ES2252760T3

ES2252760T3 - Metodos de exploracion para sustancias de union al receptor de glucocorticoides usando preparaciones de tripterygium wilfordii.

Info

Publication number: ES2252760T3
Application number: ES96936024T
Authority: ES
Inventors: Peter E. Lipsky; Xe-Lien Tao; Jim Cai; William J. Kovacs; Nancy J. Olsen
Original assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 1996-09-27
Filing date: 1996-09-27
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2016-09-27
Also published as: EP1007066A1; AU7377196A; WO1998013057A1; EP1645281A1; ATE309813T1; CA2268099C; CA2268099A1; EP1007066B1; CA2658989A1; EP1007066A4; DE69635462T2; DE69635462D1

Abstract

Un método para explorar una sustancia candidata que tiene afinidad de unión por un receptor de glucocorticoides que comprende: mezclar una sustancia candidata con un receptor de glucocorticoides en presencia de una preparación de raíz de Trypterygium wilfordii Hook F (TwHF) o un componente de unión al receptor de glucocorticoides de la misma; y determinar la unión de la sustancia candidata al receptor de glucocorticoides.

Description

Métodos de exploración para sustancias de unión al receptor de glucocorticoides usando preparaciones de
Tripterygium wilfordii.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica de etiología desconocida. Como la causa es desconocida, el tratamiento se ha dirigido ha suprimir los signos y síntomas de la inflamación crónica. Aunque se han documentado muchos agentes para disminuir el dolor y la hinchazón temporalmente, ninguno ha demostrado tener un impacto principal sobre el transcurso de la enfermedad. Aunque se han desarrollado modalidades terapéuticas para el tratamiento de esta enfermedad ^{1-4}, no se ha informado de una supresión uniforme y persistente de esta afección. Aunque los enfoques actuales son prometedores, parecen garantizados medios alternativos de desarrollo de fármacos y podrían producir no solo nuevas y eficaces modalidades de tratamiento, sino también proporcionar nuevas perspectivas sobre la patogénesis de la enfermedad que podría servir como base de innovaciones terapéuticas futuras.

Un área de investigación para nuevas invenciones terapéuticas para diferentes formas de artritis, y particularmente RA y otras enfermedades autoinmunes, es la de las medicinas chinas tradicionales. Una de estas medicinas tradicionales es de Tripterygium wilfordii Hook F, un arbusto tipo vid de la familia de las Celastraceae^{5}. Se sabe que Tripterygium wilfordii Hook F contiene varios constituyentes, algunos de los cuales parecen ser tóxicos^{6}. Se sabe que las hojas, tronco, flores y la piel de las raíces son venenosas y que su ingestión puede provocar la muerte ^{7-9}. Por el contrario, la parte leñosa de las raíces de la planta es mucho menos tóxica. Un extracto de Tripterygium wilfordii Hook F preparado de la raíz de la planta, denominado T_{2}, se ha descrito en la bibliografía china para el tratamiento de enfermedades autoinmunes ^{10-26}. La preparación parece contener componentes terapéuticos, y tener una toxicidad reducida en comparación con otras preparaciones disponibles de la planta.

El extracto T_{2} se ha evaluado en un estudio de cruce controlado con placebo doble ciego que implica 70 pacientes RA, teniendo estos pacientes una duración media de RA de 6 años ^{10-11}. Se observó una mejora significativa en una diversidad de parámetros clínicos, particularmente ESR, CRP, y títulos de factor reumatoide, después de 12 semanas de terapia en el grupo experimental en comparación con medidas iniciales o el grupo tratado con placebo. De los pacientes tratados, el 82-93% presentaron una mejora en diferentes criterios clínicos o equivalentes de laboratorio de inflamación. Una actividad inmunosupresora de T_{2} puede deducirse del descubrimiento de que el tratamiento indujo inhibición de la producción de IgM y factor reumatoide IgM por las células mononucleares sanguíneas periféricas de los pacientes in vitro^{7}. La toxicidad, que consta principalmente de erupción cutánea, complicaciones gastrointestinales y amenorrea, fue según se dice, de una naturaleza generalmente moderada, y reversible con el cese de la terapia.

La experiencia china sugirió que una dosificación diaria de 0,8-1,5 mg/kg de T_{2} era relativamente segura y eficaz. Los estudios de toxicidad aguda y crónica se han realizado con T_{2} en china usando una diversidad de modelos animales. El valor LD_{50} de T_{2} en ratones se encontró que era 159,7 \pm 14,3 mg/kg^{27}. La toxicidad crónica principal observada en ratas con administraciones de 30 mg/kg durante 90 días fue azoospermia y disminución en el peso testicular ^{27}. Dosificaciones inferiores de T_{2} no provocaron disminuciones en el peso testicular. Los estudios de toxicidad, por lo tanto, sugirieron que T_{2} mostraba un índice de seguridad razonable y debe ser capaz de administrarse a pacientes de manera segura.

La investigación ha comenzado en China para determinar el espectro de actividad de diversas preparaciones de T. wilfordii. De acuerdo con los resultados presentados de estos estudios, los extractos de TwHF fueron capaces de inhibir la formación de rosetón E por células T de cobayas, producción de IL-2 inducida por mitógeno por células T de ratón y migración estimulada por antígeno de linfocitos de rata ^{28,29.} Los componentes de T. wilfordii hook F conocidos como triptonida y triptolida se ha informado que inhiben la proliferación de linfocitos inducida por concavalina
A ^{30}. Los extractos de cloroformo/etanol de la planta, mencionados como T_{2} en la bibliografía, se han descrito como que tienen actividad significativa in vivo frente a ciertas leucemias de ratón e in vitro frente a células obtenidas de carcinomas humanos ^{31}. Se ha documentado la capacidad de T_{2} de suprimir varios modelos animales de enfermedad autoinmune, incluyendo artritis adyuvante y encefalomielitis alérgica experimental ^{28-29,32-36}. Grandes concentraciones de preparaciones de T_{2} (30 mg/kg) se ha informado que suprimen la reactividad de hipersensibilidad de tipo retardado en ratones y también puede suprimir la enfermedad de injerto contra hospedador, así como el rechazo de aloinjerto de piel y corazón ^{6,32}. Sin embargo, permanece sin estar claro si concentraciones inferiores farmacológicamente más apropiadas también ejercerían efectos terapéuticos en estos animales.

El T_{2} examinado en la bibliografía china es un extracto en bruto que contiene una mezcla de materiales, incluyendo diversos glicósidos, alcaloides, y terpenoides. El principio activo, sin embargo, aún no se ha identificado. Se han purificado unos pocos componentes, incluyendo triptolida, wilfordina, y compuestos relacionados, pero no existe un componente purificado particular que represente la actividad terapéutica o inmunosupresora de T_{2} ^{40}. Altas concentraciones de triptolida se informó que suprimían la proliferación de linfocitos B y T y la producción de interleuquina 2 por células de bazo de ratón ^{41}. Sin embargo, las concentraciones del T_{2} usadas fueron suficientemente altas para que sucediera indudablemente toxicidad específica significativa.

Varios agentes farmacológicos se han usado para tratar artritis reumatoide y otras afecciones inflamatorias. Entre estos están fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (NSAID) y glucocorticoides. Un aspecto principal del mecanismo de acción de los fármacos anti-inflamatorios no esteroideos se cree en líneas generales que es la inhibición de ciclooxigenasa, la enzima responsable de la biosíntesis de algunas prostaglandinas y ciertos autacoides relacionados. Esta inhibición depende de que el fármaco alcance la enzima ciclooxigenasa, lo que indica que el modo de acción es al nivel de interacción con la proteína enzimática en sí misma. Por ejemplo, el acetaminofeno puede bloquear la enzima sólo en un medio que sea bajo en peróxidos lo que puede explicar su mala actividad anti-inflamatoria ya que los sitios de inflamación habitualmente contienen altas concentraciones de peróxidos generados por leucocitos. La aspirina acetila una serina en o cerca del sitio activo de ciclooxigenasa, inhibiendo la actividad enzimática. El efecto secundario no deseado más habitual de NSAID y otros fármacos tipo aspirina es una propensión a inducir ulceración gástrica o intestinal. A veces también pueden suceder efectos secundarios más serios, tales como anemia como resultado de la pérdida de sangre.

Los glucocorticoides tienen la capacidad de evitar y suprimir el desarrollo de las manifestaciones de inflamación. También son de un inmenso valor en el tratamiento de enfermedades que son el resultado de reacciones inmunes no deseables. Las acciones inmunosupresoras y anti-inflamatorias de los glucocorticoides están inextricablemente unidas porque ambas provocan una gran parte de la inhibición de las funciones específicas de leucocitos, en particular, inhibición de linfoquinas.

Dos categorías de efectos tóxicos se observan en el uso terapéutico de adrecortiesteroides ^{76}: los provocados por la retirada y los provocados por el uso continuo de grandes dosis. La insuficiencia suprarrenal aguda está provocada por una retirada demasiado rápida de estos fármacos. La terapia prolongada con corticoesteroides puede provocar la supresión de la función pituitaria-suprarrenal que puede ser lenta en regresar a la normalidad. Complicaciones adicionales provocadas por terapia prolongada con corticoesteroides son: trastornos de fluido y electrolito; hipertensión; hiperglucemia y glucosuria; susceptibilidad aumentada a infecciones; incluyendo tuberculosis; úlceras pépticas, que pueden sangrar o perforar; osteoporosis; una miopatía característica; trastornos del comportamiento; cataratas subcapsulares posteriores; detención del crecimiento; y habitus de Cushing, que consta de "cara de luna", "joroba de búfalo", alargamiento de las almohadillas grasas supraclaviculares, "obesidad central", estriaciones, equimosis, acné, e hirsutismo.

Un objeto de la presente invención es proporcionar métodos de exploración usando preparaciones de T. wilfordii Hook F, y componentes aislados del mismo. Las modalidades de tratamiento con NSAID actuales vienen acompañadas por efectos secundarios significativamente no deseables. Por lo tanto, serían de gran beneficio agentes que tengan los efectos anti-inflamatorios de NSAID sin los efectos secundarios.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos de acuerdo con las reivindicaciones.

La preparación purificada de T. wilfordii se obtiene por un proceso que comprende extraer las partes leñosas de la raíz de Tripterygium wilfordii Hook F, en la mayoría de las realizaciones raíz sin piel o raíz en la que al menos algo o la mayoría de la piel se ha retirado, para proporcionar una preparación con toxicidad celular reducida, o al menos sin toxicidad celular sustancial, en comparación con preparaciones en bruto que no se han purificado o extraído de otro modo de los componentes contaminantes. Los métodos descritos como parte de la presente invención emplean preparaciones de T. wilfordii que se ha observado que tienen actividad de unión al receptor de glucocorticoides. Los receptores de glucocorticoides se reconocen por los especialistas en la técnica como importantes en varias patologías. Por tanto, los métodos pretenden incluir el uso de estos componentes de T. wilfordii, y sus formas aisladas y purificadas, que demuestran esta actividad de unión a receptores de glucocorticoides única. Las preparaciones obtenidas de manera natural y producidas sintéticamente de dichos componentes de T. wilfordii pueden, por lo tanto, usarse eficazmente en la práctica de los métodos descritos. Los componentes activos en la unión al receptor de glucocorticoides de
T. wilfordii se han caracterizado en preparaciones de raíz, y también pueden existir en otras partes de la planta. Se entiende en el significado de los componentes de unión de receptor de glucocorticoides de T. wilfordii, por lo tanto, aquellos componentes, o partes farmacológicamente activas o fragmentos de esos componentes, que se unen al receptor de glucocorticoides. Estos componentes pueden caracterizarse adicionalmente como supresores de la inflamación y respuestas inmunes sin o con efectos agonistas esteroideos mínimos y/o sin, o con efectos de NSAID mínimos.

La enfermedad inmune puede ser una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso o psoriasis.

Como se usa en la descripción de la presente invención, el término "efecto moderador esteroideo" también se define como reductor de la cantidad de esteroides, tales como prednisona, capaces de proporcionar un efecto farmacológico beneficioso del esteroide. Por ejemplo, tras el tratamiento con las preparaciones descritas, los pacientes que recibieron tratamientos con prednisona pueden mantenerse en dosis más bajas de prednisona sin pérdidas significativas de la actividad farmacológica observada a las dosis más altas iniciales del esteroide. Este fenómeno se ejemplifica en los datos presentados en la Tabla 13, en pacientes que reciben la prednisona esteroide. Por tanto, el "efecto moderador de esteroides" en el contexto de la presente invención también puede describirse como la evitación de efectos secundarios relacionados con esteroides reconocidos habitualmente, tales como inducción de intolerancia a la glucosa, osteoporosis, ganancia de peso o una combinación de estos. Este fenómeno también puede relacionarse a la ausencia de actividad agonista de esteroides de un componente o componentes de la preparación de T. wilfordii.

También como se usa en la descripción de la invención, la parte "leñosa" de la raíz es una parte de la raíz que no tiene piel, o sin piel. La toxicidad celular como se usa en la presente descripción se mide por la inducción de muerte celular, expresión del receptor de interleuquina 2, actividad de señalización celular, o una combinación de uno o más de estos efectos. La actividad de señalización celular se refiere a la producción de inositol trifosfato, generación de diacilglicerol, traslocación de proteína quinasa C, actividad de proteína tirosina quinasa, o una combinación de estas actividades.

Se describe un método para inhibir la inducción de ciclooxigenasa 2. El método comprende administrar al sujeto una cantidad farmacológicamente activa de una preparación de raíz de Tripterygium wilfordii Hook F, o un componente farmacológicamente activo de la misma, capaz de unirse al receptor de glucocorticoides. En este método, la actividad ciclooxigenasa-1 no se ve afectada sustancialmente. La inhibición de la inducción de ciclooxigenasa-2 inhibe la síntesis de una prostaglandina, un autacoide, o una citoquina inhibida por glucocorticoides, por ejemplo.

La producción constitutiva de prostaglandina y autocoides relacionados está catalizada por ciclooxigenasa-1. La ciclooxigenasa se encuentra en muchas células. La inhibición de esta enzima se ha asociado al menos en parte a efectos secundarios observados con el tratamiento que incluye NSAID. Durante la inflamación y después de la estimulación, las células inflamatorias, tales como macrófagos, transcriben un segundo gen y producen una nueva enzima, ciclooxigenasa-2, que representa la mayoría de la producción de prostaglandina en sitios inflamatorios. Los NSAID también inhiben esta enzima. Los esteroides (y T_{2}) inhiben la trascripción del gen de ciclooxigenasa-2 mientras que la actividad ciclooxigenasa-1 no se ve afectada sustancialmente. Por lo tanto, tienen los efectos anti-inflamatorios de NSAID pero no la toxicidad.

Los procesos inflamatorios dependientes de ciclooxigenasa-2 pueden ser la síntesis de una prostaglandina o la síntesis de un autacoide relacionado. Las actividades inmunosupresoras tipo corticoesteroide adicionales pueden ser la síntesis de una citoquina inhibida por glucocorticoides, tal como IL-2 o interferón \gamma, y pueden estar relacionados a un proceso de una enfermedad autoinmune, tal como, por ejemplo, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso o psoriasis.

Normalmente, cuando un glucocorticoide se une al receptor de glucocorticoides, el complejo unido induce la trascripción de los genes activados por el complejo glucocorticoide-receptor. Se ha demostrado en este documento que el extracto de TwHF, y componentes del mismo, se unen al receptor de glucocorticoides, pero no activan los genes sensibles a esteroides. Por consiguiente, los genes que se activarían normalmente por el complejo no se activan. Por lo tanto, los efectos no deseables relacionados del tratamiento con esteroides se evitan por el tratamiento con extracto de TwHF. Entre los genes mostrados claramente por la presente invención a inhibir por extractos de TwHF están el gen de IL-2, los genes de interferón \gamma y ciclooxigenasa-2. Esto proporciona un aspecto adicional más de la invención como método para inhibir tanto reacciones inmunes como respuestas inflamatorias. También se describen por la presente métodos específicos para inhibir glucocorticoides y receptores que forman complejos con las preparaciones de extracto de TwHF. Los componentes de TwHF se unen al receptor de glucocorticoides y ese complejo inhibe la trascripción de ciertos genes tales como IL-2, IFN \gamma y COX-2. Sin embargo, a diferencia del complejo de dexametasona (un corticoesteroide) y el receptor de glucocorticoides, el complejo de componentes de TwHF y el receptor de glucocorticoides no activa genes que están dirigidos por elementos de respuesta a glucocorticoides.

Los procesos dependientes del receptor del glucocorticoides no deseados cuya activación se evita en la presente invención pueden ser la inducción de intolerancia a la glucosa, osteoporosis, o ganancia de peso, supresión de la función pituitaria-suprarrenal, trastorno de fluido o electrolito, hipertensión, hiperglucemia, glucosuria, susceptibilidad de infecciones, úlcera péptica, osteoporosis, miopatía, trastorno del comportamiento, cataratas subcapsulares posteriores, detención del crecimiento, o habitus de Cushing. De hecho, todas las diversas acciones hormonales de glucocorticoides se dirigen por elementos de respuesta a glucocorticoides que regulan la trascripción génica.

La preparación puede ser un extracto de cloroformo-metanol, un extracto con cloroformo-etanol, un extracto con etanol, o acetato de etilo de la parte leñosa de la raíz de Tripterygium wilfordii Hook F. Preferiblemente, el extracto es un extracto de acetato de etilo y, más preferiblemente, el extracto se obtiene de la extracción con etanol seguido por una extracción con acetato de etilo. La preparación puede constar esencialmente de tripdiolida, triptolida, wilforonida, o compuestos relacionados del extracto que tienen la actividad biológica descrita, o un compuesto sintetizado que tiene la estructura triptolida básica que tiene actividad triptolida, y la cantidad farmacológicamente activa puede ser de 30-600 mg/día preferiblemente aproximadamente 50 mg/día a aproximadamente 100 mg/día, o en algunas aplicaciones, aproximadamente 60 mg/día. Sin embargo, puede ser clínicamente apropiado más o menos de cualquiera de estas dosis dependiendo de las necesidades y progreso del paciente particular o afección que se está tratando y la evaluación del médico que está atendiendo.

La cantidad farmacológicamente activa de la preparación de la raíz de Tripterygium wilfordii Hook F proporcionada por la presente invención se demuestra por su LD_{50} en ratones, que es mayor de aproximadamente 860 mg/kg. Expresado como un intervalo, el LD_{50} de la preparación está entre aproximadamente 860 mg/kg a 1300 mg/kg. Como se ha demostrado por esta invención, el extracto EA a producido en Texas ha mostrado tener un LD_{50}, más preferiblemente, de aproximadamente 1250 mg/kg. El LD_{50} de la preparación es mucho superior que el observado con otras preparaciones de TwHF, como se muestra en este documento, y por lo tanto, la presente preparación es considerablemente menos tóxica (es decir, requiere dosis más altas para matar). Esto pone de relieve la ventaja adicional de las presentes preparaciones como farmacológicamente más aceptables.

\newpage

La preparación de T. wilfordii se define adicionalmente como que tiene una proporción de actividad terapéutica:índice tóxico superior a aproximadamente 2,6 x 10^{-3}, o preferiblemente, de 2,6 x 10^{-3} a 4,5 x 10^{-3} o más preferiblemente, aproximadamente 4,5 x 10 ^{-3}. La proporción de actividad terapéutica:índice tóxico se calcula a partir de una proporción de ID_{50} in vitro de proliferación de células T/LD_{50}.

La preparación de Tripterygium wilfordii Hook F del presente método también se describe como que tiene menos de aproximadamente 1,3 \mug/mg de triptolida y preferiblemente, aproximadamente 2,0-1,3 \mug/mg de triptolida, o más preferiblemente, aproximadamente 0,2 \mug/mg de triptolida. Aunque la preparación puede obtenerse por cualquier medio de técnicas de extracción química que producen un producto que tiene la proporción de actividad terapéutica:índice tóxico y concentración de triptolida descritos, las técnicas más preferidas son extracción con acetato de etilo de la raíz o por una extracción con etanol seguida por una extracción con acetato de etilo de la raíz.

En una realización preferida del método descrito anteriormente, la preparación de la raíz de Tripterygium wilfordii Hook F se obtiene por un proceso que comprende las etapas de i) obtener partes leñosas de las raíces de una planta Tripterygium wilfordii Hook F; y ii) extraer las partes leñosas con un disolvente para producir una preparación de Tripterygium wilfordii Hook F, donde la preparación tiene menos de aproximadamente de 1,3 \mug/mg de triptolida. El disolvente es preferiblemente acetato de etilo. Más preferiblemente, la etapa de extracción incluye extraer con un primer disolvente y un segundo disolvente donde el primer disolvente es etanol y el segundo disolvente es acetato de etilo.

La preparación de Tripterygium wilfordii Hook F tiene una proporción de actividad terapéutica:índice tóxico de más de aproximadamente de 2,6 x 10^{-3}, y la preparación se obtiene por un proceso que comprende las etapas de i) obtener partes leñosas de las raíces de una planta Tripterygium wilfordii Hook F y retirar la piel; ii) extraer las partes leñosas con etanol para producir un extracto de etanol; iii) extraer el extracto de etanol con acetato de etilo para formar una preparación de Tripterygium wilfordii Hook F. La preparación tiene una proporción de actividad terapéutica:índice tóxico de más de aproximadamente 2,6 x 10^{-3} y un LD_{50} en ratones de más de aproximadamente 860 mg/kg, y menos de aproximadamente 1,3 \mug/mg de triptolida. En esta realización de la presente invención, las partes leñosas de las raíces sin piel se secan para formar una parte leñosa seca; la parte leñosa seca se machaca para formar un polvo; y el polvo se extrae con etanol para producir un extracto de etanol; después de obtener la etapa descrita anteriormente. Más preferiblemente, las partes leñosas de la raíz deben secarse bajo luz solar abierta.

Se describen métodos para tratar inflamación, una enfermedad inmune, o artritis reumatoide, sin activar sustancialmente un gen dependiente de esteroides en un paciente. El método comprende administrar aproximadamente 30 a aproximadamente 600 mg/día de una preparación de extracto de raíz de Tripterygium wilfordii Hook F que tiene un LD_{50} en ratones de más de aproximadamente 850 mg/kg al paciente, donde la preparación contiene menos de aproximadamente 1,3 \mug/ml de triptolida y donde la preparación se une al receptor de glucocorticoides y ejerce de este modo actividad anti-inflamatoria e inmunosupresora.

Se describe un método para inhibir los genes sensibles a glucocorticoides, tales como el gen interleuquina-2, un gen de interferón \gamma y un gen de ciclooxigenasa-2. Cada uno de estos genes está regulado negativamente por un complejo molecular de unión al receptor de glucocorticoides. La supresión de todos los genes pro-inflamatorios o potenciadotes inmunes suprimidos por glucocorticoides se prevé por la presente invención. El método comprende la etapa de administrar la preparación descrita anteriormente de extracto de raíz de Tripterygium wilfordii Hook F en una cantidad farmacológicamente activa. La cantidad farmacológicamente activa es como se describe en este documen-
to.

Se describe un método para reducir la actividad progesterona que comprende la administración de la preparación de TwHF descrita anteriormente. La reducción de actividad progesterona es útil para el control del nacimiento, por ejemplo, o como un tratamiento "del día después". Además, este enfoque debe ser útil como abortivo.

Una realización de la presente invención es una método para determinar la capacidad de una sustancia candidata de unirse al receptor de glucocorticoides en un ensayo de unión competitiva en presencia de preparación de TwHF, o un componente de unión al receptor de glucocorticoides de la misma. El método incluye en líneas generales las etapas de mezclar una sustancia candidata con un receptor de glucocorticoides en presencia de preparación de TwHF o un componente de unión al receptor de glucocorticoides de la misma, y determinar la unión de la sustancia candidata al receptor de glucocorticoides. En este método, el receptor de glucocorticoides puede ser de una preparación de fibroblastos de piel humana; el componente de unión al componente de unión al receptor de glucocorticoides puede ser triptolida, tripdiolida o wilforonida; el receptor de glucocorticoides preferiblemente se conjuga a un marcador, tal como un marcador enzimático, químico, o radiactivo. Un marcado preferido es avidina/biotina.

Cuando se desea seleccionar entre sustancias candidatas para las que, como TwHF, no activan genes sensibles a esteroides, las sustancias candidatas que muestran actividad de unión al receptor de glucocorticoides se explorarían adicionalmente para identificar aquellos que no activan la expresión de genes sensibles a esteroides. En la realización de esto, pueden identificare otras sustancias que tienen la actividad de unión al receptor de glucocorticoides de TwHF, o sus componentes activos, que también evitan los efectos secundarios relacionados con esteroides.

Una realización adicional de la invención es un método para seleccionar una sustancia adecuada para el tratamiento de inflamación o enfermedad inmune que comprende las etapas de mezclar una sustancia candidata con un receptor de glucocorticoides en presencia de la preparación de TwHF o un componente de unión al receptor de glucocorticoides de la misma, determinar la unión de la sustancia candidata al receptor de glucocorticoides, seleccionar una sustancia candidata que tiene afinidad de unión por el receptor de glucocorticoides, determinar la actividad de la sustancia candidata seleccionada para inducir la expresión de genes sensibles a esteroides, y seleccionar la sustancia candidata que es inactiva para inducir la expresión de genes sensibles a esteroides. La segunda etapa de determinación puede realizarse usando una construcción génica informadora bajo el control regulador de un elemento sensible a esteroides, por ejemplo, el elemento sensible a esteroides de la repetición larga terminal MMTV. El gen informador puede ser el gen de la luciferasa, el gen de la cloramfenicol acetiltransferasa, o el gen de \beta-galactosidasa, por ejemplo. Un especialista en la técnica, tras la lectura de la presente descripción, conocería construcciones génicas informadores similares útiles en la presente invención.

Se describe un método para bloquear la producción de interferón \gamma en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto una cantidad farmacológicamente activa de una preparación de raíz de Tripterygium wilfordii Hook F, o un componente farmacológicamente activo de la misma, capaz de bloquear la producción de interferón gamma. Un método para inhibir el gen de interleuquina-2 en un sujeto también es una realización de la invención. El método comprende administrar al sujeto una cantidad farmacológicamente activa de una preparación de raíz de Tripterygium wilfordii Hook F, o un componente farmacológicamente activo de la misma, capaz de inhibir la trascripción del gen de interleuquina-2.

Después del convenio de larga duración de la práctica de leyes de patentes, jurisprudencia, y construcción de reivindicaciones, las palabras "un" y "una" indican "uno o mas", cuando aparecen en la memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones.

Las siguientes abreviaturas se usan a lo largo de toda la descripción de la presente invención.

CRP=: proteína reactiva C

DAG=: diacilglicerol

ESR=: velocidad de sedimentación de eritrocitos

FACS=: clasificación de células activadas por fluorescencia

GR=: receptor de glucocorticoides

Ig=: inmunoglobulina

IL-2=: interleuquina-2

IL-2R=: receptor de interleuquina-2

IP=: fosfatidil inositol trifosfato

MAb=: anticuerpos monoclonales

MMTV=: virus de tumor de mama de ratones

NHS=: suero humano normal

PBMC: células mononucleares sanguíneas periféricas

PDB=: forbol dibutirato

PHA=: fitohemaglutinina

PMA=: forbol 12-miristato 13-acetato

PKC=: proteína quinasa C

RA=: artritis reumatoide

SA=: Staphylococcus aureus tratado con formalina

SK=: estreptoquinasa

SRBC=: glóbulos rojos de oveja

T_{2}=: un extracto de cloroformo/metanol de la parte leñosa de Tripterygium wilfordii Hook F

TT=: toxoide del tétanos

TwHF o TWF=: Tripterygium wilfordii Hook F

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la siguiente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en este documento.

Figura 1. Efecto de T_{2} en la proliferación de células T. Se cultivaron células T (1 x 10^{5}/pocillo) con medio (\square) o PHA (\Delta) en presencia o ausencia de concentraciones variadas de T_{2} como se indica durante 3 días. Los resultados representan la media de cpm \pm SEM de los tres experimentos.

Figura 2A, Figura 2B, Figura 2C, Figura 2D, Figura 2E, Figura 2F, Figura 2G, Figura 2H, Figura 2I, Figura 2J, Figura 2K y Figura 2L. Efecto de T_{2} en la progresión del ciclo celular de células T humanas. Se cultivaron células T (1 x 10^{5}/pocillo) con o sin PHA (1 \mug/ml) en ausencia o presencia de las concentraciones indicadas de T_{2} durante 24, 48 ó 72 horas. Las muestras se recogieron, se tiñeron con naranja de acridinio, y se analizaron con un citómetro de flujo ORTHO usando el programa CICERO para determinar la posición de las células en el ciclo celular como se evalúa por su contenido en ARN y ADN.

Figura 3. Efecto inhibidor de T_{2} sobre la producción de IL-2. Se cultivaron células T (1 x 10^{5}/pocillo) con medio (\square) o PHA (\blacksquare) en presencia o ausencia de concentraciones variadas de T_{2} durante 36 horas. Los sobrenadantes libres de células se diluyeron 1:4 y se analizaron para la actividad IL-2 con células CTLL-2. Se muestra la incorporación de [^{3}H]-TdR media \pm SEM de células CTLL-2 de 6 experimentos.

Figura 4. Efecto de IL-2 suplementario sobre la inhibición mediada por T_{2} de la proliferación de células T. Se estimularon células T (1 x 10^{5}/pocillo) con PHA (\square) o sin (\blacksquare) IL-2 (10 U/ml) y en presencia o ausencia de concentraciones variadas de T_{2} durante 3 días. Los datos se expresan como porcentaje de la incorporación de [^{3}H]-TdR de control de tres experimentos.

Figura 5A y Figura 5B. Efecto de T_{2} sobre la síntesis de ADN de células B y producción de Ig. En el cuadrante de la izquierda, se estimularon células B (5 x 10^{4}/pocillo) con SA (o) o SA + IL-2 (o), y en el cuadrante derecho con SA + IL-2 en presencia de concentraciones variadas de T_{2}. Se determino [^{3}H]-TdR después de una incubación de 5 días (cuadrante de la izquierda). Los sobrenadantes se recogieron después de un cultivo de 7 días y se ensayaron para el contenido en IgM (\blacksquare), IgG (o) e IgA (o) (cuadrante derecho). Los resultados son la media \pm SEM de 3 experimentos.

Figura 6A y Figura 6B. Efecto de T_{2} en la generación IP total por células T activadas. Se marcaron células T frescas (A) o células Jurkat (B) con [^{3}H]-mio-inositol durante una noche en ausencia o presencia de las concentraciones indicadas de T_{2}. Se determinó IP total como se describe en el Ejemplo 2. También se estimuló una alícuota de cada población celular con PHA durante 24 horas y se ensayaron los sobrenadantes para el contenido en IL-2 usando células CTLL-2 (o). Los datos son la media de 3 experimentos replicados.

Figura 7A, Figura 7B y Figura 7C. Efecto de T_{2} sobre la generación de fracciones IP por células T activadas con PHA. Se marcaron células Jurkat con [^{3}H]-mio-inositol durante una noche en presencia o ausencia de diversas concentraciones de T_{2.} Después de una incubación de 5 minutos con LiCl 10 mM, las células se activaron con PHA durante 60 minutos. Se aislaron los IP solubles en agua (IP1, cuadrante superior; IP2 cuadrante intermedio e IP3, cuadrante inferior) y se cuantificaron como se describe en el Ejemplo 2. Los datos son de uno de tres experimentos similares.

Figura 8. Efecto de T_{2} en la generación de DAG y secreción de IL-2 por células T estimuladas con PHA. Se ensayaron DAG e IL-2 como se describe en el Ejemplo 2. Los datos representan la media de determinación duplicada de tres experimentos similares.

Figura 9A y Figura 9B. Efecto de T_{2} sobre la traslocación de PKC. Se ensayó la actividad PKC en fracciones tanto citoplásmicas como de membrana como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 10 resume la evaluación de mejoras sintomáticas en pacientes de artritis reumatoide como resultado del tratamiento con una mezcla de Tripterygium wilfordii Hook F.

La Figura 11 muestra esquemáticamente la estructura de triptolida (1) y tripdiolida (2).

La Figura 12 muestra esquemáticamente la estructura de triptonida.

La Figura 13 describe esquemáticamente la estructura de wilfortrina (1) y éster metílico de wilfortrina (2).

La Figura 14 muestra la estructura de triptofenolida (1) y éster metílico de triptofenolida (2).

La Figura 15 muestra esquemáticamente la estructura de triptonoterpenol.

La Figura 16 muestra esquemáticamente la estructura de wilformina.

La Figura 17 resume el procedimiento de extracción para la preparación de triptolida.

La Figura 18 representa la estructura de wilforonida (nafto-[1,2-c]furan-3,7(1H,5H)-diona, 4,5a,6,8,9,9a-hexahidro-5a-metil-(5aR-trans)-[104331-87-5]).

La Figura 19A y Figura 19B muestran el perfil de elución de la Fracción 924.

La Figura 20A, Figura 20B, Figura 20C y Figura 20D muestran la función de la Fracción 924; 22A muestra el efecto de la Fracción 924 sobre la producción de IL-2; 22B, el efecto sobre la expresión de IL-2; 22C, el efecto sobre la proliferación de células T; y 22D, el efecto sobre la viabilidad celular.

La Figura 21 muestra una comparación de los diterpenos en los extractos de acetato de etilo de Tripterygium wilfordii Hook F preparado en China (CEA) y Texas (TEA). Los diterpenos de cada preparación de T. wilfordii Hook F (CEA y TEA) se visualizaron por la reacción de Kedde. Triptolida (3,6 \mug), triptofenolida (10 \mug) y tripdiolida (1,8 \mug) sirvieron como patrones de referencia. Las concentraciones relativas de triptofenolida, triptolida y tripdiolida de los extractos CEA y TEA se ven en esta figura.

Figura 22. TwHF inhibe la unión de dexametasona al receptor de glucocorticoides de fibroblastos de piel humana (GR).

Figura 23. TwHF inhibe la activación de un gen diana mediada por GR. El gen diana fue el gen de la luciferasa bajo el control regulador de elementos inducibles por glucocorticoides en la repetición larga terminal MMTV.

Figura 24. Curvas de respuesta a dosis del efecto de TwHF sobre la unión de ligando GR y activación del gen diana. Los datos de la Figura 20 y 21 se volvieron a trazar juntos como % de unión máxima o actividad como función del log de la concentración de TwHF.

Figura 25 A, Figura 25B y Figura 25C. El extracto de TwHF y componentes purificados inhiben el crecimiento dependiente de dexametasona de células IDH4 de un modo dependiente de la concentración. La proliferación de células IDH4 se evaluó por incorporación de [^{3}H]-timidina después de un cultivo de 72 horas. (La n es en 10^{n} es la abscisa del gráfico, es decir, 1, 2, 3, 4, ó 5; lo que indica concentración nanomolar).

-\square- Dex 1.000 nM

-\blacklozenge- Dex 100 nM

-\blacksquare- Dex 10 nM

-\lozenge- Dex 1 nM

Figura 26. RIA de cortisol con un nuevo anticuerpo anti-cortisol dirigido al anillo A detecta la inmunorreactividad en el extracto de TwHF. Los datos se expresan como la fracción de indicador de cortisol radiactivo unido al anticuerpo (B/B_{o}) como función de cortisol añadido o TwHF. La curva de desplazamiento de TwHF no es paralela a la del cortisol auténtico, pero puede existir algo de reactividad cruzada.

Figura 27. Curvas de respuesta a dosis para el efecto del compuesto A de TwHF sobre la actividad de unión de ligando GR (como para la Figura 22) y la activación de un gen diana mediada por GR (como para la Figura 23). Los datos se muestran como % de una unión máxima o actividad como función de la concentración de TwHF (escala log).

Figura 28. RIA de cortisol con un anticuerpo dirigido al anillo A no logra detectar la inmunorreactividad tipo cortisol en compuestos A y B purificados de TwHF (triptolida y tripdiolida, respectivamente). El compuesto C (triptofenolida) puede tener inmunorreactividad de baja afinidad.

Figura 29 A, Figura 29B, Figura 29C y Figura 29D. El extracto de TwHF y componentes purificados inhiben la producción de PGE_{2} inducida por endotoxina por monocitos sanguíneos periféricos humanos, RU 486 se ensaya en la Figura 29D.

Figura 30. Cromatograma de triptolida y acetofenona. Picos: 1= acetofenona; 2= triptolida. Condiciones: columna de acero inoxidable Nova Pack C18 (150 mm x 3,9 mm D.I.); fase móvil, acetonitrilo-agua (19:81); caudal, 1,5 ml/min; monitor UV a 214 nm; volumen de la muestra 10 \mul.

\newpage

Figura 31. Cromatograma de tripdiolida. Pico: 1= tripdiolida. Fase móvil acetonitrilo-agua (11:89); caudal, 2,0 ml/min. Las otras condiciones como en la Figura 30.

Figura 32. Cromatograma del extracto de Tripterygium wilfordii Hook F con el patrón interno para la determinación de triptolida. Picos: 1= acetofenona; 2= triptolida. Condiciones como en la Figura 30.

Figura 33. Cromatograma del extracto de Tripterygium wilfordii Hook F para la determinación de tripdiolida. Pico1= tripdiolida. Condiciones como en la Figura 31.

La Figura 34 muestra el efecto del extracto EA sobre la producción de IL-2 e IFN-\gamma. Se incubaron células T (1 x 10 ^{5}/ml) con PHA (1 \mug/ml) durante 24 horas en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas del extracto EA. -\square-, IFN-\gamma, -\blacklozenge-, IL-2.

Figuras 35 A-D. Recuento de glóbulos blancos (Figura 1A), concentración de nitrito (Figura 1B); TNF-\alpha (Figura 1C); y PGE2 en exudados de las bolsas de aire (Figura 1D). El WBC se midió por un contador coulter. La concentración de nitrito, TNF-\alpha y PGE2 se determinaron con reactivo de Griess, el ensayo de citotoxicidad L929 murino y el kit de ELISA de PGE2, respectivamente. Los datos se expresan como media +/- SEM de las determinaciones duplicadas de cada muestra de cada grupo de animales. Se usó el ensayo t de Student para ensayar la diferencia entre el grupo tratado con EA frente al control. *, P<0,05;**, P<0,01;***,P<0,001.

Figura 36. Contenido en PGE2 del Tejido de Revestimiento de las Bolsas de Aire. Se homogeneizó aproximadamente 1 g del tejido de revestimiento de las bolsas de aire y se extrajeron con etanol como se describe en "Materiales y Métodos". El contenido en PGE2 del material extraído se midió con el kit de ELISA como se describe por el fabricante. Los datos se expresan como la media +/- SEM de duplicados de cada muestra de cada grupo de animales. **, P<0,01 frente al grupo de control.

Figuras 37 A-C. Producción de nitrito (Figura 3A), TNF-\alpha (Figura 3B); PGE2 por las células separadas de los exudados (Figura 3C). Se cultivaron 2 x 10^{6} células exudadas/por pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos en ausencia o presencia de IL-1 (5 unidades/ml) y LPS (1 \mug/ml) durante 48 horas. Los sobrenadantes libres de células se recogieron y se midió la concentración de nitrito, TNF-\alpha y PGE2 con reactivo de Griess, kit de citotoxicidad 1.929 y ensayo de PGE2, respectivamente como se describe en "Materiales y Métodos". Los datos representan la media +/- SEM de determinaciones duplicadas de cada muestra de cada grupo de animales. * P<0,05, *** P<0,001 en comparación con el grupo de control.

Figuras 38 A-C. Producción de nitrito (Figura 4A) TNF-\alpha (Figura 4B); PGE2 por células del bazo (Figura 4C). Se cultivaron 1 x 10^{6} células de bazo/pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos en ausencia o presencia de IL-1 (5 unidades/ml) y LPS (1mg/ml) durante 24 o 48 horas. Los sobrenadantes libres de células se recogieron y se ensayaron para la producción de nitrito, TNF-\alpha y PGE2 con reactivo de Griess, kit de citotoxicidad L929 y de ELISA de PGE2, respectivamente como se describe "Materiales y Métodos". Sólo se midió PGE2 en las muestras de cultivo de 24 horas. Los resultados representan la media \pm SEM de las determinaciones duplicadas de cada muestra para cada grupo de animales. *, P<0,05 en comparación con el grupo de control.

Figuras 39A-B. Contenido del estómago (Figura 5A), contenido del riñón (Figura 5B). Se prepararon las cantidades apropiadas de tejido de estómago y renal de ratas F344 para el ensayo del contenido en PGE2 con el kit de ELISA de PGE2 como se describe en "Materiales y Métodos". Los datos se expresan como media \pm SEM de determinaciones duplicadas de cada muestra de cada grupo. Se uso el ensayo t de Student para ensayar la diferencia entre el grupo tratado con EA y el de control. *, P<0,05; ****, P<0,0001.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La presente invención describe el uso de extractos de Tripterygium wilfordii Hook F, y componentes de los mismos, para inhibir procesos inflamatorios y trastornos inmunes junto con la inducción de la inhibición mediada por el receptor de glucocorticoides de la expresión de genes pro-inflamatorios. La inhibición de la activación de estos genes pro-inflamatorios y potenciadotes inmunes proporciona un tratamiento de la inflamación o un trastorno inmune. La demostración adicional de que estos componentes de TwHF carecen de efectos agonistas esteroides indica que este método puede, por lo tanto, usarse para tratar enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, para suprimir la función inmune y para suprimir la inflamación sin los efectos no deseables de esteroides o NSAID que están en uso actual.

También se proporcionan métodos para la unión al receptor de glucocorticoides, demostrando que el acoplamiento de glucocorticoides al receptor de glucocorticoides se inhibe en presencia de la preparación de TwHF. Se proporciona, por tanto, una alternativa al uso de terapéuticos que contienen esteroides en el tratamiento de inflamación y otros trastornos, evitando el uso de TwHF los diversos efectos secundarios relacionados con esteroides asociados a esos agentes, así como evitando la irritación gástrica asociada con NSAID. También se proporcionan agentes terapéuticos para el tratamiento y prevención de la inflamación que son NSAID y libres de esteroides, conteniendo estas preparaciones como ingrediente activo una cantidad farmacéuticamente eficaz de un extracto de TwHF. Como el extracto de TwHF proporciona actividad inflamatoria, pueden reducirse las cantidades de otros agentes tales como NSAID o un esteroide a cantidades mejor toleradas por el paciente proporcionando una función medicinal alternativa, es decir, tal como la función de reducción de la fiebre o de alivio del dolor de NSAID.

El extracto de TwHF inhibe la inducción de ciclooxigenasa-2 (COX-2) pero no tiene efecto directo sobre ciclooxigenasa-1 (COX-1) y probablemente no tiene efecto directo sobre la actividad enzimática de ninguno. Por lo tanto, se describe el bloqueo de la inflamación bloqueando la inducción de COX-2, dejando COX-1 intacto y provocando de este modo ninguno de los efectos secundarios de NSAID que están relaciones con la inhibición de COX-1.

Se preparo T_{2} por extracción con cloroformo-metanol y cloroformo-etanol de raíces de Tripterygium wilfordii Hook F, habiendo retirado la piel de las raíces antes de procesar la raíz. Como ejemplo adicional, la preparación se prepara por extracción con acetato de etilo (Ejemplo 5).

El Ejemplo 1 se refiere a estudios del efecto de la preparación de Tripterygium wilfordii Hook F sobre la función de linfocitos humanos. La producción de interleuquina-2 por células T se inhibe por el extracto de TwHF inhibiendo la transcripción génica, mientras que la expresión de receptores de IL-2 no se ve afectada. También se muestra que la preparación de Tripterygium wilfordii Hook F suprime la proliferación de células B y la producción de inmunoglobulinas por células B. Los estudios descritos en el Ejemplo 2 indican que las vías de señalización no se ven afectadas por la preparación de Tripterygium wilfordii Hook F, demostrando la naturaleza selectiva de la actividad inhibidora del agente. El Ejemplo 3 se refiere a estudios del efecto de la preparación de T. wilfordii en el tratamiento de pacientes con artritis reumatoide. El Ejemplo 4 describe los componentes de la preparación T_{2} de Tripterygium wilfordii Hook F y la toxicidad de los mismos. El Ejemplo 5 describe la preparación de T. wilfordii Hook F obtenida por extracción con acetato de etilo, mientras que el Ejemplo 6 demuestra la actividad in cellulo (efectos de células intactas) del extracto de acetato de etilo.

El Ejemplo 7 proporciona estudios in vivo con el extracto de acetato de etilo de T. wilfordii. El Ejemplo 8 proporciona un estudio de toxicidad comparativo de diversas preparaciones de T. wilfordii. El Ejemplo 9 describe una técnica que puede usarse para determinar el programa de dosis del extracto de acetato de etilo para su uso in vivo. El Ejemplo 10 describe la caracterización e identificación de una fracción "924" (wilforonida) del extracto de acetato de etilo y el Ejemplo 11 describe efectos inmunosupresores de wilforonida. El Ejemplo 12 proporciona estudios que muestran la inhibición de la trascripción del gen de IL-2 y la inhibición de la producción de interferón \gamma por el extracto T2. El Ejemplo 13 demuestra la inhibición de la activación mediada por el receptor de glucocorticoides de la trascripción génica junto con una ausencia de actividad agonista GR intrínseca. El significado de estos resultados es que la inflamación puede tratarse en un sujeto usando T2 sin esteroides, evitando de este modo los efectos agonistas no deseados asociados a los esteroides. El Ejemplo 14 proporciona estudios de las propiedades anti-inflamatorias del extracto TwHF. Se proporciona un nuevo método para separar y cuantificar triptolida y tripdiolida en el Ejemplo 15 y el Ejemplo 16 describe el efecto del extracto TwHF sobre el metabolismo de progesterona, poniendo de relieve la utilidad de la presente invención para la reducción de progesterona, y las diversas condiciones fisiológicas que están relacionadas con la progesterona (es decir, embarazo). El Ejemplo 17 proporciona preparaciones terapéuticas del extracto de TwHF. El Ejemplo 18 proporciona métodos para explorar agentes que tienen actividad de unión a GR y un efecto moderador de esteroides. El Ejemplo 19 se refiere al tratamiento de artritis reumatoide (RA) con un extracto de Tripterygium wilfordii Hook F. El Ejemplo 20 se refiere a la preparación de una composición de Tripterygium wilfordii Hook F. El Ejemplo 21 se refiere a la preparación de Tripterygium wilfordii Hook F y la inflamación articular. El Ejemplo 22 se refiere al hecho de que el tratamiento con un extracto de acetato de etilo de Tripterygium wilfordii Hook F mejora la inflamación articular en ratas transgénicas HLA B27.

Ejemplo 1 Efecto de T_{2} sobre la función de linfocitos humanos

Este ejemplo describe el efecto de la preparación de T. wilfordii, T_{2}, sobre la sensibilidad inmune in vitro de células mononucleares sanguíneas periféricas humanas (PBMC) obtenidas de individuos normales. Se descubrió que la preparación ejercía un perfil dependiente de la concentración de la actividad supresora tanto en funciones de células T como de células B, mientras que las actividades funcionales de los monocitos eran más resistentes a los efectos supresores de esta preparación de T. wilfordii con cloroformo/metanol.

Métodos

Preparación celular. Se obtuvieron PBMC de la sangre de adultos sanos por centrifugación en gradientes de diatrizoato sódico/Ficoll (Sigma, St. Louis, MO). Se aislaron los monocitos de PBMC por centrifugación en Sepra-cell-MN (Sepratech, Oklahoma City, OK) o por adherencia al vidrio. Los monocitos obtenidos de los dos procedimientos se usaron para examinar la producción de interleuquina-1 (IL-1) y presentación de antígeno, respectivamente. Para la purificación de células T y células B, se incubaron PBMC con metil éster HCl de L-leucina (Sigma) durante 45 minutos a temperatura ambiente para eliminar los monocitos y las células natural killer^{51}. Los linfocitos resultantes se dispusieron en rosetones con glóbulos rojos de oveja tratados con neuraminidasa (SRBC) y después se separaron por centrifugación en Ficoll/diatrizoato^{52}. Las células T se purificaron adicionalmente por pases de la población positiva a rosetones en una columna de nylon-lana para retirar las células B residuales y los monocitos^{53}. Las células B se prepararon a partir de la población inicial de células negativas a rosetones retirando cualquier célula restante que formara rosetones con SRBC tratadas con neuraminidasa.

La tinción con anticuerpos monoclonales (Mab) para CD3 y CD20 y el análisis con el clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) indicaron que las poblaciones de células T y células B eran más del 96% y el 90% puras, respectivamente. Las células T se incubaron con mitomicina c (0,1 mg/ml) durante 45 minutos y después se lavaron minuciosamente^{54}.

Reactivos. La preparación de T. wilfordii, T_{2} usada en estos estudios era un extracto de cloroformo/metanol preparado a partir de la parte leñosa de las raíces de TWH obtenido de Taizhou Pharmaceutical Company (Taizhou, Jiang Su, República Popular China). Esta preparación, T_{2}, contenía más de 8 compuestos diferentes incluyendo glucósidos, diterpenoides, alcaloides, y cetonas. Antes de su uso, el extracto se disolvió en DMSO y se disolvió adicionalmente con medio de cultivo. Se usaron fitohemaglutinina (PHA; Wellcome Reagents, Research Triangle Park, NC), forbol dibutirato (PDB; Sigma), ionomicina (Calbiochem, San Diego, CA), y el MAb anti-CD3, 64.1, para la activación de células T^{55}. Se purificó Mab 64.1 como se ha descrito previamente [Hansen et al., "T cell protocol", Leucocyte Typing. Editado por Bernard, et al. Berlín, Springer-Verlag, 1982]. Se usó interleuquina-2 recombinante humana (rIL-2; Cetus, Emeryville, CA) y/o Staphylococcus aureus tratado con formalina (SA; Calbiochem) para la activación de células B. Se obtuvo el MAb frente a la cadena \alpha del receptor de IL-2 (IL-2R), anti-Tac, del Dr. Thomas Waldmann (NM, Bethesda, MD) y se usó para analizar la expresión de IL-2R. Se adquirió interleuquina-1 (Cistron Technology, Pine Brook, NJ) para la normalización del ensayo de IL-1. Se adquirieron anticuerpos de cabra anti-IgA, IgG y IgM humanos purificados por afinidad y anticuerpos similares conjugados a peroxidasa de rábano rusticano de Tago (Burlingame, CA). Se adquirieron estreptoquinasa (SK), y toxoide del tétanos (TT) de Hoeschst-Roussel (Somerville, NJ) y MCDC Biologics (Jamaica Plain, MA), respectivamente.

Cultivo celular y ensayo de síntesis de ADN de linfocitos. Se cultivaron células T (1 x 10^{5}/pocillo) o células B (5 x 10^{4}/pocillo)solas o células B con células T tratadas con mitomicina c (1 x 10^{5}/pocillo) en medio RPMI 1640 (Hazleton Biologics, Lenexa, KS) suplementado con suero de ternera fetal al 10%, penicilina G (200 unidades/ml), gentamicina (10 \mug/ml), y L-glutamina (0,3 mg/ml) en placas de microtitulación de 96 pocillos en un volumen total de 200 \mul, con o sin los estímulos indicados, y en presencia o ausencia de diversas concentraciones de T_{2}. La concentración final de DMSO en los cultivos fue del 0,02-0,002%. Esta concentración de DMSO no tuvo efecto en ninguna de las respuestas analizadas.

Tanto para la activación de células T como de células B, se uso estimulación anti-CD3 inmovilizada (MAb 64.1). Este MAb se inmovilizó incubando 30 \mul (5 \mug/ml) en cada pocillo durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. El exceso de anticuerpos solubles se retiró antes del cultivo celular (Hansen, supra). Las células se cultivaron durante la duración indicada, y después se pulsaron con 1 \muCi de ^{3}H-timidina (^{3}H-TdR; New England Nuclear, Boston, Ma) durante las últimas 12 y 18 horas para los cultivos de células T y células B, respectivamente. La captación de ^{3}H-TdR se midió en un contador de gente en un líquido. Todos los datos se expresan como los recuentos medios por minuto de 3 determinaciones replicadas^{56}.

Ensayo de producción de IL1. Se suspendieron monocitos (1 x 10^{5}/pocillo) en medio RPMI 1640 con suero humano normal al 1% (NHS) y se cultivaron con o sin lipopolisacárido (10 \mug/ml) en presencia o ausencia de diversas concentraciones de T_{2} durante 24 horas. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y se ensayaron diluciones en serie para IL-1 usando timocitos murinos C3H/HeJ como se describe en otra parte^{57}. Las concentraciones de T_{2} contenidas en las diluciones de los sobrenadantes no tuvieron efecto en la síntesis de ADN por timocitos C3H/HeJ.

Ensayo de producción de IL-2. Se incubaron células T (1 x 10^{5}/pocillo) con o sin PHA (1 \mug/ml) o anti-C3 inmovilizado en presencia o ausencia de diversas concentraciones de T_{2} durante 24 horas. Los sobrenadantes libres de células se recogieron, se hicieron diluciones en serie, y se ensayó el contenido en IL-2 con células CTLL-2 como se ha descrito previamente^{58}.

Expresión de IL-2R. Se cultivaron células T con o sin los estímulos indicados en presencia o ausencia de diversas concentraciones de T_{2} durante 36 horas. Después del lavado, las células se tiñeron con concentraciones de saturación de MAb anti-Tac o una de control de IgG de ratón, seguido de anticuerpo de cabra anti-Ig de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Cap-pel, West Chester, PA). Las muestras se fijaron con paraformaldehído al 1% y se analizaron con un citómetro de flujo FACSTAR (Becton Dickinsonc, Mountain View, CA), usando un programa estadístico de histograma único (Davis, supra).

Medida de síntesis de Ig. La cantidad de IgG, IgA e IgM en los sobrenadantes del cultivo de células B estimuladas con SA más rlL-2 en presencia o ausencia de T_{2} durante 7 días se determinó usando un método de ensayo inmunoabsorbente de enzimas unidas específico de isotipo. La cuantificación de la Ig en los sobrenadantes después se determinó por comparación con una curva patrón. La sensibilidad del ensayo es 15 ng/ml para IgA e IgG, y 30 ng/ml para
IgM ^{59}.

Resultados

Efecto de T_{2} sobre la sensibilidad de células T humanas. Estos estudios demuestran que T_{2} provocó una inhibición dependiente de la concentración de la incorporación de ^{3}H-timidina inducida por PHA por linfocitos T humanos purificados (Figura 1). Se observó una inhibición del cincuenta por ciento a concentraciones de aproximadamente 02 \mug por ml. El análisis del ciclo celular indicó que T_{2} evitaba que las células progresaran a través de la fase G1 del ciclo celular (Figuras 2 A-2L). La producción de IL-2 inducida por mitógeno por células T purificadas también se inhibió por una concentración similar de T_{2} (Figura 3). La expresión inducida por mitógeno de receptores de IL-2 no se inhibió por T_{2} (Tabla 1) lo que indica que no fue tóxica a esta actividad celular. Estos resultados sugirieron que la disminución en la proliferación podría ser el resultado de la inhibición de la producción de IL-2.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

Efecto de T_{2} sobre la expresión del receptor de interleuquina-2 (IL-2)*
	NiI	PHA
T_{2}	% positivo	Intensidad de fluorescencia	% positivo	Intensidad de fluorescencia
0 \mug/ml	10 \pm 2	483 \pm 18	65 \pm 17	561 \pm 166
0,65 \mug/ml	-	-	60 \pm 22	519 \pm 109
1,25 \mug/ml	9 \pm 2	504 \pm 29	61 \pm 20	525 \pm 128
2,50 \mug/ml	-	-	-	-
* \begin{minipage}[t]{150mm} Se cultivaron células T (1 x 10^{5}/pocillo) con medio o fitohemaglutinina (PHA) en presencia o ausencia de diversas concentraciones de T_{2} como se indica para 36 horas. Las células se recogieron, se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-Tac seguido de IgG de cabra anti-ratón conjugada con isotiocianato de fluoresceína, y se analizaron por citometría de flujo. Los valores son la media \pm SEM de 6 experimentos.\end{minipage}

Para examinar la producción de IL-2, se realizaron experimentos en los que se examinó el efecto de T_{2} sobre la proliferación en presencia de IL-2 suplementaria. Como puede verse en la Figura 4, gran parte del efecto inhibidor de T_{2} se superó por IL-2 suplementaria. Se estudió el efecto de T_{2} en los niveles en estado estacionario del ARNm de IL-2 en células T estimuladas con mitógeno. Se cultivaron células T (1 x 10^{6}/ml) con y sin PHA en presencia o ausencia de T_{2} (1 \mug/ml). Después de una incubación de 4 horas, se aisló el ARN total y se determinaron los niveles del ARNm de IL-2 y actina por protección con nucleasa S1. Los resultados sugirieron que una de las principales acciones de T_{2} era inhibir la producción de IL-2. Esto pareció estar provocado por una inhibición de la trascripción del gen de IL-2 ya que T_{2} inhibía la aparición de ARNm para IL-2. Estos experimentos confirmaron que una acción de T_{2} era inhibir la producción de IL-2.

Se describe en este documento un método para ensayar la inhibición selectiva de ARNm específico de IL-2, constando el método de: cultivar células eucariotas en cultivo de manera separada con y sin extracto T_{2} de Tripterygium wilfordii Hook F o componentes del mismo en una cantidad terapéuticamente eficaz para proporcionar una muestra de ensayo y una muestra de control; medir el nivel de ARNm de IL-2 y un nivel ARNm de referencia tal como ARNm de actina para proporcionar una muestra de ARNm de IL-2 de ensayo, y una muestra de ARNm de referencia de ensayo, una muestra de ARNm de IL-2 de control y una muestra de ARNm de referencia de control; comparar (nivel de ARNm de IL-2 de ensayo \divnivel de ARNm de IL-2 de control) con (nivel de ARNm de referencia de ensayo
\divnivel de ARNm de referencia de control); y cuando (nivel de ARNm de IL-2 de ensayo \divnivel de ARNm de IL-2 de control) es sustancialmente inferior a 1 y (nivel de ARNm de referencia de ensayo \divnivel de ARNm de referencia de control) es aproximadamente 1, se indica la inhibición selectiva de la producción de ARNm de IL-2 por T_{2.}

Efecto de T_{2} sobre respuestas de linfocitos B humanos

Se demostraron efectos adicionales de T_{2} cuando se examinó su acción sobre respuestas de células B humanas. Como puede verse en la figura 5A y 5B, T_{2} inhibió tanto la proliferación inducida por mitógeno de células B altamente purificadas, así como la producción de inmunoglobulinas de un modo dependiente de la concentración. Estos resultados sugirieron que T_{2} tenía efectos adicionales más allá de la alteración de la producción de IL-2. Se demostró alguna especificidad de la acción de T_{2}, sin embargo, cuando se examinaron sus efectos sobre varios tipos celulares distintos. Por tanto, T_{2} no tuvo efecto sobre la producción de IL-1 por monocitos humanos ni sobre su capacidad de funcionar como células presentadoras de antígeno. Además, no hubo efectos sobre el crecimiento de células endoteliales o fibroblastos durante un cultivo de 48 horas. Ninguno de los efectos inhibidores de T_{2} podía estar explicado por la toxicidad no específica, ya que concentraciones inhibidoras ya que las concentraciones inhibidoras de T_{2} no tuvieron efecto sobre la viabilidad de los linfocitos restantes o estimulados, células endoteliales, fibroblastos, monocitos, o leucocitos polimorfonucleados. Estos resultados mantienen la conexión de que T_{2} tiene un espectro limitado de actividad inmunosupresora que no puede explicarse por los efectos tóxicos no específicos. Es de importancia, que la capacidad de T_{2} de suprimir tanto la producción de IL-2 por células T, como la proliferación y producción de inmunoglobulinas por células B puede explicar la acción de este agente en pacientes con RA.

Ejemplo 2 Efecto de T_{2} sobre las vías de señalización críticas

El mecanismo por el que T_{2} inhibe la producción de IL-2 se examina con más detalle en el presente ejemplo. T. wilfordii puede inhibir una vía de señalización crítica implicada en la inducción de la trascripción del gen de IL-2. La información actual sugiere que la ocupación del receptor de células T conduce a la activación de tirosina quinasas, seguido por la estimulación de fosfolipasa. Esto provoca la producción de fosfatidil inositol trifosfato y diacilglicerol, que induce el aumento en al calcio intracelular y la activación de proteína quinasa C, respectivamente^{60}. Por lo tanto, se realizaron estudios adicionales para examinar la posibilidad de que T_{2} pudiera inhibir una de estas vías de señaliza-
ción.

Métodos

Efecto de la preparación de T_{2} sobre la generación de IP total por células T activadas. Se marcaron células T frescas (A) o células Jurkat (B) con [^{3}H]-mio-inositol durante una noche en ausencia o presencia de las concentraciones indicadas de la preparación de T. wilfordii obtenidas por extracción con cloroformo-metanol que se habían obtenido de la fuente de suministro descrita en el Ejemplo 1. Las células se lavaron e incubaron con LiCl 10 mn durante 5 minutos, después se activaron con PHA durante 60 minutos. Las células se extrajeron con 0,75 ml de una mezcla de 1:1 de cloroformo y metanol, seguido por 0,25 ml de cloroformo y 0,25 ml de agua. Las fases se separaron por centrifugación y las fracciones solubles en agua se aplicaron a una columna de intercambio iónico con 0,25 ml de Agl-X8 formiato. Se eluyó el inositol fosfato total con 1,5 ml de ácido fórmico 0,1 M y formiato sódico 1 M. La radiactividad se cuantificó por recuento de centelleo. También se estimuló una alícuota de cada población celular con PHA durante 24 horas y los sobrenadantes se ensayaron para el contenido en IL-2 usando células CTLL-2.

Efecto de T_{2} sobre la generación de fracciones IP por células T activadas con PHA. Se marcaron células Jurkat con [^{3}H]-mio-inositol durante una noche en presencia o ausencia de diversas concentraciones de T_{2}. Después de una incubación de 5 minutos con LiCl 10 mM, las células se activaron con PHA durante 60 minutos. Se aislaron los IP solubles en agua y se cuantificaron. Para conseguir esto, los cultivos se extrajeron con 0,75 ml de una mezcla de 1:1 de cloroformo/metanol, seguido por 0,25 ml de cloroformo y de agua. Las fases se separaron por centrifugación y la fracción soluble se aplicó a una columna de intercambio iónico de 0,25 ml de Agl-X8 formiato, y se lavó ampliamente con mio-inositol 5 \muM frío. Se eluyeron secuencialmente IP1, IP2 e IP3 con 4 ml de formiato amónico 0,2 M más ácido fórmico 0,1 M, 10 ml de formiato amónico 0,4 M más ácido fórmico 0,1 M y 10 ml de formiato amónico 1 M más ácido fórmico 0,1 M respectivamente. La radiactividad de las diversas fracciones de elución se cuantificó por recuento de centelleo.

Efecto de T_{2} en la generación de DAG y secreción de IL-2 por células T estimuladas con PHA. Las células T para cada muestra se cultivaron durante una noche con PHA en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de T_{2} . Los sedimentos celulares se lisaron con una mezcla de cloroformo y metanol, y las fracciones se separaron con NaCl 1 M y cloroformo. La fase orgánica se recogió y se secó en nitrógeno. La masa de DAG en el extracto orgánico se ensayo solubilizando los restos lipídicos en una mezcla de ^{32}P-\gamma-ATP y DAG quinasa y ácido fosfatídico, incubando a 37ºC durante una hora durante lo cual se convirtió DAG cuantitativamente a ácido p-fosfatídico. Las muestras se secaron y se volvieron a disolver en cloroformo. El disolvente se aplicó a un gel de sílice y se separó por cromatografía en capa fina con cloroformo/metanol/ácido acético. Después de la visualización con yodo, la mancha que contenía ácido fosfatídico se recogió y se determinó la radiactividad por recuento de centelleo líquido. También se estimuló una alícuota de células con mitógeno y los sobrenadantes se recogieron después de 24 horas y se evaluaron para el contenido en IL-2.

Efecto de T_{2} sobre la traslocación de PKC. Se incubaron células Jurkat (1 x 10^{6}/ml) durante una noche con o sin T_{2} a las concentraciones indicadas. Las células se lisaron por sonicación y después se separaron las fracciones citoplásmica y de membrana por centrifugación. Se ensayó la actividad PKC tanto en la fracción citoplásmica como de membrana usando un sistema de ensayo de proteína quinasa C (Amersham) que empleó un péptido sintético como aceptor de fosfato en presencia de fosfatidilserina, calcio y PMA.

Efecto de T_{2} sobre la fosforilación de tirosina de proteínas. Se incubaron células Jurckat (3 x 10^{6}) durante una noche en ausencia o presencia de las concentraciones indicadas de T_{2}. Las células se lavaron y estimularon con pH a durante 30 minutos. Después de la centrifugación, las células sedimentadas se solubilizaron con tampón de muestra 1 x SDS que contenía inhibidores de proteasa. Los lisados se centrifugaron a 10.000 rpm durante 15 minutos. Los sobrenadantes se analizaron para la fosforilación de proteínas por transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal de ratones (Upstate Biotechnology, Inc.) frente a fosfotirosina.

Resultados

El efecto de T_{2} sobre la producción inducida por mitógeno de metabolitos de fosfatidil inositol. Como puede verse en la Figura 6A-6B, la estimulación mitogénica conduce a la producción de IL2 y metabolitos de fosfatidil inositol. Mientras que se inhibió la producción de IL-2, no se inhibió la generación de metabolitos de fosfatidil inositol. Se vieron resultados similares en células T frescas y en la línea de células T leucémicas Jurkat. Estudios adicionales examinaron si T_{2} inhibe específicamente la generación de IP3, que se cree que induce aumentos en el calcio intracelular^{52}. Como puede verse en la Figura 7A-7C, T_{2} no tuvo efecto sobre la generación de IP3 u otros metabolitos PI específicos por células T activadas por mitógeno. Experimentos similares examinaron el efecto de T_{2} sobre la generación de diacilglicerol. Como puede verse en la Figura 8, T_{2} inhibía la producción de IL-2 de células T estimuladas con mitógeno, pero no tuvo efecto sobre la producción de DAG. Adicionalmente en los estudios de la invención, no mostrados, se examino la actividad de T_{2} sobre la actividad fosfolipasa C aislada de T frescas o células Jurkat. Otra vez no se observó actividad inhibidora. Estos experimentos sugirieron que la acción de T_{2} no puede explicarse por un efecto sobre estas vías de señalización tempranas. A estos niveles de adición de extracto de T_{2}, no se establece toxicidad a otras funciones celulares como se indica por estos ensayos celulares.

El efecto de T_{2} sobre la activación de proteína quinasa C. Como puede verse en la Figura 9A-9B, la estimulación con mitógeno condujo a la traslocación de PKC en células Jurkat, y T_{2} no provoca la traslocación de PKC. Finalmente, se exploró el efecto de T_{2} sobre la actividad de la actividad proteína tirosina quinasa. La estimulación mitogénica de células T conduce a la fosforilación de varias especies proteicas identificadas con un anticuerpo específico para fosfotirosina. Sin embargo, T_{2} no inhibió la actividad de proteína tirosina quinasa ya que se observaron las mismas bandas independientemente de la presencia de T_{2} durante la estimulación mitogénica. Estos experimentos demuestran de forma convincente que T_{2} no tiene efecto sobre las vías de señalización tempranas implicadas en la inducción de la trascripción del gen de IL-2.

Ejemplo 3 Ensayos in vivo

En un ensayo abierto, se descubrió que una mezcla de compuestos (T_{2}) extraídos de Tripterygium wilfordii Hook F era eficaz en el tratamiento de artritis reumatoide.

Para confirmar los resultados previos obtenidos de estos estudios abiertos, se diseñó y realizó un estudio de cruce doble ciego controlado posible.

El plan de tratamiento se diseño del siguiente modo:

Setenta pacientes con artritis reumatoide de aparición en adultos clásica o evidente que tenían enfermedad activa durante más de 6 meses se aceptaron en el ensayo y se asignaron aleatoriamente a 2 grupos de tratamiento. Los pacientes en el Grupo A recibieron T_{2} durante un primer transcurso de tratamiento de 12 semanas, y después se cambiaron posteriormente a placebo durante un segundo transcurso de tratamiento de 4 semanas de duración. Los pacientes del Grupo B recibieron placebo durante el primer transcurso y después se cruzaron y recibieron terapia con T_{2} durante el segundo transcurso. Se tomó T_{2} en una dosificación de 60 mg al día. Los comprimidos de placebo eran idénticos en apariencia a los comprimidos de T_{2}. La Tabla 2 muestra el programa del plan de tratamiento.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

Plan de tratamiento (transcurso total: 16 semanas)
	Primer transcurso del tratamiento	Segundo transcurso del tratamiento
	(12 semanas)	(4 semanas)
Grupo A	T_{2}, 20 mg t.i.d.	Placebo
Grupo B	Placebo	T_{2}, 20 mg t.i.d.

\vskip1.000000\baselineskip

Todos los pacientes se evaluaron en una clínica de artritis cada 4 semanas. La evaluación clínica, evaluación global por los médicos y distribución de fármacos se realizó por doctores individuales de un modo ciego. Las evaluaciones de laboratorio se hicieron por técnicos de un laboratorio hospitalario central, que también estaban ciegos a los detalles del ensayo.

TABLA 3

Características clínicas de los pacientes que acceden al ensayo
	Primer Transcurso de	Segundo Transcurso de
	Tratamiento	Tratamiento
	Grupo A	Grupo B	Grupo A	Grupo B
	T_{2}	Placebo	Placebo	T_{2}
Número de pacientes	35	35	27	31
Hombre/Mujer	3/32	4/31	1/26	4/27
Edad media, años	46,3	48,0	46,2	47,7
Duración media de la enfermedad (años)	5,9	6,1	5,8	6,0
Etapa de la Enfermedad
\hskip0,6cm (1)	6	6	4	5
\hskip0,6cm (2)	14	16	11	13
\hskip0,6cm (3)	12	10	10	9
\hskip0,6cm (4)	3	3	2	4

Las características clínicas de los pacientes que entran en el ensayo se muestran en la Tabla 3. Los análisis estadísticos demostraron que en el inicio del ensayo, el Grupo A y el Grupo B no diferían entre sí de manera significativa en edad, sexo, duración de la enfermedad o fase de la enfermedad.

TABLA 4

Resultados de un ensayo controlado de T_{2} en artritis reumatoide
Grupo	Nº que Comienza	Nº de Pacientes que Completan el Tratamiento
	el Tratamiento	Primer Transcurso	Segundo Transcurso
		(12 semanas)	(4 semanas)
A (T_{2} -> Placebo)	35	27	24
B (Placebo -> T_{2})	35	31	25

Como se muestra en la Tabla 4, 27 pacientes del Grupo A completaron el primer transcurso de tratamiento, de los que 24 completaron el segundo transcurso. Del grupo B 31 y 25 completaron el primer transcurso y el segundo transcurso de tratamiento, respectivamente.

La Tabla 5 indica las razones de la retirada de los pacientes del estudio. Tres pacientes del Grupo B pero ninguno del Grupo A se retiraron del ensayo por el empeoramiento de la enfermedad durante el primer transcurso de tratamiento, mientras que 4 pacientes del Grupo A pero ninguno del Grupo B se retiraron del ensayo a causa de efectos secundarios.

TABLA 5

Razones para la retirada del estudio
	Primer Transcurso del Tratamiento	Segundo Transcurso del Tratamiento
	Grupo A T_{2}	Grupo B Placebo	Grupo A Placebo	Grupo B T_{2}
	(n=35)	(n=35)	(n=27)	(n=31)
	Nº	%	Nº	%	Nº	%	Nº	%
Pérdida de seguimiento	4	11	1	3	3	11	6	19
Empeoramiento de la	0	0	3	9	0	0	0	0
enfermedad
Efectos secundarios	4	11	0	0	0	0	0	0

La Tabla 6 muestra los efectos terapéuticos del primer transcurso de tratamiento. En comparación con los pacientes del Grupo B, los pacientes del Grupo A mostraron una mejora significativa en todas las evaluaciones clínicas incluyendo agarrotamiento matutino, valor de dolor articular, número de articulaciones hinchadas, fuerza de agarre y tiempo para caminar 15 metros.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6

Cambios en los parámetros clínicos en pacientes que completan el primer transcurso del tratamiento
		Grupo A T_{2}	Grupo B Placebo	*p
		n=27)	(n=31)
Agarrotamiento	Antes	2,4 \pm 0,4	1,1 \pm 0,2
matutino	Después	0,9 \pm 0,2	2,3 \pm 1,4	0,01
Valor del dolor	Antes	25,1 \pm 1,9	25,5 \pm 1,7
articular	Después	7,9 \pm 1,3	21,9 \pm 2,1	0,001
Número de	Antes	9,2 \pm 0,9	7,8 \pm 0,7
articulaciones	Después	4,3 \pm 0,6	7,4 \pm 1,1	0,01
hinchadas
Fuerza de agarre	Antes	49,0 \pm 0,4	73,6 \pm 7,7
(media de ambos	Después	84,4 \pm 7,5	81,2 \pm 8,9	0,05
lados, mm Hg)
Tiempo para caminar	Antes	36,6 \pm 6,6	37,0 \pm 2,4
15 metros (s)	Después	21,6 \pm 1,5	31,9 \pm 3,6	0,05

\vskip1.000000\baselineskip

La mayoría de la mejora digna de atención se observó en el valor de dolor articular, que mejoró de una media de 25,1 antes de la entrada a una media de 7,9 después del primer transcurso de tratamiento con T_{2.} Por el contrario, no hubo cambios significativos en este valor en los pacientes del Grupo B tratados con placebo.

Como se muestra en la Tabla 7, el tratamiento con T_{2} también provocó mejora en los equivalentes de laboratorio en la actividad de la enfermedad. Se observaron mejoras significativas en los niveles de ESR, CRP e inmunoglobulina. Las cambios fueron significativos al nivel p 0,001 cuando se comparan entre el Grupo A y el Grupo B.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7

Cambios en los parámetros de laboratorio en pacientes que completan el primer transcurso del tratamiento
		Grupo A T_{2}	Grupo B Placebo	*P
		(n=27)	(n=31)
ESR (mm/hora)	Antes	69,2 \pm 6,4	63,9 \pm 5,2
	Después	41,0 \pm 5,9	67,2 \pm 6,6	< 0,001
CRP (u/ml)	Antes	29,4 \pm 5,7	31,6 \pm 4,1
	Después	10,4 \pm 3,9	43,7 \pm 7,0	< 0,001
RF (títulos)	Antes	87,1 \pm 23,2	86,1 \pm 35,5
	Después	48,0 \pm 13,4	63,4 \pm 10,9	NS
IgG (u/ml)	Antes	227,5 \pm 4,6	231,9 \pm 14,2
	Después	117,4 \pm 9,5	180,4 \pm 29,8	< 0,001
IgM (u/ml)	Antes	302,8 \pm 40,3	284,5 \pm 32,2
	Después	105,2 \pm 11,1	261,3 \pm 29,3	< 0,001
IgA (u/ml)	Antes	289,6 \pm 29,4	257,6 \pm 25,2
	Después	149,0 \pm 15,5	280,4 \pm 29,8	< 0,001
* Grupo A frente a Grupo B

\newpage

Hubo mayor tendencia a disminuir el título RF en pacientes tratados con T_{2} pero la diferencia entre los dos grupos después del primer transcurso de tratamiento no fue estadísticamente significativa.

Durante el segundo transcurso de terapia, los pacientes que habían recibido placebo inicialmente mejoraron de manera significativa después de 4 semanas de terapia con T_{2}. (Véase la Tabla 8). Se observaron mejoras significativas en el valor de dolor articular, cantidad de articulaciones hinchadas y fuerza de agarre. También se observó la mejora en el agarrotamiento matutino y el tiempo para caminar 15 metros, pero estos cambios no consiguieron significancia estadística. Los pacientes que habían recibido T_{2} durante las primeras 12 semanas de terapia continuaron manteniendo la mejora incluso después de 4 semanas de terapia con placebo durante el segundo transcurso.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8

Cambios en los parámetros clínicos en pacientes que completan el segundo transcurso de tratamiento
		Grupo A T_{2}	*p	Grupo B Placebo	*p
		(n = 27)		(n = 31)
Agarrotamiento	Antes	1,8 \pm 0,2		2,5 \pm 1,7	NS
matutino (horas)	Después	0,8 \pm 0,2	NS	1,3 \pm 0,9
Valor de dolor	Antes	7,9 \pm 1,4		22,2 \pm 2,4
articular	Después	11,0 \pm 2,6	NS	13,5 \pm 2,0	<0,001
Número de	Antes	4,2 \pm 0,8	NS	7,0 \pm 1,2
articulaciones	Después	4,4 \pm 0,9		3,5 \pm 0,5	<0,05
hinchadas
Fuerza de agarre	Antes	87,5 \pm 8,0	<0,05	80,1 \pm 9,2
(media de ambos	Después	70,2 \pm 9,5		97,1 \pm 13,2	0,05
lados, mm de Hg)
Tiempo para	Antes	20,3 \pm 1,7	NS	31,5 \pm 5,9
caminar 15 metros	Después	17,1 \pm 0,6		18,9 \pm 2,3	NS
(segundos)
* Después frente a antes del tratamiento

\vskip1.000000\baselineskip

Aparte de la fuerza de agarre, no se observaron cambios significativos en las evaluaciones clínicas en pacientes del Grupo A después de 4 semanas de tratamiento con placebo.

Como se muestra en la Tabla 9, se observaron disminuciones significativas en ESR y título RF en pacientes del Grupo B después del segundo transcurso de tratamiento. No se observó empeoramiento significativo en los parámetros de laboratorio en pacientes del Grupo A después de 4 semanas de terapia con placebo.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 9

Cambios en los parámetros de laboratorio en pacientes que completan el segundo transcurso de tratamiento
		Grupo A T_{2}	*p	Grupo B Placebo	*p
		(n = 24)		(n = 25)
ESR (mm/hora)	Antes	42,3 \pm 6,0		68,5 \pm 6,9	<0,001
	Después	31,7 \pm 7,3	NS	22,0 \pm 4,9
RF (títulos)	Antes	49,3 \pm 13,5		67,2 \pm 12,1
	Después	32,0\pm12,3	NS	32,0 \pm 19,1	<0,05
* Después frente a antes del tratamiento

La eficacia global de T_{2} en el presente ensayo se clasificó por su capacidad de inducir remisiones, mejora significativa o ausencia de efecto terapéutico. (Véase Tabla 10).

TABLA 10

Evaluación global del presente ensayo
Primer Transcurso de Tratamiento	Segundo Transcurso de Tratamiento
Grupo A T_{2}	Grupo B Placebo	Grupo A Placebo	Grupo B T_{2}
(n = 27)	(n = 31)	(n = 24)	(n = 25)
	Nº	%	Nº	%	Nº	%	Nº	%
Remisión	2	7,4	0	0	0	0	0	0
Mejora
Evaluación	25	93	7	23	20	82	20	80
del paciente
Evaluación	25	93	7	23	19	79	22	88
del médico
Criterios	22	82	7	23	19	79	11	44
clínicos
Evaluación	23	85	4	13	18	75	13	52
de
laboratorio

\vskip1.000000\baselineskip

En base a los criterios terapéuticos para la remisión en RA desarrollada por un subcomité de la ARA, se observó remisión en los pacientes del Grupo A al final del primer transcurso de tratamiento.

El porcentaje de pacientes que experimentaron mejoras significativas fue significativamente superior para pacientes del Grupo A que del Grupo B como se evaluó por la evaluación del médico y evaluaciones clínicas y de laboratorio después del primer transcurso de tratamiento.

El porcentaje de pacientes del Grupo B que experimentaron mejoras significativas después del segundo transcurso de tratamiento también fue marcado, mientras que la mejora se mantuvo en pacientes del Grupo A durante las 4 semanas del segundo transcurso de placebo.

Para determinar si T_{2} ejercía un efecto inmunosupresor en pacientes con RA, se obtuvieron células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de 18 pacientes de cada grupo antes y después del primer transcurso de tratamiento. Estas células se cultivaron durante 14 días y las cantidades de IgM-RF e IgM total secretadas se determinaron usando un radioinmunoensayo. (Véase Tabla 11).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 11

Producción de IgM-RF e IgM total de pacientes después del primer transcurso de tratamiento
		Grupo A T_{2}	Grupo B Placebo	*p
		(n = 18)	(n = 18)
RF	Antes	7,2 \pm 3,2	5,4 \pm 1,6
	Después	1,5 \pm 0,5	7,0 \pm 2,2	<0,01
IgM	Antes	220,7 \pm 53,6	260,5 \pm 49,3
	Después	151,9 \pm 55,3	301,2 \pm 100,5	<0,01
* Grupo A frente a Grupo B

\vskip1.000000\baselineskip

En comparación con el Grupo B, se observaron disminuciones significativas tanto en IgM-RF como IgM total en el Grupo A después del tratamiento con T_{2}. Estos resultados sugieren que la terapia con T_{2} había suprimido la producción tanto de IgM como de IgM RF en estos pacientes y por tanto ejercía un efecto inmunosupresor.

Como se muestra en la Tabla 12, los efectos secundarios más habituales de T_{2} fueron reacciones dérmicas incluyendo erupción cutánea, queilosis, debilitamiento de la piel y las uñas y pigmentación.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 12

Incidencia de reacciones adversas
	Primer transcurso de tratamiento	Segundo transcurso de tratamiento
	Grupo A T_{2}	Grupo B Placebo	Grupo A	Grupo B T_{2}
	(n = 31)	(n = 31)	Placebo (n = 24)	(n = 25)
	Nº	%	Nº	%	Nº	%	Nº	%
Erupción cutánea	15	39	1	3	0	0	7	28
y queilosis
Diarrea	6	27	0	0	0	0	2	8
Anorexia	2	5	0	0	1	4	0	0
Dolor abdominal	2	5	1	3	0	0	0	0
Amenorrea	5/16	31	0	0	S/16	31	1/18	6
Sangrado vaginal	1/10	10	0	0	0	0	0	0
postmenopáusico

\vskip1.000000\baselineskip

Aunque la incidencia de reacciones cutáneas fue bastante alta en el Grupo A durante el primer transcurso de tratamiento, ninguno de los pacientes tuvo que alterar la continuidad en el tratamiento con T_{2}. La amenorrea fue otro efecto secundario importante de T_{2}. Se observó que el 31% de los pacientes femeninos con edad de 49 o menos que habían recibido T_{2} durante 12 semanas desarrollaron amenorrea mientras que el 6% de los pacientes lo desarrollaron después de 4 semanas de tratamiento con T_{2}. La amenorrea desapareció en la mayoría de los pacientes cuando se interrumpió el tratamiento con T_{2}.

La Figura 10 resume las mejoras evaluadas en los síntomas de artritis reumatoide descritos anteriormente. T_{2} es un tratamiento eficaz para artritis reumatoide, mejorando significativamente las manifestaciones clínicas y equivalentes de laboratorio de inflamación. Aunque fue frecuente la toxicidad, se necesitó un cese de la terapia en pocos casos. Se observó mejora clínica después de sólo 4 semanas de terapia y persistió durante al menos 4 semanas después de que se interrumpiera la medicación. La terapia con T_{2} suprime la producción in vitro de IgM y factor reumatoide IgM.

La administración del extracto T_{2} también ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de lupus sistémico eritematoso (Tabla 13). También parece que es eficaz en aliviar las manifestaciones clínicas agudas que incluyen inflamación articular, erupción cutánea y enfermedad renal (Tabla 13). También se observó un efecto moderador de esteroides de T_{2}. En comparación con los corticoesteroides y agentes inmunosupresores habitualmente usados, tales como ciclofosfamida, los pacientes tratados con T_{2} tuvieron pocas complicaciones significativas.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 13

Efecto terapéutico de T_{2} en Lupus Nefritis
1.	Grupo de pacientes
	Se trataron con T_{2} 10 pacientes, con edades de 22-37, con duración de la enfermedad >1.
2.	Evaluación de laboratorio - antes del tratamiento
	+ANA: 10
	unión a anti-ADN >20%: 9
	Proteinuria > 3 g/24 h:10
	Creatinina en suero elevada: 3
3.	Plan de tratamiento
	Primer mes: 20 mg tid. de T_{2}. Mantener prednisona <40 mg/día
	Seguido de 10 mg tid. de T_{2} y prednisona en disminución
	Transcurso total de T_{2}: 24 semanas

TABLA 13 (continuación)

Efecto terapéutico de T_{2} en Lupus Nefritis
4.	Resultados de tratamiento:
	La creatinina en suero volvió a ser normal en 2/3
	La proteinuria mejoró en 10/10:
	\hskip0,5cm indetectable: 3
	\hskip0,5cm <1 g/24 h: 3
	\hskip0,5cm >1 g/24 h: 4
	Medicación concomitante
	\hskip0,5cm 3: retirada de prednisona
	\hskip0,5cm 6: prednisona continuada <10 mg/día
	\hskip0,5cm 1: cambiado a ciclofosfamida

Ejemplo 4 Componentes de extracto T_{2} y toxicidad del mismo

El presente ejemplo se proporciona para demostrar el aislamiento y caracterización de los diversos componentes químicos de un extracto de raíz de T. wilfordii Hook F identificado por la presente invención.

Las estructuras de triptolida y tripdiolida se muestran en la Figura 11. La Figura 12 muestra la estructura de triptonida. La triptonida se aisló de extractos alcohólicos de Tripterygium wilfordii Hook F por el método de Kupcham et al.^{31}. Este esquema para la preparación de triptolida se resume en la Figura 17. El presente ejemplo demuestra los efectos del extracto T_{2} (descrito en el Ejemplo 1) o triptolida en la viabilidad in cellulo de células inmunopotentes importantes.

El efecto de triptolida en las células inmunopotentes in vitro se determinó del siguiente modo:

Se incubaron células T, células B y fibroblastos (1 x 10^{6}/ml) con concentraciones variadas de T_{2} o triptolida durante 72 h. Las células se ensayaron para la viabilidad celular usando un citómetro de flujo (FACSCAN), después las células se tiñeron con yoduro de propidio. La Tabla 14 demuestra el efecto de T_{2} o triptolida sobre la viabilidad celular.

TABLA 14

Efecto de T_{2} o triptolida sobre la viabilidad celular
		Inhibidores
Tipo de célula
	Control	T_{2} (\mug/ml)	Triptolida (ng/ml)
		0,1	1,0	10,0	100,0	0,1	1,0	10,0
					(Porcentaje de
					células viables)
Células T	91,7	90,0	89,3	88,2	18,8	29,5	29,8	11,5
Células B	55,6	50,9	44,3	30,5	10,6	20,9	20,9	15,6
Fibroblastos	77,5	92,7	95,1	86,6	43,0	91,7	89,3	35,8

T_{2} a 100 \mug/ml y triptolida a 10 ng/ml fueron tóxicos para los fibroblastos lo que indica que a estos niveles, la toxicidad no es específica. A niveles inferiores, se ve la supresión de la función de células T y células B.

Se examinó la capacidad de triptolida de inhibir respuestas in vitro de linfocitos humanos. Como puede verse en la Tabla 15, la triptolida inhibió la proliferación tanto de linfocitos T como B de manera profunda a concentraciones de 0,1-1,0 ng/ml.

TABLA 15

Concentración de triptolida	Síntesis de ADN de células	Síntesis de ADN de células
(ng/ml)	T inducida por	B inducida por
	PHA	SA
	(Incorporación de ^{3}H-Timidina, CPM)
0	93.400	7.900
0,1	24.200	2.000
1,0	100	100

Estudios adicionales indicaron que esta fracción de triptolida también inhibía la producción in vitro de inmunoglobulina de linfocitos B humanos estimulados con mitógeno a concentraciones comparativamente pequeñas. Estos resultados demuestran que la fracción de triptolida es extremadamente tóxica, sin embargo, su especificidad de acción aún no está determinada. Otros componentes de Tripterygium wilfordii Hook F incluyen:

ácido polpunónico (wilfortrina) (1) y el éster metílico del mismo (2) mostrados en la Figura 13 y descritos por Keng et al. (Chem. Abst. 107: 55718y, pág. 436, 1987);

triptofenolida (1) y éster metílico de triptofenolida (2) mostrados en la Figura 14 y descritos por Wu et al. (Chem. Abst. 107: 96917f, pág. 713, 1987);

triptonoterpenol mostrado en la Figura 15 y descrito por Deng et al. (Chem. Abst. 107: 112684k, pág. 112692, 1987); y

wilformina (mostrado en la Figura 16), wilforina, wilforgina y wilforzina descritos por He et al. (Chem. Abst. 107: 130906p, 1987);

Los componentes purificados del extracto de T. wilfordii que tienen concentraciones esencialmente indetectables de triptolida se administrarán a pacientes con enfermedades autoinmunes e inflamatorias incluyendo artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso y psoriasis. La dosificación se determinará en base a la concentración de cada componente terapéutico en la mezcla T.

Ejemplo 5 Preparación con acetato de etilo de Tripterygium wilfordii Hook F

El presente ejemplo se proporciona para demostrar que la preparación de Tripterygium wilfordii Hook F puede obtenerse usando una diversidad de protocolos de extracción, incluyendo extracción con acetato de etilo.

Se prepara un extracto de la raíz de Tripterygium wilfordii Hook F empleando un protocolo de extracción con acetato de etilo. Se propone que el extracto de acetato de etilo se administrará oralmente en uso clínico.

Para preparar el extracto de acetato de etilo, las raíces de TWH obtenidas de la provincia Fujian de China se pelaron y secaron en aire abierto y a la luz del sol. Las raíces obtenidas de otras áreas geográficas también se espera que sean igualmente útiles. La madera de la planta también puede secarse usando otras técnicas incluyendo un horno o incubadora de bajo calor que alcanzará temperaturas de aproximadamente 60ºC. Las partes leñosas de la raíz se machacaron hasta un polvo. Se extrajeron mil gramos del polvo grueso de TWH con 2500 ml de etanol al 95% durante 24 horas. El material extraído se recogió en 5000 ml de etanol al 95%. El resto vegetal se calentó a reflujo con etanol al 95% durante 2 horas y el extracto de etanol se combinó con el extracto inicial. La combinación se evaporó a presión reducida hasta que se retiró todo el etanol. El extracto de etanol concentrado se disolvió en acetato de etilo con la ayuda de ultrasonificación. El extracto de acetato de etilo se filtró y el resto se disolvió con acetato de etilo repetidamente. El extracto de acetato de etilo se combinó, se filtró y se evaporó hasta sequedad a presión reducida. El material se molió en un polvo fino y se mezcló con almidón. El polvo mezclado se exploró adicionalmente a través de un tamiz Nº 60.

El polvo mezclado se incorporará en cápsulas adecuadas para uso humano usando técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica^{61} (véase Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (1990) para ensayos clínicos cuya referencia se incorpora específicamente en este documento como referencia para este propósito). En algunas realizaciones, un comprimido contendrá aproximadamente 30 mg del extracto de acetato de etilo. El extracto de acetato de etilo contiene poca triptolida, y los comprimidos contendrán cantidades reducidas de triptolida, definido para propósitos de la presente invención como preferiblemente no más de 10 \mug a 20 \mug de triptolida. La triptolida se midió con HPLC por comparación con un patrón conocido de triptolida como se describe en el Ejemplo 4 y en la Figura 17. Se preparó un único lote de 1400 g y se utilizó para la evaluación preclínica descrita a continuación.

Se realizó análisis de exploración cromatográfica en capa fina en el Wouthwestern medical Center de Dallas que mostró que el contenido en triptolida medio del extracto EA chino de diferentes lotes fabricados por Huang Shi Pharmaceutical Company fue 1,33 \mug por mg^{44,45}. El extracto de acetato de etilo producido por la presente invención contenía concentraciones mucho inferiores de triptolida de aproximadamente 0,22 \mug de triptolida por mg de extracto. El análisis por TLC y HPLC indicaron que extractos EA chino y de Texas contenían algunos componentes similares. (Figura 21).

Estudios comparativos

Se realizó una comparación de los diterpenos en los extractos de acetato de etilo de Tripterygium wilfordii Hook F preparado en China y Texas. Se disolvieron 330 mg del extracto de acetato de etilo de Texas y 40 mg del extracto de acetato de etilo chino en acetato de etilo a una concentración de 66 mg/ml y 8 mg/ml, respectivamente, seguido de sonicación durante 25 minutos y filtración al vacío. La solución de acetato de etilo se pasó a través de una columna de Al_{2}O_{3} neutra de 5 g. El material se eluyó con 30 ml de etanol. Después la elución con etanol se combinó con la solución de acetato de etilo, la solución mezclada se evaporó en aire con alto contenido de nitrógeno hasta sequedad. Los restos se disolvieron en 1 ml y 0,4 ml de cloroformo, por separado. Se aplicaron 20 ml de cada solución a una placa G F 254 de gel de sílice 20 x 20 cm (refuerzo de poliéster, placa de 250 \mum) y se volvieron a disolver con cloroformo seguido por cloroformo/éter (1:4). Triptolida (3,6 \mug), triptofenolida (10 mg) y tripdiolida (1,8 \mug) sirvieron como patrones de referencia. Después las placas se secaron al aire, los diterpenos se visualizaron por la reacción de Kedde. Se realizaron las concentraciones relativas de triptofenolida, triptolida y tripdiolida en los extractos de acetato de etilo chino y de Texas y un extracto patrón. Los resultados de este estudio se muestran en la
Figura 21.

* TEA: extracto de acetato de etilo de Tripterygium wilfordii Hook F preparado en el UT Southwestern Medical Center de Dallas.

** CEA: extracto de acetato de etilo de Tripterygium wilfordii Hook F preparado en China.

Como se muestra en la Figura 21, el extracto de acetato de etilo de Texas mostró una banda de tinción más pesada para triptofenolida que la del extracto de acetato de etilo chino, y aproximadamente igual a la del patrón. En contraste, la banda para triptolida fue más intensa para el extracto chino en comparación con el extracto de acetato de etilo de Texas. Estos descubrimientos demuestran que hay más triptolida en el extracto chino (porque se fabrica de raíces sin pelar). Por lo tanto, el extracto chino es más tóxico.

Estabilidad

El extracto de acetato de etilo de Texas es estable a temperatura ambiente durante al menos 1 año. La fotosensibilidad del extracto no está clara, y por lo tanto, se almacena en la oscuridad. Se espera que la preparación permanezca estable durante al menos 8 años.

Ejemplo 6 Actividad in cellulo del extracto de acetato de etilo de Texas

Los intentos iniciales de entender el mecanismo de acción del extracto de acetato de etilo se centraron en sus actividades inmunosupresoras potenciales. El presente ejemplo demuestra la actividad in cellulo significativa del extracto sobre la proliferación de células T inducida por antígeno y mitógeno y la producción de IL-2.

El extracto de acetato de etilo se preparó como se resume en el Ejemplo 5. El extracto de acetato de etilo ejerció varios efectos inmunosupresores sobre la sensibilidad inmune humana, incluyendo proliferación de células T inducida por antígeno y mitógeno y producción de IL-2. Los estudios in cellulo (es decir, estudios usando células completas intactas) se realizaron para determinar la concentración del extracto que inhibía la proliferación de células T humanas inducida por mitógeno o antígeno y la producción de IL-2 por células T en un 50% (ID_{50}).

Materiales y métodos

Estudios de proliferación: Se cultivaron células T con o sin PHA (0,5 \mug/ml) en presencia o ausencia del extracto de acetato de etilo a dosis de 5,7 \mug,/ml, 7,3 \mug/ml, 0,08 \mug/ml, 1,32 \mug/ml, 0,7 \mug/ml y 1,0 \mug/ml durante 3 días. Se observaron efectos significativos sobre la proliferación de células T.

Estudios de producción de IL-2: Se examinaron los efectos del extracto de acetato de etilo sobre la producción de IL-2. Se cultivaron células T con o sin PHA (1 \mug/ml) en presencia o ausencia del extracto a dosis de 3,6 \mug/ml, 3,9 \mug/ml y 0,83 \mug/ml. Se observaron efectos significativos sobe la producción de IL-2 en presencia de PHA o T.T. (véase Tabla 16).

El extracto de acetato de etilo a concentraciones de 0,08-5,7 mg/ml inhibió la proliferación y producción de IL-2 en aproximadamente un 50%. Las concentraciones del extracto que indujeron muerte de aproximadamente el 50% de las células también se determinaron (LD_{50}). El LD_{50} del extracto sobre las células T activadas por mitógeno o antígeno varió de 17-70,5 \mug/ml, que fue 10-225 veces el ID_{50} correspondiente (Tabla 16). Estos resultados demuestran que el extracto TEA mantenía fuerte potencia de actividades inmunosupresoras in cellulo.

Pueden usarse cantidades mucho mayores del extracto de acetato de etilo con un nivel de toxicidad significativamente reducido. Por lo tanto, el extracto de acetato de etilo se esperaría que fuera relativamente más seguro que el extracto T_{2}.

TABLA 16

ID_{50} Y LD_{50} in cellulo del extracto de acetato de etilo en PBMC humanas
Ensayo	Estímulo	Duración	D_{50}	LD_{50}
		del cultivo	(\mug/ml)	(\mug/ml)
Proliferación	PHA (1 \mug/ml)	2,5 días	5,7	70,5
	PHA (1 \mug/ml) + IL-2 (25 u/ml)	2,5 días	7,3	74,2
	T.T (10 \mug/ml)	5 días	0,08	18,8
	T.T (10 \mug/ml) + IL-2 (25 u/ml)	5 días	1,32	17,0
	SK (1 mg/ml)	5 días	0,7	20,0
	SK + (1 mg/ml) + IL-2 (25 u/ml)	5 días	1,0	19,8
Producción
de IL-2
	PHA (1 \mug/ml)	24 h	3,6
	PHA (1 \mug/ml)	24 h	3,9
	T.T. (10 \mug/ml)	24 h	0,83
PHA, fitohemaglutinina; TT, toxoide del tétanos; SK, estreptoquinasa

Ejemplo 7 Estudios animales in vivo de la eficacia del extracto de acetato de etilo de TWF

El presente ejemplo describe estudios que se realizaron para demostrar que el extracto de acetato de etilo de T. wilfordii ejerce una acción inmunosupresora sobre respuestas de anticuerpo primarias in vivo.

En estos estudios, se inmunizaron ratones (C57 BL/6J) con TNP-BSA emulsionado con adyuvante completo de Freund, de acuerdo con técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica. El extracto de acetato de etilo se preparó como se resume en el Ejemplo 5. En el día de la inmunización, los ratones se trataron con el extracto de acetato de etilo a 125 ó 250 mg/kg/día por vía oral. En otros estudios, se inmunizaron ratones con fosforilcolina-KLH emulsionado con adyuvante completo de Freund 30 días después de iniciar el tratamiento con extracto de acetato de etilo. Se recogieron los sueros 10 y 26 días después de la inmunización. Se determinaron los anticuerpos frente a TNP, TNP-BSA o PC-KLH en estos sueros por el método de ELISA. El método de ELISA es un ensayo de inmunorreactividad convencional bien conocido por los especialistas en la técnica.

Los resultados de estos estudios muestran que las respuestas de anticuerpo primarias para cada uno de estos antígenos estuvieron marcadamente aumentada en los ratones tratados con el extracto de acetato de etilo (Tabla 17). El tratamiento que comenzó 30 días antes de la inmunización fue el más eficaz para suprimir las respuestas de anticuerpo, pero el tratamiento que comenzó en el día de la inmunización sólo disminuyó significativamente las respuestas de anticuerpo.

100

Se trataron ratones C57 BL/6J (5 en cada grupo) sin o con dosis variadas del extracto de acetato de etilo por vía oral. Se inyectaron 100 mg de los antígenos emulsionados en 0,1 ml de adyuvante completo de Freund por vía intraperitoneal en el mismo día de comenzar el tratamiento con EA o 30 días después de iniciar el tratamiento con extracto TEA. Se tomó sangre de la vena de la cola el 10º o 26º día después de la inmunización. Se determinaron los anticuerpos frente a TNP solo o TNP-BSA en los sueros con ELISA. Se estimó la cantidad relativa de anticuerpos en los sueros comparando las lecturas de O.D. para cada muestra en la misma dilución para ensayos individuales. Se ensayaron múltiples diluciones de suero y se mostraron los datos para las diluciones en las que todas las lecturas están en la parte lineal de la curva.

Ejemplo 8 Toxicidad de los extractos de acetato de etilo

El presente ejemplo se proporciona para demostrar la toxicidad reducida de preparaciones de TWF, particularmente el extracto de acetato de etilo de la presente invención en comparación con otros extractos de T. wilfordii.

Se realizó un ensayo de toxicidad aguda usando ratones C57 BL/6J. Para los estudios iniciales, se usaron 25 ratones (5 en cada grupo) para estimar el LD_{50} aproximado. No se desarrollaron muertes con la preparación de acetato de etilo de T. wilfordii hasta que se administraron dosis muy altas de 1200 mg/kg. El 80% de los ratones tratados con 1400 mg/kg del extracto de acetato de etilo murieron. Después de esto, 50 ratones de la misma cepa se dividieron en 5 grupos con cantidades iguales de cada sexo en cada grupo. A los ratones se les dio una dosis única de extracto de acetato de etilo por vía oral a 0, 1100, 1150, 1230, 1350 y 1500 mg/kg de peso corporal. Los ratones se observaron durante 7 días después de esto. El LD_{50} se estimó de acuerdo con el método de Spearman-Karber^{62}. El LD_{50} del extracto de acetato de etilo de este experimento fue 1250 mg/kg/día (Tabla 19). Todas las muertes sucedieron en los primeros 3 días del estudio.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 18

Ensayo de toxicidad aguda del extracto de acetato de etilo en ratones
Dosis	Xi	Ri	Ni	Pi	Pi+Pi+1	I
(mg/kg)					2
1100	3,04	0	10	0	0,15	0,02
1150	3,06	3	10	0,3	0,35	0,03
1230	3,09	4	10	0,4	0,55	0,04
1350	3,13	7	10	0,7	0,85	0,05
1500	3,18	10	10	1,0
\begin{minipage}[t]{155mm} Se dividieron aleatoriamente los ratones en 5 grupos con cantidades iguales de cada sexo para cada grupo. Los ratones se trataron con diversas dosis del extracto de acetato de etilo como se indica por vía oral durante 7 días. Se registró la cantidad ratones muertos. Se calculó LD_{50} de acuerdo con el método de Spearman-Karber:\end{minipage}
Si X = LD_{50},
Log X = X_{k} - \Sigma[(Pi+Pi+_{1}) x I x 0,5].
Log X = 3,098
LD_{50} = 1253,1 mg/kg.
\begin{minipage}[t]{155mm} Xi = Log_{dosis}; Ri = número de ratones muertos; Ni = número de ratones ensayados; Pi = (Ri/Ni); I = Xi+_{1}-Xi; X_{k} = logaritmo de la dosis (k) a la que murieron los animales tratados.\end{minipage}

Se realizó una autopsia inmediatamente después de la muerte de los ratones. El examen histológico demostró necrosis linfocítica marcada de centros germinales esplénicos y timo, sólo con cambios moderados en el hígado, riñón, pulmón o cerebro de algunos de los animales.

TABLA 19

Comparación del extracto de acetato de etilo de Texas y chino
	Extracto EA
Fuente de la Parte del material	Parte leñosa de las raíces de la	Todas las raíces de la provincia
vegetal de la planta de la que se	provincia Fujian de Tejas	Hubei china
extrajo EA
Contenido en triptolida de (\mug/g	4,80	27,50
material vegetal)
(\mug/mg del extracto EA) ID_{50}	0,22	1,33
(in vitro sobre la proliferación
de células T humanas estimulada
por PHA, \mug/ml)	5,7	2,0
LD_{50} (en ratones, mg/kg de peso	1253	764*
corporal)
relación de ID_{50} in vitro de proli-	4,5 x 10^{-3}	2,6 x 10^{-3}
feración de células T/LD_{50} (sobre
ratones)
* \begin{minipage}[t]{150mm} La media del LD_{50} de diferentes lotes de comprimidos en el extracto CEA preparado de TWH obtenido de los diferentes países o provincias de China\end{minipage}

Como se muestra en la Tabla 19, la dosis LD_{50} de la preparación china es aproximadamente 764 mg/kg en comparación con los 1253 mg/kg para el extracto de Texas. El LD_{50} de T_{2} en ratones se ha informado que es 159,7 \pm 14,3 mg/kg y el LD_{50} del extracto chino varió de 608-858 mg/kg. El ID_{50} de la preparación china es 2,0 \mug/ml en comparación con 5,7 para el extracto de Texas. La proporción ID_{50}/LD_{50} del extracto chino es 2,6 x 10^{-3}. Este valor de actividad terapéutica:índice tóxico es significativamente inferior a la proporción ID_{50}/LD_{50} del extracto TEA, ID_{50}:LD_{50} = 4,5 x 10^{-3}. Las proporciones de cada uno de los extractos calculadas con los datos presentados en la Tabla 19 indican que el extracto de Texas tiene un equilibrio actividad terapéutica:índice tóxico superior, y por tanto es superior como preparación terapéutica en comparación con preparaciones de TwHF descritas en la bibliografía.

Ejemplo 9 Uso in vivo de extracto de acetato de etilo de texas

El presente ejemplo se proporciona para resumir el uso del extracto de acetato de etilo de Texas en animales, particularmente seres humanos.

El programa de dosificación del extracto de acetato de etilo a usar en estudios en escala y seguros iniciales se calculará usando LD_{50} del extracto y su contenido en triptolida. El extracto de acetato de etilo de Texas se procesó usando el mismo procedimiento usado en China para producir el extracto de acetato de etilo chino con la excepción de que el material preparado como el extracto de acetato de etilo de Texas se extrae de la parte leñosa pelada de las raíces de TWH. El extracto chino se extrae de la raíz completa de la planta. La dosificación presentada del extracto chino se empleará como referencia para calcular la dosificación del extracto de acetato de etilo de Texas (Tabla 19). La bibliografía china informa de que 60-120 mg/día del extracto CEA es seguro y eficaz en el tratamiento de RA (Shu et al., 1989; grupo de estudio cooperativo Hubei, 1981). La cantidad de extracto chino contiene 131,2-262,4 mg de triptolida por comprimido. Los ensayos clínicos con el extracto de Texas emplearán dosis en escala de 30 mg, 60 mg y 120 mg/día en tres dosis divididas. La dosis más baja es equivalente a aproximadamente el 25% de la dosis más baja del extracto chino usado de manera segura en China mientras que la dosis más alta (dosis de 120 mg del extracto de TEA) se aproxima a la dosis más baja del extracto CEA usado en China y contiene 26,4 \mug de triptolida.

La administración de extractos de TWH está contraindicada en pacientes con leucopenia, trombocitopenia y función hepática o renal alterada. No se han hecho estudios para evaluar los efectos de los extractos sobre mujeres embarazadas o en periodo de lactancia.

Los pacientes interrumpirán el tratamiento con extractos de TWH si desarrollan cualquiera de los siguientes: vómitos o diarrea persistente; anorexia profunda; recuento de WBC de \leq2.500 células/mm^{3}, o recuento de plaquetas de s 100.000 células. Los pacientes que desarrollan estos síntomas deben controlarse con frecuencia para los recuentos de glóbulos blancos, así como la función hepática y renal.

Ejemplo 10 Fracción 924 de la caracterización de TWF e identificación

El presente ejemplo se proporciona para detallar la actividad biológica de un componente de la fracción 924 de un extracto de acetato de etilo de T. wilfordii.

En base a ejemplos previos, se tuvo conciencia de que muchos compuestos diterpeno de TwHF, tales como triptolida, tienen capacidad supresora tanto en funciones inmunes in vitro como in vivo. Los grupos moleculares responsables de la función supresora inmune de estos compuestos son desconocidos, sin embargo, la estructura central de los diterpenoides que puede estar relacionada a su actividad consta de 5 elementos lactona \alpha-\beta-insaturados que pueden identificarse por reactivos de Kedde. Se usó HPLC para fraccionar el extracto de acetato de etilo de TwHF y se emplearon los reactivos de Kedde para localizar las fracciones. Después, se determinó el efecto de las fracciones seleccionadas en la producción de IL-2 in vitro e incorporación de [^{3}H]-timidina por células T activadas con PHA. Las fracciones que inhiben estas funciones de células T se seleccionaron y el patrón cromatográfico se identificó con HPLC. Se purificó adicionalmente una fracción con HPLC y se cristalizó repetidamente; se obtuvo un compuesto puro, cristalizado y se denominó "924".

Purificación de una fracción 924 de un extracto de acetato de etilo

La parte pelada leñosa seca de la raíz de TwHF se extrajo con etanol. La solución se concentró a presión reducida, y el residuo se disolvió en acetato de etilo. Esta solución se pasó a través de Al_{2}O_{3} con etanol como eluyente. El eluido se evaporó y el resto se cromatografió en gel de sílice con cloroformo, cloroformo-éter y acetato de etilo como eluyente sucesivo. Las fracciones eluidas con cloroformo-éter se purificaron en una columna de HPLC preparativa compactada con Nova-Pak C18 y equipada con un detector 214. Metanol-agua fue la fase móvil. Se recogió una fracción que tiene reacción positiva al reactivo de Kedde y se extrajo con cloroformo. La solución de cloroformo se evaporó hasta sequedad y el resto cristalizó en diclorometano-hexano para producir 924. "924" es soluble en etanol, y etanol y cloroformo.

La fracción "924" inhibía la síntesis de ADN por células T estimuladas con PHA. La fracción "924" a una concentración de 1 ng/ml o más inhibió que las células T estimuladas con PHA captaran [^{3}H]-timidina. La capacidad de inhibición se correlacionó con las concentraciones del compuesto. La pendiente de la curva de inhibición de "924" de la proliferación de células T fue bastante plana en que el grado de inhibición cambió de 14,6% a 54,2% cuando la concentración de "924" aumentó de 1 ng/ml a 100 ng/ml. Esto fue diferente de algunos componentes de TwHF, tal como triptolida o tripdiolida que ejercen acción inmunosupresora potente con aumento en sus concentraciones al nivel de ngs, y provocaron potenciación significativa de la inhibición de la función celular.

La fracción "924" inhibió la producción de IL-2 por células T estimuladas con PHA. De manera similar con el patrón del efecto inhibidor de "924" sobre la síntesis de ADN de células T, a las concentraciones inhibidoras, "924" fue capaz de reducir la producción de IL-2 por células T inducidas por PHA. Se vio una reducción del 50% de la secreción de IL-2 a 42,11 ng/ml (véase Figura 20B).

La fracción 924 también demostró actividad significativa en la inhibición de la proliferación de células T, proporcionando inhibición de la proliferación de células T a dosis relativamente bajas de 200 ng/ml de la fracción 924 (véase Figura 20C). A concentraciones de 1.000 ng/ml de la fracción 924, no fue evidente ninguna proliferación celular (véase Figura 20C). No hubo efecto de "924" sobre la expresión de IL-2R por células T activadas con PHA. La fracción "924" a 500 ng/ml (al menos 50 veces la concentración eficaz para inhibir la proliferación de células T o producción de IL-2) no afectó a la expresión de IL-2R por células T activadas con PHA.

La fracción "924" no afectó a la viabilidad de células T estimuladas con PHA a todas las concentraciones empleadas, variando de 1 ng/ml hasta 1000 ng/ml. El ID50/LD50 in vitro de "924" de la proliferación de células T no fue de más de 10 indicando que, en las mismas condiciones de cultivo, "924" no aumenta la muerte celular hasta que alcanza 10 veces más de su concentración inhibidora. La fracción 924 también demostró toxicidad celular relativamente baja, como se demuestra en la Figura 20D. Las concentraciones de la fracción 924 de entre 1 y 500 ng/ml no difirieron significativamente en términos de viabilidad celular, expresada como porcentaje de células viables en la población de control. Una concentración de la fracción 924 de 1.000 ng/ml sólo fue ligeramente más tóxica para la viabilidad celular en comparación con la dosis de 0 ng/ml (véase Figura 20D, 0 ng/ml = 22% de control; 1.000 ng/ml de la fracción 924 = 35% de viabilidad celular de control).

La reacción positiva al reactivo de Kedde indicó que "924" tiene una estructura de una lactona \alpha,\beta-insaturada. Como muchos de los compuestos diterpenoides conocidos tales como triptolida, triptoclorolida, 16-hidroxitriptolida, tripdiolida, triptonida y triptofenolida también tienen la lactona \alpha,\beta-insaturada, los patrones de TLC y HPLC de "924" se compararon con estos compuestos. El patrón de "924" fue diferente al de todos los compuestos mencionados anteriormente. El patrón tuvo las características cromatográficas de los diterpenoides y no siguió el patrón regular de los diterpenoides ensayados por varios sistemas cromatográficos normales y en fase inversa. Por lo tanto, "924" parece ser un compuesto no diterpenoide. Después del análisis adicional de la fracción 924 por RMN/espectroscopía de masas, la fracción se determinó que era el compuesto puro, wilforonida (Figura 18).

Ejemplo 11 Efectos inmunosupresores de wilforonida

Se cultivaron células T con o sin PHA (0,5 microgramos/ml) en presencia o ausencia de concentraciones de 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml o 500 ng/ml de la preparación de wilforonida descrita en la preparación del Ejemplo 10 durante tres días. Se añadió [^{3}H]-timidina durante al menos 14 horas de cultivo. Cada concentración se procesó por cuadruplicado (4 veces) y los resultados para cada concentración se ponderaron para proporcionar una media. Las medias de valores de cpm x 10^{3} se combinaron y se expresaron como un porcentaje de inhibición de células T. Estos datos se proporcionan en la Tabla 20.

Como se muestra en la Tabla 20, una concentración de 100 ng/ml de wilforonida proporcionó una inhibición del 21,19% de la proliferación de células T inducida por PHA in cellulo. Una concentración de 200 ng/ml de wilforonida proporcionó una inhibición del 26,43% de la proliferación de células T inducida por PHA. Una concentración de 500 ng/ml de wilforonida provocó una inhibición del 62,86% de la proliferación de células T inducida por PHA. (Véase Tabla 20). Un ID_{50} de 391,30 ng/ml de wilforonida se observó (véase Tabla 20).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 20

Efecto de wilforonida sobre la proliferación de células T inducida por PHA*
Wilforonida	cpm x 10^{3}	media de	% de
(ng/ml)	1.	2.	3.	4.	cpm x 10^{3}	inhibición
0	34,1	36,9	58,5	38,5	42,0
10	23,5	37,1	57,5	36,3	38,6	8,09
50	30,2	35,3	57,0	44,8	41,8	0,48
100	13,0	37,6	55,2	26,7	33,1	21,19
200	6,8	33,9	56,5	26,4	30,9	26,43
500	0,3	19,7	30,9	11,3	15,6	62,86
ID_{50} (ng/ml)						391,30
* \begin{minipage}[t]{140mm} Se cultivaron células T con o sin PHA (0,5 \mu g/ml) en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de wilforonida durante 3 días. Se añadió [^{3}H]\text{-}timidina durante las últimas 14 horas. Los datos son de 4 experimentos independientes.\end{minipage}

Efecto de wilforonida sobre la producción de IL-2 inducida por PHA

También se examinaron los efectos de wilforonida sobre la producción de IL-2. Se cultivaron células T con o sin PHA (1 microgramo/ml) en presencia o ausencia de 0 (control), 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml o 200 ng/ml de wilforonida durante una noche. Los sobrenadantes libres de células se diluyeron 1 a 80 y se ensayó el contenido en IL-2 con células CTLL-2. La producción de IL-2 por las células T cultivadas sin estimulación se encontró que fue de menos de 0,32 unidades/ml.

Los resultados obtenidos del estudio se proporcionan en la Tabla 21. La concentración de 10 ng/ml de wilforonida mostró una inhibición del 37,94% de la producción de IL-2 inducida por PHA con relación al control. La concentración de 50 ng/ml de wilforonida provocó una inhibición del 54,22% de producción de IL-2 inducida por PHA con relación al control. Las concentraciones de 10 ng/ml provocaron una inhibición del 68,20%, provocando la concentración de 200 ng/ml de wilforonida una inhibición del 74,96% de la producción de IL-2 inducida por PHA.

También se determinó un ID_{50} global de 42,11 ng/ml. Estos datos se proporcionan en la Tabla 21.

TABLA 21

Efecto de wilforonida sobre la producción de IL-2 inducida por PHA
Wilforonida	IL-2 (unidad/ml)	Media	% de
(ng/ml)	1.	2.	3.	4.		inhibición
0	1,422	23,436	50,020	10,701	21,395
10	1,628	20,723	27,374	3385	13,278	37,94
50	1,664	26,983	4,509	6,042	9,795	54,22
100	0,800	11,160	10,170	4,982	6,803	68,20
200	0,850	10,301	8,502	1,773	5,357	74,96
ID_{50} (ng/ml)						42,11
* \begin{minipage}[t]{145mm} Se cultivaron células T con o sin PHA (1 mg/ml) en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de wilforonida durante una noche. Los sobrenadantes libres de células se diluyeron 1 a 80 para el ensayo del contenido en IL-2 con células CTTL-2. La producción de IL-2 por las células T cultivadas sin estimulación fue menor de 0,32 unidades/ml.\end{minipage}

Efecto inhibidor de wilforonida sobre la proliferación de células T inducida por antígeno

Se cultivaron células T con o sin SK (1 ng/ml) o SK + IL-2 (50 u/ml) o SK + PMA (0,2 ng/ml) en presencia o ausencia de las siguientes concentraciones de wilforonida: 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 500 ng/ml o 1.000 ng/ml. Se dejó que las células se cultivaran durante cinco días. Los cultivos se pulsaron con [^{3}H]-timidina durante al menos 24 horas de cultivo. Los datos recogidos de este estudio se proporcionan en la Tabla 22. Estos datos representan la media del porcentaje de inhibición de la incorporación de [^{3}H]-timidina de cinco experimentos independientes. Se calculó ID_{50} en base a la fórmula de regresión usando la calculadora fx-3600. Las células T cultivadas con SK o SK + IL-2 o SK + PMA dieron cpm de 1,87 x 10^{3}, 4,99 x 10^{3} y 6,67 x 10^{3}, respectivamente.

La respuesta a SK inhibida por bajas concentraciones de wilforonida se demostró que se superaba parcialmente añadiendo IL-2 o PMA, como se demuestra por el ID_{50} marcadamente más alto (aumentado). Esto indica que la inhibición se correlaciona con una disminución en la producción de IL-2. Esta disminución se supera añadiendo IL-2 o co-estimulando con PMA que induce la producción de IL-2.

Los datos de este estudio se proporcionan en la Tabla 22.

TABLA 22

Efecto inhibidor de wilforonida sobre la proliferación de células T inducida por antígeno*
Wilforonida	SK	SK+IL-2	SK+PMA
(ng/ml)
10	42,15	19,59	22,67
50	44,47	12,37	17,70
100	49,14	14,52	20,32
500	75,20	61,70	53,30
1.000	84,23	86,21	65,43
ID_{50} (ng/ml)	127,12	476,00	613,00
* \begin{minipage}[t]{145mm} Se cultivaron células T con o sin SK (1 mg/ml) o SK más IL-2 (50 u/ml) o SK más PMA (2 ng/ml) en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de wilforonida durante 5 días. Los cultivos se pulsaron con [^{3}H]\text{-}timidina durante al menos 24 horas. Los datos representan la media del % de inhibición de la incorporación de [^{3}H]\text{-}timidina de 5 experimentos independientes. Los ID_{50} se calcularon en base a la fórmula de regresión usando la calculadora fx-3600. Las células T cultivadas con SK o SK+IL-2 o SK+PMA dieron cpm de 1,87 x 10^{3}, 4,99 x 10^{3} y 6,67 x 10^{3}, respectivamente.\end{minipage}

Ejemplo 12 El extracto T2 de TwHF inhibe la producción de interferón \gamma y la transcripción del gen de IL-2

El presente ejemplo demuestra que el extracto T2 de Tripterygium wilfordii Hook F inhibe la producción de interferón \gamma la transcripción del gen de IL-2.

Se realizaron estudios de transcripción para determinar si el extracto de TwHF afectaba directamente a la transcripción del gen de IL-2 o tenía efectos post-transcripcionales. Se emplearon células Jurkat que se habían transfectado de manera estable con una construcción que contenía el promotor de IL-2 dirigiendo la transcripción del gen informador, cloranfericol acetiltransferasa (CAT).

Métodos

Ensayo de IFN-\gamma. Se determinó el contenido en IFN-\gamma en sobrenadantes con un kit de radioinmunoensayo como se describe por el fabricante (Centocor, Malvern, PA). Se cultivaron células T (1 x 10^{5}/ml) con PHA (1 mg/ml) durante 24 horas en presencia o ausencia del extracto EA. Se ensayaron los sobrenadantes libres de células para el contenido en IL-2 e IFN-\gamma.

Ensayo de IL-2 CAT. Se electroporaron células Jurkat con una construcción del promotor IL-2 que contenía la mayoría de los sitios de unión del factor de transcripción específico de células T en el promotor/potenciador (región -342 a +47 obtenida de la construcción IL-2/PJGFCA19) dirigiendo el gen de la cloranfenicol acetil transferasa bacteriana (CAT) insertado en un vector que contiene un marcador de selección de neomicina, denominado IL-2/PML3 (72,73). Las células se seleccionaron con geniticina (0,5 mg/ml) durante aproximadamente un mes antes de su uso. Las células después se incubaron con PHA y PMA, en presencia de concentraciones variadas de un extracto de TwHF (un extracto de cloroformo/metanol de la parte leñosa de las raíces de TwHF, disuelto en DMSO y diluido con medio de cultivo) o en medio solo durante 20 horas. Después de la incubación, los sobrenadantes se recogieron para el ensayo de IL-2 secretada y cantidades equivalentes de células se lavaron y lisaron por congelación/descongelación repetida en 100 \mul de Tris-HCl 0,25 M (pH 7,8) y se centrifugaron durante 5 minutos a alta velocidad para retirar los desechos celulares. La actividad CAT se midió por la adición de 1 \mulCi de [^{14}C]-cloranfenicol (60 mCi/mmol; New England Nuclear, Boston, MA) y 14 \mul de acetil coenzima A 5 mM a los lisados seguido de una incubación de 12 h a 37ºC como se ha descrito previamente por Gorman et al. (74). La reacción se detuvo por la adición de 1 ml de acetato de etilo frío y después de la separación de fases, la fase orgánica se evaporó, se resuspendió en 20 \mul de acetato de etilo y se salpicó sobre placas de cromatografía de capa fina en gel de sílice. Los cromatogramas se visualizaron y la radiactividad se cuantificó usando un dispositivo de detección \beta automático y de formación de imágenes (AMBIS). El porcentaje de conversión se calculó dividiendo las cpm del cloranfenicol acetilado por el cloranfenicol total presente en cada muestra. La actividad CAT se descubrió que se correlacionaba con los niveles de IL-2 secretado cuando estas células se estimulaban con diversos mitógenos. Las células Jurkat transfectadas con PML-LDLr-6500 se tomaron como control positivo para la actividad CAT^{75}.

Resultados

Inhibición de la transcripción del gen de IL-2 inducida por mitógeno por extractos de TwHF. Los datos de la Tabla 23 muestran que el extracto de TwHF inhibió la actividad CAT inducida por mitógeno de un modo dependiente de dosis, similar al observado para la producción de IL-2.

Inhibición de la transcripción de IL-2 por un extracto T2^{1}
	% de Acetilación	Producción de IL-2
		(unidades/ml)
Control	0,17	23,4
PHA+PMA	6,90	5440
PHA+PMA+52 1 \mug	0,22	0
PHA+PMA+T2 5 \mug	0,22	0
PHA+PMA+T2 10 \mug	0,19	0
células 4JK	95,80	-
^{1} \begin{minipage}[t]{140mm} Se incubaron células T Jurkat transfectadas de manera estable con una construcción promotor de IL-2/CAT con o sin PHA (2 \mu g/ml) en presencia o ausencia de concentraciones variadas de un extracto de TGF durante 18 h. Los sobrenadantes se recogieron para el ensayo de IL-2 con células CTLL-2. Los extractos celulares se evaluaron para actividad CAT como se describe en los métodos. La actividad CAT de una línea celular de control transfectada con una construcción de CAT dirigida por un promotor constitutivamente activo (células 4JK) se muestra como control positivo para el ensayo.\end{minipage}

Estos resultados indican que el extracto de TwHF inhibe la transcripción del gen de IL-2.

Inhibición de la producción de IFN-\gamma. Como se muestra en la Figura 34, el extracto EA inhibió la producción de IL-2 inducida por PHA (EC_{50} = 0,75 \pm 0,12 \mug/ml). La producción de IFN-\gamma inducida por PHA también muy sensible a la inhibición mediada por EA (EC_{50} = 0,64 \pm 0,04 \mug/ml).

Ejemplo 13 Unión al receptor de glucocorticoides de componentes de Tripterygium wilfordii Hook F (TwHF)

El presente ejemplo proporciona datos de la capacidad del extracto de TwHF y componentes de TwHF purificados de unirse al receptor de glucocorticoides (GR). La unión del extracto de TwHF y componentes del mismo al GR se demostró por inhibición competitiva de la unión del ligando GR natural usando diversos sistemas modelo. La capacidad de TwHF de competir con [^{3}H]-dexametasona por la unión del receptor de glucocorticoides, la capacidad de TwHF de inhibir la activación mediada por el receptor de glucocorticoides de una construcción génica diana sensible en células de mamífero transfectadas, y la capacidad de TwHF de inhibir el crecimiento de una línea celular transfectada que expresa un receptor de glucocorticoides que regula el antígeno T grande de SV40, y por lo tanto, cuyo crecimiento es dependiente de dexametasona, se examinó.

Los extractos de cloroformo-metanol de TwHF se usaron en este ejemplo; la actividad de estos extractos está correlacionada con la actividad de los extractos de acetato de etilo por la cantidad de triptolida en las preparaciones. La cantidad de triptolida se midió por HPLC como se describe en el Ejemplo 15.

Métodos

Ensayo de unión a glucocorticoides en células completas. Se cultivaron fibroblastos de piel humana en MEM-suero de ternera bovino al 10% en una atmósfera de CO_{2} al 5% a 37ºC. Las células se sembraron en pocillos de 7 centímetros a 750.000 células por pocillo. Veinticuatro horas antes de los experimentos, el medio se cambió a MEM con 5 mg/ml de albúmina de suero bovina. En el día del experimento, el medio se reemplazó con 3,0 ml de MEM por pocillo con [^{3}H]-dexametasona 10 nM. Se añadieron cantidades variadas del extracto de TwHF a algunos pocillos. Las células se incubaron a 37ºC durante 60 minutos, después se lavaron, se recogieron por tratamiento con tripsina, y se lisaron en 1 ml de agua. Las alícuotas se ensayaron para proteínas y se contaron para la radiactividad unida. Estas células expresan, de media, aproximadamente 170 fmol de receptor de glucocorticoides por mg de proteína.

Transfecciones celulares y ensayos de activación génica mediada por GR. Se mantuvieron células COS-7 en cultivo en DMEM-suero de ternera bovino al 10%. Estas células no expresan receptores de hormonas esteroides endógenos. Las células se sembraron a 10^{6} células por placa de 10 cm. Veinticuatro horas después, las células se transfectaron con 500 ng de pRShGr\alpha, un vector de expresión de GR (obtenido del Salk Institute, La Jolla, CA) y 10 \mug de pMMTV-luciferasa, un gen informador sintético. Sin embargo, pueden usarse otros vectores de expresión y genes informadores sintéticos disponibles para los especialistas en la técnica para la transfección. El vector pMMTV-luciferasa contiene el gen de la luciferasa bajo el control regulador de elementos inducibles por glucocorticoides en la repetición larga terminal MMTV. Las células se transfectaron usando la técnica de precipitación con fosfato (kit de transfección de mamíferos, Stratagene, La Jolla, CA). Después de la transfección, se añadió dexametasona (1 \muM) al medio. Veinticuatro horas después, las células se lavaron, se recogieron, y se prepararon lisados por tres ciclos de congelación/descongelación. Los lisados se aclararon por centrifugación a 12.000 x g durante 5 minutos; se ensayaron alícuotas para el contenido en proteínas y cantidades iguales de proteínas se usaron para ensayos de luciferasa.

Un sistema de ensayo adicional que se empleó implicó células IDH4, cuyo crecimiento depende de la presencia de dexametasona. Las células IDH4, que expresan receptores de glucocorticoides endógenos, se produjeron transfectando fibroblastos humanos con un plásmido que contenía la repetición larga terminal MMTV dirigiendo el antígeno T grande SV40. Como el crecimiento prolongado de estas células depende de la expresión del antígeno T grande, estas células requieren glucocorticoide exógeno para mantener la proliferación.

Resultados

El extracto de TwHF se une a GR. El extracto de cloroformo-metanol de TwHF inhibió la unión de [^{3}H]-dexametasona al GR expresado de manera endógena en fibroblastos de piel humana (Figura 22). Se incubaron monocapas intactas de fibroblastos de piel de genitales humanos (aproximadamente 170 fmol de GR por mg de proteína) con [^{3}H]-dexametasona 10 nM sola o con una concentración en aumento de TwHF. No es posible la estimación de las afinidades de unión relativas de TwHF y dexametasona, sin embargo, ya que el extracto de TwHF es una mezcla de compuestos. La inhibición del 50% de la actividad de GR sucedió con la adición de aproximadamente 5 \mug del extracto. La adición de etanol puro, el disolvente para el extracto de TwHF, en volúmenes iguales no tuvo efecto sobre la actividad de unión del ligando GR. Además, el extracto de TwHF no tuvo efectos sobre la unión de dihidrotestosterona a los fibroblastos de piel de genitales, indicando que no inhibían la actividad del receptor de andrógenos, lo que implica un efecto específico sobre GR.

El extracto de TwHF inhibe la activación inducida por dexametasona de la transcripción del gen diana pero carece de actividad agonista GR intrínseca. El extracto de cloroformo-metanol de TwHF también inhibió la activación mediada por GR de un gen diana sintético (Figura 23). Se transfectaron células COS-7 con un vector de expresión de GR humano y la construcción del gen informador MMTV-luciferasa. Se transfectó un conjunto de placas en paralelo con la construcción RSV-luciferasa constitutivamente activa. Después de 24 horas, se añadió dexametasona a una concentración de 10 nM sola o en combinación con concentraciones en aumento de TwHF. Las células se lisaron después de 24 horas y se ensayaron para la actividad de luciferasa. En ausencia de TwHF, los niveles de fondo de actividad luciferasa fueron de aproximadamente el 1% de la actividad inducida por dexametasona. La adición de dexametasona provocó, de media, una inducción de 100 a 200 veces de la actividad luciferasa. Además del extracto de TwHF en concentraciones mostradas para competir por la unión de GR inhibió la activación del gen diana (Figura 23). La expresión de luciferasa bajó el control de un promotor constitutivamente activo, es decir, un promotor no sensible al receptor de glucocorticoides, (RSV-luciferasa) no se inhibió por la adición de TwHF (Figura 23) lo que indica especificidad del extracto de TwHF por los procesos dependientes de GR.

Para determinar si TwHF tiene actividad agonista glucocorticoide directa, células COS-7 transfectadas con un vector de expresión de GR humano y la construcción informadora MMTV se estimularon con TwHF, pero sin dexametasona. TWF no provocó activación del gen diana directa (Tabla 24). Por el contrario, la dexametasona indujo transcripción drástica del gen informador.

TABLA 24

TWF carece de Actividad Agonista de GR intrínseca
	Control	TWF 0,4	TWF 0,8	TWF 2,0	TWF 4,0	DEX 10
		\mug/ml	\mug/ml	\mug/ml	\mug/ml	nM
RLU Nº 1	998	1260	1603	1167	903	193,419
RLU Nº 2	2850	2012	1905	1106	517	218,786
\begin{minipage}[t]{145mm} Se transfectaron células COS-7 con vector de expresión de GR y la construcción MMTV-gen informador luciferasa. Después de 24 horas se añadió TWF a concentraciones conocidas para competir por la unión a GR (0,4-4,0 \mu g/ml). Las células se lisaron después de 24 horas y los extractos se ensayaron para la actividad luciferasa. Los controles incluyeron ausencia de adición (control negativo) y dexametasona 10 nM (control positivo). Los datos mostrados son unidades de luz relativa (actividad luciferasa) para transfecciones duplicadas en un experimento único.\end{minipage}

Experimentos similares en células L929 y en células COS y L929 estimuladas con AMPc (conocido como actividad agonista "no enmascarada" de algunos competidores de GR) confirmaron esta ausencia de función agonista de TwHF.

Para comparar las curvas de respuesta a concentración para la inhibición mediada por TwHF de la actividad de unión del ligando GR y la inhibición de TwHF de la activación del gen diana mediada por GR, se combinaron los datos de la Figura 22 y 23. Donde las curvas son comparables, TwHF parece varias veces más potente para la inhibición de la activación del gen diana en comparación con la inhibición de la unión del ligando (Figura 24).

El extracto de TwHF y el componente tripdiolida purificado inhibió el crecimiento dependiente de dexametasona de células IDH4 de un modo dependiente de la concentración (Figura 25A, 25B y 25C). La triptofenolida fue menos activa y su actividad no se correlacionó en líneas generales con la dosificación. Se cultivaron células IDH4 (2 x 10^{6}/ml) durante 72 horas en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino libre de dexametasona con o sin dexametasona en presencia o ausencia de T2 o tripdiolida o triptofenolida, según se indique. [^{3}H]-timidina estuvo presente durante las últimas 16 h. Los datos representan la media del % de inhibición de la incorporación de [^{3}H]-timidina de tres determinaciones replicadas de tres experimentos separados. Las células IDH4 incubadas sin estimulación dieron 16.391 cpm. Las células cultivadas con dexametasona a 1 nM, 10 nM, 100 nM y 1.000 nM dieron 35,554, 52,937, 105,357 y 96,677 cpm, respectivamente.

Estudios adicionales evaluaron si la inmunorreactividad tipo cortisol estaba contenida en el extracto TwHF. Con la mayoría de los anticuerpos anti-cortisol ensayados, no se encontró ninguna evidencia de la presencia de dichas moléculas en TwHF. Esto se confirmó por los experimentos de fraccionamiento en Sephadex LH-20 en los que se descubrió que la capacidad de bloque del receptor de glucocorticoides de TwHF existe en fracciones distintas de la posición de elución del cortisol auténtico. Con un anticuerpo anti-cortisol único dirigido frente al anillo A del esteroide, se detectó algo de inmunorreactividad tipo cortisol (Figura 26). Estos datos sugieren que algunos componentes de TwHF podrían tener características estructurales tipo cortisol, pero no se encontró cortisol auténtico.

Los compuestos de TwHF purificados se ensayaron de manera similar para los efectos sobre la unión del ligando a GR, y para la inhibición de la activación del gen diana mediada por GR. Tanto triptolida (compuesto A) como tripdiolida (compuesto B) inhibieron la activación del gen diana por GR, mientras que triptofenolida (compuesto C) fue mucho menos potente. Es de importancia observar que, la triptofenolida es mucho menos supresora que la triptolida o tripdiolida. Se muestran curvas de inhibición de la unión y activación del gen diana para el compuesto A (Figura 27). Otra vez, el compuesto fue más potente en la inhibición de la inducción de MMTV-luciferasa en más de un orden de magnitud. Ninguno de los componentes de TwHF purificados mostró inmunorreactividad de cortisol (Figura 28).

Ejemplo 14 Propiedades anti-inflamatorias del extracto de TwHF

En el presente ejemplo, el extracto de TwHF y tripdiolida se examinaron para su capacidad de inhibir la inducción in vivo de una actividad enzimática pro-inflamatoria, es decir, la estimulación de la forma inducible de ciclooxigenasa (COX-2). Ciclooxigenasa-1 es la enzima responsable de la síntesis constitutiva de prostaglandinas y ciertos autocoides relacionados, mediadores de la inflamación. La inhibición de esta enzima provoca los efectos secundarios de NSAID. Durante la inflamación y después de la estimulación, las células inflamatorias, tales como macrófagos, producen una nueva enzima, ciclooxigenasa-2, que es responsable de mucha de la producción de prostaglandina en los sitios inflamatorios.

Los monocitos (1 x 10^{6}/ml), separados de las PBMC humanas normales, se incubaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero humano normal al 5% con o sin LPS (10 \mug/ml) y en presencia o ausencia de uno de los siguientes reactivos: T2, tripdiolida, dexametasona, o RU486, a las concentraciones indicadas (Figura 29A-29D). Después de 18 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes libres de células y se ensayaron para el contenido en PGE2 con un kit de radioinmunoensayo (Amersham), como se describe por el fabricante. Los datos representan la media de dos determinaciones replicadas de dos experimentos separados. Los monocitos cultivados con LPS produjeron 392 pg de PGE2/0,2 millones de células. Los monocitos humanos producen prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) cuando se estimulan con endotoxina bacteriana. Esto se refiere a la inducción de ciclooxigenasa-2 (COX-2) y se inhibe por dexametasona (Figura 29A-29D). De manera similar, la producción de PGE_{2} se inhibe por el extracto de TwHF y su componente inmunosupresor purificado, tripdiolida. La producción de PGE_{2} constitutiva por monocitos no estimulados que está mediada por ciclooxigenasa-1 no se inhibió por TwHF o sus componentes. En esos estudios previos se muestra específicamente que está documentado que el extracto de TwHF no inhibió otras funciones de los monocitos, tales como presentación de antígeno.

En resumen, los datos son consistentes con la conclusión de que los componentes de TwHF interaccionan específicamente con el receptor de glucocorticoides y ejercen efectos anti-inflamatorios e inmunosupresores por este mecanismo, y no tienen actividad directa sobre los genes sensibles a glucocorticoides.

Estos datos demuestran adicionalmente que el extracto T2, y componentes del mismo, se unen al receptor de glucocorticoides, y el complejo humano no logra activar las regiones promotoras sensibles al receptor de glucocorticoides. Los genes que necesitan estos promotores para activarse, por lo tanto, no se inducen. De manera concomitante, T2 inhibe los procesos inflamatorios como se demuestra en este documento por la inhibición de la inducción de ciclooxigenasa-2 y también por la inhibición de la activación del gen de IL-2 e interferón \gamma. El efecto combinado de la propiedad anti-inflamatoria sin la inducción de actividad agonista relacionada con esteroides proporciona un método de tratamiento desconocido hasta ahora y buscado durante mucho tiempo para inflamación, enfermedad autoinmune, y otras afecciones inmunosupresoras donde pueden evitarse los efectos no deseables de los esteroides (TwHF no tiene actividad agonista) y fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (por ejemplo, aspirina) (la ciclooxigenasa-1 no está inhibida por TwHF).

Ejemplo 15 Determinación por HPLC de triptolida y tripdiolida en un extracto de acetato de etilo de TwHF

Se describe un nuevo método analítico para la determinación de triptolida y tripdiolida en extractos de acetato de etilo de Tripterygium wilfordii Hook F en el presente ejemplo. El procedimiento consta de un enriquecimiento preliminar de la triptolida y tripdiolida por cromatografía con cartucho de alúmina B Sep-Pak seguido por análisis por HPLC. Se realizó HPLC con una columna de acero inoxidable compactada con Nova-Pack C18, usando acetonitrilo-agua (19:81) como fase móvil para triptolida y acetonitrilo-agua (11:89) para tripdiolida. El efluente se control por detección en el ultravioleta a 214 nm. El análisis cuantitativo de triptiolida después se realiza por comparación con un patrón interno, y de tripdiolida por el método de patrón externo. Las cantidades de triptolida y tripdiolida por 100 mg de extracto de acetato de etilo se determinaron que eran 19,88 \mug y 9,58 \mug respectivamente. El método es suficientemente sensible y específico para ensayar los diterpenos encontrados en Tripterygium wilfordii Hook F de manera precisa.

Métodos

Instrumentos. La cromatografía líquida Waters (Milford, MA) se configuró con dos bombas modelo 510, un inyector modelo U6K y un detector UV modelo 441 ajustado a 214 nm. Los datos se procesaron con el software Millenium, Versión 1.10 (Waters Assoc.). La columna de acero inoxidable (150 mm x 3.9 mm D.I.) se compactó con Nova-Pack C18 con tamaño de partícula de 4 \mum (Water Assoc.). Se usó una pre-columna de HPLC, con un inserto envasado con Nova-Pak C18, (Water Assoc.) para prolongar la vida de la columna. Se usó el baño de agua ultrasónico modelo ULTRAsonik 2QT/H en la desgasifiación del disolvente y la preparación de la muestra se adquirió de NEY Barkmeyer Division (Yucaipa, CA.).

Compuestos químicos y reactivos. Se prepararon triptolida y tripdiolida a partir del extracto de acetato de etilo de TwHF por cromatografía en columna de gel de sílice de manera sucesiva con cloroformo, cloroformo-éter y cloroformo-acetato de etilo como eluyentes. Las fracciones que contenían triptolida y tripdiolida se purificaron en HPLC preparativa con una columna de Nova-Pak C18, 25 x 100 mm, usando acetonitrilo-agua como la fase móvil. Los compuestos se recristalizaron en hexano-diclorometano. Se identificó la triptolida por UV, IR, RMN de protones y espectros de masa. La tripdiolida se identificó por HPLC, TLC y RMN de protones y comparación con el producto de laboratorio conocido proporcionado por Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. (Ridgefield, Connecticut). El acetonitrilo era de calidad HPLC adquirido de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI), el agua fue Millipore pure, y otros disolventes eran de calidad GR. Las fases móviles se desgasificaron por vacío junto con sonicación justo antes de su uso. El cartucho de alúmina B Sep-Pak Plus se adquirió de Waters Assoc. (Milford, MA); la acetofenona, seleccionada como patrón interno para la evaluación de triptolida se adquirió de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MI). Las estructuras químicas de triptolida y tripdiolida se muestran en la Figura 11.

Preparación del extracto de acetato de etilo de TwHF. Las raíces de TwHF se recogieron de la provincia Fujian, China. Se retiró la piel de las raíces y se molió la parte leñosa de las raíces hasta un polvo grueso. Se extrajeron 1000 g del polvo grueso con etanol tres veces. Las soluciones de etanol se combinaron y se evaporaron a presión reducida. El resto después se extrajo con acetato de etilo. La concentración de la solución a presión reducida produjo 22 g del extracto de acetato de etilo.

Procedimiento de enriquecimiento. Se pesaron aproximadamente 50 mg de extracto de acetato de etilo de manera precisa y se disolvieron en 10 ml de cloroformo en un baño ultrasónico durante 25 minutos. La solución del extracto se filtró y el resto se lavó con 10 ml de cloroformo-acetato de etilo (9:1). Los lavados combinados con la solución de cloroformo original se aplicaron al cartucho Sep-Pak. Se pasaron sucesivamente 25 ml de cloroformo-acetato de etilo (9:1) y 15 ml de acetato de etilo-metanol (9:1) a través del cartucho. La fracción de cloroformo-acetato de etilo, usada para la determinación de triptolida, se evaporó hasta sequedad en una corriente suave de nitrógeno. El resto se disolvió con 1,00 ml de solución de acetofenona, que se preparó disolviendo acetofenona en metanol para obtener una solución que tiene una concentración de 12,5 \mug/ml. El resto disuelto se diluyó con acetonitrilo-agua (19:81) hasta 2,00 ml. La fracción de acetato de etilo-metanol se evaporó. El resto se disolvió en 1,00 ml de solución de acetonitrilo-agua (11:89) y se usó para analizar el contenido en tripdiolida.

Determinación de diterpenos. Se inyectó un volumen de 10 \mul de solución de muestra purificada en la cromatografía líquida. La fase móvil para cada separación se enumera en el cromatograma individual. La triptolida se determinó por comparación con un patrón interno. Las soluciones de referencia que contienen 1,83, 3,66, 7,32, 16,08 y 36,18 ng \mul^{-1} de triptolida y 6,25 ng \mul^{-1} de acetofenona para cada solución se prepararon en acetonitrilo-agua (19:81). Las soluciones de referencia de tripdiolida se prepararon en acetonitrilo-agua (11:89) a las concentraciones de 1,28, 2,55, 5,10, 10,20, 20,40, 30,60 y 40,80 ng \mul^{-1}. Se inyectaron dos replicados de cada una en el sistema de HPLC. Los cromatogramas resultantes produjeron datos para las curvas patrón. Los contenidos de triptolida y tripdiolida se calcularon y expresaron por 100 mg del extracto seco (secado a 80ºC a un peso constante).

Resultados

El procedimiento de enriquecimiento y la separación cromatográfica así como la selección de un patrón interno son los tres problemas principales en análisis de HPLC de extractos vegetales en bruto. Se investigaron muchos procedimientos de enriquecimiento durante las fases preliminares de este estudio. Éstos incluyeron diferentes absorbentes, tales como gel de sílice, alúmina N, florisil, diol, aminopropil NH_{2}, cianopropil CN, carbono activado y poliamida. Además, se ensayaron diferentes sistemas disolvente. Se descubrió que el cartucho de alúmina B Sep-Pak Plus era un método de purificación eficaz y adecuado que implicaba la cantidad mínima de etapas. Se realizó HPLC con una columna Nova-Pack C18 usando acetonitrilo-agua como sistema de fase móvil. Esto provocó una mejor separación de triptolida, tripdiolida y acetofenona de otros componentes del vegetal que con el uso de metanol-agua como fase móvil. Se empleó una longitud de onda de detección de 214 nm a causa del anillo de lactona \alpha,\beta-insaturada en las estructuras de diterpeno. Se descubrió que la acetofenona era el patrón interno más adecuado para la determinación de triptolida. A causa de la interferencia de otros componentes, no fueron exitosos intentos de usar un patrón interno en la determinación de tripdiolida. La Figura 30 ilustra el cromatograma de triptolida y acetofenona. Los tiempos de retención de los dos compuestos fueron 11,35 min y 8,15 min respectivamente. La Figura 31 muestra el cromatograma de tripdiolida. El tiempo de retención fue 10,3 min.

La separación de triptolida, acetofenona y tripdiolida de los extractos de TwHF por HPLC se consiguieron usando el método descrito anteriormente. Este enfoque proporcionó una buena recuperación cuantitativa y reproductible. La Figura 32 representa un cromatograma típico del extracto de la determinación de triptolida después de la adición de acetofenona. Es evidente que los otros componentes presentes en el extracto no alteraron el pico del patrón interno. La Figura 33 muestra un cromatograma típico del extracto para la determinación de tripdiolida.

La pureza del pico se ensayó recogiendo las fracciones correspondientes a ambos compuestos y analizándolos por HPLC en la misma columna usando metanol-agua (30:70) como fase móvil y ajustando el caudal a 1,0 ml por minuto. Los resultados indicaron que un componente único con los tiempos de retención correspondientes a triptolida (5,1 min) o tripdiolida (16,7 min) se habían aislado.

Se obtuvo un gráfico de calibración lineal para triptolida representando la proporción del área del pico de triptolida del patrón interno (y) frente a la cantidad de triptolida (x, ng). La ecuación de regresión y el coeficiente de correlación (r) fueron y = 0,025x - 0,049, r = 0,99999, n = 5. Se obtuvo el gráfico de calibración lineal de tripdiolida representando el área del pico de respuesta de tripdiolida (y) frente a la cantidad de tripdiolida (x, ng). La ecuación de regresión y el coeficiente de correlación fueron 6 = 744,2x - 2123, r = 0,9998, n = 7. El intervalo de la curva de calibración fue de aproximadamente 18,3 ng a aproximadamente 361,8 ng para triptolida y de aproximadamente 12,8 ng a aproximadamente 408,0 ng para tripdiolida.

El límite de detección se determinó a concentraciones muy bajas usando el método descrito. Las cantidades detectables de triptolida y tripdiolida fueron aproximadamente 4,77 \pm 0,66 ng (n = 4) y aproximadamente 9,05 \pm 0,66 ng (n = 3) respectivamente.

Se realizó el ensayo de recuperación añadiendo triptolida y tripdiolida puras al extracto y ensayando con el mismo procedimiento descrito anteriormente. Las recuperaciones (media del % \pm SD) de triptolida fue aproximadamente 98,34 \pm 1,54 (n = 4) y tripdiolida fue aproximadamente 95,85 \pm 1,49 (n = 4).

Los resultados del ensayo se representan en la Tabla 25. Cada término es la media de dos inyecciones. Los contenidos de triptolida y tripdiolida en aproximadamente 100 mg del extracto de acetato de etilo de TwHF fueron aproximadamente 19,88 y aproximadamente 9,58 \mug respectivamente.

TABLA 25

Contenidos de triptolida y tripdiolida en el extracto de Tripterygium wilfordii Hook F. determinados por HPLC^{1}
Diterpenos	Cantidad en determinaciones	Media \pm SD	Desviación típica relativa
	individuales (\mug por 100 mg		(%)
	de extracto)
Triptolida	18,45 20,90	19,88 \pm 1,04 n = 6	0,052
	21,05, 18,95
	19,82 20,12
Tripdiolida	10,30 10,03 10,17	9,58 \pm 0,54 n = 15	0,056
	9,64 9,72 10,14
	10,14 9,51 9,12
	8,75 8,98 9,01
	8,98 9,11 10,06
^{1} \begin{minipage}[t]{145mm} Los valores de los experimentos individuales son las cantidades por 100 mg de extracto de acetato de etilo seco.\end{minipage}

En resumen, este ejemplo proporciona un método seguro, sensible y fiable para la determinación de triptolida y tripdiolida en un extracto de TwHF. El pretratamiento de muestras con el cartucho de alúmina B Sep-Pak antes de HPLC representa un procedimiento de enriquecimiento rápido, simple y eficaz con una recuperación muy satisfactoria de los compuestos. El empleo exitoso del patrón interno mejoró enormemente la precisión y reproducibilidad del ensayo de triptolida. La triptolida y tripdiolida son dos de los compuestos diterpeno principales contenidos en TwHF. Este estudio proporciona los primeros datos cuantitativos acerca del contenido en tripdiolida en TwHF. Combinado con la capacidad de analizar triptolida, el enfoque hace posible evaluar la eficacia y toxicidad del extracto de TwHF y controlar la calidad y seguridad de la preparación de este material para ensayos clínicos y experimentos animales.

Ejemplo 16 El extracto de TwHF impide el metabolismo de progesterona

El presente ejemplo profético describe una propiedad del extracto TwHF de impedir el metabolismo de progesterona.

Se espera que el extracto o componentes del mismo puedan unirse al receptor de progesterona ya que muchos compuestos que se unen al receptor de glucocorticoides también se unen al receptor de progesterona y por tanto se usan como un medio del control de nacimiento y como un medio para interrumpir el embarazo. Como se muestra en la Figura 29D, RU486 inhibe la producción de PGE_{2} inducida por endotoxina por monocitos sanguíneos periféricos humanos, sin embargo, no es tan eficaz como el extracto de TwHF a concentraciones inferiores. El uso de preparaciones de TwHF en seres humanos se proporciona en el Ejemplo 9.

Ejemplo 17 Preparaciones terapéuticas del extracto de TwHF

El presente ejemplo detalla preparaciones adecuadas de los extractos, tales como píldoras, comprimidos, cápsulas, y similares que pueden prepararse y usarse en los diversos aspectos de la invención.

El extracto de TwHF, o componentes purificados del mismo, pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden encerrarse en una cápsula de gelatina con cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta. Para una administración terapéutica oral, el extracto, o componentes del mismo, pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares, ingeribles. Dichas composiciones y preparaciones deben contener al menos un 0,1% de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones pueden, por supuesto, variarse y pueden ser adecuadamente de entre aproximadamente 2 a aproximadamente un 60% en peso de la unidad. La cantidad de compuestos activos en dichas composiciones terapéuticamente útiles es aproximadamente 30-120 mg, preferiblemente aproximadamente 60 mg, de modo que se obtenga una dosificación adecuada.

Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, como goma de tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz, o gelatina; excipientes, tales como fosfato dicálcico, un agente disgregante, tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina pueden añadirse o un agente aromatizante, tal como menta, aceite de gaulteria, o aroma de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes diversos materiales distintos como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener los compuestos activos, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y aromatizante, tal como aroma de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debe ser farmacéuticamente pura y sustancialmente no tóxica en las cantidades empleadas. Además, el extracto, o componentes del mismo, pueden incorporarse en preparación y formulaciones de liberación sostenida.

El extracto, o componentes del mismo, referidos a triptolida, tripdiolida o wilforonida seleccionados por las actividades biológicas y moleculares descritas en este documento también pueden administrarse por vía parenteral o intraperitoneal. Las soluciones del compuesto activo purificado como base libre o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezclado adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que exista facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar conservada frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse por el uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el extracto, o componentes del mismo, en la cantidad necesaria en el disolvente apropiado con diversos ingredientes distintos enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril del mismo.

Ejemplo 18 Métodos para explorar agentes que tienen actividad de unión a GR y un efecto moderador de esteroides

El presente ejemplo proporciona ensayos para explorar sustancias candidatas para la actividad de unión al receptor de glucocorticoides siendo inactivas para la inducción de genes sensibles a esteroides. Aunque TwHF, y componentes del mismo, han mostrado desde el primer momento en la presente descripción unirse al receptor incluso en presencia de dexametasona; se ha identificado un ensayo para identificar otras sustancias de unión al receptor de glucocorticoides usando TwHF, o una fracción/componente activa del receptor del mismo. A modo de ejemplo, se incuba una sustancia candidata con el receptor de glucocorticoides en presencia de TwHF, o un componente de unión al receptor del mismo, y se seleccionarían sustancias que compiten con TwHF, o un componente del mismo, para el receptor. Se contempla que esta técnica de exploración resultará útil en la identificación general de un compuesto o mezcla de compuestos que tengan actividad de unión para el receptor de glucocorticoides. En otras realizaciones del método, la sustancia candidata se explorará adicionalmente para determinar si es capaz de inhibir la activación de genes dependientes de esteroides, usando el TwHF como patrón.

Otra realización de la presente invención es un método para determinar la capacidad de una sustancia candidata de unirse al receptor de glucocorticoides en, por ejemplo, un ensayo de unión competitivo en presencia de preparación de TwHF, o componentes de unión al receptor de glucocorticoides farmacológicamente activos del mismo. Por ejemplo, el método, en algunas realizaciones, incluye en líneas generales las etapas de obtener una preparación del receptor de glucocorticoides, mezclar una sustancia candidata con la preparación del receptor de glucocorticoides en presencia de preparación de TwHF o un componente farmacológicamente activo de la misma que se une al receptor de glucocorticoides, y determinar la capacidad de la sustancia candidata de unirse al receptor de glucocorticoides en presencia del TwHF, o componente farmacológicamente activo del mismo.

Naturalmente, se mediría o determinaría la unión de la composición de TwHF o componente de la composición, en ausencia de la sustancia candidata añadida en un estudio control separado. También se añadiría la sustancia candidata y la preparación de TwHF junto con una preparación de receptor y se determinaría la capacidad de la sustancia candidata de competir con el TwHF para la unión del receptor. Una sustancia candidata que reduce la unión de la preparación de TwHF al receptor con relación a la unión en su ausencia es un indicio de una sustancia candidata con capacidad de unión al receptor de glucocorticoides.

Por consiguiente, en ensayos de exploración para identificar agentes farmacéuticos que se unen al receptor de glucocorticoides, se propone que los compuestos aislados de fuentes naturales tales como vegetales, animales o incluso fuentes tales como marina, forestal o muestras de tierra, pueden ensayarse para la presencia de agentes farmacéuticos potencialmente útiles. Se entenderá que los agentes farmacéuticos a explorar también podrían obtenerse de composiciones químicas o compuestos fabricados por el hombre. Los compuestos activos pueden incluir fragmentos o partes de compuestos de origen natural o pueden encontrarse sólo como combinaciones activas de compuestos conocidos que son inactivos de otro modo.

Cualquier método puede emplearse en líneas generales para determinar la unión del receptor de glucocorticoides. Por ejemplo, usando los métodos del Ejemplo 15 para determinar la cantidad de triptolida o tripdiolida no unida presente en una fracción sobrenadante del ensayo anterior, sería posible determinar la cantidad de unión por la sustancia candidata. Una muestra de control incluiría una muestra donde sólo está presente TwHF.

Métodos adicionales serán aquellos en los que el receptor de glucocorticoides incorpora o está conjugado a un marcador, tal como un marcador enzimático, químico o radiomarcador, o incorpora uno de los ligandos de un sistema de detección basado en dos ligandos tal como sistema de avidina/biotina. Por facilidad y seguridad, se prefiere el uso de marcadores enzimáticos, tales como, por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, ureasa o fosfatasa alcalina. En dichos casos, se emplearía un sustrato indicador colorimétrico para proporcionar un medio detectable por el ojo humano o por un espectrofotómetro.

Un especialista en la técnica después de la lectura de la presente descripción se dará cuenta de que una sustancia candidata que es capaz de unirse al receptor de glucocorticoides en presencia de TwHF o al menos un componente del mismo que tiene actividad farmacológica para la unión al receptor de glucocorticoides, puede activar los genes sensibles a esteroides o puede inhibir la activación de genes sensibles a esteroides. Un ensayo que usa un gen informador bajo el control de regiones reguladoras del receptor de glucocorticoides como el usado en el Ejemplo 13 determinaría si se activan los genes sensibles a esteroides, y también sirve para proporcionar un método para la selección adicional entre sustancias candidatas para las que no activan genes sensibles a esteroides.

Un ejemplo de una preparación de receptor de glucocorticoides es una preparación de fibroblastos humanos. Un ejemplo de región reguladora de GR son los elementos inducibles por GR de la repetición larga terminal MMTV. Un ejemplo de un gen informador es el gen de la luciferasa, o el gen CAT (cloranfenicol acetiltransferasa).

Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y atifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en la que cualquier medio convencional o agente es compatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

Ensayo para nitrito: El contenido en nitrito en muestras diluidas duplicadas se midió añadiendo 100 \mul de reactivo de Griess recién preparado a 100 \mul de las muestras en placas de 96 pocillos y leyendo la OD a 540 nm. La concentración de nitrito se determinó por comparación con las curvas de OD de diluciones en serie de nitrito sódico. La concentración detectable mínima fue 1,6 \muM.

Determinación de TNF-\alpha: Se midió TNF-\alpha por citotoxicidad de fibroblastos L929 murinos. Brevemente, se incubaron 7 x 10^{4} células L929/pocillo en medio completo en placas de microcultivo de 96 pocillos durante 3 horas. Después se cargaron 100 \mul de patrones TNF-\alpha/pocillo o diluciones de la muestra, se añadieron 50 ml de cicloheximida a 0,3 mg/ml en cada pocillo. Las células se cultivaron durante 18 horas. Las placas se tiñeron con cristal de violeta al 0,5% en metanol/solución salina normal 1:4 y se leyó la OD a 540 nm.

Los siguientes ejemplos se incluyeron para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Debe apreciarse por los especialistas en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas descubiertas que funcionan bien en la práctica de la presente invención, y por tanto, puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los especialistas en la técnica, deben, a la luz de la presente descripción, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen y seguir obteniendo un resultado parecido o similar sin alejarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 19 Tratamiento de artritis reumatoide (RA) con un extracto de Tripterygium wilfordii Hook F

Se inscribieron trece pacientes con RA activa en un ensayo de aumento de dosis en Fase I, de un extracto de acetato de etilo de Tripteryglum wilfordii Hook F. Se han establecido la seguridad y efectos inmunosupresores de este extracto por estudios in vitro e in vivo. Dos hombres y 11 mujeres con una edad media de 55,2 años se inscribieron. La duración de la enfermedad fue 10,6 años, el 92% eran RF + y colectivamente tenían una media de 3,2 DMARD. Continuaron con dosis estables de NSAID (11 pts) y prednisona \leq7,5 mg/d (8 pts). Todos cumplieron los criterios ACR para RA y demostraron enfermedad activa.

Los pacientes recibieron uno de los tres regímenes de dosificación: 30 mg, 60 mg y 120 mg al día (durante 8 semanas cada uno) (n = 5); 60, 120 y 180 mg al día (n = 2); o 120, 180 y 240 mg al día (n = 6). Después las dosis se aumentaron mensualmente hasta que se consiguieron las dosis máximas (570 mg). Los pacientes se evaluaron cada mes para la seguridad, y la eficacia clínica se evaluó usando los criterios de Paulus modificados en un 20%. Se retiraron cuatro pacientes antes de recibir 180 mg/d por ausencia de eficacia, falta de aceptación u otra enfermedad. Nueve pacientes recibieron una media de 59,1 semanas (intervalo: 40-96) de terapia. Se vieron respuestas clínicas significativas a dosis \geq180 mg/d y fueron máximas con dosis más altas y mayor duración de la terapia. Las disminuciones significativas (p <0,01) en ESR, CRP y suero RF también se observaron \geq180 mg/d. Se muestran las respuestas dependientes de dosis:

mg/d 30 60 120 150 180 210 240 270 300 390 480 570 390

Respuesta 2/5 0/6 1/11 1/3 6/10 2/2 7/9 3/6 8/9 8/9 8/9 8/9 8/8. La duración de respuesta se evaluó mensualmente después del cese de la terapia: 9/9, 8/9 y 4/8 continuaron siendo sensibles después de 1, 2 y 3 meses. Los sucesos adversos incluyeron dispepsia, hipertensión, diarrea, y náuseas. La hipertensión fue la más habitual a 570 mg/d. Estos datos demuestran que la administración crónica de este extracto es segura y una terapia eficaz en RA, especialmente a dosis \geq180 mg/d.

Ejemplo 20 Tripterygium wilfordii Hook F inhibe la regulación positiva de la actividad de ciclooxigenasa-2 y la producción de PGE inducible

El presente ejemplo demuestra el efecto de un extracto de metanol/cloroformo (T2) de (TWH) y sus componentes activos en la producción de PGE in vitro por células humanas de diversos tipos, incluyendo monocitos sanguíneos periféricos, fibroblastos sinoviales RA y la línea celular histiocítica U937.

T2 y sus componentes activos, triptolida y tripdiolida, inhibieron la producción de PGE2 por monocitos estimulados con LPS. Esto reflejó la supresión marcada de la inducción de ARN para ciclooxigenasa-2 (COX-2). Por el contrario, T2, y tripdiolida tuvieron efecto sobre la producción de PGE2 por células U937 activadas con LPS que no expresan COX-2. LPS también estimuló fibroblastos sinoviales RA para producir COX-2 y aumentar la producción de PGE2, ambas cuales se inhibieron significativamente por T2. T2 regula negativamente la producción de PGE2 inhibiendo la inducción de la expresión de COX-2. Esto puede contribuir a su capacidad de suprimir enfermedades autoinmunes e inflamatorias.

Ejemplo 21 Tratamiento con un extracto de acetato de etilo de Tripterygium wilfordii Hook mejora la inflamación articular en ratas transgénicas HLA B27

Se preparó un extracto de TWH por extracción secuencial de raíces de la planta con etanol y acetato de etilo. Este extracto ejerció acción inmunosupresora in vitro tanto en células T como en células B.

Para demostrar que este extracto ejercía efecto terapéutico en un modelo animal de artritis reactiva, se realizó un estudio en ratas transgénicas HLA B27 con enfermedad articular inflamatoria y gastrointestinal. Los animales se dividieron aleatoriamente en tres grupos y se trataron durante 4 semanas con vehículo sólo o el extracto de TWH a 270 mg/kg o 450 mg/kg. Estas dosis fueron comparables a 1/5 y 1/3 de las que provocan letalidad aguda en el 50% de las ratas. Se observaron disminuciones significativas en la hinchazón articular de la segunda semana del ensayo en ambos grupos tratados con el extracto. Por el contrario, se encontró un aumento en la hinchazón articular en animales tratados con vehículo.

Se redujeron los niveles en plasma de nitrito e IL-6 después del tratamiento con el extracto de TWH en comparación con el grupo tratado con vehículo. Además, la incorporación de [^{3}H]-timidina inducida por PHA y la producción de IL-2 y la producción de TNF\alpha, IL-6 y nitrito estimulada por LPS+IL-1 por las células esplénicas de los animales tratados con TWH fue significativamente inferior a la de las células esplénicas de animales tratados con vehículo al final del tratamiento. No se produjo diarrea por el tratamiento. Estos resultados indican que el TWH suprimió la artritis en ratas transgénicas HLA-B27 en virtud de sus acciones anti-inflamatorias e inmunosupresoras, y demuestran la utilidad del uso de TWH para el tratamiento de artritis en seres humanos.

Ejemplo 22 Concentración de PGE2 Y TNF-\alpha en el exudado de las bolsas de aire en ratas F344 tratadas con vehículo o extracto EA

Se prepararon las bolsas de aire y se estimularon con carragenano al 1% en los 2 grupos de animales como se describe en "Materiales y Métodos". Los exudados se recogieron cuidadosamente justo después de sacrificar a los animales. Se contaron los glóbulos blancos con un contador coulter, se midieron el contenido en PGE2, nitrito y TNF-\alpha de los exudados con ELISA, reactivo de Griess y toxicidad de L929, respectivamente. Los números son la media de cada grupo.

TABLA 26

Concentración de PGE2 Y TNF-\alpha en el exudado de las bolsas de aire en ratas F344 tratadas con
vehículo o extracto EA
Tratamiento
	Vehículo 7	Extracto EA 7	Ensayo t	Valor p
Número de
animales
Volumen del	4,61	4,45
exudado (ml)
Recuento de	18,95	7,42	Vehículo/EA	0,0003
glóbulos
blancos
(millones/ml)
Nitrito (\muM)	39,41	19,74	Vehículo/EA	0,0178
PGE2 (ng/ml)	22,02	5,78	Vehículo/EA	0,0046

Materiales y métodos

Animales y régimen de tratamiento: Se dividieron aleatoriamente ratas F344 macho en 2 grupos con 7 en cada grupo. El extracto de acetato de etilo (EA) de Tripterygium Wilfordii hook. F se disolvió en etanol al 10% que contenía Tween 20 al 10%. Los animales se trataron por una sonda diaria con vehículo solo o el extracto EA a 270 mg/kg de peso corporal. El transcurso total del tratamiento fue 5 días.

\newpage

Preparación de la bolsa de aire: Se produjeron cavidades aéreas por inyección subcutánea de 20 ml de aire en el área intracapsular de la espalda a intervalos de 2 días entre cada inyección. Se inyectaron 2 ml de carragenano al 1% disuelto en solución salina directamente en la bolsa el día después de la última expansión con aire. Los animales se sacrificaron y se recogió el tejido 16 h después de la estimulación con carragenano.

Reactivos: Se preparó el extracto EA extrayendo las raíces de Tripterygium Wilfordii hook. F con etanol seguido por acetato de etilo. El carragenano se adquirió de Sigma. Se usó la línea celular de fibroblastos murinos L929 ADCC como diana para citotoxicidad. Se adquirió el TNF-\alpha recombinante humano de Genzyme (West Malling, Inglaterra). Se adquirió el kit de ELISA para PGE2 de Amersham (Arlington, Illinois). El reactivo de Griess se preparó mezclando volúmenes iguales de naftilentilendiamina al 0,2% (Sigma) y sulfanilamida al 2% (Sigma) en ácido fosfórico al 5% (Sigma).

Cultivo celular para la síntesis de ADN de linfocitos y producción de PGE2, TNF-\alpha y nitrito: Se separaron las células del bazo o células del exudado de las bolsas de aire del bazo o los exudados y se lavaron una vez con solución salina normal. Las células se incubaron en RPMI-1640 suplementado con suero de ternera fetal al 10%, penicilina G (200 unidades), gentamicina (10 \mug/ml) y L-glutamina (0,3 mg/ml) en placas de cultivo de microtitulación de 96 pocillos o 24 pocillos con o sin los estímulos indicados para los periodos de tiempo indicados. Para la determinación de la proliferación de linfocitos T, se añadió 1 \muCi de [^{3}H]-timidina al cultivo durante las últimas 16 h. En los tiempos puntuales indicados, se recogieron los sobrenadantes libres de células, se hicieron alícuotas y se almacenaron a -20ºC hasta que se ensayaron.

Ensayo de PGE2: Se prepararon muestras para la determinación de PGE2 como se describe por el fabricante del kit de ensayo. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo de células esplénicas o las células de exudado o el exudado o el homogeneizado del tejido se extrajeron con etanol. Los extractos de etanol se pasaron a través de una columna C18 y se eluyó PGE2 con acetato de etilo. Los eluidos después se secaron en gas nitrógeno. El contenido en PGE2 de la muestra se determinó usando el kit de ELISA como se describe por el fabricante (Amersham).

Referencias

1. Kirkman et al. (1989) "Response to monoclonal CD7 antibody in rheumatoid arthritis" Lancet 1:589.

2. Caperton et al. (1989) "Treatment of refractory rheumatoid arthritis (RA) with anti-lymphocyte immunotoxin" Arthritis Rheum. 24:2130.

3. Herog et al. (1989) "Anti-CD4 antibody treatment of patients with rheumatoid arthritis: l. Effect on clinical course and circulating T cells" J. Autoimmunity 2:627.

4. Kyle et al. (1989) "Beneficial effect of monoclonal antibody to interleukin 2 receptor on activated T cells in 30 Rheumatoid arthritis" Ann. Rheum. Dis. 48:428.

5. Jia Li (1985) "Chemistry and pharmacology and clinical application of plants of Tripterygium family" Yao Xue Tong Bao 20:101.

6. Hubei Study Group (1982) "Pharmacological study on the ethanol extract of Tripterygium wilfordii Hook F" Zung Cao Yao 13:27.

7. Wei et al. (1988) "Side effects of T_{2} in the treatment of 106 patients with glomerular diseases" New Drug and It's Clinícal Applícatíon 1 (6):37.

8. Jiang et al. (1987) "Tripterygium wilfordii Hook caused acute toxicity with kidney involvement in 17 cases" Chinese J. Kidney Dis 3(3):167.

9. Chen et al. (1987) Clinical analysis of 10 cases of "Tripterygium wilfordii Hook caused toxicity" Symposium, "Clinical Application of Tripterygium wilfordii Hook", Hubei, China.

10. Tao et al. (1987) "Prospective, controlled, double-blind, cross-over trial of T_{2} (polyglycosides extracted from Tripterygium wilfordii Hook F) in the treatment of rheumatoid arthritis" Chinese J. Int. Med. 26:399.

11. Tao et al. (1988) "Mechanism of treatment of rheumatoid arthritis with Tripterygium wilfordii Hook F l. Effect of T_{2} on secretion of total lgM and IgM-RF by PBMC" Acta. Acad Med Sinicae 10:361.

12. Tao et al. (1989) "A prospective, controlled, double blind, cross-over study of Tripterygium wilfordii Hook F in the treatment of rheumatoid arthritis" Chinese Med. J. 102(5):327.

13. (1982) "T_{2} Study Group of Jiang Su Province of China: Summary of the clinical trials of T_{2} in the treatment of 554 patients with various diseases." Annals Chinese Acad. Med Sci. 3:3.

\newpage

14. Yu, Dy Y (1983) "Clinical observation of 144 cases of rheumatoid arthritis treated with glycoside of radix Tripterygium wilfordii" J. Trad Chinese Med. 3(2): 125.

15. Xue, Z (1984) "Treatment of 21 cases of systemic lupus erythematosus (SLE) with Tripterygium wilfordii" Chinese J. Derm 17(3):201.

16. (1979) "T_{2} Study Group of Chinese Institute of Dermatology: Clinical observation on the treatment of skin disorders with polyglycoside of Tripterygium wilfordii" Acta. Acad. Med. Sinicae 1 (2):6.

17. Xie, D (1983) "Experience in the treatment of Behcet's disease with polyglycosides of Tripterygium wilfordii Hook" Zhong Xi Yi Jie HE ZA Zhi 3(6):349.

18. Peng, S (1983) "Report on 20 patients with Henoch-Schonlein purpura treated with polyglycosides of Tripterygium wilfordii Hook (T_{2})" Jian Su Yi Yao 11 :38.

19. Feng, B (1985) "Observation on the effect of polyglycosides of Tripterygium wilfordii Hook (T_{2}) on 50 cases of leprosy reactive status" Ghinese Clin. Derm. J. 4:211.

20. Wu, Y (1986) "Treatment of neuralgia of leprosy reactive status with polyglycosides of Triplerygium wilfordii Hook(T_{2})" Chinese J. Derm. 19(4):217.

21. Jiang, X (1982) "Exploration of the treatment of nephrotic syndrome with polyglycosides of Triplerygium wilfordii Hook (T_{2})" Chinese J. Ped 20(4):201.

22. Li, X (1982) "Clinical observation on the treatment of 53 cases of nephrotic syndrome with polyglycosides of Tripterygium wílfordii Hook (T_{2})" Chinese J. Ped 20(4):203.

23. Qian, J (1987) "Observation on the effect of polyglycosides of Tripterygium wilfordii Hook (T_{2}) on idiopathic IgA nephropathy" Annual Meeting of Nephrology (República Popular China).

24. Li, X (1987) "Treatment of 50 cases of children's purpura nephritis with polyglycosides of Tripterygium wilfordii Hook" Jiang Su Yi Yao 12:644.

25. Pan, Y (1987) "Treatment of purpura nephritis with Tripterygium wilfordii Hook" Acta. Acad Med Sinicae 9(6):2.

26. Cheng, R (1988) "Observation of the therapeutic effect of polyglycosides of Tripterygium wílfordii Hook (T_{2}) combined with thyroid gland tablets on chronic Iymphocytic thyroiditis" Zhong Xi Vi Jie He Za Zhi 8(11 ):676.

27. Zheng et al. (1983) "Studies on toxicity of total glycosides in Tripterygium wílfordii" Acta. Acad. Med. Sinicae 5(2):73.

28. Zuo et al. (1986) "Different effect of Tripterygium reglii on T and B cell function" Chinese J. Immunol. 2:232.

29. Zhang, LS (1986) "Inhibitory effect of celastrol on murine Iymphocyte proliferation" Acta. Pharmacol. Sinicae 7:85.

30. Zang et al. (1986) Shanghai Yike Dalle Xueba, 13(4):267-272.

31. Kupchan et al. (1972) J. Am. Ghem. Soc., 94:3194-3195.

32. Zheng et al. (1983) "Studies on pharmacological actions of total glycosides in Tripterygium wilfordii Hook F" Acta. Acad. Med Sinicae 5:1.

33. Chang et al. (1984) "A preliminary study of the immunosuppressive activity of mixed glycosides of Tripterygium wilfordii Hook F" Chinese J Immunol. 4:331.

34. Zheng et al. (1982) "Effect of the decoction of Tripterygium wilfordii Hook on immune functions" Fujiang Med J. 4:222.

35. Zhang et al. (1983) "Studies on diterpenoids from Tripterygium wilfordii" Acta. Acad Med Shanghai 13:267.

36. Zhang el al. (1981) "Antineoplastic action of triptolide and its effect on the immunologic function in mice" Acta. Pharmacal. Sinicae 2(2):128.

37. Cheng HW et al. (1985) "Cellular immunological study on experimental allergic encephalopathy and the exploration of the effect of Tripterygium wilfordii Hook on it", Immunology Bulletin 5(3,4):7.

38. Zheng J et al. (1983), Studies on toxicity of total glycosides in Tripterygium wilfordii. Acta Acad Med Sinicae 5 (2):73.

39. Zheng JR et al. (1985a), Effect of total glycosides of Tripterygium wilfordii on animal reproductive organs. 1. Experiments of male rats. Acta Academiae Sinicae 5(2):73.

40. Kupchan, SM (1976) "Novel plant-derived tumor inhibitors and their mechanisms of action" Cancer Treatment Reports 60: 1115.

41. Hubei Cooperative Study Group of Tripterygium wilfordii Hook (1981), Clinical study of the extract of tripterygium wilfordii hook in the treatment of rheumatoid arthritis. Wu Han Yi Xue Yuan Xue Bao 4:62, 1981.

42. Chen, Zizhen, et al. (1986), Proceedings in the study of the active compounds of Tripterygium wilfordii Hook F. Zong Guo Yi Yaun Yao Xue Za Zhi. 6(9):26.

43. Chen, Zizhen, et al. (1988), Study of the active compounds and the preparation of Tripterygium wilfordii. Hook F. Zi Liao Hui Bian. 6-9.

44. Chen, Zizhen et al. (1985), Quantitative measurement of triptolide content in the tablets of Tripterygium witfordii Hook F. Zi Liao Hui Bian.

45. Fang, Guoxin et al. (1986), Quantitative measurement of triptolide contained in the ethyl acetate extract of Tripterygium wilfordii Hook F and its tablets. Zhong Tao Tong Bao 11 (8):38.

46. Zhang, Yigu et al. (1983) "An experimental pathological study of intoxication by the ethyl acetate extract of Lei Gung Teng (Tripterygium wilfordii Hook F)", Yao Wu Yan Jiu 4:367.

47. Li, Lezhen et al. (1982), Pharmacological study of the ethyl acetate extract of Tripterygium wilfordii Hook F. Zhong Cao Yao 13(4):27.

48. Hubei Cooperative Study Group of Tripterygium wilfordii Hook F (1979), Preliminary pharmacologic study of Tripterygium wilfordii Hook F. Hubei Wei Sheng 1:73.

49. Phytochemistry Study Group of Hubei Academy of Chinese Traditional Medicine and Therapy. Study of the active ingredients of Tripterygium wilfordii Hook F in the treatment of rheumatoid arthritis (1978), Zhong Cao Yao Tong Xum. 11:8.

50. Chen Kunchang et al. (1986), "The lactores from three wingnut (Tripterygium wilfordii HookF) in Huber", Chem. Abstracts, Vol. 105:384, abstract Nº 105:130886u.

51. Thiele et al. (1983), J. Immunol. 131 :2282-2290.

52. Rosenberg, et al. (1979), J Immunol. 122:926-931.

53. Rosenstreich, et al. (1971), J. Exp. Med. 134:1170-1186.

54. Jelinek et al. (1986), J. Immunol. 136:83-92.

55. Geppert et al. (1987), J Immunol. 138:1660-1666.

56. Davis et al. (1986), J Immunol. 137:3758-3767.

57. Moreno et al. (1986), J Immunol. 136:3579-3587.

58. Gillis et al. (1978), J Immunol. 120:2027-2032.

59. Splawski et al. (1986), J lmmunol. 139:1432-1437.

60. Weiss et al. (1986) "The role of the T3/antigen receptor complex in T cell activation" Ann. Rev: Immunol. 4:593.

61. Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18ª edición.

62. Delaunois, A.L. (1973), Intemational encyclopedia of Pharmacology and Therapeutics, Section 7, Biostatistics in Pharmacology- Vol. II, Pergamon Press.

63. Zalkow et al. (1988) "Macrocyclic pyrolizidine alkaloids from Senecio anonymous. Separation of a complex alkaloid extract using droplet countercurrent chromatography" J. Nat. Prod. 31:1520.

64. Shu, Dafeu et al. (1989), Report of 270 cases of rheumatoid arthritis treated with ethyl acetate extract of Tripterygium wilfordii Hook. Zhong Yao Yao Li Yu Lin Chuang, 5(3):40.

65. Zhang LS (1986), Inhibitory effect of celastrol on murine Iymphocyte proliferation. Acta Phamacol Sinicae 7:85.

66. Nan Jiang Jun Ou Zong Yi Yuan (1979), Effect of T II and Huang Jiang (Po) on Iymphocytes. Zi LiaO Xuan Bian 10:5.

67. Kuang Yan De et al. (1988), Effect of TWH on IL-2 production and IL-2 receptor expression. Shanghai J Immunology 8(4):250.

68. Zhu Xi Yuan et al. (1988), In vitro observation on the effect of Tripterygium hypoglaucum hutch on immune responses. Physiological Sciences 8:417.

69. Zheng YL et al. (1982) "Effect of the decoction of Tripterygium wilfordíi Hook on immune functions", Fujiang Med J. 4:222.

70. Chang JL et al. (1984) "A preliminary study of the immunosuppressive activity of mixed glycosides of Tripterygium wilfordii Hook F." Chinese J. Immunol. 4:331.

71. Zheng JR et al. (1985b), Effects of total glycosides of Tripterygium wilfordii on reproductive organs of experimental animals. II. Experiments in female rats. Acta Academiae Sinicae 7(4):256.

72. Durand et al. (1988) Mol. Cell Biol. 8:1715.

73. Owaki et al. (1993) EMBO 12:4367-4373.

74. Gorman et al. (1982) Mol. Cell Biol. 2:1044.

75. Markar et al., J. Lipid Research 35:1888-1895, 1994.

76. Goodman and Gilman, The Pharmacologícal Basis ofTherapeutícs, 8ª Ed., Gilman, A.G., Rall, T.W., Nies, A.S., and Taylor, P., Editors, Pergamon Press, pág. 1448, 1990.

77. Patente de Estados Unidos Nº. 5.294.443, Lipsky et al.

Claims

1. Un método para explorar una sustancia candidata que tiene afinidad de unión por un receptor de glucocorticoides que comprende:

mezclar una sustancia candidata con un receptor de glucocorticoides en presencia de una preparación de raíz de Trypterygium wilfordii Hook F (TwHF) o un componente de unión al receptor de glucocorticoides de la misma; y

determinar la unión de la sustancia candidata al receptor de glucocorticoides.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el receptor de glucocorticoides es de una preparación de fibroblastos de piel humana; en particular, en el que el componente de unión al receptor de glucocorticoides es triptolida, tripdiolida o wilforonida; en particular, en el que el receptor de glucocorticoides está conjugado con un marcador, en particular, en el que el marcador es un marcador enzimático, químico, o radiactivo; en particular, en el que el receptor de glucocorticoides está conjugado con avidina/biotina.

3. Un método para seleccionar una sustancia adecuada para tratar inflamación o enfermedad inmune que comprende:

mezclar una sustancia candidata con un receptor de glucocorticoides en presencia de preparación de TwHF o un componente de unión al receptor de glucocorticoides de la misma;

determinar la unión de la sustancia candidata al receptor de glucocorticoides;

seleccionar una sustancia candidata que tiene afinidad de unión por el receptor de glucocorticoides;

determinar la actividad de la sustancia candidata seleccionada para inducir la expresión de un gen sensible a esteroides; y

seleccionar la sustancia candidata que es inactiva para inducir la expresión del gen sensible a esteroides.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el componente de unión al receptor de glucocorticoides es triptolida, tripdiolida o wilforonida; en particular, en el que la segunda etapa de determinación se realiza usando una construcción de gen informador bajo el control regulador de un elemento sensible a esteroides, en particular, en el que el elemento sensible a esteroides es de la repetición larga terminal MMTV, en particular, en el que el gen informador es el gen de la luciferasa o el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa, en particular, en el que el receptor de glucocorticoides es de una preparación de fibroblasto cutáneo humano.