ES2262601T3 - Inmobilizacion de biomoleculas. - Google Patents
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Abstract
Un sustrato unido a biomolécula que comprende: un soporte sólido hecho de moléculas poliméricas, cada una de las cuales contiene un primer grupo reactivo, estando dicho primer grupo reactivo presente sin modificación de la superficie del soporte sólido; y una pluralidad de biomoléculas, cada una de las cuales contiene un segundo grupo reactivo; en el que uno de los dos grupos reactivos es un grupo de sustitución y el otro es un grupo saliente; y las biomoléculas están unidas covalentemente al soporte sólido mediante una reacción de ligación química entre los dos grupos reactivos.
Description
Inmovilización de biomoléculas.
Los ensayos de diagnóstico y otros
procedimientos químicos requieren frecuentemente conectar una
molécula a un soporte sólido. Por ejemplo, una proteína se conecta
habitualmente a un soporte sólido para un ensayo inmunológico, y un
oligonucleótido a un soporte sólido para un ensayo basado en
hibridación. La conexión se puede conseguir en un número de modos
diferentes, incluyendo unión covalente e interacción no covalente.
De forma típica, la conexión covalente es más robusta. Véase, por
ejemplo, Lamture y col. (1994) Oligonucleotide Research 22:
2121 a 2125; Beattie y col. (1995) Mol. Biotechnol. 4: 213 a
225; Joos y col. (1997) Anal. Biochem 247: 96 a 101; Rogers
y col. (1999) Anal. Biochem. 266: 23 a 30; y Chrisey y col.
(1996) Oligonucleotide Research 24: 3031 a 3039.
Se ha desarrollado un número de protocolos para
conectar de forma covalente un oligonucleótido a una superficie
soporte. Un ejemplo consigue esto, por ejemplo, sintetizando un
oligonucleótido directamente sobre una superficie soporte usando
reacciones fotolitográficas por etapas. Por ejemplo, véanse las
patentes de Estados Unidos números 5.424.186; 5.510.270 y
5.744.305. De forma alternativa, un ácido nucleico, tal como un ADNc
clonado, un producto de PCR (reacción en cadena de la polimeresa),
o un oligonucleótido sintético, se puede depositar sobre una
superficie de un soporte sólido, por ejemplo, un portaobjetos
microscópico, en forma de una red. Normalmente, la superficie se
modifica con el fin de unir covalentemente un ácido nucleico.
El documento EP0390500 describe la
inmovilización de proteínas (por ejemplo, IgG humana) sobre una
superficie de poliestireno modificada con una tercera molécula, es
decir, un compuesto de N-hidroximetilacetamida.
El documento EP0403700 describe ligandos
reactivos (por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas) con gel de
sílice modificados con tercera y cuarta moléculas.
El gel de sílice se modifica en primer lugar con
polietileniminopropiltrimetoxisilano y luego con un compuesto que
tiene un resto reactivo que es capaz de formar uniones covalentes
con ligandos (por ejemplo, glutaraldehído). El documento EP1035218
describe la inmovilización de un oligonucleótido sobre una
superficie modificada con una tercera molécula, es decir, un
polímero que contiene grupos funcionales. Basu y Wickstrom,
Tetrahedron Letters, 3682, 4943 a 4946, 1995, describen la síntesis
de un conjugado ADN-péptido sobre un soporte
amino-HLP modificado con una tercera molécula,
1-(Fmoc-amino)-5-(hidroximetil)-6-(DMT-O)-hexano.
En un aspecto, esta invención se refiere a un
sustrato unido a biomolécula que incluye (1) un soporte sólido
hecho de moléculas poliméricas, cada una de las cuales contiene un
grupo reactivo; y (2) una pluralidad de biomoléculas, cada una de
las cuales contiene otro grupo reactivo. Uno de los dos grupos
reactivos es un grupo saliente y el otro es un grupo de
sustitución, y las biomoléculas se enlazan de forma covalente al
soporte sólido mediante una reacción de ligación química entre los
dos grupos reactivos. En otras palabras, tras la reacción de
ligación química, el grupo saliente se aparta de las biomoléculas o
del soporte sólido, y los puentes del grupo de sustitución, las
biomoléculas y el soporte sólido mediante una unión covalente. Cada
uno de los dos grupos reactivos ya descritos se refiere bien a su
estado de pre- o de post-reacción, dependiendo de
si participa en la reacción. Incluso, en un sustrato unido a
biomolécula de esta invención, no todos los grupos reactivos sobre
el sustrato participan en la reacción de
ligación.
ligación.
Un grupo saliente es el grupo que se separa de
una molécula durante una reacción de ligación química. Este puede
ser, por ejemplo, halógeno. Un grupo de sustitución puede ser bien
un grupo nucleófilo o un grupo electrófilo. Un grupo nucleófilo es
una especie química que tiene electrones en pares no compartidos
(por ejemplo, cualquier ácido de Lewis) y puede ser neutro o tener
una carga negativa. Ejemplos del grupo nucleófilo incluyen un grupo
que contiene oxígeno (por ejemplo, hidroxilo, alcoxi, o aciloxi), un
grupo que contiene azufre (por ejemplo mercapto, alquiltio,
sulfonato o fosforotioato), un grupo que contiene nitrógeno (por
ejemplo, amino, alquilamino, acilamino, nitro, azido o isocianato)
y halógeno. Un grupo electrófilo es una especie química que tiene un
orbital vacante para ocupar por electrones, y puede ser neutro o
tener una carga positiva. Un ejemplo del grupo electrófilo es un
organo-
metálico.
metálico.
Un soporte sólido usado para poner en práctica
esta invención está hecho de al menos un tipo de moléculas
poliméricas distribuidas uniformemente en todo el soporte sólido,
cada una de las cuales contiene un grupo saliente o un grupo de
sustitución. Un soporte sólido puede ser flexible y capaz de
doblarse, plegarse o ser manipulado de otra forma sin romperse.
Este puede ser también rígido y adquirir una configuración deseable,
tal como película, hoja, tubo, disco o esfera. Se puede usar
también un soporte sólido poroso, tal como gel. Se pueden usar
cualquiera de los soportes sólidos ya descritos solos, o en
combinación con cualquier otro soporte (por ejemplo, vidrio) bien
conocido en la técnica. Ejemplos de un soporte sólido para uso en
esta invención incluyen, pero sin limitarse a estos, resina de
poli(cloruro de vinilo) (PVC), resina de
urea-formaldehído, y acrílica. Cuando un soporte
sólido es resina de PVC, el grupo cloruro en el PVC es un grupo
saliente. Una biomolécula que contiene un grupo de sustitución
puede reaccionar con el grupo cloruro, dando lugar a unión
covalente de la biomolécula con la resina de PVC. Cuando un soporte
sólido es resina de urea-formaldehído, el grupo
amino en urea formaldehído es un grupo de sustitución. Una
biomolécula que contiene un grupo saliente puede reaccionar con el
grupo amino, dando lugar a un unión covalente de la biomolécula con
la resina de urea-formaldehído.
Una biomolécula que se va a conectar con el
soporte sólido ya descrito puede ser un biopolímero (por ejemplo,
un oligonucleótido, un péptido, un polisacárido, o una
glicoproteína) o un biomonómero (por ejemplo, un nucleósido, un
aminoácido, o un monosacárido), cualquiera de los cuales puede ser
una molécula de origen natural o un análogo sintético. El término
"oligonucleótido" usado en esta invención se refiere a un ADN
sintético, un ARN sintético, un ADNc, un ARNm, o un ácido nucleico
peptídico. La biomolécula contiene un grupo saliente o un grupo de
sustitución, que, si no está presente de forma natural, se debe
introducir mediante procedimientos químicos o bioquímicos bien
conocidos en la técnica. Pueden localizarse un grupo saliente o un
grupo de sustitución en cualquier posición adecuada de la
biomolécula.
En otro aspecto, esta invención se refiere a un
procedimiento para la preparación del sustrato unido a biomolécula
anteriormente descrito. El procedimiento incluye (1) proporcionar un
soporte sólido hecho de moléculas poliméricas, cada una de las
cuales contiene un grupo saliente (o un grupo de sustitución),
estando dicho grupo presente sin modificación de la superficie del
soporte sólido; y una pluralidad de biomoléculas, cada una de las
cuales contiene un grupo de sustitución (o un grupo saliente); y
(2) enlace de las biomoléculas al soporte sólido mediante una
reacción de ligación química entre los grupos saliente y de
sustitución para formar un sustrato unido a biomolécula.
Una ventaja de esta invención es que la
superficie de un soporte sólido no necesita ser modificada con el
fin de conectar de forma covalente una biomolécula. Otras ventajas,
características y objetos de la invención serán evidentes a partir
de la descripción y de las reivindicaciones.
Los detalles de una o varias realizaciones de la
invención se establecen en la descripción siguiente.
Se puede preparar un sustrato unido a
biomolécula de esta invención mediante unión covalente de una
biomolécula que contiene un grupo de sustitución a un soporte
sólido que contiene un grupo saliente. Por ejemplo, se puede
depositar un oligonucleótido que contiene fosforotioato sobre resina
de PVC. El grupo fosforotioato, un grupo de sustitución, reacciona
con el grupo cloruro, un grupo saliente, en el PVC para formar una
resina de PVC unida a oligonucleótido. Se muestra a continuación un
esquema que ilustra esta reacción de ligación química.
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Se puede preparar también un sustrato unido a
biomolécula de esta invención mediante unión covalente de una
biomolécula que contiene un grupo de sustitución a un soporte
sólido que contiene un grupo de sustitución. Por ejemplo, se puede
depositar un oligonucleótido que contiene yodotimidina sobre resina
urea-formaldehído. El grupo amino, un grupo de
sustitución, en la resina de urea-formaldehído
reacciona con el grupo yodo, un grupo saliente, sobre el
oligonucleótido para producir resina de
urea-formaldehído unida a oligonucleótido. Se
muestra a continuación un esquema que ilustra esta reacción de
ligación química.
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Una biomolécula tiene un grupo reactivo (es
decir, un grupo saliente o un grupo de sustitución), que puede
localizarse en cualquier posición adecuada. Por ejemplo, un
oligonucleótido tiene un grupo reactivo en su término 3' o 5', o en
una posición no terminal. Esta puede estar inmovilizada sobre un
soporte sólido e hibridizarse con su miembro par. Cuando el grupo
reactivo está en una posición no terminal, el olignucleótido puede
ser capaz de formar una estructura "horquilla" sobre el
soporte sólido para mejorar la eficacia de hibridación.
Se puede preparar una biomolécula que contenga
un grupo reactivo usando cualquier metodología conveniente. Por
ejemplo, en la que la biomolécula sea un oligonucleótido, existe un
número de protocolos para introducir un oligonucleótido con un
grupo reactivo, si no está presente de forma natural. Por ejemplo,
se puede sintetizar químicamente un oligonucleótido sobre un
sintetizador de ADN/ARN usando fosforamiditas no modificadas, y se
puede añadir enzimáticamente un grupo reactivo a uno de los términos
del oligonucleótido. De forma alternativa, se puede incorporar una
fosforamidita modificada, con un grupo reactivo, en una posición
adecuada de un oligonucleótido usando un sintetizador de ADN/ARN.
Como otro ejemplo, cuando la biomolécula es un péptido, esta se
puede preparar químicamente (por ejemplo, sobre un sintetizador de
péptido) o biológicamente (por ejemplo, expresada de una célula
huésped). Está presente un grupo funcional tal como carboxi,
hidroxi, fenoxi, amino, guanidino o mercapto en péptidos, y puede
servir como un grupo reactivo. Si se necesitase un grupo reactivo
adicional, este se puede introducir, por ejemplo, mediante
incorporación de un análogo de aminoácido.
La síntesis de un oligonucleótido de esqueleto
modificado, tal como un oligonucleótido que contiene fosforotioato,
se describe, por ejemplo, en Krieg y col. (1995) Nature 374:
546 a 549; Winer y col. (1997) Proc. Natl. Acad Sci.
Estados Unidos 94: 10833 a 10837, y en Boggs y col. (1997)
Antisense Nucleic Drug Dev 7(5): 461 a 471. La
síntesis de un oligonucleótido de base modificada, así como también
de otros oligonucleótidos de esqueleto modificado (por ejemplo, que
contienen fosforoditioato o aminoalquilfosfotriéster), se describe
por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 6.232.296.
Se puede unir una biomolécula al soporte de
forma aleatoria, o en un orden. El procedimiento de esta invención
puede introducir una biomolécula, tal como un oligonucleótido, un
péptido, un polisacárido, un nucleósido, un aminoácido, o un
monosacárido, sobre un soporte sólido en la forma de una red, es
decir, una disposición ordenada tal como una matriz de filas y
columnas. Una red individual puede contener un número de
biomoléculas conectadas únicas. La red puede contener una
pluralidad de direcciones (siendo cada dirección una biomolécula
conectada única), y una o más moléculas conectadas únicas. Cada
sitio direccionable puede ser directamente adyacente a al menos un
sitio distinto, o se puede separar uno de otro, por ejemplo,
mediante una arista, vértice o superficie exenta de biomoléculas
conectadas. La red puede tener una pluralidad de direcciones sobre
el soporte sólido. La densidad de las direcciones se selecciona para
proporcionar resolución adecuada para detección, y puede ser al
menos 10, 10^{3}, 10^{5}, 10^{7} ó 10^{9}
direcciones/cm^{2}, o no más de 10, 10^{3}, 10^{5}, 10^{7}
ó 10^{9} direcciones/cm^{2}. La distancia centro a centro entre
direcciones puede ser de 1 cm, 10 mm, 10 nm, 0,1 nm o inferior, o
varía entre ellos. El mayor diámetro de cada dirección puede ser de
1 cm, 10 mm, 0,1 mm o inferior, o varía entre ellos. Cada dirección
puede contener 10 mg, 100 ng, 100 pg, 0,1 pg o menos de la
biomolécula, o varía entre ellos. De forma alternativa cada
dirección contiene 100, 10^{4}, 10^{6}, 10^{8} o más
biomoléculas, o varía entre ellos. Las direcciones pueden estar
distribuidas sobre el sustrato en una dimensión, en dos dimensiones
o en tres dimensiones.
Se puede usar un sustrato unido a biomolécula de
esta invención en aplicaciones variadas, cuando tales aplicaciones
son por lo general analíticas, en las que la presencia de un analito
determinado en una muestra dada se detecta al menos
cualitativamente, si no cuantitativamente. De forma más específica,
la muestra sospechosa de contener el analito de interés se pone en
contacto con las biomoléculas sobre el soporte sólido en condiciones
suficientes para que el analito interactúe con su respectivo
miembro par que está presente sobre el soporte sólido. Si el
analito de interés está presente en la muestra, este puede formar un
complejo con su miembro par. La presencia del complejo se puede
detectar mediante, por ejemplo, uso de un sistema de producción de
señal tal como una etiqueta isotópica o fluorescente presente en el
analito.
Un ejemplo de un sustrato unido a biomolécula es
una red de oligonucleótido, en el que se puede usar un ensayo de
hibridación. El ensayo de hibridación puede ser un ensayo de
descubrimiento de gen, un ensayo de análisis de expresión génica
diferencial, un ensayo de secuenciación, o un análisis de
polimorfismo genómico. Por ejemplo, se puede usar una red de
oligonucleótido para producir perfiles de expresión génica tras
reacciones de extensión con cebador mediado por polimerasa. Véase
por ejemplo la patente de Estados Unidos nº 5.262.311; Liang P &
Pardee, A.B. (1992) Science 257; 967 a 971; Liang P &
Pardee, ediciones A.B. (1997) Methods in Molecular Biology:
Differential Display Methods and Protocols, volumen 85). Una red
de este tipo se puede usar, por ejemplo, para identificar genes
asociados con enfermedades o compuestos tamiz para descubrimiento de
fármacos en un formato de gran rendimiento. En particular se ha
probado una red de alta densidad para controlar la expresión
génica, mapear clones de librería genómica, y
re-secuenciar genes para tamizar mutaciones y
polimorfismos. Por ejemplo, véase, Ramsay (1998) Nature
Biotechnology 16: 40 a 44; Bains y Smith (1988) J. Theor.
Biol. 135: 303 a 307; Drmanac y col. (1989) Genomics 4:
114 a 128; y Shena y col. (1995) Science 270: 467 a 470.
Los ejemplos específicos siguientes se entienden
como meramente ilustrativos, y no limitativos del resto de la
descripción en modo alguno. Sin más elaboración, se cree que un
especialista en la técnica puede, basándose en la descripción de
esta invención, usar la presente invención en toda su extensión.
Se preparó una solución de oligonucleótido
modificado con 3'-fosforotioato y
5'-biotina 10 \muM (TM). Se salpicó 0,5 \mul
(TL) de la solución sobre un sustrato plástico hecho de resina de
PVC. La placa plástica se incubó a 32ºC durante la noche, se lavó
con agua desionizada y destilada (ADD), se hizo reaccionar con
estreptavidina - fosfatasa alcalina y se trató con un tampón que
contiene nitroazul de tetrazolio
(NBT)/5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
(BCIP). Los resultados indican que el oligonucleótido se unió
covalentemente al sustrato plástico.
Se preparó una solución de oligonucleótido
modificada con 3'-amino y 5'-biotina
10 \muM (TM). Se salpicó 0,5 \mul (TL) de la solución sobre una
chapa plástica hecha de resina de PVC. El sustrato plástico se
incubó a 32ºC durante la noche, se lavó con (ADD), se hizo
reaccionar con estreptavidina - fosfatasa alcalina y se trató con
un tampón que contiene NBT/BCIP. Los resultados indican que el
oligonucleótido se unió covalentemente al sustrato plástico.
Se preparó una solución de oligonucleótido
modificada con 3'-fosforotioato 10 \muM (TM). Se
salpicó 0,5 \mul (TL) de la solución sobre una chapa plástica
hecha de resina de PVC. El sustrato de plástico se incubó a 32ºC
durante la noche, y se lavó con ADD. Se aplicó al sustrato de
plástico un producto de PCR marcado con biotina, que contiene una
secuencia complementaria al oligonucleótido modificado con
3'-fosforotioato. Tras incubación se lavó la chapa,
se hizo reaccionar con estreptavidina - fosfatasa alcalina, y se
trató con un tampón de detección que contiene NBT/BCIP. Los
resultados mostraron que la hibridación del producto de PCR en el
oligonucleótido sobre el sustrato era eficiente.
Claims (37)
1. Un sustrato unido a biomolécula que
comprende:
un soporte sólido hecho de moléculas
poliméricas, cada una de las cuales contiene un primer grupo
reactivo, estando dicho primer grupo reactivo presente sin
modificación de la superficie del soporte sólido; y una pluralidad
de biomoléculas, cada una de las cuales contiene un segundo grupo
reactivo;
en el que uno de los dos grupos reactivos es un
grupo de sustitución y el otro es un grupo saliente; y las
biomoléculas están unidas covalentemente al soporte sólido mediante
una reacción de ligación química entre los dos grupos reactivos.
2. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 1, en el que el primer grupo reactivo es un grupo
saliente y el segundo grupo reactivo es un grupo nucleófilo.
3. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 2, en el que el primer grupo reactivo es halógeno,
amino o mercapto.
4. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 3, en el que el soporte sólido es poli(cloruro
de vinilo) y el primer grupo reactivo es cloruro.
5. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 2, en el que el segundo grupo reactivo es
fosforotioato o un amino.
6. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 5, en el que el primer grupo reactivo es halógeno,
amino o mercapto.
7. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 6, en el que el soporte sólido es poli(cloruro
de vinilo) y el primer grupo reactivo es cloruro.
8. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 2, en el que la biomolécula es un nucleótido o un
oligonucleótido.
9. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 8, en el que el segundo grupo reactivo es
fosforotioato o un amino.
10. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 9, en el que el primer grupo reactivo es halógeno,
amino o mercapto.
11. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 10, en el que el soporte sólido es
poli(cloruro de vinilo) y el primer grupo reactivo es
cloruro.
12. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 2, en el que la biomolécula es un aminoácido o un
péptido.
13. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 1, en el que el primer grupo reactivo es un grupo
saliente y el segundo grupo reactivo es un grupo electrófilo.
14. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 1, en el que el primer grupo reactivo es un grupo
nucleófilo y el segundo grupo reactivo es un grupo saliente.
15. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 14, en el que el primer grupo reactivo es halógeno,
amino o mercapto.
16. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 15, en el que el soporte sólido es resina de
urea-formaldehído y el primer grupo reactivo es
amino.
17. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 14, en el que el segundo grupo reactivo es
halógeno.
18. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 17, en el que el primer grupo reactivo es halógeno,
amino o mercapto.
19. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 18, en el que el soporte sólido es resina de
urea-formaldehído y el primer grupo reactivo es
amino.
20. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 14, en el que la biomolécula es un nucleótido o un
oligonucleótido.
21. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 20, en el que el segundo grupo reactivo es
halógeno.
22. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 21, en el que el primer grupo reactivo es halógeno,
amino o mercapto.
23. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 22, en el que el soporte sólido es resina de
urea-formaldehído y el primer grupo reactivo es
amino.
24. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 14, en el que la biomolécula es un aminoácido o un
péptido.
25. El sustrato unido a biomolécula de la
reivindicación 1, en el que el primer grupo reactivo es un grupo
electrófilo y el segundo grupo reactivo es un grupo saliente.
26. Un procedimiento para la preparación de un
sustrato unido a biomolécula, que comprende
proporcionar un soporte sólido hecho de
moléculas poliméricas, cada una de las cuales contiene un primer
grupo reactivo, estando dicho primer grupo reactivo presente sin
modificación de la superficie del soporte sólido; y una pluralidad
de moléculas, cada una de las cuales contiene un segundo grupo
reactivo; en el que uno de los dos grupos reactivos es un grupo de
sustitución y el otro es un grupo saliente; y
enlace de las biomoléculas con el soporte sólido
mediante una reacción de ligación química entre los dos grupos
reactivos para formar el sustrato unido a biomolécula.
27. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que el primer grupo reactivo es un grupo saliente y el segundo
grupo reactivo es un grupo nucleófilo.
28. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que el soporte sólido es poli(cloruro de vinilo) y el
primer grupo reactivo es cloruro.
29. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que el segundo grupo reactivo es fosforotioato o un amino.
30. El procedimiento de la reivindicación 29, en
el que el soporte sólido es poli(cloruro de vinilo) y el
primer grupo reactivo es cloruro.
31. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que la biomolécula es un nucleótido o un oligonucleótido.
32. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que la biomolécula es un aminoácido o un péptido.
33. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que el primer grupo reactivo es un grupo saliente y el segundo
grupo reactivo es un grupo electrófilo.
34. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que el primer grupo reactivo es un grupo nucleófilo y el segundo
grupo reactivo es un grupo saliente.
35. El procedimiento de la reivindicación 34, en
el que la biomolécula es un nucleótido o un oligonucleótido.
36. El procedimiento de la reivindicación 34, en
el que la biomolécula es un aminoácido o un péptido.
37. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que el primer grupo reactivo es un grupo electrófilo y el segundo
grupo reactivo es un grupo saliente.
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| EP01202713A EP1278063B1 (en) | 2001-07-16 | 2001-07-16 | Imobilization of biomolecules |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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