencias presentado en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) a nivel de aminoácidos. La homología puede ser por lo menos del 60%, por ejemplo por lo menos del 70%, por ejemplo por lo menos del 80% con la secuencia expuesta en la SEC. ID nº: 1 y en la Figura 7.

El porcentaje de homología en el presente caso se calcula sobre la base de los aminoácidos que son idénticos en las posiciones correspondientes en las dos secuencias en investigación. Las sustituciones conservadoras no se tienen en cuenta. En el cálculo del porcentaje de homología de una supuesta molécula de eotaxina en investigación con la secuencia mostrada en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) o con la SEC. ID nº: 2 (Figura 8) si la molécula en investigación presenta una longitud diferente de la eotaxina expuesta en la SEC. ID nº: 1 o en la SEC. ID nº: 2 (Figura 7 o Figura 8), entonces el cálculo se basa en los aminoácidos en la parte de la molécula en investigación que se solapan con la secuencia mostrada en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) o en la SEC. ID nº: 2 (Figura 8). Los paquetes del programa informático para la alineación de las secuencias de aminoácidos y el cálculo de la homología están disponibles en el mercado, por ejemplo, el programa “Bestfit” disponible en Genetics Computer Group Sequence Analysis Software, Madison, Wisconsin, U.S.A.

A menos que se especifique de otro modo, los valores específicos del porcentaje de homología entre la eotaxina y otras citocinas quimiotácticas dadas en la presente memoria se han calculado basándose en la eotaxina expuesta en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7).

Como se indicó anteriormente, las eotaxinas que pueden obtenerse de otras especies aparte de los cobayas, por ejemplo de seres humanos, presentarán diferencias interespecie del tipo demostrado por otros miembros del ramal C-C de la superfamilia del factor 4 de plaquetas de quimiocinas, por ejemplo, diferencias en la longitud de la proteína, secuencia de aminoácidos y modificaciones de carbohidrato. Pueden, por ejemplo, existir variaciones en los restos de los terminales en C y/o N. Por ejemplo, es de esperar que el peso molecular de una eotaxina procedente de una especie distinta de cobaya esté comprendida en el intervalo entre 6 kDa y 16 kDa, pero en algunos casos una eotaxina puede tener un peso molecular inferior a 6 kDa o superior a 16 kDa.

Asimismo, es de esperar que en general una eotaxina de otra especie distinta del cobaya, presente por lo menos 40% de homología total con la secuencia expuesta en la SEC. ID nº: 1 y en la Figura 7. La homología puede ser de por lo menos 50%, por ejemplo de por lo menos 60%, por ejemplo de por lo menos 70%, por ejemplo de por lo menos 80% con la secuencia expuesta en la SEC. ID nº: 1 y en la Figura 7. Sin embargo, pueden existir eotaxinas procedentes de otras especies aparte de los cobayas que presenten menos de 40% de homología con la SEC. ID nº: 1 (Figura 7).

Las eotaxinas pueden ser identificadas por una cualquiera o más de las características expuestas anteriormente, en particular por su capacidad para atraer y/o activar eosinófilos in vitro y dar lugar a su acumulación y/o activación in vivo. Una característica que ayuda a la identificación de una molécula como una eotaxina es la falta de efecto atractivo sobre los eosinófilos.

Se proporciona un método de determinación de la capacidad de una sustancia para producir la acumulación eosinófila in vivo, es decir, un método para la experimentación de supuestas eotaxinas, que comprende la administración de la sustancia, generalmente por vía intradérmica, a un animal de ensayo tratado previamente con eosinófilos marcados, por ejemplo marcados con 111In y posteriormente la determinación del número de eosinófilos marcados en un punto de la piel.

Un método in vitro que puede utilizarse para ensayar la susceptibilidad de una supuesta eotaxina para atraer y/o activar eosinófilos in vitro es la susceptibilidad de la sustancia para aumentar las concentraciones en el eosinófilo del calcio intracelular. Otros métodos generales de determinación de la actividad quimiotáctica in vitro pueden utilizarse para ensayar las supuestas eotaxinas in vitro.

La confirmación de que un eosinófilo táctico es una eotaxina puede hacerse también considerando la homología de secuencia de esta proteína con la secuencia expuesta en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7) y/o con la secuencia expuesta en SEC. ID nº: 2 (Figura 8) y/o considerando la relación estructural entre la proteína y la eotaxina de cobaya.

Como se mencionó anteriormente, tanto RANTES como MIP-1a son activadores eosinófilos. La eotaxina presenta similitudes funcionales pero baja homología estructural con RANTES y MIP-1a (31% de homología con MIP-1a a nivel de aminoácido calculada basándose en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7); 32% de homología cuando se calcula sobre la base de las secuencias de solapamiento y 26% de homología con RANTES a nivel de aminoácido calculada sobre la base de la SEC. ID nº: 1 (Figura 7); 27% de homología cuando se calcula sobre la base de las secuencias de solapamiento). Una eotaxina puede distinguirse de RANTES y de MIP-1a no sólo por el grado de homología sino también por diferencias generales en la secuencia y en la estructura.

Además de la molécula completa de eotaxina, la presente invención proporciona asimismo moléculas que comprenden menos qie la secuencia completa de eotaxina. Dichas moléculas (denominadas “fragmentos” en la presente memoria) pueden ser polipéptidos o péptidos. Para su utilización como sustituto de eotaxina, un fragmento debería conservar una o más de las actividades biológicas de la molécula precursora.

Los eosinófilos contienen un arsenal de productos químicos necesarios para destruir los parásitos. Estos productos químicos han estado implicados en el daño al epitelio de las vías respiratorias que produce asma y puede relacionarse con los cambios observados en la función de las vías respiratorias (26, 27). Para los estudios de los inventores se sugiere que las eotaxinas deberían considerarse como importantes mediadores de la acumulación eosinófila in vivo. Los propios macrófagos, linfocitos, neutrófilos, mastocitos, células epiteliales de las vías respiratorias, células del tejido conectivo, células endoteliales vasculares y eosinófilos son asimismo candidatos como fuente de actividad quimiotáctica de eosinófilos generada en los pulmones. Las plaquetas pueden desempeñar también una función ya que se ha demostrado que pueden liberar quimiocinas del C-C (22). Además, una deposición de plaquetas inicial puede estar implicada en la acumulación posterior de eosinófilos in vivo (28, 29) y existen pruebas de que el factor activador de plaquetas produce la síntesis de un eosinófilo quimioatrayente no identificado in vivo (30). A este respecto, es de interés que el factor de crecimiento derivado de plaquetas pueda provocar la expresión génica de las quimiocinas del C-C en fibroblastos (31). Además, las quimiocinas del C-C han estado implicadas en la cicatrización de la herida (18). Esto puede ser importante en la fibrosis subepitelial de la membrana basal que es una característica destacada del pulmón asmático. Por lo tanto, las eotaxinas pueden estar implicadas tanto en la acumulación de eosinófilos como en los cambios estructurales crónicos en los pulmones.

Las eotaxinas pueden desempeñar una función importante en el asma y en otras enfermedades con un componente inflamatorio en las que la acumulación de eosinófilos y/o la activación es una característica destacada, por ejemplo, rinitis y eccema, especialmente el eccema alérgico. Por consiguiente, los agentes que inhiben o si no ocultan la producción, liberación o acción de eotaxinas tienen potencial como agentes terapéuticos selectivos. Dichos agentes y su utilización terapéutica se describen en la presente memoria.

Dichos agentes incluyen los inhibidores que afectan la interacción de una eotaxina con los receptores de eotaxina, por ejemplo, uniéndose a una eotaxina o a un receptor de eotaxina. Un ejemplo de dicho inhibidor son los propios receptores que, en la administración, pueden unirse a una eotaxina e impedir su interacción con los receptores naturales. Dichos receptores inhibidores pueden ser solubles o insolubles. Los receptores que no están implicados en la activación en la activación celular pueden unirse a células o producirse en ellas. Dichos receptores pueden utilizarse también para eliminar la eotaxina endógena.

Más ejemplos de agentes que afectan la interacción de las eotaxinas con los receptores de eotaxina son los antagonistas del receptor, y anticuerpos, ambos anticuerpos dirigidos contra (susceptibles de unirse a) una eotaxina y los anticuerpos dirigidos contra un receptor de eotaxina, especialmente los anticuerpos monoclonales. Cualquier otro agente que inhiba o si no oculte la unión de una eotaxina a un receptor de eotaxina presenta también potencial terapéutico, por ejemplo, cualquier otro agente que se una a una eotaxina o a un receptor de eotaxina. Más agentes que presentan potencial terapéutico son los que impiden o reducen la activación de los receptores de eotaxina.

Por lo tanto, según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo que se une específicamente a la proteína quimiotáctica como se reivindica en la invención.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona la utilización de un anticuerpo reivindicado en la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del asma o de otra enfermedad inflamatoria.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una preparación farmacéutica que comprende, como principio activo, un anticuerpo reivindicado en la invención mezclado con un portador farmacéuticamente adecuado o junto con el mismo. Más agentes que inhiben o si no ocultan la acción de las eotaxinas son los que cambian la estructura de una eotaxina de modo que ya no es capaz de unirse a un receptor de eotaxina, por ejemplo, una enzima u otro agente que degrade especificadamente eotaxina.

La promiscuidad del receptor es frecuente entre las quimiocinas, de modo que aunque es esencial que un receptor sea capaz de unirse a una eotaxina, el receptor no necesita necesariamente ser específico para la eotaxina. Por ejemplo, un receptor puede unirse a MIP-1a, RANTES y/o otras quimiocinas atrayentes de eosinófilo así como una eotaxina.

Como se indicó anteriormente, las posibilidades para la intervención terapéutica incluyen la utilización de un receptor al que se une una eotaxina, especialmente un receptor soluble. Puede presentar ventajas el utilizar un receptor específico para eotaxina. Otras posibilidades de intervención terapéutica incluyen los antagonistas del receptor, por ejemplo, basados en las estructuras tridimensionales o en las secuencias de aminoácidos de las eotaxinas y/o de los receptores de eotaxina, y los agentes descubiertos para inhibir la eotaxina u otros agonistas que se unen a receptores de eotaxina o los activan. Por ejemplo, un antagonista del receptor o un inhibidor del agonista puede ser

un polipéptido en el que se ha modificado la secuencia completa de una eotaxina natural, por ejemplo, mediante sustitución de aminoácidos, o puede ser un fragmento de una eotaxina (es decir, un polipéptido o péptido pequeño que comprenda parte de la secuencia de aminoácidos de una eotaxina natural) o un fragmento modificado de una eotaxina, por ejemplo, modificado por sustitución de aminoácidos.

Además, el conocimiento de la secuencia y/o de la estructura de las eotaxinas ya sea solo o en combinación con el conocimiento de la secuencia y/o estructura de otras quimiocinas que se unen a el/los mismo(s) receptor(es) como eotaxinas, proporciona información útil para el diseño de agentes terapéuticos.

Pueden utilizarse agentes que impiden o inhiben la síntesis o liberación de eotaxina también terapéuticamente. Dichos agentes y su utilización se describen también en la presente memoria.

Todos los inhibidores de actividad de, síntesis y liberación de eotaxina, incluyendo los receptores solubles, anticuerpos, antagonistas e inhibidores de la unión del agonista y su utilización se describen en la presente memoria.

Se describe por consiguiente un agente que inhibe o si no oculta la producción, liberación o acción de una eotaxina, especialmente un agente descrito anteriormente, para su utilización como medicamento. Aunque no forme parte de la invención, también se proporciona también la utilización de un agente que inhibe u oculta la producción, liberación

o acción de una eotaxina, especialmente un agente descrito anteriormente, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del asma o de otra enfermedad que tenga un componente inflamatorio, particularmente con acumulación de eosinófilos, por ejemplo, rinitis o eccema, especialmente eccema alérgico.

La utilización de la información estructural y de la secuencia en relación con las eotaxinas en el diseño de agentes terapéuticos y de diagnóstico útiles, por ejemplo, en un diseño por ordenador basado en la estructura tridimensional de las eotaxinas forma parte de la presente invención.

Los supuestos inhibidores de actividad de eotaxina pueden identificarse utilizando ensayos in vivo e in vitro basados en la inhibición de la acción quimiotáctica y/o acumulación y/o activación de los eosinófilos por las eotaxinas. Se conocen algunos métodos generales para la determinación de la actividad de un compuesto para un efecto inhibidor en la actividad de una citocina quimioatrayente in vitro. Dichos ensayos pueden utilizarse para determinar la acción inhibidora de un supuesto inhibidor o de los efecto in vitro producidos en los eosinófilos por las eotaxinas.

Los análisis que son adecuados para identificar supuestos inhibidores de eotaxina incluyen, por ejemplo, la inhibición in vitro de la elevación de las concentraciones de calcio intracelular producidas en las células por la eotaxina. El método para determinar la capacidad de una sustancia para producir acumulación de eosinófilos in vivo, es decir, un método para analizar las supuestas eotaxinas, puede utilizarse también para determinar la capacidad de una sustancia para inhibir la acumulación de eosinófilos producida in vivo por una eotaxina: se pretrata un animal con eosinófilos marcados, se administra una eotaxina y un supuesto inhibidor, y se determinan posteriormente el número de eosinófilos marcados en una zona de la piel. La eotaxina se administra generalmente por vía intradérmica, y el supuesto inhibidor puede administrarse por la misma vía o por una vía diferente, por ejemplo de forma general.

En la presente memoria se describen ejemplos de análisis in vitro e in vivo para la determinación de la actividad de la eotaxina y para la determinación de la actividad inhibidora de la eotaxina. Por ejemplo, el Ejemplo 1 proporciona un protocolo detallado para el análisis in vivo de la presente invención, y el Ejemplo 4 proporciona protocolos detallados de varios análisis. Los análisis descritos en la presente memoria pueden utilizarse como tal, o pueden modificarse según se requiera. Los análisis pueden utilizarse solos o en combinación para demostrar la actividad de eotaxina e inhibidora de eotaxina. Los supuestos inhibidores pueden ser cualquiera de los tipos de las moléculas descritas anteriormente, incluyendo receptores, por ejemplo, receptores solubles, anticuerpos y antagonistas e inhibidores de la unión del agonista. Asimismo, se proporcionan métodos para el análisis de supuestos inhibidores de eotaxinas.

Con mayor detalle según la presente invención se proporciona un método de análisis del efecto inhibidor de un compuesto sobre la actividad de una citocina quimioatrayente in vitro, caracterizado porque la citocina quimioatrayente es una proteína quimioatrayente reivindicada en la invención.

La presente memoria describe asimismo una preparación farmacéutica que comprende, como principio activo, un agente que inhibe o si no oculta la producción, liberación o acción de una eotaxina, mezclada o junto con un portador farmacéuticamente adecuado. Dichos agentes están descritos anteriormente e incluyen, por ejemplo, un inhibidor de la síntesis o liberación de eotaxina, un receptor de eotaxina soluble, un antagonista receptor de eotaxina o un inhibidor de un agonista receptor de eotaxina, un anticuerpo contra eotaxina o un anticuerpo contra un receptor de eotaxina.

La presente memoria describe asimismo un método para el tratamiento del asma y de otras enfermedades inflamatorias, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un agente que inhibe o si no oculta la producción, liberación o actuación de una eotaxina. El agente puede ser tal como el descrito anteriormente, por ejemplo, un inhibidor de la síntesis o liberación de eotaxina, un receptor de eotaxina soluble, un antagonista receptor de eotaxina o un inhibidor de un agonista receptor de eotaxina o un anticuerpo contra eotaxina o contra un receptor

de eotaxina.

La presente memoria describe asimismo análisis de eotaxinas y de anticuerpos antieotaxina, especialmente inmunoanálisis y en particular los ELISA (ensayo inmunosorbente con enzima ligada). La invención proporciona, por ejemplo, un inmunoanálisis de un antígeno, caracterizado porque el antígeno es una eotaxina de la invención, y también proporciona un inmunoanálisis de un anticuerpo, caracterizado porque el anticuerpo forma un complejo con una proteína quimioatrayente de la invención. La presente memoria describe asimismo análisis de eotaxinas que son análogos a los inmunoanálisis de eotaxinas pero que utilizan un socio de enlace específico distinto de un anticuerpo. En dicho análisis del socio de enlace específico puede utilizarse un receptor de eotaxina en lugar de un anticuerpo antieotaxina.

En un inmunoanálisis, un anticuerpo antieotaxina puede, por ejemplo, recubrir una superficie sólida que permita la captura y por consiguiente la detección de eotaxina. Un anticuerpo antieotaxina puede utilizarse en un análisis para la detección de anticuerpos contra eotaxina, por ejemplo, en un análisis de anticuerpos competitivo. Una eotaxina marcada o un derivado de la misma, por ejemplo, una eotaxina recombinante o un péptido sintético que comprende parte de la secuencia de aminoácidos de una eotaxina puede utilizarse en un análisis de eotaxina con antígeno competitivo o puede utilizarse para recubrir una superficie sólida en un análisis de captura de anticuerpos contra eotaxina. Muchos tipos diferentes de formato de análisis están bien descritos en la bibliografía de la técnica tal como, véase por ejemplo “ELISA and Other Solid Phase Immunoassays, Theoretical and Practical Aspects”, eds. Kemeny

D. M. y Challacombe S. J., John Wiley, 1988. (36). Los análisis que utilizan un receptor de eotaxina en lugar de un anticuerpo antieotaxina pueden realizarse de manera análoga.

Como se mencionó anteriormente, se proporciona un procedimiento para la producción de una eotaxina, que comprende la obtención de fluido de lavado bronqueoalveolar obtenido de un animal humano o no humano sometido a la prueba de provocación con un estímulo provocador, por ejemplo, de un ser humano que padece de asma alérgica o no alérgica, u otra enfermedad pulmonar, o un cobaya sensibilizado con una proteína extraña, y el aislamiento de una fracción que presenta actividad quimiotáctica de eosinófilo. Un método de aislamiento de una fracción que contiene eotaxina de fluido de lavado bronqueoalveolar es el intercambio catiónico sucesivo, la exclusión por tamaño y los sistemas de HPLC en fase inversa. La fracción deseada contiene generalmente un polipéptido que tiene un peso molecular comprendido en el intervalo entre 6 y 16 kDa. La pureza puede verificarse por SDS-PAGE. Si se desea, la autenticidad de la sustancia obtenida puede determinarse por comparación de su secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID nº: 1 o en la SEC. ID nº: 2 (Figura 7 o Figura 8).

Las eotaxinas pueden obtenerse según el procedimiento anterior de otras fuentes, por ejemplo, de los fluidos del lavado broncoalveolar o de cultivos in vitro de macrófagos, linfocitos, neutrófilos, mastocitos, células epiteliales de las vías respiratorias, células de tejido conectivo, células endoteliales vasculares y de los propios eosinófilos.

Alternativamente, una eotaxina completa, o una parte (fragmento) de una eotaxina, por ejemplo, un polipéptido o fragmento de péptido, pueden producirse por síntesis química, por ejemplo, según la técnica de Merryfield. Otro método para producir una eotaxina completa o una parte de la misma es mediante la tecnología del ADN recombinante. Todos los métodos de producción de eotaxina forman parte de la presente invención.

Para producir un polipéptido o un fragmento de polipéptido (o péptido) de eotaxina completa por la tecnología del ADN recombinante, se inserta una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido en un vector de expresión bajo el control de las secuencias de control asociadas. Un polipéptido recombinante puede expresarse a continuación utilizando un sistema de expresión procariótico, por ejemplo en E. coli, o utilizando un sistema de células eucarióticas, en cuyo caso el polipéptido resultante puede estar glucosilado. Dichas técnicas son normalizadas véase, por ejemplo Sambrook, J., Fritisch, E. F. y Maniatis T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (37).

Un ácido nucleico que codifica la totalidad o parte de un polipéptido de eotaxina puede obtenerse cribando un banco preparado a partir de células apropiadas, por ejemplo, células de cobaya o de pulmón humano sometidas a la prueba de provocación con alergeno. El cribado puede realizarse utilizando una sonda que comprende secuencias características de una eotaxina, en especial, las secuencias que distinguen la eotaxina de otras citocinas relacionadas, por ejemplo, RANTES y MIP-1a. Puede ser preferible utilizar una sonda larga, por ejemplo, una sonda que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de eotaxina completo.

Alternativamente, puede utilizarse la secuencia polipeptídica de una eotaxina para diseñar cebadores de oligonucleótido, por ejemplo, cebadores degenerados. Los cebadores pueden comprender, por ejemplo, bases menos específicas en su interacción que las bases naturales, por ejemplo, puede utilizarse inosina. Ejemplos de cebadores son la secuencia transcrita

5’ TGC TGT TTC CGI GTI ACI AAC AAA(SEC. ID nº: 3)

basada en la secuencia CCFRVTNK de aminoácidos y la secuencia antitranscrita

5’ CAT CTT GTC IGG CTT IAT TTC(SEC. ID nº: 4)

basada en la secuencia de aminoácidos EIKPDKM. Dichos cebadores pueden utilizarse para la ampliación del ARNm transcrito complementario mediante la reacción en cadena de polimerasa. Esto proporciona sondas de ADNc para el cribado de bancos, por ejemplo, como se describió anteriormente, para aislar clones de eotaxina completa. Los cebadores pueden incluir codones seleccionados basándose en la preferencia por especies conocidas.

Como se indicó anteriormente, los derivados de eotaxinas naturales forman parte también de la presente invención. Dichos derivados incluyen polipéptidos que presentan una o más de las modificaciones siguientes en relación con una eotaxina natural:

(i)

alargamiento o acortamiento del terminal C;

(ii)

alargamiento o acortamiento del terminal N;

(iii) deleción y/o inserción de secuencias internas;

(iv)

sustituciones de aminoácidos, por ejemplo en el terminal C y/o N; y

(v)

un modelo diferente de glucosilación. (Existe, por ejemplo, un punto potencial de O-glucosilación en el resto 70).

Dichos derivados pueden operar como agonistas en estudios de la relación estructura/actividad o como antagonistas del receptor.

Los anticuerpos antieotaxina y los anticuerpos del receptor antieotaxina tanto policlonales como monoclonales, puede producirse según técnicas normalizadas, por ejemplo, Kohler y Milstein (38). Puede utilizarse una eotaxina completa como antígeno, o puede preferirse utilizar un fragmento de una eotaxina para producir un anticuerpo contra un determinante antigénico específico. Puede utilizarse una eotaxina natural como antígeno. Alternativamente, puede utilizarse una eotaxina recombinante o sintética o un polipéptido o péptido de eotaxina. Por lo tanto, según otro aspecto aún de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la preparación de un anticuerpo según la invención que comprende la utilización de una proteína quimiotáctica según la invención.

Las Figuras 1 a 18 de los dibujos adjuntos ilustran la presente invención. A continuación proporciona una breve descripción de las Figuras. Una descripción más detallada de las Figuras se proporciona a continuación y en el apartado Ejemplos de la presente memoria.

Figura 1: Protocolo para la generación y ensayo de actividad quimioatrayente de eosinófilos in vivo.

Figura 2: Generación de actividad quimioatrayente de eosinófilos en los pulmones de cobayas sensibilizados tras la prueba de provocación con antígeno a lo largo del tiempo.

Las Figuras 3, 4 y 5 se refieren todas a la purificación de la eotaxina procedente de los fluidos del lavado brocoalveolar (BAL):

Figura 3: Perfil de HPLC en fase inversa final que presenta la absorbancia a 214 nm y el gradiente de acetonitrilo.

Figura 4: Medición de la actividad quimioatrayente de 111In-eosinófilo de las fracciones obtenidas en la cromatografía HPLC.

Figura 5: Medición de la actividad quimioatrayente con 111In-neutrófilo; falta de actividad significativa observada.

Figura 6: Análisis SDS-PAGE de las fracciones 50 a 56 por HPLC en fase inversa con C18.

Figuras 7 y 8: Secuencias de aminoácidos de una eotaxina aislada de cobaya.

Figura 9: Comparación de la secuencia de eotaxina de la Figura 7 con MCP-1, MCP-2, MCP-3 humano (21), MCP-1 de cobaya (24), MIP-1a, MIP-1 y RANTES (18) humanas que presentan restos conservados (sombreadas).

Figura 10: Comparación de la acumulación de eosinófilos con 111In in vivo utilizando eotaxina de cobaya y proteínas RANTES, MIP-1a y MCP-1 recombinantes humanas.

Figura 11 (recuadro): Inhibición de la fijación de 125I-RANTES a eosinófilos de cobaya producidos in vitro por eotaxina y RANTES pero no por un miembro IL-8 del ramal C-X-C de quimiocinas.

Las Figuras 12, 13 y 14 ilustran el potencial de bloqueo de la respuesta a la eotaxina de cobaya. Éstas hacen uso del hecho de que RANTES humano, mientras compite con eotaxina por las zonas de fijación, no activa los eosinófilos de cobaya.

Figura 12: Elevación de las concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos humanos in vitro producida por eotaxina, RANTES y a alta concentración solamente, MCP-1.

Figura 13: Elevación de las concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos de cobaya in vitro producida por eotaxina, pero no por RANTES ni por MCP-1 humanas.

Figura 14: Vestigios representativos que muestran la inhibición de la elevación producida por eotaxina de cobaya de las concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos de cobaya in vitro por la exposición previa de las mismas células a RANTES humana.

Figura 15 (recuadro): Valores (media±SEM) para cuatro preparaciones de eosinófilos por separado.

Figura 16: Curva de respuesta a la dosis que muestra la inhibición de la elevación producida por eotaxina de cobaya de las concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos de cobaya in vitro por la exposición previa de las mismas células a RANTES humana.

Figura 17: Histograma que presenta la comparación de la respuesta in vivo de eosinófilos de cobaya a la eotaxina, RANTES y RANTES más eotaxina inyectada conjuntamente por vía intradérmica.

Figura 18: Histograma que presenta el número de eosinófilos y de neutrófilos en el fluido de lavado broncoalveolar (BAL) después de la administración de eotaxina de cobaya como aerosol a las vías respiratorias del cobaya.

Como en los pacientes asmáticos alérgicos, la exposición de cobayas sensibilizados a antígeno aerosolizado produce una fase inmediata de broncoconstricción con desgranulación de mastocitos asociada seguida, en algunos individuos, de una fase tardía de broncoconstricción e hipersensibilidad en las vías respiratorias (4-7). Aunque de manera clara ningún modelo simula todas las propiedades de la enfermedad humana, el modelo de cobaya comparte características comunes con la respuesta asmática en el hombre que se ha utilizado ampliamente para investigar los posibles mecanismos (7). En especial, tanto en el cobaya como en el hombre, la respuesta inmediata al alérgeno activa la acumulación posterior en los pulmones de gran número de eosinófilos. Se diseñaron experimentos para detectar el aspecto en el pulmón de quimioatrayentes que pueden ser responsables de la acumulación de eosinófilos. Se empleó una estrategia que se había aplicado anteriormente a la identificación de quimioatrayentes neutrófilos en exudados inflamatorios (8-10).

Se sensibilizaron cobayas con ovoalbúmina intraperitoneal el día 1 seguido de una corta exposición de sus pulmones a la ovoalbúmina aerosolizada el día 8. Los días 15 a 21 los animales se sometieron a la prueba de provocación con ovoalbúmina aerosolizada y se sacrificaron a diferentes intervalos utilizando una sobredosis de barbitúrico. Inmediatamente después de la muerte se lavaron las vías respiratorias con solución salina. El fluido de lavado broncoalveolar (BAL) se centrifugó para separar las células, y los sobrenadantes se almacenaron a -20ºC para análisis o se sometieron a purificación. La actividad quimioatrayente de eosinófilos en muestras de fluido BAL o fracciones de HPLC se ensayó inyectándoles por vía intradérmica en el ensayo de cobayas administrados previamente con inyecciones intravenosas de eosinófilos con 111In (11, 12). Después de un intervalo de 2 ó 4 h, los animales de ensayo se sacrificaron y se punzaron las zonas de la piel donde se hizo el recuento con un contador gamma (Figura 1).

La Figura 2 presenta el aspecto de la actividad quimioatrayente de eosinófilos en el fluido BAL a lo largo del tiempo. Se observó actividad significativa 30 min después de la prueba de provocación con antígeno. La actividad aumentó hasta 3 h, permaneció elevada a las 6 h, pero no fue significativa en las muestras de 24 h. Las muestras de referencia (fluido BAL de cobayas pseudosensibilizados o sometidos a prueba de provocación o sensibilizados o pseudosometidos a prueba de provocación) tomadas a las 3 h no presentaban actividad significativa.

La actividad quimioatrayente de eosinófilos, que se denominó eotaxina, se purificó a partir de fluido BAL de 3 h por intercambio catiónico sucesivo, exclusión por tamaño y HPLC en fase inversa utilizando el ensayo de acumulación de eosinófilos con 111In in vivo para medir la actividad de las fracciones completamente. La eotaxina eluyó como un pico discreto aislado de bioactividad tanto del intercambio catiónico como en las etapas de exclusión por tamaño, lo que indica una proteína fuertemente catiónica de 7 a 14 kDa. La cromatografía en fase inversa separó la actividad quimioatrayente de eosinófilos en dos picos (fracciones 51+52 y fracción 54), que estaban asociados a picos discretos de absorbancia de proteínas (Figuras 3 y 4). La selectividad por los eosinófilos se mostró por la falta de actividad quimioatrayente neutrófila significativa en estas fracciones medida por la acumulación de neutrófilos con 111In en el ensayo de la piel (Figura 5). El examen histológico de la piel inyectada con eotaxina (2 pmoles) demostró la acumulación de eosinófilos a las 4 y 24 h, especialmente alrededor de los vasos sanguíneos pequeños (cepas de

hematoxilina y eosina).

El análisis SDS-PAGE puso de manifiesto una sola banda de proteína en cada una de las fracciones 51, 52 y 54 (Figura 6). La proteína en las fracciones 51 y 52 fue ligeramente mayor que la de la fracción 54. Esto se confirmó por análisis de masas en los que las señales principales fueron aproximadamente 8,81 y 8,38 kDa respectivamente (véase el Ejemplo 3). El secuenciado N-terminal de las fracciones 51, 52 y 54 puso de manifiesto secuencias idénticas de aminoácidos (véase la Figura 7). La secuencia del resto 37 N-terminal de eotaxina expuesta en la SEC. ID nº: 1 y la Figura 7 presenta el 57% de homología con la proteína quimiotáctica de monocitos humanos (MCP-1 (13), conocida de otro modo como MCAF (14) y JE (15)). Los péptidos trípticos de la fracción 54 se secuenciaron también y se alinearon fácilmente por comparación con la MCP-1 humana para proporcionar la secuencia prácticamente completa de eotaxina con una homología global del 53%, véase la Figura 7. Es probable que las variaciones en la masa molecular reflejen la glucosilación diferencial ya que las cuatro señales de masa obtenidas (dos mayores y dos menores, véase el Ejemplo 3) son todas diferentes entre sí por múltiplos de aproximadamente 220 unidades de masa. La secuencia no contiene puntos de N-glucosilación, pero se ha identificado un punto potencial de O-glucosilación en la posición 70 (véase el Ejemplo 3). MCP-1 humana también presenta homogeneidad en SDS-PAGE debido a las diferencias en la modificación del carbohidrato ligado al O (16).

La superfamilia del factor 4 de plaquetas de las citocinas quimioatrayente, o quimiocinas, se caracteriza por cuatro cisteínas conservadas. La posición relativas de las dos cisteínas N-terminales permite la subdivisión de esta superfamilia en las quimiocinas de C-X-C (p. ej. IL-8 (17)) que son predominantemente quimioatrayente neutrófilos y las quimiocinas con C-C (p. ej. MCP-1, RANTES, MIP-1a y MIP-1 (18)) que son quimiotácticas para otros leucocitos aparte de los neutrófilos. Eotaxina es un miembro del ramal C-C de las quimiocinas. La mayor homología (53%) es con MCP-1 humana que, en los estudios limitados in vitro hasta la fecha, se ha descrito que es inactiva en eosinófilos humanos (19, 20) y con la MCP-2 humana descrita recientemente (54%) y MCP-3 (51% de homología calculada sobre la base de la SEC. ID nº: 1 (Figura 7); 54% de homología cuando se calcula basándose en las secuencias de solapamiento) (21). La homología con otras quimiocinas humanas con C-C (Figura 9) es: MIP-1 (37% calculado basándose en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7); 39% cuando se calcula basándose en las secuencias de solapamiento), MIP-1a (31% calculado basándose en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7); 32% cuando se calcula basándose en las secuencias de solapamiento) y RANTES (26% calculado basándose en la SEC. ID nº: 1 (Figura 7); 27% cuando se calcula basándose en la secuencia de solapamiento). Se ha demostrado recientemente que las dos proteínas últimas son potentes activadores eosinófilos in vitro (20, 22) mientras que MIP-1 activa los linfocitos in vitro (23) pero aparentemente no los eosinófilos (20). La eotaxina presenta la homología estructural mayor con MCP1, MCP-2 y MCP-3 humanas. La eotaxina presenta similitudes funcionales, pero relativamente poca homología, cuando se compara con RANTES y MIP-1a. La eotaxina es claramente una molécula distinta de MCP-1 de cobaya; esta última se ha clonado recientemente (24) y presenta solamente un 43% de homología con la secuencia de eotaxina, véase la Figura 9. MCP-1 de cobaya se demostró que era quimiotáctica para los monocitos pero no se demostró en eosinófilos (24). Es interesante que la eotaxina tiene un 41% de homología con una proteína con C-C cuyo gen se expresa en mastocitos de ratón y se regula por incremento 2 h después de la interacción entre IgE y el antígeno (25). No se ha descrito ninguna actividad funcional para esta proteína pero es distinta (51% de homología) de la MCP-1/JE de ratón (25).

La eotaxina del cobaya fue muy potente para producir la acumulación de eosinófilos in vivo: 1-2 pmoles/punto de piel proporcionando una respuesta de 730±140% (media ± s.e.m., n=18 animales) en comparación con los puntos inyectados con solución salina. Además, la acumulación notable de eosinófilos se observó a los 30 minutos de inyección intradérmica (Figura 10). Esto está apoyado en experimentos in vitro. El efecto de la eotaxina en los eosinófilos in vitro se observó por (i) inhibición de la fijación de 125I-RANTES a células de cobaya (Figura 11), (ii) elevación del calcio citoplasmático en células humanas y de cobaya (Figuras 12 y 13) y (iii) quimiotaxia de eosinófilos humanos en un sistema con cámara Boyden: las respuestas quimiotácticas a la eotaxina y RANTES fueron de magnitud similar en todo el intervalo entre 0,1 y 3,0 nm. A diferencia de la eotaxina, MCP-1 recombinante humana y RANTES no produjeron respuestas de eosinófilos de cobaya in vitro o in vivo (Figuras 10 y 13). Esto puede reflejar una diferencia de la especie aunque RANTES no se unió a los eosinófilos de cobaya sin producir activación (Figura 11, recuadro en Figura 10). La eotaxina tiene una potencia similar a RANTES en los eosinófilos humanos mientras que MCP-1 es inactiva (20) o activa solamente a grandes dosis (Figura 12). Por lo tanto, la eotaxina tiene un potente efecto directo tanto en eosinófilos humanos como de cobaya.

RANTES humana puede inhibir in vitro e in vivo las respuestas de los eosinófilos de cobaya a la eotaxina de cobaya. Las Figuras 14, 15 y 16 presentan la respuesta de eosinófilos de cobaya cargados con FURA-2 a la eotaxina de cobaya antes y después de la adición de RANTES humana. El aumento producido por la eotaxina en la concentración del calcio intracelular se reduce en un grado sustancial cuando las células se exponen en primer lugar a RANTES humana, que no puede producir una respuesta. La Figura 17 demuestra que RANTES humana, cuando se inyecta conjuntamente con la eotaxina, reduce la acumulación de eosinófilos de cobaya producidos por la eotaxina en la piel de cobaya in vivo. Los resultados apoyan las observaciones de los inventores de que la eotaxina presenta unión competitiva con RANTES humana radiomarcada en eosinófilos de cobaya y que la eotaxina es un potente estimulante operativo mientras que RANTES no lo es. Por consiguiente, RANTES parece actuar como antagonista receptor para eotaxina en eosinófilos de cobaya.

La Figura 18 demuestra que los eosinófilos se acumulan en la vías respiratorias del cobaya in vivo dentro de las 24 horas de la administración de la eotaxina aerosolizada de cobaya, mientras que sustancialmente no se observa acumulación de neutrófilos.

Los Ejemplos siguientes ilustran la presente invención.

Ejemplo 1

Producción y análisis del fluido de lavado broncoalveolar

MÉTODOS: Se sensibilizaron cobayas Dunkin Hartley macho (300 a 400 g) con ovoalbúmina intraperitoneal (OA, 1 mg) el día 1 seguido de exposición a antígeno aerosolizado (OA al 2% durante 5 min utilizando un nebulizador ultrasónico) el día 8 (6). Los días 15 al 21, se pretrataron los animales con una antihistamina para impedir la muerte aguda por accidente (pirilamina, 10 mg kg-1, i.p.) y se sometieron a la prueba de provocación por exposición a antígeno aerosolizado (OA al 1% durante 20 min). En diferentes momentos después de la prueba de provocación con antígeno se trataron los animales con atropina (0,06 mg kg-1, i.p.) para impedir la broncoconstricción y se sacrificaron con una sobredosis de barbitúrico. Se realizó el lavado broncoalveolar con 4 ml de solución salina. Las muestras se centrifugaron para separar las células y el sobrenadante se almacenó a -20ºC antes del análisis. Las muestras de BAL se analizaron mediante inyección intradérmica (0,1 ml) en cobayas a los que se administraron previamente inyecciones intravenosas de 5×106 eosinófilos con 111In (producidos en animales donantes mediante inyecciones intraperitoneales repetidas de suero de caballo y purificados en gradientes de Percoll discontinuos, >94% de pureza) (11, 12). Después de 4 horas, los animales del ensayo se sacrificaron y se punzaron puntos de la piel para el recuento gamma. Los datos se presentan como media ± s. e. m. y se analizaron mediante análisis de varianza de una vía. Un valor p de <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

RESULTADOS: La Figura 1 presenta, esquemáticamente procedimientos para la generación y medición de la actividad quimioatrayente de eosinófilos in vivo. La Figura 2 ilustra la generación de actividad quimioatrayente de eosinófilos a lo largo del tiempo en pulmones de cobayas sensibilizados después de la prueba de provocación con antígeno (cuadrados negros, n=4-10). Se midió la actividad en un ensayo in vivo en la piel de la acumulación de eosinófilos con 111In en cobayas no sensibilizados (3 animales de ensayo por muestra de BAL). Se observó actividad significativa en las muestras de lavado broncoalveolar tomadas 0,5, 1,5, 3 y 6 h después de la prueba de provocación con antígeno (comparadas con las respuestas a la solución salina intradérmica, mostradas como línea de puntos). No se observó actividad significativa en las muestras de 24 h. No se observó actividad en las muestras de lavado obtenidas 3 h después de la pseudoprueba de provocación (solución salina) de animales sensibilizados (círculos negros, n=5) o de la prueba de provocación con antígeno de pseudoanimales sensibilizados (solución salina) (rombos negros, n=5).

Ejemplo 2

Purificación de eotaxina en fluidos de lavado broncoalveolar

MÉTODOS: Se recogió fluido de lavado broncoalveolar (BAL) de 25 cobayas sensibilizados (cada lavado con 4 ml, seguido de 2×10 ml de solución salina) 3 h después de la prueba de provocación con antígeno (OA al 1%, exposición de 5 min) se aplicó a una columna HPLC de intercambio catiónico (Ultropac TSK535CM, 7,5×150 mm). Se eluyó la actividad en acetato amónico aprox. 1,4 M, pH 5,5, y se liofilizó para HPLC por exclusión de tamaño (columnas SWP Ultropac TSK, 7,5×75 mm, G4000SW, 7,5×600 mm y G2000SW, 7,5×600 mm en serie, equilibrada en TFA al 0,08%). Se eluyó la actividad a aprox. 7 a 14 kDa. Esto se aplicó a una columna HPLC (4×250 mm) en fase inversa Vydac C18 de poro amplio (300 Å) en TFA al 0,08%, se eluyó con un gradiente lineal de acetonitrilo (ACN del 0 al 80% en TFA al 0,08%, durante 80 min, en fracciones de 1 ml min-1) y se recogieron fracciones de 0,5 min. Se liofilizaron alícuotas (4%) de cada fracción en presencia de proteína portadora (BSA, <0,1 ng de endotoxina mg-1) y se redisolvieron en 0,8 ml de solución salina para experimentación en los bioanálisis en piel de acumulación de 111Ineosinófilos y de 111In-neutrófilos durante 2 horas (n=4). Se produjeron eosinófilos (99%, 0,5% de neutrófilos) con inyecciones intraperitoneales repetidas de suero de caballo (11, 12) y neutrófilos (99,4%, 0,6% de eosinófilos) se produjeron con una sola inyección intraperitoneal de caseína (5% p/v, 15 ml) 17 h antes de la purificación en gradientes discontinuos de Percoll y marcado con 111In.

RESULTADOS: Los resultados se presentan en las Figuras 3, 4 y 5. La Figura 3 presenta el perfil de HPLC en fase inversa final mostrando la absorbancia a 214 nm y el gradiente de acetonitrilo. La Figura 4 demuestra que se observó actividad quimioatrayente eosinófila en 2 picos, que corresponden a las fracciones 51+52 y la fracción 54, que corresponde a picos discretos de absorbancia. La Figura 5 demuestra que no se detectó actividad quimioatrayente de neutrófilos significativa en estas fracciones. En cambio, C5a de cobaya des Arg (plasma activado con zymosan al 30% (11), aprox. 10 pmoles/punto) produjo la acumulación tanto de 111In-eosinófilos (5.211±893) como de 111Inneutrófilos (9.872±473). Las fracciones 50, 53, 55 y 56 proporcionaron poca o ninguna actividad continuamente en los bioanálisis de acumulación de leucocitos en la piel del cobaya. No se detectó absorbancia de proteína significativa en el gradiente restante (hasta el 80% de acetonitrilo).

Ejemplo 3

Pureza, análisis de masas y secuencia proteica de eotaxina

MÉTODOS: Se liofilizaron 2% de alícuotas de cada fracción, se redisolvieron en 10 µl de tampón SDS, se calentaron (95ºC, 5 min.) y se introdujeron 0,3 µl en gles de gradiente de 8 a 25% en un Pharmacia Phast System. Se observaron los geles con tinción de plata. Se realizó el análisis de masas en las fracciones 51, 52 y 54 utilizando un Finningan MAT Lasermat con matrices de ácido a-ciano-4-hidroxicinnámico y ácido sinapínico. Se calibraron las mediciones de masas internamente utilizando patrones de proteína. Se aplicaron 5% de alícuotas de cada fracción bioactiva (51, 52 y 54) directamente al análisis de la secuencia N-terminal automática utilizando ciclos rápidos en un Applied Biosystems 477A que contenían un microcartucho esencialmente como se describe (32). Se obtuvieron los residuos aminoterminales 37, 35 y 29 para las fracciones 51, 52 y 54 respectivamente. No se encontraron diferencias entre las posiciones correspondientes. Los campos iniciales visibles de estos tres análisis fueron todos aproximadamente de 7 a 8 pmoles. Por lo tanto las fracciones 51, 52 y 54 contenían aprox. 200 pmoles cada una, suponiendo el 70 al 80% de campos de secuenciado. Se observaron huecos en las posiciones 8, 9 y 33, correspondientes a la presencia de restos de cisteína en estas posiciones. Se redujeron aproximadamente 30 pmoles de la fracción 54 y se alquilaron por tratamiento sucesivo con ditiotreitol 1 mM durante 5 min a 50ºC y a continuación acrilamida 10 mM durante 30 min a 37ºC antes de la digestión con tripsina alquilada (Promega) en Tris/HCl 20 mM, pH 8,8, que contenía 0,5% de Thesit. Se separaron los péptidos utilizando una columna Reliasil C18(300 Å, 5 µm) (1×150 mm) desarrollada con un gradiente lineal de concentración de acetonitrilo en ácido trifluoroacético al 0,08% en 50 µl/min o un sistema HPLC de Microm. Se sometieron los péptidos purificados a análisis de la secuencia N-terminal como anteriormente, pero los cuatro restos de cisteína se identificaron positivamente como derivado PTH-cys-S--propionamida (33). La posición 70 no dio derivado de PTH en los péptidos T6 y T7 y es una posición probable de O-glucosilación.

RESULTADOS: En las Figuras 6, 7, 8 y 9 se presentan los resultados. La Figura 6 es una fotografía del gel de SDS-PAGE. Como referencia, se introdujo IL-8 humana (72 aminoácidos, aprox. 8 kDa) en las bandas A, B y C (12, 2,4 y 0,5 ng/0,3 µl/banda respectivamente). La duración de la desorción con láser del análisis de masas por tramos proporcionó señales a 8,81 kDa (mayor) y a 9,03 kDa (menor) para cada una de las fracciones 51 y 52. La fracción 54 proporcionó señales a 8,38 kDa (mayor) y a 8,15 kDa (menor).

Las Figuras 7 y la SEC. ID nº: 1 presentan la secuencia de aminoácidos de eotaxina, que se determinó secuenciando la molécula íntegra así como los péptidos procedentes de la digestión con tripsina (T). El análisis N-terminal presentó la homología mayor con MCP-1 humana (57%) y los péptidos trípticos se alinearon fácilmente por comparación con la secuencia de MCP-1 humana. La Figura 8 presenta la secuencia de aminoácidos confirmada por secuenciado del ácido nucleico. La Figura 9 es una comparación de la secuencia de eotaxina con MCP-1, MCP-2, MCP-3 humanas (21), MCP-1 de cobaya (24), MIP-1a, MIP-1 y RANTES humanas (18) que presentan restos conservados (sombreados).

Ejemplo 4

Experimentación in vitro e in vivo de eotaxina

MÉTODOS:

(i)

Eotaxina era un grupo de ambos picos de bioactividad (fracciones 51+52 y fracción 54) de la separación por HPLC en fase inversa final descrita en el Ejemplo 2 (véase Figuras 3, 4 y 5). La acumulación de 111Ineosinófilos en la piel de cobaya se midió durante 4 h como se describe en el Ejemplo 1 (véase Figuras 1 y 2). En los mismos animales (n=4) se inyectó eotaxina en puntos adicionales 30 minutos antes del sacrificio.

(ii)

Durante los estudios de fijación, se incubaron 4×105 eosinófilos con 125I-RANTES 0,1 nM y varias concentraciones de ligando frío (50 µl a 0ºC durante 2 h). La solución salina tamponada de Hank contenía HEPES 30 mM, EDTA 10 mM; azida sódica al 0,1% y BSA al 1% a pH 7,5. Los resultados son la media de dos análisis cada uno realizado por triplicado.

(iii) Para la medición de las concentraciones de calcio intracelular se cargaron eosinófilos humanos y de cobaya (107 células/ml en PBS exento de Ca2+/Mg2++BSA al 0,1%) con éster fura-2-acetoximetílico (2,5 µl, 30 min a 37ºC). Después de dos lavados las células se volvieron a poner en suspensión a razón de 106 células/ml en PBS exento de Ca2+/Mg2+ que contenía HEPES 10 mM, BSA al 0,25% y glucosa 10 mM (pH 7,4). Las alícuotas se dispensaron en cubetas de cuarzo y se ajustó el [Ca2+] externo a 1 mM con CaCl2. Se controlaron los cambios de fluorescencia a 37ºC utilizando un espectrofotómetro Perkin Elmer LS50 a longitudes de onda de excitación de 340 nm en 380 nm y longitud de onda de emisión de 510 nm. Se calcularon las concentraciones de [Ca2+]i tal como se describió anteriormente (34) utilizando la relación de las dos lecturas de fluorescencia y una Kd para la fijación de Ca2+ a 37ºC de 224 nM. Se prepararon eosinófilos periféricos humanos tal como se describió anteriormente (35) por centrifugación por densidad en Percoll seguido de eliminación inmunomagnética de neutrófilos CD16+ utilizando el sistema MACS. Se prepararon eosinófilos de

cobaya tal como se describió en el Ejemplo 1 (11, 12).

(iv)

Para probar la supresión de la acumulación eosinófila in vivo utilizando RANTES humana, se midió la acumulación de eosinófilos de cobaya marcados con 111I en los puntos de la piel tal como se describió anteriormente. Se inyectaron cobayas con 1,8 pmoles de eotaxina (n=2), 100 pmoles de RANTES (n=1) o con 1,8 pmoles de eotaxina de 100 pmoles de RANTES (n=2). Se utilizó como referencia solución salina intradérmica.

(v)

Para probar la actividad antagonista del receptor, se estimularon eosinófilos de cobaya cargados con éster fura-2-acetoximetílico con eotaxina 3 nM con o sin pretratamiento con RANTES humana.

(vi)

Para investigar el efecto de la exposición al aerosol de cobayas a la eotaxina, se expusieron cobayas naturales a un aerosol de eotaxina o un medio de referencia (n=8 por grupo). Se realizó la exposición colocando dos animales en una cámara aislada y nebulizando 24 pmoles de eotaxina disuelta en 100 ml de PBS que contenía proteína portadora BSA a razón de 80 µg/m durante un periodo de 35 a 40 minutos. Los animales de referencia recibieron PBS/BSA aerosolizado de la misma manera. Se sacrificaron los animales 20 horas después de la exposición a eotaxina o al medio de referencia. Se recuperó el fluido BAL (5×10 ml de HBSS, EDTA 10 mM, pH 7,35) y se centrifugó (300 g, 20 min, 4ºC). El recuento de células BAL totales se determinó con hemocitómetro y se realizaron recuentos de células diferenciadas en preparaciones coloreadas con citospina (DiffQuick) (3 por animal, 400 recuentos de células por portaobjetos).

RESULTADOS: Los resultados se presentan en las Figuras 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.

La Figura 10 demuestra que la eotaxina de cobaya (1,6 pmoles) produce acumulación significativa de 111Ineosinófilos in vivo 30 min (cuadros blancos, p<0,01) y 4 h (cuadros negros, p<0,01) tras la inyección intradérmica. En cambio, las proteínas recombinantes humanas, RANTES, MIP-1a y MCP-1 a dosis hasta de 100 pmoles, no tuvieron efecto durante 4 horas. El recuadro de la Figura 11 demuestra que eotaxina y RANTES, pero no la IL-8 de la quimiocina IL-8 C-X-C, inhiben la fijación de 125I-RANTES (B0=14,4%) en eosinófilos de cobaya in vitro. La Figura 17 demuestra que (a) RANTES humano no produce acumulación significativa de eosinófilos y (b) que RANTES humana inhibe hasta un grado sustancial la acumulación eosinófila producida por eotaxina, lo que sugiere que RANTES actúa como antagonista receptor para la eotaxina in vivo.

La Figura 12 demuestra que eotaxina, RANTES y, a concentración elevada solamente, MCP-1 producen la elevación de concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos humanos in vitro. Existen vestigios con eosinófilos procedentes de un donante. En otros dos donantes eotaxina 2 nM produjo una elevación de calcio media de 61 nM. En los tres donantes (97,3±1,2% de eosinófilos) las respuestas a RANTES 10 nM fueron [Ca2+]i 194±74 nM y las respuestas a MCP-1 100 nM fueron [Ca2+]i 93±38 nM.

La Figura 13 demuestra que eotaxina de cobaya, pero no RANTES o MCP-1 humanas, eleva las concentraciones de calcio intracelular en eosinófilos de cobaya in vitro. Existen vestigios con células procedentes de un donante. En tres donantes (97,5±0,8% de eosinófilos) las respuestas fueron: eotaxina 2 nM, [Ca2+]i 90±13 nM; RANTES 100 nM, [Ca2+]i 2,0±1,7 nM; MCP-1 100 nM, [Ca2+]i 3,3±0,7 nM.

La Figura 14 y el recuadro de la Figura 15 demuestran que el tratamiento anterior de eosinófilos de cobaya con RANTES (100 nM) inhibe el aumento de las concentraciones de calcio libre intracelular observadas cuando se tratan eosinófilos con eotaxina (3 nM) sola. RANTES parece ser que actúa como antagonista receptor en eosinófilos de cobaya. La Figura 16 es una curva de respuesta a la dosis utilizando eotaxina 3 nM y aumentado las cantidades de RANTES.

La Figura 18 demuestra que la eotaxina de cobaya, administrada en forma de aerosol, produce acumulación eosinófila en las vías respiratorias del cobaya in vivo, mientras que no se observa sustancialmente acumulación de neutrófilos.

Referencias

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38. Kohler & Milstein, Nature 256, 495-497 (1975).

Listado de secuencias

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE: 15

(A)

DENOMINACIÓN: Nacional Hert & Lung Institute

(B)

CALLE: Dovehouse Street

(C)

CIUDAD: Londres

(E)

PAÍS: Inglaterra

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): SW3 6LY (G)TELÉFONO: 071 352 8121

(H)

Telefax: 071 376 3442

(A)

DENOMINACIÓN: Ludwig Institute for Cancer Research 25 (B) CALLE: Hedges House, 153-155 Regent Street

(C)

CIUDAD: Londres

(E)

PAÍS: Inglaterra

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): W1R 7FD (G)TELÉFONO: 071 494 0025

(H)

Telefax: 071 494 1404

(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CITOCINA QUIMIOTÁCTICA

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

(iv)

LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR: 35

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25 (EPO)

(vi) DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9318984

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 14-SEP-1993 45

(vi) DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9408602

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 29-ABR-1994

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

55 (A) LONGITUD: 73 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(C)

CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Cavia porcellus

(D) ETAPA DE DESARROLLO: Adulto 65 (F) TIPO DE TEJIDO: Fluido de lavado broncoalveolar

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

5 (2) INFORMACIÓN RELATIVAS A LA SEC ID nº 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 73 aminoácidos 10 (B) TIPO: aminoácido

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NO 15 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Cavia cobaya

(F)

TIPO DE TEJIDO: Fluido de lavado broncoalveolar 20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

(2)

INFORMACIÓN RELATIVAS A LA SEC ID nº 3: 25

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico30 (C) NÚMERO DE CADENAS: una

(D) CONFIGURACIÓN: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador)

(iii) HIPOTÉTICA: SÍ 35 (iii) CADENA COMPLEMENTARIA: NO

(ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inosina(B) POSICIÓN: 12

5

(ix) CARACTERÍSTICAS: (A) DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inosina(B) POSICIÓN: 15

10

(ix) CARACTERÍSTICAS: (A) DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inosina(C) POSICIÓN: 18

15

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3: TGCTGTTTCC GNGTNACNAA CAAA 24

(2) INFORMACIÓN RELATIVAS A LA SEC ID nº 4:

20

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

25

(A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico(C) NÚMERO DE CADENAS: una(D) CONFIGURACIÓN: lineal

30

(ii) (iii)(iii)(ix) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (cebador) HIPOTÉTICA: SÍ ANTISENTIDO: SÍ CARACTERÍSTICAS:

(A) DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inosina(B) POSICIÓN: 10

35

(ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) DENOMINACIÓN/CLAVE: base_modificada: N es inopina(B) POSICIÓN: 16

40

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

CATCTTGTCN GGCTTNATTT C

21

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Proteína quimioatrayente aislada capaz de atraer eosinófilos y de inducir acumulación eosinófila in vitro e in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto atractivo para los neutrófilos in vivo, que consiste en o que

   5 comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEC. ID nº: 1, o un fragmento de dicha proteína quimioatrayente que conserva sus actividades biológicas.
2. 2. Proteína quimioatrayente según la reivindicación 1, que consiste en o que comprende una secuencia de

   aminoácidos tal como se ha expuesto en la SEC. ID nº: 1. 10
3. 3. Procedimiento para la producción de una proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende el cultivo in vitro de macrófagos, linfocitos, mastocitos, células epiteliales de las vías respiratorias

   o células de tejido conectivo, y el aislamiento de las células o del fluido del cultivo celular de una fracción que

   demuestra actividad quimioatrayente de eosinófilos in vitro e in vivo y que no presenta sustancialmente ningún efecto 15 atractivo para los neutrófilos in vivo.
4. 4. Anticuerpo que se une específicamente a la proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1

   o 2.

   20 5. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
5. 6. Anticuerpo según la reivindicación 4 o 5, para su utilización como medicamento o en diagnóstico.

6. 7.

   Utilización de un anticuerpo según la reivindicación 4 o 5, para la preparación de un medicamento destinado al 25 tratamiento del asma o de otra enfermedad inflamatoria.

7. 8. Utilización según la reivindicación 7, para el tratamiento de la rinitis o del eccema.

8. 9.

   Preparación farmacéutica que comprende, como principio activo, un anticuerpo según la reivindicación 4 o 5, 30 mezclado o junto con un vehículo farmacéuticamente adecuado.

9. 10. Inmunoanálisis para un antígeno, caracterizado porque el antígeno es una proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

   35 11. Inmunoanálisis para un anticuerpo, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo que forma un complejo con una proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
10. 12. Método de ensayo de un compuesto para un efecto inhibidor sobre la actividad de una citocina quimioatrayente in

    vitro, caracterizado porque la citosina quimioatrayente es una proteína quimioatrayente según cualquiera de las 40 reivindicaciones 1 o 2.
11. 13. Procedimiento para la preparación de un anticuerpo según la reivindicación 4 o 5, que comprende la utilización de una proteína quimioatrayente según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.