ES2252240T3 - Metodo de tamizaje para modulares de la estabilidad de los cromosomas dependientes de la metiltransferasa. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar un compuesto que altera la estabilidad cromosómica dependiente de la cromatina de orden superior en la mitosis y la meiosis, dicho método comprendiendo la incubación de un sustrato para una histona H3K9 metiltransferasa, en presencia de un donante de metilo, con una metiltransferasa que tiene actividad metiltransferasa como la histona H3K9 de Suv39h en presencia y en la ausencia de un compuesto de prueba y determinando si el compuesto de prueba modula la actividad metiltransferasa.

Description

Método de tamizaje para moduladores de la estabilidad de los cromosomas dependientes de la metiltransferasa.

La invención se refiere a un método para identificar compuestos que influencian la dinámica de los cromosomas en células eucariotas. En particular, la invención se refiere al tratamiento y prevención de condiciones humanas por modulación de la estabilidad cromosómica dependiente de la cromatina de orden superior durante la mitosis y meiosis.

La cromatina de orden superior es esencial para el control epigenético de genes y para la organización funcional de cromosomas. Las diferencias en la estructura de la cromatina de orden superior han sido asociadas con las distintas modificaciones covalentes de las colas de histona que regulan estados transcripcionales "on" o "off" (Grunstein, 1998; Turner, 1998; Strahl y Allis, 2000) e influencia la condensación y segregación de cromosomas (Karpen y Allshire, 1997; Wei et al., 1999).

Las histonas constituyen una familia de proteínas altamente conservada (H3, H4, H2A, H2B, H1) que son los mayores componentes de la estructura de la cromatina eucariota. Las histonas compactan el DNA genómico en unidades básicas repetidas, los nucleosomas. Además de la función de empaquetar DNA, se ha probado que las histonas son componentes integrales de la maquinaria molecular que regula la expresión génica.

Las modificaciones post-traduccionales del N-terminal de la histona, particularmente de H4 y H3, están bien documentadas y han sido funcionalmente caracterizadas como cambios en la acetilación (Grunstein, 1998; Turner, 1998; Strahi y Allis, 2000), fosforilación (Wei et al., 1999) y, más recientemente, metilación (Chen et al., 1999; Strahi et al., 1999). En contraste al gran número de acetiltransferasas de histonas (HAT) y desacetilasas de histonas (HDAC), solamente empiezan a ser identificados los genes que codifican las actividades enzimáticas que regulan la fosforilación (Sassone-Corsi et al. 1999; Hsu et al., 2000) o metilación (Chen et al., 1999) del N-terminal de la histona. Además, la interdependencia de las diferentes modificaciones de la cola de histonas para la integración del rendimiento transcripcional o de la organización de la cromatina de orden superior actualmente no se entiende.

En general, está incrementando la evidencia que la regulación de la proliferación celular normal y aberrante no solamente afecta a nivel transcripcional, sino que también está implicado un nivel más alto de regulación, p.ej. la organización de la estructura de la cromatina a través de la modificación de las moléculas de histona. La determinación de las proteínas y los mecanismos moleculares implicados en la modificación de histonas contribuirá a entender el programa de proliferación celular y arrojará luz sobre los mecanismos implicados en la proliferación aberrante que tiene lugar en la formación y progresión de tumores (Jacobson y Pillus, 1999).

Las cribas genéticas para supresores de la variegación o efecto de posición (PEV) en Drosophila (Reuter y Spierer, 1992) y S. pombe (Allshire et al., 1995) han identificado una subfamilia de aproximadamente 30-40 locus que se refieren a los genes del grupo Su(var) (Wallrath, 1998). Interesantemente, varias desacetilasas de histona (De Rubertis et al., 1996), fosfatasas proteicas de tipo 1 (Baksa et al., 1993) y S-adenosil metionina sintetasa (Larsson et al., 1996) han sido clasificadas como Su(var)s.. Por el contrario, Su(var)2-5 (que es alélico a HP1) (Eissenberg et al., 1992), Su(var)3-7 (Cléard et al., 1997) y Su(var)3-9 (Tschiersch et al., 1994; Schotta y Reuter, 2000) codifican las proteínas asociadas a heterocromatina. Así la función genética de Su(var) sugiere un modelo, en que las modificaciones en el nivel nucleosomal puede iniciar la formación de subdominios cromosómicos definidos que luego se estabilizan y se propagan mediante las proteínas heterocromáticas SU(VAR) (Henikoff, 1997).

Su(var)3-9 es dominante sobre la mayoría de mutaciones modificadoras de la PEV (Tschiersch et al., 1994), y los mutantes en el correspondiente gen clr4 de S. pombe (Ivanova et al., 1998) interrumpen la asociación de la heterocromatina de otros factores modificadores y resultan en defectos de la segregación cromosómica (Ekwall et al., 1996). Recientemente, homólogos humanos (SUV39HI) y murinos (Suv39h1 y Suv39h2) Su(var)3-9 han sido aislados (Aagaard et al., 1999). Se ha mostrado que codifican las proteínas heterocromáticas que se asocian con HP1 de mamíferos (Aagaard et al., 1999). La familia de la proteína SU(VAR)3-9 combina dos de los dominios de "reguladores de cromatina" más evolucionadamente conservados: el dominio cromo (Aaslaand y Stewart, 1995; Koonin et al., 1995) y el SET (Tschiersch et al., 1994; Jenuwein et al., 1998). Mientras que los 60 aminoácidos del dominio cromo presentan plegamiento antiguo como en las histonas (Ball et al., 1997) que dirigen las localizaciones eu- o heterocromáticas (Platero et al., 1995), el papel molecular del dominio SET de 130 aminoácidos permanece enigmático. Estudios de sobreexpresión con mutantes humanos SUV39H1 indicaron una interferencia dominante con la organización de la cromatina de orden superior que, sorprendentemente, sugirió una relación funcional entre el dominio SET y la distribución de la histona H3 (Melcher et al., 2000) fosforilada (en la serina 10).

Es un objetivo de la invención ganar más entendimiento en las rutas moleculares que llevan a modificaciones de histonas y la organización de la cromatina de orden superior con el fin de aprovechar estos descubrimientos para interferir con la expresión aberrante de genes y la inestabilidad genómica a través de la mala segregación y así proporcionar nuevas terapias para el cáncer.

En particular, fue un objetivo de la invención investigar la función de miembros de la familia de la proteína SU(VAR)3-9 en vista a desarrollar nuevas estrategias para afectar la estabilidad de cromosomas dependientes de cromatina de orden superior. Tales estrategias pueden ser empleadas en terapias para el tratamiento de condiciones con la expresión genética aberrante e inestabilidad genómica a través de la mala segregación cromosómica que causalmente están implicadas. (El término "estabilidad cromosómica" implica la segregación exitosa de cromosomas resultantes en el mantenimiento de un cariotipo estable).

Los Ejemplos 1 a 7 de la presente invención muestran que proteínas relacionadas SU(VAR)3-9 de mamíferos (SUV39HI humana, Suv39h1 murina y Suv39h2 murina) son metiltransferasas de histona específicas para H3 dependiente de dominios SET que selectivamente metilan la lisina 9 ("K9") del N-terminal de H3. La metilación de K9 regula negativamente la fosforilación de la serina 10 adyacente y, revela un "código de histona" que aparece intrínsicamente unida a la organización de la cromatina de orden superior. (A continuación, las metiltransferasas de histonas se llaman "HMTasas" o, más generalmente, "MTasas").

Tras haber identificado Suv39h1 y Suv39h2 como metiltransferasas de histona específicas de la lisina 9 de la histona H3 de mamíferos (Suv39h HMTasas), se mostró que estas HMTasas son enzimas ricas en heterocromatina que transitoriamente se acumulan en los centrómeros durante la mitosis (Aagaard et al., 1999; Aagaard et al.,(2000). Además, se mostró que la metilación de la histona H3 en la lisina 9 (H3-K9) crea un sitio de unión de alta afinidad para proteínas HP1 (Lachner et al., 2001; Bannister et al., (2001), de ese modo definiendo el sistema de metilación SUV39H1-HP1 como un mecanismo regulatorio crucial para el ensamblaje y propagación de heterocromatina (Jenuwein, 2001). La sobreexpresión de SUV39H1 humana induce heterocromatina ectópica y resulta en la mala segregación en líneas celulares de mamíferos (Melcher et al., 2000). Además de las funciones mitóticas esenciales descritas antes, la heterocromatina también es crucial para la reorganización dinámica de cromosomas meióticos. La meiosis se inicia mediante movimientos cromosómicos desde el lumen nuclear a la membrana nuclear, donde los cromosomas se agrupan a través de sus secuencias satélite pericéntricas (Hawley et al., 1992; Scherthan et al., 1996). En la profase meiótica, los cromosomas condensan, seguido por el emparejamiento homólogo y la recombinación (en el paquiteno) entre cromosomas maternos y paternos. El comienzo de las divisiones meióticas está precedido por desinapsis, más condensación cromosómica y fosforilación de la histona H3 en la heterocromatina pericéntrica (Cobb et al., 1999). En particular para células germinales de machos, el contenido genómico haploide finalmente se organiza en un bloque heterocromático en espermátides de elongación. En Drosophila, la heterocromatinay sus secuencias satélite asociadas han sido propuestas para asistir en los movimientos iniciales meióticos de los cromosomas en el emparedamiento homólogo orientando los cromosomas a lo largo de una estructura de orden superior similar (Hawley et al., 1992; Karpen et al., 1996; Dernburg et al., 1996b). En células germinales de mamíferos, un punto de control del paquiteno (de Vries et al.,1999) controla cromosomas desalineados y desaparejados y detiene células en la profase meiótica, previniendo así la producción de los gametos aneuploides.

Un objetivo más de la invención para analizar el papel de Suv39hl y Suv39h2 en el desarrollo embrionario y en la espermatogénesis en vista de utilizar estas proteínas como dianas farmacológicas para condiciones que implican fertilidad, en particular la fertilidad masculina.

Para resolver los problemas asociados a la presente invención, en un primer paso se aplicaron técnicas bioinformáticas. Usando los dominios SET de la familia de la proteína SU(VAR)3-9 como un alineamiento inicial, se encontraron la secuencia significativa y similitudes de la estructura secundaria (ver Métodos) a seis metiltransferasas proteicas de planta.

Para investigar si el dominio SET de SUV39H1 humano tiene actividad enzimática, se probaron histonas como posibles sustratos para la metilación in vitro. Los resultados obtenidos demuestran que SUV39H1 esconde una actividad intrínseca metiltransferasa de histona y sugiere que esta actividad HMTasa reside en el C-terminal del dominio
SET.

Usando proteínas recombinantes, GST-Suv39h1(82-412) murina y la correspondiente proteína de fusión SUV39H1 humana [GST-SUV39H1(82-412)] mostraron ser catalíticamente activas. Se introdujeron pequeñas deleciones internas en las dos regiones conservadas del núcleo del dominio SET en GST-SUV39H11(82-412), y se generaron mutantes adicionales que les falta la cola C-terminal (cola-AC) o la región rica en cisteínas asociada a SET (\ding{115}cys). Todas las proteínas mutantes fallaron al demostrar la actividad HMTasa.

A pesar de estos resultados que sugieren una contribución significativa por las regiones ricas en cisteínas, su ausencia aparente en las metiltransferasas de plantas no evita la actividad catalítica. Para investigar la función enzimática del dominio SET con más detalle, se introdujeron mutaciones puntuales en los motivos más altamente conservados. Los ensayos de la HMTasa in vitro indicaron que todas las mutaciones puntuales, con la excepción de una, abolieron la actividad enzimática. Sorprendentemente, la última mutación resultó en un enzima multiactivo con la actividad aproximadamente multiplicada por 20. Los datos obtenidos definen el motivo _{320}H\phi\phiNHSC_{326} en el dominio SET como un sitio catalítico importante.

Ya que el dominio SET es uno de los motivos proteicos más conservados en los reguladores de la cromatina (Stassen et al., 1995; Jenuwein et al., 1998), luego se analizaron si los miembros de la familia SU(VAR)3-9 u otras proteínas del dominio SET contienen actividad HMTasa. Se generaron los productos de fusión GST de los dominios extendidos SET de CLR4 de S. pombe (Ivanova et al., 1998), EZH2 humano (Laible et al., 1997) yHRX humano(Tkachuk et al., 1992) que correspondían a GST-SUV39H1 (82-412). Interesantemente, GST-CLR4(127-490) mostró actividad HMTasa pronunciada a niveles incrementados de tres a cinco veces más comparado con el producto SUV39H1 recombinante, consistente con CLR4 que lleva una arginina en la posición hiperactiva. Los resultados obtenidos de este análisis muestran, de acuerdo con el análisis mutacional de SUV39HI, que la actividad HMTasa hacia histonas libres parece requerir la combinación del dominio SET con regiones ricas en cisteínas adyacentes, que es un descubrimiento de calidad solamente en un número restringido de dominios SET de proteínas que los contienen.

Estos experimentos indicaron que la actividad HMTasa de las proteínas relacionadas de SU(VAR)3-9 de mamíferos es selectiva para la histona H3 bajo condiciones de ensayo escogidas. Para examinar este descubrimiento con más detalle, las reacciones de metilación in vitro se realizaron con histonas individuales. Se podrá demostrar que H3 es específicamente metilada mediante GST-Suv39h1 (82-412), mientras que no se detectaron señales con H2A, H2B o H4. La metilación de H3 se ha demostrado que tiene lugar predominantemente en la lisina 4 en un amplio rango de organismos, así como en la lisina 9 en células HeLa, aunque la(s) HMTasa(s) tiene(n) que ser definidas aun (Strahl et al., 1999). Para investigar el perfil de utilización del sitio de Suv39h1, se probaron péptidos no modificados que comprenden el N-terminal de H3 de tipo salvaje y un péptido mutante K9L como sustratos. Adicionalmente, se incluyeron insulina y péptidos que comprenden el N-terminal de CENP-A (Sullivan et al., 1994), macroH2A (Pehrson y Fried, 1992). Estos ensayos in vitro revelaron la metilación selectiva del péptido H3 de tipo salvaje. Los datos obtenidos también sugieren que el N-terminal de H3 es un residuo preferido para la actividad HMTasa dependiente de Suv39h1.

Para determinar más definitivamente esta preferencia de sitio, el péptido N-terminal de H3 se metiló in vitro mediante GST-Suv39h1(82-412), usando S-adenosil-[metil-^{3}H]-L-metionina. El péptido marcado, purificado por HPLC de fase reversa, entonces se microsecuenció directamente, y se analizó la incorporación de ^{3}H asociada con cada aminoácido individual. Los resultados confirmaron la transferencia selectiva de la marca metilo en la lisina 9, demostrando que Suv39h1 es una HMTasa altamente específica de sitio para el N-terminal de H3 in vitro.

Los genes Suv39h murinos están codificados por 2 loci Suv39h1 y Suv39h2. Para investigar la importancia in vivo de la función de Suv39h y Suv39h dependiente de metilación K9 de H3, se generaron variedades de ratón deficientes de ambos Suv39h1 y Suv39h2. Las variedades deficientes de Suv39h1 y Suv39h2 se cruzaron para producir ratones dobles deficientes en Suv39h. Los ratones dobles mutantes nacieron en proporciones sub-Mendelianas. Algunos embriones dobles nulos mostraron retrasos en el crecimiento severos y exencefalía. Además los mutantes dobles supervivientes tuvieron retraso en el crecimiento, sugiriendo el papel para Suv39h en la proliferación celular.

Con el fin de determinar si los fenotipos embrionarios en ratones Suv39h no viables pueden ser atribuidos a defectos mitóticos, se analizaron PMEF (fibroblastos primarios embrionarios de ratón) derivados a partir de ratones dobles Suv39h. PMEF de Suv39h dobles nulos muestran un índice G1 reducido y una proporción incrementada de células con morfologías nucleares aberrantes, reminiscentes de defectos de división durante la mitosis. Además, células dobles no viables también muestran inestabilidades genómicas e inmediatamente pasan a ser aneuploides. La severidad de este incremento de aneuploidías aumenta cuanto mayor número de pasadas. La incapacidad de células Suv39h dobles nulas para mantener un cariotipo estable pueden subyacer el fenotipo embrionario Suv39h.

La fosforilación en la serina 10 (phosH3) en el extremo N-terminal de H3 se ha demostrado que requiere condensación y subsiguiente segregación de cromosomas(Wei et al., 1999). Durante el ciclo celular, la phosH3 se inicia en la heterocromatina pericéntrica en la G2 tardía entonces progresa a lo largo de todos los cromosomas durante la mitosis (Hendzel et al., 1997). Se encontró que en los PMEF de tipo salvaje, aproximadamente el 7% de las células positivas se tiñeron para la característica, foci phosH3 asociada a heterocromatina. En contraste, este número aumenta en un factor de alrededor 3 veces más en PMEF de Suv39h doble nulo. Este resultado sugiere que los niveles globales de phosH3 pueden ser potenciados en PMEF de Suv39h doble nulo. Esto fue confirmado bioquímicamente. Juntos, los datos obtenidos son más consistentes con un modelo en el que la metilación mediada por Suv39h de la Lisina 9 en H3 regula negativamente la fosforilación de la serina 10.

Juntos, estos datos demuestran claramente papeles cruciales para Suv39h durante la división celular. La pérdida de la función Suv39h perjudica la metilación K9 de la histona H3 e induce la división celular defectuosa resultando en inestabilidades del genoma. La inestabilidad/defectos de la segregación subyace a la etiología de algunos cánceres humanos (Lengauer et al., 1997) y a menudo son un pre-requisito para la progresión tumoral. Estas observaciones hacen a Suv39h un candidato excelente para nuevas aproximaciones terapéuticas para terapias tumorales.

Además, un conjunto de experimentos de la presente invención proporcionan evidencias in vivo de que la ausencia de las actividades HMTasa de Suv39h altera el desarrollo y la viabilidad de ratones mutantes, y se correlaciona directamente con una falta casi completa de la metilación K9-H3 en la heterocromatina pericéntrica. Notablemente, los ratones deficientes de Suv39h muestran inestabilidades cromosómicas en ambas células somáticas y meióticas que además se evidencian mediante un riesgo incrementado para el desarrollo de linfomas de células B e interacciones de cromosomas perturbados durante la meiosis masculina. Estos datos in vivo indican un papel fundamental para la metilación K9-H3 en la heterocromatina pericéntrica y sugieren que las HMTasas de Suv39h regulan una "competencia heterocromática" que protege la estabilidad del cromosoma durante la mitosis y meiosis.

Las interrupciones genéticas simples para cualquiera de Suv39h9 o Suv39h2 permiten un desarrollo normal del ratón y no parecen afectar a la viabilidad y fertilidad del ratón mutante. Esta redundancia aparente en la función génica sería considerada con el perfil de expresión solapante de los dos genes de Suv39h durante la embriogénesis de ratón (O'Carroll et al., 2000). Por lo contrario, la interrupción combinada de ambos genes de ratones dobles nulos Suv39h (dn) resulta en viabilidad perinatal severamente alterada (=33%; Tabla 1), retraso del crecimiento e hipogonadismo en machos. Ambos machos dn Suv39h son infértiles.

Aunque los fetos dn Suv39h parecen desarrollarse normalmente hasta el día E12.5, luego muestran tamaños corporales más pequeños y frecuentemente son resorbidos durante la gestación tardía. Estos análisis in vivo indican
un(os) papel(es) importante(s) para los genes Suv39h durante el desarrollo de mamíferos y para la viabilidad global. Puesto que la ausencia de las actividades HMTasa de Suv39h induce inestabilidades genómicas, la alta letalidad de los fetos dn Suv39h podría ser principalmente una consecuencia de la segregación de cromosomas perturbados que perjudicarían significativamente los programas de proliferación y diferenciación del embrión en desarrollo.

Aunque los enzimas Suv39h son las mayores HMTasas para la metilación K9-H3 en la heterocromatina pericéntrica en células somáticas (ver Figura 12) y en las primeras células meióticas (ver Figura 13B), hay 15 únicas secuencias de genes en el genoma de ratón que contienen el dominio SET más altamente conservado en la evolución que son como para codificar enzimas adicionales con supuesta actividad HMTasa (Jenuwein, 2001). Al menos uno de esos dominios SET que contienen proteínas pueden necesitar también metilar la H3 en la lisina (Tachibana et al., 2001). Así, el \approx 33%
de viabilidad de ratón dn Suv39h podría ser dependiente de la actividad compensatoria de otras HMTasas que se pueden expresar en diferentes grados según la mezcla genética, en los que se han analizado los ratones dn Suv39h.

La ausencia de actividades HMTasa de Suv39h provoca inestabilidades genómicas en una variedad de tipos celulares, incluyendo fibroblastos embrionarios de ratón (PMEF) (ver Figura 10), hígado fetal y células de la médula ósea y en espermatogonia (ver Figura 14C). De acuerdo con las aneuploidías observadas en estos sistemas celulares, los ratones deficientes de Suv39h provocan un riesgo incrementado para tumorogénesis, resultando en linfomas de células B de activación tardía en \approx 33% de los ratones dn Suv39h (ver Figura 11). Los linfomas de células B también desarrollan bajo dosis de genes Suv39h reducida en ratones mutantes compuestos que contienen interrupciones de Suv39hl (ver Tabla II). De forma intrigante, las aneuploidías inducidas por Suv39h caracterizadas por el fallo de segregación del conjunto casi completo de los cromosomas, resultando en células hipo-tetraploides o incluso hipo-octaploides (ver Figura 10). Estos datos sugieren una insuficiencia general de segregación de cromosomas, consistentes con la falta de metilación K9-H3 alrededor de todos los centrómeros acrocéntricos en células dn Suv39h(ver Figura 12).

Distintas modificaciones del N-terminal de histona, tal como acetilación (Ekwall et al., 1997) y fosforilación (Wei et al., 1999) han mostrado que se requieren para la correcta segregación de cromosomas en S. pombe y Tetrahymena, presuntamente por inducción de una estructura de cromatina especializada pericéntrica que facilita el establecimiento de un centrómero funcional. A causa de que la metilación K9-H3 restringe la fosforilación de H3 mediada por la quinasa IpI1/aurora (Hsu et al., 2000) y también es interdependiente con la acetilación de la histona (Rea et al., 2000), la ausencia de actividades HMTasa de Suv39h es probable que perturbe este patrón distinto de modificación de histonas. Segundo, además de alterar disposiciones de nucleosomas, las modificaciones de histonas pueden generar afinidades de interacción de histonas para proteínas asociadas a la cromatina (Rice y Allis, 2001). A pesar de que la localización de los epítopos CENP aparece inalterada, el enriquecimiento heterocromático de las proteínas HP1 en gran parte está perdido en las células dn somáticas Suv39h (Lachner et al., 2001). Notablemente, HP1 interacciona in vitro con INCENP (Ainsztein et al., 1998) que forma un complejo con aurora-B (Adams et al., 2000; Kaitna et al., 2000). La mutación de INCENP induce varias anormalidades mitóticas incluyendo macronúcleos y puentes internucleares, y resulta en la mala segregación casi completa de cromosomas y el fallo de la citocinesis (Cutts et al., 1999; Adams et al., 2000; Kaitna et al., 2000). Estos intrigantes paralelos sugieren una posible unión in vivo entre la metilación K9-H3 mediada por Suv39h y la fosforilación dependiente de aurora-B, y podría categorizar los genes Suv39h como genes supresoresde tumores.

Las inestabilidades cromosómicas mediadas por Suv39h solamente afectan a una sub-población de células y no parecen provocar apoptosis pronunciada (ver Figura 10b), consistente con análisis similares de mutantes clr4 en S. pombe (Ekwall et al., 1996; Ivanova et al., 1998). Estos datos sugieren que los defectos inducidos por Suv39h en células somáticas no están bajo estricta vigilancia de los puntos críticos de control (Cortez y Elledge, 2000; por ver Bernard et al., 1998) y pueden estar causados también por problemas de segregación tardía durante la mitosis. Es más, una fracción de células dn Suv39h contiene cromosomas que se demoran en la anafase. Puesto que los PMEF de dn Suv39h se caracterizan por cariotipos hipo-tetraploides y hipo-octaploides (ver Figura 10d) y las células tumorales contienen cromosomas "mariposa" (ver Figura 11c), se propone un modelo (Figura 16, panel superior), en que la ausencia de metilación K9-H3 permitiría asociaciones pericéntricas más fuertes o más persistentes entre cromosomas alineados de la metafase. Aunque queda por determinar el papel de las HMTasas de Suv39h en la cohesión centromérica, se proporciona un mecanismo atractivo para explicar posibles fallos de la citocinesis y la mala segregación del complemento cromosómico entero sin activar puntos críticos de control conocidos.

En contraste con las células somáticas, los defectos mediados por Suv39h en la meiosis de machos inducen apoptosis pronunciada de espermatocitos en estado V - VI durante la transición desde el paquiteno medio hasta el tardío (ver Figura 13a). La activación de la muerte celular programada en este estado también se ha observado en mutantes de ratón que son dañados en el control del daño del DNA (Xu et al., 1996), la recombinación meiótica (Yoshida et al., 1998; de Vries et al., 1999; Baudat et al., 2000) y en la formación del complejo sinaptonémico (Yuan et al., 2000). En espermatocitos Suv39h dn, la metilación del H3-K9 pericéntrico se reduce específicamente en el estado del pre-leptoteno pero, sorprendentemente, parece una tinción salvaje durante las fases meióticas finales (ver Figura 13B, panel de abajo). Así, en analogía con las asociaciones centroméricas aumentadas antes discutidas, se propone que el daño en la metilación en el inicio de la meiosis induce a una aglomeración del centrómero aberrante que no puede ser ya "rescatada" por la actividad hipotética de las HMTasas H3-K9 adicionales durante el paquiteno medio. Este modelo (ver Figura 16, panel de abajo) caracterizaría la metilación de H3-K9 dependiente de Suv39h como uno de los requisitos primarios para asegurar una meiosis con éxito y evitar interacciones heterocromáticas ilegítimas. Puesto que las interacciones no homólogas tendrán como resultado una sinapsis retardada o incluso un fallo en la formación de parejas completa (ver Figura 14a), dispararán la apoptosis al activar el punto de control del paquiteno (de Vries et al., 1999), protegiendo así la línea germinal masculina de acumular aneuploidías.

En Suv39h dn de ratón, los fallos espermatogénicos vienen dados por interacciones cromosómicas ilegítimas, retraso sináptico, cromosomas sexuales no emparejados y mala segregación en la meiosis 1 (ver Figuras 14-15). Resulta notable que la mayor fracción de estas interacciones "prohibidas" comprenda contactos físicos entre los cromosomas sexuales y los autosomas que son mediadas en gran parte mediante las regiones centroméricas (ver Figura 14D y 14J). Estos datos sugieren que los daños en la metilación H3-K9 pueden permitir que la heterocromatina pericéntrica forme configuraciones más relajadas, que son propensas a unirse en asociaciones aleatorias. Estudios citológicos y genéticos con Drosophila demostraron el potencial intrínseco de la heterocromatina para restringir las interacciones inter- e intracromosómicas (Dernbrug et al., 1996a; Csink y Henikoff, 1996). Además, la heterocromatina pericéntrica ha demostrado ser iniciadora y mantenedora del alineamiento y emparejamiento de cromosomas aquiasmáticos hasta la fase de meiosis 1 (Karpen et al., 1996; Dernburg et al., 1996b), lo que sugiere un papel de la heterocromatina en la definición de estructuras cromosómicas de orden superior "auto-complementarias" que asegurarían el reconocimiento por parejas de cromosomas homólogos (Karpen et al., 1996). Los datos in vivo sobre la función de las HMTasas Suv39h serían coherentes con estos papeles propuestos para la heterocromatina y revelarían las primeras pruebas de que la definición no alterada de heterocromatina meiótica puede afectar a la identidad cromosómica en un organismo mamífero.

Finalmente, la deficiencia de Suv39h induce a una univalencia de los cromosomas sexuales en las fases del paquiteno y diacinesis (ver Figura 15). Resulta intrigante que HP1\beta (Motzkus et al., 1999; Turner et al., 2000) y la HMTasa Suv39h2 (O'Carroll et al., 2000) localicen la estructura de cromatina especializada de los cromosomas sexuales en el cuerpo XY. Aunque la formación del cuerpo XY parece normal en el paquiteno temprano/medio de los espermatocitos Suv39h dn, la deficiencia de Suv39h prolonga la metilación de H3-K9 (ver las flechas en la Figura 13B) e induce a la hipocondensación del cromosoma Y (ver Figura 15E). Estos resultados incluyen las actividades HMTasa Suv39h en la definición de la identidad heterocromática del cromosoma Y y sugieren que la metilación de H3-K9 mediada por Suv39h puede indirectamente promover o estabilizar el emparejamiento de homólogos de los cromosomas sexuales heteromórficos.

La heterocromatina se describió por primera vez hace más de 70 años (Heitz, 1928). Debido a su apariencia estable en el núcleo celular, se ha propuesto que sirva para funciones cruciales para la herencia de identidades de tipo celular y la fidelidad de segregación cromosómica. Los descubrimientos de las primeras HMTasas (Rea et al., 2000; O'Carroll et al., 2000) y sus uniones mecánicas para generar una afinidad heterocromática mediante la metilación de H3-K9 y el agrupamiento de proteínas HP1 (Lachner et al., 2001; Bannister et al., 2001; Nakayama et al., 2001) ha definido actualmente un punto de entrada para iniciar una disección de algunos de los papeles básicos de la heterocromatina.

Los experimentos de la presente invención han proporcionado pruebas in vivo de que la metilación de H3-K9 en la heterocromatina pericéntrica es, de hecho, un requisito crucial para asegurar el desarrollo del mamífero y para proteger la estabilidad cromosómica tanto en células somáticas como en células germinales masculinas. Puesto que la deficiencia de Suv39h deteriora la función cromosómica en la mitosis y meiosis, los datos asignan un papel fundamental a la metilación de H3-K9 en dirigir una "competencia heterocromática" para la dinámica cromosómica general e identifican (y revelan) algunas de las funciones biológicas directas de la entidad enigmática llamada heterocromatina.

En un primer aspecto, los resultados obtenidos en los experimentos de la presente invención muestran que los miembros de la familia de proteínas SU(VAR)3-9 tienen actividad HMTasa que las identifica como dianas noveles para la terapia de trastornos proliferativos, concretamente el cáncer.

Además, los experimentos de la invención demuestran que las HMTasas Suv39h son importantes para el desarrollo embrionario y la espermatogénesis.

La disrupción combinada de los dos genes HMTasa Suv39h elimina la metilación H3-K9 en la heterocromatina pericéntrica e induce a inestabilidades cromosómicas con un riesgo aumentado de tumorogénesis.

Por otro lado, el Suv39h doble nulo de ratón macho muestra un fallo espermatogénico completo que está causado en gran medida por asociaciones no homólogas de cromosomas y sinapsis retardadas, dando como resultado la apoptosis de células en la profase meiótica. Conjuntamente, estos resultados establecen que la metilación de la histona H3-K9 como un determinante crucial para la heterocromatina pericéntrica y proporcionan un papel directo para las HMTasas Suv39h de mantenimiento de la "competencia heterocromática" que protege la estabilidad cromosómica durante la mitosis y meiosis.

La identificación de los miembros de la familia de proteínas SU(VAR) 3-9 ejemplificada por la Suv39H1 humana, la Suv39h1 murina y la Suv39h2 murina, como histonas H3 MTasas específicas de K9 es el pre-requisito para el diseño de métodos de ensayo que permitan encontrar compuestos que alteren, concretamente que interfieran con, la estabilidad cromosómica dependiente de la cromatina de orden superior, que es la base para nuevos enfoques en la terapia del cáncer. (En adelante, si no se especifica de otra forma, el término "Suv39h" se refiere tanto a la proteína murina como a la humana).

Debido al papel de Suv39h1 ó Suv39h2 en la espermatogénesis, los compuestos que modulan la actividad MTasa de estas proteínas y, por lo tanto, modulan la espermatogénesis, pueden también usarse en el tratamiento de infertilidad masculina (usando compuestos que mejoren la actividad MTasa Suv39h) y para la contracepción masculina reversible (usando compuestos que inhiban la actividad MTasa de Suv39h).

La presente invención se refiere a un método para identificar un compuesto que altera la estabilidad cromosómica dependiente de la cromatina de nivel superior durante la mitosis y meiosis, donde dicho método comprende la incubación de un sustrato para una metiltransferasa, en la presencia de un donador de metilo, con una metiltransferasa que tenga una histona H3-K9 metiltransferasa con una actividad parecida a la de Suv39h, en la presencia y ausencia de un compuesto de prueba y que determina si el compuesto modula la actividad MTasa.

En los experimentos de la presente invención, las variantes de Suv39h con mutaciones puntuales en el dominio SET se mostraron para conferir actividad hiperactiva HMTasa a la proteína. Estas variantes de Suv39h pueden ser usadas de forma ventajosa en el método de la invención.

En una realización preferida, la MTasa es Suv39h1 ó Suv39h2 de ratón, y preferentemente la MTasa es SUV39H1 ó SUV39H2 humana.

Puesto que se ha demostrado en la presente invención que la Suv39h recombinante retiene la actividad HMTasa, se utiliza más preferiblemente una MTasa recombinante. La Suv39h y las variantes de Suv39h pueden producirse recombinantemente de acuerdo con métodos estándar mediante la expresión en huéspedes adecuados, p.ej. bacterias, levaduras, insectos, o células eucariotas y purificadas, p.ej. columnas de glutationagarosa si se ha marcado con GST.

Las secuencias cDNA de Suv39h1 y SUV39H1 se saben a partir de la bibliografía (Aagaard et al., 1999), la secuencia cDNA de Suv39h2 cDNA se muestra en la ID de SEC Nº 1; el cDNA SUV39H2 humano se define por las EST como se muestra en la ID de SEC Nº 3 - 6.

En el caso de probar los efectos de los compuestos sobre la actividad Suv39h, el ensayo comprende, como características esenciales, la incubación de una proteína H3 histona o un fragmento N-terminal de H3 histona que incluya K9, un donador de metilo, p.ej. metionina o S-adenosil-L-metionina, con una preparación que tenga actividad MTasa Suv39h y la determinación de la actividad MTasa en presencia o ausencia de una sustancia de prueba.

Los sustratos MTasa útiles en el método de la invención pueden ser aquéllos equivalentes, o que imiten los sustratos que se dan naturalmente, p.ej. histona H3 purificada bioquímicamente, histona H3 producida recombinantemente, o un péptido de la histona H3 que contenga el sitio de metilación K9. Se puede identificar sustratos de Suv39h noveles mediante técnicas de bioinformática y bioquímica y evaluar usando ensayos bioquímicos descritos en los Ejemplos de la presente invención. Por ejemplo, los sustratos Suv39h noveles pueden identificarse por técnicas de co-inmunoprecipitación. Las proteínas Suv39h o las versiones marcadas de proteínas Suv39h pueden ser inmunoprecipitadas con antisuero específico y las proteínas que interactúen se pueden identificar por técnicas de espectroscopía de masa. También puede utilizarse un cribado de doble híbrido de levadura usando proteínas Suv39h o porciones de proteínas Suv39h como cebo útil para identificar proteínas noveles interactuando a partir de una gran variedad de bibliotecas de cDNA.

En una realización preferida, se usa el fragmento de histona H3 ARTKQTARKSTGGKAPRKQL (ID de SEC Nº 7). De forma alternativa, puede usarse un péptido modificado para el cual la afinidad/actividad MTasa se vea incrementada. Tales péptidos pueden diseñarse cambiando y/o añadiendo y/o eliminando aminoácidos y probando el sustrato en experimentos en serie para la afinidad/actividad MTasa.

El grupo metilo del donador de metilo lleva preferiblemente una etiqueta detectable, p.ej. una etiqueta radiactiva o cromogénica, que puede ser cuantificada por transferencia al sustrato.

Preferiblemente, el donador de metilo es una S-adenosil-L-metionina o una metionina marcada radiactivamente.

De forma alternativa al uso de un donador de metilo marcado, el sustrato, tras la metilación por el enzima, se usa para que sirva como epítopo que pueda ser reconocido por un anticuerpo específico y así pueda cuantificarse por técnicas estándar de inmunoensayos, p.ej. ELISA. Los anticuerpos útiles en este tipo de ensayo pueden obtenerse utilizando el sustrato metilado, preferiblemente un péptido pequeño, p.ej. el péptido con la secuencia mostrada en ID de SEC Nº 7, como un antígeno y obteniendo anticuerpos policlonales o monoclonales de acuerdo con las técnicas estándar. La generación y purificación de un anticuerpo específico de metilo contra la posición 9 de lisina de la histona H3 se describe en la sección de Materiales y Métodos. Se describe también un metilo H3-K9 adecuado en Nakayama et al., 2001.

Para aplicaciones a pequeña escala, el método de cribado puede basarse en un ensayo tal como se describe en el Ejemplo 2, 3 ó 4.

En una realización preferida, el método de cribado de la invención utiliza el hecho de que la metilación de la histona H3 en la lisina 9 (H3-K9) crea un sitio de unión de alta afinidad por las proteínas HP1. En esta realización, el sustrato, tras la metilación, se deja unir a HP1 y luego se incuba con un anticuerpo marcado anti-HP1. La diferencia en la intensidad de la marca entre la reacción en ausencia o presencia del compuesto de prueba es un indicativo del efecto modulador del compuesto sobre la actividad MTasa.

HP1 es preferiblemente usado en la forma recombinante. Basándose en la información de la secuencia de cDNA de HP1 (Jones et al., 2000; Nº de acceso B0006821), la HP1 se produce recombinantemente de acuerdo con la tecnología estándar. Las proteínas recombinantes o sus fragmentos se usan para generar anticuerpos policlonales o monoclonales que se utilizan en este formato de ensayo.

En una realización preferida, el método de la invención se lleva a cabo en una escala de alta capacidad. Para esta realización, los mayores componentes de ensayo, concretamente Suv39h, se usan en una forma recombinante.

Para el formato de alta capacidad, los métodos de cribado de la invención para identificar los inhibidores MTasa, se llevan a cabo de acuerdo con procedimientos de ensayo estándar. Tales ensayos se basan en la transferencia catalítica, mediada por Suv39h o una variante de Suv39h, de un grupo metilo de un donador a un sustrato, p.ej. un péptido de la histona H3. Para conseguir esto, el sustrato, p.ej. la histona H3 o una variante o fragmento de la misma, es inmovilizada en un vehículo, normalmente una placa microtitulada, e incubada con Suv39h recombinante o una variante de Suv39h y un donador de metilo.

El grupo metilo del donador de metilo lleva una marca, preferiblemente una marca cromogénica o radiactiva.

Las marcas fluorescentes o radiactivas y los otros reactivos para llevar a cabo la reacción enzimática a una escala de alta capacidad están disponibles comercialmente y pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del proveedor (p.ej. Molecular Probes, Wallac). Algunos ejemplos de marcas fluorescentes adecuadas son los derivados de cumarina, como la 7-amino-4-metilcumarina o la 7-amino-4-trifluorometilcumarina. La marca radiactiva puede ser un átomo ^{14}C o un ^{3}H. Tras la transferencia del grupo metilo al sustrato por Suv39h, en el caso de un reactivo cromogénico, el donador de metilo cambia de color, cosa que puede cuantificarse. En el caso de usar un donador de metilo radiactivo, el grupo metilo es transferido al sustrato y puede cuantificarse directamente.

El diseño del ensayo específico depende de varios parámetros, p.ej. del tamaño del sustrato usado. En el caso de usar un péptido corto, los métodos de transferencia de energía por desactivación de fluorescencia o por resonancia de fluorescencia son ejemplos de tecnologías de ensayo adecuadas, como se describe posteriormente.

El sustrato puede marcarse, p.ej. con biotina. La reacción se lleva a cabo luego en solución y posteriormente es transferida a placas microtituladas recubiertas con estreptavidina, p.ej. en el caso de grupos metilo radiactivos, las placas "flash", cuyos materiales contienen el centelleante, o placas que estén recubiertas con centelleante. De esta manera, el nivel de metilación del sustrato puede cuantificarse en una máquina/lector de centelleo adecuado. De forma alternativa, el ensayo puede realizarse en las placas "flash" recubiertas con estreptavidina con el sustrato biotinilado ya unido a las placas. Este tipo de ensayo puede realizarse también en la forma del llamado "ensayo homogéneo" (un tipo de ensayo que no requiere transferencia inmediata y pasos de lavado) p.ej. usando microcuentas que estén recubiertas con un producto centelleante y estreptavidina, a la que se une el sustrato biotinilado.

De forma similar a la biotina, otras marcas comúnmente utilizadas, como Flag, Myc, HA, GST, que son adecuadas para la inmovilización del sustrato a la placa que está recubierta con anticuerpo específico de la marca, pueden usarse en los ensayos antes descritos.

En una variante, este ensayo se realiza en el tipo de ensayo con formato ELISA. En este caso, un anticuerpo específico para metilo se usa para detectar la cantidad de sustrato metilado unido a la placa.

Alternativamente, la placa está recubierta con un anticuerpo contra el sustrato metilado para capturar el sustrato metilado: el sustrato está también marcado o etiquetado cromogénicamente y la cantidad de sustrato metilado marcado ligado puede cuantificarse o bien mediante un anticuerpo específico para la marca o bien midiendo el nivel de marca cromogénica. A modo de ejemplo, el sustrato es un péptido lineal o ramificado, como [TARKST]_{4}-K_{2}-K-cys que lleva una marca cromogénica, p.ej. europio, y tras la metilación por una MTasa del estilo de Suv39h, se convierte en un epítopo para el anticuerpo específico de Lys9-metilo (ver materiales y métodos) inmovilizado sobre un vehículo (p.ej. placa microtitulada). El sustrato no capturado se lava, la marca de europio se rompe y su fluorescencia se ve potenciada. El nivel de fluorescencia se calcula por fluorescencia de resolución temporal. El nivel de fluorescencia está directamente relacionado con el nivel de sustrato metilado (Figura 17).

Una realización alternativa se basa en el principio de que la metilación del péptido puede alterar su sensibilidad a la rotura por la proteasa. Usando este principio, el ensayo de desactivación de fluorescencia (Transferencia de Energía por Resonancia "TER") puede usarse para determinar la medida de la metilación de sustratos peptídicos. Inicialmente se cuenta con un sustrato peptídico Suv39h, que contiene el sitio de metilación y un sitio de reconocimiento/corte para una proteasa concreta, que es sensible a las modificaciones (en este caso, metilación de la lisina) del sitio de reconocimiento/corte, p.ej. tripsina o LysC. El péptido porta un donador fluorescente cerca de uno de sus extremos y un aceptor cerca del otro extremo. En el sustrato sin fraccionar, la fluorescencia del sustrato es desactivada por la persistente TER intramolecular entre donador y aceptor. Tras la rotura del sustrato (no metilado) por la proteasa, los productos de rotura se liberan a partir de la reducción TER y se genera una señal fluorescente. La metilación del sustrato elimina la capacidad de la proteasa para romper el sustrato. Así, la eliminación de la actividad proteasa (que es proporcional a la metilación) se refleja por la represión de señal, en caso de inhibición total de proteasa, represión de la señal total hasta el nivel base.

Un ensayo de este tipo puede realizarse de la siguiente forma: la solución del sustrato etiquetado (p.ej. el péptido marcado con ácido 4-[[4'-(dimetilamino)fenil]azo]benzoico (DABCYL) en un extremo y con ácido 5-[(2'-aminoetil)amino]naftalensulfónico (EDANS) en el otro extremo, o etiquetado en un extremo con benciloxicarbonil y con 4-aminometilcumarina en el otro extremo)en tampón de ensayo se transfiere a cada uno de los pocillos de placas microtituladas de 96 pocillos negros. Tras añadir las sustancias de prueba en la concentración determinada, la MTasa y el donador de metilo se añaden a los pocillos. Después de la incubación bajo condiciones de reacción y durante un periodo de tiempo suficiente para la reacción de metilación, p.ej. durante 40 minutos a temperatura ambiente, la proteasa, p.ej. tripsina, se añade y se deja que reaccione en condiciones adecuadas. Finalmente, se mide la fluorescencia en un fluorómetro a la longitud de onda de excitación, p.ej. a 340 nm, y a la longitud de onda de emisión, p.ej. a 485 nm.

En el caso de usar un ensayo de Fluorescencia por Transmisión de Energía por Resonancia (FRET), los siguientes pares de marcas disponibles comercialmente para el método de la invención son los siguientes: Europio (Eu) y aloficocianina (APC), Eu y Cy5, Eu y PE (Wallac, Turku, Finland). Y si una sustancia de prueba es un modulador de la actividad MTasa, existirá, en función del sistema de detección, y dependiendo de si la sustancia de prueba tiene un efecto inhibidor o activador, un descenso del aumento de la señal detectable en comparación con la muestra control en ausencia de sustancia de prueba. En el formato de alto rendimiento, los compuestos con una actividad moduladora del efecto de la MTasa Suv39h pueden identificarse por cribado de las sustancias de prueba a partir de bibliotecas de compuestos de acuerdo con los principios del ensayo conocido, p.ej. en un sistema automatizado con placas microtituladas.

Al proporcionar un método para identificar compuestos que ejerzan su efecto por modulación directa, en particular por inhibición, una MTasa del tipo de Suv39h, la presente invención proporciona las bases para inhibir la proliferación de células animales con rápida división, especialmente las células tumorales.

Los compuestos identificados en los métodos anteriores tienen la capacidad de interferir con la estabilidad cromosómica y la segregación cromosómica de alta fidelidad al modular la actividad MTasa de Suv39h.

Preferiblemente, los compuestos son moduladores específicos de Suv39h, concretamente Suv39h1 ó Suv39h2. Los compuestos que actúan como moduladores de la actividad MTasa del tipo de Suv39h, concretamente los moduladores de Suv39h son útiles en terapias humanas, especialmente en la terapia del cáncer.

Los compuestos que inhiben la actividad HMTasa Suv39h tienen como resultado un descenso en la estabilidad genómica y pueden usarse en terapias para células diana en división, concretamente células tumorales altamente proliferativas. Se administran preferiblemente en combinación con otros agentes desestabilizantes del genoma, p.ej. inhibidores de la mitosis como los fijadores de tubulina (taxanos, p.ej. taxol, Paclitaxol; o epitelones). Los inhibidores de SUV39H pueden usarse conjuntamente con o con anterioridad a la aplicación de terapias tumorales convencionales, como radioterapia o quimioterapia, en agentes concretos que dañan el DNA para pre-sensibilizar las células tumorales. Al desestabilizar el genoma celular, los inhibidores SUV39H hacen que la célula sea más susceptible al tratamiento paralelo/subsiguiente.

Los inhibidores de SUV39H se usarán preferiblemente en una terapia de combinación y se aplicarán en tratamientos consecutivos y transitorios. Puesto que el desarrollo de linfomas de células B en ratones de doble nulo Suv39h sólo ocurre con un inicio tardío (esto es, tras 9 años de edad), los tratamientos transitorios con inhibidores de SUV39H no deberían inducir un aumento inmediato del riesgo tumoral sino más bien debilitar las estabilidades genómicas generales de las células altamente proliferativas.

De la misma manera, los agentes que potencian la actividad HMTasa Suv39h pueden usarse para estabilizar el genoma de las células inherentemente inestables, proporcionándoles menos propensión a la adquisición de proliferación que provoque mutaciones. Un modelo de la función de Suv39h y los efectos de la inhibición o la potenciación de los enzimas Suv39h se muestra en la Figura 8.

La eficacia de los compuestos identificados como moduladores de Suv39h puede probarse in vivo en células de mamífero con células de doble nulo Suv39h que sirvan como control positivo. Los compuestos efectivos en la terapia del cáncer deberían interferir en la estabilidad y la segregación cromosómicas, que pueden medirse elaborando el cariotipo, por ejemplo al analizar el contenido del DNA mediante FACS (separador de células activadas por fluorescencia), o mediante técnicas citológicas estándar. Las sustancias cuyo potencial para su uso terapéutico se ha confirmado en tales cribados secundarios pueden seguir evaluándose para comprobar su efecto sobre las células tumorales. Para evaluar la inhibición de la proliferación celular tumoral, las células tumorales humanas primarias se incuban con el compuesto identificado en el cribado y se estudia la inhibición de la proliferación de células tumorales mediante métodos convencionales, p.ej. incorporación de bromo-desoxi-uridina o de ^{3}H timidina. Los compuestos que muestran efectos anti-proliferativos en estos ensayos pueden ser más estudiados en modelos animales tumorales y usarse para la terapia de tumores.

Los compuestos para aplicación en la fertilidad masculina pueden probarse en modelos animales descritos por Vigil et al., 1985, en modelos animales desarrollados para estudios experimentales de espermatogénesis humana, como se describe en Weinbauer et al., 2001, o en modelos animales que imitan los defectos reproductivos masculinos humanos, como se describe en Lamb y Niederberger (1994). Se pueden encontrar directrices para una aplicación válida de los datos animales a la evaluación de trastornos reproductivos humanos en Working, 1988.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos identificados como fármacos candidatos por el método de la invención pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos estándar, que incluyen llevar a cabo cultivos celulares y experimentos animales para determinar el IC_{50}, LD_{50}, y el ED_{50}. Los datos obtenidos se usan para determinar el rango de dosis humanas, que además depende de la forma de dosificación (comprimidos, cápsulas, aerosoles, ampollas, etc.) y la vía de administración (oral, bucal, nasal, parenteral, rectal o, en el caso de aplicaciones contraceptivas masculinas temporales, mediante formas de aplicación de liberación sostenida local, p.ej. micropellet de lenta liberación que se implantan dentro de las gónadas, o adyacentes a las mismas). Una composición farmacéutica que contenga el compuesto como el principio activo puede formularse de forma convencional usando uno o más excipientes y transportadores fisiológicamente activos. Los métodos para hacer tales formulaciones pueden encontrarse en manuales, como "Remington Pharmaceutical Sciences".

Como Suv39h tiene que mantener un cariotipo estable, puede considerarse como un gen supresor de tumores. Si las mutaciones de SUV39H también demuestran ser un factor subyacente en los eventos de transformación celular en humanos, cosa que los análisis de ratón doble nulo Suv39h en linfomas de células B en desarrollo indican con fuerza, puede esperarse que la re-introducción del gen Suv39h de tipo salvaje en una terapia génica tenga como resultado una estabilidad genómica aumentada, retrasando o inhibiendo así la progresión cancerosa.

Para la terapia génica puede administrarse moléculas de DNA Suv39h, preferiblemente contenidas en una forma recombinante en un plásmido, directamente, o como parte de un virus o bacteria recombinante. En principio, puede usarse cualquier método de terapia génica para aplicar DNA recombinante Suv39h, tanto in vivo como ex vivo.

Los ejemplos de administración in vivo son la inyección directa de DNA "desnudo", bien por vía intramuscular o usando un acelerador de partículas. Algunos ejemplos de organismos recombinantes incluyen virus de vacuna o adenovirus. Además, los transportadores sintéticos para ácidos nucleicos como lípidos catiónicos, microesferas, micropellets o liposomas pueden usarse para la administración in vivo de moléculas de ácido nucleico que codifiquen para el polipéptido Suv39h.

Puesto que en la presente invención se ha mostrado que el Suv39h media en las transiciones dinámicas en la cromatina de mamíferos de orden superior en gran medida mediante su actividad HMTasa intrínseca, la metilación de la histona H3-K9 (H3-K9 Me) puede usarse para cribar células/pacientes por inestabilidades genómicas basadas en la heterocromatina. En esencia, los anticuerpos específicos para H3-K9Me pueden usarse como una herramienta diagnóstica para enfermedades humanas asociadas con posibles expresiones genéticas aberrantes y con inestabilidades genómicas mediante mala segregación cromosómica o con una definición u organización aberrante de la heterocromatina.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Actividad HMTasa de SUV39H1 transfectado y recombinante y proteínas Suv39h1.

Figura 2: Actividad HMTasa específica del dominio SET de proteínas relacionadas con SU(VAR)3-9 de mamífero.

Figura 3: La lisina 9 de la histona H3 es el mayor sitio para metilación in Vitro por Suv39h1 recombinante.

Figura 4: Reconocimiento de Suv39h1 y Suv39h2 en la línea germinal de ratón.

Figura 5: Análisis de PMEF doble nulo Suv39h.

Figura 6: Mitosis aberrante en PMEF doble nulo Suv39h.

Figura 7: Fosforilación phosH3 aumentada en PMEF Suv39h de doble nulo.

Figura 8: Modelo para la función HMTasa Suv39h.

Figura 9: Generación y elaboración del genotipo de ratones deficientes en Suv39h1- y Suv39h2-.

Figura 10: Inestabilidades cromosómicas en PMEFs Suv39h dn.

Figura 11: Desarrollo de linfomas de células B en ratones mutantes Suv39h.

Figura 12: Metilación H3-K9 dependiente de Suv39h en la heterocromatina pericéntrica.

Figura 13: Fallo espermatogénico y metilación H3-K9 en células germinales de ratón Suv39h dn.

Figura 14: Asociaciones ilegítimas y sinopsis retardadas de cromosomas meióticos Suv39h dn.

Figura 15: Funciones aberrantes del cromosoma Y durante la meiosis de espermatocitos Suv39h dn.

Figura 16: Modelo para una "competencia heterocromática" en la protección de la estabilidad cromosómica.

Figura 17: Ilustración esquemática de un método de cribado para la identificación de moduladores de Suv39h.

Materiales y Métodos a) Alineación de secuencias y predicciones de estructuras secundarias

Los dominios SET de SUV39H1 humana (Aagaard et al., 1999),SU(VAR)3-9 de Drosophila (Tschiersch et al., 1994) y CLR4 de S. pombe(Ivanova et al.,1998) se usaron como alineación múltiple de inicio para búsquedas en bases de datos por similitud usando los métodos Profile (Birney et al., 1996), el Modelo Oculto de Markov (Eddy, 1998) y BLAST (Herramienta de búsqueda de alineación local básica) iterativa específica de la posición (Altschul et al. 1997). Hay listas representativas disponibles en la página del dominio SET del servidor WWW-server SMART (Schultz et al., 2000). Estas búsquedas revelaron similitudes significativas a seis proteínas vegetales (números de acceso Q43088, O65218, P94026, O80013, AAC29137 y AC007576_12) descritas como supuestas N-metiltransferasas de lisina. Por ejemplo, una búsqueda PSI-BLAST con la proteína hipotética SPAC3c7.09 de S. pombe como consulta identificó estas secuencias de plantas y secuencias de dominio SET bien conocidas en las 10 veces que se hizo utilizando un umbral de inclusión de valor-E de 0,001. La misma búsqueda también reveló la presencia de un dominio SET en YHR109w, que se sabe que codifica una citocromo c MTasa (Martzen et al., 1999), en tres pasadas. Se predijeron estructuras secundarias consenso mediante algoritmos (Frishman y Argos, 1997).

b) Proteínas SUV39H1 marcadas con epítopo en células HeLa

Se han descrito las líneas celulares HeLa sobreexpresando (myc)3-SUV39H1 (aa 3-412) o (myc)3-Nchromo (aa 3-118) de longitud completa (Aagaard et al., 1999; Meicher et al., 2000). Se inmunoprecipitó extractos nucleares con cuentas de anticuerpo anti-myc (Aagaard et al., 199), y aproximadamente 1-3 \mug de proteínas SUV39H1 marcadas con (myc)_{3} unidas a la matriz se usaron para ensayos de HMTasa in Vitro.

c) Generación y purificación de proteínas de fusión GST

Se ha descrito el producto GST-Suv1 (82-412) expresado a partir del vector pGEX-2T (Pharmacia) como una proteína de fusión glutation-S-transferasa (GST)(Aagaard et al., 1999). Las construcciones GST adicionales se generaron por transferencia de amplicones por PCR BamHI-EcoRI en pGEX-2T, codificando fusiones en marco para Suv39h1 (7-221), SUV39H1(82-412), SUV39H1(82-378) \DeltaC-tail, SUV39H1(255-412) \Deltacys, Suv39h2(157-477) (O'Carroll et al., 2000), CLR4(127-490) (Ivanova et al., 1998), EZH2(382-747) (Laible et al., 1997) y HRX(3643-3969) (Tkachuk et al., 1992). Las eliminaciones internas cortas (\DeltaNHSCDPN_{323-329} y \DeltaGEELTFDY_{358-365}) o mutaciones puntuales dentro del motivo -_{320}H\phi\phiNHSC_{326}- se elaboraron directamente en el plásmido GST-SUV39H1(82-412) por doble mutagénesis por PCR. Todas las construcciones se confirmaron por secuenciación.

Las proteínas recombinantes se expresaron en 11 cultivos de E. coli de la cepa BL21 y se solubilizó en 10 ml de tampón RIPA (Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, EDTA 5 mM, NP-40 1%, desoxiclorato de sodio 0,5%) que contenga un conjunto completo de inhibidores de proteasa (Boehringer Mannheim) y lisozima (5 mg/ml; Sigma) mediante congelación-descongelación en N_{2} líquido, seguido por una sonicación. Las proteínas solubles se eliminaron por centrifugación, se purificaron con 800 \mul de cuentas de sefarosa glutationa (Pharmacia) y se lavaron dos veces con tampón RIPA. La concentración de proteína se determinó por tinción con Coomassie de geles SDS-PAGE. Las proteínas de fusión unidas a la matriz se usaron inmediatamente para ensayos de HMTasa in Vitro o se almacenaron a 4ºC.

d) Ensayo de metiltransferasa histona (HMTasa) in vitro

Las reacciones in Vitro de HMTasa se modificaron en función de los protocolos descritos (Strahl et al., 1999) y se llevaron a un volumen de 50 \mul de tampón con actividad metilasa (MAB: Tris 50 mM pH 8,5, KCl 20 mM, MgCl_{2} 10 mM, \beta-ME 10 mM, sacarosa 250 mM), que contiene 20 \mug de histonas libres (mezcla de H1, H3, H2B, H2A y H4; Boehringer Mannheim) como sustratos y 300 nCi de S-adenosil-[metil-^{14}C]-L-metionina (25 µCi/ml) (Amersham) como donador de metilo. Se usaron rutinariamente 10 \mug de proteínas de fusión GST unidas a la matriz para el ensayo de la actividad HMTasa. Tras incubar durante 60 min a 37ºC, se pararon las reacciones al hervir en tampón de carga SDS, y las proteínas se separaron con SDS-PAGE al 15 ó al 18% y se visualizaron por tinción con Coomassie y fluorografía.

Los ensayos HMTasa con histonas individuales (Boehringer Mannheim), insulina (Sigma) o péptidos N-terminales se realizaron con 5 \mug de sustrato. Se utilizaron los siguientes péptidos: N-terminal de tipo salvaje de histona H3 humana (ARTKQTARKSTGGKAPRKQL) (ID de SEC Nº 7) y péptido mutante que cambia la lisina 9 (en negrita) por leucina; N-terminal de CENP-A humano (MGPRRRSRKPEAPRRRSPSP) (ID de SEC Nº 8) (Sullivan et al., 1994); N-terminal de macro-H2A de rata (MSSRGGKKKSTKTSRSAKAG) (ID de SEC Nº 9) (Pherson y Fried, 1992).

La microsecuenciación de péptidos en el péptido N-terminal de H3 de tipo salvaje metilado in Vitro y la determinación de la incorporación de ^{3}H de aminoácidos individuales por contaje de centelleos se llevó a cabo como se ha descrito (Strahl et al., 1999).

e) Reconocimiento de los loci de los genes Suv39h1 y Suv39h2 en células madre embrionarias

Los clones genómicos parciales del locus de Suv39h1 (cromosoma X) y del locus Suv39h2 (cromosoma 2)
(O'Carroll et al., 2000) se usaron para generar brazos de homología largos y cortos, en una estrategia para producir proteínas de fusión en marco para los primeros 40 aminoácidos de Suv39h1 o de los primeros 113 aminoácidos de Suv39h2 con \beta-galactosidasa (LacZ) modificada con una señal de localización nuclear (sln). Para el reconocimiento, se derivó un amplicón PCR Pfu de 1,2 kb y un fragmento de DNA SacI de 5,4 kb a partir del subclon genómico gSuv39h1 #18, y se preparó un amplicón PCR Pfu de 1,3 kb y un fragmento de DNA MluI/ApaI de 5,0 kb a partir del subclon genómico gSuv39h2 #28 (ver Figura 9A). Los casetes de reconocimiento derivados de pGNA contenían un gen RSV-neomycin (neo) para una selección positiva y dos sitios de poliadenilación. El gen de toxina difteria A (TDA) bajo el control del promotor MCI se usó para seleccionar una integración aleatoria y se insertó 3' de los brazos largos de homología. Tras la linearización con Notl, las construcciones de reconocimiento de Suv39h1 y Suv39h2 fueron electroporadas en células madre embrionarias (CME) E14.1 (129/Sv) y R1 dependientes de alimentador (feeder).

Tras la selección, las colonias celulares CME resistentes a G418 se cribaron para recombinación homóloga por PCR anidado usando cebadores externos a los brazos cortos de Suv39h1 (PCR1: 5'-ATGGGGGCAGGGTTTTCGGG
TAGAC, ID DE SEC Nº 10; PCR2: 5'-AAATGGTATTTGCAGGCCAC-TTCTTG, ID DE SEC Nº 11) ó de Suv39h2 (PCR1: 5'-GAAAAGGTTGTTCTCCAGCTC, ID DE SEC Nº 12; PCR2: 5'-GGATGGGATGGTGG-AATGGTTTT
TAT, ID DE SEC Nº 13) y cebadores en el gen lacZ (lacZ-PCR1: 5'-AACCCGTCGGATTCTCCGTGGGAAC, ID DE SEC Nº 14; lacZ-PCR2: 5'-CTCAGGAA-GATCGCACTCCAGCC, ID DE SEC Nº 15).

El reconocimiento exitoso se confirmó por análisis Southern blot de DNA de CME digeridas con PvuII con una sonda externa Suv39h1 de intrones \approx500 bp, generada con los cebadores g24r (5'-GACTGC-CTAGTCTGGCACT
GAACTID DE SEC Nº 16) y g13 (5'-GATCACTGCGTACATATAC-ACTGAT, ID DE SEC Nº 17), o de DNA de CME digeridas con HindIII con una sonda externa Suv39h2 exón/intrón de 500 bp, generada con los cebadores Plf (5'-TAGACTT-CTACTACATTAACG, ID DE SEC Nº 18) y P1f (5'-GATGTCAGTGGCTATGAATG, ID DE SEC Nº 19). Estas sondas de DNA detectan un fragmento de 4,5 kb del alelo Suv39h1 de tipo salvaje y un fragmento de 4,0 kb del alelo diana, o fragmentos de 11 kb y 6,1 kb de Suv39h2 de tipo salvaje y alelos diana (ver Figura 9B).

f) Generación y genotipación de ratones deficientes de Suv39h1- y Suv39h2

Varios clones de CME independientemente aumentaron en ratones quiméricos que sufrieron las mutaciones a través de la línea germinal. Se cruzaron los ratones Suv39h1-/- y Suv39h2-/- para producir ratones mutantes con el componente Suv39h (p.ej. Suv39h1-/-, Suv39h2+/-; null1/het2), que luego se aparearon para generar ratones Suv39h doble nulos (dn). Todos los ratones descritos en este estudio se mantuvieron en un fondo genético mixto de origen 129/Sv y C57B1/6J

El ratón mutante se genotipó por análisis Southern blot como se ha descrito antes. El análisis blot de proteínas de los extractos nucleares de los testículos de ratones con anticuerpos \alpha-Suv39h1 y \alpha-Suv39h2 se realizó como se ha descrito previamente (O'Carroll et al., 2000).

g) Generación y análisis de fibroblastos embrionarios de ratones primarios Suv39h doble nulos (PMEF)

Los PMEF fueron derivados de embriones de día E12,5 Suv39h de doble nulo obtenidos después del cruce de ratones mutantes Suv39h1-/- Suv39h2+/. Como control, se prepararon PMEF a partir de embriones de tipo salvaje con antecedentes genéticos iguales. Para el análisis de los perfiles de ciclo celular y curvas de crecimiento, los PMEF del pasaje 2 se analizaron como se ha descrito (Xu et al., 1999). La tinción de la cromatina de la interfase de PMEF con anticuerpos \alpha-phosH3 (Hendzel et al., 1997) se hizo en células impermeabilizadas como se ha descrito (Melcher et al., 2000). Para el análisis bioquímico, los extractos nucleares totales se precalibraron por tinción Ponceau, inmuno-blot con anticuerpos \alpha-H3 (Upstate Biotechnology) y \alpha-phosH3 (Hendzel et al., 1997) y se visualizó mediante tinción con peroxidasa usando Quimioluminiscencia Pontenciada (ECL) (Amersham).

h) Curvas de crecimiento y análisis FACS de PMEF

Para analizar el potencial proliferativo de células de tipo salvaje y mutantes, se sembraron PMEF sobre placas de 10 cm^{2}. Durante los siguientes 30 pasajes, 3x10^{5}células se continuaron sembrando cada tres días sobre una placa nueva de 10 cm^{2} (protocolo 3T3), y se determinaron sus tasas de duplicación. Los perfiles de DNA de los cultivos de PMEF del pasaje 3 y el pasaje 8 se obtuvieron por FACS de células fijadas con etanol y tintadas con yoduro de propidio, usando núcleos de eritrocitos de pollo (Becton Dickinson) como un estándar interno.

i) Cultivo de médula ósea y análisis FACS de células de linfoma de células B

Las células de la médula ósea de ratón de tipo salvaje y Suv39h dn se cultivaron durante dos semanas en medio StemPro-34 SFM (Life Technologies) complementado con IL-3 (10 ng/ml), IL-6 (5 ng/ml), SCF (100 ng/ml), ligando FLT 3 (20 ng/ml), GM-CSF (1 ng/ml) (todos de R&D Systems), dexametasona 10 \muM (Sigma) e IGF-1 (40 ng/ml) (Sigma). Los cultivos crecieron a densidades de aproximadamente 3 x 10^{6} células por ml, y se purificaron a partir de células muertas y diferenciadas por centrifugación del gradiente Ficoll-Paque (Pharmacia). Se obtuvieron células de linfoma primario a partir del bazo y los nódulos linfáticos usando un Colador Celular de Nylon de 70 \mum (Becton Dickinson) y se cultivó en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 5%, glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina al 1% (todos de Gibco-BRL). Las suspensiones de células individuales crecieron durante la noche en un medio que adicionalmente contiene \beta-mercaptoetanol 50 \muM y sobrenadante condicionado al 5% de rIL-7 produciendo células J558L.

La identidad de las células tumorales se determinó por análisis FACS usando anticuerpos (todos de Pharmingen) que detectan marcadores de superficie celular específicos. Todas las células tumorales fueron doble positivas para los marcadores de células B B220-low (RA3-6B2) y CD19 (1D3), pero negativas para los marcadores de células T Cd3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), o para los marcadores de macrófago/granulocito Gr-1 (RB6-8C5), Mac-1 (M1/70) y para un marcador de linaje de eritrocitos, Ter-119. La mayoría de células de linfoma de células B resultó también doble positiva para CD43 (S7) e IgM (R6-60.2), mientras que algunos cultivos clonales mostraron reactividad frente a CD5 (53-7.3). Estos perfiles FACS caracterizan a los tumores mediados por Suv39h como similares a la leucemia linfocítica crónica en humanos (Foon y Gale, 1995).

j) Análisis del cariotipo y extendido cromosómico

Se analizó el PMEF y el cariotipo de células tumorales en extendidos cromosómicos de metafase detenidas con colchicina y teñidas con Giemsa.

Los extendidos de metafase de espermatogonias y espermatocitos se prepararon a partir de fragmentos de túbulo seminífero hinchados hipotónicamente con citrato de sodio al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente y durante la noche a 4ºC con solución de Carnoy (metanol 75%, ácido acético 25%). Tras incubar los fragmentos seminíferos en ácido acético al 60% durante 2 minutos, se generó una suspensión de células individuales por reiteración de pipeteo, se transfirió a un portaobjetos de cristal precalentado (60ºC), y se extendió las células por cizallado mecánico con una varilla de cristal.

k) Generación y purificación de anticuerpos \alpha-metH3-K9

Para generar anticuerpos específicos de metilo contra la posición de histona H3 lisina 9 se generó un péptido hexamérico, -TARK(Me)_{2}ST-cys, conteniendo una lisina di-metilada (Bachem) y una cisteína Terminal. Para aumentar la antigeneicidad e inmunogeneicidad, también se sintetizó un péptido "ramificado" que consiste en cuatro "dedos" TARK(Me)_{2}ST que están unidos a sus C-terminales mediante residuos de lisina. La secuencia de este péptido "ramificado" es [TARK(Me)_{2}S]_{4}-K_{2}-K-cys. Los péptidos se emparejaron con KLH y se cultivó antisuero policlonal de conejo, indicando que el péptido "ramificado" era mucho más inmunogénico que el péptido lineal.

Se absorbió en bloque el antisuero crudo de dos conejos positivos (#2233 y #2236) contra un péptido de control "ramificado" pero sin modificar, seguido por una purificación de afinidad contra un antígeno "ramificado" dimetilado que había sido reticulado a una columna de Poros^{TM} (Lachner et al., 2001). Se eluyeron los anticuerpos unidos con glicina 100 mM pH 2,5 y se neutralizaron con 1/10 vol. de Hepes 2M pH 7,9. La especificidad por el metilo de los anticuerpos se confirmó en spot blots que presentaban péptidos H3 histona K-9 dimetilados o sin modificar en blots de proteína que contienen extractos nucleares de PMEF de tipo salvaje o Suv39h dn. Los anticuerpos \alpha-meth3-K9 de afinidad purificada (concentración aproximada de 0,6 mg/ml) pueden usarse a diluciones de 1:1.000 para análisis blot de proteínas o a diluciones entre 1:1.000 y 1:5.000 para inmunofluorescencia indirecta.

l) Inmunofluorescencia de cromatina en interfase y cromosomas en metafase

Los PMEF del pasaje 6 se fijaron con p-FA al 2% durante 10 minutos en hielo, se lavaron, se incubaron con solución bloqueadora (PBS, BSA 2,5%, suero de cabra 10% y Tween20 0,1%) durante 30 min a temperatura ambiente y se tiñeron durante la noche a 4ºC con los anticuerpos \alpha-meth3-K9. Tras varios lavados con PBS que contiene BSA 0,2% y Tween20 0,1%, los anticuerpos primarios se detectaron con anticuerpos \alpha-conejo de cabra conjugados de Flúor 488 Alexa (Molecular Probes). Se contratiñó con 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), y se insertó en Vectashield (Vector Laboratories).

Para la preparación de cromosomas en metafase, se detuvieron las células de médula ósea o células tumorales primarias con un tratamiento de colchicina (0,5 mg/ml) (Sigma) durante 2,5 horas. Seguidamente se hincharon hipotónicamente en KCl 0,6% o tampón RBS (TrisHcl 10 mM pH 7,4; NaCl 10 mM; MgCl_{2} 5 mM) durante 15 minutos a 37ºC y se centrifugaron durante 8 minutos a 2000 rpm en Citospin (Shandon). Las células extendidas se fijaron inmediatamente con p-FA helado al 2% en PBS durante 15 minutos, se lavaron dos veces y se tiñeron con anticuerpos \alpha-metH3-K9 como se ha descrito anteriormente.

m) Histología de testículos

Se diseccionaron los testículos de ratón macho, se fijaron en fluido Bouins (ácido pícrico saturado al 75%, ácido acético glacial al 5%, formaldehído al 9,3%) y se tiñeron con haematoxilina/eosina. La estadificación de los túbulos seminíferos se llevó a cabo de acuerdo con Oakberg (1956) y Russell et al. (1990). Los análisis FISH con sondas de DNA satélite de ratón se realizaron como se acaba de describir (Scherthan et al., 1996), y los ensayos Túnel se realizaron usando el sistema de detección de apoptosis DeadEnd (Promega). Además, se analizaron criosecciones testiculares (O'Carroll et al., 2000) por inmunohistoquímica con anticuerpos \alpha-Scep, \alpha-Hp1\beta, \alpha-phosH3 y \alpha-met H3-K9.

n) Inmunofluorescencia de células germinales y extendidos de cromosomas meióticos

Se prepararon extendidos de células espermatogénicas de acuerdo con Peters et al. (1997ª) con algunas pequeñas modificaciones. Se obtuvo una suspensión de células germinales individuales en medio DMEM por disrupción mecánica de túbulos seminíferos aislados. Tras varios lavados y un hinchamiento hipotónico en hipotampón (TrisHcl 30 mM pH 8,2, sacarosa 50 mM, citrato de sodio 17 mM) durante 10 minutos a temperatura ambiente, las células se resuspendieron en sacarosa 100 mM, TrisHcl 15 mM pH 8,2 y se extendieron en portaobjetos limpiados con anterioridad cubiertos por una fina película de p-FA 1% que contiene borato 5 mM pH 9,2 y TritonX-100 0,15%. Los portaobjetos se secaron lentamente en una cámara húmeda durante aproximadamente 2 horas y se guardaron a -80ºC. La clasificación de sub-etapas meióticas se realizó de acuerdo con la morfología cambiante de autosomas y cromosomas sexuales como se ha descrito (Peters et al., 1997b).

La inmunofluorescencia de doble marca de estas preparaciones de células germinales se llevó a cabo por incubación secuencial con anticuerpos policlonales \alpha-metH3-K9 de conejo y con anticuerpos secundarios conjugados a Alexa568 \alpha-conejo de cabra. Tras una fijación breve en p-FA 1%, las muestras se incubaron con anticuerpos \alpha-Scp3 policlonales de conejo (Lammers et al., 1995) que se visualizaron con anticuerpos secundarios conjugados a Alexa488 \alpha-conejo de cabra. Además, las co-tinciones se hicieron con anticuerpos \alpha-Scp3 y \alpha-Scp1 (Offenberg et al., 1991)(ver Figura 14A-C) y \alpha-Scp3 y \alpha-HP1\beta (Wreggett et al., 1994), y \alpha-Scp3 y \alpha-phosH3 (HEndzel et al., 1997).

o) Análisis EM

La preparación y tinción de plata de complejos SC a partir de células germinales extendidas (ver apartados anteriores) se realizó de acuerdo con Peters et al. (1997ª), y las muestras se analizaron en un microscopio electrónico de transmisión Jeol 1200 EKII.

Ejemplo 1 Similitud de secuencias de los dominios SET con metiltransferasas de plantas

Al usar los dominios SET de la familia de proteínas SU(VAR)3-9 como alineación inicial, se detectó secuencias similitudes significativas de la estructura secundaria y las secuencias (ver Métodos) a seis proteínas metiltransferasas vegetales. Aunque algunas de estas secuencias vegetales se han clasificado como N-metiltransferasas lisina histona potenciales, sólo una se ha caracterizado funcionalmente pero se vio que le faltaba la actividad HMTasa (Klein y Houtz, 1995; Zheng et al., 1998).

Se detectaron similitudes entre la estructura aminoacídica y secundaria [hojas \beta (b) o hélice \alpha (h)] de las fracciones C-terminales de las secuencias de los dominios SET para SUV39H1 humana (Aagaard et al., 1999) (AG019968), Suv39h2 murina (O'Carroll et al. 2000), (AF149205), SU(VAR)3-9 de Drosophila (Tschiersch et al., 1994) (P45975), una ORF C15H11.5 parecida a SU(VAR)3-9 de C.elegans (CAB02737), CLR4 de S. pombe (Ivanova et al., 1998) (O74565), EZH2 humana (Laible et al., 1997) (Q15910), el HRX homólogos humanos de tritórax (Tkachuk et al., 1992) (Q03164), y MTasas de P. sativum (rubisco Is-MT; Q43088) (Klein y Houtz, 1995; Zheng et al., 1998) y A. thaliana (O65218). Las secuencias de MTasa vegetales contienen una inserción de aproximadamente 100 aminoácidos en medio del dominio SET.

Ejemplo 2 Actividad HMTasa de las proteínas SUV39H1 y Suv39h1 recombinantes

Para investigar si el dominio SET de SUV39H1 humana tiene actividad enzimática, se estudiaron las histonas como posibles sustratos para metilación in Vitro. Al usar las líneas celulares HeLa que expresan de forma "estable" SUV39H1 de longitud completa marcadas con myc tripe (aa 3-412), la proteína ectópica se enriqueció con extractos nucleares por inmunoprecipitación con cuentas anti-myc (ver Figura 1/1A, flechas de la parte superior del panel) y se sondó para comprobar su actividad de transferencia de un grupo metil marcado a partir de S-adenosil-[metil-^{14}C]-L-metionina a histonas libres de acuerdo con las condiciones descritas (Strahl et al., 1999). Los productos de reacción se separaron por PAGE-SDS y se visualizaron por fluorografía, indicando la transferencia selectiva de la marca de metilo a H3 (Figura 1/1A, panel inferior). En cambio, no se detectó ninguna señal con los extractos de la línea celular HeLa que expresa sólo el tercio del N-terminal de SUV39H1 (aa 3-118) o con extractos de células control HeLa. Para confirmar que la actividad HMTasa es una propiedad intrínseca de SUV39H1 y no está mediada por un factor asociado a SUV39H1, las reacciones HMTasa in vitro se repitieron con productos recombinantes que se purificaron como proteínas de fusión GST a partir de E. coli (ver Figura 1/2B, ver las flechas de la parte superior del panel). Para este análisis, se usó Suv39h1 murina, que es idéntica a la SUV39H1 en un 95% (Aagaard et al., 1999). Un producto GST purificado que contenía 82-412 aa mantuvo la actividad HMTasa (aunque a un nivel reducido en comparación con la SUV39H1 transfectada), mientras que un producto GST purificado que contiene 7-221 aa se mostró negativo, incluso a concentraciones más elevadas de proteína (Figura 1/2B, panel de abajo). Estos resultados sugieren que la actividad HMTasa reside en el dominio SET C-terminal.

En la Fig. 1A, la SUV39H1 humana de longitud completa marcada con myc (aa 3-412) ó una proteína SUV39H1 truncada en su C-terminal (aa 3-118) se inmunoprecipitaron a partir de líneas celulares HeLa transfectadas de forma "estable" con cuentas de anticuerpos anti-myc y se usaron en reacciones HMTasa in vitro con histonas libres como sustrato y S-adenosil-[metil-^{14}C]-L-metiona como donador de metilo. La tinción Coomassie (panel superior) muestra las proteínas purificadas mediante flechas y las histonas libres con puntos. La fluorografía (panel de abajo, Figura 1A) indica la actividad HMTasa de (myc)_{3}-SUV1(3-412).

En los experimentos que se muestran en la Fig. 1B, las proteínas de fusión GST recombinantes que codifican para diferentes dominios de Suv39h1 murina se usaron en concentraciones de proteína crecientes para reacciones HMTasa in vitro como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 3 a) Definición de motivo catalítico en el dominio SET de SUV39H1 humana

De forma similar a los productos de la GST-Suv39h1(82-412) murina recombinante, la proteína de fusión SUV39
H1 humana correspondiente [GST-SUV39H1(82-412)] es catalíticamente activa (ver Figura 2). Pequeñas deleciones internas (\DeltaNHSCDPN_{323-329}; \DeltaNHSC y \DeltaGEELTFDY_{358-365}; \DeltaGEEL) se introdujeron en las dos regiones conservadas del núcleo del dominio SET en GST-SUV39H11(82-412), y, además, las mutantes que no tenían cola C-terminal (\DeltaC-cola) o la región rica en cisteínas asociada a SET (\Deltacys) también fueron generadas. Ninguna proteína mutante demostró actividad HMTasa (ver Figura 2/1A). Para investigar la función enzimática del dominio SET con mayor detalle, las mutaciones puntuales se introdujeron en el motivo más altamente conservado. Los ensayos HMTasa in vitro indicaron que todas las mutaciones puntuales, con la excepción de una, suprimieron la actividad enzimática. Sorprendentemente, la última mutación (H320R) tuvo como resultado un enzima hiperactivo con una actividad aproximadamente 20 veces mayor. Los datos obtenidos definen el motivo _{320}H\phi\phiNHSC_{326} en el dominio SET como un sitio catalítico importante.

b) Actividad HMTasa específica del dominio SET de proteínas relacionadas con SU(VAR)3-9 de mamífero

Debido a que el dominio SET es uno de los motivos proteicos más conservados en los reguladores de cromatina (Stassen et al. 1995; Jenuwein et al. 1998), se analizó seguidamente si los miembros de la familia SU(VAR)3-9 u otras proteínas del dominio SET tienen actividad HMTasa. Se generaron los productos de fusión GST en los dominios SET extendidos de CLR4 de S. pombe (Ivanova et al., 1998), EZH2 humana (Laible et al., 1997) y HRX humana (Tkachuk et al., 1992) de forma que se correspondieran con GST-SUV39H1 (82-412)(ver Figura 2/2B). Resulta interesante que GST-CLR4(127-490) mostró una actividad HMTasa pronunciada a niveles de tres a cinco veces mayores (ver Figura 2/2C) en comparación con el producto SUV39H1 recombinante, que es concuerda con el CLR4 que lleva una arginina en la posición hiperactiva. En contraste, tanto GST-EZH2(382-747) como GST-HRX(3643-3966) no tuvieron actividad HMTasa detectable respecto a las histonas libres (Figura 2/2C), mientras que un producto GST comprable generó, a partir del gen aislado de Suv39h2 de murina (O'Carroll et al., 2000), GST-Suv39h2(157-477), resultó tan activo como GST-SUV39H1(82-412). EZH2 no tiene cisteínas en su C-terminal y HRX no contiene una región rica en cisteínas asociada a SET (Figura 2B). Ambos dominios de estas cisteínas están presentes en CLR4, Suv39h2 y SUV39H1. De acuerdo con los análisis mutacionales de SUV39H1, parece que la actividad HMTasa respecto a las histonas libres requiere de la combinación del dominio SET con regiones adyacentes ricas en cisteína, y es una cualidad encontrada sólo en un número restringido de proteínas que contienen el dominio SET.

En la Fig. 2A, aproximadamente 10 \mug de las proteínas de fusión indicadas que codifican para GST-SUV1 (82-412) (= SUV39H1 humana) y siete mutantes del dominio SET se usaron en reacciones HMTasa in vitro con histonas libres, como se resume en la Figura 1. Para el mutante H320 hiperactivo, sólo se usó 1 \mug (10%) del producto de fusión correspondiente. La Fig. 2 muestra un diagrama que representa las estructuras de dominio de las proteínas CLR4, Suv39h2, SUV39H1, EZH2 y HRX con las flechas demarcando la fusión N-terminal a GST. Las regiones ricas en cisteína se indican marcadas en gris.

En la Fig. 2C, aproximadamente 10 \mug de las proteínas de fusión indicadas que codifican para CLR4 S. Pombe [GST-CLR4(127-490)], Suv39h2 murina [GST-Suv2(157-477)], EZH2 humana [GST-EZH2(382-747)], HRX humana [GST-HRX(3643-3969)] y SUV39H1 humana [GST-SUV1(82-402)] se usaron en reacciones HMTasa in vitro con histonas libres como se resume en la Figura 1.

Ejemplo 4 La lisina 9 del N-terminal de H3 es el mayor sitio para metilación in vitro por Suv39h1 recombinante

Los ejemplos anteriores indicaban que la actividad HMTasa de las proteínas relacionadas con SU(VAR)3-9 mamífera es selectiva para H3 bajo las condiciones escogidas de este ensayo. Para examinar este descubrimiento con más detalle, se llevaron a cabo reacciones de metilación in vitro con histonas individuales, usando GST-Suv39h1 (82-412) como enzima. Tal como se muestra en la Figura 3/1A, la H3 es específicamente metilada por GST-Suv39h1(82-412),
mientras que no se detectan señales con H2A, H2B ó H4. Se presenta una señal débil en caso de que se use H1 como el único sustrato. La importancia de la metilación de H1 aun está por determinar. La metilación de H3 ocurre predominantemente en la lisina 4 en un amplio grupo de organismos, así como la lisina 9 en células HeLa, aunque la(s) HMTasa(s) responsables tienen todavía que definirse (Strahl et al., 1999). Para investigar el perfil de utilización del sitio de Suv39h1, se estudiaron como sustratos a péptidos sin modificar, incluyendo la H3 N-terminal de tipo salvaje (aa 1-20) y un péptido K9L mutante, cambiando la lisina 9 por leucina. Adicionalmente, la insulina y los péptidos que incluyen el N-terminal de CENP-A (Sullivan et al., 1994) y macroH2A (Pehrson y Fried, 1992) fueron incluidos. Los péptidos fueron metilados in vitro por GST-Suv39h1(82-412), y se separaron los productos de reacción por un elevado porcentaje de SDS-PAGE y se visualizaron por fluorografía. Estos ensayos in vitro revelaron una metilación selectiva del péptido H3 de tipo salvaje, mientras que no se detectó ninguna señal con péptidos CENP-A o macroH2A, o con insulina (ver Figura 3/2B). Es importante que el péptido H3 (K9L) mutado no era un sustrato, lo que sugiere que la lisina 9 del H3 N-terminal es un residuo preferido para la actividad HMTasa dependiente de Suv39h1.

Para determinar de una forma más definitiva esta preferencia de sitio, el péptido H3 de tipo salvaje N-terminal se metiló in vitro por GST-Suv39h1(82-412), usando S-adenosil-[metil-^{3}H]-L-metionina. El péptido marcado, purificado por HPLC de fase reversa, luego se microsecuenció directamente, y se analizó la incorporación de ^{3}H asociada con cada aminoácido individual mediante contaje de centelleos. Los resultados confirmaron la transferencia selectiva de marca de metilo a la lisina 9 (ver Figura 3/2C), demostrando que la Suv39h1 es una HMTasa altamente específica para un sitio para la H3 N-terminal in vitro.

En la Fig. 3A, aproximadamente 10 \mug de GST-Suv39h1(82-412) murina se usaron en reacciones HMTasa in vitro con histonas individuales, como se resume en la Figura 1.

La Fig. 3B muestra los resultados de los ensayos de metilación in vitro usando GST-Suv39h1(82-412) como enzima y los péptidos N-terminales indicados de H3 salvaje, H3 mutado (K9L), CENP-A, macroH2A o insulina como sustratos.

La Fig. 3C muestra el resultado de la secuenciación automática del péptido H3 N-terminal de tipo salvaje (aa 1-20) que había sido metilado in vitro por la GST-Suv39h1(82-412) recombinante. Se muestra la incorporación de H3 de aminoácidos individuales identificados en cada serie sucesiva de la microsecuenciación.

Ejemplo 5 Reconocimiento de los loci de Suv39h1 y Suv39h2 en la línea germinal de ratón

Los genes de Suv39h murina se codifican por 2 loci, Suv39h1 y Suv39h2 (O'Carroll et al., 2000. Para investigar la importancia de la función Suv39h in vivo y la metilación H3-K9 dependiente de Suv39h, se generaron cepas de ratón deficientes de tanto Suv39h1 como Suv39h2 de acuerdo con las técnicas estándar. Las estrategias de reconocimiento se muestran en la Figura 4, así como la demostración de la producción de alelos nulos para tanto Suv39h1 como Suv39h2. La mutación de cualquiera de los genes tiene como resultado ratones fértiles y viables como consecuencia de la redundancia funcional entre ambos loci. Por lo tanto, las cepas deficientes de Suv39h1 y Suv39h2 de ratón doble nulo nacen en proporciones sub-Mendelianas (ver Ejemplo 8B, abajo), donde sólo se observa aproximadamente un 30% de los doble mutantes Suv39h esperados. La Fig. 4 muestra una estrategia de reconocimiento convencional usada para inactivar el loci Suv39h unido a X. La Fig 4B muestra el análisis de Northern Blot de Suv39h1 de bazo (sp), hígado (Li), riñón (Kidney), y cerebro (Br) de ratones nulos Suv39h y de tipo salvaje. La Fig 4C muestra la estrategia de reconocimiento convencional usada para inactivar el locus Suv39h2 autosómico. (Panel de abajo) Análisis Western blot con anticuerpos \alpha-Suv39h2 en extractos de proteína derivados de testículos salvajes y Suv39h2 nulos.

Ejemplo 6 Mitosis aberrante en fibroblastos de ratón primarios de Suv39h doble nulo (PMEF)

Para determinar si los fenotipos embrionarios en ratón Suv39h doble nulo pueden ser atribuidos a defectos mitóticos, se analizaron PMEF derivados de ratones Suv39h dobles. Los perfiles del ciclo celular de PMEF salvaje y Suv39h doble nulo indican porcentajes bastante similares de células que están en fase S y G2/M (ver Figura 5A), mientras que las PMEF Suv39h doble nulo muestran un índice G1 reducido y una proporción aumentada de células con morfologías nucleares aberrantes, reminiscentes de los defectos de división durante la mitosis. Por ejemplo, los PMEF de Suv39h doble nulo contienen aproximadamente el doble de células con micro- y poli-núcleos, y se caracterizan además por subpoblaciones celulares con núcleos de tamaños mayores de lo normal, o con una definición débil de heterocromatina que sólo aparece en algunos focos inusualmente condensados (ver Figura 5B). Además, las células Suv39h doble nulo también muestran inestabilidades genómicas y se vuelven fácilmente aneuploides (ver también Ejemplo 9, debajo). La gravedad de estos aneuploidías aumenta con números de pasaje más elevados (ver Figura 6). La incapacidad de las células doble nulo Suv39h para mantener un cariotipo estable puede subyacer el fenotipo embrionario Suv39h.

La Fig. 5A muestra el porcentaje de células en varias fases del ciclo celular de PMEF salvajes y doble nulas Suv39h.

La Fig. 5B muestra imágenes representativas (izquierda y en medio) de mitosis aberrantes en PMEF de Suv39h doble nulo detectadas por tinción DAPI y \alpha-tubulina (no mostrada). También se muestra (imagen derecha) un núcleo ejemplificando la definición inusual de heterocromatina en una subpoblación de PMEF de Suv39h doble nulo. Todas las imágenes se tomaron a una magnificación de 630 veces.

La Fig. 6A muestra el perfil de contenido de DNA de PMEF salvajes y doble nulas Suv39h en el pasaje 3. La Fig. 6B muestra que el perfil de contenido de DNA de PMEF salvajes y doble nulas Suv39h en el pasaje 8.

Ejemplo 7 Fosforilación phosH3 aumentada en PMEF doble nulas Suv39h

La fosforilación en la serina 10 (phosH3) en la cola N-terminal de H3 se ha mostrado necesaria para la condensación y la subsiguiente segregación de cromosomas (Wei et al., 1999). Durante el ciclo celular, phosH3 inicial dentro de la heterocromatina pericéntrica en G2 tardío y luego progresa a lo largo de todos los cromosomas durante la mitosis (Hendzel et al., 1997). En las PMEF salvajes, aproximadamente un 7% de las cepas de células positivas para la característica, focos phosH3 asociados a heterocromatina, como se detecta por inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos \alpha-phosH3 (ver Figura 7A, panel derecho). En cambio, este número se incrementa por un factor de alrededor de tres veces más en las PMEF doble nulas Suv39h, con aproximadamente un 22% de las células conteniendo focos fosH3 (Figura 7A, panel izquierdo), aunque su definición aparece en muchos pequeños puntos que no siempre se solapan con material denso-DAPI. Este resultado sugiere que los niveles generales de fosH3 pueden ser potenciados con PMEF doble nulas Suv39h. Por lo tanto, la abundancia relativa de fosH3 en extractos nucleares precalibrados se determinó con anticuerpos específicos para \alpha-fosH3. Esta cuantificación indicó un nivel significativamente mayor de fosH3 en células doble nulas Suv39h en comparación con controles salvajes (ver Figura 7B). Resumiendo, los datos obtenidos son más coherentes con un modelo en el que la metilación mediada por Suv39h de lisina 9 en H3 regula negativamente la fosforilación de la serina 10.

La Fig. 7A muestra una tinción de cromatina en interfase con anticuerpos \alpha-fosH3 y anticuerpos secundarios conjugados CY3. El DNA se contratiñó con DAPI. Se contó por lo menos 1000 células para evaluar el porcentaje (indicado en la Figura) de células positivas \alpha-fosH3. La Fig 7B muestra un análisis Western cuantitativo con 15 \mug y con 30 \mug de proteínas nucleares totales que han pasado por un inmunotransferencia con anticuerpos \alpha-H3 y \alpha-fosH3.

Ejemplo 8 a) Generación de ratón doble deficiente Suv39h

Las HMTasas Suv39h murinas están codificadas por dos loci cuyos mapas genéticos han sido encontrados para posiciones proximales al centrómero en el cromosoma X (Suv39h1) o en el cromosoma 2 (Suv39h2) (O'Carroll et al., 2000). Ambos loci genéticos fueron interrumpidos independientemente por recombinación homóloga en células madre embrionarias (CME) usando un enfoque de reconocimiento convencional que sustituye partes del dominio cromo evolutivamente conservado con el gen bacteriano LacZ y un casete de selección RSV-neomicina (Figura 9a). Estas estrategias de reconocimiento producen proteínas de fusión en marco de los primeros 40 aminoácidos de Suv39h1 ó de los primeros 113 aminoácidos de Suv39h2 con lacZ, lo que mantiene la actividad \beta-galactosidasa. Los clones celulares CME reconocidos se usaron para generar ratones quiméricos que transmitieron los alelos Suv39h1 ó Suv39h2 a través de la línea germinal (Figura 9b). Los análisis de transferencia de proteína de extractos nucleares de testículos a partir de ratón deficiente de Suv39h1 y Suv39h2 salvaje con anticuerpos específicos para \alpha-Suv39h1 y \alpha-Suv39h2 (Aagaard et al., 1999; O'Carroll et al., 2000) indicaron la ausencia de las proteínas respectivas, demostrando que por ambos genes se habían generado alelos con pérdida de función.

b) Viabilidad alterada de Suv39h doble nula de ratones

Los ratones deficientes para Suv39h1 ó Suv39h2 muestran una fertilidad y viabilidad normales, y no se observa fenotipos aparentes, lo que sugiere que ambos genes pueden ser funcionalmente redundantes durante el desarrollo del ratón (O'Carroll et al., 2000). Por lo tanto, los ratones Suv39h1-/- y Suv39h2-/- se cruzaron para generar mutantes Suv39h compuestos que luego se usaron para derivar Suv39h doble nulo (dn) de ratón. Los ratones Suv39h dn obtenidos a partir de varios cruces diferentes (Tabla I) nacen sólo en proporciones sub-Mendelianas, crecen retardadamente (Figura 9d) y se caracterizan por hipogonadismo en los machos. Por ejemplo, de un total de 197 ratones, se esperaba que 46 ratones fueran doble nulo (Tabla I), pero sólo nacieron 15 ratones dn Suv39h (aproximadamente el 33%). El análisis de la embriogénesis de ratón indicó un desarrollo normal de los fetos Suv39h dn hasta el día E12,5, mientras que en etapas posteriores, los fetos Suv39h dn eran más pequeños y se observaba una tasa de resorciones y de mortalidad prenatal más elevada. El conjunto de todos estos resultados demuestra que los genes Suv39h son necesarios para una viabilidad normal, y para un desarrollo pre- y postnatal.

La Figura 9 muestra el reconocimiento y la elaboración del genotipo de ratones deficientes de Suv39h1 y Suv39h2 de la siguiente forma: (A) Representación por diagrama de los loci genómicos de Suv39h1 y Suv39h2, los vectores de reemplazo y los alelos reconocidos. Los exones se indican con cajas negras con números que se refieren a las posiciones iniciales de aminoácido de los exones respectivos (O'Carroll et al., 2000). También se muestran los sitios de restricción diagnósticos y una sonda externa usada para los análisis de Southern blot. pA indica señales de poliadenilación. (B) Análisis de Southern blot de DNA digerido por PvuII o HindIII aislados de la progenie de cruces heterozigotos de Suv39h1+/- ó Suv39h2+/-. (C) Análisis de transferencia de proteína de extractos nucleares de testículos de ratón de tipo salvaje (wt), Suv39h1-/- (Suv1-/-) y Suv39h2-/- (Suv2-/-) con anticuerpos \alpha-Suv39h1 y \alpha-Suv39h2. El tamaño de las proteínas Suv39h1 ó Suv39h2 se indica por las flechas. (D) Los ratones doble nulo (dn) Suv39h crecen de forma retardada después de nacer y durante su vida adulta.

Ejemplo 9 Mala segregación cromosómica en fibroblastos embrionarios Suv39h dn

Para examinar los defectos dependientes de Suv39h con más detalle, se derivó fibroblastos embrionarios de ratón primario (PMEF) de fetos del día E12,5. Las curvas de crecimiento comparativas entre PMEF Suv39h dn y de tipo salvaje (wt) en un protocolo 3T3 sobre los primeros 20 pasajes indicó que PMEF Suv39h dn mostraban una tasa de duplicación mayor hasta el pasaje 12 (Figura 10a). En pasajes posteriores, los PMEF Suv39h dn parecían tener un potencial proliferativo ligeramente reducido, al contrario que los PMEF wt inmortalizados, que sobrevivieron a la crisis Hayflick característica. Recientemente se ha observado (ver Ejemplo 6) que los PMEF Suv39h dn contienen una fracción significativa de células con morfologías nucleares aberrantes, como macronúcleos o polinúcleos, que son características reminiscentes de la mala segregación cromosómica y la mitosis defectuosas (Rea et al., 2000). Por lo tanto, el contenido de DNA de los PMEF Suv39h dn y wt del pasaje 3 y el pasaje 8 se analizó por FACS. Mientras que los PMEF wt se mostraron genómicamente estables en el pasaje 3, los PMEF Suv39h dn ya contenían células con un contenido de DNA mayor que 4N, como se indica en la carga aneuploide en el perfil FACS (Figura 10B, paneles superiores). En el pasaje 8, los PMEF wt maduran de forma importante. En cambio, los PMEF Suv39h dn continúan proliferando, aunque muchas células muestran contenidos de DNA octaploide (Fig. 10B, paneles inferiores).

Para caracterizar todavía más estas inestabilidades genómicas, los análisis de cariotipo se realizaron con PMEF del pasaje 8 (Figura 10C). Concretamente se examinó 45 cariotipos de cada uno de los dos cultivos independientes de PMEF wt y de los dos de PMEF Suv39h. Como se muestra en la Figura 10D, una fracción mayor de los cariotipos wt son no-diploides, con números cromosómicos entre 25 y 82. Las aneuploidías aumentaron significativamente en los cariotipos de Suv39h dn y comprenden números cromosómicos entre 38 y 162. Es notable que, mientras que los PMEF wt contienen una selección aleatoria de cariotipos aneuploides, los PMEF Suv39h dn son altamente hipo-tetraploides o hipo-octaploides. Los cromosomas en los PMEF Suv39h dn parecieron de morfología normal y no se observó ninguna fusión Robertsoniana. Se concluyó que la ausencia de la función de Suv39h induce a inestabilidades genómicas, principalmente por provocar una segregación defectuosa del conjunto entero de cromosomas.

La Figura 10 muestra las inestabilidades cromosómicas en los PMEF Suv39h dn de la siguiente manera:(A) tasas de duplicación relativas de PMEF Suv39h dn y wt determinados en un protocolo 3T3 sobre los primeros 20 pasajes. (B) Contenidos de DNA de cultivos de masa de PMEF Suv39h dn y wt en el pasaje 3 y el pasaje 8. (C) Extendidos de la metafase que muestran un número diploide (n=40) de cromosomas para wt y un número hiper-tetraploide (n=82) de cromosomas para los PMEF Suv39h dn. (D) Análisis estadístico del cariotipo con dos cultivos de PMEF wt y dos de PMEF Suv39h dn en el pasaje 8. Para cada cultivo se evaluó 45 metafases.

Ejemplo 10 Desarrollo de linfomas de células B en ratones mutantes Suv39h

Posteriormente se analizó ratones mutantes de Suv39h para estudiar la incidencia de tumorogénesis. Puesto que la mayoría de ratones Suv39h dn son no-viables, se examinó distintos genotipos Suv39h que diferían en su dosificación de genes bien para Suv39h1 ó para Suv39h2. Por ejemplo, se esperaba que la X-inactivación aleatoria del gen Suv39h1 unido a X podría aumentar el riesgo de tumor en ratones Suv39h1+/-, incluso en presencia de una copia funcional de Suv39h2, cuya expresión es reducida en la mayoría de tejidos adultos (O'Carroll et al., 2000). Sin embargo, el examen de 98 ratones que eran o bien heterogocitos (het) o nulos para el locus Suv39h1 indicó aproximadamente un 28% de penetración en la formación de tumores con inicio entre 9 y 15 meses de edad (Tabla II). Estos tumores son predominantemente linfomas de células B (Figura 11A) que se parecen, por perfiles de FACS (ver Materiales y Métodos), a linfomas no Hodgin de progreso lento humanos (Foon y Gale, 1995). La incidencia de tumor para linfomas de células B de inicio tardío fue de aproximadamente 33% en los pocos ratones Suv39h dn viables (n=6). En cambio, los ratones Suv39h2+/- ó Suv39h2-/- desarrollaron linfomas de células B con sólo \leq 5% de penetración (n=21), y no se observó formación de tumor en ratones de tipo salvaje de control.

Los cultivos primarios derivaron a partir de nódulos linfáticos de tumor de ratón Suv39h dn y de Suv39h1-/-, Suv39h2+/-(nulo1/het2), y se analizaron los cariotipos de las células de linfoma de células B. De forma coherente con las aneuploidías descritas anteriormente para los cultivos en masa de PMEF, estas células tumorales resultaron ampliamente hiper-diploides, pero también incluían algunos cariotipos hiper-tetradiploides (Figura 11B). Sorprendentemente, una fracción de los cariotipos de tumor Suv39h dn, examinada en varios linfomas de células B independientes, se caracteriza porque tener cromosomas no segregados que se mantenían unidos mediante sus regiones acrocéntricas (Figura 11C). Estos cromosomas "mariposa" aumentan la intrigante posibilidad de que la ausencia de la actividad HMTasa de Suv39h pueda hacer que la calidad y función de la heterocromatina pericéntrica sea defectuosa al aumentar las interacciones más persistentes entre los cromosomas en metafase. Sin embargo, el análisis de metilación H3-K9 con un anticuerpo recién desarrollado (ver Ejemplo 11 más adelante) indica la ausencia de tinción metH3-K9 en la heterocromatina pericéntrica de cromosomas de tumor derivada de las células de linfoma de células B Suv39h null1/het2.

La figura 11 muestra el desarrollo de los linfomas de células B en ratones mutantes de Suv39h de la siguiente manera: (A) nódulos linfáticos y bazo de un ratón con tumor Suv39h de 11 meses y de un ratón de control de tipo salvaje. (B) Análisis del cariotipo de cuatro cultivos primarios independientes derivados de los nódulos linfáticos de ratones con tumores Suv39h dn (null1/null2) y Suv39h1-/-, Suv39h+/- (null1/het2). (C) Extendido de metafase de una célula de linfoma de células B Suv39h primaria que muestra cromosomas "mariposa" que se mantienen asociados mediante sus regiones acrocéntricas.

Ejemplo 11 Ausencia de metilación H3-K9 en heterocromatina Suv39h dn

Los análisis de cariotipo antes mencionados sobre PMEF y células tumorales sugieren un mecanismo general mediante el cual la segregación de todo el complemento cromosómico puede ser defectuosa debido a defectos dependientes de Suv39h en la organización de la cromatina pericéntrica. Para evaluar directamente el papel de las HMTasas Suv39h en la metilación de las histonas y la formación de heterocromatina, se cultivó antisuero policlonal de conejo que específicamente reconoce histona H3 cuando está dimetilada en lisina 9 (\alpha-metH3-K9). Como se muestra en la Figura 12A, este antisuero detecta la tinción focal en PMEF wt que se solapan significativamente con heterocromatina rica en DAPI. En PMEF derivados de ratones deficientes de sólo Suv39h1 ó Suv39h2, aproximadamente un 75% de las células dio positivo para focos heterocromáticos con estos anticuerpos \alpha-metH3-K9. Es importante que la tinción heterocromática para metH3-K9 se eliminó en PMEF Suv39h dn (Figura 12A, línea derecha).

Los extendidos de cromosomas mitóticos de células de médula ósea también fueron analizados con el antisuero \alpha-metH3-K9. En los extendidos wt, la heterocromatina pericéntrica se visualizó de forma selectiva (ver insertados en la Figura 12B), mientras que sólo la tinción residual se detectó en extendidos Suv39h dn. De esta manera, coherentemente con la localización de SUV39H1 en centrómeros activos (Aagaard et al., 2000), estos datos demuestran que ambos enzimas Suv39h son las HMTasas más importantes para la metilación de H3-K9 en heterocromatina pericéntrica de células somáticas. Además, estos resultados también caracterizan los anticuerpos \alpha-metH3-K9 como un nuevo marcador citológico novel para la heterocromatina y corroborar estudios de S. pombe recientes, donde el aumento de la metilación H3-K9 en regiones MAT y CEN se mostró independiente del enzima funcional Clr4 (Nakayama et al., 2001).

La Figura 12 muestra la metilación H3-K9 dependiente de Suv39h en la heterocromatina pericéntrica de la siguiente manera: (A) tinción DAPI y metH3-K9 en la cromatina de tipo salvaje (wt) en interfase de los PMEF Suv39h1-/-, Suv39h2-/-, y Suv39h dn. Los porcentajes se refieren a núcleos en interfase que muestran metilación H3-K9 en focos heterocromáticos. (B) tinción DAPI y metH3-K9 en cromosomas mitóticos preparados a partir de cultivos in vitro de células de médula ósea salvajes y Suv39h dn.

Ejemplo 12 a) Hipogonadismo e insuficiencia espermatogénica completa en ratón Suv39h dn

El patrón de expresión de los genes de Suv39h sugiere un papel importante durante la espermatogénesis (O'Carroll et al., 2000). Sin embargo, los machos Suv39h dn (n=7) no son fértiles, no contienen esperma maduro y el peso de sus testículos es 3-10 veces menor en comparación con el de los machos wt (Figura 13A). Para investigar la insuficiencia espermatogénica con más detalle se realizaron secciones histológicas, demostrando túbulos seminíferos normalmente desarrollados en los testículos de ratones wt que muestran la diferenciación característica de las espermatogonias (Sg) proliferando mitóticamente a espermatocitos meióticos (Sc) y las espermátides haploides post-meióticos (St) (Figura 13A). Por otra parte, la espermatogénesis disminuyó dramáticamente en ratones Suv39h dn, con un paro aparente en la diferenciación en la transición entre espermatocito temprano a maduro, resultando en túbulos seminíferos altamente vacuolarizados (Figura 13A).

Los análisis FISH con sondas de DNA satélite de ratón y los ensayos TUNEL se usaron para caracterizar mejor los defectos espermatogénicos dependientes de Suv39h. Mientras que la proliferación mitótica de espermatogonias parecía normal, se observó un aumento de 3-10 veces en el porcentaje de los espermatocitos del pre-leptoteno. Estos espermatocitos del pre-leptoteno a menudo eran más grandes. Estos resultados sugieren que la entrada en la profase meiótica se retarda en ausencia de la función de Suv39h. A pesar de este retraso, la progresión posterior a través de la profase meiótica hasta la mitad del paquiteno se mostró normal. Entre el medio paquiteno y el final del mismo, sin embargo, muchos espermatocitos sufrieron apoptosis, lo que tuvo como resultado túbulos en fase V-VI (ver Figura 13A) que en su mayoría carecían de espermatocitos en fase de paquiteno y que no contenían espermátides haploides. Se concluyó que la ausencia de la función genética de Suv39h induce a una entrada retardada en la profase meiótica, y dispara una apoptosis pronunciada de espermatocitos durante la fase del paquiteno medio al paquiteno tardío.

b) Metilación H3-K9 en la heterocromatina meiótica

Para investigar si la insuficiencia espermatogénica dependiente de Suv39h podía estar correlacionada con una disminución distinta de heterocromatina meiótica, se analizaron preparaciones de extendidos y criosecciones con anticuerpos \alpha-metH3-K9. En las preparaciones wt, los anticuerpos \alpha-metH3-K9 decoran los focos heterocromáticos en la espermatogonios (B-Sg) y en los espermatocitos del pre-leptoteno (preL-Sc) (Figura 13B, imágenes izquierdas, panel superior). En el principio de la profase meiótica (Zyg-Sc) y el paquiteno temprano, la tinción \alpha-metH3-K9 no era exclusiva para la heterocromatina, sino que también se extendió a la eucromatina. Desde la mitad del paquiteno hasta el diploteno y en diacinesia, la tinción \alpha-metH3-K9 se restringió a los grupos de diferenciación heterocromáticos que se condensan en un bloque de heterocromatina en espermátides haciéndose más largos (Figura 13B, paneles superiores). Las señales MetH3-K9 en espermátides alargados y espermatozoides maduros, en las que las histonas están reemplazadas por protaminas, no se detectaron. La autenticidad de este patrón de tinción se ha confirmado en análisis de co-localización con anticuerpos que reconocen el complejo sinaptonémico (Offenberg et al., 1991; Lammers et al., 1995), HP1\beta (Motzkus et al., 1999) y phosH3 (Cobb et al., 1999). De esta manera, en analogía con las tinciones somáticas vistas anteriormente para PMEF, estos resultados indican que la metilación de H3-K9 es también un marcador específico para heterocromatina meiótica en las células germinales masculinas diferenciándose.

c) Metilación H3-K9 reducida y aneuploidías en espermatogonios Suv39h dn

En las preparaciones de extendidos de Suv39h dn de testículo, la metilación H3-K9 estaba ausente en los espermatogonios y los espermatocitos del pre-leptoteno (Figura 13B, imágenes de la izquierda, panel inferior). Además, tampoco se observó la tinción eucromática pronunciada que caracteriza los espermatocitos tempranos (Zyg-Sc) en el inicio de la profase meiótica. La reducción de la metilación H3-K9 iba acompañada por una distribución dispersa de phosH3 en aproximadamente un 60% de los espermatogonios Suv39h dn. En cambio, HP1\beta era altamente detectable tanto en espermatogonios wt como Suv39h dn.

Sorprendentemente, a partir del medio paquiteno, se observó la tinción salvaje para metH3-K9 en la heterocromatina pericéntrica (Figura 13B, panel inferior). La localización de HP1ß y las señales phosH3 en autosomas ocurrió de forma normal en espermatocitos Suv39h dn tardíos. De esta manera, los resultados demuestran que las HMTasas Suv39h regulan la metilación H3-K9 en las espermatogonias y en las primeras fases de la profase meiótica. De forma similar a los análisis con PMEF (ver apartados anteriores), se observó un índice aproximadamente 5 veces mayor para la mala segregación cromosómica completa en espermatogonias Suv39h dn que tuvo como resultado la ocurrencia de espermatocitos tetraploides (ver Figura 14C, abajo). En resumen, estos datos definen un papel meiótico temprano y específico de cada etapa para las HMTasas Suv39h, y también sugieren la existencia de una o varias HMTasas H3-K9 noveles que pueden metilar heterocromatina durante la profase meiótica, la diacinesia y en espermátidos.

La Figura 13 muestra la insuficiencia espermatogénica y la metilación H3-K9 en células germinales de ratón Suv39h dn de la siguiente manera: (A) Una histología y tamaño general de testículos de tipo salvaje y Suv39h dn a aproximadamente 5 meses de edad. La sección de los testículos Suv39h dn revela muchos túbulos seminíferos que carecen de espermatocitos (Sc) y espermátides (St). Concretamente, aunque algunos túbulos seminíferos contienen espermatocitos del zigoteno (Zyg-Sc), las fases de diferenciación más avanzada (2) muestran espermatocitos apoptóticos (flechas) en el paquiteno. En fases de diferenciación aún posteriores (3), los espermatocitos del paquiteno están casi completamente ausentes. Algunos túbulos (4) contienen células de Sertoli (Sec). Abreviaciones; Espermatogonias intermedios (In-Sg) y del tipo B (B-Sg); espermatocitos del preleptoteno (PreL-Sc), zigoteno (Zyg-Sc), paquiteno medio (mPach-Sc), paquiteno tardío (lPach-Sc), diploteno (Diplo-Sc) y diacinesia/M-I (M-I-Sc); espermátides redondos (rSt), alargándose (elSt) y alargados (eSt); células de Sertoli (SeC).

(B) La inmunofluorescencia de doble marca de células germinales wt (panel superior) y Suv39h dn (panel inferior) con anticuerpos \alpha-metH3-K9 (rosa) y \alpha-Scp3 (verde). El DNA se contratiñó con DAPI (azul). En las células germinales Suv39h, la metilación H3-K9 estaba ausente en espermatogonia proliferándose (B-Sg) y en espermatocitos del pre-leptoteno (PreL-Sc), y se ve altamente reducida en los espermatocitos del zigoteno (Zyg-Sc) donde sólo se detectó señales residuales en la heterocromatina pericéntrica (punta de flechas). En etapas posteriores, la metilación H3-K9 se observa en una tinción de tipo salvaje (comparar paneles inferiores y superiores), aunque los cromosomas sexuales Suv39h dn permanecen marcados más intensamente en el diploteno y la diacinesis. La doble flecha indica la región pseudo-autosómica (PAR).

Ejemplo 13 a) Interacciones no homólogas y sinapsis retardadas en espermatocitos Suv39h dn

La ausencia de metilación H3-K9 pericéntrica en los espermatogonias y en los espermatocitos tempranos sugiere un papel de las HMTasas Suv39h en la definición de la estructura de orden superior que puede ser necesaria para las alineaciones iniciales y el agrupamiento de cromosomas meióticos. Por lo tanto, la sinapsis cromosómica se analizó por inmunofluorescencia en extendidos de paquiteno con anticuerpos que son específicos para los elementos axiales/laterales y centrales del complejo sinaptonémico (SC) (Figura 14A,B). Intrigantemente, en aproximadamente un 15% (n=90) de los espermatocitos Suv39h dn, se observó las interacciones no homólogas entre autosomas (Figura 14J). Las interacciones no homólogas fueron aún más frecuentes (aproximadamente un 35%) entre cromosomas sexuales y autosomas (X/Y-A). Estas asociaciones ilegítimas ocurrieron predominantemente entre los finales acrocéntricos (cen-cen) de cromosomas no homólogos, en menor medida entre centrómeros y telómeros (cen-tel) y raramente entre telómeros (tel-tel) (Figura 14J). Además, los espermatocitos Suv39h dn contenían cromosomas sexuales que no estaban en sinapsis (ver más adelante) y bivalentes autosomales que estaban retardados en sinapsis. Las sinapsis retardadas de los autosomas (A-del) estaban correlacionadas casi de forma invariable con el hecho de formar parte en asociaciones no homólogas (Figura 14A), lo que sugiere que ambos procesos pueden estar funcionalmente relacionados.

Las asociaciones ilegítimas se confirmaron posteriormente por microscopía de transmisión de electrones (Figura 14D-G). Estos análisis ultraestructurales revelaron la presencia de conexiones físicas y estructuras parecidas a puentes entre los finales de cromosomas no homólogos (doble flecha en la Figura 14D, C, F). La incidencia de cambio de pareja (Figura 14G) y de alineaciones no homólogas también se observó. Ninguna de estas interacciones cromosómicas aberrantes se detectó en preparaciones EM a partir de espermatocitos wt.

b) Mala segregación bivalente en la meiosis I en espermatocitos Suv39h dn

Para determinar si la ausencia de metH3-K9 en el principio de la profase puede afectar la dinámica cromosómica y la segregación durante las divisiones meióticas, se analizó luego las preparaciones de extendido testicular para células de la diacinesia/metafase I (M-I) y metafase II (M-II). En la diacenesia/M-I, la mayoría de espermatocitos Suv39h dn mostraron bivalentes con morfología similar a la del tipo salvaje, indicando que la condensación de cromosoma y la formación de quiasmas se mantuvo imperturbada (pero ver la Figura 15B-D, abajo). Sin embargo, en la M-II, aproximadamente un 14% de los espermatocitos secundarios fue tetraploide, lo que indica una alteración de la segregación de todos los bivalentes durante la primera división meiótica (Figura 14I y 14K). Por lo tanto, los defectos inducidos por Suv39h en la heterocromatina pericéntrica persisten durante la división meiótica y no parecen ser "rescatados" por la metilación H3-K9 adicional que sucede durante la mitad y la última parte de la profase meiótica (ver Figura 13B).

La Figura 14 muestra las asociaciones ilegítimas y las sinapsis retardadas de los cromosomas meióticos Suv39h dn de la siguiente manera: (A-C) inmunofluorescencia de doble etiqueta de espermatocitos en el paquiteno Suv39h dn con anticuerpos que son específicos para los elementos axiales/laterales \alpha-Scp3 (en verde) y los elementos centrales \alpha-Scp1 (en rojo) del complejo sinaptonémico (SC). Este co-marcaje revela cromosomas que no están en sinapsis en una tinción parecida a verde y cromosomas en sinapsis en un color rojo-naranjoso. El DNA se contratiñó con DAPI (azul) que destaca la heterocromatina pericéntrica en un contraste azul más intenso. (A) Dos espermatocitos en la mitad del paquiteno (mPach-Sc) que muestran múltiples asociaciones ilegítimas (cabezas de flecha) entre los autosomas no homólogos (A) y entre autosomas y cromosomas sexuales (X,Y). Varios autosomas están también retardados en sinapsis (A_{del}). (B) Espermatocitos del paquiteno tardío (lPach-Sc) que contienen dos autosomas que forman parte de interacciones no homólogas mediante sus regiones pericéntricas (cabezas de flecha). Además, los cromosomas sexuales no se han emparejado. (C) El espermatocito tetraploide resultante de la mala segregación completa de todos los cromosomas en la división mitótica precedente de una espermatogonia Suv39h dn.

(D-G) Microscopía de transferencia electrónica de cromosomas Suv39h dn en el paquiteno, que confirman que las asociaciones de cromosomas no homólogos ocurren principalmente mediante la heterocromatina pericéntrica, que se visualiza por la tinción plateada más granular (cabeza de flecha y flechas dobles). Los cromosomas que se observa en el panel G muestran múltiples participaciones en intercambios de pareja.

(H,I) Cromosomas de la metafase II teñidos con Giemsa de espermatocitos wt y Suv39h dn secundarios que ilustra la completa mala segregación en la división de meiosis I precedente de las células Suv39h dn.

(J) Histograma de la frecuencia de asociaciones de cromosomas no homólogos y la sinapsis retardada en espermatocitos del paquiteno wt (n=80) y Suv39h dn (n=90). (K) histograma de la frecuencia de mala segregación en meiosis I de cromosomas bivalentes en espermatocitos secundarios wt (n=40) y Suv39h dn (n=30).

Ejemplo 14 La deficiencia de Suv39h interfiere con la segregación de cromosomas sexuales

La espermatogénesis en mamíferos machos se especializa por la presencia de cromosomas heteromórficos sexuales los cuales forman una única región de cromatina conocida como la vesícula sexual o cuerpo XY (Solari, 1974). Además, el cromosoma Y es el cromosoma más heterocromático en el ratón (Pardue y Gall, 1970). El emparejamiento y cruzamiento homólogos entre cromosomas sexuales son dependientes de la presencia de una región pequeña, pseudoautosómica llamada PAR (Burgoyne, 1982). La ausencia de la función Suv39h interfiere con la organización de la cromatina y segregación de los cromosomas sexuales de varias maneras.

Primero, aunque las señales metH3-K9 en el cuerpo XY (flechas en la Figura 13B) se detectaron a niveles comparables en espermatocitos del paquiteno de tipo salvaje y mutantes, los cromosomas sexuales de Suv39h dn dejan más fuertemente metilado en el diploteno y la diacinesia (ver Figura 13B, paneles inferiores). Correspondientemente, se observó HP1\beta prolongado unido al cuerpo XY durante el diploteno. Segundo, en la diacinesia/M-I, la región proximal del brazo largo del cromosoma Y aparece hipocondensado en un 10% de las células dn Suv39h (Figura 15B, E). Además, los cromosomas Y mutantes muestran una separación prematura de sus brazos o incluso separación completa de dos cromátidas hermanas (Figura 15D, E). Tercero, la metilación H3-K9 se presenta en el PAR (flechas dobles en la Figura 13B) en los cromosomas sexuales de tipo salvaje y de Suv39h, y el PAR también se decora con HP1\beta. A pesar de estos patrones de tinción similares, los cromosomas sexuales no consiguieron hacer la sinapsis
en \approx 15% de los espermatocitos del paquiteno de Suv39h dn (Figura 14A, B). En la diacinesia/M-I (Figura 15B, C), la presencia de univalentes XY se incrementó 4 veces más comparado con células de tipo salvaje (Figura 15F). Juntos, estos datos indican un papel para las HMTasas de Suv39h en co-regular la estructura de la cromatina especializada de los cromosomas sexuales, en particular del cromosoma Y altamente heterocromático.

La Figura 15 muestra la función aberrante del cromosoma Y durante la meiosis de los espermatocitos Suv39h dn como sigue: los cromosomas de la metafase I/diacinesia teñidos por Giemsa de espermatocitos primarios de tipo salvaje (A) y Suv39h dn (B-D) que ilustran la univalencia (B, C), condensación alterada (B, C) y la separación prematura de las cromátidas hermanas del cromosoma Y (C, D). (E) Histograma para la frecuencia de células en diacinesia/M-I con condensación anormal o separación prematura de las cromátidas hermanas del cromosoma Y (tipo salvaje: n = 190;
Suv39h dn: n = 170). (F) Histograma para la frecuencia de la univalencia de XY en el paquiteno (tipo salvaje: n = 80; Suv39h dn: n = 80) o diacinesia/M-I (tipo salvaje: n = 190; Suv39h dn: n = 170).

Ejemplo 15 Cribado para moduladores de la actividad MTasa de Suv39h1

Todos los pasos son automáticos y la posición de los diferentes compuestos de prueba se registran informáticamente para una referencia posterior. Los compuestos que se prueban para la actividad moduladora se colocan en alícuotas dentro de placas de 384 pocillos por duplicado. 20-200 nmol de SUV39H1 marcado con GST recombinante en tampón MAB, luego se añade a la reacción. 20 nmol de péptido ramificado ([(TARKST)]4-K2-K-cys) que ha sido marcado con europio luego se añade, seguido por 100 nmol de S-adenosilmetionina. Esta reacción se deja a temperatura ambiente durante 40 minutos, luego se transfiere a una segunda placa cubierta con anticuerpo \alpha-metH3-K9. Esta reacción luego se deja a temperatura ambiente durante 40 minutos para permitir que el anticuerpo se una al sustrato metilado. Siguiendo la captura del sustrato metilado, el sustrato no metilado no unido se eliminó lavándolo en 50 mM tris pH 8,5. El marcador europio luego se escinde del péptido en 50 \mul de una solución potenciadora pH 4,5 durante 25 minutos. Las moléculas de europio queladas luego se excitan a 360 nm y el nivel de fluorescencia emitida a 620 nm luego se calcula usando fluorescencia redisuelta en el tiempo en un lector de placas PolarStar. Los resultados luego se representan en gráficos automáticamente.

El nivel de fluorescencia se relaciona directamente con el nivel de la actividad MTasa. El efecto de los diferentes compuestos sobre la actividad MTasa puede ser claramente vista en el gráfico cuando se comparan las reacciones control con los compuestos no añadidos o con el enzima no añadido.

La Figura 17 ilustra el principio del método de cribado como sigue:

a) Una Mtasa como Suv39h1 se incuba con S-Adenosil Metionina (SAM) y un sustrato peptídico no modificado marcado cromogénicamente (pej. péptido ramificado [TARKST]4-K2-K-cis). Después de la metilación de este sustrato el sustrato se convierte en un epítope para un anticuerpo específico Lis9-metilo que ha sido inmovilizado sobre una placa microtitulada. El nivel de péptido unido luego puede ser cuantificado por el nivel de fluorescencia de la marca cromogénica.

b) En presencia de un modulador (p.ej. un inhibidor, I) la transferencia de grupos metilos mediante la MTasa será afectada (disminuida), en consecuencia afectará la cantidad de sustrato capturada por el anticuerpo inmovilizado, que se cuantifica por el nivel de fluorescencia. Un compuesto con efectos inhibitorios resultará en una disminución de la señal fluorescente, mientras que un compuesto con efectos potenciadores resultará en un incremento en la señal fluorescente.

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TABLA I

Cruce esperado de ratones dn	N1H2 X H1H2^{a} 1:8	N1H2 X N1H2 1:4	N1H2 X H1N2 1:4	TOTAL
# Total ratones nacidos	81	89	27	197
# ratones dn esperados^{b}	11	27	8	46
# ratones dn observados	4	8	3	15
% de ratones viables	36,4	29,6	37,5	32,6
^{a} es decir: N1H2X H1H2:

100

Suv39h1-/- x

101

Suv39h1+/-, Suv39h2+/- ^{b} \begin{minipage}[t]{150mm} Basado en el número de ratones nacidos con otras combinaciones alélicas de Suv39h1 y Suv39h2 que muestran viabilidad prenatal no reducida.\end{minipage}

TABLA II Incidencia de linfomas de células B en ratones con la dosis del gen Suv39h reducida

Genotipo	Dosis del gen Suv39h	# ratones con tumor	# total de ratones	% de ratones con tumor
W1W2	3	0	57	0
W1H2, W1N2,
H1N2	0-2	1	22	4,6
H1W2, N1W2	2-3	8	26	30,8
H1H2, N1H2*	1-2	20	72	27,8
N1N2	0	2	6	33,3
P.ej.: N1H2: Suv39h1-/-, Suv39h2+/-

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<110> Boehringer Ingelheim International GmbH

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<120> Método para identificar compuestos que alteran más la estabilidad del cromosoma dependiente de cromatina

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<130> Caso 14/055 PCT

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<140>

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<141>

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<160> 19

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1452

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> 3'UTR

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<222> (1) .. (18)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (19)..(1452)

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<400> 1

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1

2

3

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<210> 2

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<211> 477

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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4

5

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<210> 3

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<211> 543

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc feature

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<222> (1). (543)

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<223> EST Acc. No.173625

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<400> 3

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6

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<210> 4

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<211> 579

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1) . (579)

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<223> EST Acc. No. AQ494637

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<400> 4

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7

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<210> 5

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<211> 565

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1).. (565)

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<223> EST Acc. No. AQ691972

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<400> 5

8

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<210> 6

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<211> 535

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1) _(535)

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<223> EST Acc. No. AQ554070

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<400> 6

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9

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<210> 7

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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\sa{Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro}

\sac{Arg Lys Gln Leu}

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<210> 8

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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\sa{Met Gly Pro Arg Arg Arg Ser Arg Lys Pro Glu Ala Pro Arg Arg Arg Ser Pro Ser Pro}

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<210> 9

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Rattus rattus

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<400> 9

200

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<210> 10

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgggggcag ggttttcggg tagac

\hfill

25

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<210> 11

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaatggtatt tgcaggccac ttcttg

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26

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<210> 12

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 12

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aaatggtatt tgcaggccac ttcttg

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26

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<210> 13

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 13

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ggatgggatg gtggaatggt ttttat

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26

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<210> 14

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 14

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aaatggtatt tgcaggccac ttcttg

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26

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<210> 15

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 15

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aaatggtatt tgcaggccac ttcttg

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26

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<210> 16

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 16

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gactgcctag tctggcactg aact

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24

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<210> 17

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 17

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gatcactgcg tacatataca ctgat

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25

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<210> 18

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 18

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tagacttcta ctacattaac g

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21

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<210> 19

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<211> 20

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<212> DNA

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<213>Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador

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<400> 19

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gatgtcagtg gctatgaatg

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20

Claims (12)

1. Un método para identificar un compuesto que altera la estabilidad cromosómica dependiente de la cromatina de orden superior en la mitosis y la meiosis, dicho método comprendiendo la incubación de un sustrato para una histona H3K9 metiltransferasa, en presencia de un donante de metilo, con una metiltransferasa que tiene actividad metiltransferasa como la histona H3K9 de Suv39h en presencia y en la ausencia de un compuesto de prueba y determinando si el compuesto de prueba modula la actividad metiltransferasa.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la metiltransferasa es Suv39h1 murina o SUV39H1 humana.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la metiltransferasa es Suv39h2 murina o SUV39H2 humana.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el sustrato es histona H3 o un fragmento N-terminal de la misma que contiene el sitio de metilación en la lisina 9.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el fragmento N-terminal de la histona H3 tiene la secuencia de aminoácidos como se publica en ID de SEC NO:7.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el donante de metilos es metionina o S-adenosil-L-metionina.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el grupo metilo de los donantes de metilos llevan una marca detectable.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el grupo donante de metilos lleva un marcador cromogénico y la actividad metiltransferasa se determina midiendo el cambio en el color sobre la transferencia del grupo metilo al sustrato.

9. El método de la reivindicación 7, en donde el donante de metilos lleva un marcador radioactivo y la actividad metiltransferasa se determina midiendo la radioactividad transferida al sustrato sobre la transferencia al grupo metilo.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la actividad metiltransferasa se determina inmunológicamente por cuantificación de la unión de un anticuerpo específico para el sitio de metilación del sustrato.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el sustrato lleva una marca detectable.

12. Un anticuerpo que específicamente reconoce la lisina 9 metilada en la histona H3.