ES2255198T3 - Metodo para determinar el potencial metastasico empleando el gen asp1. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un tejido metastásico o el potencial metastásico de un tejido, que comprende la etapa de: medir en una muestra de tejido el producto de expresión de un gen que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, en donde se identifica como metastásico o que tiene potencial metastásico una muestra de tejido que expresa un producto de un gen que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18.

Description

Método para determinar el potencial metastásico empleando el gen ASP1.

Campo técnico de la invención

Esta invención se refiere a métodos para predecir el comportamiento de tumores y en particular, pero no exclusivamente, a métodos en los cuales se examina en una muestra de tumor la expresión de una secuencia génica especificada que indica la propensión a la extensión de metástasis.

Fundamento de la invención

A pesar del uso de varios marcadores histoquímicos, genéticos e inmunológicos (por ejemplo los ASP, polipéptidos y polinucleótidos (Patente europea 0848062)) los médicos todavía tienen dificultad en predecir que tumores experimentarán metástasis a otros órganos. Algunos pacientes necesitan terapia adyuvante para impedir la recidiva y metástasis y otros no. Distinguir entre estas subpoblaciones de pacientes no es sencillo. Por tanto, no se puede diseñar fácilmente el curso de tratamiento. Existe, por tanto, la necesidad en la técnica de nuevos marcadores para distinguir entre tumores de diferente potencial metastásico.

Sumario de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar métodos para determinar que tumores experimentarán probablemente metástasis y métodos para suprimir la metástasis de estos tumores. Estos y otros objetos de la invención son proporcionados por una o más de las realizaciones descritas a continuación.

Una realización de la invención es un método para identificar un tejido metastásico o el potencial metastásico de un tejido. En una muestra de tejido se mide el producto de expresión del gen que comprende una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18. Se identifica como metastásica o que tiene potencial metastásico una muestra de tejido que expresa el producto del gen que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18.

Una realización adicional de la invención es un método para identificar un tejido metastásico o el potencial metastásico de un tejido. Una muestra de tejido que comprende moléculas polinucleotídicas monocatenarias se pone en contacto con una disposición ordenada (array) de polinucleótidos que comprende al menos una sonda de polinucleótido monocatenario. Dicha al menos una sonda de polinucleótido monocatenario comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18. Se sospecha que la muestra de tejido es metastásica o tiene potencial metastásico. Se detectan polinucleótidos bicatenarios unidos a la disposición ordenada de polinucleótidos. La detección de un polinucleótido bicatenario que comprende nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 18 identifica la muestra de tejido como metastásica o que tiene potencial metastásico.

Por tanto, la invención es útil para prescribir más racionalmente el curso de la terapia para pacientes con cáncer, especialmente los que padecen cáncer de mama o de colon.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Presentación diferencial basada en cebadores arbitrarios y confirmación por análisis de transferencia de RNA de diferentes líneas celulares de cáncer de mama humano. Figura 1A. Auto-radiografía de un gel de presentación diferencial que representa dos bandas de un tamaño de aproximadamente 1,2 kb en la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-435. Se prepararon mezclas de reacción para la presentación diferencial y se hicieron desplazar en el gel por duplicado. Figura 1B. Análisis de transferencia Northern que verifica el modelo de expresión en MDA-MB-435. El cDNA aislado del gel de presentación diferencial se hibridó a dos transcritos de un tamaño de aproximadamente 2,0 kb y 2,5 kb. Se cargaron cantidades iguales de RNA en cada pista según se determinó por tinción de la membrana con azul de metileno e hibridación de la membrana con una sonda de \beta-actina humana.

Figura 2. Secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos deducida de CSP56. Figura 2A. La secuencia larga de 518 aminoácidos se muestra con el código de una sola letra debajo de la secuencia de nucleótidos de 1855 pares de bases. Están subrayados el residuo del sitio activo (D) y los residuos de los aminoácidos flanqueantes característicos de las aspartil-proteasas. El supuesto propéptido está enmarcado en un recuadro. El supuesto péptido señal en el N-terminal y el dominio transmembránico en el C-terminal están subrayados. Figura 2B. Etiquetas de secuencias expresadas que extienden la secuencia de nucleótidos de CSP56 hasta una longitud de 2606 pares de bases. Figura 2C. Representación esquemática de CSP56. SS,secuencia señal; Pro, propéptido; DT, dominio transmembránico. Los asteriscos indican los sitios activos.

Figura 3. Alineamiento de múltiples secuencias de aminoácidos de CSP56 con otros miembros de la familia de la pepsina de aspartil-proteasas. Los residuos de aminoácidos idénticos están indicados por recuadros negros. Los residuos activos de aspartil-proteasa (D-S/T-G) están indicados por una barra en la parte superior. Los residuos de cisteína característicos de la aspartil-proteasa en miembros de la familia de la pepsina están indicados por asteriscos. El supuesto dominio de unión a la membrana está subrayado. Los huecos están indicados por puntos. Cat-E, catepsina E; Pep-A, pepsinógeno E; Pep-C, pepsinógeno C; Cat-D, catepsina D.

Figura 4. Expresión de CSP56 en tumor primario y metástasis aislada de ratones scid (ratones con deficiencia de células ByT). Análisis de transferencia Northern usando RNA aislado de tumores primarios (TP) y tejidos metastásicos (Met) de ratones a los que se había inyectado diferentes líneas celulares de cáncer de mama humano. Se cargaron cantidades iguales de RNA en cada pista indicado por la tinción de la membrana con azul de metileno e hibridación de la membrana con una sonda de \beta-actina humana.

Figura 5. CSP56 está sobre-regulado en muestras de tumor de pacientes con tumor de mama. Figura 5A. Análisis de transferencia Northern de RNA aislado de tejido de mama tumoral y normal del mismo paciente. Figura 5B. Análisis de transferencia Northern usando RNA aislado de tres diferentes pacientes humanos con tumor de mama y tejido de mama normal.

Figura 6. Análisis de hibridación in situ de la expresión de CSP56 en tumores de mama y de colon. Las secciones adyacentes o casi adyacentes a través del tejido de mama normal (A-C) y el tejido de mama primario (D-F) de un paciente y a través de tejido de colon normal (G, H), tumor de colon primario (J, K), y metástasis de hígado (L, M) de otro paciente. Las secciones A, D, G, J y L se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E). Las secciones B, E, H, K y M se hibridaron con la sonda antisentido de CSP56, y las secciones C y F se hibridaron con la sonda de control del sentido de CSP56. d, conducto galactóforo; f, tejido conjuntivo adiposo; ly, linfocitos; m, mucosa de colon; met, tejido metastásico; TP, tumor primario; st, estroma; ct, células tumorales.

Figura 7. Expresión de CSP56 en tejidos humanos. Análisis de transferencia de RNA que representa transcritos CSP56 de 2,0 kb y 2,5 kb en diversos tejidos humanos. LSP = linfocitos de sangre periférica.

Descripción detallada de la invención

En la invención se ha encontrado que cierto número de genes se expresan diferentemente entre células cancerosas y células cancerosas no metastásicas (véase SEQ. ID. NO: 1-18 y la Tabla 1). Esta información puede utilizarse para preparar reactivos de diagnóstico específicos para los productos de expresión de los genes diferencialmente presentados. También puede usarse en métodos de diagnóstico y pronóstico que ayudaran a los médicos a planificar regímenes de tratamiento adecuados para cánceres, especialmente de mama o de colon.

Algunos de los marcadores metastásicos descritos en la presente memoria, tal como el clon 122, están sobre-regulados en células metastásicas con respecto a las células no metastásicas. Algunos de los marcadores metastásicos, tales como los clones 337 y 280, están sub-regulados en células metastásicas con respecto a las células no metastásicas. La identificación de estas relaciones y marcadores permite la formulación de reactivos y métodos como se describe adicionalmente más adelante. Además, se han identificado homologías a proteínas conocidas que sugieren funciones para las proteínas descritas. Por ejemplo, el transcrito 280 es homólogo al precursor de N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana, el transcrito 245 es homólogo a la ATP -sulfurilasa-adenosina-5'-fosfosulfato-quinasa bifuncional, y el transcrito 122 es homólogo al pepsinógeno humano c, una aspartil-proteasa.

Es un descubrimiento de la presente invención que una nueva aspartil-proteasa, CSP56, está sobre-expresada en cáncer muy metastásico, particularmente en cáncer de mama y de colon, y está asociada con el progreso de tumores primarios hasta un estado metastásico. Esta información puede utilizarse para preparar reactivos de diagnóstico específicos para productos de expresión del gen CSP56. También puede usarse en métodos de diagnóstico y pronóstico que ayudarán a los médicos a planificar regímenes de tratamiento adecuados para cánceres, especialmente de mama y de colon.

La secuencia de aminoácidos de la proteína CSP56 se muestra en la SEQ ID NO: 19. Las secuencias de aminoácidos codificadas por nuevos polinucleótidos de la invención puede predecirse ejecutando un programa de traducción para cada uno de los tres marcos de lectura de una secuencia polinucleotídica particular. La proteína CSP56 mostrada en la SEQ ID NO: 19, o las variantes proteínicas biológicamente activas de origen natural o no natural de las proteínas marcadoras metastásicas, incluyendo CSP56, pueden usarse en métodos de diagnóstico y terapéuticos Las variantes proteínicas marcadoras metastásicas biológicamente activas, incluyendo variantes de CSP56, retienen las mismas actividades biológicas que la proteína codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 18. Las actividades biológicas de las proteínas marcadoras metastásicas incluyen una expresión diferencial entre tumores y tejido normal, particularmente entre tumores con alto potencial metastásico y tejido normal. La actividad biológica de CSP56 también incluye la capacidad de permitir metástasis y actividad de aspartil-proteasa.

La actividad biológica de una variante proteínica marcadora metastásica, incluyendo una variante CSP56, puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. La expresión diferencial de la variante, por ejemplo, puede medirse en líneas celulares que varían en potencial metastásico, tales como las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231 (Brinkley et al., Cancer Res. 40, 3118-29,1980), MDA-MB-435 (Brinkley et al., 1980), MCF-7, BT-20, ZR-75-1, MDA-MB-157, MDA-MB-361, MDA-MB-453, Alab y MDA-MB-468, o las líneas celulares de cáncer de colon Km12C y Km12L4A. La línea celular MDA-MB-231 se depositó en ATCC el 15 de mayo de 1998 (ATCC CRL-12532). La línea celular Km12C se depositó en ATCC el 15 de mayo de 1998 (ATCC CRL-12533). La línea celular Km12L4A se depositó en ATCC el 19 de marzo de 1998(ATCC CRL-12496). La línea celular MDA-MB-435 se depositó en ATCC el 9 de octubre de 1998 (ATCC CRL 12583). La línea celular MCF-7 se depositó en ATCC el 9 de octubre de 1998 (ATCC CRL-12584).

La expresión en una línea celular no cancerosa, tal como la línea celular de mama Hs58Bst, puede compararse con la expresión en líneas celulares cancerosas. Alternativamente, una línea celular de cáncer de mama con alto potencial metastásico, tal como MDA-MB-231 o MDA-MB-435, puede ser puesta en contacto con un polinucleótido que codifica una variante y analizarse la disminución de su potencial metastásico, por ejemplo monitorizando la división celular o la síntesis de proteína o DNA, como es conocido en la técnica. También puede medirse la actividad de aspartil-proteasa de una variante CSP56 potencial, por ejemplo, como se enseña en Wright et al., J. Prot. Chem. 16, 171-81 (1997).

Las variantes proteínicas marcadoras metastásicas biológicamente activas de origen natural, incluyendo variantes de CSP56, se encuentran en seres humanos y otras especies y comprenden secuencias de aminoácidos que son sustancialmente idénticas a la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 18. Las variantes proteínicas marcadoras metastásicas biológicamente activas de origen no natural pueden construirse en el laboratorio, usando técnicas estándares de DNA recombinante.

Preferiblemente, las variantes proteínicas marcadoras metastásicas biológicamente activas de origen natural o no natural tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 65%, 75%, 85%, 90% o 95% idénticas a la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 18 y tienen modelos similares de expresión diferencial, aunque estas propiedades pueden diferir en grados, Las variantes de CSP56 biológicamente activas de origen natural o no natural también tienen actividad de aspartil-proteasa. Más preferiblemente, las variantes son al menos 98% o 99% idénticas. El porcentaje de identidad de secuencia se determina usando programas de ordenador que emplean el algoritmo de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con los siguientes parámetros: una penalización para la creación de huecos de 12 y una penalización para la extensión de huecos de 1. El algoritmo de búsqueda de homologías de Smith-Waterman se describe en Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482-489.

La guía para determinar que residuos de aminoácidos pueden estar sustituidos, insertados o suprimidos sin abolir la actividad biológica o inmunológica puede encontrarse usando programas de ordenador bien conocidos en la técnica, tal como el programa DNASTAR. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en variantes proteínicas marcadoras metastásicas biológicamente activas son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos similarmente cargados o no cargados. Un cambio conservador de un aminoácido implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias a saber: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican algunas veces en el mismo grupo como aminoácidos aromáticos. Es razonable esperar que un reemplazamiento aislado de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o un reemplazamiento similar de un aminoácido por otro aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto importante sobre la actividad de aspartil-proteasa de CSP56, especialmente si el reemplazamiento no está en el dominio catalítico de la proteasa.

Las variantes proteínicas marcadoras metastásicas también incluyen variantes alélicas, variantes de especies, muteína, formas glicosiladas, conjugados por agregación con otras moléculas, y conjugados covalentes con restos químicos no relacionados que retienen la actividad biológica. Las variantes proteínicas marcadoras metastásicas covalentes pueden prepararse por unión de funcionalidades a grupos que se encuentran en la cadena de aminoácidos en el residuo N- o C-terminal, como es conocido en la técnica. Las truncaciones o deleciones de regiones que no afectan a los modelos de expresión de proteínas marcadoras metastásicas o, por ejemplo, la actividad de aspartil-proteasa de CSP56, también son variantes biológicamente activas.

Un subconjunto de mutantes, denominadas muteínas, es un grupo de proteínas en las que los residuos de cisteína están sustituidos por aminoácidos neutros, tales como serina, que no participan en los puentes disulfuro. Estos mutantes pueden ser estables en un intervalo más amplio de temperatura que las proteínas de origen natural. Véase Mark et al., patente de EE.UU. 4.959.314.

Los polipéptidos marcadores metastásicos contienen menos aminoácidos que las proteínas marcadoras metastásicas completas. La polipéptidos de CSP56 pueden contener al menos 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 23, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 40, 50, 60, 75, 100, 111, 112, 120, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, o 500 o más aminoácidos de una proteína CSP56 o su variante biológicamente activa. Los polipéptidos de CSP56 preferidos comprenden al menos los aminoácidos 106-115, 105-116, 104-117, 100-120, 297-306, 296-307, 295-308, 290-320, 8-20, 7-21, 6-22, 1-30, 461-489, 460-490, 459-491 y 407-518 de la SEQ ID NO: 19. Las moléculas de polipéptido que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 18, pero que poseen sustituciones de aminoácidos secundarias que no afectan sustancialmente a las propiedades biológicas de una variante polipeptídica marcadora metastásica particular están dentro de la definición de polipéptidos marcadores metastásicos.

Las proteínas o polipéptidos marcadores metastásicos pueden aislarse de, por ejemplo, células humanas, usando técnicas bioquímicas bien conocidas por los expertos. Una preparación de proteína marcadora metastásica aislada y purificada es al menos 80% pura; preferiblemente, las preparaciones son al menos 90%, 95%, 98% o 99% puras. Las proteínas y polipéptidos marcadores metastásicos también pueden producirse por métodos de DNA recombinante o por métodos de síntesis química. Para la producción de proteínas o polipéptidos marcadores metastásicos recombinantes la secuencia codificadora de SEQ ID NO: 18 puede expresarse en sistemas de expresión eucarióticos o procarióticos bien conocidos. Pueden usarse sistemas de expresión de bacterias, levaduras, insectos o mamíferos como es conocido en la técnica. Alternativamente, pueden usarse métodos de síntesis química, tales como síntesis de péptidos en fase sólida, para sintetizar proteínas o polipéptidos marcadores metastásicos. Las variantes proteínicas o polipeptídicas biológicamente activas pueden producirse similarmente.

También pueden construirse proteínas de fusión que comprenden aminoácidos contiguos de proteínas marcadoras metastásicas. Las proteínas de fusión son útiles para generar anticuerpos contra secuencias de aminoácidos de proteínas marcadoras metastásicas y para usar en diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, las proteínas de fusión de CSP56 pueden usarse para identificar proteínas que interactúan con la proteína CSP56 e influyen, por ejemplo, en su actividad de aspartil-proteasa, su expresión diferencial o en su capacidad para permitir la metástasis. Para este fin pueden usarse métodos físicos, tales como cromatografía de afinidad para proteínas o ensayos basados en colecciones para interacciones proteína-proteína, tales como los sistemas de los dos híbridos en levadura o de presentación en fagos. Dichos métodos son muy conocidos en la técnica y también pueden usarse para escrutinios de fármacos.

Una proteína de fusión comprende dos segmentos proteínicos unidos entre si por medido de un enlace peptídico. El primer segmento proteínico comprende al menos 8, 10, 11, 12, 13. 14, 15, 16, 17, 20, 21, 23, 25, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 40, 50, 60, 75, 100, 111, 112, 120, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 o 500 aminoácidos contiguos de una proteína CSP56. Los aminoácidos pueden seleccionarse de la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido SEQ ID NO: 18 o de una variante biológicamente activa de esta secuencia. El primer segmento proteínico también puede ser una proteína marcadora metastásica de longitud completa. El primer segmento proteínico puede ser N-terminal o C-terminal, según sea conveniente.

El segundo segmento proteínico puede ser una proteína de longitud completa o puede ser un fragmento proteínico o polipéptido. Las proteínas comúnmente usadas en la construcción de proteínas de fusión incluyen \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde (GFP), proteínas autofluorescentes, incluyendo proteína fluorescente azul (BFP), glutation-S-transferasa (GST), luciferasa, peroxidasa de rábano silvestre (HRP) y cloramfenicol-acetiltransferasa (CAT). Adicionalmente, se usan etiquetas de epítopos en construcciones de proteínas de fusión, incluyendo etiquetas de histidina (His), etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina de la gripe (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G y etiquetas de tiorredoxina (Trx). Otras construcciones de proteínas de fusión pueden incluir proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones del dominio de unión a DNA de Lex A (DBD), fusiones del dominio de unión a DNA de GAL4 DNA y fusiones de la proteína BP16 del virus de herpex simples (HSV).

Estas fusiones pueden hacerse, por ejemplo, uniendo covalentemente dos segmentos proteínicos o por métodos estándares en la técnica de la biología molecular. Los métodos de DNA recombinante pueden usarse para preparar proteínas de fusión, por ejemplo, preparando una construcción de DNA que comprenda la secuencia codificadora de SEQ ID NO: 18 en una marco de lectura apropiado con nucleótidos que codifican el segundo segmento proteínico y expresando la construcción de DNA en una célula hospedante, como es conocido en la técnica. Muchos kits para construir proteínas de fusión están disponibles de compañías que suministran herramientas para experimentos a laboratorios de investigación, incluyendo, por ejemplo, Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), Clontech (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MBL International Corporation (MIC; Watertown,MA) y Quantum Biotechnologies (Montreal, Canadá; 1-888-DNA-KITS).

Las proteínas, polipéptidos, variantes biológicamente activas o proteínas de fusión marcadores metastásicos aislados pueden usarse como inmunógenos, para obtener una preparación de anticuerpos que se unen específicamente a los epítopos de la proteína marcadora metastásica. Los anticuerpos pueden usarse, entre otras cosas, para detectar proteínas marcadoras metastásicas, tales como CSP56, en tejido humano, particularmente en tumores humanos, o en sus fracciones. Los anticuerpos también pueden usarse para detectar la presencia de mutaciones en los genes de las proteínas marcadoras metastásicas, tal como el gen CSP56, lo cual da como resultado la sub- o sobre-expresión de una proteína marcadora metastásica o la expresión de una proteína marcadora metastásica con un tamaño o movilidad electroforética alterado. Mediante la unión a CSP56, por ejemplo, los anticuerpos también pueden impedir la actividad aspartil-proteasa de CSP56 o la capacidad de CSP56 para permitir la metástasis.

Los anticuerpos que específicamente se unen a epítopos de una proteína, polipéptidos, proteínas de fusión o variantes biológicamente activas marcadores metastásicos se pueden usar en ensayos inmunoquímicos, incluyendo sin limitación, transferencias Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos proporcionan una señal de detección al menos 5, 10 ó 20 veces mayor que la señal de detección proporcionada por otras proteínas cuando se usan en dichos ensayos inmmoquímicos. Preferiblemente, los anticuerpos que específicamente se unen a epítopos de una proteína marcadora metastásica particular no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar en la solución esa proteína marcadora mestastásica o fragmentos polipeptídicos de la proteína marcadora metastásica.

Los anticuerpos específicos de proteínas marcadoras metastásicas se unen específicamente a epítopos presentes en una proteína marcadora metastásica que tenga una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18 o a variantes biológicamente activas de la secuencia de aminoácidos. Típicamente, para formar un epítopo se requieren al menos 6, 8, 10 ó 12 aminoácidos contiguos. Sin embargo, los epítopos que implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25 o 50 aminoácidos. Preferiblemente, los epítopos de proteínas marcadoras metastásicas no están presentes en otras proteínas humanas.

Los epítopos de una proteína marcadora metastásica que son particularmente antigénicos pueden seleccionarse, por ejemplo, por escrutinio rutinario de fragmentos polipeptídicos de la proteína marcadora metastásica para antigenicidad o aplicando un método teórico para seleccionar regiones antigénicas de proteína a la secuencia de aminoácidos de la proteína marcadora metastásica. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Hopp and Wood, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 3824-28 (1981), Hopp and Wood, Mol. Immunol. 20, 483-89 (1983) y Sutcliffe et al., Science 219, 660-66 (1983). Con referencia a la Figura 3, pueden evitarse las regiones antigénicas de CSP56 que también podrían unirse a anticuerpos que reaccionan cruzadamente con aspartil-proteasas.

Puede generarse cualquier tipo de anticuerpos conocidos en la técnica para unirse específicamente a los epítopos de la proteína marcadora metastásica. Por ejemplo, las preparaciones de anticuerpos policlonales y monoclonales pueden prepararse usando métodos estándares que son bien conocidos en la técnica. Similarmente, también pueden prepararse anticuerpos monocatenarios. Los anticuerpos monocatenarios que específicamente se unen a los epítopos de la proteína marcadora metastásica pueden aislarse, por ejemplo, a partir de colecciones de presentación de inmunoglobulinas monocatenarias, como es conocido en la técnica. La colección es "explorada" frente a una secuencia de aminoácidos de proteína marcadora metastásica y pueden aislarse cierto número de anticuerpos monocatenarios que se unen con alta afinidad a diferentes epítopos de la proteína marcadora metastásica. Hayashi et al., 1995, Gene 160:129-30. Los anticuerpos monocatenarios también pueden construirse usando un método de amplificación de DNA, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando cDNA de hibridoma como molde. Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5:507-11.

Los anticuerpos monocatenarios pueden ser mono- o bi-específicos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos tetravalentes, bi-específicos monocatenarios se muestra, por ejemplo, en Colma and Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15:159-63. La construcción de anticuerpos bivalentes, bi-específicos monocatenarios se muestra inter alia en Mallender and Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269:199-206.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo monocatenario se puede construir usando síntesis de nucleótidos manual o automatizada, clonación en una construcción de expresión usando métodos de DNA recombinante estándares e introducir en una célula para expresar la secuencia codificadora, como se describe más adelante. Alternativamente, los anticuerpos monocatenarios pueden producirse directamente usando, por ejemplo, tecnología de fago filamentoso. Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61:497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165:81-91.

Los anticuerpos monoclonales y otros también pueden ser "humanizados" para impedir que un paciente desencadene una respuesta inmune contra el anticuerpo cuando se usa terapéuticamente. Dichos anticuerpos pueden tener secuencias suficientemente similares a las de los anticuerpos humanos para ser usados directamente en terapia o pueden requerir alteración de unos cuantos residuos claves. Las diferencias de secuencias entre, por ejemplo, anticuerpos de roedores y secuencias de seres humanos, pueden minimizarse reemplazando residuos que difieran de los de las secuencias humanas, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio de residuos individuales o injertando regiones completas determinantes de la complementariedad. Alternativamente, se pueden producir anticuerpos humanizados usando métodos recombinantes, como los descritos en la patente de GB 2188638B. Los anticuerpos que específicamente se unen a epítopos de una proteína marcadora metastásica pueden contener sitios de unión al antígeno que están parcial o completamente humanizados, como se describe en la patente de EE.UU. 5.565.332.

Pueden construirse y usarse terapéuticamente otros tipos de anticuerpos., Por ejemplo, pueden construirse anticuerpos quiméricos, tal como se ha descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 93/03151. También pueden prepararse proteínas de unión que se derivan de inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas, tales como los "diacuerpos" descritos en la solicitud de patente WO 94/13804.

Los anticuerpos, pueden ser purificados por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse por afinidad haciéndolos pasar por una columna a la cual esta unida una proteína, polipéptido, variante o proteína de fusión marcador metastásico. Los anticuerpos unidos pueden eluirse luego de la columna usando un tampón con una alta concentración de sal.

También pueden usarse polinucleótidos sub-genómicos que codifican proteínas, polipéptidos, variantes o proteínas de fusión marcadores metastásicas. Los polinucleótidos sub-genómicos contienen menos de un cromosoma completo. Preferiblemente, los polinucleótidos sub-genómicos están libres de intrones.

Un polinucleótido CSP56 puede comprender una secuencia contigua de al menos 10, 11, 12, 15, 20, 24, 25, 30, 32, 33, 35, 36, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 60, 63, 69, 70, 74, 75, 80, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 100, 105, 114, 120, 125, 150, 225, 300, 333, 336, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, o 1850 nucleótidos seleccionados de SEQ ID NO: 18 o puede comprender SEQ ID NO: 18. Un polinucleótido CSP56 aislado codifica al menos 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 25, 29, 30, 31, 32, 40, 50, 75, 100 o 111 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 19 y puede codificar la secuencia completa de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 19. El polinucleótido CSP56 preferido codifica al menos los aminoácidos 1-30, 8-20, 7-21, 6-22, 106-115, 105-116, 104-117, 100-120, 297-306, 296-307, 295-308, 290-320, 461-489, 460-490, 459-491 y 407-518 de SEQ ID NO: 19.

El complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18 es una secuencia de nucleótidos contigua que forma pares de bases de Watson-Crick con una secuencia de nucleótidos contigua mostrada en SEQ ID NO: 18. Los complementos de las secuencias codificadoras pueden usarse para proporcionar oligonuleótidos y sondas antisentido. Los oligonucleótidos y sondas antisentido pueden consistir en al menos 11, 12, 15, 20, 25, 30, 50 ó 100 nucleótidos contiguos. También puede usarse un complemento de una secuencia codificadora completa. También son polinucleótidos que pueden usarse los polinucleótidos bicatenarios que comprenden la totalidad o una parte de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 18, así como los polinucleótidos que codifican anticuerpos o ribozimas específicos de proteínas marcadoras metastásicas.

También son polinucleótidos que pueden usarse las secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican secuencias de aminoácidos de proteínas y/o variantes marcadoras metastásicas, así como las secuencias de nucleótidos homólogas que son al menos 65%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% idénticas a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 18. El porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse usando programas de ordenador que emplean el algoritmo de Smith-Waterman, por ejemplo tal como se aplica en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando una búsqueda de hueco afín con los siguientes parámetros: una penalización para la creación de huecos de 12 y una penalización para la extensión de huecos de 1.

Típicamente, las secuencias de polinucleótidos homólogas pueden confirmarse por hibridación en condiciones rigurosas, como es conocido en la técnica. Por ejemplo, usando las siguientes condiciones de lavado - 2 X SSC, 0,1% SDS, dos veces a temperatura ambiente, 30 minutos cada vez; luego 2 X SSC, 0,1% SDS, 50ºC una vez durante 30 minutos; luego 2 X SSC, dos veces a temperatura ambiente, 10 minutos cada vez - pueden identificarse secuencias homólogas que contienen como máximo 25-30% de desapareamientos de pares de bases. Más preferiblemente, las cadenas homólogas de ácidos nucleicos contienen 15-25% de desapareamientos de pares de bases, incluso más preferiblemente 5-15%, 2-10%, o 1-5% de desapareamientos de pares de bases. Los grados de homología de polinucleótidos pueden seleccionarse variando la rigurosidad de las condiciones de lavado para la identificación de clones de genotecas (u otras fuentes de material genético), como es bien conocido en la técnica descrita por ejemplo, en manuales tales como el de Sambrook et al., titulado MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed.
(1989).

Los homólogos de especie de polinucleótidos sub-genómicos también pueden ser identificadas preparando sondas o cebadores adecuados y escrutando genotecas de expresión de cDNA y genotecas genómicas de otras especies, tales como ratones, monos, levadura o bacterias. Las secuencias completas de polinucleótidos pueden obtenerse por recorrido cromosómico, escrutinio de genotecas para solapar clones, 5' RACE, u otros métodos bien conocidos en la técnica. Es bien conocido que la T_{m} de un DNA bicatenario disminuye en 1-1,5ºC con cada 1% de disminución de homología (Bonner et al., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973). Los polinucleótidos homólogos humanos o los polinucleótidos de otras especies pueden ser identificados por tanto, por ejemplo, hibridando un supuesto polinucleótido homólogo con un polinucleótido que tenga la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18, comparando la temperatura de fusión del híbrido de ensayo con la temperatura de fusión de un híbrido que comprenda un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18 y un polinucleótido que es perfectamente complementario a la secuencia de nucleótidos y calculando el número de pares de bases que están desapareadas en el híbrido de ensayo.

Las secuencias de nucleótidos que se hibridan a la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18 siguiendo condiciones rigurosas de hibridación y/o lavado son también polinucleótidos sub-genómicos Las condiciones rigurosas de lavado son bien conocidas y entendidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989, en las páginas 9.50-9.51.

Típicamente, para condiciones rigurosas de hibridación debe elegirse una combinación de temperatura y concentración de sal que sea aproximadamente 12-20ºC por debajo de la T_{m} calculada para el híbrido en estudio. La T_{m} de un híbrido entre la secuencia de polinucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 18 y una secuencia de polinucleótidos que es 65%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a esa secuencia puede calcularse, por ejemplo, usando la ecuación de Bolton and McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48, 1390 (1962):

T_{m} = 81,5^{o}C - 16,6(log_{10}[Na^{+}]) + 0,41(%G+C) - 0,63(%formamida)-600/L.

donde L = longitud del híbrido en pares de bases.

Las condiciones rigurosas de lavado incluyen, por ejemplo, 4 X SSC a 65ºC, o formamida al 50%, 4 X SSC a 42ºC, 0,5 X SSC, 0,1% SDS a 65ºC. Las condiciones altamente rigurosas de lavado incluyen, por ejemplo, 0,2 X SSC a 65ºC.

Los polinucleótidos sub-genómicos pueden purificarse para obtenerlos libres de otras secuencias de nucleótidos usando técnicas de purificación estándares de ácidos nucleicos. Por ejemplo, pueden usarse enzimas de restricción y sondas para aislar polinucleótidos que abarcan las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas marcadoras metastásicas. Alternativamente, puede usarse la PCR para sintetizar y amplificar dichos polinucleótidos. Al menos 90% de una preparación de polinucleótidos aislados y purificados comprende polinucleótidos que codifican proteínas marcadoras metastásicas.

Las moléculas de DNA complementario (cDNA) que codifican proteínas marcadoras metastásicas también son polinucleótidos sub-genómicos. Las moléculas de cDNA pueden prepararse por técnicas estándares de biología molecular, usando como molde mRNA. Las moléculas de cDNA pueden replicarse luego usando métodos de biología molecular conocidos en la técnica y descritos en manuales tales como el de Sambrook et al., 1989. Se puede usar una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para obtener copias adicionales de los polinucleótidos sub-genómicos usando bien sea DNA genómico humano o bien sea cDNA como molde.

Alternativamente, pueden usarse técnicas de síntesis química para sintetizar moléculas de polinucleótidos sub-genómicos. La degeneración del código genético permite que sean sintetizadas secuencias alternativas de nucleótidos que codificarán una secuencia de aminoácidos de CSP56 como se muestra en la SEQ ID NO: 19, o una variante biológicamente activa de esa secuencia.

Pueden usarse sondas de polinucleótidos para detector secuencias de polipéptidos marcadores metastásicos, por ejemplo, en protocolos de hibridación, tales como transferencia Northern o Southern o hibridaciones in situ. Las sondas de polinucleótidos comprenden al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30 ó 40 o más nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 18. Las sondas de polinucleótidos pueden comprender un marcador detectable, tal como un marcador radioisotópico, fluorescente, enzimático o quimioluminiscente.

Los polinucleótidos aislados pueden usarse, por ejemplo, como cebadores para obtener copias adicionales de los polinucleótidos o como sondas para detectar mRNA. Los polinucleótidos también pueden usarse para expresar el mRNA de proteína, polipéptidos, variantes biológicamente activas, anticuerpos monocatenarios, ribozimas o proteínas de fusión marcadores metastásicos.

Cualquiera de los polinucleótidos descritos anteriormente puede estar presente en una construcción, tal como una construcción de DNA o RNA. La construcción puede ser un vector y puede usarse para transferir el polinucleótido a una célula, por ejemplo, por propagación del polinucleótido. Las construcciones pueden ser moléculas lineales o circulares. Pueden estar en moléculas autónomamente replicables o en moléculas sin secuencias de replicación, y pueden ser reguladas por sus propias secuencias o por otras secuencias reguladoras, como es conocido en la técnica.

Una construcción también puede ser una construcción de expresión. Una construcción de expresión comprende un promotor que es funcional en una célula hospedante seleccionada. Por ejemplo, el experto puede seleccionar fácilmente un promotor apropiado de un gran número de promotores específicos de tipos celulares conocidos y usados en la técnica. La construcción de expresión también puede contener un terminador de la transcripción que sea funcional en la célula hospedante. La construcción de expresión comprende un segmento de polinucleótido que codifica, por ejemplo, la totalidad o una parte de una proteína, polipéptido, variante biológicamente activa, anticuerpo, ribozima o proteína de fusión marcador metastásico. El segmento polinucleotídico está situado aguas abajo (en dirección 3') del promotor. La transcripción del segmento polinucleotídico se inicia en el promotor. La construcción de expresión puede ser lineal o circular y puede contener secuencias, si se desea, para replicación autónoma.

Los polinucleótidos sub-genómicos pueden propagarse en vectores y líneas celulares usando métodos bien conocidos en la técnica. Los sistemas de expresión en bacterias incluyen los descritos en Chang et al., Nature (1978) 275: 615, Goeddel et al., Nature (1979) 281: 544, Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057, patente europea 36776, patente de EE.UU. 4.551.433, deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 21-25 y Siebenlist et al., Cell (1980) 20: 269.

Los sistemas de expresión en levaduras incluyen los descritos en Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153:163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 142; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132: 3459, Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8: 135; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3376; Patente de EE.UU. 4.837.148, Patente de EE.UU. 4.929.555; Beach and Nurse, Nature (1981) 300: 706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10: 380, Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10: 49, Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112: 284-289; Tilburn et al., Gene (1983) 26: 205-221; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 1470-1474; Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475479; Patente europea 244234 y solicitud de patente WO 91/00357.

La expresión de polinucleótidos sub-genómicos en insectos puede conseguirse como se describe en la patente de EE.UU. 4.745.051, Friesen et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression" en: THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (W. Doerfler, ed.), las patentes europeas 127839 y 155476 y Vlak et al., J. Gen. Virol (1988) 69: 765-776, Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 177, Carbonell et al., Gene (1988) 73: 409, Maeda et al., Nature (1985) 315:592-594, Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 8404, Miyajima et al., Gene (1987) 58: 273; y Martín et al., DNA (1988) 7:99. Numerosas cepas y variantes de baculovirus y las células hospedantes de insectos tolerantes correspondientes de hospedantes se describen en Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6: 47-55, Miller et al, en GENETIC ENGINEERING(Setlow, J.K. et al, eds.), Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279 y Maeda et al., Nature; (1985) 315: 592-594.

La expresión en mamíferos de polinucleótidos sub-genómicos puede conseguirse como ha sido descrito por Dijkema et al., en EMBO J. (1985) 4: 761, Gorman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79: 6777, Boshart et al., Cell (1985) 41: 521 y la patente de EE.UU. 4.399.216. Pueden ser facilitados otros aspectos de la expresión en mamíferos como los descritos por Ham and Wallace, en Meth. Enz. (1979) 58: 44, Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1980) 102: 255 y las patentes de EE.UU.4.767.704, 4.657.866,4.927.762, 4.560.655, las solicitudes de patente WO 90/103430 y WO 87/00195 y la patente de EE.UU. RE 30985.

Los polinucleótidos sub-genómicos pueden ser moléculas lineales o circulares. Pueden estar en moléculas autónomamente replicables o en moléculas sin secuencias de replicación. Pueden estar regulados por sus propias secuencias o por otras secuencias reguladoras, como es conocido en la técnica. Los polinucleótidos sub-genómicos pueden introducirse en células hospedantes adecuadas usando una variedad de métodos que están disponibles en la técnica, tales como transferencia de DNA mediada por transferrina-policatión, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, transferencia de DNA mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex revestidas con DNA, fusión de protoplastos, infección viral; electroporación y transfección mediada por fosfato de calcio.

Los polinucleótidos también pueden ser usados en vehículos suministradores de genes, con la finalidad de suministrar un mRNA u oligonucleótido (bien con la secuencia de un mRNA natural o bien con su complemento), proteína de longitud completa, proteína de fusión, polipéptido o ribozima o anticuerpo monocatenario, en una célula, preferiblemente una célula eucariótica. Un vehículo suministrador de genes puede ser, por ejemplo, DNA plasmídico desnudo, un vector de expresión viral que comprende un polinucleótido o un polinucleótido junto con un liposoma o un agente de condensación.

El vehículo suministrador de genes puede comprender un promotor y uno de los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Los promotores preferidos son promotores específicos de tejidos y promotores que son activados por la proliferación celular, tales como los promotores de timidita-quinasa y timidilato-sintasa. Otros promotores preferidos incluyen promotores que son activables por infección con un virus, tal como los promotores de los interferones \alpha y \beta y promotores que son activables por una hormona, tal como un estrógeno. Otros promotores que pueden usarse incluyen el virus Moloney LTR (long terminal repeat), el promotor de CMV y el promotor de albúmina de ratón.

Un vehículo suministrador de genes puede comprender secuencias virales, tales como un origen viral de replicación o una señal de empaquetamiento. Estas secuencias virales pueden seleccionarse de virus, tales como astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus, retrovirus, togavirus o adenovirus. En una realización preferida, el vehículo suministrador de genes es un vector retroviral recombinante. Los retrovirus recombinantes y sus diversos usos han sido descritos en numerosas referencias, incluyendo, por ejemplo, Mann et al., Cell 33:153, 1983, Cane and Mulligan, Proc. Nat. Acad Sci. USA. 81:6349, 1984, Miller et al., Human Gene Therapy 1:5-14,1990, Patentes de EE.UU. 4.405.712, 4.861.719 y 4.980.289, solicitudes PCT Nº WO 89/02468, WO 89/05349 y WO 90/02806. Puede utilizarse numerosos vehículos suministradores de genes retrovirales, incluyendo, por ejemplo, los descritos en la patente europea 0415731; las solicitudes de patentes internacionales WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; la patente de EE.UU. nº 5.219.740; las solicitudes de patente WO 93/11230; WO 93/10218; Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860-3864, 1993; Vile and Hart, Cancer Res. 53:962-967, 1993; Ram et al., Cancer Res. 53:83-88, 1993; Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33:493-503, 1992; Baba et al., J. Neurosurg. 79:729-735, 1993(Patente de EE.UU. Nº 4.777.127, patente de GB 2.200.651, patente europea 0345242 y la solicitud de patente WO 91/02805).

Los retrovirus particularmente preferidos proceden de los retrovirus que incluyen el virus de la leucosis aviar (ATCC Nº VR 535 y VR-247), el virus de la leucemia bovina (VR-1315), el virus de la leucemia de múridos (MLV), el virus inductor de focos de células de visón (Koch et al., J. Vir. 49:828, 1984; y Oliff et al., J. Vir. 48:542, 1983), el virus del sarcoma de múridos(ATCC Nº VR-844, 45010 y 45016), el virus de la reticuloendoteliosis (ATCC Nº VR-994, VR-770 y 45011), el virus del sarcoma de Rous, el virus de monos de Mason-Pfizer, el virus endógeno de babuinos, los retrovirus de felinos endógenos (por ejemplo, RD114) y secuencias gL30 de ratón o rata usadas como vector retroviral.

Las cepas particularmente preferidas de MLV a partir de las cuales pueden generarse retrovirus recombinantes incluyen 4070A y 1504A (Hartley and Rowe, J. Vir. 19:19, 1976), Abelson (ATCC Nº VR-999), Friend (ATCC Nº VR-245), Graffi (Ru et al., J Vir. 67:4722, 1993; y Yantchev Neoplasma 26:397, 1979), Gross (ATCC Nº VR-590), Kirsten (Albino et al., J. Exp. Med. 164:1710, 1986), virus del sarcoma de Harvey (Manly et al., J. Vir. 62:3540, 1988; y Albino et al., J. Exp. Med. 164:1710, 1986) y Rauscher (ATCC Nº VR-998) y Moloney MLV (ATCC Nº VR-190).

Un retrovirus no de ratón particularmente preferido es el virus del sarcoma de Rous. Los virus del sarcoma de Rous preferidos incluyen los virus Bratislava (Manly et al., J. Vir. 62:3540, 1988; y Albino et al., J. Exp. Med. 164:1710, 1986), Bryan de alto título (por ejemplo, ATCC Nº VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 y VR-728), Bryan estándar (ATCC Nº VR-140), Carr-Zilber (Adgighitov et al., Neoplasma 27:159, 1980), Engelbreth-Holzn (Laurent et al., Biochem Biophys Acta 908:241, 1987), Harris, Prague (por ejemplo, ATCC Nº VR-772 y 45033) y Schmidt-Ruppin (e.g. ATCC Nº VR-724, VR-725, VR-354).

Cualquiera de los retrovirus anteriores puede utilizarse fácilmente para ensamblar o construir vehículos suministradores de genes retrovirales dada la descripción proporcionada en la presente memoria y las técnicas recombinantes estándares (por ejemplo, Sambrook et al., 1989 y Kunkle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:488, 1985) conocidas en la técnica. Las porciones de los vectores de expresión retrovirales pueden proceder de diferentes retrovirus. Por ejemplo, los retrovectores LTR pueden proceder de un virus de sarcoma de múridos, un sitio de unión a tRNA de un virus del sarcoma de Rous, una señal de empaquetamiento de un virus de leucemia de múridos y un origen de la síntesis de la segunda cadena de un virus de la leucosis aviar. Estos vectores retrovirales recombinantes pueden usarse para generar partículas de vectores retrovirales competentes en la transducción introduciéndolos en líneas celulares de empaquetamiento adecuadas (véase la solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie 07/800921, presentada el 29 de noviembre de 1991). Pueden producirse retrovirus recombinantes que dirigen la integración específica en el sitio del genoma retroviral recombinante en regiones específicas del DNA de la célula hospedante. Tal integración específica del sitio puede estar mediada por una integrasa quimérica incorporada en la partícula retroviral (véase la solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie 08/445466 presentada el 22 de mayo de 1995). Es preferible que el vehículo suministrador del gen viral recombinante sea un virus recombinante de replicación defectuosa.

Pueden prepararse fácilmente líneas celulares de empaquetamiento para uso con los vehículos suministradores de genes retrovirales anteriormente descritos (véase la solicitud de patente de EE.UU. Nº de serie 08/240,030, presentada el 9 de mayo de 1994; véase también la solicitud de patente WO 92/05266) y usarse para crear líneas celulares productoras (también denominadas líneas celulares vectoras o "VCL") para la producción de partículas virales recombinantes. Las líneas celulares de empaquetamiento pueden prepararse a partir de líneas celulares humanas (por ejemplo, células HT1080) o células progenitoras de visón, permitiendo con ello la producción de vehículos suministradores de genes retrovirales recombinantes que sean capaces de superar la inactivación en suero humano. La construcción de vehículos suministradores de genes retrovirales recombinantes se describe con detalle en la solicitud de patente WO 91/02805. Estos vehículos suministradores de genes retrovirales recombinantes pueden usarse para generar partículas retrovirales competentes en la transducción introduciéndolas en líneas celulares de empaquetamiento apropiadas. Similarmente, los vehículos suministradores de genes de adenovirus también pueden prepararse y utilizarse fácilmente dada la descripción proporcionada en la presente memoria (véase también Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988 y Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991, y las solicitudes de patentes WO 93/07283, WO 93/06223 y WO 93/07282).

Un vehículo suministrador de genes también puede ser un vehículo suministrador de genes adenovirales recombinantes. Tales vehículos pueden prepararse y utilizarse fácilmente dada la descripción proporcionada en la presente memoria (véase Berkner, Biotechniques 6:616, 1988y Rosenfeld et al., Science 252:431, 1991 y las solicitudes de patentes WO 93/07283, WO 93/06223 y WO 93/07282). Los vehículos suministradores de genes asociados a adenovirus también pueden construirse y usarse para suministrar a células in vitro o in vivo proteínas o polinucleótidos. El uso in vitro de vehículos suministradores de genes asociados a adenovirus se describe en Chatterjee et al., Science 258: 1485-1488 (1992), Walsh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 7257-7261 (1992), Walsh et al., J. Clin. Invest. 94: 1440-1448 (1994), Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993), Ponnazhagan et al., J. Exp. Med. 179: 733-738 (1994), Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:10183-10187 (1994), Einerhand et al., Gene Ther. 2:336-343 (1995), Luo et al., Exp. Hematol. 23: 1261-1267 (1995) y Zhou et al., Gene Therapy 3:223-229 (1996). El uso in vivo de estos vehículos se describe en Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10613-10617 (1993) y Kaplitt et al., Nature Genet. 8:148-153 (1994).

El vehículo suministrador de genes también puede ser un togavirus. Los togavirus preferidos incluyen alfa-virus, en particular los descritos en la solicitud de patente WO 95/07994. Los alfa-virus incluyendo los virus Sindbis y ELVS pueden ser vehículos suministradores de genes para polinucleótidos. Los alfa-virus se describen en las solicitudes de patente WO 94/21792, WO 92/10578 y WO 95/07994. Pueden construirse y usarse diferentes sistemas de vehículos suministradores de genes de alfa-virus para proporcionar polinucleótidos a una célula. Ejemplos representativos de tales sistemas incluyen los descritos en las patentes de EE.UU. 5.091.309 y 5.217.879. Los vehículos suministradores de genes de alfa-virus particularmente preferidos para uso incluyen los que se describen en la solicitud de patente WO 95/07994.

Preferiblemente, el vehículo viral recombinante es un vehículo viral de alfa-virus recombinante basado en un virus Sindbis. Las construcciones de Sindbis, así como numerosas construcciones similares pueden prepararse fácilmente. Los vehículos suministradores de genes virales Sindbis comprenden típicamente una secuencia en 5' capaz de iniciar la transcripción del virus Sindbis, una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas no estructurales de Sindbis, una región de unión viral inactivada de modo que se impida la transcripción de fragmentos, y una secuencia de reconocimiento de RNA-polimerasa de Sindbis. Opcionalmente, la región de unión viral puede modificarse de modo que se reduzca, aumente o mantenga la transcripción de polinucleótidos. Como apreciarán los expertos en la técnica, pueden usarse regiones correspondientes de otros alfa-virus en lugar de las anteriormente descritas.

La región de unión viral de un vehículo suministrador de genes derivado de alfa-virus puede comprender una primera región de unión viral que ha sido inactivada para impedir la transcripción del polinucleótido y una segunda región de unión viral que ha sido modificada, de tal modo que se reduzca la transcripción del polinucleótido. Un vehículo derivado de alfa-virus también puede incluir un promotor en 5' capaz de iniciar la síntesis de RNA viral a partir de cDNA y una secuencia en 3' que controla la terminación de la transcripción.

Otros vehículos suministradores de genes togavirales recombinantes que pueden utilizarse en la presente invención incluyen los derivados del virus Semliki Forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), el virus Middleberg (ATCC VR-370), el virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), el virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532) y los descritos en las patentes de EE.UU. nº 5.091.309 y 5.217.879 y en la solicitud de patente WO 92/10578. Los vehículos Sindbis antes descritos, así como numerosas construcciones similares pueden prepararse fácilmente.

Otros vehículos suministradores de genes virales adecuados para uso incluyen, por ejemplo, los derivados de poliovirus (Evans et al., Nature 339:385, 1989 y Sabin et al., J. Biol. Standardization 1:115, 1973) (ATCC VR-58); rinovirus (Arnold et al., J. Cell. Biochem. L401, 1990) (ATCC VR-1110); virus de la viruela, tal como virus de la viruela del canario o de la viruela vacuna (Fisher-Hoch et al., PROC. NATL. ACD. SCI. U.S.A. 86:317, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad Sci. 569:86,1989; Flexner et al., Vaccine 8:17, 1990; Patentes de EE.UU. 4.603.112 y 4,769.330; solicitud de patente WO 89/01973) (ATCC VR-111; ATCC VR-2010); SV40 (Mulligan et al., Nature 277:108, 1979) (ATCC VR-305), (Madzak et al., J. Gen. Vir. 73:1533, 1992); virus de la gripe (Luytjes et al., Cell 59:1107, 1989; McMicheal et al., The New England Journal of Medicine 309:13, 1983; y Yap et al., Nature 273:238, 1978)(ATCC VR-797); parvovirus, tales como virus adenoasociados (Samulski et al., J. Vir. 63:3822, 1989 y Mendelson et al., Virology 166:154, 1988) (ATCC VR-645); virus herpes simple (Kit et al., Adv. Exp. Med. Biol. 215:219,1989)(ATCC VR-977; ATCC VR-260); Nature 277: 108, 1979); virus de la inmunodeficiencia humana (Patente europea 386882, Buchschacher et al., J. Vir: 66:2731,1992); virus de paperas (patente europea 440219) (ATCC VR-24); A (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), Aura (ATCC -VR-368), virus Bebaru (ATCC VR-600; ATCC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), virus Chikungunya (ATCC VR-64; ATCC VR-1241), Fort Morgan (ATCC VR-924), virus Getah (ATCC VR-369; ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), virus Mucambo (ATCC VR-580; ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), virus Pixuna (ATCC VR-372; ATCC VR-1245), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), Whataroa (ATCC VR-926), Y-62-33 (ATCC VR-375), virus O'Nyong, virus de la encefalitis oriental (ATCC VR-65; ATCC VR-1242), virus de la encefalitis occidental (ATCC VR-70; ATCC VR-1251; ATCC VR-622; ATCC VR-1252) y coronavirus. (Harnre et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 121:190,1966) (ATCC VR-740).

Un polinucleótido también puede combinarse con un agente de condensación para formar un vehículo suministrador de genes. El agente de condensación puede ser un policatión, tal como polilisina, poliarginina, poliornitina, protamina, espermina, espermidina y putrescina. Muchos métodos adecuados para preparar dichas uniones son conocidos en la técnica.

Alternativamente, se asocia un polinucleótido con un liposoma para formar un vehículo suministrador de genes. Los liposomas son pequeñas vesículas lipídicas constituidas por un compartimento acuoso rodeado por una bicapa lipídica, típicamente estructuras esféricas o ligeramente alargada de varios cientos de Amgstroms de diámetro. En condiciones apropiadas, un liposoma puede fusionarse con una membrana del plasma de una célula o con la membrana de una vesícula endocítica dentro de una célula que ha internalizado el liposoma, con lo cual libera su contenido en el citoplasma. Antes de la interacción con la superficie de una célula, sin embargo, la membrana del liposoma actúa como una barrera relativamente impermeable que secuestra y protege su contenido, por ejemplo, de enzimas degradantes.

Debido a que el liposoma es una estructura sintética, se pueden producir liposomas especialmente diseñados que incorporan aspectos deseados. Véase Stryer, Biochemistry, pp. 236-240, 1975 (W.H. Freeman, San Francisco, CA); Szoka et al., Biochim. Biophys. Acta 600:1,1980; Bayer et al., Biochirn. Biophys. Acta. 550:464,1979; Rivnay et al., Meth. Enzymol. 149:119, 1987; Wang et al, Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A. 84:7851, 1987; Plant et al., Anal. Biochem. 176:420, 1989 y la patente de EE.UU. 4.762.915. Los liposomas pueden encapsular una variedad de moléculas de ácidos nucleicos incluyendo DNA, RNA, plásmidos y construcciones de expresión que comprenden polinucleótidos.

Las preparaciones de liposomas incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras. Los liposomas catiónicos han mostrado que median el suministro intracelular de DNA plasmídico (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416, 1987), mRNA (Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081,1989) y factores de transcripción purificados (Debs et al., J. Biol. Chem. 265:10189-10192, 1990), en forma funcional. Los liposomas catiónicos están fácilmente disponibles. Por ejemplo, los liposomas de N-[1,2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOIMA) están disponibles con la marca comercial Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand lsland, NY. Véase también Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5148-5152.87, 1994. Otros liposomas comercialmente disponibles incluyen Transfectase (DDAB/DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Otros liposomas catiónicos pueden prepararse a partir de materiales fácilmente asequibles usando métodos bien conocidos en la técnica. Véase,por ejemplo, Szoka et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 75:4194-4198, 1978; y la solicitud de patente WO 90/11092 para descripciones de la síntesis de liposomas DOTAP (1,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano).

Similarmente, los liposomas aniónicos y neutros están fácilmente disponibles, tal como en la compañía Avanti Polar Lipids (Birmingharm, AL), o pueden prepararse fácilmente usando materiales fácilmente asequibles. Dichos materiales incluyen fosfatidil-colina, colesterol, fosfatidil-etanolamina, dioleoil-fosfatidil-colina (DOPC), dioleoil-fosfatidil-glicerol (DOPG), dioleoil-fosfatidil-etanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales también pueden mezclarse con los materiales de partida de DOTMA y DOTAP en relaciones apropiadas. Los métodos para preparar liposomas usando estos materiales son bien conocidos en la técnica.

Los liposomas pueden comprender vesículas multilaminares (MLV), pequeñas vesículas unilaminares (SUV) o grandes vesículas unilaminares (LUV). Los diversos complejos liposoma-ácido nucleico se preparan usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Straubinger et al., METHODS OF IMMUNOLOGY (1983), Vol. 101, pp. 512-527; Szoka et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 87:3410-3414, 1990; Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta 394:483, 1975; Wilson et al., Cell 17:77, 1979; Deamer and Bangham, Biochim. Biophys Acta 443:629, 1976; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836, 1977; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348, 1979; Enoch and Strittmatter, Proc. Natl. Acad Sc.: USA 75:145,1979; Fraley et al., J. Biol. Chem. 255:10431, 1980; Szoka and Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145, 1979; y Schaefer-Ridder et al., Science 215:166, 1982.

Además, las lipoproteínas pueden incluir un polinucleótido para suministrar a una célula. Ejemplos de dichas lipoproteínas incluyen quilomicrones, HDL, IDL, LDL y VLDL. También pueden usarse mutantes, fragmentos o fusiones de estas proteínas. También pueden usarse modificaciones de lipoproteínas de origen natural, tales como LDL acetiladas. Estas lipoproteínas pueden dirigir el suministro de oligonucleótidos a células dianas que expresan receptores de lipoproteínas. Preferiblemente, si las lipoproteínas incluyen un polinucleótido, no está incluido en la composición ningún otro ligando para dirigir a la célula diana.

Pueden usarse moléculas de polinucleótidos desnudas como vehículos suministradores de genes, como se describe en la solicitud de patente WO 90/11092 y la patente de EE.UU. nº 5.580.859. Dichos vehículos suministradores de genes pueden ser DNA o RNA y pueden estar unidos a adenovirus muertos. Curiel et al, Hum. Gene. Ther. 3:147-154, 1992. Otros vehículos adecuados incluyen DNA-ligando (Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989), combinaciones de lípido-DNA (Feigner et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 84:7413-7417, 1989), liposomas (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7851-7855, 1987) y microproyectiles (Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2726-2730, 1991).

Se puede aumentar la eficacia de la absorción de polinucleótido desnudo en las células revistiendo los polinucleótidos sobre perlas de látex biodegradables. Este método tiene la ventaja de la observación de que las perlas de látex, cuando se incuban con células en cultivos, se transportan eficazmente y se concentran en la región perinuclear de las células. Las perlas serán transportadas dentro de las células cuando se inyectan en el músculo. Las perlas de látex revestidas con polinucleótidos serán transportadas eficazmente al interior de las células después de que se inicia la endocitosis por las perlas de látex y aumentará por tanto la transferencia de genes y la eficacia de la expresión. Este método se puede mejorar más tratando las perlas para aumentar su hidrofobicidad, con lo cual se facilita la ruptura del endosoma y la liberación de los polinucleótidos en el citoplasma.

La invención proporciona un método de detectar la expresión de genes marcadores metastásicos en una muestra biológica, tal como una muestra de tejido de mama o de colon. La detección de la expresión de genes marcadores metastásicos es útil, por ejemplo, para identificar tejido metastásico e identificar el potencial metastásico de un tejido, para identificar pacientes que tienen el riesgo de desarrollar cánceres metastásicos en otros órganos del cuerpo.

La muestra de tejido puede ser, por ejemplo, un tejido sólido o una muestra de fluido. La proteína o los productos de expresión de ácidos nucleicos pueden detectarse en la muestra de tejido. En una realización, en la muestra de tejido se analiza la presencia de proteínas marcadoras metastásicas. La proteína marcadora metastásica tiene una secuencia codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 18 y puede detectarse usando anticuerpos específicos de las proteínas marcadoras metastásicas. Los anticuerpos pueden estar marcados, por ejemplo, con un marcador radiactivo, fluorescente, biotinilado o enzimático y detectarse directamente, o pueden detectarse usando métodos inmunoquímicos indirectos, usando un anticuerpo secundario marcado. La presencia de proteínas marcadoras metastásicas puede analizarse, por ejemplo, en secciones de tejidos por inmunocitoquímica, o en lisados, usando transferencia Western. como es conocido en la técnica.

En otra realización, en la muestra de tejido se analiza la presencia de mRNA de proteínas marcadoras metastásicas. El mRNA de proteínas marcadoras metastásicas puede detectarse por hibridación in situ en secciones de tejidos o en manchas de transferencias de Northern que contienen poli A + mRNA. Las sondas específicas de proteínas marcadoras metastásicas pueden generarse usando la secuencia de cDNA SEQ ID NO: 18. Las sondas tienen preferiblemente una longitud de 15 a 50 nucleótidos, aunque pueden tener una longitud de 8, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 60, 75 ó 100 nucleótidos. Las sondas pueden sintetizarse químicamente o pueden generarse a partir de polinucleótidos más largos usando enzimas de restricción. Las sondas pueden estar marcadas, por ejemplo, con un marcador radiactivo, biotinilado o fluorescente. Si se desea, la muestra de tejido puede ser sometida a un proceso de amplificación de ácidos nucleicos.

Una muestra de tejido en la cual se detecta el producto de expresión del polinucleótido de la SEQ. ID NO: 18 se identifica como metastásica o como poseedora de potencial metastásico.

Opcionalmente, puede cuantificarse el nivel de un producto de expresión marcador metastásico particular en una muestra de tejido. La cuantificación puede realizarse, por ejemplo, comparando el nivel de producto de expresión detectado en la muestra de tejido con las cantidades de producto presente en una curva patrón. La comparación puede hacerse visualmente o usando una técnica, tal como densitometría, con o sin ayuda de ordenador. Para uso como control, las muestras de tejido pueden aislarse de otros seres humanos, otros órganos no cancerosos del paciente que ésta siendo analizado o preferiblemente cáncer de mama o de colon no metastásico del paciente que está siendo analizado.

Los polinucleótidos que codifican reactivos específicos de marcadores metastásicos, tales como anticuerpos y sondas de nucleótidos, pueden suministrarse en un kit para detectarlos en una muestra biológica. El kit también puede contener tampones o componentes de marcado, así como instrucciones para usar los reactivos para detectar los productos de expresión marcadores metastásicos en la muestra biológica.

La expresión de genes marcadores metastásicos en una célula puede aumentarse o disminuirse, según se desee. La expresión de genes marcadores metastásicos puede ser alterada para fines terapéuticos, como se describe más adelante, o puede usarse para identificar agentes terapéuticos.

La expresión de un gen marcador metastásico cuya expresión está sobre-regulada en un cáncer metastásico puede ser disminuida usando una ribozima, que es una molécula de RNA con actividad catalítica. Véase, por ejemplo, Cech, 1987, Science 236: 1532-1539; Cech, 1990, Ann. Rev. Biochern. 59:543-568; Cech, 1992, Curr. Opin. Struct, Biol. 2:605-609; Couture and Stinchcomb, 1996, Trends Genet. 12: 510-515. Las ribozimas pueden usarse para inhibir la función de un gen escindiendo una secuencia de RNA, como es conocido en la técnica (por ejemplo, Haseloff et al., patente de EE.UU. nº 5.641.673).

La secuencia codificadora de los genes marcadores metastásicos puede usarse para generar una ribozima que se unirá específicamente a mRNA transcrito de un gen marcador metastásico. Se han desarrollado y descrito en la técnica métodos para diseñar y construir ribozimas que puedan escindir otras moléculas de RNA en trans de una manera altamente específica (véase Haseloff et al., (1988), Nature 334:585-591). Por ejemplo, la actividad de escisión de las ribozimas puede ser dirigida a los RNA diana específicos manipulando por ingeniería genética una región de "hibridación" aislada en la ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia complementaria al RNA diana y por tanto se hibrida específicamente con la diana (véase, por ejemplo, Gerlach et al., Patente europea 321201). Pueden usarse secuencias complementarias más largas para aumentar la afinidad de la secuencia de hibridación por la diana. Las regiones de hibridación y de escisión de la ribozima pueden estar integralmente relacionadas; por tanto, por hibridación al RNA diana a través de las regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima puede escindir la diana.

Las ribozimas pueden introducirse en células como parte de una construcción de DNA, como es conocido en la técnica. La construcción de DNA también puede incluir elementos reguladores de la transcripción, tal como un elemento promotor, un potenciador o un elemento UAS, y una señal de terminación de la transcripción, para controlar la transcripción de la ribozima en las células.

Pueden usarse métodos mecánicos, tales como microinyección, transfección mediada por liposomas, electroporación o precipitación con fosfato de calcio para introducir la construcción de DNA que contiene la ribozima en las células cuya división se desea disminuir, como se ha descrito antes. Alternativamente, si se desea que la construcción de DNA sea retenida establemente por las células, la construcción de DNA puede suministrarse en un plásmido y mantenerse como un elemento separado o integrado en el genoma de las células, como es conocido en la técnica.

Como se enseña en la patente de EE.UU. nº 5.641.673 de Haseloff et al., la ribozima puede ser manipulada por ingeniería genética para que su expresión ocurra en respuesta a factores que inducen la expresión de los genes marcadores metastásicos. La ribozima también puede ser manipulada por ingeniería genética para proporcionar un nivel adicional de regulación, de modo que la destrucción del mRNA ocurra solamente cuando están inducidos en la célula tanto la ribozima como los genes marcadores metastásicos.

La expresión de los genes marcadores metastásicos también puede alterarse usando una secuencia de oligonucleótidos antisentido. La secuencia antisentido es complementaria de al menos una porción de la secuencia codificadora de un gen marcador metastásico que tenga la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 18. El complemento de la secuencia de nucleótidos mostrado en la SEQ ID NO: 18 consiste en una secuencia de nucleótidos contigua que forma pares de bases de Watson-Crick con la secuencia de nucleótidos contigua mostrada en SEQ ID NO: 18.

Preferiblemente, la secuencia de oligonucleótidos antisentido tiene una longitud de al menos seis nucleótidos, pero puede tener una longitud de aproximadamente 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos. También pueden usarse secuencias más largas. Las moléculas de oligonucleótidos antisentido pueden proporcionarse en una construcción de DNA e introducirse en células cuya división ha de ser disminuida, como se ha descrito anteriormente.

Los oligonucleótidos antisentido pueden estar compuestos de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse manualmente o por un sintetizador automatizado, uniendo covalentemente el extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido con uniones no fosfodiéster internucleotídicas, tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres fosfato, carbamatos, acetamidato, ésteres carboximetílicos, carbonatos y triésteres fosfato. Véase Brown, 1994, Meth. Mol. Biol. 20:1-8; Sonveaux, 1994, Meth. Mol. Biol. 26:1-72; Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-583.

No se requiere complementariedad exacta para la formación satisfactoria de dúplex entre una molécula antisentido y la secuencia codificadora complementaria de un gen marcador metastásico. Las moléculas antisentido que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5 o más tramos de nucleótidos contiguos que son exactamente complementarios de una porción de una secuencia codificadora de un gen marcador metastásico, separada cada una por un tramo de nucleótidos contiguos que no son complementarios de secuencias codificadoras adyacentes, pueden proporcionar la especificidad de dirección al mRNA diana de un gen marcador metastásico. Preferiblemente, cada tramo de nucleótidos contiguos tiene al menos una longitud de 4, 5, 6, 7 u 8 o más nucleótidos. Las secuencias intercalantes no complementarias tienen preferiblemente una longitud de 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos. Un experto en la técnica puede usar fácilmente el punto de fusión calculado de un par antisentido-sentido para determinar el grado de desapareamiento que será tolerado entre un oligonucleótido antisentido particular y una secuencia codificadora del gen marcador metastásico particular.

Los oligonucleótidos antisentido pueden modificarse sin alterar su capacidad para hibridarse a una secuencia codificadora de una proteína marcadora metastásica. Estas modificaciones pueden ser internas en uno o ambos extremos de la molécula antisentido. Por ejemplo, las uniones fosfato internucleosídicas pueden modificarse añadiendo restos de colesterilo o diamina con números variables de residuos de carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal. Las bases y/o los azúcares modificados, tales como arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido 3',5'-sustituido en el cual están sustituidos el grupo 3'-hidroxilo o el grupo 5'-fosfato, también pueden emplearse en un oligonucleótido antisentido modificado. Estos oligonucleótidos modificados pueden prepararse por métodos bien conocidos en la técnica. Agrawal et al., 1992, Trends Biotechnol. 10:152-158; Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Uhlmann et al., 1987, Tetrahedron. Lett. 215:3539-3542.

Los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína marcadora metastásica también pueden usarse para alterar la expresión del gen marcador metastásico. Los anticuerpos específicos se unen a proteínas marcadoras metastásicas e impiden que la proteína actúe en la célula. Los polinucleótidos que codifican anticuerpos específicos pueden introducirse en las células, como se ha descrito anteriormente.

Para aumentar la expresión de genes marcadores metastásicos que son sub-regulados en células metastásicas, pueden introducirse en una célula la totalidad o una porción de un gen o producto de expresión marcador metastásico. Opcionalmente, el gen o producto de expresión puede ser un componente de una composición terapéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable (véase más adelante). La secuencia codificadora completa puede introducirse, como se ha descrito antes. Alternativamente, puede introducirse en la célula una porción de la proteína marcadora metastásica o una secuencia de nucleótidos que la codifica.

La expresión de genes marcadores metastásicos endógenos en una célula puede también alterarse introduciendo en marco de lectura con los genes marcadores metastásicos endógenos una construcción de DNA que comprende una secuencia dirigida a la proteína marcadora metastásica diana, una secuencia reguladora, un exón y un sitio donador de empalme no apareado por recombinación homóloga, tal que se forme una célula homólogamente recombinante que comprenda la construcción de DNA. La nueva unidad de transcripción puede usarse para activar o desactivar los genes marcadores metastásicos según se desee. Este método de afectar a la expresión endógena de los genes se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.641.670.

La secuencia dirigida a la diana es un segmento de al menos 10, 12, 15, 20 ó 50 nucleótidos contiguos seleccionada de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 18. La unidad de transcripción está situada aguas arriba (en dirección 5'), de una secuencia codificadora del gen endógeno de la proteína marcadora metastásica. La secuencia reguladora exógena dirige la transcripción de la secuencia codificadora de los genes marcadores metastásicos.

La expresión de las proteínas marcadoras metastásicas puede usarse para escrutar fármacos que tengan un efecto terapéutico anti-metastásico. El efecto de un compuesto de ensayo sobre la síntesis de la proteína marcadora metastásica también puede usarse para identificar compuestos de ensayo que modulan la metástasis. La síntesis de proteínas marcadoras metastásicas en una muestra biológica, tal como un cultivo celular, muestra de tejido o un homogeneizado libre de células, puede ser medida por cualquier medio para medir la síntesis de proteínas conocido en la técnica, tal como incorporación de aminoácidos marcados en proteínas y detección de proteínas marcadoras metastásicas marcadas en un gel de poliacrilamida. La cantidad de proteínas marcadoras metastásicas puede detectarse por ejemplo, usando, anticuerpos específicos de proteínas marcadoras metastásicas en transferencias Western. La cantidad de proteínas marcadoras metastásicas sintetizada en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo puede determinarse por cualquier medio conocido en la técnica, tal como comparación de la cantidad de proteína marcadora metastásica sintetizada con la cantidad de proteínas marcadoras metastásicas presentes en una curva
patrón.

El efecto de un compuesto de ensayo sobre la síntesis de proteínas marcadoras metastásicas también puede medirse por análisis de transferencia Northern, midiendo la cantidad de expresión de mRNA de las proteínas marcadoras metastásicas en respuesta al compuesto de ensayo usando sondas de nucleótidos específicas de proteínas marcadoras metastásicas, como es conocido en la técnica. Un compuesto de ensayo que disminuye la síntesis de una proteína marcadora metastásica codificada por el polinucleótido de la SEQ ID NO: 18 se identifica como un posible agente terapéutico.

Típicamente, una muestra biológica, tal como una muestra de mama o de colon, se pone en contacto con un intervalo de concentraciones del compuesto de ensayo, tales como 1,0 nM, 5,0 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 mM, 10 mM, 50 mM, y 100 mM. Preferiblemente, el compuesto de ensayo aumenta o disminuye la expresión de una proteína marcadora metastásica en 60%, 75% u 80%. Más preferiblemente, se consigue un aumento o disminución de 85%, 90%, 95% ó 98%.

Las composiciones terapéuticas para aumentar o disminuir la expresión de proteínas marcadoras metastásicas se describen como apropiadas. Las composiciones terapéuticas para aumentar la expresión de genes marcadores metastásicos son deseables para marcadores metastásicos sub-regulados. Estas comprenden polinucleótidos que codifican la totalidad o una porción del producto de expresión de genes de proteínas marcadoras metastásicas. Preferiblemente, la composición terapéutica contiene una construcción de expresión que comprende un promotor y un segmento de polinucleótido que codifica al menos seis aminoácidos contiguos de la proteína marcadora metastásica. Dentro de la construcción de expresión, el segmento de polinucleótido está situado aguas abajo (en dirección 3') desde el promotor y la transcripción del segmento de polinucleótidos se inicia en el promotor.

Se desea la disminución de la expresión de genes marcadores metastásicos en condiciones en las cuales el gen marcador metastásico está sobre-regulado en cáncer metastásico. Las composiciones terapéuticas para tratar estos trastornos comprenden un polinucleótido que codifica un reactivo que se une específicamente a un producto de expresión de una proteína marcadora metastásica, como se describe en la presente memoria.

Las composiciones terapéuticas marcadoras metastásicas también comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales vehículos incluyen, pero sin limitación, macromoléculas grandes lentamente metabolizadas, tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos) poli(ácidos glicólicos), aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. También pueden usarse en la composición sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos o sulfatos, así como las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos o benzoatos.

Las composiciones terapéuticas también pueden contener líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol y etanol, así como sustancias, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes o agentes tamponadores del pH. Los liposomas, tales como los descritos en la patente de EE.UU. nº 5.422.120, las solicitudes de patentes WO 95/13796, WO 91/14445 o la patente europea 524968 B1, también pueden usarse como un vehículo para la composición terapéutica.

Típicamente, una composición marcadora metastásica terapéutica se prepara en forma de una preparación inyectable, bien sea como una solución o suspensión líquida; sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para poner en solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. Una composición marcadora metastásica también puede formularse en comprimidos con revestimiento entérico o cápsula de gel de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en la patente de EE.UU. 4.853.230, la patente europea 225189 y las patentes austriacas 9.224.296 y 9.230.801.

La administración de los agentes terapéuticos marcadores metastásicos puede incluir administración local o general, incluyendo inyección, administración oral, pulverización de partículas o administración cateterizada y administración tópica. Pueden usarse diversos métodos para administrar una composición marcadora metastásica directamente a un sitio específico del cuerpo.

Para tratamiento de tumores, por ejemplo, puede localizarse un pequeño tumor o lesión metastásica e inyectarse varias veces una composición marcadora metastásica terapéutica en diferentes zonas dentro del cuerpo del tumor. Alternativamente, pueden identificarse las arterias que alimentan un tumor e inyectarse una composición terapéutica en dicha arteria, con el fin de suministrar la composición directamente al tumor.

Un tumor que tiene un centro necrótico puede aspirarse y la composición inyectarse directamente en el centro vacío del tumor. Una composición marcadora metastásica terapéutica puede administrarse directamente a la superficie de un tumor, por ejemplo, por aplicación tópica de la composición. Puede usarse formación de imágenes por rayos X para ayudar en algunos de los métodos de administración anteriores. Pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente agentes terapéuticos combinados, incluyendo proteína, polipéptido o polinucleótido sub-genómico marcador metastásico y otros agentes terapéuticos.

Puede usarse administración dirigida a la diana por receptores para administrar composiciones terapéuticas que contienen polinucleótidos sub-genómicos, proteínas o reactivos, tales como anticuerpos, ribozimas u oligonucleótidos antisentido para tejidos específicos. Las técnicas de administración mediada por receptores se describen, por ejemplo, en Findeis et al. (1993), Trends in Biotechnol. 11, 202-05; Chiou et al. (1994), GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J. A. Wolff, ed.); Wu & Wu (1988), J. Biol. Chem. 263, 621-24; Wu et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 542-46; Zenke et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655-59; Wu et. al. (1991), J. Biol. Chem. 266, 338-42.

Alternativamente, una composición marcadora metastásica terapéutica puede introducirse ex vivo en células humanas y luego las células se vuelven a introducir en seres humanos. Las células pueden retirarse de una variedad de lugares incluyendo, por ejemplo, un tumor seleccionado o un órgano afectado. Además, una composición terapéutica puede insertarse en, por ejemplo, fibroblastos dérmicos o leucocitos de sangre periférica no afectados. Si se desea, también pueden ser retiradas específicamente de la sangre fracciones particulares de células tales como un sub-conjunto de células T o células madres (véase, por ejemplo, la solicitud PCT WO 91/16116). Las células retiradas pueden luego ponerse en contacto con una composición marcadora metastásica terapéutica utilizando cualquiera de las técnicas anteriormente descritas, seguido por la devolución de las células al ser humano, preferiblemente en, o dentro de, la proximidad de un tumor u otro sitio que haya de tratarse. Los métodos antes descritos pueden comprender adicionalmente las etapas de empobrecimiento de fibroblastos u otras células tumorales no contaminantes después de retirar las células tumorales de un ser humano y/o la etapa de inactivación de las células, por ejemplo, por
irradiación.

Tanto la dosis de una composición marcadora metastásica como el medio de administración pueden determinarse basándose en las características específicas de la composición terapéutica, el estado, la edad y el peso del paciente, la evolución de la enfermedad y otros factores relevantes. Preferiblemente, una composición terapéutica aumenta o disminuye la expresión de los genes marcadores metastásicos en 50%, 60%, 70% u 80%. Más preferiblemente, la expresión de los genes marcadores metastásicos aumenta o disminuye en 90%, 95%, 99% o 100%. La eficacia del mecanismo elegido para alterar la expresión de los genes marcadores metastásicos puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como hibridación de sondas de nucleótidos con mRNA de los genes marcadores metastásicos, RT-PCR cuantitativa, o detección de proteínas marcadoras metastásicas usando anticuerpos
específicos.

Si la composición contiene proteínas, polipéptido o anticuerpos marcadores metastásicos, las dosis eficaces de la composición están en el intervalo de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50 \mug/kg de peso corporal del paciente, aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 500 \mug/kg de peso corporal del paciente, y aproximadamente 200 a aproximadamente 250 \mug/kg.

Las composiciones terapéuticas que contienen polinucleótidos sub-genómicos marcadores metastásicos pueden administrarse en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de DNA para administración local en un protocolo de terapia de genes. También pueden usarse durante un protocolo de terapia de genes intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg,aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 2 mg, aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 500 \mug y aproximadamente 20 \mug a aproximadamente 100 \mug de DNA. Factores tales como el método de acción y la eficacia de la transformación y expresión son consideraciones que afectarán a la dosificación requerida para la eficacia última de los polinucleótidos sub-genómicos de las proteínas marcadoras metastásicas. Cuando se desee una mayor expresión sobre una zona mayor de tejido, pueden requerirse mayores cantidades de polinucleótidos sub-genómicos de las proteínas marcadoras metastásicas o las mismas cantidades readministradas en un protocolo sucesivo de administraciones, o varias administraciones a diferentes porciones de tejido adyacentes o próximas, por ejemplo, un sitio tumoral para obtener un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación habitual en ensayos clínicos determinará los intervalos específicos para conseguir un efecto terapéutico óptimo.

Los polinucleótidos sub-genómicos marcadores metastásicos también pueden usarse en disposiciones ordenadas (arrays) de polinucleótidos. Las disposiciones ordenadas de polinucleótidos proporcionan una técnica de alto rendimiento que puede analizar un gran número de secuencias de polinucleótidos en una sola muestra. Esta tecnología puede usarse, por ejemplo, como una herramienta de diagnóstico, para identificar lesiones metastásicas o para valorar el potencial metastásico de un tumor.

Para crear disposiciones ordenadas, se pueden colocar como manchas sondas de polinucleótidos monocatenarios sobre un sustrato en una matriz o disposición ordenada bidimensional. Cada sonda de polinucleótido monocatenario puede comprender al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ó 30 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18. Las disposiciones ordenadas preferidas comprenden al menos una sonda de polinucleótido monocatenario que contiene al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 ó 30 o más nucleótidos contiguos seleccionados de la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18.

El sustrato puede ser cualquier sustrato al que se puedan unir las sondas de polinucleótidos, incluyendo, pero sin limitación, vidrio, nitrocelulosa, silicona y nilón. Las sondas de polinucleótidos puede unirse al sustrato por enlaces covalentes o por interacciones no específicas, tales como interacciones hidrófobas. Las técnicas para construir disposiciones ordenadas y los métodos para usar estas disposiciones ordenadas se describen en las siguientes patentes y solicitudes de patentes EP Nº 0799897; PCT Nº WO 97/29212; PCT Nº WO 97/27317; EP Nº 0785280; PCT Nº WO 97/02357; EE.UU. Nº 5.593.839; 5.578.832; EP Nº 0728520; EE.UU. Nº 5.599.695; EP Nº 0721016; EE.UU. Nº 5.556.752; PCT Nº WO 95/22058; y EE.UU. Nº 5.631.734. También pueden usarse disposiciones ordenadas de polinucleótidos comercialmente disponibles, tales como Affymetrix GeneChip®. El uso de GeneChip® para detectar la expresión de genes se describe, por ejemplo, en Lockhart et al., Nature Biotechnology 14:1675(1996); Chee et al., Science 274:610 (1996); Hacia et al., Nature Genetics 14:441, 1996; y Kozal et al., Nature Medicine 2:753,
1996.

Las muestras de tejidos que se sospecha que son metastásicas o cuyo potencial metastásico es desconocido pueden tratarse para formar polinucleótidos monocatenarios, por ejemplo por calentamiento o por desnaturalización química, como es conocido en la técnica. Los polinucleótidos monocatenarios de la muestra de tejido pueden ser marcados e hibridados a las sondas de polinucleótidos en la disposición ordenada. Los marcadores detectables que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, marcadores radiactivos, marcadores biotinilados, fluoróforos y marcadores quimioluminescentes. Los polinucleótidos bicatenarios, que comprenden los polinucleótidos de la muestra marcada unida a las sondas de polinucleótidos pueden detectarse una vez que la porción no unida de la muestra es eliminada por lavado. La detección puede ser visual o ayudada por ordenador.

La detección de un polinucleótido bicatenario que comprende nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 18 identifica la muestra de tejido como metastásica o como poseedora de potencial metastásico.

La exposición anterior describe generalmente la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más completa en los ejemplos específicos siguientes que se proporcionan en la presente memoria sólo con fines de ilustración y no han de entenderse como limitativos del alcance de la invención.

Métodos experimentales

En los ejemplos siguientes se usaron los siguientes materiales y métodos.

Líneas celulares: Las líneas celulares MCF-7, BR-3, BT-20, ZR-75-1, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MDA-MB-435, MDA-MB-453, MDA-MB-468, Alab y Hs578Bst se obtuvieron de American Type Culture Collection. Todas las líneas celulares se cultivaron de acuerdo con sus especificaciones.

Presentación diferencial: La presentación diferencial se realizó usando el kit de perfil de mRNA Hieroglyph de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Genomyx Corp., Foster City, CA). Se usaron un total de 200 pares de cebadores para perfilar la expresión génica. Después de la amplificación de los mRNA cebados al azar por la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), los productos de cDNA se separaron en geles de tipo de secuenciación al 6% usando un secuenciador GenomyxLR (Genomyx Corp.). Los geles secos se expusieron a una película Kodak XAR-2 (Kodak, Rochester, NY) durantes diversos tiempos.

Los fragmentos de cDNA diferencialmente expresados se escindieron y reamplificaron de acuerdo con la instrucciones del fabricante (Genomyx Corp.). Debido a que una rebanada de gel escindida del gel contiene de 1 a 3 fragmentos de cDNA del mismo tamaño (Martín et al., BioTechniques 24, 1018-26, 1998; Giese et al., Differential Display, Academic Press, 1998), los productos reamplificados se separaron por geles de polimorfismo de confirmación de una sola cadena como se describe en (Mathieu-Dande et al., Nucl. Acids Res. 24, 1504-07,1996) y se secuenciaron directamente usando los cebadores M13 universal y T7.

Construcción y escrutinio de una genoteca de cDNA de células estromales de médula ósea humana. Se aisló RNA de células estromales de médula ósea humana (Poietic Technologies, Inc., Germantown, MD) usando un protocolo de extracción con tiocianato de guanidinio/fenol-cloroformo (Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294-99, 1979). El RNA de Poli(A)^{+} se aisló usando columnas giratorias de oligo-dT (Stratagene, La Jolla, CA). La primera y segunda síntesis de cadena se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia, Piscataway, NJ).El cDNA bicatenario se ligó al vector fagémido pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA). Se escrutaron aproximadamente, 1 x 10^{6} placas usando un fragmento de cDNA de CSP56 de 1,2 kb. El DNA plasmídico de clones positivos se obtuvo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La exactitud de la secuencia de nucleótidos se determinó por secuenciación de doble cadena.

Análisis por transferencia Northern y RT-PCR. Las transferencias Northern que contenían RNA de poli(A)^{+} preparadas de varios tejidos tumorales y normales humanos se adquirieron a ClonTech (Palo Alto, CA) y Biochain Institute (San Leandro, CA). Las demás transferencias Northern se prepararon usando 20 a 30 \mug de RNA total aislado por un protocolo de extracción con tiocianato de guanidinio /fenol-cloroformo (Chirgwin et al., 1979) de diferentes líneas celulares humanas normales y de cáncer de mama. Las transferencias Northern se hibridaron a 65ºC en Express-hyb (ClonTech).

La RT-PCR se realizó usando el kit de PCR para RNA con transcriptasa inversa (Perkin-Elmer, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Hibridación in situ. La hibridación in situ se realizó en tejidos humanos, congelados inmediatamente después de su extracción quirúrgica y corte criógeno a 10 \mum, siguiendo el protocolo de Pfaff et al., Cell 84, 309-20, 1996. Se generaron ribosondas marcadas con digoxigenina-UTP usando como molde el DNA de plásmido que contenía CSPS6. Para la generación de la sonda antisentido, el DNA se linealizó con EcoRI (aproximadamente un transcrito de 1 kb) o Ncol (transcrito de longitud completa) y se transcribió con T3-polimerasa. Para el control del sentido, el DNA se linealizó con Xhol (transcrito de longitud completa) y se transcribió con T7-polimerasa. Las sondas hibridadas se detectaron con anticuerpos anti-digoxigenina acoplados a fosfatasa alcalina usando púrpura BM como sustrato (Boehringer Mannheim).

Crecimiento de tumor en la mama adiposa de ratones inmunodeficientes. Se anestesiaron ratones scid (inmunodeficiencia grave combinada) (Jackson Laboratory), y se les hizo una pequeña incisión para exponer la mama adiposa. Se inyectaron aproximadamente 4 x 10^{6} células en la mama adiposa de cada ratón. El crecimiento de tumores se monitorizó por examen semanal, y se determinó el crecimiento por medidas con un calibrador. Después de aproximadamente 4 semanas, se extirparon los tumores primarios de los ratones anestesiados y las incisiones en la piel se cerraron con grapas para heridas. Aproximadamente 4 semanas más tarde, los ratones se sacrificaron y se examinó la presencia de metástasis en pulmón. Se analizaron histológicamente los tumores primarios y la metástasis en pulmón para detectar la presencia de células humana. Se usó una parte del tejido tumoral que representa más del 80% de las células de origen humano para aislar el RNA total. En el caso de MDA-MD-435, se usaron grandes metástasis en pulmón que representan más del 90% de células humanas. El RNA total se amplificó por RT-PCR usando cebadores específicos para la región codificadora de CSP56. Los productos de reacción se transfirieron en forma de manchas sobre membranas de nilón y se hibridaron con una sonda específica de CSP56.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra la identificación de un gen expresado diferencialmente en la línea celular de cáncer de mama humano agresiva e invasiva, MDA-MB-435.

Para identificar los genes asociados al fenotipo metastásico, se compararon los perfiles de expresión génica en cuatro líneas celulares de cáncer de mama humano usando los que presentan diferentes fenotipos malignos, MDA-MB-453, MCF-7, MDA-MB-231, y MDA-MB-435, que varían de escasamente invasivos hasta más agresivamente invasivos (Engel et al., Cancer Res. 38, 4327-39, 1978; Shafie and Liotta, Cancer Lett. 11, 81-87, 1990; Ozello and Sordat, Eur. J. Cancer 16, 553-59, 1980; Price et al., Cancer Res. 50, 717-21, 1990). Las líneas celulares se eligieron como material de partida basándose en la capacidad de obtener altas cantidades de RNA puro. En contraste, las biopsias de cáncer de mama humano consistían en una mezcla de células cancerosas y de otros tipos incluyendo macrófagos y linfocitos (Kelly et al., Br. J. Cancer 57, 174-77, 1988; Whitford et al., Br. J. Cancer 62, 971-75, 1990). Las líneas celulares de cáncer de mama humano descritas se han estudiado ampliamente en modelos de ratones que permitían caracterizar funcionalmente genes candidatos identificados en la evolución del tumor.

Para asegurar que las líneas celulares retenían sus propiedades malignas originales después del paso prolongado en cultivo, se examinó su potencial para crecer en ratones scid y para formar metástasis después de la inyección en la mama adiposa. Tres de las cuatro líneas celulares formaron tumores primarios, de acuerdo con informes previos (Engel et al., 1978; Shafie and Liotta, 1990; Ozello and Sordat, 1980; Price et al., 1990). No se detectó formación de tumor primario con MDA-MB-453. Además, los ratones a los que se inyectó MDA-MB-231 y MDA-MB-435 desarrollaron metástasis en pulmón, detectándose la incidencia más alta al usar MDA-MB-435.

A continuación se realizó un análisis de presentación diferencial usando RNA total aislado de líneas celulares de cáncer de mama y un total de 200 combinaciones diferentes de pares de cebadores. Entre los diversos transcritos diferencialmente expresados, se amplificó específicamente un fragmento de cDNA de 1,2 kb procedente de la muestra de RNA de MDA-MB-435 usando la combinación de par de cebadores, Ap8 [5'-ACGACTCACTATAGG GC(T)_{12}AA] (SEQ ID NO: 20) y Arp1 (5'-ACAATTTCACACAGGACGACTCCAAG) (SEQ ID NO: 21) (Figura 1A, pistas 5 y 6). También se detectó una expresión débil en MDA-MB-231 (Figura 1A, pistas 1 y 2), mientras que no se detectó señal en las muestras de RNA aisladas de MCF-7 y MDAMB-453 (Figura 1A, pistas 3, 4, 7 y 8).

Para confirmar el modelo de expresión, el fragmento de DNA se aisló del gel, se reamplificó, se radiomarcó y se usó como sonda de hibridación en un análisis de transferencia Northern de líneas celulares de cáncer de mama humanas con diferentes fenotipos malignos y una línea celular de mama no tumorígena (Figura 1B). La sonda radiactiva se hibridó con similar intensidad a dos transcritos de un tamaño de aproximadamente 2,0 kb y 2,5 kb en la muestra de RNA de MDA-MB-435 (pista 9). La expresión débil de estos transcritos se detectó en las líneas celulares de mama humanas escasamente invasivas (pistas 2 y 3) o en la línea no tumorígena Hs578Bst (pista 1). No se detectó señal en MDA-MB-453 ni en MCF-7. Estos datos muestran un modelo de expresión restringido de este gen para líneas celulares de cáncer de mama humanas altamente o moderadamente metastásicas.

Ejemplo 2

Este Ejemplo demuestra la secuencia de nucleótidos de cDNA de CSP56.

La comparación de la secuencia de nucleótidos de cDNA de CSP56 con las bases de datos públicas no mostró homologías significativas. Para obtener más información sobre la secuencia de nucleótidos, se escrutó una genoteca de cDNA de células estromales de médula ósea humana. Uno de los clones positivos extendía el clon original hasta una longitud de 1855 nucleótidos (Figura 2A). Esta secuencia se extendió más en el extremo 3' con diversas etiquetas secuenciadas expresadas hasta una longitud de 2606 nucleótidos (Figura_{.}2B). Los 750 nucleótidos adicionales son más probablemente el resultado de una selección alternativa del sitio de poli-A.

El análisis de la secuencia de nucleótidos reveló un único marco de lectura abierto de 518 aminoácidos, comenzando con un codón de iniciación para traducción en la posición del nucleótido 101 y terminando con un codón de parada en la posición de nucleótido 1655. Una secuencia de consenso de Kozak (Kozak, Cell 44, 283-92, 1986) alrededor del codón de iniciación y el análisis del uso de codón (paquete Wisconsin, UNIX) sugiere que este clon de cDNA contiene la región codificadora completa.

La traducción del marco de lectura abierto predice una proteína con un peso molecular de 56 kD. Basándose en su expresión específica en las líneas celulares de cáncer de mama humanas altamente metastásicas, la proteína codificada por el cDNA se denominó CSP56 correspondiente a la expresión inglesa cancer-specific-protein de 56kD.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra que la CSP56 es una nueva aspartil-proteasa.

La comparación del marco de lectura abierto de CSP56 con proteínas de bases de datos públicas mostró alguna homología con miembros de la familia de la pepsina de las aspartil-proteasas (Figura 3). Un aspecto característico de esta familia de proteasas es la presencia de dos centros activos que evolucionan por duplicación de genes (Davies, Ann. Rev. Biophys. Biochem. 19, 189-215, 1990; Neil and Barrett, Meth. Enz. 248, 105-80, 1995). Los residuos de aminoácidos que comprenden los dominios catalíticos (Asp-Thr/Ser-Gly) y los residuos flanqueantes presentan la conservación más alta en esta familia y se conservan en CSP56 (Figuras 2 y 3).

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La CSP56, sin embargo, muestra aspectos estructurales que son distintos de las otras aspartil-proteasas. Las similitudes globales de CSP56 con el pepsinógeno C y A, la renina y las catepsinas D y E son solamente del 55, 51, 54, 52 y 51%, respectivamente, prescindiendo de la extensión C-terminal de CSP56. Los residuos de cisteína encontrados antes y después de los dominios catalíticos en otros miembros están ausentes en CSP56 (Figura 3). CSP56 también contiene una extensión carboxi-terminal de aproximadamente 90 residuos de aminoácidos que no muestra homología significativa con otras proteínas conocidas.

La CSP56 también contiene un resto hidrófobo que consiste en 29 residuos de aminoácidos en la extensión C-terminal que puede actuar como un dominio de unión a membranas. La CSP56 (Figuras 2C y 3) también contiene una supuesta secuencia señal.

La CSP56 es por tanto una nueva aspartil-proteasa con un supuesto dominio transmenbránico (aminoácidos 8-20) y un tramo de aproximadamente 45 aminoácidos que representan un supuesto propéptido (aminoácidos 21 a 76).

Ejemplo 4

Este Ejemplo demuestra el modelo de expresión de CSP56 en todo el desarrollo del cáncer de mama humano y en la metástasis.

Para examinar más el modelo de expresión de CSP56, se realizó un análisis de transferencia Northern usando líneas celulares normales y de cáncer de mama humanas adicionales (Figura 4). La expresión de CSP56 se detectó en MDA-MB-435, MDA-MB-468 y BR-3 (pistas 1, 4 y 9), con la señal más fuerte en MDA-MB-435. Otras líneas celulares mostraron una expresión débil. No se detectó señal en las líneas celulares de cáncer de mama humanas escasamente invasivas MDA-MB-453 y MCF-7 y en la línea celular de mama normal Hs578Bst. Juntos estos datos están de acuerdo con el aumento de la expresión de CSP56 en líneas celulares de cáncer de mama altamente malignas.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra el modelo de expresión de CSP56 en tejidos humanos normales.

Para determinar la distribución en los tejidos de CSP56 se examinó por análisis de transferencia Northern el RNA de poliA^{+} de diversos tejidos humanos (Figura 7). Se detectaron dos transcritos principales que tenían un tamaño similar a los detectados en líneas celulares cancerosas y tejidos humanos. La expresión más alta se detectó en páncreas, próstata y placenta. Se detectó una expresión débil o ausencia de señal en cerebro y linfocitos de sangre periférica.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra la identificación de transcritos de CSP56 en tumores primarios y tejido de pulmón metastásico aislado de ratones inmunodeficientes a los que se había inyectado MDA-MB-435.

Se usó el modelo de ratón scid para examinar la expresión de CSP56 en tumores. Este modelo ha demostrado ser adecuado para evaluar la función de los genes implicados en la tumorigenicidad y metástasis de células de cáncer de mama humano (Steeg et al., Breast Cancer Res. Treat. 25, 175-87, 1993; Price, Breast Cancer Res. Treat. 39, 93-102, 1996).

Se inyectaron diferentes líneas celulares de cáncer de mama humano en la mama adiposa de ratones inmunodeficientes. Los tumores primarios y, si fuera aplicable, las metástasis de pulmón se aislaron de los ratones y se preparó el RNA total por análisis de transferencia Northern (Figura 4).

Se detectaron transcritos de CSP56 en RNA de tumores primarios derivados de MDA-MB-435, MDA-MB-468 y Alab, pero no de MCF-7 (Figura 4). También se detectó la expresión del gen CSP56 en metástasis de pulmón de ratones a los que se había inyectado MDA-MB-435 (pista 1). El fracaso en detectar transcritos de CSP56 en tumores primarios de ratones a los que se había inyectado ZR-75-1, MDA-MB-361 y MDA-MB-231 podía explicarse con la pequeña cantidad de tejidos cancerosos humanos en estos tumores, como se juzgó por la débil señal de \beta-actina humana cuando se comparó con otras muestras de RNA de tumor primario.

Juntos estos datos excluyeron las condiciones de cultivo in vitro como causa de la sobre-regulación de CSP56 y establecieron este gen como un nuevo marcador tumoral.

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra la detección de la expresión del gen CSP56 en muestras de pacientes.

La expresión de CSP56 se examinó en muestras de RNA aisladas de biopsias tumorales de pacientes. Una transferencia Northern que contenía el RNA total de tejido tumoral de mama y tejido de mama normal del mismo paciente se hibridó con una sonda específica de CSP56 (Fig. 5A). Los transcritos de CSP56 se detectaron en la muestra tumoral mientras que no se detectó señal en el RNA de mama normal (pistas 1 y 2). Similarmente, la expresión de los transcritos de CSP56 estaba sobre-regulada en otras dos muestras de RNA de cáncer de mama en comparación con un control de RNA de mama normal (Fig. 5B). El aumento de expresión de CSP56 también se detectó en tejido de cáncer de colon humano cuando se comparó con tejido de colon normal del mismo paciente.

Para identificar los tipos de células que expresan transcritos de CSP56 in vivo, se realizó un análisis de hibridación in situ en muestras de tejidos obtenidas de una paciente con cáncer de mama (Figuras 6A-6F). Se detectó una señal débil de CSP56 en las células de los conductos de tejido de mama normal (Figura 6B). En el tumor primario, la CSP56 estaba altamente expresada en las células tumorales, pero no en los linfocitos circundantes (Figura 6E). No se detectó señal usando la sonda con sentido (Figuras 6C y 6F).

También se analizaron muestras de tejidos obtenidas de dos pacientes con cáncer de colon (Figuras 6G-6M) para detectar la expresión de CSP56. No se detectó señal en tejido de colon normal (Figura 6H), mientras que los transcritos de CSP56 eran abundantes en las células tumorales tanto de tumor de colon primario como de metástasis de hígado, y no se detectó expresión en el estroma circundante (Figuras 6K y 6M).

Estos datos demuestran que la CSP56 está sobre-expresada en células tumorales de pacientes humanos con cáncer y pueden desempeñar un papel en el desarrollo y evolución de diferentes tipos de tumores.

TABLA 1

Número de	SEQ ID	Cáncer de	Cáncer de mama	Cáncer de mama	Baja metástasis	Alta metástasis
transcripto	NO:	mama no	metastásico	metastásico	procedente	procedente
		metastásico	a los huesos	al pulmón	del colon	del colon
122	1	-	-	+
156	2	+	-	-
166	3	+	-	-
172	4	-	-	+
245	5	+	+	-
280	6	+	-	-
288	7	+	-	-
337	8	+	-	-
344	9	+	-	-
355	10	+	-	-
42	11	-	-	+
59	12	+	-	-
87	13	+	-	-
310	14	+	+	-
349	15	+	-	-
362c	16				-	+
305c	17				+	-
+ indica que el transcrito es detectable por transferencias Northern.
- indica que el transcrito no es detectable por transferencias Northern.
Algunos transcritos son detectables por RT-PCR incluso cuando no son detectables en transferencias Northern.

<110> Chiron Corporation

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<120> Genes regulados de cáncer de pecho y colon metastásicos

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<130> 1451.100

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<140> PCT/US98/27608

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<141> 24-Dic-1998

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<160> 21

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 2429

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<212> DNA

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<213> humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

1

2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 486

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(486)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 397

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(397)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 376

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

5

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2730

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

8

9

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(218)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(426)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 480

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(480)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 402

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(402)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 575

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(575)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 442

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

15

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(332)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 970

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> humano

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(970)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 528

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> aspectos misceláneos

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(528)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C o G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3831

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1718

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1873

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 518

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

24

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgactcact atagggcttt ttttttttta a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaatttcac acaggacgac tccaag

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (6)

1. Un método para identificar un tejido metastásico o el potencial metastásico de un tejido, que comprende la etapa de:

medir en una muestra de tejido el producto de expresión de un gen que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18, en donde se identifica como metastásico o que tiene potencial metastásico una muestra de tejido que expresa un producto de un gen que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 18.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de tejido se selecciona de tejido de mama y de colon.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde el producto de expresión es una proteína.

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde el producto de expresión es mRNA.

5. Un método para identificar un tejido metastásico o el potencial metastásico de un tejido, que comprende la etapa de:

poner en contacto una muestra de tejido que comprende moléculas de polinucleótidos monocatenarios con una disposición ordenada de polinucleótidos que comprende al menos una sonda de polinucleótido monocatenario, en donde dicha al menos una sonda de polinucleótido monocatenario comprende al menos 20 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 18, en donde se sospecha que la muestra de tejido es metastásica o tiene potencial metastásico; y

detectar los polinucleótidos bicatenarios unidos a la disposición ordenada de polinucleótidos, en donde la detección de un polinucleótido bicatenario que comprende nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 18 identifica la muestra de tejido como metastásica o poseedora de potencial metastásico.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la muestra de tejido se selecciona de tejido de mama y de colon.