ES2252760T3 - Metodos de exploracion para sustancias de union al receptor de glucocorticoides usando preparaciones de tripterygium wilfordii. - Google Patents
Metodos de exploracion para sustancias de union al receptor de glucocorticoides usando preparaciones de tripterygium wilfordii.Info
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Abstract
Un método para explorar una sustancia candidata que tiene afinidad de unión por un receptor de glucocorticoides que comprende: mezclar una sustancia candidata con un receptor de glucocorticoides en presencia de una preparación de raíz de Trypterygium wilfordii Hook F (TwHF) o un componente de unión al receptor de glucocorticoides de la misma; y determinar la unión de la sustancia candidata al receptor de glucocorticoides.
Description
Métodos de exploración para sustancias de unión
al receptor de glucocorticoides usando preparaciones de
Tripterygium wilfordii.
Tripterygium wilfordii.
La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad
inflamatoria crónica de etiología desconocida. Como la causa es
desconocida, el tratamiento se ha dirigido ha suprimir los signos y
síntomas de la inflamación crónica. Aunque se han documentado muchos
agentes para disminuir el dolor y la hinchazón temporalmente,
ninguno ha demostrado tener un impacto principal sobre el transcurso
de la enfermedad. Aunque se han desarrollado modalidades
terapéuticas para el tratamiento de esta enfermedad
^{1-4}, no se ha informado de una supresión
uniforme y persistente de esta afección. Aunque los enfoques
actuales son prometedores, parecen garantizados medios alternativos
de desarrollo de fármacos y podrían producir no solo nuevas y
eficaces modalidades de tratamiento, sino también proporcionar
nuevas perspectivas sobre la patogénesis de la enfermedad que podría
servir como base de innovaciones terapéuticas futuras.
Un área de investigación para nuevas invenciones
terapéuticas para diferentes formas de artritis, y particularmente
RA y otras enfermedades autoinmunes, es la de las medicinas chinas
tradicionales. Una de estas medicinas tradicionales es de
Tripterygium wilfordii Hook F, un arbusto tipo vid de la
familia de las Celastraceae^{5}. Se sabe que Tripterygium
wilfordii Hook F contiene varios constituyentes, algunos de los
cuales parecen ser tóxicos^{6}. Se sabe que las hojas, tronco,
flores y la piel de las raíces son venenosas y que su ingestión
puede provocar la muerte ^{7-9}. Por el contrario,
la parte leñosa de las raíces de la planta es mucho menos tóxica. Un
extracto de Tripterygium wilfordii Hook F preparado de la
raíz de la planta, denominado T_{2}, se ha descrito en la
bibliografía china para el tratamiento de enfermedades autoinmunes
^{10-26}. La preparación parece contener
componentes terapéuticos, y tener una toxicidad reducida en
comparación con otras preparaciones disponibles de la planta.
El extracto T_{2} se ha evaluado en un estudio
de cruce controlado con placebo doble ciego que implica 70 pacientes
RA, teniendo estos pacientes una duración media de RA de 6 años
^{10-11}. Se observó una mejora significativa en
una diversidad de parámetros clínicos, particularmente ESR, CRP, y
títulos de factor reumatoide, después de 12 semanas de terapia en el
grupo experimental en comparación con medidas iniciales o el grupo
tratado con placebo. De los pacientes tratados, el
82-93% presentaron una mejora en diferentes
criterios clínicos o equivalentes de laboratorio de inflamación.
Una actividad inmunosupresora de T_{2} puede deducirse del
descubrimiento de que el tratamiento indujo inhibición de la
producción de IgM y factor reumatoide IgM por las células
mononucleares sanguíneas periféricas de los pacientes in
vitro^{7}. La toxicidad, que consta principalmente de erupción
cutánea, complicaciones gastrointestinales y amenorrea, fue según se
dice, de una naturaleza generalmente moderada, y reversible con el
cese de la terapia.
La experiencia china sugirió que una dosificación
diaria de 0,8-1,5 mg/kg de T_{2} era relativamente
segura y eficaz. Los estudios de toxicidad aguda y crónica se han
realizado con T_{2} en china usando una diversidad de modelos
animales. El valor LD_{50} de T_{2} en ratones se encontró que
era 159,7 \pm 14,3 mg/kg^{27}. La toxicidad crónica principal
observada en ratas con administraciones de 30 mg/kg durante 90 días
fue azoospermia y disminución en el peso testicular ^{27}.
Dosificaciones inferiores de T_{2} no provocaron disminuciones en
el peso testicular. Los estudios de toxicidad, por lo tanto,
sugirieron que T_{2} mostraba un índice de seguridad razonable y
debe ser capaz de administrarse a pacientes de manera segura.
La investigación ha comenzado en China para
determinar el espectro de actividad de diversas preparaciones de
T. wilfordii. De acuerdo con los resultados presentados de
estos estudios, los extractos de TwHF fueron capaces de inhibir la
formación de rosetón E por células T de cobayas, producción de
IL-2 inducida por mitógeno por células T de ratón y
migración estimulada por antígeno de linfocitos de rata ^{28,29.}
Los componentes de T. wilfordii hook F conocidos como
triptonida y triptolida se ha informado que inhiben la proliferación
de linfocitos inducida por concavalina
A ^{30}. Los extractos de cloroformo/etanol de la planta, mencionados como T_{2} en la bibliografía, se han descrito como que tienen actividad significativa in vivo frente a ciertas leucemias de ratón e in vitro frente a células obtenidas de carcinomas humanos ^{31}. Se ha documentado la capacidad de T_{2} de suprimir varios modelos animales de enfermedad autoinmune, incluyendo artritis adyuvante y encefalomielitis alérgica experimental ^{28-29,32-36}. Grandes concentraciones de preparaciones de T_{2} (30 mg/kg) se ha informado que suprimen la reactividad de hipersensibilidad de tipo retardado en ratones y también puede suprimir la enfermedad de injerto contra hospedador, así como el rechazo de aloinjerto de piel y corazón ^{6,32}. Sin embargo, permanece sin estar claro si concentraciones inferiores farmacológicamente más apropiadas también ejercerían efectos terapéuticos en estos animales.
A ^{30}. Los extractos de cloroformo/etanol de la planta, mencionados como T_{2} en la bibliografía, se han descrito como que tienen actividad significativa in vivo frente a ciertas leucemias de ratón e in vitro frente a células obtenidas de carcinomas humanos ^{31}. Se ha documentado la capacidad de T_{2} de suprimir varios modelos animales de enfermedad autoinmune, incluyendo artritis adyuvante y encefalomielitis alérgica experimental ^{28-29,32-36}. Grandes concentraciones de preparaciones de T_{2} (30 mg/kg) se ha informado que suprimen la reactividad de hipersensibilidad de tipo retardado en ratones y también puede suprimir la enfermedad de injerto contra hospedador, así como el rechazo de aloinjerto de piel y corazón ^{6,32}. Sin embargo, permanece sin estar claro si concentraciones inferiores farmacológicamente más apropiadas también ejercerían efectos terapéuticos en estos animales.
El T_{2} examinado en la bibliografía china es
un extracto en bruto que contiene una mezcla de materiales,
incluyendo diversos glicósidos, alcaloides, y terpenoides. El
principio activo, sin embargo, aún no se ha identificado. Se han
purificado unos pocos componentes, incluyendo triptolida,
wilfordina, y compuestos relacionados, pero no existe un componente
purificado particular que represente la actividad terapéutica o
inmunosupresora de T_{2} ^{40}. Altas concentraciones de
triptolida se informó que suprimían la proliferación de linfocitos B
y T y la producción de interleuquina 2 por células de bazo de ratón
^{41}. Sin embargo, las concentraciones del T_{2} usadas fueron
suficientemente altas para que sucediera indudablemente toxicidad
específica significativa.
Varios agentes farmacológicos se han usado para
tratar artritis reumatoide y otras afecciones inflamatorias. Entre
estos están fármacos anti-inflamatorios no
esteroideos (NSAID) y glucocorticoides. Un aspecto principal del
mecanismo de acción de los fármacos
anti-inflamatorios no esteroideos se cree en líneas
generales que es la inhibición de ciclooxigenasa, la enzima
responsable de la biosíntesis de algunas prostaglandinas y ciertos
autacoides relacionados. Esta inhibición depende de que el fármaco
alcance la enzima ciclooxigenasa, lo que indica que el modo de
acción es al nivel de interacción con la proteína enzimática en sí
misma. Por ejemplo, el acetaminofeno puede bloquear la enzima sólo
en un medio que sea bajo en peróxidos lo que puede explicar su mala
actividad anti-inflamatoria ya que los sitios de
inflamación habitualmente contienen altas concentraciones de
peróxidos generados por leucocitos. La aspirina acetila una serina
en o cerca del sitio activo de ciclooxigenasa, inhibiendo la
actividad enzimática. El efecto secundario no deseado más habitual
de NSAID y otros fármacos tipo aspirina es una propensión a inducir
ulceración gástrica o intestinal. A veces también pueden suceder
efectos secundarios más serios, tales como anemia como resultado de
la pérdida de sangre.
Los glucocorticoides tienen la capacidad de
evitar y suprimir el desarrollo de las manifestaciones de
inflamación. También son de un inmenso valor en el tratamiento de
enfermedades que son el resultado de reacciones inmunes no
deseables. Las acciones inmunosupresoras y
anti-inflamatorias de los glucocorticoides están
inextricablemente unidas porque ambas provocan una gran parte de la
inhibición de las funciones específicas de leucocitos, en
particular, inhibición de linfoquinas.
Dos categorías de efectos tóxicos se observan en
el uso terapéutico de adrecortiesteroides ^{76}: los provocados
por la retirada y los provocados por el uso continuo de grandes
dosis. La insuficiencia suprarrenal aguda está provocada por una
retirada demasiado rápida de estos fármacos. La terapia prolongada
con corticoesteroides puede provocar la supresión de la función
pituitaria-suprarrenal que puede ser lenta en
regresar a la normalidad. Complicaciones adicionales provocadas por
terapia prolongada con corticoesteroides son: trastornos de fluido y
electrolito; hipertensión; hiperglucemia y glucosuria;
susceptibilidad aumentada a infecciones; incluyendo tuberculosis;
úlceras pépticas, que pueden sangrar o perforar; osteoporosis; una
miopatía característica; trastornos del comportamiento; cataratas
subcapsulares posteriores; detención del crecimiento; y habitus de
Cushing, que consta de "cara de luna", "joroba de búfalo",
alargamiento de las almohadillas grasas supraclaviculares,
"obesidad central", estriaciones, equimosis, acné, e
hirsutismo.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar métodos de exploración usando preparaciones de T.
wilfordii Hook F, y componentes aislados del mismo. Las
modalidades de tratamiento con NSAID actuales vienen acompañadas por
efectos secundarios significativamente no deseables. Por lo tanto,
serían de gran beneficio agentes que tengan los efectos
anti-inflamatorios de NSAID sin los efectos
secundarios.
La presente invención proporciona métodos de
acuerdo con las reivindicaciones.
La preparación purificada de T. wilfordii
se obtiene por un proceso que comprende extraer las partes leñosas
de la raíz de Tripterygium wilfordii Hook F, en la mayoría de
las realizaciones raíz sin piel o raíz en la que al menos algo o la
mayoría de la piel se ha retirado, para proporcionar una preparación
con toxicidad celular reducida, o al menos sin toxicidad celular
sustancial, en comparación con preparaciones en bruto que no se han
purificado o extraído de otro modo de los componentes contaminantes.
Los métodos descritos como parte de la presente invención emplean
preparaciones de T. wilfordii que se ha observado que tienen
actividad de unión al receptor de glucocorticoides. Los receptores
de glucocorticoides se reconocen por los especialistas en la técnica
como importantes en varias patologías. Por tanto, los métodos
pretenden incluir el uso de estos componentes de T.
wilfordii, y sus formas aisladas y purificadas, que demuestran
esta actividad de unión a receptores de glucocorticoides única. Las
preparaciones obtenidas de manera natural y producidas
sintéticamente de dichos componentes de T. wilfordii pueden,
por lo tanto, usarse eficazmente en la práctica de los métodos
descritos. Los componentes activos en la unión al receptor de
glucocorticoides de
T. wilfordii se han caracterizado en preparaciones de raíz, y también pueden existir en otras partes de la planta. Se entiende en el significado de los componentes de unión de receptor de glucocorticoides de T. wilfordii, por lo tanto, aquellos componentes, o partes farmacológicamente activas o fragmentos de esos componentes, que se unen al receptor de glucocorticoides. Estos componentes pueden caracterizarse adicionalmente como supresores de la inflamación y respuestas inmunes sin o con efectos agonistas esteroideos mínimos y/o sin, o con efectos de NSAID mínimos.
T. wilfordii se han caracterizado en preparaciones de raíz, y también pueden existir en otras partes de la planta. Se entiende en el significado de los componentes de unión de receptor de glucocorticoides de T. wilfordii, por lo tanto, aquellos componentes, o partes farmacológicamente activas o fragmentos de esos componentes, que se unen al receptor de glucocorticoides. Estos componentes pueden caracterizarse adicionalmente como supresores de la inflamación y respuestas inmunes sin o con efectos agonistas esteroideos mínimos y/o sin, o con efectos de NSAID mínimos.
La enfermedad inmune puede ser una enfermedad
autoinmune, tal como artritis reumatoide, lupus sistémico
eritematoso o psoriasis.
Como se usa en la descripción de la presente
invención, el término "efecto moderador esteroideo" también se
define como reductor de la cantidad de esteroides, tales como
prednisona, capaces de proporcionar un efecto farmacológico
beneficioso del esteroide. Por ejemplo, tras el tratamiento con las
preparaciones descritas, los pacientes que recibieron tratamientos
con prednisona pueden mantenerse en dosis más bajas de prednisona
sin pérdidas significativas de la actividad farmacológica observada
a las dosis más altas iniciales del esteroide. Este fenómeno se
ejemplifica en los datos presentados en la Tabla 13, en pacientes
que reciben la prednisona esteroide. Por tanto, el "efecto
moderador de esteroides" en el contexto de la presente invención
también puede describirse como la evitación de efectos secundarios
relacionados con esteroides reconocidos habitualmente, tales como
inducción de intolerancia a la glucosa, osteoporosis, ganancia de
peso o una combinación de estos. Este fenómeno también puede
relacionarse a la ausencia de actividad agonista de esteroides de un
componente o componentes de la preparación de T.
wilfordii.
También como se usa en la descripción de la
invención, la parte "leñosa" de la raíz es una parte de la raíz
que no tiene piel, o sin piel. La toxicidad celular como se usa en
la presente descripción se mide por la inducción de muerte celular,
expresión del receptor de interleuquina 2, actividad de señalización
celular, o una combinación de uno o más de estos efectos. La
actividad de señalización celular se refiere a la producción de
inositol trifosfato, generación de diacilglicerol, traslocación de
proteína quinasa C, actividad de proteína tirosina quinasa, o una
combinación de estas actividades.
Se describe un método para inhibir la inducción
de ciclooxigenasa 2. El método comprende administrar al sujeto una
cantidad farmacológicamente activa de una preparación de raíz de
Tripterygium wilfordii Hook F, o un componente
farmacológicamente activo de la misma, capaz de unirse al receptor
de glucocorticoides. En este método, la actividad
ciclooxigenasa-1 no se ve afectada sustancialmente.
La inhibición de la inducción de ciclooxigenasa-2
inhibe la síntesis de una prostaglandina, un autacoide, o una
citoquina inhibida por glucocorticoides, por ejemplo.
La producción constitutiva de prostaglandina y
autocoides relacionados está catalizada por
ciclooxigenasa-1. La ciclooxigenasa se encuentra en
muchas células. La inhibición de esta enzima se ha asociado al menos
en parte a efectos secundarios observados con el tratamiento que
incluye NSAID. Durante la inflamación y después de la estimulación,
las células inflamatorias, tales como macrófagos, transcriben un
segundo gen y producen una nueva enzima,
ciclooxigenasa-2, que representa la mayoría de la
producción de prostaglandina en sitios inflamatorios. Los NSAID
también inhiben esta enzima. Los esteroides (y T_{2}) inhiben la
trascripción del gen de ciclooxigenasa-2 mientras
que la actividad ciclooxigenasa-1 no se ve afectada
sustancialmente. Por lo tanto, tienen los efectos
anti-inflamatorios de NSAID pero no la
toxicidad.
Los procesos inflamatorios dependientes de
ciclooxigenasa-2 pueden ser la síntesis de una
prostaglandina o la síntesis de un autacoide relacionado. Las
actividades inmunosupresoras tipo corticoesteroide adicionales
pueden ser la síntesis de una citoquina inhibida por
glucocorticoides, tal como IL-2 o interferón
\gamma, y pueden estar relacionados a un proceso de una enfermedad
autoinmune, tal como, por ejemplo, artritis reumatoide, lupus
sistémico eritematoso o psoriasis.
Normalmente, cuando un glucocorticoide se une al
receptor de glucocorticoides, el complejo unido induce la
trascripción de los genes activados por el complejo
glucocorticoide-receptor. Se ha demostrado en este
documento que el extracto de TwHF, y componentes del mismo, se unen
al receptor de glucocorticoides, pero no activan los genes sensibles
a esteroides. Por consiguiente, los genes que se activarían
normalmente por el complejo no se activan. Por lo tanto, los efectos
no deseables relacionados del tratamiento con esteroides se evitan
por el tratamiento con extracto de TwHF. Entre los genes mostrados
claramente por la presente invención a inhibir por extractos de TwHF
están el gen de IL-2, los genes de interferón
\gamma y ciclooxigenasa-2. Esto proporciona un
aspecto adicional más de la invención como método para inhibir tanto
reacciones inmunes como respuestas inflamatorias. También se
describen por la presente métodos específicos para inhibir
glucocorticoides y receptores que forman complejos con las
preparaciones de extracto de TwHF. Los componentes de TwHF se unen
al receptor de glucocorticoides y ese complejo inhibe la
trascripción de ciertos genes tales como IL-2, IFN
\gamma y COX-2. Sin embargo, a diferencia del
complejo de dexametasona (un corticoesteroide) y el receptor de
glucocorticoides, el complejo de componentes de TwHF y el receptor
de glucocorticoides no activa genes que están dirigidos por
elementos de respuesta a glucocorticoides.
Los procesos dependientes del receptor del
glucocorticoides no deseados cuya activación se evita en la presente
invención pueden ser la inducción de intolerancia a la glucosa,
osteoporosis, o ganancia de peso, supresión de la función
pituitaria-suprarrenal, trastorno de fluido o
electrolito, hipertensión, hiperglucemia, glucosuria,
susceptibilidad de infecciones, úlcera péptica, osteoporosis,
miopatía, trastorno del comportamiento, cataratas subcapsulares
posteriores, detención del crecimiento, o habitus de Cushing. De
hecho, todas las diversas acciones hormonales de glucocorticoides se
dirigen por elementos de respuesta a glucocorticoides que regulan la
trascripción génica.
La preparación puede ser un extracto de
cloroformo-metanol, un extracto con
cloroformo-etanol, un extracto con etanol, o acetato
de etilo de la parte leñosa de la raíz de Tripterygium wilfordii
Hook F. Preferiblemente, el extracto es un extracto de acetato
de etilo y, más preferiblemente, el extracto se obtiene de la
extracción con etanol seguido por una extracción con acetato de
etilo. La preparación puede constar esencialmente de tripdiolida,
triptolida, wilforonida, o compuestos relacionados del extracto que
tienen la actividad biológica descrita, o un compuesto sintetizado
que tiene la estructura triptolida básica que tiene actividad
triptolida, y la cantidad farmacológicamente activa puede ser de
30-600 mg/día preferiblemente aproximadamente 50
mg/día a aproximadamente 100 mg/día, o en algunas aplicaciones,
aproximadamente 60 mg/día. Sin embargo, puede ser clínicamente
apropiado más o menos de cualquiera de estas dosis dependiendo de
las necesidades y progreso del paciente particular o afección que se
está tratando y la evaluación del médico que está atendiendo.
La cantidad farmacológicamente activa de la
preparación de la raíz de Tripterygium wilfordii Hook F
proporcionada por la presente invención se demuestra por su
LD_{50} en ratones, que es mayor de aproximadamente 860 mg/kg.
Expresado como un intervalo, el LD_{50} de la preparación está
entre aproximadamente 860 mg/kg a 1300 mg/kg. Como se ha demostrado
por esta invención, el extracto EA a producido en Texas ha mostrado
tener un LD_{50}, más preferiblemente, de aproximadamente 1250
mg/kg. El LD_{50} de la preparación es mucho superior que el
observado con otras preparaciones de TwHF, como se muestra en este
documento, y por lo tanto, la presente preparación es
considerablemente menos tóxica (es decir, requiere dosis más altas
para matar). Esto pone de relieve la ventaja adicional de las
presentes preparaciones como farmacológicamente más aceptables.
\newpage
La preparación de T. wilfordii se define
adicionalmente como que tiene una proporción de actividad
terapéutica:índice tóxico superior a aproximadamente 2,6 x
10^{-3}, o preferiblemente, de 2,6 x 10^{-3} a 4,5 x 10^{-3} o
más preferiblemente, aproximadamente 4,5 x 10 ^{-3}. La
proporción de actividad terapéutica:índice tóxico se calcula a
partir de una proporción de ID_{50} in vitro de
proliferación de células T/LD_{50}.
La preparación de Tripterygium wilfordii
Hook F del presente método también se describe como que tiene menos
de aproximadamente 1,3 \mug/mg de triptolida y preferiblemente,
aproximadamente 2,0-1,3 \mug/mg de triptolida, o
más preferiblemente, aproximadamente 0,2 \mug/mg de triptolida.
Aunque la preparación puede obtenerse por cualquier medio de
técnicas de extracción química que producen un producto que tiene la
proporción de actividad terapéutica:índice tóxico y concentración
de triptolida descritos, las técnicas más preferidas son extracción
con acetato de etilo de la raíz o por una extracción con etanol
seguida por una extracción con acetato de etilo de la raíz.
En una realización preferida del método descrito
anteriormente, la preparación de la raíz de Tripterygium
wilfordii Hook F se obtiene por un proceso que comprende las
etapas de i) obtener partes leñosas de las raíces de una planta
Tripterygium wilfordii Hook F; y ii) extraer las partes
leñosas con un disolvente para producir una preparación de
Tripterygium wilfordii Hook F, donde la preparación tiene
menos de aproximadamente de 1,3 \mug/mg de triptolida. El
disolvente es preferiblemente acetato de etilo. Más preferiblemente,
la etapa de extracción incluye extraer con un primer disolvente y
un segundo disolvente donde el primer disolvente es etanol y el
segundo disolvente es acetato de etilo.
La preparación de Tripterygium wilfordii
Hook F tiene una proporción de actividad terapéutica:índice tóxico
de más de aproximadamente de 2,6 x 10^{-3}, y la preparación se
obtiene por un proceso que comprende las etapas de i) obtener partes
leñosas de las raíces de una planta Tripterygium wilfordii
Hook F y retirar la piel; ii) extraer las partes leñosas con etanol
para producir un extracto de etanol; iii) extraer el extracto de
etanol con acetato de etilo para formar una preparación de
Tripterygium wilfordii Hook F. La preparación tiene una
proporción de actividad terapéutica:índice tóxico de más de
aproximadamente 2,6 x 10^{-3} y un LD_{50} en ratones de más de
aproximadamente 860 mg/kg, y menos de aproximadamente 1,3 \mug/mg
de triptolida. En esta realización de la presente invención, las
partes leñosas de las raíces sin piel se secan para formar una parte
leñosa seca; la parte leñosa seca se machaca para formar un polvo; y
el polvo se extrae con etanol para producir un extracto de etanol;
después de obtener la etapa descrita anteriormente. Más
preferiblemente, las partes leñosas de la raíz deben secarse bajo
luz solar abierta.
Se describen métodos para tratar inflamación, una
enfermedad inmune, o artritis reumatoide, sin activar
sustancialmente un gen dependiente de esteroides en un paciente. El
método comprende administrar aproximadamente 30 a aproximadamente
600 mg/día de una preparación de extracto de raíz de Tripterygium
wilfordii Hook F que tiene un LD_{50} en ratones de más de
aproximadamente 850 mg/kg al paciente, donde la preparación contiene
menos de aproximadamente 1,3 \mug/ml de triptolida y donde la
preparación se une al receptor de glucocorticoides y ejerce de este
modo actividad anti-inflamatoria e
inmunosupresora.
Se describe un método para inhibir los genes
sensibles a glucocorticoides, tales como el gen
interleuquina-2, un gen de interferón \gamma y un
gen de ciclooxigenasa-2. Cada uno de estos genes
está regulado negativamente por un complejo molecular de unión al
receptor de glucocorticoides. La supresión de todos los genes
pro-inflamatorios o potenciadotes inmunes suprimidos
por glucocorticoides se prevé por la presente invención. El método
comprende la etapa de administrar la preparación descrita
anteriormente de extracto de raíz de Tripterygium wilfordii
Hook F en una cantidad farmacológicamente activa. La cantidad
farmacológicamente activa es como se describe en este
documen-
to.
to.
Se describe un método para reducir la actividad
progesterona que comprende la administración de la preparación de
TwHF descrita anteriormente. La reducción de actividad progesterona
es útil para el control del nacimiento, por ejemplo, o como un
tratamiento "del día después". Además, este enfoque debe ser
útil como abortivo.
Una realización de la presente invención es una
método para determinar la capacidad de una sustancia candidata de
unirse al receptor de glucocorticoides en un ensayo de unión
competitiva en presencia de preparación de TwHF, o un componente de
unión al receptor de glucocorticoides de la misma. El método incluye
en líneas generales las etapas de mezclar una sustancia candidata
con un receptor de glucocorticoides en presencia de preparación de
TwHF o un componente de unión al receptor de glucocorticoides de la
misma, y determinar la unión de la sustancia candidata al receptor
de glucocorticoides. En este método, el receptor de glucocorticoides
puede ser de una preparación de fibroblastos de piel humana; el
componente de unión al componente de unión al receptor de
glucocorticoides puede ser triptolida, tripdiolida o wilforonida; el
receptor de glucocorticoides preferiblemente se conjuga a un
marcador, tal como un marcador enzimático, químico, o radiactivo. Un
marcado preferido es avidina/biotina.
Cuando se desea seleccionar entre sustancias
candidatas para las que, como TwHF, no activan genes sensibles a
esteroides, las sustancias candidatas que muestran actividad de
unión al receptor de glucocorticoides se explorarían adicionalmente
para identificar aquellos que no activan la expresión de genes
sensibles a esteroides. En la realización de esto, pueden
identificare otras sustancias que tienen la actividad de unión al
receptor de glucocorticoides de TwHF, o sus componentes activos, que
también evitan los efectos secundarios relacionados con
esteroides.
Una realización adicional de la invención es un
método para seleccionar una sustancia adecuada para el tratamiento
de inflamación o enfermedad inmune que comprende las etapas de
mezclar una sustancia candidata con un receptor de glucocorticoides
en presencia de la preparación de TwHF o un componente de unión al
receptor de glucocorticoides de la misma, determinar la unión de la
sustancia candidata al receptor de glucocorticoides, seleccionar una
sustancia candidata que tiene afinidad de unión por el receptor de
glucocorticoides, determinar la actividad de la sustancia candidata
seleccionada para inducir la expresión de genes sensibles a
esteroides, y seleccionar la sustancia candidata que es inactiva
para inducir la expresión de genes sensibles a esteroides. La
segunda etapa de determinación puede realizarse usando una
construcción génica informadora bajo el control regulador de un
elemento sensible a esteroides, por ejemplo, el elemento sensible a
esteroides de la repetición larga terminal MMTV. El gen informador
puede ser el gen de la luciferasa, el gen de la cloramfenicol
acetiltransferasa, o el gen de
\beta-galactosidasa, por ejemplo. Un especialista
en la técnica, tras la lectura de la presente descripción, conocería
construcciones génicas informadores similares útiles en la presente
invención.
Se describe un método para bloquear la producción
de interferón \gamma en un sujeto. El método comprende administrar
al sujeto una cantidad farmacológicamente activa de una preparación
de raíz de Tripterygium wilfordii Hook F, o un componente
farmacológicamente activo de la misma, capaz de bloquear la
producción de interferón gamma. Un método para inhibir el gen de
interleuquina-2 en un sujeto también es una
realización de la invención. El método comprende administrar al
sujeto una cantidad farmacológicamente activa de una preparación de
raíz de Tripterygium wilfordii Hook F, o un componente
farmacológicamente activo de la misma, capaz de inhibir la
trascripción del gen de interleuquina-2.
Después del convenio de larga duración de la
práctica de leyes de patentes, jurisprudencia, y construcción de
reivindicaciones, las palabras "un" y "una" indican "uno
o mas", cuando aparecen en la memoria descriptiva, incluyendo las
reivindicaciones.
Las siguientes abreviaturas se usan a lo largo de
toda la descripción de la presente invención.
- CRP=
- proteína reactiva C
- DAG=
- diacilglicerol
- ESR=
- velocidad de sedimentación de eritrocitos
- FACS=
- clasificación de células activadas por fluorescencia
- GR=
- receptor de glucocorticoides
- Ig=
- inmunoglobulina
- IL-2=
- interleuquina-2
- IL-2R=
- receptor de interleuquina-2
- IP=
- fosfatidil inositol trifosfato
- MAb=
- anticuerpos monoclonales
- MMTV=
- virus de tumor de mama de ratones
- NHS=
- suero humano normal
- PBMC
- células mononucleares sanguíneas periféricas
- PDB=
- forbol dibutirato
- PHA=
- fitohemaglutinina
- PMA=
- forbol 12-miristato 13-acetato
- PKC=
- proteína quinasa C
- RA=
- artritis reumatoide
- SA=
- Staphylococcus aureus tratado con formalina
- SK=
- estreptoquinasa
- SRBC=
- glóbulos rojos de oveja
- T_{2}=
- un extracto de cloroformo/metanol de la parte leñosa de Tripterygium wilfordii Hook F
- TT=
- toxoide del tétanos
- TwHF o TWF=
- Tripterygium wilfordii Hook F
Los siguientes dibujos forman parte de la
siguiente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar
adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La
invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos
dibujos en combinación con la descripción detallada de las
realizaciones específicas presentadas en este documento.
Figura 1. Efecto de T_{2} en la proliferación
de células T. Se cultivaron células T (1 x 10^{5}/pocillo) con
medio (\square) o PHA (\Delta) en presencia o ausencia de
concentraciones variadas de T_{2} como se indica durante 3 días.
Los resultados representan la media de cpm \pm SEM de los tres
experimentos.
Figura 2A, Figura 2B, Figura 2C, Figura 2D,
Figura 2E, Figura 2F, Figura 2G, Figura 2H, Figura 2I, Figura 2J,
Figura 2K y Figura 2L. Efecto de T_{2} en la progresión del ciclo
celular de células T humanas. Se cultivaron células T (1 x
10^{5}/pocillo) con o sin PHA (1 \mug/ml) en ausencia o
presencia de las concentraciones indicadas de T_{2} durante 24, 48
ó 72 horas. Las muestras se recogieron, se tiñeron con naranja de
acridinio, y se analizaron con un citómetro de flujo ORTHO usando el
programa CICERO para determinar la posición de las células en el
ciclo celular como se evalúa por su contenido en ARN y ADN.
Figura 3. Efecto inhibidor de T_{2} sobre la
producción de IL-2. Se cultivaron células T (1 x
10^{5}/pocillo) con medio (\square) o PHA (\blacksquare) en
presencia o ausencia de concentraciones variadas de T_{2} durante
36 horas. Los sobrenadantes libres de células se diluyeron 1:4 y se
analizaron para la actividad IL-2 con células
CTLL-2. Se muestra la incorporación de
[^{3}H]-TdR media \pm SEM de células
CTLL-2 de 6 experimentos.
Figura 4. Efecto de IL-2
suplementario sobre la inhibición mediada por T_{2} de la
proliferación de células T. Se estimularon células T (1 x
10^{5}/pocillo) con PHA (\square) o sin (\blacksquare)
IL-2 (10 U/ml) y en presencia o ausencia de
concentraciones variadas de T_{2} durante 3 días. Los datos se
expresan como porcentaje de la incorporación de
[^{3}H]-TdR de control de tres experimentos.
Figura 5A y Figura 5B. Efecto de T_{2} sobre la
síntesis de ADN de células B y producción de Ig. En el cuadrante de
la izquierda, se estimularon células B (5 x 10^{4}/pocillo) con SA
(o) o SA + IL-2 (o), y en el cuadrante derecho con
SA + IL-2 en presencia de concentraciones variadas
de T_{2}. Se determino [^{3}H]-TdR después de
una incubación de 5 días (cuadrante de la izquierda). Los
sobrenadantes se recogieron después de un cultivo de 7 días y se
ensayaron para el contenido en IgM (\blacksquare), IgG (o) e IgA
(o) (cuadrante derecho). Los resultados son la media \pm SEM de 3
experimentos.
Figura 6A y Figura 6B. Efecto de T_{2} en la
generación IP total por células T activadas. Se marcaron células T
frescas (A) o células Jurkat (B) con
[^{3}H]-mio-inositol durante una
noche en ausencia o presencia de las concentraciones indicadas de
T_{2}. Se determinó IP total como se describe en el Ejemplo 2.
También se estimuló una alícuota de cada población celular con PHA
durante 24 horas y se ensayaron los sobrenadantes para el contenido
en IL-2 usando células CTLL-2 (o).
Los datos son la media de 3 experimentos replicados.
Figura 7A, Figura 7B y Figura 7C. Efecto de
T_{2} sobre la generación de fracciones IP por células T activadas
con PHA. Se marcaron células Jurkat con
[^{3}H]-mio-inositol durante una
noche en presencia o ausencia de diversas concentraciones de
T_{2.} Después de una incubación de 5 minutos con LiCl 10 mM, las
células se activaron con PHA durante 60 minutos. Se aislaron los IP
solubles en agua (IP1, cuadrante superior; IP2 cuadrante intermedio
e IP3, cuadrante inferior) y se cuantificaron como se describe en el
Ejemplo 2. Los datos son de uno de tres experimentos similares.
Figura 8. Efecto de T_{2} en la generación de
DAG y secreción de IL-2 por células T estimuladas
con PHA. Se ensayaron DAG e IL-2 como se describe en
el Ejemplo 2. Los datos representan la media de determinación
duplicada de tres experimentos similares.
Figura 9A y Figura 9B. Efecto de T_{2} sobre la
traslocación de PKC. Se ensayó la actividad PKC en fracciones tanto
citoplásmicas como de membrana como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 10 resume la evaluación de mejoras
sintomáticas en pacientes de artritis reumatoide como resultado del
tratamiento con una mezcla de Tripterygium wilfordii Hook
F.
La Figura 11 muestra esquemáticamente la
estructura de triptolida (1) y tripdiolida (2).
La Figura 12 muestra esquemáticamente la
estructura de triptonida.
La Figura 13 describe esquemáticamente la
estructura de wilfortrina (1) y éster metílico de wilfortrina
(2).
La Figura 14 muestra la estructura de
triptofenolida (1) y éster metílico de triptofenolida (2).
La Figura 15 muestra esquemáticamente la
estructura de triptonoterpenol.
La Figura 16 muestra esquemáticamente la
estructura de wilformina.
La Figura 17 resume el procedimiento de
extracción para la preparación de triptolida.
La Figura 18 representa la estructura de
wilforonida
(nafto-[1,2-c]furan-3,7(1H,5H)-diona,
4,5a,6,8,9,9a-hexahidro-5a-metil-(5aR-trans)-[104331-87-5]).
La Figura 19A y Figura 19B muestran el perfil de
elución de la Fracción 924.
La Figura 20A, Figura 20B, Figura 20C y Figura
20D muestran la función de la Fracción 924; 22A muestra el efecto de
la Fracción 924 sobre la producción de IL-2; 22B, el
efecto sobre la expresión de IL-2; 22C, el efecto
sobre la proliferación de células T; y 22D, el efecto sobre la
viabilidad celular.
La Figura 21 muestra una comparación de los
diterpenos en los extractos de acetato de etilo de Tripterygium
wilfordii Hook F preparado en China (CEA) y Texas (TEA). Los
diterpenos de cada preparación de T. wilfordii Hook F (CEA y TEA) se
visualizaron por la reacción de Kedde. Triptolida (3,6 \mug),
triptofenolida (10 \mug) y tripdiolida (1,8 \mug) sirvieron como
patrones de referencia. Las concentraciones relativas de
triptofenolida, triptolida y tripdiolida de los extractos CEA y TEA
se ven en esta figura.
Figura 22. TwHF inhibe la unión de dexametasona
al receptor de glucocorticoides de fibroblastos de piel humana
(GR).
Figura 23. TwHF inhibe la activación de un gen
diana mediada por GR. El gen diana fue el gen de la luciferasa bajo
el control regulador de elementos inducibles por glucocorticoides en
la repetición larga terminal MMTV.
Figura 24. Curvas de respuesta a dosis del efecto
de TwHF sobre la unión de ligando GR y activación del gen diana. Los
datos de la Figura 20 y 21 se volvieron a trazar juntos como % de
unión máxima o actividad como función del log de la concentración de
TwHF.
Figura 25 A, Figura 25B y Figura 25C. El extracto
de TwHF y componentes purificados inhiben el crecimiento dependiente
de dexametasona de células IDH4 de un modo dependiente de la
concentración. La proliferación de células IDH4 se evaluó por
incorporación de [^{3}H]-timidina después de un
cultivo de 72 horas. (La n es en 10^{n} es la abscisa del gráfico,
es decir, 1, 2, 3, 4, ó 5; lo que indica concentración
nanomolar).
-\square- Dex 1.000 nM
-\blacklozenge- Dex 100 nM
-\blacksquare- Dex 10 nM
-\lozenge- Dex 1 nM
Figura 26. RIA de cortisol con un nuevo
anticuerpo anti-cortisol dirigido al anillo A
detecta la inmunorreactividad en el extracto de TwHF. Los datos se
expresan como la fracción de indicador de cortisol radiactivo unido
al anticuerpo (B/B_{o}) como función de cortisol añadido o TwHF.
La curva de desplazamiento de TwHF no es paralela a la del cortisol
auténtico, pero puede existir algo de reactividad cruzada.
Figura 27. Curvas de respuesta a dosis para el
efecto del compuesto A de TwHF sobre la actividad de unión de
ligando GR (como para la Figura 22) y la activación de un gen diana
mediada por GR (como para la Figura 23). Los datos se muestran como
% de una unión máxima o actividad como función de la concentración
de TwHF (escala log).
Figura 28. RIA de cortisol con un anticuerpo
dirigido al anillo A no logra detectar la inmunorreactividad tipo
cortisol en compuestos A y B purificados de TwHF (triptolida y
tripdiolida, respectivamente). El compuesto C (triptofenolida) puede
tener inmunorreactividad de baja afinidad.
Figura 29 A, Figura 29B, Figura 29C y Figura 29D.
El extracto de TwHF y componentes purificados inhiben la producción
de PGE_{2} inducida por endotoxina por monocitos sanguíneos
periféricos humanos, RU 486 se ensaya en la Figura 29D.
Figura 30. Cromatograma de triptolida y
acetofenona. Picos: 1= acetofenona; 2= triptolida. Condiciones:
columna de acero inoxidable Nova Pack C18 (150 mm x 3,9 mm D.I.);
fase móvil, acetonitrilo-agua (19:81); caudal, 1,5
ml/min; monitor UV a 214 nm; volumen de la muestra 10 \mul.
\newpage
Figura 31. Cromatograma de tripdiolida. Pico: 1=
tripdiolida. Fase móvil acetonitrilo-agua (11:89);
caudal, 2,0 ml/min. Las otras condiciones como en la Figura 30.
Figura 32. Cromatograma del extracto de
Tripterygium wilfordii Hook F con el patrón interno para la
determinación de triptolida. Picos: 1= acetofenona; 2= triptolida.
Condiciones como en la Figura 30.
Figura 33. Cromatograma del extracto de
Tripterygium wilfordii Hook F para la determinación de
tripdiolida. Pico1= tripdiolida. Condiciones como en la Figura
31.
La Figura 34 muestra el efecto del extracto EA
sobre la producción de IL-2 e
IFN-\gamma. Se incubaron células T (1 x 10
^{5}/ml) con PHA (1 \mug/ml) durante 24 horas en presencia o
ausencia de las concentraciones indicadas del extracto EA.
-\square-, IFN-\gamma, -\blacklozenge-,
IL-2.
Figuras 35 A-D. Recuento de
glóbulos blancos (Figura 1A), concentración de nitrito (Figura 1B);
TNF-\alpha (Figura 1C); y PGE2 en exudados de las
bolsas de aire (Figura 1D). El WBC se midió por un contador coulter.
La concentración de nitrito, TNF-\alpha y PGE2 se
determinaron con reactivo de Griess, el ensayo de citotoxicidad L929
murino y el kit de ELISA de PGE2, respectivamente. Los datos se
expresan como media +/- SEM de las determinaciones duplicadas de
cada muestra de cada grupo de animales. Se usó el ensayo t de
Student para ensayar la diferencia entre el grupo tratado con EA
frente al control. *, P<0,05;**, P<0,01;***,P<0,001.
Figura 36. Contenido en PGE2 del Tejido de
Revestimiento de las Bolsas de Aire. Se homogeneizó aproximadamente
1 g del tejido de revestimiento de las bolsas de aire y se
extrajeron con etanol como se describe en "Materiales y
Métodos". El contenido en PGE2 del material extraído se midió con
el kit de ELISA como se describe por el fabricante. Los datos se
expresan como la media +/- SEM de duplicados de cada muestra de cada
grupo de animales. **, P<0,01 frente al grupo de control.
Figuras 37 A-C. Producción de
nitrito (Figura 3A), TNF-\alpha (Figura 3B); PGE2
por las células separadas de los exudados (Figura 3C). Se cultivaron
2 x 10^{6} células exudadas/por pocillo en placas de cultivo de 24
pocillos en ausencia o presencia de IL-1 (5
unidades/ml) y LPS (1 \mug/ml) durante 48 horas. Los sobrenadantes
libres de células se recogieron y se midió la concentración de
nitrito, TNF-\alpha y PGE2 con reactivo de Griess,
kit de citotoxicidad 1.929 y ensayo de PGE2, respectivamente como se
describe en "Materiales y Métodos". Los datos representan la
media +/- SEM de determinaciones duplicadas de cada muestra de cada
grupo de animales. * P<0,05, *** P<0,001 en comparación con el
grupo de control.
Figuras 38 A-C. Producción de
nitrito (Figura 4A) TNF-\alpha (Figura 4B); PGE2
por células del bazo (Figura 4C). Se cultivaron 1 x 10^{6} células
de bazo/pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos en ausencia o
presencia de IL-1 (5 unidades/ml) y LPS (1mg/ml)
durante 24 o 48 horas. Los sobrenadantes libres de células se
recogieron y se ensayaron para la producción de nitrito,
TNF-\alpha y PGE2 con reactivo de Griess, kit de
citotoxicidad L929 y de ELISA de PGE2, respectivamente como se
describe "Materiales y Métodos". Sólo se midió PGE2 en las
muestras de cultivo de 24 horas. Los resultados representan la media
\pm SEM de las determinaciones duplicadas de cada muestra para
cada grupo de animales. *, P<0,05 en comparación con el grupo de
control.
Figuras 39A-B. Contenido del
estómago (Figura 5A), contenido del riñón (Figura 5B). Se prepararon
las cantidades apropiadas de tejido de estómago y renal de ratas
F344 para el ensayo del contenido en PGE2 con el kit de ELISA de
PGE2 como se describe en "Materiales y Métodos". Los datos se
expresan como media \pm SEM de determinaciones duplicadas de cada
muestra de cada grupo. Se uso el ensayo t de Student para ensayar la
diferencia entre el grupo tratado con EA y el de control. *,
P<0,05; ****, P<0,0001.
La presente invención describe el uso de
extractos de Tripterygium wilfordii Hook F, y componentes de
los mismos, para inhibir procesos inflamatorios y trastornos inmunes
junto con la inducción de la inhibición mediada por el receptor de
glucocorticoides de la expresión de genes
pro-inflamatorios. La inhibición de la activación de
estos genes pro-inflamatorios y potenciadotes
inmunes proporciona un tratamiento de la inflamación o un trastorno
inmune. La demostración adicional de que estos componentes de TwHF
carecen de efectos agonistas esteroides indica que este método
puede, por lo tanto, usarse para tratar enfermedades autoinmunes,
tales como artritis reumatoide, para suprimir la función inmune y
para suprimir la inflamación sin los efectos no deseables de
esteroides o NSAID que están en uso actual.
También se proporcionan métodos para la unión al
receptor de glucocorticoides, demostrando que el acoplamiento de
glucocorticoides al receptor de glucocorticoides se inhibe en
presencia de la preparación de TwHF. Se proporciona, por tanto, una
alternativa al uso de terapéuticos que contienen esteroides en el
tratamiento de inflamación y otros trastornos, evitando el uso de
TwHF los diversos efectos secundarios relacionados con esteroides
asociados a esos agentes, así como evitando la irritación gástrica
asociada con NSAID. También se proporcionan agentes terapéuticos
para el tratamiento y prevención de la inflamación que son NSAID y
libres de esteroides, conteniendo estas preparaciones como
ingrediente activo una cantidad farmacéuticamente eficaz de un
extracto de TwHF. Como el extracto de TwHF proporciona actividad
inflamatoria, pueden reducirse las cantidades de otros agentes tales
como NSAID o un esteroide a cantidades mejor toleradas por el
paciente proporcionando una función medicinal alternativa, es decir,
tal como la función de reducción de la fiebre o de alivio del dolor
de NSAID.
El extracto de TwHF inhibe la inducción de
ciclooxigenasa-2 (COX-2) pero no
tiene efecto directo sobre ciclooxigenasa-1
(COX-1) y probablemente no tiene efecto directo
sobre la actividad enzimática de ninguno. Por lo tanto, se describe
el bloqueo de la inflamación bloqueando la inducción de
COX-2, dejando COX-1 intacto y
provocando de este modo ninguno de los efectos secundarios de NSAID
que están relaciones con la inhibición de COX-1.
Se preparo T_{2} por extracción con
cloroformo-metanol y
cloroformo-etanol de raíces de Tripterygium
wilfordii Hook F, habiendo retirado la piel de las raíces antes
de procesar la raíz. Como ejemplo adicional, la preparación se
prepara por extracción con acetato de etilo (Ejemplo 5).
El Ejemplo 1 se refiere a estudios del efecto de
la preparación de Tripterygium wilfordii Hook F sobre la
función de linfocitos humanos. La producción de
interleuquina-2 por células T se inhibe por el
extracto de TwHF inhibiendo la transcripción génica, mientras que la
expresión de receptores de IL-2 no se ve afectada.
También se muestra que la preparación de Tripterygium
wilfordii Hook F suprime la proliferación de células B y la
producción de inmunoglobulinas por células B. Los estudios descritos
en el Ejemplo 2 indican que las vías de señalización no se ven
afectadas por la preparación de Tripterygium wilfordii Hook
F, demostrando la naturaleza selectiva de la actividad inhibidora
del agente. El Ejemplo 3 se refiere a estudios del efecto de la
preparación de T. wilfordii en el tratamiento de pacientes
con artritis reumatoide. El Ejemplo 4 describe los componentes de la
preparación T_{2} de Tripterygium wilfordii Hook F y la
toxicidad de los mismos. El Ejemplo 5 describe la preparación de
T. wilfordii Hook F obtenida por extracción con acetato de
etilo, mientras que el Ejemplo 6 demuestra la actividad in
cellulo (efectos de células intactas) del extracto de acetato
de etilo.
El Ejemplo 7 proporciona estudios in vivo
con el extracto de acetato de etilo de T. wilfordii. El
Ejemplo 8 proporciona un estudio de toxicidad comparativo de
diversas preparaciones de T. wilfordii. El Ejemplo 9 describe
una técnica que puede usarse para determinar el programa de dosis
del extracto de acetato de etilo para su uso in vivo. El
Ejemplo 10 describe la caracterización e identificación de una
fracción "924" (wilforonida) del extracto de acetato de etilo y
el Ejemplo 11 describe efectos inmunosupresores de wilforonida. El
Ejemplo 12 proporciona estudios que muestran la inhibición de la
trascripción del gen de IL-2 y la inhibición de la
producción de interferón \gamma por el extracto T2. El Ejemplo 13
demuestra la inhibición de la activación mediada por el receptor de
glucocorticoides de la trascripción génica junto con una ausencia de
actividad agonista GR intrínseca. El significado de estos resultados
es que la inflamación puede tratarse en un sujeto usando T2 sin
esteroides, evitando de este modo los efectos agonistas no deseados
asociados a los esteroides. El Ejemplo 14 proporciona estudios de
las propiedades anti-inflamatorias del extracto
TwHF. Se proporciona un nuevo método para separar y cuantificar
triptolida y tripdiolida en el Ejemplo 15 y el Ejemplo 16 describe
el efecto del extracto TwHF sobre el metabolismo de progesterona,
poniendo de relieve la utilidad de la presente invención para la
reducción de progesterona, y las diversas condiciones fisiológicas
que están relacionadas con la progesterona (es decir, embarazo). El
Ejemplo 17 proporciona preparaciones terapéuticas del extracto de
TwHF. El Ejemplo 18 proporciona métodos para explorar agentes que
tienen actividad de unión a GR y un efecto moderador de esteroides.
El Ejemplo 19 se refiere al tratamiento de artritis reumatoide (RA)
con un extracto de Tripterygium wilfordii Hook F. El Ejemplo
20 se refiere a la preparación de una composición de Tripterygium
wilfordii Hook F. El Ejemplo 21 se refiere a la preparación de
Tripterygium wilfordii Hook F y la inflamación articular. El
Ejemplo 22 se refiere al hecho de que el tratamiento con un extracto
de acetato de etilo de Tripterygium wilfordii Hook F mejora
la inflamación articular en ratas transgénicas HLA B27.
Este ejemplo describe el efecto de la preparación
de T. wilfordii, T_{2}, sobre la sensibilidad inmune in
vitro de células mononucleares sanguíneas periféricas humanas
(PBMC) obtenidas de individuos normales. Se descubrió que la
preparación ejercía un perfil dependiente de la concentración de la
actividad supresora tanto en funciones de células T como de células
B, mientras que las actividades funcionales de los monocitos eran
más resistentes a los efectos supresores de esta preparación de
T. wilfordii con cloroformo/metanol.
Preparación celular. Se obtuvieron PBMC de
la sangre de adultos sanos por centrifugación en gradientes de
diatrizoato sódico/Ficoll (Sigma, St. Louis, MO). Se aislaron los
monocitos de PBMC por centrifugación en
Sepra-cell-MN (Sepratech, Oklahoma
City, OK) o por adherencia al vidrio. Los monocitos obtenidos de los
dos procedimientos se usaron para examinar la producción de
interleuquina-1 (IL-1) y
presentación de antígeno, respectivamente. Para la purificación de
células T y células B, se incubaron PBMC con metil éster HCl de
L-leucina (Sigma) durante 45 minutos a temperatura
ambiente para eliminar los monocitos y las células natural
killer^{51}. Los linfocitos resultantes se dispusieron en
rosetones con glóbulos rojos de oveja tratados con neuraminidasa
(SRBC) y después se separaron por centrifugación en
Ficoll/diatrizoato^{52}. Las células T se purificaron
adicionalmente por pases de la población positiva a rosetones en una
columna de nylon-lana para retirar las células B
residuales y los monocitos^{53}. Las células B se prepararon a
partir de la población inicial de células negativas a rosetones
retirando cualquier célula restante que formara rosetones con SRBC
tratadas con neuraminidasa.
La tinción con anticuerpos monoclonales (Mab)
para CD3 y CD20 y el análisis con el clasificador de células
activadas por fluorescencia (FACS) indicaron que las poblaciones de
células T y células B eran más del 96% y el 90% puras,
respectivamente. Las células T se incubaron con mitomicina c (0,1
mg/ml) durante 45 minutos y después se lavaron
minuciosamente^{54}.
Reactivos. La preparación de T.
wilfordii, T_{2} usada en estos estudios era un extracto de
cloroformo/metanol preparado a partir de la parte leñosa de las
raíces de TWH obtenido de Taizhou Pharmaceutical Company (Taizhou,
Jiang Su, República Popular China). Esta preparación, T_{2},
contenía más de 8 compuestos diferentes incluyendo glucósidos,
diterpenoides, alcaloides, y cetonas. Antes de su uso, el extracto
se disolvió en DMSO y se disolvió adicionalmente con medio de
cultivo. Se usaron fitohemaglutinina (PHA; Wellcome Reagents,
Research Triangle Park, NC), forbol dibutirato (PDB; Sigma),
ionomicina (Calbiochem, San Diego, CA), y el MAb
anti-CD3, 64.1, para la activación de células
T^{55}. Se purificó Mab 64.1 como se ha descrito previamente
[Hansen et al., "T cell protocol", Leucocyte
Typing. Editado por Bernard, et al. Berlín,
Springer-Verlag, 1982]. Se usó
interleuquina-2 recombinante humana
(rIL-2; Cetus, Emeryville, CA) y/o Staphylococcus
aureus tratado con formalina (SA; Calbiochem) para la
activación de células B. Se obtuvo el MAb frente a la cadena
\alpha del receptor de IL-2
(IL-2R), anti-Tac, del Dr. Thomas
Waldmann (NM, Bethesda, MD) y se usó para analizar la expresión de
IL-2R. Se adquirió interleuquina-1
(Cistron Technology, Pine Brook, NJ) para la normalización del
ensayo de IL-1. Se adquirieron anticuerpos de cabra
anti-IgA, IgG y IgM humanos purificados por afinidad
y anticuerpos similares conjugados a peroxidasa de rábano rusticano
de Tago (Burlingame, CA). Se adquirieron estreptoquinasa (SK), y
toxoide del tétanos (TT) de Hoeschst-Roussel
(Somerville, NJ) y MCDC Biologics (Jamaica Plain, MA),
respectivamente.
Cultivo celular y ensayo de síntesis de ADN de
linfocitos. Se cultivaron células T (1 x 10^{5}/pocillo) o
células B (5 x 10^{4}/pocillo)solas o células B con células
T tratadas con mitomicina c (1 x 10^{5}/pocillo) en medio RPMI
1640 (Hazleton Biologics, Lenexa, KS) suplementado con suero de
ternera fetal al 10%, penicilina G (200 unidades/ml), gentamicina
(10 \mug/ml), y L-glutamina (0,3 mg/ml) en placas
de microtitulación de 96 pocillos en un volumen total de 200 \mul,
con o sin los estímulos indicados, y en presencia o ausencia de
diversas concentraciones de T_{2}. La concentración final de DMSO
en los cultivos fue del 0,02-0,002%. Esta
concentración de DMSO no tuvo efecto en ninguna de las respuestas
analizadas.
Tanto para la activación de células T como de
células B, se uso estimulación anti-CD3 inmovilizada
(MAb 64.1). Este MAb se inmovilizó incubando 30 \mul (5 \mug/ml)
en cada pocillo durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. El
exceso de anticuerpos solubles se retiró antes del cultivo celular
(Hansen, supra). Las células se cultivaron durante la
duración indicada, y después se pulsaron con 1 \muCi de
^{3}H-timidina (^{3}H-TdR; New
England Nuclear, Boston, Ma) durante las últimas 12 y 18 horas para
los cultivos de células T y células B, respectivamente. La captación
de ^{3}H-TdR se midió en un contador de gente en
un líquido. Todos los datos se expresan como los recuentos medios
por minuto de 3 determinaciones replicadas^{56}.
Ensayo de producción de IL1. Se
suspendieron monocitos (1 x 10^{5}/pocillo) en medio RPMI 1640 con
suero humano normal al 1% (NHS) y se cultivaron con o sin
lipopolisacárido (10 \mug/ml) en presencia o ausencia de diversas
concentraciones de T_{2} durante 24 horas. Los sobrenadantes del
cultivo se recogieron y se ensayaron diluciones en serie para
IL-1 usando timocitos murinos C3H/HeJ como se
describe en otra parte^{57}. Las concentraciones de T_{2}
contenidas en las diluciones de los sobrenadantes no tuvieron efecto
en la síntesis de ADN por timocitos C3H/HeJ.
Ensayo de producción de
IL-2. Se incubaron células T (1 x
10^{5}/pocillo) con o sin PHA (1 \mug/ml) o
anti-C3 inmovilizado en presencia o ausencia de
diversas concentraciones de T_{2} durante 24 horas. Los
sobrenadantes libres de células se recogieron, se hicieron
diluciones en serie, y se ensayó el contenido en
IL-2 con células CTLL-2 como se ha
descrito previamente^{58}.
Expresión de IL-2R. Se
cultivaron células T con o sin los estímulos indicados en presencia
o ausencia de diversas concentraciones de T_{2} durante 36 horas.
Después del lavado, las células se tiñeron con concentraciones de
saturación de MAb anti-Tac o una de control de IgG
de ratón, seguido de anticuerpo de cabra anti-Ig de
ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína
(Cap-pel, West Chester, PA). Las muestras se fijaron
con paraformaldehído al 1% y se analizaron con un citómetro de flujo
FACSTAR (Becton Dickinsonc, Mountain View, CA), usando un programa
estadístico de histograma único (Davis, supra).
Medida de síntesis de Ig. La cantidad de
IgG, IgA e IgM en los sobrenadantes del cultivo de células B
estimuladas con SA más rlL-2 en presencia o ausencia
de T_{2} durante 7 días se determinó usando un método de ensayo
inmunoabsorbente de enzimas unidas específico de isotipo. La
cuantificación de la Ig en los sobrenadantes después se determinó
por comparación con una curva patrón. La sensibilidad del ensayo es
15 ng/ml para IgA e IgG, y 30 ng/ml para
IgM ^{59}.
IgM ^{59}.
Efecto de T_{2} sobre la sensibilidad de
células T humanas. Estos estudios demuestran que T_{2} provocó
una inhibición dependiente de la concentración de la incorporación
de ^{3}H-timidina inducida por PHA por linfocitos
T humanos purificados (Figura 1). Se observó una inhibición del
cincuenta por ciento a concentraciones de aproximadamente 02 \mug
por ml. El análisis del ciclo celular indicó que T_{2} evitaba que
las células progresaran a través de la fase G1 del ciclo celular
(Figuras 2 A-2L). La producción de
IL-2 inducida por mitógeno por células T purificadas
también se inhibió por una concentración similar de T_{2} (Figura
3). La expresión inducida por mitógeno de receptores de
IL-2 no se inhibió por T_{2} (Tabla 1) lo que
indica que no fue tóxica a esta actividad celular. Estos resultados
sugirieron que la disminución en la proliferación podría ser el
resultado de la inhibición de la producción de
IL-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Efecto de T_{2} sobre la expresión del receptor de interleuquina-2 (IL-2)* | ||||
NiI | PHA | |||
T_{2} | % positivo | Intensidad de fluorescencia | % positivo | Intensidad de fluorescencia |
0 \mug/ml | 10 \pm 2 | 483 \pm 18 | 65 \pm 17 | 561 \pm 166 |
0,65 \mug/ml | - | - | 60 \pm 22 | 519 \pm 109 |
1,25 \mug/ml | 9 \pm 2 | 504 \pm 29 | 61 \pm 20 | 525 \pm 128 |
2,50 \mug/ml | - | - | - | - |
* \begin{minipage}[t]{150mm} Se cultivaron células T (1 x 10^{5}/pocillo) con medio o fitohemaglutinina (PHA) en presencia o ausencia de diversas concentraciones de T_{2} como se indica para 36 horas. Las células se recogieron, se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-Tac seguido de IgG de cabra anti-ratón conjugada con isotiocianato de fluoresceína, y se analizaron por citometría de flujo. Los valores son la media \pm SEM de 6 experimentos.\end{minipage} | ||||
Para examinar la producción de
IL-2, se realizaron experimentos en los que se
examinó el efecto de T_{2} sobre la proliferación en presencia de
IL-2 suplementaria. Como puede verse en la Figura 4,
gran parte del efecto inhibidor de T_{2} se superó por
IL-2 suplementaria. Se estudió el efecto de T_{2}
en los niveles en estado estacionario del ARNm de
IL-2 en células T estimuladas con mitógeno. Se
cultivaron células T (1 x 10^{6}/ml) con y sin PHA en presencia o
ausencia de T_{2} (1 \mug/ml). Después de una incubación de 4
horas, se aisló el ARN total y se determinaron los niveles del ARNm
de IL-2 y actina por protección con nucleasa S1. Los
resultados sugirieron que una de las principales acciones de T_{2}
era inhibir la producción de IL-2. Esto pareció
estar provocado por una inhibición de la trascripción del gen de
IL-2 ya que T_{2} inhibía la aparición de ARNm
para IL-2. Estos experimentos confirmaron que una
acción de T_{2} era inhibir la producción de
IL-2.
Se describe en este documento un método para
ensayar la inhibición selectiva de ARNm específico de
IL-2, constando el método de: cultivar células
eucariotas en cultivo de manera separada con y sin extracto T_{2}
de Tripterygium wilfordii Hook F o componentes del mismo en
una cantidad terapéuticamente eficaz para proporcionar una muestra
de ensayo y una muestra de control; medir el nivel de ARNm de
IL-2 y un nivel ARNm de referencia tal como ARNm de
actina para proporcionar una muestra de ARNm de IL-2
de ensayo, y una muestra de ARNm de referencia de ensayo, una
muestra de ARNm de IL-2 de control y una muestra de
ARNm de referencia de control; comparar (nivel de ARNm de
IL-2 de ensayo \divnivel de ARNm de
IL-2 de control) con (nivel de ARNm de referencia de
ensayo
\divnivel de ARNm de referencia de control); y cuando (nivel de ARNm de IL-2 de ensayo \divnivel de ARNm de IL-2 de control) es sustancialmente inferior a 1 y (nivel de ARNm de referencia de ensayo \divnivel de ARNm de referencia de control) es aproximadamente 1, se indica la inhibición selectiva de la producción de ARNm de IL-2 por T_{2.}
\divnivel de ARNm de referencia de control); y cuando (nivel de ARNm de IL-2 de ensayo \divnivel de ARNm de IL-2 de control) es sustancialmente inferior a 1 y (nivel de ARNm de referencia de ensayo \divnivel de ARNm de referencia de control) es aproximadamente 1, se indica la inhibición selectiva de la producción de ARNm de IL-2 por T_{2.}
Se demostraron efectos adicionales de T_{2}
cuando se examinó su acción sobre respuestas de células B humanas.
Como puede verse en la figura 5A y 5B, T_{2} inhibió tanto la
proliferación inducida por mitógeno de células B altamente
purificadas, así como la producción de inmunoglobulinas de un modo
dependiente de la concentración. Estos resultados sugirieron que
T_{2} tenía efectos adicionales más allá de la alteración de la
producción de IL-2. Se demostró alguna especificidad
de la acción de T_{2}, sin embargo, cuando se examinaron sus
efectos sobre varios tipos celulares distintos. Por tanto, T_{2}
no tuvo efecto sobre la producción de IL-1 por
monocitos humanos ni sobre su capacidad de funcionar como células
presentadoras de antígeno. Además, no hubo efectos sobre el
crecimiento de células endoteliales o fibroblastos durante un
cultivo de 48 horas. Ninguno de los efectos inhibidores de T_{2}
podía estar explicado por la toxicidad no específica, ya que
concentraciones inhibidoras ya que las concentraciones inhibidoras
de T_{2} no tuvieron efecto sobre la viabilidad de los linfocitos
restantes o estimulados, células endoteliales, fibroblastos,
monocitos, o leucocitos polimorfonucleados. Estos resultados
mantienen la conexión de que T_{2} tiene un espectro limitado de
actividad inmunosupresora que no puede explicarse por los efectos
tóxicos no específicos. Es de importancia, que la capacidad de
T_{2} de suprimir tanto la producción de IL-2 por
células T, como la proliferación y producción de inmunoglobulinas
por células B puede explicar la acción de este agente en pacientes
con RA.
El mecanismo por el que T_{2} inhibe la
producción de IL-2 se examina con más detalle en el
presente ejemplo. T. wilfordii puede inhibir una vía de
señalización crítica implicada en la inducción de la trascripción
del gen de IL-2. La información actual sugiere que
la ocupación del receptor de células T conduce a la activación de
tirosina quinasas, seguido por la estimulación de fosfolipasa. Esto
provoca la producción de fosfatidil inositol trifosfato y
diacilglicerol, que induce el aumento en al calcio intracelular y la
activación de proteína quinasa C, respectivamente^{60}. Por lo
tanto, se realizaron estudios adicionales para examinar la
posibilidad de que T_{2} pudiera inhibir una de estas vías de
señaliza-
ción.
ción.
Efecto de la preparación de T_{2} sobre la
generación de IP total por células T activadas. Se marcaron
células T frescas (A) o células Jurkat (B) con
[^{3}H]-mio-inositol durante una
noche en ausencia o presencia de las concentraciones indicadas de la
preparación de T. wilfordii obtenidas por extracción con
cloroformo-metanol que se habían obtenido de la
fuente de suministro descrita en el Ejemplo 1. Las células se
lavaron e incubaron con LiCl 10 mn durante 5 minutos, después se
activaron con PHA durante 60 minutos. Las células se extrajeron con
0,75 ml de una mezcla de 1:1 de cloroformo y metanol, seguido por
0,25 ml de cloroformo y 0,25 ml de agua. Las fases se separaron por
centrifugación y las fracciones solubles en agua se aplicaron a una
columna de intercambio iónico con 0,25 ml de Agl-X8
formiato. Se eluyó el inositol fosfato total con 1,5 ml de ácido
fórmico 0,1 M y formiato sódico 1 M. La radiactividad se cuantificó
por recuento de centelleo. También se estimuló una alícuota de cada
población celular con PHA durante 24 horas y los sobrenadantes se
ensayaron para el contenido en IL-2 usando células
CTLL-2.
Efecto de T_{2} sobre la generación de
fracciones IP por células T activadas con PHA. Se marcaron
células Jurkat con
[^{3}H]-mio-inositol durante una
noche en presencia o ausencia de diversas concentraciones de
T_{2}. Después de una incubación de 5 minutos con LiCl 10 mM, las
células se activaron con PHA durante 60 minutos. Se aislaron los IP
solubles en agua y se cuantificaron. Para conseguir esto, los
cultivos se extrajeron con 0,75 ml de una mezcla de 1:1 de
cloroformo/metanol, seguido por 0,25 ml de cloroformo y de agua. Las
fases se separaron por centrifugación y la fracción soluble se
aplicó a una columna de intercambio iónico de 0,25 ml de
Agl-X8 formiato, y se lavó ampliamente con
mio-inositol 5 \muM frío. Se eluyeron
secuencialmente IP1, IP2 e IP3 con 4 ml de formiato amónico 0,2 M
más ácido fórmico 0,1 M, 10 ml de formiato amónico 0,4 M más ácido
fórmico 0,1 M y 10 ml de formiato amónico 1 M más ácido fórmico 0,1
M respectivamente. La radiactividad de las diversas fracciones de
elución se cuantificó por recuento de centelleo.
Efecto de T_{2} en la generación de DAG y
secreción de IL-2 por células T estimuladas con
PHA. Las células T para cada muestra se cultivaron durante una
noche con PHA en presencia o ausencia de las concentraciones
indicadas de T_{2} . Los sedimentos celulares se lisaron con una
mezcla de cloroformo y metanol, y las fracciones se separaron con
NaCl 1 M y cloroformo. La fase orgánica se recogió y se secó en
nitrógeno. La masa de DAG en el extracto orgánico se ensayo
solubilizando los restos lipídicos en una mezcla de
^{32}P-\gamma-ATP y DAG quinasa
y ácido fosfatídico, incubando a 37ºC durante una hora durante lo
cual se convirtió DAG cuantitativamente a ácido
p-fosfatídico. Las muestras se secaron y se
volvieron a disolver en cloroformo. El disolvente se aplicó a un gel
de sílice y se separó por cromatografía en capa fina con
cloroformo/metanol/ácido acético. Después de la visualización con
yodo, la mancha que contenía ácido fosfatídico se recogió y se
determinó la radiactividad por recuento de centelleo líquido.
También se estimuló una alícuota de células con mitógeno y los
sobrenadantes se recogieron después de 24 horas y se evaluaron para
el contenido en IL-2.
Efecto de T_{2} sobre la traslocación de
PKC. Se incubaron células Jurkat (1 x 10^{6}/ml) durante una
noche con o sin T_{2} a las concentraciones indicadas. Las células
se lisaron por sonicación y después se separaron las fracciones
citoplásmica y de membrana por centrifugación. Se ensayó la
actividad PKC tanto en la fracción citoplásmica como de membrana
usando un sistema de ensayo de proteína quinasa C (Amersham) que
empleó un péptido sintético como aceptor de fosfato en presencia de
fosfatidilserina, calcio y PMA.
Efecto de T_{2} sobre la fosforilación de
tirosina de proteínas. Se incubaron células Jurckat (3 x
10^{6}) durante una noche en ausencia o presencia de las
concentraciones indicadas de T_{2}. Las células se lavaron y
estimularon con pH a durante 30 minutos. Después de la
centrifugación, las células sedimentadas se solubilizaron con tampón
de muestra 1 x SDS que contenía inhibidores de proteasa. Los lisados
se centrifugaron a 10.000 rpm durante 15 minutos. Los sobrenadantes
se analizaron para la fosforilación de proteínas por transferencia
de western usando un anticuerpo monoclonal de ratones (Upstate
Biotechnology, Inc.) frente a fosfotirosina.
El efecto de T_{2} sobre la producción
inducida por mitógeno de metabolitos de fosfatidil inositol.
Como puede verse en la Figura 6A-6B, la estimulación
mitogénica conduce a la producción de IL2 y metabolitos de
fosfatidil inositol. Mientras que se inhibió la producción de
IL-2, no se inhibió la generación de metabolitos de
fosfatidil inositol. Se vieron resultados similares en células T
frescas y en la línea de células T leucémicas Jurkat. Estudios
adicionales examinaron si T_{2} inhibe específicamente la
generación de IP3, que se cree que induce aumentos en el calcio
intracelular^{52}. Como puede verse en la Figura
7A-7C, T_{2} no tuvo efecto sobre la generación
de IP3 u otros metabolitos PI específicos por células T activadas
por mitógeno. Experimentos similares examinaron el efecto de T_{2}
sobre la generación de diacilglicerol. Como puede verse en la Figura
8, T_{2} inhibía la producción de IL-2 de células
T estimuladas con mitógeno, pero no tuvo efecto sobre la producción
de DAG. Adicionalmente en los estudios de la invención, no
mostrados, se examino la actividad de T_{2} sobre la actividad
fosfolipasa C aislada de T frescas o células Jurkat. Otra vez no se
observó actividad inhibidora. Estos experimentos sugirieron que la
acción de T_{2} no puede explicarse por un efecto sobre estas
vías de señalización tempranas. A estos niveles de adición de
extracto de T_{2}, no se establece toxicidad a otras funciones
celulares como se indica por estos ensayos celulares.
El efecto de T_{2} sobre la activación de
proteína quinasa C. Como puede verse en la Figura
9A-9B, la estimulación con mitógeno condujo a la
traslocación de PKC en células Jurkat, y T_{2} no provoca la
traslocación de PKC. Finalmente, se exploró el efecto de T_{2}
sobre la actividad de la actividad proteína tirosina quinasa. La
estimulación mitogénica de células T conduce a la fosforilación de
varias especies proteicas identificadas con un anticuerpo específico
para fosfotirosina. Sin embargo, T_{2} no inhibió la actividad de
proteína tirosina quinasa ya que se observaron las mismas bandas
independientemente de la presencia de T_{2} durante la
estimulación mitogénica. Estos experimentos demuestran de forma
convincente que T_{2} no tiene efecto sobre las vías de
señalización tempranas implicadas en la inducción de la trascripción
del gen de IL-2.
En un ensayo abierto, se descubrió que una mezcla
de compuestos (T_{2}) extraídos de Tripterygium wilfordii
Hook F era eficaz en el tratamiento de artritis reumatoide.
Para confirmar los resultados previos obtenidos
de estos estudios abiertos, se diseñó y realizó un estudio de cruce
doble ciego controlado posible.
El plan de tratamiento se diseño del siguiente
modo:
Setenta pacientes con artritis reumatoide de
aparición en adultos clásica o evidente que tenían enfermedad activa
durante más de 6 meses se aceptaron en el ensayo y se asignaron
aleatoriamente a 2 grupos de tratamiento. Los pacientes en el Grupo
A recibieron T_{2} durante un primer transcurso de tratamiento de
12 semanas, y después se cambiaron posteriormente a placebo durante
un segundo transcurso de tratamiento de 4 semanas de duración. Los
pacientes del Grupo B recibieron placebo durante el primer
transcurso y después se cruzaron y recibieron terapia con T_{2}
durante el segundo transcurso. Se tomó T_{2} en una dosificación
de 60 mg al día. Los comprimidos de placebo eran idénticos en
apariencia a los comprimidos de T_{2}. La Tabla 2 muestra el
programa del plan de tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Plan de tratamiento (transcurso total: 16 semanas) | ||
Primer transcurso del tratamiento | Segundo transcurso del tratamiento | |
(12 semanas) | (4 semanas) | |
Grupo A | T_{2}, 20 mg t.i.d. | Placebo |
Grupo B | Placebo | T_{2}, 20 mg t.i.d. |
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los pacientes se evaluaron en una clínica
de artritis cada 4 semanas. La evaluación clínica, evaluación global
por los médicos y distribución de fármacos se realizó por doctores
individuales de un modo ciego. Las evaluaciones de laboratorio se
hicieron por técnicos de un laboratorio hospitalario central, que
también estaban ciegos a los detalles del ensayo.
Características clínicas de los pacientes que acceden al ensayo | ||||
Primer Transcurso de | Segundo Transcurso de | |||
Tratamiento | Tratamiento | |||
Grupo A | Grupo B | Grupo A | Grupo B | |
T_{2} | Placebo | Placebo | T_{2} | |
Número de pacientes | 35 | 35 | 27 | 31 |
Hombre/Mujer | 3/32 | 4/31 | 1/26 | 4/27 |
Edad media, años | 46,3 | 48,0 | 46,2 | 47,7 |
Duración media de la enfermedad (años) | 5,9 | 6,1 | 5,8 | 6,0 |
Etapa de la Enfermedad | ||||
\hskip0,6cm (1) | 6 | 6 | 4 | 5 |
\hskip0,6cm (2) | 14 | 16 | 11 | 13 |
\hskip0,6cm (3) | 12 | 10 | 10 | 9 |
\hskip0,6cm (4) | 3 | 3 | 2 | 4 |
Las características clínicas de los pacientes que
entran en el ensayo se muestran en la Tabla 3. Los análisis
estadísticos demostraron que en el inicio del ensayo, el Grupo A y
el Grupo B no diferían entre sí de manera significativa en edad,
sexo, duración de la enfermedad o fase de la enfermedad.
Resultados de un ensayo controlado de T_{2} en artritis reumatoide | |||
Grupo | Nº que Comienza | Nº de Pacientes que Completan el Tratamiento | |
el Tratamiento | Primer Transcurso | Segundo Transcurso | |
(12 semanas) | (4 semanas) | ||
A (T_{2} -> Placebo) | 35 | 27 | 24 |
B (Placebo -> T_{2}) | 35 | 31 | 25 |
Como se muestra en la Tabla 4, 27 pacientes del
Grupo A completaron el primer transcurso de tratamiento, de los que
24 completaron el segundo transcurso. Del grupo B 31 y 25
completaron el primer transcurso y el segundo transcurso de
tratamiento, respectivamente.
La Tabla 5 indica las razones de la retirada de
los pacientes del estudio. Tres pacientes del Grupo B pero ninguno
del Grupo A se retiraron del ensayo por el empeoramiento de la
enfermedad durante el primer transcurso de tratamiento, mientras que
4 pacientes del Grupo A pero ninguno del Grupo B se retiraron del
ensayo a causa de efectos secundarios.
Razones para la retirada del estudio | ||||||||
Primer Transcurso del Tratamiento | Segundo Transcurso del Tratamiento | |||||||
Grupo A T_{2} | Grupo B Placebo | Grupo A Placebo | Grupo B T_{2} | |||||
(n=35) | (n=35) | (n=27) | (n=31) | |||||
Nº | % | Nº | % | Nº | % | Nº | % | |
Pérdida de seguimiento | 4 | 11 | 1 | 3 | 3 | 11 | 6 | 19 |
Empeoramiento de la | 0 | 0 | 3 | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 |
enfermedad | ||||||||
Efectos secundarios | 4 | 11 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
La Tabla 6 muestra los efectos terapéuticos del
primer transcurso de tratamiento. En comparación con los pacientes
del Grupo B, los pacientes del Grupo A mostraron una mejora
significativa en todas las evaluaciones clínicas incluyendo
agarrotamiento matutino, valor de dolor articular, número de
articulaciones hinchadas, fuerza de agarre y tiempo para caminar 15
metros.
\vskip1.000000\baselineskip
Cambios en los parámetros clínicos en pacientes que completan el primer transcurso del tratamiento | ||||
Grupo A T_{2} | Grupo B Placebo | *p | ||
n=27) | (n=31) | |||
Agarrotamiento | Antes | 2,4 \pm 0,4 | 1,1 \pm 0,2 | |
matutino | Después | 0,9 \pm 0,2 | 2,3 \pm 1,4 | 0,01 |
Valor del dolor | Antes | 25,1 \pm 1,9 | 25,5 \pm 1,7 | |
articular | Después | 7,9 \pm 1,3 | 21,9 \pm 2,1 | 0,001 |
Número de | Antes | 9,2 \pm 0,9 | 7,8 \pm 0,7 | |
articulaciones | Después | 4,3 \pm 0,6 | 7,4 \pm 1,1 | 0,01 |
hinchadas | ||||
Fuerza de agarre | Antes | 49,0 \pm 0,4 | 73,6 \pm 7,7 | |
(media de ambos | Después | 84,4 \pm 7,5 | 81,2 \pm 8,9 | 0,05 |
lados, mm Hg) | ||||
Tiempo para caminar | Antes | 36,6 \pm 6,6 | 37,0 \pm 2,4 | |
15 metros (s) | Después | 21,6 \pm 1,5 | 31,9 \pm 3,6 | 0,05 |
\vskip1.000000\baselineskip
La mayoría de la mejora digna de atención se
observó en el valor de dolor articular, que mejoró de una media de
25,1 antes de la entrada a una media de 7,9 después del primer
transcurso de tratamiento con T_{2.} Por el contrario, no hubo
cambios significativos en este valor en los pacientes del Grupo B
tratados con placebo.
Como se muestra en la Tabla 7, el tratamiento con
T_{2} también provocó mejora en los equivalentes de laboratorio en
la actividad de la enfermedad. Se observaron mejoras significativas
en los niveles de ESR, CRP e inmunoglobulina. Las cambios fueron
significativos al nivel p 0,001 cuando se comparan entre el Grupo A
y el Grupo B.
\vskip1.000000\baselineskip
Cambios en los parámetros de laboratorio en pacientes que completan el primer transcurso del tratamiento | ||||
Grupo A T_{2} | Grupo B Placebo | *P | ||
(n=27) | (n=31) | |||
ESR (mm/hora) | Antes | 69,2 \pm 6,4 | 63,9 \pm 5,2 | |
Después | 41,0 \pm 5,9 | 67,2 \pm 6,6 | < 0,001 | |
CRP (u/ml) | Antes | 29,4 \pm 5,7 | 31,6 \pm 4,1 | |
Después | 10,4 \pm 3,9 | 43,7 \pm 7,0 | < 0,001 | |
RF (títulos) | Antes | 87,1 \pm 23,2 | 86,1 \pm 35,5 | |
Después | 48,0 \pm 13,4 | 63,4 \pm 10,9 | NS | |
IgG (u/ml) | Antes | 227,5 \pm 4,6 | 231,9 \pm 14,2 | |
Después | 117,4 \pm 9,5 | 180,4 \pm 29,8 | < 0,001 | |
IgM (u/ml) | Antes | 302,8 \pm 40,3 | 284,5 \pm 32,2 | |
Después | 105,2 \pm 11,1 | 261,3 \pm 29,3 | < 0,001 | |
IgA (u/ml) | Antes | 289,6 \pm 29,4 | 257,6 \pm 25,2 | |
Después | 149,0 \pm 15,5 | 280,4 \pm 29,8 | < 0,001 | |
* Grupo A frente a Grupo B |
\newpage
Hubo mayor tendencia a disminuir el título RF en
pacientes tratados con T_{2} pero la diferencia entre los dos
grupos después del primer transcurso de tratamiento no fue
estadísticamente significativa.
Durante el segundo transcurso de terapia, los
pacientes que habían recibido placebo inicialmente mejoraron de
manera significativa después de 4 semanas de terapia con T_{2}.
(Véase la Tabla 8). Se observaron mejoras significativas en el valor
de dolor articular, cantidad de articulaciones hinchadas y fuerza de
agarre. También se observó la mejora en el agarrotamiento matutino y
el tiempo para caminar 15 metros, pero estos cambios no consiguieron
significancia estadística. Los pacientes que habían recibido T_{2}
durante las primeras 12 semanas de terapia continuaron manteniendo
la mejora incluso después de 4 semanas de terapia con placebo
durante el segundo transcurso.
\vskip1.000000\baselineskip
Cambios en los parámetros clínicos en pacientes que completan el segundo transcurso de tratamiento | |||||
Grupo A T_{2} | *p | Grupo B Placebo | *p | ||
(n = 27) | (n = 31) | ||||
Agarrotamiento | Antes | 1,8 \pm 0,2 | 2,5 \pm 1,7 | NS | |
matutino (horas) | Después | 0,8 \pm 0,2 | NS | 1,3 \pm 0,9 | |
Valor de dolor | Antes | 7,9 \pm 1,4 | 22,2 \pm 2,4 | ||
articular | Después | 11,0 \pm 2,6 | NS | 13,5 \pm 2,0 | <0,001 |
Número de | Antes | 4,2 \pm 0,8 | NS | 7,0 \pm 1,2 | |
articulaciones | Después | 4,4 \pm 0,9 | 3,5 \pm 0,5 | <0,05 | |
hinchadas | |||||
Fuerza de agarre | Antes | 87,5 \pm 8,0 | <0,05 | 80,1 \pm 9,2 | |
(media de ambos | Después | 70,2 \pm 9,5 | 97,1 \pm 13,2 | 0,05 | |
lados, mm de Hg) | |||||
Tiempo para | Antes | 20,3 \pm 1,7 | NS | 31,5 \pm 5,9 | |
caminar 15 metros | Después | 17,1 \pm 0,6 | 18,9 \pm 2,3 | NS | |
(segundos) | |||||
* Después frente a antes del tratamiento |
\vskip1.000000\baselineskip
Aparte de la fuerza de agarre, no se observaron
cambios significativos en las evaluaciones clínicas en pacientes del
Grupo A después de 4 semanas de tratamiento con placebo.
Como se muestra en la Tabla 9, se observaron
disminuciones significativas en ESR y título RF en pacientes del
Grupo B después del segundo transcurso de tratamiento. No se observó
empeoramiento significativo en los parámetros de laboratorio en
pacientes del Grupo A después de 4 semanas de terapia con
placebo.
\vskip1.000000\baselineskip
Cambios en los parámetros de laboratorio en pacientes que completan el segundo transcurso de tratamiento | |||||
Grupo A T_{2} | *p | Grupo B Placebo | *p | ||
(n = 24) | (n = 25) | ||||
ESR (mm/hora) | Antes | 42,3 \pm 6,0 | 68,5 \pm 6,9 | <0,001 | |
Después | 31,7 \pm 7,3 | NS | 22,0 \pm 4,9 | ||
RF (títulos) | Antes | 49,3 \pm 13,5 | 67,2 \pm 12,1 | ||
Después | 32,0\pm12,3 | NS | 32,0 \pm 19,1 | <0,05 | |
* Después frente a antes del tratamiento |
La eficacia global de T_{2} en el presente
ensayo se clasificó por su capacidad de inducir remisiones, mejora
significativa o ausencia de efecto terapéutico. (Véase Tabla
10).
Evaluación global del presente ensayo | ||||||||
Primer Transcurso de Tratamiento | Segundo Transcurso de Tratamiento | |||||||
Grupo A T_{2} | Grupo B Placebo | Grupo A Placebo | Grupo B T_{2} | |||||
(n = 27) | (n = 31) | (n = 24) | (n = 25) | |||||
Nº | % | Nº | % | Nº | % | Nº | % | |
Remisión | 2 | 7,4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Mejora | ||||||||
Evaluación | 25 | 93 | 7 | 23 | 20 | 82 | 20 | 80 |
del paciente | ||||||||
Evaluación | 25 | 93 | 7 | 23 | 19 | 79 | 22 | 88 |
del médico | ||||||||
Criterios | 22 | 82 | 7 | 23 | 19 | 79 | 11 | 44 |
clínicos | ||||||||
Evaluación | 23 | 85 | 4 | 13 | 18 | 75 | 13 | 52 |
de | ||||||||
laboratorio |
\vskip1.000000\baselineskip
En base a los criterios terapéuticos para la
remisión en RA desarrollada por un subcomité de la ARA, se observó
remisión en los pacientes del Grupo A al final del primer transcurso
de tratamiento.
El porcentaje de pacientes que experimentaron
mejoras significativas fue significativamente superior para
pacientes del Grupo A que del Grupo B como se evaluó por la
evaluación del médico y evaluaciones clínicas y de laboratorio
después del primer transcurso de tratamiento.
El porcentaje de pacientes del Grupo B que
experimentaron mejoras significativas después del segundo transcurso
de tratamiento también fue marcado, mientras que la mejora se
mantuvo en pacientes del Grupo A durante las 4 semanas del segundo
transcurso de placebo.
Para determinar si T_{2} ejercía un efecto
inmunosupresor en pacientes con RA, se obtuvieron células
mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de 18 pacientes de cada
grupo antes y después del primer transcurso de tratamiento. Estas
células se cultivaron durante 14 días y las cantidades de
IgM-RF e IgM total secretadas se determinaron usando
un radioinmunoensayo. (Véase Tabla 11).
\vskip1.000000\baselineskip
Producción de IgM-RF e IgM total de pacientes después del primer transcurso de tratamiento | ||||
Grupo A T_{2} | Grupo B Placebo | *p | ||
(n = 18) | (n = 18) | |||
RF | Antes | 7,2 \pm 3,2 | 5,4 \pm 1,6 | |
Después | 1,5 \pm 0,5 | 7,0 \pm 2,2 | <0,01 | |
IgM | Antes | 220,7 \pm 53,6 | 260,5 \pm 49,3 | |
Después | 151,9 \pm 55,3 | 301,2 \pm 100,5 | <0,01 | |
* Grupo A frente a Grupo B |
\vskip1.000000\baselineskip
En comparación con el Grupo B, se observaron
disminuciones significativas tanto en IgM-RF como
IgM total en el Grupo A después del tratamiento con T_{2}. Estos
resultados sugieren que la terapia con T_{2} había suprimido la
producción tanto de IgM como de IgM RF en estos pacientes y por
tanto ejercía un efecto inmunosupresor.
Como se muestra en la Tabla 12, los efectos
secundarios más habituales de T_{2} fueron reacciones dérmicas
incluyendo erupción cutánea, queilosis, debilitamiento de la piel y
las uñas y pigmentación.
\vskip1.000000\baselineskip
Incidencia de reacciones adversas | ||||||||
Primer transcurso de tratamiento | Segundo transcurso de tratamiento | |||||||
Grupo A T_{2} | Grupo B Placebo | Grupo A | Grupo B T_{2} | |||||
(n = 31) | (n = 31) | Placebo (n = 24) | (n = 25) | |||||
Nº | % | Nº | % | Nº | % | Nº | % | |
Erupción cutánea | 15 | 39 | 1 | 3 | 0 | 0 | 7 | 28 |
y queilosis | ||||||||
Diarrea | 6 | 27 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 8 |
Anorexia | 2 | 5 | 0 | 0 | 1 | 4 | 0 | 0 |
Dolor abdominal | 2 | 5 | 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Amenorrea | 5/16 | 31 | 0 | 0 | S/16 | 31 | 1/18 | 6 |
Sangrado vaginal | 1/10 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
postmenopáusico |
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque la incidencia de reacciones cutáneas fue
bastante alta en el Grupo A durante el primer transcurso de
tratamiento, ninguno de los pacientes tuvo que alterar la
continuidad en el tratamiento con T_{2}. La amenorrea fue otro
efecto secundario importante de T_{2}. Se observó que el 31% de
los pacientes femeninos con edad de 49 o menos que habían recibido
T_{2} durante 12 semanas desarrollaron amenorrea mientras que el
6% de los pacientes lo desarrollaron después de 4 semanas de
tratamiento con T_{2}. La amenorrea desapareció en la mayoría de
los pacientes cuando se interrumpió el tratamiento con T_{2}.
La Figura 10 resume las mejoras evaluadas en los
síntomas de artritis reumatoide descritos anteriormente. T_{2} es
un tratamiento eficaz para artritis reumatoide, mejorando
significativamente las manifestaciones clínicas y equivalentes de
laboratorio de inflamación. Aunque fue frecuente la toxicidad, se
necesitó un cese de la terapia en pocos casos. Se observó mejora
clínica después de sólo 4 semanas de terapia y persistió durante al
menos 4 semanas después de que se interrumpiera la medicación. La
terapia con T_{2} suprime la producción in vitro de IgM y
factor reumatoide IgM.
La administración del extracto T_{2} también ha
demostrado ser eficaz en el tratamiento de lupus sistémico
eritematoso (Tabla 13). También parece que es eficaz en aliviar las
manifestaciones clínicas agudas que incluyen inflamación articular,
erupción cutánea y enfermedad renal (Tabla 13). También se observó
un efecto moderador de esteroides de T_{2}. En comparación con los
corticoesteroides y agentes inmunosupresores habitualmente usados,
tales como ciclofosfamida, los pacientes tratados con T_{2}
tuvieron pocas complicaciones significativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Efecto terapéutico de T_{2} en Lupus Nefritis | |
1. | Grupo de pacientes |
Se trataron con T_{2} 10 pacientes, con edades de 22-37, con duración de la enfermedad >1. | |
2. | Evaluación de laboratorio - antes del tratamiento |
+ANA: 10 | |
unión a anti-ADN >20%: 9 | |
Proteinuria > 3 g/24 h:10 | |
Creatinina en suero elevada: 3 | |
3. | Plan de tratamiento |
Primer mes: 20 mg tid. de T_{2}. Mantener prednisona <40 mg/día | |
Seguido de 10 mg tid. de T_{2} y prednisona en disminución | |
Transcurso total de T_{2}: 24 semanas |
Efecto terapéutico de T_{2} en Lupus Nefritis | |
4. | Resultados de tratamiento: |
La creatinina en suero volvió a ser normal en 2/3 | |
La proteinuria mejoró en 10/10: | |
\hskip0,5cm indetectable: 3 | |
\hskip0,5cm <1 g/24 h: 3 | |
\hskip0,5cm >1 g/24 h: 4 | |
Medicación concomitante | |
\hskip0,5cm 3: retirada de prednisona | |
\hskip0,5cm 6: prednisona continuada <10 mg/día | |
\hskip0,5cm 1: cambiado a ciclofosfamida |
El presente ejemplo se proporciona para demostrar
el aislamiento y caracterización de los diversos componentes
químicos de un extracto de raíz de T. wilfordii Hook F
identificado por la presente invención.
Las estructuras de triptolida y tripdiolida se
muestran en la Figura 11. La Figura 12 muestra la estructura de
triptonida. La triptonida se aisló de extractos alcohólicos de
Tripterygium wilfordii Hook F por el método de Kupcham et
al.^{31}. Este esquema para la preparación de triptolida se
resume en la Figura 17. El presente ejemplo demuestra los efectos
del extracto T_{2} (descrito en el Ejemplo 1) o triptolida en la
viabilidad in cellulo de células inmunopotentes
importantes.
El efecto de triptolida en las células
inmunopotentes in vitro se determinó del siguiente modo:
Se incubaron células T, células B y fibroblastos
(1 x 10^{6}/ml) con concentraciones variadas de T_{2} o
triptolida durante 72 h. Las células se ensayaron para la viabilidad
celular usando un citómetro de flujo (FACSCAN), después las células
se tiñeron con yoduro de propidio. La Tabla 14 demuestra el efecto
de T_{2} o triptolida sobre la viabilidad celular.
Efecto de T_{2} o triptolida sobre la viabilidad celular | ||||||||
Inhibidores | ||||||||
Tipo de célula | ||||||||
Control | T_{2} (\mug/ml) | Triptolida (ng/ml) | ||||||
0,1 | 1,0 | 10,0 | 100,0 | 0,1 | 1,0 | 10,0 | ||
(Porcentaje de | ||||||||
células viables) | ||||||||
Células T | 91,7 | 90,0 | 89,3 | 88,2 | 18,8 | 29,5 | 29,8 | 11,5 |
Células B | 55,6 | 50,9 | 44,3 | 30,5 | 10,6 | 20,9 | 20,9 | 15,6 |
Fibroblastos | 77,5 | 92,7 | 95,1 | 86,6 | 43,0 | 91,7 | 89,3 | 35,8 |
T_{2} a 100 \mug/ml y triptolida a 10 ng/ml
fueron tóxicos para los fibroblastos lo que indica que a estos
niveles, la toxicidad no es específica. A niveles inferiores, se ve
la supresión de la función de células T y células B.
Se examinó la capacidad de triptolida de inhibir
respuestas in vitro de linfocitos humanos. Como puede verse
en la Tabla 15, la triptolida inhibió la proliferación tanto de
linfocitos T como B de manera profunda a concentraciones de
0,1-1,0 ng/ml.
Concentración de triptolida | Síntesis de ADN de células | Síntesis de ADN de células |
(ng/ml) | T inducida por | B inducida por |
PHA | SA | |
(Incorporación de ^{3}H-Timidina, CPM) | ||
0 | 93.400 | 7.900 |
0,1 | 24.200 | 2.000 |
1,0 | 100 | 100 |
Estudios adicionales indicaron que esta fracción
de triptolida también inhibía la producción in vitro de
inmunoglobulina de linfocitos B humanos estimulados con mitógeno a
concentraciones comparativamente pequeñas. Estos resultados
demuestran que la fracción de triptolida es extremadamente tóxica,
sin embargo, su especificidad de acción aún no está determinada.
Otros componentes de Tripterygium wilfordii Hook F
incluyen:
ácido polpunónico (wilfortrina) (1) y el éster
metílico del mismo (2) mostrados en la Figura 13 y descritos por
Keng et al. (Chem. Abst. 107: 55718y, pág. 436, 1987);
triptofenolida (1) y éster metílico de
triptofenolida (2) mostrados en la Figura 14 y descritos por Wu
et al. (Chem. Abst. 107: 96917f, pág. 713, 1987);
triptonoterpenol mostrado en la Figura 15 y
descrito por Deng et al. (Chem. Abst. 107: 112684k, pág.
112692, 1987); y
wilformina (mostrado en la Figura 16), wilforina,
wilforgina y wilforzina descritos por He et al. (Chem. Abst.
107: 130906p, 1987);
Los componentes purificados del extracto de T.
wilfordii que tienen concentraciones esencialmente indetectables
de triptolida se administrarán a pacientes con enfermedades
autoinmunes e inflamatorias incluyendo artritis reumatoide, lupus
sistémico eritematoso y psoriasis. La dosificación se determinará en
base a la concentración de cada componente terapéutico en la mezcla
T.
El presente ejemplo se proporciona para demostrar
que la preparación de Tripterygium wilfordii Hook F puede
obtenerse usando una diversidad de protocolos de extracción,
incluyendo extracción con acetato de etilo.
Se prepara un extracto de la raíz de
Tripterygium wilfordii Hook F empleando un protocolo de
extracción con acetato de etilo. Se propone que el extracto de
acetato de etilo se administrará oralmente en uso clínico.
Para preparar el extracto de acetato de etilo,
las raíces de TWH obtenidas de la provincia Fujian de China se
pelaron y secaron en aire abierto y a la luz del sol. Las raíces
obtenidas de otras áreas geográficas también se espera que sean
igualmente útiles. La madera de la planta también puede secarse
usando otras técnicas incluyendo un horno o incubadora de bajo calor
que alcanzará temperaturas de aproximadamente 60ºC. Las partes
leñosas de la raíz se machacaron hasta un polvo. Se extrajeron mil
gramos del polvo grueso de TWH con 2500 ml de etanol al 95% durante
24 horas. El material extraído se recogió en 5000 ml de etanol al
95%. El resto vegetal se calentó a reflujo con etanol al 95% durante
2 horas y el extracto de etanol se combinó con el extracto inicial.
La combinación se evaporó a presión reducida hasta que se retiró
todo el etanol. El extracto de etanol concentrado se disolvió en
acetato de etilo con la ayuda de ultrasonificación. El extracto de
acetato de etilo se filtró y el resto se disolvió con acetato de
etilo repetidamente. El extracto de acetato de etilo se combinó, se
filtró y se evaporó hasta sequedad a presión reducida. El material
se molió en un polvo fino y se mezcló con almidón. El polvo
mezclado se exploró adicionalmente a través de un tamiz Nº 60.
El polvo mezclado se incorporará en cápsulas
adecuadas para uso humano usando técnicas bien conocidas por los
especialistas en la técnica^{61} (véase Remington’s Pharmaceutical
Sciences, 18ª ed. (1990) para ensayos clínicos cuya referencia se
incorpora específicamente en este documento como referencia para
este propósito). En algunas realizaciones, un comprimido contendrá
aproximadamente 30 mg del extracto de acetato de etilo. El extracto
de acetato de etilo contiene poca triptolida, y los comprimidos
contendrán cantidades reducidas de triptolida, definido para
propósitos de la presente invención como preferiblemente no más de
10 \mug a 20 \mug de triptolida. La triptolida se midió con
HPLC por comparación con un patrón conocido de triptolida como se
describe en el Ejemplo 4 y en la Figura 17. Se preparó un único lote
de 1400 g y se utilizó para la evaluación preclínica descrita a
continuación.
Se realizó análisis de exploración cromatográfica
en capa fina en el Wouthwestern medical Center de Dallas que mostró
que el contenido en triptolida medio del extracto EA chino de
diferentes lotes fabricados por Huang Shi Pharmaceutical Company fue
1,33 \mug por mg^{44,45}. El extracto de acetato de etilo
producido por la presente invención contenía concentraciones mucho
inferiores de triptolida de aproximadamente 0,22 \mug de
triptolida por mg de extracto. El análisis por TLC y HPLC indicaron
que extractos EA chino y de Texas contenían algunos componentes
similares. (Figura 21).
Se realizó una comparación de los diterpenos en
los extractos de acetato de etilo de Tripterygium wilfordii
Hook F preparado en China y Texas. Se disolvieron 330 mg del
extracto de acetato de etilo de Texas y 40 mg del extracto de
acetato de etilo chino en acetato de etilo a una concentración de 66
mg/ml y 8 mg/ml, respectivamente, seguido de sonicación durante 25
minutos y filtración al vacío. La solución de acetato de etilo se
pasó a través de una columna de Al_{2}O_{3} neutra de 5 g. El
material se eluyó con 30 ml de etanol. Después la elución con etanol
se combinó con la solución de acetato de etilo, la solución mezclada
se evaporó en aire con alto contenido de nitrógeno hasta sequedad.
Los restos se disolvieron en 1 ml y 0,4 ml de cloroformo, por
separado. Se aplicaron 20 ml de cada solución a una placa G F 254 de
gel de sílice 20 x 20 cm (refuerzo de poliéster, placa de 250
\mum) y se volvieron a disolver con cloroformo seguido por
cloroformo/éter (1:4). Triptolida (3,6 \mug), triptofenolida (10
mg) y tripdiolida (1,8 \mug) sirvieron como patrones de
referencia. Después las placas se secaron al aire, los diterpenos se
visualizaron por la reacción de Kedde. Se realizaron las
concentraciones relativas de triptofenolida, triptolida y
tripdiolida en los extractos de acetato de etilo chino y de Texas y
un extracto patrón. Los resultados de este estudio se muestran en
la
Figura 21.
Figura 21.
* TEA: extracto de acetato de etilo
de Tripterygium wilfordii Hook F preparado en el UT
Southwestern Medical Center de
Dallas.
** CEA: extracto de acetato de
etilo de Tripterygium wilfordii Hook F preparado en
China.
Como se muestra en la Figura 21, el extracto de
acetato de etilo de Texas mostró una banda de tinción más pesada
para triptofenolida que la del extracto de acetato de etilo chino, y
aproximadamente igual a la del patrón. En contraste, la banda para
triptolida fue más intensa para el extracto chino en comparación con
el extracto de acetato de etilo de Texas. Estos descubrimientos
demuestran que hay más triptolida en el extracto chino (porque se
fabrica de raíces sin pelar). Por lo tanto, el extracto chino es más
tóxico.
El extracto de acetato de etilo de Texas es
estable a temperatura ambiente durante al menos 1 año. La
fotosensibilidad del extracto no está clara, y por lo tanto, se
almacena en la oscuridad. Se espera que la preparación permanezca
estable durante al menos 8 años.
Los intentos iniciales de entender el mecanismo
de acción del extracto de acetato de etilo se centraron en sus
actividades inmunosupresoras potenciales. El presente ejemplo
demuestra la actividad in cellulo significativa del extracto
sobre la proliferación de células T inducida por antígeno y mitógeno
y la producción de IL-2.
El extracto de acetato de etilo se preparó como
se resume en el Ejemplo 5. El extracto de acetato de etilo ejerció
varios efectos inmunosupresores sobre la sensibilidad inmune humana,
incluyendo proliferación de células T inducida por antígeno y
mitógeno y producción de IL-2. Los estudios in
cellulo (es decir, estudios usando células completas intactas)
se realizaron para determinar la concentración del extracto que
inhibía la proliferación de células T humanas inducida por mitógeno
o antígeno y la producción de IL-2 por células T en
un 50% (ID_{50}).
Estudios de proliferación: Se cultivaron
células T con o sin PHA (0,5 \mug/ml) en presencia o ausencia del
extracto de acetato de etilo a dosis de 5,7 \mug,/ml, 7,3
\mug/ml, 0,08 \mug/ml, 1,32 \mug/ml, 0,7 \mug/ml y 1,0
\mug/ml durante 3 días. Se observaron efectos significativos sobre
la proliferación de células T.
Estudios de producción de
IL-2: Se examinaron los efectos del extracto de
acetato de etilo sobre la producción de IL-2. Se
cultivaron células T con o sin PHA (1 \mug/ml) en presencia o
ausencia del extracto a dosis de 3,6 \mug/ml, 3,9 \mug/ml y 0,83
\mug/ml. Se observaron efectos significativos sobe la producción
de IL-2 en presencia de PHA o T.T. (véase Tabla
16).
El extracto de acetato de etilo a concentraciones
de 0,08-5,7 mg/ml inhibió la proliferación y
producción de IL-2 en aproximadamente un 50%. Las
concentraciones del extracto que indujeron muerte de aproximadamente
el 50% de las células también se determinaron (LD_{50}). El
LD_{50} del extracto sobre las células T activadas por mitógeno o
antígeno varió de 17-70,5 \mug/ml, que fue
10-225 veces el ID_{50} correspondiente (Tabla
16). Estos resultados demuestran que el extracto TEA mantenía
fuerte potencia de actividades inmunosupresoras in
cellulo.
Pueden usarse cantidades mucho mayores del
extracto de acetato de etilo con un nivel de toxicidad
significativamente reducido. Por lo tanto, el extracto de acetato de
etilo se esperaría que fuera relativamente más seguro que el
extracto T_{2}.
ID_{50} Y LD_{50} in cellulo del extracto de acetato de etilo en PBMC humanas | ||||
Ensayo | Estímulo | Duración | D_{50} | LD_{50} |
del cultivo | (\mug/ml) | (\mug/ml) | ||
Proliferación | PHA (1 \mug/ml) | 2,5 días | 5,7 | 70,5 |
PHA (1 \mug/ml) + IL-2 (25 u/ml) | 2,5 días | 7,3 | 74,2 | |
T.T (10 \mug/ml) | 5 días | 0,08 | 18,8 | |
T.T (10 \mug/ml) + IL-2 (25 u/ml) | 5 días | 1,32 | 17,0 | |
SK (1 mg/ml) | 5 días | 0,7 | 20,0 | |
SK + (1 mg/ml) + IL-2 (25 u/ml) | 5 días | 1,0 | 19,8 | |
Producción | ||||
de IL-2 | ||||
PHA (1 \mug/ml) | 24 h | 3,6 | ||
PHA (1 \mug/ml) | 24 h | 3,9 | ||
T.T. (10 \mug/ml) | 24 h | 0,83 | ||
PHA, fitohemaglutinina; TT, toxoide del tétanos; SK, estreptoquinasa |
El presente ejemplo describe estudios que se
realizaron para demostrar que el extracto de acetato de etilo de
T. wilfordii ejerce una acción inmunosupresora sobre
respuestas de anticuerpo primarias in vivo.
En estos estudios, se inmunizaron ratones (C57
BL/6J) con TNP-BSA emulsionado con adyuvante
completo de Freund, de acuerdo con técnicas bien conocidas por los
especialistas en la técnica. El extracto de acetato de etilo se
preparó como se resume en el Ejemplo 5. En el día de la
inmunización, los ratones se trataron con el extracto de acetato de
etilo a 125 ó 250 mg/kg/día por vía oral. En otros estudios, se
inmunizaron ratones con fosforilcolina-KLH
emulsionado con adyuvante completo de Freund 30 días después de
iniciar el tratamiento con extracto de acetato de etilo. Se
recogieron los sueros 10 y 26 días después de la inmunización. Se
determinaron los anticuerpos frente a TNP, TNP-BSA o
PC-KLH en estos sueros por el método de ELISA. El
método de ELISA es un ensayo de inmunorreactividad convencional bien
conocido por los especialistas en la técnica.
Los resultados de estos estudios muestran que las
respuestas de anticuerpo primarias para cada uno de estos antígenos
estuvieron marcadamente aumentada en los ratones tratados con el
extracto de acetato de etilo (Tabla 17). El tratamiento que comenzó
30 días antes de la inmunización fue el más eficaz para suprimir las
respuestas de anticuerpo, pero el tratamiento que comenzó en el día
de la inmunización sólo disminuyó significativamente las respuestas
de anticuerpo.
Se trataron ratones C57 BL/6J (5 en cada grupo)
sin o con dosis variadas del extracto de acetato de etilo por vía
oral. Se inyectaron 100 mg de los antígenos emulsionados en 0,1 ml
de adyuvante completo de Freund por vía intraperitoneal en el mismo
día de comenzar el tratamiento con EA o 30 días después de iniciar
el tratamiento con extracto TEA. Se tomó sangre de la vena de la
cola el 10º o 26º día después de la inmunización. Se determinaron
los anticuerpos frente a TNP solo o TNP-BSA en los
sueros con ELISA. Se estimó la cantidad relativa de anticuerpos en
los sueros comparando las lecturas de O.D. para cada muestra en la
misma dilución para ensayos individuales. Se ensayaron múltiples
diluciones de suero y se mostraron los datos para las diluciones en
las que todas las lecturas están en la parte lineal de la curva.
El presente ejemplo se proporciona para demostrar
la toxicidad reducida de preparaciones de TWF, particularmente el
extracto de acetato de etilo de la presente invención en comparación
con otros extractos de T. wilfordii.
Se realizó un ensayo de toxicidad aguda usando
ratones C57 BL/6J. Para los estudios iniciales, se usaron 25 ratones
(5 en cada grupo) para estimar el LD_{50} aproximado. No se
desarrollaron muertes con la preparación de acetato de etilo de
T. wilfordii hasta que se administraron dosis muy altas de
1200 mg/kg. El 80% de los ratones tratados con 1400 mg/kg del
extracto de acetato de etilo murieron. Después de esto, 50 ratones
de la misma cepa se dividieron en 5 grupos con cantidades iguales de
cada sexo en cada grupo. A los ratones se les dio una dosis única
de extracto de acetato de etilo por vía oral a 0, 1100, 1150, 1230,
1350 y 1500 mg/kg de peso corporal. Los ratones se observaron
durante 7 días después de esto. El LD_{50} se estimó de acuerdo
con el método de Spearman-Karber^{62}. El
LD_{50} del extracto de acetato de etilo de este experimento fue
1250 mg/kg/día (Tabla 19). Todas las muertes sucedieron en los
primeros 3 días del estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de toxicidad aguda del extracto de acetato de etilo en ratones | ||||||
Dosis | Xi | Ri | Ni | Pi | Pi+Pi+1 | I |
(mg/kg) | 2 | |||||
1100 | 3,04 | 0 | 10 | 0 | 0,15 | 0,02 |
1150 | 3,06 | 3 | 10 | 0,3 | 0,35 | 0,03 |
1230 | 3,09 | 4 | 10 | 0,4 | 0,55 | 0,04 |
1350 | 3,13 | 7 | 10 | 0,7 | 0,85 | 0,05 |
1500 | 3,18 | 10 | 10 | 1,0 | ||
\begin{minipage}[t]{155mm} Se dividieron aleatoriamente los ratones en 5 grupos con cantidades iguales de cada sexo para cada grupo. Los ratones se trataron con diversas dosis del extracto de acetato de etilo como se indica por vía oral durante 7 días. Se registró la cantidad ratones muertos. Se calculó LD_{50} de acuerdo con el método de Spearman-Karber:\end{minipage} | ||||||
Si X = LD_{50}, | ||||||
Log X = X_{k} - \Sigma[(Pi+Pi+_{1}) x I x 0,5]. | ||||||
Log X = 3,098 | ||||||
LD_{50} = 1253,1 mg/kg. | ||||||
\begin{minipage}[t]{155mm} Xi = Log_{dosis}; Ri = número de ratones muertos; Ni = número de ratones ensayados; Pi = (Ri/Ni); I = Xi+_{1}-Xi; X_{k} = logaritmo de la dosis (k) a la que murieron los animales tratados.\end{minipage} | ||||||
Se realizó una autopsia inmediatamente después de
la muerte de los ratones. El examen histológico demostró necrosis
linfocítica marcada de centros germinales esplénicos y timo, sólo
con cambios moderados en el hígado, riñón, pulmón o cerebro de
algunos de los animales.
Comparación del extracto de acetato de etilo de Texas y chino | ||
Extracto EA | ||
Fuente de la Parte del material | Parte leñosa de las raíces de la | Todas las raíces de la provincia |
vegetal de la planta de la que se | provincia Fujian de Tejas | Hubei china |
extrajo EA | ||
Contenido en triptolida de (\mug/g | 4,80 | 27,50 |
material vegetal) | ||
(\mug/mg del extracto EA) ID_{50} | 0,22 | 1,33 |
(in vitro sobre la proliferación | ||
de células T humanas estimulada | ||
por PHA, \mug/ml) | 5,7 | 2,0 |
LD_{50} (en ratones, mg/kg de peso | 1253 | 764* |
corporal) | ||
relación de ID_{50} in vitro de proli- | 4,5 x 10^{-3} | 2,6 x 10^{-3} |
feración de células T/LD_{50} (sobre | ||
ratones) | ||
* \begin{minipage}[t]{150mm} La media del LD_{50} de diferentes lotes de comprimidos en el extracto CEA preparado de TWH obtenido de los diferentes países o provincias de China\end{minipage} | ||
Como se muestra en la Tabla 19, la dosis
LD_{50} de la preparación china es aproximadamente 764 mg/kg en
comparación con los 1253 mg/kg para el extracto de Texas. El
LD_{50} de T_{2} en ratones se ha informado que es 159,7 \pm
14,3 mg/kg y el LD_{50} del extracto chino varió de
608-858 mg/kg. El ID_{50} de la preparación china
es 2,0 \mug/ml en comparación con 5,7 para el extracto de Texas.
La proporción ID_{50}/LD_{50} del extracto chino es 2,6 x
10^{-3}. Este valor de actividad terapéutica:índice tóxico es
significativamente inferior a la proporción ID_{50}/LD_{50} del
extracto TEA, ID_{50}:LD_{50} = 4,5 x 10^{-3}. Las
proporciones de cada uno de los extractos calculadas con los datos
presentados en la Tabla 19 indican que el extracto de Texas tiene un
equilibrio actividad terapéutica:índice tóxico superior, y por tanto
es superior como preparación terapéutica en comparación con
preparaciones de TwHF descritas en la bibliografía.
El presente ejemplo se proporciona para resumir
el uso del extracto de acetato de etilo de Texas en animales,
particularmente seres humanos.
El programa de dosificación del extracto de
acetato de etilo a usar en estudios en escala y seguros iniciales se
calculará usando LD_{50} del extracto y su contenido en
triptolida. El extracto de acetato de etilo de Texas se procesó
usando el mismo procedimiento usado en China para producir el
extracto de acetato de etilo chino con la excepción de que el
material preparado como el extracto de acetato de etilo de Texas se
extrae de la parte leñosa pelada de las raíces de TWH. El extracto
chino se extrae de la raíz completa de la planta. La dosificación
presentada del extracto chino se empleará como referencia para
calcular la dosificación del extracto de acetato de etilo de Texas
(Tabla 19). La bibliografía china informa de que
60-120 mg/día del extracto CEA es seguro y eficaz en
el tratamiento de RA (Shu et al., 1989; grupo de estudio
cooperativo Hubei, 1981). La cantidad de extracto chino contiene
131,2-262,4 mg de triptolida por comprimido. Los
ensayos clínicos con el extracto de Texas emplearán dosis en escala
de 30 mg, 60 mg y 120 mg/día en tres dosis divididas. La dosis más
baja es equivalente a aproximadamente el 25% de la dosis más baja
del extracto chino usado de manera segura en China mientras que la
dosis más alta (dosis de 120 mg del extracto de TEA) se aproxima a
la dosis más baja del extracto CEA usado en China y contiene 26,4
\mug de triptolida.
La administración de extractos de TWH está
contraindicada en pacientes con leucopenia, trombocitopenia y
función hepática o renal alterada. No se han hecho estudios para
evaluar los efectos de los extractos sobre mujeres embarazadas o en
periodo de lactancia.
Los pacientes interrumpirán el tratamiento con
extractos de TWH si desarrollan cualquiera de los siguientes:
vómitos o diarrea persistente; anorexia profunda; recuento de WBC de
\leq2.500 células/mm^{3}, o recuento de plaquetas de s 100.000
células. Los pacientes que desarrollan estos síntomas deben
controlarse con frecuencia para los recuentos de glóbulos blancos,
así como la función hepática y renal.
El presente ejemplo se proporciona para detallar
la actividad biológica de un componente de la fracción 924 de un
extracto de acetato de etilo de T. wilfordii.
En base a ejemplos previos, se tuvo conciencia de
que muchos compuestos diterpeno de TwHF, tales como triptolida,
tienen capacidad supresora tanto en funciones inmunes in
vitro como in vivo. Los grupos moleculares responsables
de la función supresora inmune de estos compuestos son desconocidos,
sin embargo, la estructura central de los diterpenoides que puede
estar relacionada a su actividad consta de 5 elementos lactona
\alpha-\beta-insaturados que
pueden identificarse por reactivos de Kedde. Se usó HPLC para
fraccionar el extracto de acetato de etilo de TwHF y se emplearon
los reactivos de Kedde para localizar las fracciones. Después, se
determinó el efecto de las fracciones seleccionadas en la producción
de IL-2 in vitro e incorporación de
[^{3}H]-timidina por células T activadas con PHA.
Las fracciones que inhiben estas funciones de células T se
seleccionaron y el patrón cromatográfico se identificó con HPLC. Se
purificó adicionalmente una fracción con HPLC y se cristalizó
repetidamente; se obtuvo un compuesto puro, cristalizado y se
denominó "924".
La parte pelada leñosa seca de la raíz de TwHF se
extrajo con etanol. La solución se concentró a presión reducida, y
el residuo se disolvió en acetato de etilo. Esta solución se pasó a
través de Al_{2}O_{3} con etanol como eluyente. El eluido se
evaporó y el resto se cromatografió en gel de sílice con cloroformo,
cloroformo-éter y acetato de etilo como eluyente sucesivo. Las
fracciones eluidas con cloroformo-éter se purificaron en una columna
de HPLC preparativa compactada con Nova-Pak C18 y
equipada con un detector 214. Metanol-agua fue la
fase móvil. Se recogió una fracción que tiene reacción positiva al
reactivo de Kedde y se extrajo con cloroformo. La solución de
cloroformo se evaporó hasta sequedad y el resto cristalizó en
diclorometano-hexano para producir 924. "924"
es soluble en etanol, y etanol y cloroformo.
La fracción "924" inhibía la síntesis de ADN
por células T estimuladas con PHA. La fracción "924" a una
concentración de 1 ng/ml o más inhibió que las células T estimuladas
con PHA captaran [^{3}H]-timidina. La capacidad
de inhibición se correlacionó con las concentraciones del compuesto.
La pendiente de la curva de inhibición de "924" de la
proliferación de células T fue bastante plana en que el grado de
inhibición cambió de 14,6% a 54,2% cuando la concentración de
"924" aumentó de 1 ng/ml a 100 ng/ml. Esto fue diferente de
algunos componentes de TwHF, tal como triptolida o tripdiolida que
ejercen acción inmunosupresora potente con aumento en sus
concentraciones al nivel de ngs, y provocaron potenciación
significativa de la inhibición de la función celular.
La fracción "924" inhibió la producción de
IL-2 por células T estimuladas con PHA. De manera
similar con el patrón del efecto inhibidor de "924" sobre la
síntesis de ADN de células T, a las concentraciones inhibidoras,
"924" fue capaz de reducir la producción de
IL-2 por células T inducidas por PHA. Se vio una
reducción del 50% de la secreción de IL-2 a 42,11
ng/ml (véase Figura 20B).
La fracción 924 también demostró actividad
significativa en la inhibición de la proliferación de células T,
proporcionando inhibición de la proliferación de células T a dosis
relativamente bajas de 200 ng/ml de la fracción 924 (véase Figura
20C). A concentraciones de 1.000 ng/ml de la fracción 924, no fue
evidente ninguna proliferación celular (véase Figura 20C). No hubo
efecto de "924" sobre la expresión de IL-2R por
células T activadas con PHA. La fracción "924" a 500 ng/ml (al
menos 50 veces la concentración eficaz para inhibir la proliferación
de células T o producción de IL-2) no afectó a la
expresión de IL-2R por células T activadas con
PHA.
La fracción "924" no afectó a la viabilidad
de células T estimuladas con PHA a todas las concentraciones
empleadas, variando de 1 ng/ml hasta 1000 ng/ml. El ID50/LD50 in
vitro de "924" de la proliferación de células T no fue de
más de 10 indicando que, en las mismas condiciones de cultivo,
"924" no aumenta la muerte celular hasta que alcanza 10 veces
más de su concentración inhibidora. La fracción 924 también demostró
toxicidad celular relativamente baja, como se demuestra en la
Figura 20D. Las concentraciones de la fracción 924 de entre 1 y 500
ng/ml no difirieron significativamente en términos de viabilidad
celular, expresada como porcentaje de células viables en la
población de control. Una concentración de la fracción 924 de 1.000
ng/ml sólo fue ligeramente más tóxica para la viabilidad celular en
comparación con la dosis de 0 ng/ml (véase Figura 20D, 0 ng/ml =
22% de control; 1.000 ng/ml de la fracción 924 = 35% de viabilidad
celular de control).
La reacción positiva al reactivo de Kedde indicó
que "924" tiene una estructura de una lactona
\alpha,\beta-insaturada. Como muchos de los
compuestos diterpenoides conocidos tales como triptolida,
triptoclorolida, 16-hidroxitriptolida, tripdiolida,
triptonida y triptofenolida también tienen la lactona
\alpha,\beta-insaturada, los patrones de TLC y
HPLC de "924" se compararon con estos compuestos. El patrón de
"924" fue diferente al de todos los compuestos mencionados
anteriormente. El patrón tuvo las características cromatográficas de
los diterpenoides y no siguió el patrón regular de los diterpenoides
ensayados por varios sistemas cromatográficos normales y en fase
inversa. Por lo tanto, "924" parece ser un compuesto no
diterpenoide. Después del análisis adicional de la fracción 924 por
RMN/espectroscopía de masas, la fracción se determinó que era el
compuesto puro, wilforonida (Figura 18).
Se cultivaron células T con o sin PHA (0,5
microgramos/ml) en presencia o ausencia de concentraciones de 10
ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml o 500 ng/ml de la preparación
de wilforonida descrita en la preparación del Ejemplo 10 durante
tres días. Se añadió [^{3}H]-timidina durante al
menos 14 horas de cultivo. Cada concentración se procesó por
cuadruplicado (4 veces) y los resultados para cada concentración se
ponderaron para proporcionar una media. Las medias de valores de cpm
x 10^{3} se combinaron y se expresaron como un porcentaje de
inhibición de células T. Estos datos se proporcionan en la Tabla
20.
Como se muestra en la Tabla 20, una concentración
de 100 ng/ml de wilforonida proporcionó una inhibición del 21,19% de
la proliferación de células T inducida por PHA in cellulo.
Una concentración de 200 ng/ml de wilforonida proporcionó una
inhibición del 26,43% de la proliferación de células T inducida por
PHA. Una concentración de 500 ng/ml de wilforonida provocó una
inhibición del 62,86% de la proliferación de células T inducida por
PHA. (Véase Tabla 20). Un ID_{50} de 391,30 ng/ml de wilforonida
se observó (véase Tabla 20).
\vskip1.000000\baselineskip
Efecto de wilforonida sobre la proliferación de células T inducida por PHA* | ||||||
Wilforonida | cpm x 10^{3} | media de | % de | |||
(ng/ml) | 1. | 2. | 3. | 4. | cpm x 10^{3} | inhibición |
0 | 34,1 | 36,9 | 58,5 | 38,5 | 42,0 | |
10 | 23,5 | 37,1 | 57,5 | 36,3 | 38,6 | 8,09 |
50 | 30,2 | 35,3 | 57,0 | 44,8 | 41,8 | 0,48 |
100 | 13,0 | 37,6 | 55,2 | 26,7 | 33,1 | 21,19 |
200 | 6,8 | 33,9 | 56,5 | 26,4 | 30,9 | 26,43 |
500 | 0,3 | 19,7 | 30,9 | 11,3 | 15,6 | 62,86 |
ID_{50} (ng/ml) | 391,30 | |||||
* \begin{minipage}[t]{140mm} Se cultivaron células T con o sin PHA (0,5 \mu g/ml) en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de wilforonida durante 3 días. Se añadió [^{3}H]\text{-}timidina durante las últimas 14 horas. Los datos son de 4 experimentos independientes.\end{minipage} | ||||||
También se examinaron los efectos de wilforonida
sobre la producción de IL-2. Se cultivaron células T
con o sin PHA (1 microgramo/ml) en presencia o ausencia de 0
(control), 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml o 200 ng/ml de wilforonida
durante una noche. Los sobrenadantes libres de células se diluyeron
1 a 80 y se ensayó el contenido en IL-2 con células
CTLL-2. La producción de IL-2 por
las células T cultivadas sin estimulación se encontró que fue de
menos de 0,32 unidades/ml.
Los resultados obtenidos del estudio se
proporcionan en la Tabla 21. La concentración de 10 ng/ml de
wilforonida mostró una inhibición del 37,94% de la producción de
IL-2 inducida por PHA con relación al control. La
concentración de 50 ng/ml de wilforonida provocó una inhibición del
54,22% de producción de IL-2 inducida por PHA con
relación al control. Las concentraciones de 10 ng/ml provocaron una
inhibición del 68,20%, provocando la concentración de 200 ng/ml de
wilforonida una inhibición del 74,96% de la producción de
IL-2 inducida por PHA.
También se determinó un ID_{50} global de 42,11
ng/ml. Estos datos se proporcionan en la Tabla 21.
Efecto de wilforonida sobre la producción de IL-2 inducida por PHA | ||||||
Wilforonida | IL-2 (unidad/ml) | Media | % de | |||
(ng/ml) | 1. | 2. | 3. | 4. | inhibición | |
0 | 1,422 | 23,436 | 50,020 | 10,701 | 21,395 | |
10 | 1,628 | 20,723 | 27,374 | 3385 | 13,278 | 37,94 |
50 | 1,664 | 26,983 | 4,509 | 6,042 | 9,795 | 54,22 |
100 | 0,800 | 11,160 | 10,170 | 4,982 | 6,803 | 68,20 |
200 | 0,850 | 10,301 | 8,502 | 1,773 | 5,357 | 74,96 |
ID_{50} (ng/ml) | 42,11 | |||||
* \begin{minipage}[t]{145mm} Se cultivaron células T con o sin PHA (1 mg/ml) en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de wilforonida durante una noche. Los sobrenadantes libres de células se diluyeron 1 a 80 para el ensayo del contenido en IL-2 con células CTTL-2. La producción de IL-2 por las células T cultivadas sin estimulación fue menor de 0,32 unidades/ml.\end{minipage} | ||||||
Se cultivaron células T con o sin SK (1 ng/ml) o
SK + IL-2 (50 u/ml) o SK + PMA (0,2 ng/ml) en
presencia o ausencia de las siguientes concentraciones de
wilforonida: 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 500 ng/ml o 1.000 ng/ml.
Se dejó que las células se cultivaran durante cinco días. Los
cultivos se pulsaron con [^{3}H]-timidina durante
al menos 24 horas de cultivo. Los datos recogidos de este estudio se
proporcionan en la Tabla 22. Estos datos representan la media del
porcentaje de inhibición de la incorporación de
[^{3}H]-timidina de cinco experimentos
independientes. Se calculó ID_{50} en base a la fórmula de
regresión usando la calculadora fx-3600. Las células
T cultivadas con SK o SK + IL-2 o SK + PMA dieron
cpm de 1,87 x 10^{3}, 4,99 x 10^{3} y 6,67 x 10^{3},
respectivamente.
La respuesta a SK inhibida por bajas
concentraciones de wilforonida se demostró que se superaba
parcialmente añadiendo IL-2 o PMA, como se demuestra
por el ID_{50} marcadamente más alto (aumentado). Esto indica que
la inhibición se correlaciona con una disminución en la producción
de IL-2. Esta disminución se supera añadiendo
IL-2 o co-estimulando con PMA que
induce la producción de IL-2.
Los datos de este estudio se proporcionan en la
Tabla 22.
Efecto inhibidor de wilforonida sobre la proliferación de células T inducida por antígeno* | |||
Wilforonida | SK | SK+IL-2 | SK+PMA |
(ng/ml) | |||
10 | 42,15 | 19,59 | 22,67 |
50 | 44,47 | 12,37 | 17,70 |
100 | 49,14 | 14,52 | 20,32 |
500 | 75,20 | 61,70 | 53,30 |
1.000 | 84,23 | 86,21 | 65,43 |
ID_{50} (ng/ml) | 127,12 | 476,00 | 613,00 |
* \begin{minipage}[t]{145mm} Se cultivaron células T con o sin SK (1 mg/ml) o SK más IL-2 (50 u/ml) o SK más PMA (2 ng/ml) en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de wilforonida durante 5 días. Los cultivos se pulsaron con [^{3}H]\text{-}timidina durante al menos 24 horas. Los datos representan la media del % de inhibición de la incorporación de [^{3}H]\text{-}timidina de 5 experimentos independientes. Los ID_{50} se calcularon en base a la fórmula de regresión usando la calculadora fx-3600. Las células T cultivadas con SK o SK+IL-2 o SK+PMA dieron cpm de 1,87 x 10^{3}, 4,99 x 10^{3} y 6,67 x 10^{3}, respectivamente.\end{minipage} | |||
El presente ejemplo demuestra que el extracto T2
de Tripterygium wilfordii Hook F inhibe la producción de
interferón \gamma la transcripción del gen de
IL-2.
Se realizaron estudios de transcripción para
determinar si el extracto de TwHF afectaba directamente a la
transcripción del gen de IL-2 o tenía efectos
post-transcripcionales. Se emplearon células Jurkat
que se habían transfectado de manera estable con una construcción
que contenía el promotor de IL-2 dirigiendo la
transcripción del gen informador, cloranfericol acetiltransferasa
(CAT).
Ensayo de IFN-\gamma. Se
determinó el contenido en IFN-\gamma en
sobrenadantes con un kit de radioinmunoensayo como se describe por
el fabricante (Centocor, Malvern, PA). Se cultivaron células T (1 x
10^{5}/ml) con PHA (1 mg/ml) durante 24 horas en presencia o
ausencia del extracto EA. Se ensayaron los sobrenadantes libres de
células para el contenido en IL-2 e
IFN-\gamma.
Ensayo de IL-2 CAT. Se
electroporaron células Jurkat con una construcción del promotor
IL-2 que contenía la mayoría de los sitios de unión
del factor de transcripción específico de células T en el
promotor/potenciador (región -342 a +47 obtenida de la construcción
IL-2/PJGFCA19) dirigiendo el gen de la cloranfenicol
acetil transferasa bacteriana (CAT) insertado en un vector que
contiene un marcador de selección de neomicina, denominado
IL-2/PML3 (72,73). Las células se seleccionaron con
geniticina (0,5 mg/ml) durante aproximadamente un mes antes de su
uso. Las células después se incubaron con PHA y PMA, en presencia de
concentraciones variadas de un extracto de TwHF (un extracto de
cloroformo/metanol de la parte leñosa de las raíces de TwHF,
disuelto en DMSO y diluido con medio de cultivo) o en medio solo
durante 20 horas. Después de la incubación, los sobrenadantes se
recogieron para el ensayo de IL-2 secretada y
cantidades equivalentes de células se lavaron y lisaron por
congelación/descongelación repetida en 100 \mul de
Tris-HCl 0,25 M (pH 7,8) y se centrifugaron durante
5 minutos a alta velocidad para retirar los desechos celulares. La
actividad CAT se midió por la adición de 1 \mulCi de
[^{14}C]-cloranfenicol (60 mCi/mmol; New England
Nuclear, Boston, MA) y 14 \mul de acetil coenzima A 5 mM a los
lisados seguido de una incubación de 12 h a 37ºC como se ha descrito
previamente por Gorman et al. (74). La reacción se detuvo
por la adición de 1 ml de acetato de etilo frío y después de la
separación de fases, la fase orgánica se evaporó, se resuspendió en
20 \mul de acetato de etilo y se salpicó sobre placas de
cromatografía de capa fina en gel de sílice. Los cromatogramas se
visualizaron y la radiactividad se cuantificó usando un dispositivo
de detección \beta automático y de formación de imágenes (AMBIS).
El porcentaje de conversión se calculó dividiendo las cpm del
cloranfenicol acetilado por el cloranfenicol total presente en cada
muestra. La actividad CAT se descubrió que se correlacionaba con
los niveles de IL-2 secretado cuando estas células
se estimulaban con diversos mitógenos. Las células Jurkat
transfectadas con PML-LDLr-6500 se
tomaron como control positivo para la actividad CAT^{75}.
Inhibición de la transcripción del gen de
IL-2 inducida por mitógeno por extractos de
TwHF. Los datos de la Tabla 23 muestran que el extracto de TwHF
inhibió la actividad CAT inducida por mitógeno de un modo
dependiente de dosis, similar al observado para la producción de
IL-2.
Inhibición de la transcripción de IL-2 por un extracto T2^{1} | ||
% de Acetilación | Producción de IL-2 | |
(unidades/ml) | ||
Control | 0,17 | 23,4 |
PHA+PMA | 6,90 | 5440 |
PHA+PMA+52 1 \mug | 0,22 | 0 |
PHA+PMA+T2 5 \mug | 0,22 | 0 |
PHA+PMA+T2 10 \mug | 0,19 | 0 |
células 4JK | 95,80 | - |
^{1} \begin{minipage}[t]{140mm} Se incubaron células T Jurkat transfectadas de manera estable con una construcción promotor de IL-2/CAT con o sin PHA (2 \mu g/ml) en presencia o ausencia de concentraciones variadas de un extracto de TGF durante 18 h. Los sobrenadantes se recogieron para el ensayo de IL-2 con células CTLL-2. Los extractos celulares se evaluaron para actividad CAT como se describe en los métodos. La actividad CAT de una línea celular de control transfectada con una construcción de CAT dirigida por un promotor constitutivamente activo (células 4JK) se muestra como control positivo para el ensayo.\end{minipage} | ||
Estos resultados indican que el extracto de TwHF
inhibe la transcripción del gen de IL-2.
Inhibición de la producción de
IFN-\gamma. Como se muestra en la Figura 34,
el extracto EA inhibió la producción de IL-2
inducida por PHA (EC_{50} = 0,75 \pm 0,12 \mug/ml). La
producción de IFN-\gamma inducida por PHA también
muy sensible a la inhibición mediada por EA (EC_{50} = 0,64 \pm
0,04 \mug/ml).
El presente ejemplo proporciona datos de la
capacidad del extracto de TwHF y componentes de TwHF purificados de
unirse al receptor de glucocorticoides (GR). La unión del extracto
de TwHF y componentes del mismo al GR se demostró por inhibición
competitiva de la unión del ligando GR natural usando diversos
sistemas modelo. La capacidad de TwHF de competir con
[^{3}H]-dexametasona por la unión del receptor de
glucocorticoides, la capacidad de TwHF de inhibir la activación
mediada por el receptor de glucocorticoides de una construcción
génica diana sensible en células de mamífero transfectadas, y la
capacidad de TwHF de inhibir el crecimiento de una línea celular
transfectada que expresa un receptor de glucocorticoides que regula
el antígeno T grande de SV40, y por lo tanto, cuyo crecimiento es
dependiente de dexametasona, se examinó.
Los extractos de
cloroformo-metanol de TwHF se usaron en este
ejemplo; la actividad de estos extractos está correlacionada con la
actividad de los extractos de acetato de etilo por la cantidad de
triptolida en las preparaciones. La cantidad de triptolida se midió
por HPLC como se describe en el Ejemplo 15.
Ensayo de unión a glucocorticoides en células
completas. Se cultivaron fibroblastos de piel humana en
MEM-suero de ternera bovino al 10% en una atmósfera
de CO_{2} al 5% a 37ºC. Las células se sembraron en pocillos de 7
centímetros a 750.000 células por pocillo. Veinticuatro horas antes
de los experimentos, el medio se cambió a MEM con 5 mg/ml de
albúmina de suero bovina. En el día del experimento, el medio se
reemplazó con 3,0 ml de MEM por pocillo con
[^{3}H]-dexametasona 10 nM. Se añadieron
cantidades variadas del extracto de TwHF a algunos pocillos. Las
células se incubaron a 37ºC durante 60 minutos, después se lavaron,
se recogieron por tratamiento con tripsina, y se lisaron en 1 ml de
agua. Las alícuotas se ensayaron para proteínas y se contaron para
la radiactividad unida. Estas células expresan, de media,
aproximadamente 170 fmol de receptor de glucocorticoides por mg de
proteína.
Transfecciones celulares y ensayos de
activación génica mediada por GR. Se mantuvieron células
COS-7 en cultivo en DMEM-suero de
ternera bovino al 10%. Estas células no expresan receptores de
hormonas esteroides endógenos. Las células se sembraron a 10^{6}
células por placa de 10 cm. Veinticuatro horas después, las células
se transfectaron con 500 ng de pRShGr\alpha, un vector de
expresión de GR (obtenido del Salk Institute, La Jolla, CA) y 10
\mug de pMMTV-luciferasa, un gen informador
sintético. Sin embargo, pueden usarse otros vectores de expresión y
genes informadores sintéticos disponibles para los especialistas en
la técnica para la transfección. El vector
pMMTV-luciferasa contiene el gen de la luciferasa
bajo el control regulador de elementos inducibles por
glucocorticoides en la repetición larga terminal MMTV. Las células
se transfectaron usando la técnica de precipitación con fosfato (kit
de transfección de mamíferos, Stratagene, La Jolla, CA). Después de
la transfección, se añadió dexametasona (1 \muM) al medio.
Veinticuatro horas después, las células se lavaron, se recogieron, y
se prepararon lisados por tres ciclos de congelación/descongelación.
Los lisados se aclararon por centrifugación a 12.000 x g durante 5
minutos; se ensayaron alícuotas para el contenido en proteínas y
cantidades iguales de proteínas se usaron para ensayos de
luciferasa.
Un sistema de ensayo adicional que se empleó
implicó células IDH4, cuyo crecimiento depende de la presencia de
dexametasona. Las células IDH4, que expresan receptores de
glucocorticoides endógenos, se produjeron transfectando fibroblastos
humanos con un plásmido que contenía la repetición larga terminal
MMTV dirigiendo el antígeno T grande SV40. Como el crecimiento
prolongado de estas células depende de la expresión del antígeno T
grande, estas células requieren glucocorticoide exógeno para
mantener la proliferación.
El extracto de TwHF se une a GR. El
extracto de cloroformo-metanol de TwHF inhibió la
unión de [^{3}H]-dexametasona al GR expresado de
manera endógena en fibroblastos de piel humana (Figura 22). Se
incubaron monocapas intactas de fibroblastos de piel de genitales
humanos (aproximadamente 170 fmol de GR por mg de proteína) con
[^{3}H]-dexametasona 10 nM sola o con una
concentración en aumento de TwHF. No es posible la estimación de las
afinidades de unión relativas de TwHF y dexametasona, sin embargo,
ya que el extracto de TwHF es una mezcla de compuestos. La
inhibición del 50% de la actividad de GR sucedió con la adición de
aproximadamente 5 \mug del extracto. La adición de etanol puro, el
disolvente para el extracto de TwHF, en volúmenes iguales no tuvo
efecto sobre la actividad de unión del ligando GR. Además, el
extracto de TwHF no tuvo efectos sobre la unión de
dihidrotestosterona a los fibroblastos de piel de genitales,
indicando que no inhibían la actividad del receptor de andrógenos,
lo que implica un efecto específico sobre GR.
El extracto de TwHF inhibe la activación
inducida por dexametasona de la transcripción del gen diana pero
carece de actividad agonista GR intrínseca. El extracto de
cloroformo-metanol de TwHF también inhibió la
activación mediada por GR de un gen diana sintético (Figura 23). Se
transfectaron células COS-7 con un vector de
expresión de GR humano y la construcción del gen informador
MMTV-luciferasa. Se transfectó un conjunto de placas
en paralelo con la construcción RSV-luciferasa
constitutivamente activa. Después de 24 horas, se añadió
dexametasona a una concentración de 10 nM sola o en combinación con
concentraciones en aumento de TwHF. Las células se lisaron después
de 24 horas y se ensayaron para la actividad de luciferasa. En
ausencia de TwHF, los niveles de fondo de actividad luciferasa
fueron de aproximadamente el 1% de la actividad inducida por
dexametasona. La adición de dexametasona provocó, de media, una
inducción de 100 a 200 veces de la actividad luciferasa. Además del
extracto de TwHF en concentraciones mostradas para competir por la
unión de GR inhibió la activación del gen diana (Figura 23). La
expresión de luciferasa bajó el control de un promotor
constitutivamente activo, es decir, un promotor no sensible al
receptor de glucocorticoides, (RSV-luciferasa) no se
inhibió por la adición de TwHF (Figura 23) lo que indica
especificidad del extracto de TwHF por los procesos dependientes de
GR.
Para determinar si TwHF tiene actividad agonista
glucocorticoide directa, células COS-7 transfectadas
con un vector de expresión de GR humano y la construcción
informadora MMTV se estimularon con TwHF, pero sin dexametasona.
TWF no provocó activación del gen diana directa (Tabla 24). Por el
contrario, la dexametasona indujo transcripción drástica del gen
informador.
TWF carece de Actividad Agonista de GR intrínseca | ||||||
Control | TWF 0,4 | TWF 0,8 | TWF 2,0 | TWF 4,0 | DEX 10 | |
\mug/ml | \mug/ml | \mug/ml | \mug/ml | nM | ||
RLU Nº 1 | 998 | 1260 | 1603 | 1167 | 903 | 193,419 |
RLU Nº 2 | 2850 | 2012 | 1905 | 1106 | 517 | 218,786 |
\begin{minipage}[t]{145mm} Se transfectaron células COS-7 con vector de expresión de GR y la construcción MMTV-gen informador luciferasa. Después de 24 horas se añadió TWF a concentraciones conocidas para competir por la unión a GR (0,4-4,0 \mu g/ml). Las células se lisaron después de 24 horas y los extractos se ensayaron para la actividad luciferasa. Los controles incluyeron ausencia de adición (control negativo) y dexametasona 10 nM (control positivo). Los datos mostrados son unidades de luz relativa (actividad luciferasa) para transfecciones duplicadas en un experimento único.\end{minipage} | ||||||
Experimentos similares en células L929 y en
células COS y L929 estimuladas con AMPc (conocido como actividad
agonista "no enmascarada" de algunos competidores de GR)
confirmaron esta ausencia de función agonista de TwHF.
Para comparar las curvas de respuesta a
concentración para la inhibición mediada por TwHF de la actividad de
unión del ligando GR y la inhibición de TwHF de la activación del
gen diana mediada por GR, se combinaron los datos de la Figura 22 y
23. Donde las curvas son comparables, TwHF parece varias veces más
potente para la inhibición de la activación del gen diana en
comparación con la inhibición de la unión del ligando (Figura
24).
El extracto de TwHF y el componente tripdiolida
purificado inhibió el crecimiento dependiente de dexametasona de
células IDH4 de un modo dependiente de la concentración (Figura 25A,
25B y 25C). La triptofenolida fue menos activa y su actividad no se
correlacionó en líneas generales con la dosificación. Se cultivaron
células IDH4 (2 x 10^{6}/ml) durante 72 horas en DMEM suplementado
con un 10% de suero bovino libre de dexametasona con o sin
dexametasona en presencia o ausencia de T2 o tripdiolida o
triptofenolida, según se indique. [^{3}H]-timidina
estuvo presente durante las últimas 16 h. Los datos representan la
media del % de inhibición de la incorporación de
[^{3}H]-timidina de tres determinaciones
replicadas de tres experimentos separados. Las células IDH4
incubadas sin estimulación dieron 16.391 cpm. Las células cultivadas
con dexametasona a 1 nM, 10 nM, 100 nM y 1.000 nM dieron 35,554,
52,937, 105,357 y 96,677 cpm, respectivamente.
Estudios adicionales evaluaron si la
inmunorreactividad tipo cortisol estaba contenida en el extracto
TwHF. Con la mayoría de los anticuerpos
anti-cortisol ensayados, no se encontró ninguna
evidencia de la presencia de dichas moléculas en TwHF. Esto se
confirmó por los experimentos de fraccionamiento en Sephadex
LH-20 en los que se descubrió que la capacidad de
bloque del receptor de glucocorticoides de TwHF existe en fracciones
distintas de la posición de elución del cortisol auténtico. Con un
anticuerpo anti-cortisol único dirigido frente al
anillo A del esteroide, se detectó algo de inmunorreactividad tipo
cortisol (Figura 26). Estos datos sugieren que algunos componentes
de TwHF podrían tener características estructurales tipo cortisol,
pero no se encontró cortisol auténtico.
Los compuestos de TwHF purificados se ensayaron
de manera similar para los efectos sobre la unión del ligando a GR,
y para la inhibición de la activación del gen diana mediada por GR.
Tanto triptolida (compuesto A) como tripdiolida (compuesto B)
inhibieron la activación del gen diana por GR, mientras que
triptofenolida (compuesto C) fue mucho menos potente. Es de
importancia observar que, la triptofenolida es mucho menos supresora
que la triptolida o tripdiolida. Se muestran curvas de inhibición de
la unión y activación del gen diana para el compuesto A (Figura
27). Otra vez, el compuesto fue más potente en la inhibición de la
inducción de MMTV-luciferasa en más de un orden de
magnitud. Ninguno de los componentes de TwHF purificados mostró
inmunorreactividad de cortisol (Figura 28).
En el presente ejemplo, el extracto de TwHF y
tripdiolida se examinaron para su capacidad de inhibir la inducción
in vivo de una actividad enzimática
pro-inflamatoria, es decir, la estimulación de la
forma inducible de ciclooxigenasa (COX-2).
Ciclooxigenasa-1 es la enzima responsable de la
síntesis constitutiva de prostaglandinas y ciertos autocoides
relacionados, mediadores de la inflamación. La inhibición de esta
enzima provoca los efectos secundarios de NSAID. Durante la
inflamación y después de la estimulación, las células inflamatorias,
tales como macrófagos, producen una nueva enzima,
ciclooxigenasa-2, que es responsable de mucha de la
producción de prostaglandina en los sitios inflamatorios.
Los monocitos (1 x 10^{6}/ml), separados de las
PBMC humanas normales, se incubaron en medio
RPMI-1640 suplementado con suero humano normal al
5% con o sin LPS (10 \mug/ml) y en presencia o ausencia de uno de
los siguientes reactivos: T2, tripdiolida, dexametasona, o RU486, a
las concentraciones indicadas (Figura 29A-29D).
Después de 18 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes
libres de células y se ensayaron para el contenido en PGE2 con un
kit de radioinmunoensayo (Amersham), como se describe por el
fabricante. Los datos representan la media de dos determinaciones
replicadas de dos experimentos separados. Los monocitos cultivados
con LPS produjeron 392 pg de PGE2/0,2 millones de células. Los
monocitos humanos producen prostaglandina E_{2} (PGE_{2})
cuando se estimulan con endotoxina bacteriana. Esto se refiere a la
inducción de ciclooxigenasa-2
(COX-2) y se inhibe por dexametasona (Figura
29A-29D). De manera similar, la producción de
PGE_{2} se inhibe por el extracto de TwHF y su componente
inmunosupresor purificado, tripdiolida. La producción de PGE_{2}
constitutiva por monocitos no estimulados que está mediada por
ciclooxigenasa-1 no se inhibió por TwHF o sus
componentes. En esos estudios previos se muestra específicamente
que está documentado que el extracto de TwHF no inhibió otras
funciones de los monocitos, tales como presentación de antígeno.
En resumen, los datos son consistentes con la
conclusión de que los componentes de TwHF interaccionan
específicamente con el receptor de glucocorticoides y ejercen
efectos anti-inflamatorios e inmunosupresores por
este mecanismo, y no tienen actividad directa sobre los genes
sensibles a glucocorticoides.
Estos datos demuestran adicionalmente que el
extracto T2, y componentes del mismo, se unen al receptor de
glucocorticoides, y el complejo humano no logra activar las regiones
promotoras sensibles al receptor de glucocorticoides. Los genes que
necesitan estos promotores para activarse, por lo tanto, no se
inducen. De manera concomitante, T2 inhibe los procesos
inflamatorios como se demuestra en este documento por la inhibición
de la inducción de ciclooxigenasa-2 y también por
la inhibición de la activación del gen de IL-2 e
interferón \gamma. El efecto combinado de la propiedad
anti-inflamatoria sin la inducción de actividad
agonista relacionada con esteroides proporciona un método de
tratamiento desconocido hasta ahora y buscado durante mucho tiempo
para inflamación, enfermedad autoinmune, y otras afecciones
inmunosupresoras donde pueden evitarse los efectos no deseables de
los esteroides (TwHF no tiene actividad agonista) y fármacos
anti-inflamatorios no esteroideos (por ejemplo,
aspirina) (la ciclooxigenasa-1 no está inhibida por
TwHF).
Se describe un nuevo método analítico para la
determinación de triptolida y tripdiolida en extractos de acetato de
etilo de Tripterygium wilfordii Hook F en el presente
ejemplo. El procedimiento consta de un enriquecimiento preliminar de
la triptolida y tripdiolida por cromatografía con cartucho de
alúmina B Sep-Pak seguido por análisis por HPLC. Se
realizó HPLC con una columna de acero inoxidable compactada con
Nova-Pack C18, usando
acetonitrilo-agua (19:81) como fase móvil para
triptolida y acetonitrilo-agua (11:89) para
tripdiolida. El efluente se control por detección en el ultravioleta
a 214 nm. El análisis cuantitativo de triptiolida después se
realiza por comparación con un patrón interno, y de tripdiolida por
el método de patrón externo. Las cantidades de triptolida y
tripdiolida por 100 mg de extracto de acetato de etilo se
determinaron que eran 19,88 \mug y 9,58 \mug respectivamente. El
método es suficientemente sensible y específico para ensayar los
diterpenos encontrados en Tripterygium wilfordii Hook F de
manera precisa.
Instrumentos. La cromatografía líquida
Waters (Milford, MA) se configuró con dos bombas modelo 510, un
inyector modelo U6K y un detector UV modelo 441 ajustado a 214 nm.
Los datos se procesaron con el software Millenium, Versión 1.10
(Waters Assoc.). La columna de acero inoxidable (150 mm x 3.9 mm
D.I.) se compactó con Nova-Pack C18 con tamaño de
partícula de 4 \mum (Water Assoc.). Se usó una
pre-columna de HPLC, con un inserto envasado con
Nova-Pak C18, (Water Assoc.) para prolongar la vida
de la columna. Se usó el baño de agua ultrasónico modelo ULTRAsonik
2QT/H en la desgasifiación del disolvente y la preparación de la
muestra se adquirió de NEY Barkmeyer Division (Yucaipa, CA.).
Compuestos químicos y reactivos. Se
prepararon triptolida y tripdiolida a partir del extracto de acetato
de etilo de TwHF por cromatografía en columna de gel de sílice de
manera sucesiva con cloroformo, cloroformo-éter y
cloroformo-acetato de etilo como eluyentes. Las
fracciones que contenían triptolida y tripdiolida se purificaron en
HPLC preparativa con una columna de Nova-Pak C18, 25
x 100 mm, usando acetonitrilo-agua como la fase
móvil. Los compuestos se recristalizaron en
hexano-diclorometano. Se identificó la triptolida
por UV, IR, RMN de protones y espectros de masa. La tripdiolida se
identificó por HPLC, TLC y RMN de protones y comparación con el
producto de laboratorio conocido proporcionado por Boehringer
Ingelheim Pharmaceuticals Inc. (Ridgefield, Connecticut). El
acetonitrilo era de calidad HPLC adquirido de Aldrich Chemical Co.
(Milwaukee, WI), el agua fue Millipore pure, y otros disolventes
eran de calidad GR. Las fases móviles se desgasificaron por vacío
junto con sonicación justo antes de su uso. El cartucho de alúmina B
Sep-Pak Plus se adquirió de Waters Assoc. (Milford,
MA); la acetofenona, seleccionada como patrón interno para la
evaluación de triptolida se adquirió de Sigma Chemical Co. (St.
Louis, MI). Las estructuras químicas de triptolida y tripdiolida se
muestran en la Figura 11.
Preparación del extracto de acetato de etilo
de TwHF. Las raíces de TwHF se recogieron de la provincia
Fujian, China. Se retiró la piel de las raíces y se molió la parte
leñosa de las raíces hasta un polvo grueso. Se extrajeron 1000 g
del polvo grueso con etanol tres veces. Las soluciones de etanol se
combinaron y se evaporaron a presión reducida. El resto después se
extrajo con acetato de etilo. La concentración de la solución a
presión reducida produjo 22 g del extracto de acetato de etilo.
Procedimiento de enriquecimiento. Se
pesaron aproximadamente 50 mg de extracto de acetato de etilo de
manera precisa y se disolvieron en 10 ml de cloroformo en un baño
ultrasónico durante 25 minutos. La solución del extracto se filtró
y el resto se lavó con 10 ml de cloroformo-acetato
de etilo (9:1). Los lavados combinados con la solución de
cloroformo original se aplicaron al cartucho
Sep-Pak. Se pasaron sucesivamente 25 ml de
cloroformo-acetato de etilo (9:1) y 15 ml de acetato
de etilo-metanol (9:1) a través del cartucho. La
fracción de cloroformo-acetato de etilo, usada para
la determinación de triptolida, se evaporó hasta sequedad en una
corriente suave de nitrógeno. El resto se disolvió con 1,00 ml de
solución de acetofenona, que se preparó disolviendo acetofenona en
metanol para obtener una solución que tiene una concentración de
12,5 \mug/ml. El resto disuelto se diluyó con
acetonitrilo-agua (19:81) hasta 2,00 ml. La fracción
de acetato de etilo-metanol se evaporó. El resto se
disolvió en 1,00 ml de solución de acetonitrilo-agua
(11:89) y se usó para analizar el contenido en tripdiolida.
Determinación de diterpenos. Se inyectó un
volumen de 10 \mul de solución de muestra purificada en la
cromatografía líquida. La fase móvil para cada separación se enumera
en el cromatograma individual. La triptolida se determinó por
comparación con un patrón interno. Las soluciones de referencia que
contienen 1,83, 3,66, 7,32, 16,08 y 36,18 ng \mul^{-1} de
triptolida y 6,25 ng \mul^{-1} de acetofenona para cada solución
se prepararon en acetonitrilo-agua (19:81). Las
soluciones de referencia de tripdiolida se prepararon en
acetonitrilo-agua (11:89) a las concentraciones de
1,28, 2,55, 5,10, 10,20, 20,40, 30,60 y 40,80 ng \mul^{-1}. Se
inyectaron dos replicados de cada una en el sistema de HPLC. Los
cromatogramas resultantes produjeron datos para las curvas patrón.
Los contenidos de triptolida y tripdiolida se calcularon y
expresaron por 100 mg del extracto seco (secado a 80ºC a un peso
constante).
El procedimiento de enriquecimiento y la
separación cromatográfica así como la selección de un patrón interno
son los tres problemas principales en análisis de HPLC de extractos
vegetales en bruto. Se investigaron muchos procedimientos de
enriquecimiento durante las fases preliminares de este estudio.
Éstos incluyeron diferentes absorbentes, tales como gel de sílice,
alúmina N, florisil, diol, aminopropil NH_{2}, cianopropil CN,
carbono activado y poliamida. Además, se ensayaron diferentes
sistemas disolvente. Se descubrió que el cartucho de alúmina B
Sep-Pak Plus era un método de purificación eficaz y
adecuado que implicaba la cantidad mínima de etapas. Se realizó
HPLC con una columna Nova-Pack C18 usando
acetonitrilo-agua como sistema de fase móvil. Esto
provocó una mejor separación de triptolida, tripdiolida y
acetofenona de otros componentes del vegetal que con el uso de
metanol-agua como fase móvil. Se empleó una longitud
de onda de detección de 214 nm a causa del anillo de lactona
\alpha,\beta-insaturada en las estructuras de
diterpeno. Se descubrió que la acetofenona era el patrón interno
más adecuado para la determinación de triptolida. A causa de la
interferencia de otros componentes, no fueron exitosos intentos de
usar un patrón interno en la determinación de tripdiolida. La Figura
30 ilustra el cromatograma de triptolida y acetofenona. Los tiempos
de retención de los dos compuestos fueron 11,35 min y 8,15 min
respectivamente. La Figura 31 muestra el cromatograma de
tripdiolida. El tiempo de retención fue 10,3 min.
La separación de triptolida, acetofenona y
tripdiolida de los extractos de TwHF por HPLC se consiguieron usando
el método descrito anteriormente. Este enfoque proporcionó una
buena recuperación cuantitativa y reproductible. La Figura 32
representa un cromatograma típico del extracto de la determinación
de triptolida después de la adición de acetofenona. Es evidente que
los otros componentes presentes en el extracto no alteraron el pico
del patrón interno. La Figura 33 muestra un cromatograma típico del
extracto para la determinación de tripdiolida.
La pureza del pico se ensayó recogiendo las
fracciones correspondientes a ambos compuestos y analizándolos por
HPLC en la misma columna usando metanol-agua (30:70)
como fase móvil y ajustando el caudal a 1,0 ml por minuto. Los
resultados indicaron que un componente único con los tiempos de
retención correspondientes a triptolida (5,1 min) o tripdiolida
(16,7 min) se habían aislado.
Se obtuvo un gráfico de calibración lineal para
triptolida representando la proporción del área del pico de
triptolida del patrón interno (y) frente a la cantidad de triptolida
(x, ng). La ecuación de regresión y el coeficiente de correlación
(r) fueron y = 0,025x - 0,049, r = 0,99999, n = 5. Se obtuvo el
gráfico de calibración lineal de tripdiolida representando el área
del pico de respuesta de tripdiolida (y) frente a la cantidad de
tripdiolida (x, ng). La ecuación de regresión y el coeficiente de
correlación fueron 6 = 744,2x - 2123, r = 0,9998, n = 7. El
intervalo de la curva de calibración fue de aproximadamente 18,3 ng
a aproximadamente 361,8 ng para triptolida y de aproximadamente
12,8 ng a aproximadamente 408,0 ng para tripdiolida.
El límite de detección se determinó a
concentraciones muy bajas usando el método descrito. Las cantidades
detectables de triptolida y tripdiolida fueron aproximadamente 4,77
\pm 0,66 ng (n = 4) y aproximadamente 9,05 \pm 0,66 ng (n = 3)
respectivamente.
Se realizó el ensayo de recuperación añadiendo
triptolida y tripdiolida puras al extracto y ensayando con el mismo
procedimiento descrito anteriormente. Las recuperaciones (media del
% \pm SD) de triptolida fue aproximadamente 98,34 \pm 1,54 (n =
4) y tripdiolida fue aproximadamente 95,85 \pm 1,49 (n = 4).
Los resultados del ensayo se representan en la
Tabla 25. Cada término es la media de dos inyecciones. Los
contenidos de triptolida y tripdiolida en aproximadamente 100 mg del
extracto de acetato de etilo de TwHF fueron aproximadamente 19,88 y
aproximadamente 9,58 \mug respectivamente.
Contenidos de triptolida y tripdiolida en el extracto de Tripterygium wilfordii Hook F. determinados por HPLC^{1} | |||
Diterpenos | Cantidad en determinaciones | Media \pm SD | Desviación típica relativa |
individuales (\mug por 100 mg | (%) | ||
de extracto) | |||
Triptolida | 18,45 20,90 | 19,88 \pm 1,04 n = 6 | 0,052 |
21,05, 18,95 | |||
19,82 20,12 | |||
Tripdiolida | 10,30 10,03 10,17 | 9,58 \pm 0,54 n = 15 | 0,056 |
9,64 9,72 10,14 | |||
10,14 9,51 9,12 | |||
8,75 8,98 9,01 | |||
8,98 9,11 10,06 | |||
^{1} \begin{minipage}[t]{145mm} Los valores de los experimentos individuales son las cantidades por 100 mg de extracto de acetato de etilo seco.\end{minipage} | |||
En resumen, este ejemplo proporciona un método
seguro, sensible y fiable para la determinación de triptolida y
tripdiolida en un extracto de TwHF. El pretratamiento de muestras
con el cartucho de alúmina B Sep-Pak antes de HPLC
representa un procedimiento de enriquecimiento rápido, simple y
eficaz con una recuperación muy satisfactoria de los compuestos. El
empleo exitoso del patrón interno mejoró enormemente la precisión y
reproducibilidad del ensayo de triptolida. La triptolida y
tripdiolida son dos de los compuestos diterpeno principales
contenidos en TwHF. Este estudio proporciona los primeros datos
cuantitativos acerca del contenido en tripdiolida en TwHF.
Combinado con la capacidad de analizar triptolida, el enfoque hace
posible evaluar la eficacia y toxicidad del extracto de TwHF y
controlar la calidad y seguridad de la preparación de este material
para ensayos clínicos y experimentos animales.
El presente ejemplo profético describe una
propiedad del extracto TwHF de impedir el metabolismo de
progesterona.
Se espera que el extracto o componentes del mismo
puedan unirse al receptor de progesterona ya que muchos compuestos
que se unen al receptor de glucocorticoides también se unen al
receptor de progesterona y por tanto se usan como un medio del
control de nacimiento y como un medio para interrumpir el embarazo.
Como se muestra en la Figura 29D, RU486 inhibe la producción de
PGE_{2} inducida por endotoxina por monocitos sanguíneos
periféricos humanos, sin embargo, no es tan eficaz como el extracto
de TwHF a concentraciones inferiores. El uso de preparaciones de
TwHF en seres humanos se proporciona en el Ejemplo 9.
El presente ejemplo detalla preparaciones
adecuadas de los extractos, tales como píldoras, comprimidos,
cápsulas, y similares que pueden prepararse y usarse en los diversos
aspectos de la invención.
El extracto de TwHF, o componentes purificados
del mismo, pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, con un
diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden
encerrarse en una cápsula de gelatina con cubierta dura o blanda, o
pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse
directamente con el alimento de la dieta. Para una administración
terapéutica oral, el extracto, o componentes del mismo, pueden
incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos,
comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones,
jarabes, obleas, y similares, ingeribles. Dichas composiciones y
preparaciones deben contener al menos un 0,1% de compuesto activo.
El porcentaje de las composiciones y preparaciones pueden, por
supuesto, variarse y pueden ser adecuadamente de entre
aproximadamente 2 a aproximadamente un 60% en peso de la unidad. La
cantidad de compuestos activos en dichas composiciones
terapéuticamente útiles es aproximadamente 30-120
mg, preferiblemente aproximadamente 60 mg, de modo que se obtenga
una dosificación adecuada.
Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y
similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante, como
goma de tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz, o gelatina;
excipientes, tales como fosfato dicálcico, un agente disgregante,
tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y
similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y un
agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina pueden
añadirse o un agente aromatizante, tal como menta, aceite de
gaulteria, o aroma de cereza. Cuando la forma unitaria de
dosificación es una cápsula, puede contener, además de materiales
del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes
diversos materiales distintos como recubrimientos o para modificar
de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por
ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con
laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener los
compuestos activos, sacarosa como agente edulcorante, metil y
propilparabenos como conservantes, un colorante y aromatizante, tal
como aroma de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material
usado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación
debe ser farmacéuticamente pura y sustancialmente no tóxica en las
cantidades empleadas. Además, el extracto, o componentes del mismo,
pueden incorporarse en preparación y formulaciones de liberación
sostenida.
El extracto, o componentes del mismo, referidos a
triptolida, tripdiolida o wilforonida seleccionados por las
actividades biológicas y moleculares descritas en este documento
también pueden administrarse por vía parenteral o intraperitoneal.
Las soluciones del compuesto activo purificado como base libre o
sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua
mezclado adecuadamente con un tensioactivo, tal como
hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse
en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y
en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas
preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de
microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso
inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y
polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o
dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma
debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que exista
facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de
fabricación y almacenamiento y debe estar conservada frente a la
acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y
hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión
que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo,
glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares),
mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez
apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un
recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de
partícula necesario en el caso de dispersión y por el uso de
tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede
conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por
ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y
similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes
isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción
prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse por el
uso en las composiciones de agentes retardantes de la absorción, por
ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan
incorporando el extracto, o componentes del mismo, en la cantidad
necesaria en el disolvente apropiado con diversos ingredientes
distintos enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por
esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se
preparan incorporando los diversos ingredientes activos
esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de
dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los
enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la
preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos
preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y secado
por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más
cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada
previamente estéril del mismo.
El presente ejemplo proporciona ensayos para
explorar sustancias candidatas para la actividad de unión al
receptor de glucocorticoides siendo inactivas para la inducción de
genes sensibles a esteroides. Aunque TwHF, y componentes del mismo,
han mostrado desde el primer momento en la presente descripción
unirse al receptor incluso en presencia de dexametasona; se ha
identificado un ensayo para identificar otras sustancias de unión al
receptor de glucocorticoides usando TwHF, o una fracción/componente
activa del receptor del mismo. A modo de ejemplo, se incuba una
sustancia candidata con el receptor de glucocorticoides en presencia
de TwHF, o un componente de unión al receptor del mismo, y se
seleccionarían sustancias que compiten con TwHF, o un componente del
mismo, para el receptor. Se contempla que esta técnica de
exploración resultará útil en la identificación general de un
compuesto o mezcla de compuestos que tengan actividad de unión para
el receptor de glucocorticoides. En otras realizaciones del método,
la sustancia candidata se explorará adicionalmente para determinar
si es capaz de inhibir la activación de genes dependientes de
esteroides, usando el TwHF como patrón.
Otra realización de la presente invención es un
método para determinar la capacidad de una sustancia candidata de
unirse al receptor de glucocorticoides en, por ejemplo, un ensayo de
unión competitivo en presencia de preparación de TwHF, o componentes
de unión al receptor de glucocorticoides farmacológicamente activos
del mismo. Por ejemplo, el método, en algunas realizaciones, incluye
en líneas generales las etapas de obtener una preparación del
receptor de glucocorticoides, mezclar una sustancia candidata con la
preparación del receptor de glucocorticoides en presencia de
preparación de TwHF o un componente farmacológicamente activo de la
misma que se une al receptor de glucocorticoides, y determinar la
capacidad de la sustancia candidata de unirse al receptor de
glucocorticoides en presencia del TwHF, o componente
farmacológicamente activo del mismo.
Naturalmente, se mediría o determinaría la unión
de la composición de TwHF o componente de la composición, en
ausencia de la sustancia candidata añadida en un estudio control
separado. También se añadiría la sustancia candidata y la
preparación de TwHF junto con una preparación de receptor y se
determinaría la capacidad de la sustancia candidata de competir con
el TwHF para la unión del receptor. Una sustancia candidata que
reduce la unión de la preparación de TwHF al receptor con relación a
la unión en su ausencia es un indicio de una sustancia candidata con
capacidad de unión al receptor de glucocorticoides.
Por consiguiente, en ensayos de exploración para
identificar agentes farmacéuticos que se unen al receptor de
glucocorticoides, se propone que los compuestos aislados de fuentes
naturales tales como vegetales, animales o incluso fuentes tales
como marina, forestal o muestras de tierra, pueden ensayarse para la
presencia de agentes farmacéuticos potencialmente útiles. Se
entenderá que los agentes farmacéuticos a explorar también podrían
obtenerse de composiciones químicas o compuestos fabricados por el
hombre. Los compuestos activos pueden incluir fragmentos o partes de
compuestos de origen natural o pueden encontrarse sólo como
combinaciones activas de compuestos conocidos que son inactivos de
otro modo.
Cualquier método puede emplearse en líneas
generales para determinar la unión del receptor de glucocorticoides.
Por ejemplo, usando los métodos del Ejemplo 15 para determinar la
cantidad de triptolida o tripdiolida no unida presente en una
fracción sobrenadante del ensayo anterior, sería posible determinar
la cantidad de unión por la sustancia candidata. Una muestra de
control incluiría una muestra donde sólo está presente TwHF.
Métodos adicionales serán aquellos en los que el
receptor de glucocorticoides incorpora o está conjugado a un
marcador, tal como un marcador enzimático, químico o radiomarcador,
o incorpora uno de los ligandos de un sistema de detección basado
en dos ligandos tal como sistema de avidina/biotina. Por facilidad y
seguridad, se prefiere el uso de marcadores enzimáticos, tales
como, por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, ureasa o
fosfatasa alcalina. En dichos casos, se emplearía un sustrato
indicador colorimétrico para proporcionar un medio detectable por
el ojo humano o por un espectrofotómetro.
Un especialista en la técnica después de la
lectura de la presente descripción se dará cuenta de que una
sustancia candidata que es capaz de unirse al receptor de
glucocorticoides en presencia de TwHF o al menos un componente del
mismo que tiene actividad farmacológica para la unión al receptor de
glucocorticoides, puede activar los genes sensibles a esteroides o
puede inhibir la activación de genes sensibles a esteroides. Un
ensayo que usa un gen informador bajo el control de regiones
reguladoras del receptor de glucocorticoides como el usado en el
Ejemplo 13 determinaría si se activan los genes sensibles a
esteroides, y también sirve para proporcionar un método para la
selección adicional entre sustancias candidatas para las que no
activan genes sensibles a esteroides.
Un ejemplo de una preparación de receptor de
glucocorticoides es una preparación de fibroblastos humanos. Un
ejemplo de región reguladora de GR son los elementos inducibles por
GR de la repetición larga terminal MMTV. Un ejemplo de un gen
informador es el gen de la luciferasa, o el gen CAT (cloranfenicol
acetiltransferasa).
Como se usa en este documento, "vehículo
farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los
disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes
antibacterianos y atifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de
la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para
sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica.
Excepto en la medida en la que cualquier medio convencional o agente
es compatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las
composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes
activos suplementarios en las composiciones.
Ensayo para nitrito: El contenido en nitrito en
muestras diluidas duplicadas se midió añadiendo 100 \mul de
reactivo de Griess recién preparado a 100 \mul de las muestras en
placas de 96 pocillos y leyendo la OD a 540 nm. La concentración de
nitrito se determinó por comparación con las curvas de OD de
diluciones en serie de nitrito sódico. La concentración detectable
mínima fue 1,6 \muM.
Determinación de TNF-\alpha: Se
midió TNF-\alpha por citotoxicidad de fibroblastos
L929 murinos. Brevemente, se incubaron 7 x 10^{4} células
L929/pocillo en medio completo en placas de microcultivo de 96
pocillos durante 3 horas. Después se cargaron 100 \mul de patrones
TNF-\alpha/pocillo o diluciones de la muestra, se
añadieron 50 ml de cicloheximida a 0,3 mg/ml en cada pocillo. Las
células se cultivaron durante 18 horas. Las placas se tiñeron con
cristal de violeta al 0,5% en metanol/solución salina normal 1:4 y
se leyó la OD a 540 nm.
Los siguientes ejemplos se incluyeron para
demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Debe
apreciarse por los especialistas en la técnica que las técnicas
descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas
descubiertas que funcionan bien en la práctica de la presente
invención, y por tanto, puede considerarse que constituyen modos
preferidos para su práctica. Sin embargo, los especialistas en la
técnica, deben, a la luz de la presente descripción, apreciar que
pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones específicas que
se describen y seguir obteniendo un resultado parecido o similar sin
alejarse del espíritu y alcance de la invención.
Se inscribieron trece pacientes con RA activa en
un ensayo de aumento de dosis en Fase I, de un extracto de acetato
de etilo de Tripteryglum wilfordii Hook F. Se han establecido
la seguridad y efectos inmunosupresores de este extracto por
estudios in vitro e in vivo. Dos hombres y 11 mujeres
con una edad media de 55,2 años se inscribieron. La duración de la
enfermedad fue 10,6 años, el 92% eran RF + y colectivamente tenían
una media de 3,2 DMARD. Continuaron con dosis estables de NSAID (11
pts) y prednisona \leq7,5 mg/d (8 pts). Todos cumplieron los
criterios ACR para RA y demostraron enfermedad activa.
Los pacientes recibieron uno de los tres
regímenes de dosificación: 30 mg, 60 mg y 120 mg al día (durante 8
semanas cada uno) (n = 5); 60, 120 y 180 mg al día (n = 2); o 120,
180 y 240 mg al día (n = 6). Después las dosis se aumentaron
mensualmente hasta que se consiguieron las dosis máximas (570 mg).
Los pacientes se evaluaron cada mes para la seguridad, y la eficacia
clínica se evaluó usando los criterios de Paulus modificados en un
20%. Se retiraron cuatro pacientes antes de recibir 180 mg/d por
ausencia de eficacia, falta de aceptación u otra enfermedad. Nueve
pacientes recibieron una media de 59,1 semanas (intervalo:
40-96) de terapia. Se vieron respuestas clínicas
significativas a dosis \geq180 mg/d y fueron máximas con dosis más
altas y mayor duración de la terapia. Las disminuciones
significativas (p <0,01) en ESR, CRP y suero RF también se
observaron \geq180 mg/d. Se muestran las respuestas dependientes
de dosis:
mg/d 30 60 120 150 180 210 240 270 300 390 480
570 390
Respuesta 2/5 0/6 1/11 1/3 6/10 2/2 7/9 3/6 8/9
8/9 8/9 8/9 8/8. La duración de respuesta se evaluó mensualmente
después del cese de la terapia: 9/9, 8/9 y 4/8 continuaron siendo
sensibles después de 1, 2 y 3 meses. Los sucesos adversos incluyeron
dispepsia, hipertensión, diarrea, y náuseas. La hipertensión fue la
más habitual a 570 mg/d. Estos datos demuestran que la
administración crónica de este extracto es segura y una terapia
eficaz en RA, especialmente a dosis \geq180 mg/d.
El presente ejemplo demuestra el efecto de un
extracto de metanol/cloroformo (T2) de (TWH) y sus componentes
activos en la producción de PGE in vitro por células humanas
de diversos tipos, incluyendo monocitos sanguíneos periféricos,
fibroblastos sinoviales RA y la línea celular histiocítica U937.
T2 y sus componentes activos, triptolida y
tripdiolida, inhibieron la producción de PGE2 por monocitos
estimulados con LPS. Esto reflejó la supresión marcada de la
inducción de ARN para ciclooxigenasa-2
(COX-2). Por el contrario, T2, y tripdiolida
tuvieron efecto sobre la producción de PGE2 por células U937
activadas con LPS que no expresan COX-2. LPS también
estimuló fibroblastos sinoviales RA para producir
COX-2 y aumentar la producción de PGE2, ambas
cuales se inhibieron significativamente por T2. T2 regula
negativamente la producción de PGE2 inhibiendo la inducción de la
expresión de COX-2. Esto puede contribuir a su
capacidad de suprimir enfermedades autoinmunes e inflamatorias.
Se preparó un extracto de TWH por extracción
secuencial de raíces de la planta con etanol y acetato de etilo.
Este extracto ejerció acción inmunosupresora in vitro tanto
en células T como en células B.
Para demostrar que este extracto ejercía efecto
terapéutico en un modelo animal de artritis reactiva, se realizó un
estudio en ratas transgénicas HLA B27 con enfermedad articular
inflamatoria y gastrointestinal. Los animales se dividieron
aleatoriamente en tres grupos y se trataron durante 4 semanas con
vehículo sólo o el extracto de TWH a 270 mg/kg o 450 mg/kg. Estas
dosis fueron comparables a 1/5 y 1/3 de las que provocan letalidad
aguda en el 50% de las ratas. Se observaron disminuciones
significativas en la hinchazón articular de la segunda semana del
ensayo en ambos grupos tratados con el extracto. Por el contrario,
se encontró un aumento en la hinchazón articular en animales
tratados con vehículo.
Se redujeron los niveles en plasma de nitrito e
IL-6 después del tratamiento con el extracto de TWH
en comparación con el grupo tratado con vehículo. Además, la
incorporación de [^{3}H]-timidina inducida por PHA
y la producción de IL-2 y la producción de
TNF\alpha, IL-6 y nitrito estimulada por
LPS+IL-1 por las células esplénicas de los animales
tratados con TWH fue significativamente inferior a la de las células
esplénicas de animales tratados con vehículo al final del
tratamiento. No se produjo diarrea por el tratamiento. Estos
resultados indican que el TWH suprimió la artritis en ratas
transgénicas HLA-B27 en virtud de sus acciones
anti-inflamatorias e inmunosupresoras, y demuestran
la utilidad del uso de TWH para el tratamiento de artritis en seres
humanos.
Se prepararon las bolsas de aire y se estimularon
con carragenano al 1% en los 2 grupos de animales como se describe
en "Materiales y Métodos". Los exudados se recogieron
cuidadosamente justo después de sacrificar a los animales. Se
contaron los glóbulos blancos con un contador coulter, se midieron
el contenido en PGE2, nitrito y TNF-\alpha de los
exudados con ELISA, reactivo de Griess y toxicidad de L929,
respectivamente. Los números son la media de cada grupo.
Concentración de PGE2 Y TNF-\alpha en el exudado de las bolsas de aire en ratas F344 tratadas con | ||||
vehículo o extracto EA | ||||
Tratamiento | ||||
Vehículo 7 | Extracto EA 7 | Ensayo t | Valor p | |
Número de | ||||
animales | ||||
Volumen del | 4,61 | 4,45 | ||
exudado (ml) | ||||
Recuento de | 18,95 | 7,42 | Vehículo/EA | 0,0003 |
glóbulos | ||||
blancos | ||||
(millones/ml) | ||||
Nitrito (\muM) | 39,41 | 19,74 | Vehículo/EA | 0,0178 |
PGE2 (ng/ml) | 22,02 | 5,78 | Vehículo/EA | 0,0046 |
Animales y régimen de tratamiento: Se dividieron
aleatoriamente ratas F344 macho en 2 grupos con 7 en cada grupo. El
extracto de acetato de etilo (EA) de Tripterygium Wilfordii
hook. F se disolvió en etanol al 10% que contenía Tween 20 al
10%. Los animales se trataron por una sonda diaria con vehículo solo
o el extracto EA a 270 mg/kg de peso corporal. El transcurso total
del tratamiento fue 5 días.
\newpage
Preparación de la bolsa de aire: Se produjeron
cavidades aéreas por inyección subcutánea de 20 ml de aire en el
área intracapsular de la espalda a intervalos de 2 días entre cada
inyección. Se inyectaron 2 ml de carragenano al 1% disuelto en
solución salina directamente en la bolsa el día después de la última
expansión con aire. Los animales se sacrificaron y se recogió el
tejido 16 h después de la estimulación con carragenano.
Reactivos: Se preparó el extracto EA extrayendo
las raíces de Tripterygium Wilfordii hook. F con etanol
seguido por acetato de etilo. El carragenano se adquirió de Sigma.
Se usó la línea celular de fibroblastos murinos L929 ADCC como diana
para citotoxicidad. Se adquirió el TNF-\alpha
recombinante humano de Genzyme (West Malling, Inglaterra). Se
adquirió el kit de ELISA para PGE2 de Amersham (Arlington,
Illinois). El reactivo de Griess se preparó mezclando volúmenes
iguales de naftilentilendiamina al 0,2% (Sigma) y sulfanilamida al
2% (Sigma) en ácido fosfórico al 5% (Sigma).
Cultivo celular para la síntesis de ADN de
linfocitos y producción de PGE2, TNF-\alpha y
nitrito: Se separaron las células del bazo o células del exudado de
las bolsas de aire del bazo o los exudados y se lavaron una vez con
solución salina normal. Las células se incubaron en
RPMI-1640 suplementado con suero de ternera fetal al
10%, penicilina G (200 unidades), gentamicina (10 \mug/ml) y
L-glutamina (0,3 mg/ml) en placas de cultivo de
microtitulación de 96 pocillos o 24 pocillos con o sin los estímulos
indicados para los periodos de tiempo indicados. Para la
determinación de la proliferación de linfocitos T, se añadió 1
\muCi de [^{3}H]-timidina al cultivo durante las
últimas 16 h. En los tiempos puntuales indicados, se recogieron los
sobrenadantes libres de células, se hicieron alícuotas y se
almacenaron a -20ºC hasta que se ensayaron.
Ensayo de PGE2: Se prepararon muestras para la
determinación de PGE2 como se describe por el fabricante del kit de
ensayo. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo de células
esplénicas o las células de exudado o el exudado o el homogeneizado
del tejido se extrajeron con etanol. Los extractos de etanol se
pasaron a través de una columna C18 y se eluyó PGE2 con acetato de
etilo. Los eluidos después se secaron en gas nitrógeno. El contenido
en PGE2 de la muestra se determinó usando el kit de ELISA como se
describe por el fabricante (Amersham).
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Lipsky et al.
Claims (4)
1. Un método para explorar una sustancia
candidata que tiene afinidad de unión por un receptor de
glucocorticoides que comprende:
mezclar una sustancia candidata con un receptor
de glucocorticoides en presencia de una preparación de raíz de
Trypterygium wilfordii Hook F (TwHF) o un componente de unión
al receptor de glucocorticoides de la misma; y
determinar la unión de la sustancia candidata al
receptor de glucocorticoides.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el
receptor de glucocorticoides es de una preparación de fibroblastos
de piel humana; en particular, en el que el componente de unión al
receptor de glucocorticoides es triptolida, tripdiolida o
wilforonida; en particular, en el que el receptor de
glucocorticoides está conjugado con un marcador, en particular, en
el que el marcador es un marcador enzimático, químico, o radiactivo;
en particular, en el que el receptor de glucocorticoides está
conjugado con avidina/biotina.
3. Un método para seleccionar una sustancia
adecuada para tratar inflamación o enfermedad inmune que
comprende:
mezclar una sustancia candidata con un receptor
de glucocorticoides en presencia de preparación de TwHF o un
componente de unión al receptor de glucocorticoides de la misma;
determinar la unión de la sustancia candidata al
receptor de glucocorticoides;
seleccionar una sustancia candidata que tiene
afinidad de unión por el receptor de glucocorticoides;
determinar la actividad de la sustancia candidata
seleccionada para inducir la expresión de un gen sensible a
esteroides; y
seleccionar la sustancia candidata que es
inactiva para inducir la expresión del gen sensible a
esteroides.
4. El método de la reivindicación 3, en el que el
componente de unión al receptor de glucocorticoides es triptolida,
tripdiolida o wilforonida; en particular, en el que la segunda etapa
de determinación se realiza usando una construcción de gen
informador bajo el control regulador de un elemento sensible a
esteroides, en particular, en el que el elemento sensible a
esteroides es de la repetición larga terminal MMTV, en particular,
en el que el gen informador es el gen de la luciferasa o el gen de
la cloranfenicol acetiltransferasa, en particular, en el que el
receptor de glucocorticoides es de una preparación de fibroblasto
cutáneo humano.
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