ES2250436T3

ES2250436T3 - Linea celular productora de insulina obtenida por electrofusion.

Info

Publication number: ES2250436T3
Application number: ES01953264T
Authority: ES
Inventors: Peter Raymond Flatt; Neville Hugo Mcclenaghan
Original assignee: UUTech Ltd
Current assignee: UUTech Ltd
Priority date: 2000-08-02
Filing date: 2001-08-02
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2021-08-02
Also published as: CA2418072A1; DE60114019T2; EP1305410A2; WO2002010346A3; US20040005702A1; AU2001275752B2; ATE306548T1; WO2002010346A2; DE60114019D1; EP1305410B1; AU7575201A

Abstract

Una línea celular humana pancreática producida mediante electrofusión de células de islotes humanos normales con células de al menos una línea celular humana inmortal en la que la línea celular pancreática humana es capaz de segregar insulina.

Description

Línea celular productora de insulina obtenida por electrofusión.

La presente invención se refiere a la producción de líneas celulares las cuales segregan insulina. Más específicamente la invención se refiere a líneas celulares que producen insulina derivadas de células de islotes pancreáticos.

El suministro limitado de islotes humanos y procedimientos intensivos de trabajo para su aislamiento conjuntamente con la variabilidad funcional marcada son problemas inherentes, los cuales restringen grandemente el número de estudios bioquímicos y de transplante de islote que se llevan a cabo. La generación de líneas de células B pancreáticas humanas proporcionaría, por primera vez, un suministro prácticamente infinito de células secretoras de insulina pura las cuales se podrían cultivar y recoger con un mínimo esfuerzo Tales líneas celulares humanas serían extremadamente útiles en estudios de biología de las células B pancreáticas. . Adicionalmente, tales líneas celulares humanas serían alternativas atractivas al uso del tejido primario en las terapias de transplante celular para la diabetes de
tipo 1.

Se han desarrollado un gran número de líneas celulares de insulinoma de roedor. La mayoría han derivado de animales transgénicos que expresan el oncogén del antígeno SV-40 a partir del promotor del gen de insulinoma (Efrat y col., 1988; Hanahan, 1985; Santere y col., 1981). La mayoría de las líneas celulares producidas mediante estos procedimientos muestran defectos inherentes que incluyen inestabilidad y fallo para responder a estimuladores fisiológicos de secreción de insulina (Efrat y col., 1996). Sin embargo, estudios recientes han tenido éxito en duplicar muchas de las propiedades de las células B-pancreáticas totalmente diferenciadas (Knaack y col., 1994). Por ejemplo, una línea celular murina de un ratón transgénico en el cual un antígeno SV-40 promotor de insulina se insertó bajo el control del sistema inducible de tetraciclina, se mostró que revertía hiperglicemia en un modelo de diabetes en ratón (Efrat y col., 1995). Estos experimentos demostraron claramente el potencial de las líneas celulares B-pancreáticas para el transplante celular y terapia génica de diabetes (Efrat y col., 1998).

Las líneas celulares productoras de insulina humanas serían un modelo mucho más deseable, a diferencia de las líneas celulares de roedores, por un número de razones. Para el transplante clínico, una ventaja principal de las células humanas sobre aquellas de otras especies es que no necesitarían superar la barrera del xenotransplante (Cooper y col., 1994). Los alotransplantes son mucho más fáciles para proteger del rechazo inmunitario comparados con los xenoinjertos. El rechazo hiperagudo de xenotransplantes está causado por el reconocimiento de antígenos carbohidratos de la superficie celular por anticuerpos que se dan en la naturaleza (Cooper u col., 1994). Los xenotransplantes han provocado también numerosas preocupaciones éticas y de seguridad, incluyendo la introducción de patógenos animales desconocidos dentro de la población humana. Otra preocupación es que los péptidos inmunogénicos emitidos por xenotransplantes pueden facilitar respuestas inmunes, las cuales podrían resultar en reactividad cruzada frente a proteínas del hospedador, activando potencialmente así nuevas respuestas autoinmunes (Efrat, 1998). Otra ventaja de las células B pancreáticas humanas es que es probable que ellas sean más compatibles con la mayoría de las células B animales. Además, las células endocrinas humanas difieren de otras especies en algunas de sus propiedades biológicas. Por ejemplo, se ha mostrado que el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es un potente mitógeno para la célula B pancreática humana, mientras en el ratón es relativamente inactivo (Hayek y col., 1995; Otonkoski y
col., 1994).

A pesar del ímpetu irrefrenable para producir líneas celulares humanas que secreten insulina, ha demostrado ser extremadamente difícil establecer tales líneas celulares a partir del linaje humano pancreático endocrino, comparado con el de roedor (Efrat y col., 1996; Wang y col., 1997). Una línea celular humana de insulinoma se ha desarrollado a partir de un insulinoma espontáneo, pero aparentemente crece más lentamente y ha perdido muchas características diferenciadas (Gueli y col., 1987). Otros investigadores han intentado inmortalizar células B pancreáticas fetales o adultas usando transfección con oncogenes (Wang y col., 1997). Sin embargo esta aproximación se ha frustrado por la incapacidad de tales células de continuar expresando insulina y sus velocidades de crecimiento restringidas in vitro (Wang, y col., 1997).

Es un objeto de la presente invención proporcionar una línea celular pancreática humana la cual es capaz de segregar insulina.

De acuerdo con la presente invención se proporciona una línea celular pancreática humana, producida por electrofusión de células de islotes humanos normales con células de líneas celulares humanas inmortales en las que la línea celular pancreática humana es capaz de segregar insulina.

Las líneas celulares típicas capaces de segregar insulina se eligen del grupo de líneas celulares que constan de la línea celular depositada con el número de acceso 00112811 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire el 28 de noviembre de 2000 y las líneas celulares depositadas con los números de acceso PTA 3523, PTA 3524 y PTA 3525 en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20100-2209, EE.UU. el 17 de julio de 2001.

La invención también proporciona un procedimiento para la producción de líneas celulares pancreáticas humanas capaces de segregar insulina, incluyendo el procedimiento las etapas de electrofundir una mezcla de células de islotes humanos normales con células de al menos una línea celular humana inmortal e incubar la mezcla para generar células híbridas las cuales son capaces de segregar insulina.

Preferiblemente las células de islotes y las células inmortales humanas se mezclan en aproximadamente una
razón 1:1.

Preferiblemente la electrofusión ocurre en una cámara helicoidal.

Preferiblemente la etapa de electrofusión incluye exponer a las células a una primera fase de pulso de campo CA, una segunda fase de pulso de campo CC y una tercera fase de pulso de campo CA.

La primera fase de pulso puede estar comprendida entre 5-10 voltios, preferiblemente 7 voltios, 2 MHz del campo CA durante entre 20-40, preferiblemente 30 segundos.

La segunda fase de pulso comprende típicamente de 40 a 80 voltios, preferiblemente 60 voltios, pulsos triples de campo CC con cada uno de los pulsos triples siendo de 10-20, preferiblemente de 15 segundos de duración.

La tercera fase de pulso comprende típicamente de 5 a 10 voltios, preferiblemente 7 voltios, 2 MHz del campo CA durante entre 20-40, preferiblemente 30 segundos.

Los medios en los cuales las células se cultivan típicamente comprenden hipoxantina, aminopterina y timidina.

Típicamente, la hipoxantina está presente en los medios de incubación a una concentración de entre 0,05 \mumol/l-0,5 \mumol/l.

Típicamente, la aminopterina está presente en los medios de incubación a una concentración de entre 0,2-0,6 \mumol/l.

Típicamente, la timidina está presente en los medios de incubación a una concentración de entre 10-20 \mumol/l.

La incubación se puede llevar a cabo en presencia de al menos un secretagogo elegido del grupo que comprende glucosa, gliceraldehído, arginina, leucina y alanina.

La incubación se puede llevar a cabo en presencia de al menos una sustancia elegida del grupo que comprende KCl, IBMX, tioglucosa, tolbutamida, diazóxido y verapamilo.

Una línea celular producida mediante el procedimiento de la invención puede mostrar características de transporte de glucosa tan eficientes como células B pancreáticas normales.

Una línea celular producida mediante el procedimiento de la invención puede mostrar actividad de fosforilación de glucosa que concuerda con las células pancreáticas normales.

La invención también se refiere al uso de células productoras de insulina producidas por los procedimientos de la invención para proporcionar terapia génica de la diabetes de tipo 1.

La invención se refiere también al uso de células productoras de insulina producidas mediante el procedimiento en la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes.

La invención se refiere también al uso de una línea celular de acuerdo con la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes.

La invención se refiere también al uso de una línea celular de acuerdo con la invención para la producción de insulina.

La invención también se refiere al uso de células o materiales derivados de las líneas celulares descritas en el presente documento y para usos de éstos.

De acuerdo con la presente invención se ha proporcionado también un procedimiento para la generación de líneas celulares pancreáticas humanas las cuales son capaces de segregar insulina, los procedimientos incluyen la etapa de electrofundir células de islotes humanos normales con líneas celulares humanas inmortales para generar células híbridas las cuales son capaces de expresar atributos de células B pancreáticas normales.

La invención proporciona así líneas celulares pancreáticas normales capaces de segregar insulina producida por un procedimiento de electrofusión.

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En el ejemplo la línea celular referida con números de acceso anteriores se refiere bajo números de referencia interna. Estos son como sigue:

	Números de acceso	Referencia interna

	00112811	1.1B4
	PTA 3523	1.1E7
	PTA 3524	1.2B4
	PTA 3525	1.4E7

Un número de realizaciones de la presente invención se describirá ahora sólo por medio de ejemplo. Con referencia a las figuras acompañantes en las cuales:

La figura 1 muestra las típicas etapas implicadas en la producción de líneas de células B pancreáticas secretoras de insulina humanas mediante electrofusión.

La figura 2 representa la insulina liberada dentro del medio en las 24 horas finales mediante híbridos celulares (resistentes a azaguanina) que resultan de electrofusión de células de islotes humanos con células TRM-1 después de 40 días de cultivo, valores control son media \pm SEM ( n = 6), otros valores son media de determinaciones por duplicado, las fusiones 1 y 2 utilizaron preparaciones de islotes 1 y 2, respectivamente.

La figura 3 representa la insulina liberada dentro del medio en las 24 horas finales mediante híbridos celulares (resistentes a azaguanina) que resultan de electrofusión de células de islotes humanos con células PANC-1 después de 25 días de cultivo, las células en A se seleccionaron sobre la base de alta producción de insulina para clonación, las células en B, clones 1.1B4 y 1.1B7 se seleccionaron sobre la base de producción de insulina para evaluación adicional, los valores control son la media \pm SEM (n = 6), otros valores son la media de determinaciones por duplicado, la fusión utilizó la preparación de islotes 1.

La figura 4 representa la insulina liberada en el medio en las 24 horas finales por híbridos celulares (resistentes a azaguanina) que resultan de electrofusión de células de islotes humanos con células PANC-1 después de cultivo de 30 días, las células en pocillo B se seleccionaron sobre la base de producción de insulina alta mediante clonación, (B) se seleccionó el clon 1.1E7 para evaluación adicional, los valores de control son la media \pm SEM (n = 6), otros valores son la media de determinaciones por duplicado, las fusiones utilizaron la preparación de islotes 3.

La figura 5 representa la insulina liberada en el medio en las 24 horas finales por híbridos celulares (resistentes a azaguanina) que resultan de electrofusión de células de islotes humanos con células Hup-T_{3}-1 después de cultivo de 30 días, las células en pocillo C se seleccionaron sobre la base de producción de insulina alta para clonación, (B) los clones de 1.2B4 se seleccionaron para evaluación adicional, los valores control son media \pm SEM (n = 6), otros valores son la media de determinaciones por duplicado, la fusión utilizó la preparación de islotes 3.

La figura 6 muestra, (A) la morfología de líneas celulares PANC-1 y (B) la morfología de las líneas celulares 1.1B4 derivadas de islotes humanos, usando microscopio de contraste de fase (aumento x200).

La figura 7 muestra (A) la morfología de la línea celular 1.1E7 derivada de islotes y (B) línea celular 1.4E7, usando microscopio de contraste de fase (aumento x200).

La figura 8 muestra (A) la morfología de la línea celular Hup-T_{3}-1 y (B) la línea celular derivada de islotes humanos 1.2B4, usando microscopio de contraste de fase (aumento x200).

La figura 9 representa el contenido de insulina celular de las líneas celulares derivadas de islotes humanos en diferentes canales, los valores son media \pm SEM (n = 8), no hubo diferencias significativas en contenido de insulina entre las líneas celulares o número de canales incrementados.

La figura 10 representa la capacidad de respuesta a glucosa de las células 1.1B4 (A), 1.1E7 (B), 1.4E7 (C) y 1.2B4 (D) derivadas de islotes humanos, tras 40 minutos de preincubación, los efectos de diversas concentraciones de glucosa se probaron durante incubaciones de 60 minutos, los valores son media \pm SEM (n = 12), *\rho < 0,05, ** \rho < 0,01, *** \rho < 0,001 comparados con glucosa 0 mM.

La figura 11 representa la insulina liberada desde clones derivados de islotes humanos en glucosa 1,1 mM como un % del contenido celular de insulina, tras 40 minutos de preincubación, los efectos de glucosa 1,1 mM se probaron durante incubación de 60 minutos, los valores son media \pm SEM (n = 12).

La figura 12 representa la capacidad de respuesta a glucosa de las células 1.1B4 (A), 1,1E7 (B), 1.4E7 (C) y 1.2B4 (D) en presencia de IBMX (200 \muM), tras 40 minutos de preincubación, los efectos de diversas concentraciones de glucosa se probaron en presencia de IBMX (200 \muM) durante incubación de 60 minutos, los valores son media \pm SEM (n = 12), *\rho < 0,05, ** \rho < 0,01, *** \rho < 0,001 comparados con glucosa 0 mM (en presencia de IBMX 200 \muM).

La figura 13 representa los efectos de IBMX (200 \muM) en capacidad de respuesta a glucosa de células 1.1B4 derivadas de islotes humanos, tras 40 minutos de preincubación, la secreción de insulina se midió después de incubaciones de 60 minutos en presencia de los secretagogos indicados, los valores son media \pm SEM (n = 12), \Delta\Delta\Delta\rho < 0,001 comparados con control a la misma concentración de glucosa.

La figura 14 representa los efectos de IBMX (200 \muM) en capacidad de respuesta a glucosa de células 1.1E7 derivadas de islotes humanos, tras 40 minutos de preincubación, la secreción de insulina se midió después de incubaciones de 60 minutos en presencia de los secretagogos indicados, los valores son media \pm SEM (n = 12), \Delta\Delta\Delta\rho < 0,001 comparados con control a la misma concentración de glucosa.

La figura 15 representa los efectos de IBMX (200 \muM) en capacidad de respuesta a glucosa de células 1.4E7 derivadas de islotes humanos, tras 40 minutos de preincubación, la secreción de insulina se midió después de incubaciones de 60 minutos en presencia de los secretagogos indicados, los valores son media \pm SEM (n = 12), \Delta\rho < 0,05, \Delta\Delta\Delta\rho < 0,001 comparados con control a la misma concentración de glucosa.

La figura 16 representa los efectos de IBMX (200 \muM) en capacidad de respuesta a glucosa de células 1.2B4 derivadas de islotes humanos, tras 40 minutos de preincubación, la secreción de insulina se midió después de incubaciones de 60 minutos en presencia de los secretagogos indicados, los valores son media \pm SEM (n = 12).

La figura 17 representa la capacidad de respuesta a glucosa de las células 1.1B4 (A), 1,1E7 (B), 1.4E7 (C) y 1.2B4 en presencia de 5-tioglucosa (2 mM), tras 40 minutos de preincubación, los efectos de diversas concentraciones de glucosa se probaron en presencia de 5-tioglucosa (2 mM), durante 60 minutos de incubaciones, los valores son media \pm SEM (n = 12), *\rho < 0,05, ** \rho < 0,01, *** \rho < 0,001.

La figura 18 representa los efectos de 5-tioglucosa (2 mM) en capacidad de respuesta a glucosa de células 1.1B4 derivadas de islotes humanos, tras 40 minutos de preincubación, la secreción de insulina se midió después de incubaciones de 60 minutos en presencia de los secretagogos indicados, los valores son media \pm SEM (n = 12), \Delta\Delta\rho < 0,01, \Delta\Delta\Delta\rho < 0,001 comparados con control a la misma concentración de glucosa.

La figura 19 representa los efectos de 5-tioglucosa (2 mM) en capacidad de respuesta a glucosa de células 1.1E7 derivadas de islotes humanos, tras 40 minutos de preincubación, la secreción de insulina se midió después de incubaciones de 60 minutos en presencia de los secretagogos indicados, los valores son media \pm SEM (n = 12), \Delta\Delta\Delta\rho < 0,001 comparados con control a la misma concentración de glucosa.

La figura 20 representa los efectos de 5-tioglucosa (2 mM) en capacidad de respuesta a glucosa de células 1.1E7 derivadas de islotes humanos, tras 40 minutos de preincubación, la secreción de insulina se midió después de incubaciones de 60 minutos en presencia de los secretagogos indicados, los valores son media \pm SEM (n = 12), \Delta\rho < 0,05, \Delta\Delta\rho < 0,01 comparados con control a la misma concentración de glucosa.

La figura 21 representa los efectos de 5-tioglucosa (2 mM) en capacidad de respuesta a glucosa de células 1.2B4 derivadas de islotes humanos, tras 40 minutos de preincubación, la secreción de insulina se midió después de incubaciones de 60 minutos en presencia de los secretagogos indicados, los valores son media \pm SEM (n = 12), \Delta\Delta\Delta\rho < 0,001 comparados con control a la misma concentración de glucosa.

La figura 22 representa los efectos de estimuladores conocidos de la función de las células B pancreáticas en secreción de insulina desde células 1.1B4 derivadas de islotes humanos a glucosa 5,6 u 11,1 mM, gráfica A o B respectivamente, tras 40 minutos de preincubación, se probaron los efectos de diversas adiciones a 5,6 (A) o 11,1 (B) mM de glucosa, los valores son media \pm SEM (n = 12), \rho < 0,05, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 comparados con glucosa 5,6 (A) o 11,1 (B) mM sola.

La figura 23 representa los efectos de estimuladores conocidos de la función de las células B pancreáticas en secreción de insulina desde células 1.1E7 derivadas de islotes humanos a glucosa 5,6 u 11,1 mM, gráfica A o B respectivamente, tras 40 minutos de preincubación, se probaron los efectos de diversas adiciones a 5,6 (A) u 11,1 (B) mM de glucosa, los valores son media \pm SEM (n = 8), \rho < 0,05, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 comparados con glucosa 5,6 (A) o 11,1 (B) mM sola.

La figura 24 representa los efectos de estimuladores conocidos de la función de las células B pancreáticas en secreción de insulina desde células 1.1E7 derivadas de islotes humanos a glucosa 5,6 ó 11,1 mM, gráfica A o B respectivamente, tras 40 minutos de preincubación, se probaron los efectos de diversas adiciones a glucosa 5,6 (A) o 11,1 (B) mM, los valores son media \pm SEM (n = 12), \rho < 0,05, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 comparados con glucosa 5,6 (A) o 11,1 (B) mM sola.

La figura 25 representa los efectos de estimuladores conocidos de la función de las células B pancreáticas en secreción de insulina desde células 1.2B4 derivadas de islotes humanos a glucosa 5,6 ó 11,1 mM, gráfica A o B respectivamente, tras 40 minutos de preincubación, se probaron los efectos de diversas adiciones a glucosa 5,6 (A) o 11,1 (B) mM, los valores son media \pm SEM (n = 12), \rho < 0,05, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 comparados con glucosa 5,6 (A) o 11,1 (B) mM sola.

La figura 26 representa los efectos de estimuladores conocidos de la función de las células B pancreáticas en secreción de insulina desde células 1.1B4, 1.1E7, 1.4E7 y 1.2B4 derivadas de islotes humanos, gráfica A, B, C o D respectivamente, tras 40 minutos de preincubación, se probaron los efectos de diversas adiciones a glucosa 16,7 mM durante incubaciones de 60 minutos, los valores son media \pm SEM (n = 12), \rho < 0,05, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 comparados con glucosa 16,7 mM sola, los efectos de EGTA se determinaron en tampón libre de calcio.

La figura 27 representa los efectos del número de canal en estimulación de secreción de insulina desde líneas celulares secretoras de insulina, tras 40 minutos de preincubación, se probaron los efectos de diversas adiciones durante un periodo de incubación de 60 minutos, los valores son media \pm SEM (n = 12), \rho < 0,05, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 comparados con glucosa 0 mM, no hubo diferencias significativas entre el canal 17 y el 40.

La figura 28 muestra un análisis de bandas de Western para proteína transportadora de glucosa GLUT-1 en (A) células de islotes humanos clonales PANC-1 y derivadas y (B) células de islotes humanos clonales Hup-T_{3}-1 y derivadas, donde L es hígado de rata Wistar el cual se usó como un control positivo y C representa células parentales de PANC-1 y Hup-T_{3}-1 respectivamente.

La figura 29 muestra un análisis de bandas de Western para proteína glucoquinasa en (A) células de islotes humanos clonales PANC-1 y derivadas y (B) células de islotes humanos clonales Hup-T_{3}-1 y derivadas, donde L es hígado de rata Wistar el cual se usó como un control positivo y C representa células parentales de PANC-1 y Hup-T_{3}-1 respectivamente.

La figura 30 ilustra la captación de 3-O-metil-D-[1-^{3}H]glucosa por células PANC-1 o células derivadas de islotes humanos 1.1B4 a concentración de glucosa baja y alta, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a glucosa 1,1 ó 16,7 mM durante periodos de 0 a 360 segundos. Los valores son media \pm SEM (n = 3) , ***\rho < 0,001 cuando se compara con PANC-1 a glucosa 16,7 mM, \Delta\rho < 0,05 cuando se comparan con PANC-1 a glucosa 1,1 mM.

La figura 31 ilustra la captación de 3-O-metil-D-[1-^{3}H]glucosa por células PANC-1 o células derivadas de islotes humanos 1.1E7 a concentración de glucosa baja y alta, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a glucosa 1,1 ó 16,7 mM durante periodos de 0 a 360 segundos, valores son media \pm SEM (n = 3), ***\rho < 0,001 cuando se compara con PANC-1 a glucosa 16,7 mM.

La figura 32 ilustra la captación de 3-O-metil-D-[1-^{3}H]glucosa por células PANC-1 o células derivadas de islotes humanos 1.1E7 a concentración de glucosa baja y alta, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a glucosa 1,1 ó 16,7 mM durante periodos de 0 a 360 segundos, los valores son media \pm SEM (n = 3), *\rho < 0,05, ***\rho < 0,001 cuando se comparan con PANC-1 a glucosa 16,7 mM.

La figura 33 ilustra la captación de 3-O-metil-D-[1-^{3}H]glucosa por células Hup-T_{3} o células derivadas de islotes humanos 1.2B4 a concentración de glucosa baja y alta, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a glucosa 1,1 ó 16,7 mM durante periodos de 0 a 360 segundos, valores son media \pm SEM (n = 3), *\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 cuando se compara con Hup-T_{3} a glucosa 16,7 mM.

La figura 34 ilustra las actividades de fosforilación de glucosa de PANC-1 o células 1.1B4, 1.1E7, y 1.4E7 derivadas de islotes humanos, las fracciones citoplásmicas solubles se sometieron a ensayo espectrofotométricamente para determinar las contribuciones relativas de glucoquinasa y hexoquinasa a las actividades de fosforilación total de glucosa de las células, los valores son media \pm SEM (n = 3), *\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 comparados con células PANC-1, el porcentaje de contribución a la actividad fosforilante de glucosa total se da entre paréntesis.

La figura 35 ilustra las actividades de fosforilación de glucosa de Hup-T_{3}-1 y células derivadas de islotes humanos 1.2B4, las fracciones citoplásmicas solubles se sometieron a ensayo espectrofotométricamente para determinar las contribuciones relativas de glucoquinasa y hexoquinasa a las actividades fosforilantes de glucosa totales, los valores son media \pm SEM (n = 3), no hubo diferencias significativas entre los dos tipos celulares, el porcentaje de contribución a la actividad de fosforilación de glucosa total se da entre paréntesis.

La figura 36 ilustra las actividades de oxidación a partir de D-[U-^{14}C]glucosa en PANC-1 y células 1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7 derivadas de islotes, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a diversas concentraciones de glucosa, los valores son media \pm SEM (n = 3), *\rho < 0,05, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 cuando se comparan con glucosa 1,1 mM.

La figura 37 ilustra los efectos de 5-tioglucosa en la oxidación de glucosa a partir de D-[U-^{14}C]glucosa en PANC-1, células 1.1B4, 1.1E7, y 1.4E7 derivadas de islotes humanos, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a diversas concentraciones de glucosa, los valores son media \pm SEM (n = 3), \Delta\Delta\Delta\rho < 0,001 cuando se comparan con la misma concentración de glucosa en ausencia de 5-tioglucosa, *\rho < 0,05, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 cuando se comparan con glucosa 1,1 mM en ausencia de 5-tioglucosa.

La figura 38 ilustra utilización de glucosa a partir de D-[1-^{3}H]glucosa en PANC-1, y células 1.1B4, 1.1E7, y 1.4E7 derivadas de islotes en presencia o ausencia de 5-tioglucosa, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a diversas concentraciones de glucosa, los valores son media \pm SEM (n = 3), ***\rho < 0,001 cuando se comparan con glucosa 1,1 mM en ausencia de 5-tioglucosa, \Delta\rho < 0,05 comparados con la misma concentración de glucosa en ausencia de 5-tioglucosa.

La figura 39 ilustra utilización de glucosa a partir de D-[U-^{14}C]glucosa en Hup-T_{3}-1 y células 1.2B4 derivadas de islotes humanos, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a diversas concentraciones de glucosa, los valores son media \pm SEM (n = 3), *\rho < 0,05, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 cuando se comparan con glucosa 1,1 mM.

La figura 40 ilustra los efectos de 5-tioglucosa u oxidación de glucosa a partir de D-[U-^{14}C]glucosa en Hup-T_{3}-1 y células 1.2B4 derivadas de islotes humanos, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a diversas concentraciones de glucosa, los valores son media \pm SEM (n = 3), \Delta\Delta\rho < 0,01, \Delta\Delta\Delta\rho < 0,001 cuando se comparan con la misma concentración de glucosa en ausencia de 5-tioglucosa, **\rho < 0,01, ***\rho < 0,001 cuando se comparan con glucosa 1,1 mM en ausencia de 5-tioglucosa.

La figura 41 ilustra la utilización de glucosa a partir de a partir de D-[U-^{14}C]glucosa en Hup-T_{3}-1 y células 1.2B4 derivadas de islotes humanos en presencia o ausencia de 5-tioglucosa, las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC a diversas concentraciones de glucosa, los valores son media \pm SEM (n = 3), ***\rho < 0,001 cuando se comparan con glucosa 1,1 mM en ausencia de 5-tioglucosa, \Delta\Delta\Delta\rho < 0,001 cuando se comparan con la misma concentración de glucosa en ausencia de 5-tioglucosa.

La figura 42 muestra tinción inmunocitoquímica para glucoquinasa celular (aumento x 400).

La figura 43 muestra tinción inmunocitoquímica para insulina celular (aumento x 400).

La figura 44 muestra tinción inmunocitoquímica para polipéptido amiloide de islote celular (IAPP) (aumento x 400).

La figura 45 muestra tinción inmunocitoquímica para glucagón celular (aumento x 400).

La figura 46 muestra tinción inmunocitoquímica para somatoestatina celular (aumento x 400).

Figura 47-Tabla 1: detalles respecto a preparaciones de islotes humanos.

Figura 48-Tabla 2: cinéticas de captación de 3-O-metil-D-[1-^{3}H]glucosa de PANC-1, HuP-T3 y líneas celulares secretoras de insulina derivadas de islotes humanos.

Figura 49-Tabla 3: mitad del tiempo de equilibración máxima de cinéticas de captación de 3-O-metil-D-[1-^{3}H]glucosa en PANC-1, HuP-T3 y líneas celulares secretoras de insulina derivadas de islotes humanos.

Figura 50-Tabla 4: flujo metabólico relativo a través de metabolismo de glucosa oxidativo en HuP-T3, PANC-1 y líneas celulares secretoras de insulina derivadas de islotes humanos incubadas en glucosa a 1,1 ó 16,7 mmol/l en ausencia o presencia de 5-tioglucosa (2 mmol/l).

Figura 51-Tabla 5: sumario de investigación inmunocitoquímica de proteínas funcionales en líneas celulares de islotes humanos novedosas y parentales.

Figura 52-Tabla 6: sumario de características funcionales de líneas celulares de islotes humanos novedosas

Figura 53-Tabla 7: resultados de perfil de identidad de 1.4E7.

Figura 54-Tabla 8: resultados de perfil de identidad de 1.1E7.

Figura 55-Tabla 9: resultados de perfil de identidad de 1.1B4.

Figura 56-Tabla 10: resultados de perfil de identidad de 1.2B4.

Las siguientes realizaciones de la presente invención describen el uso de parámetros de electrofusión optimizados para la generación de líneas celulares humanas secretoras de insulina. Se comunican estudios detallados sobre las características y propiedades funcionales de los clones de células B pancreáticas humanas establecidos. Los islotes humanos se aislaron por el Profesor R. Gomis (Barcelona, España) y se enviaron en medio de cultivo de tejidos por mensajero al día siguiente a Coleraine. Se emplearon 3 donantes de páncreas bajo el visto bueno ético local. El primer lote de 400 islotes de un donante masculino de 30 años se recibió el 13-6-1997. El segundo lote de 400 islotes de un donante masculino de 25 años se recibió el 17-10-1997. El tercer lote de 400 islotes de un donante masculino de 28 años se recibió el 3/12/1997 (tabla 1). Los islotes se disgregaron en células individuales y se cultivaron durante toda una noche en medio de cultivo RPMI 1640 antes de los estudios de electrofusión.

Las líneas celulares PANC-1 y Hup-T_{3} inmortales se obtuvieron a partir de ACECC en los canales 60 y 52, respectivamente. PANC-1 es una línea epitelial celular derivada de un carcinoma pancreático de origen ductal de un varón caucasiano de 56 años de edad (Lieber y col., 1975). La línea celular Hup-T_{3} es una línea celular epitelial derivada de ascites tomada de un varón japonés de 66 años de edad (Nishimura y col., 1993). Los compañeros de fusión celular humanos derivados de islotes inmortales, TRM-1, HAP% y B6 se proporcionaron por el Profesor Hayek (California, EE.UU) y tienen un número de canal de 8, 15 y 10, respectivamente.

La viabilidad de células preparadas a partir de las tres preparaciones de células de islotes humanos, valoradas por exclusión de azul de trypan después de cultivo durante toda una noche, fue del 67%, 39% y 71%, respectivamente (tabla 1). Las células de islotes se resuspendieron después en medio de fusión a una densidad de 2 x 10^{6} células/ml. Las líneas celulares pancreáticas humanas (PANC-1, Hup-T_{3}, TRM-1, B6 o HAP6) se recogieron, se lavaron dos veces con medio de fusión y se resuspendieron en medio de fusión a una densidad de 2 x 10^{6} células/ml. Se mezclaron ambos tipos de células a razón de 1:1 y 300 \mul de mezcla celular se pipetearon en una cámara helicoidal (Biojet, B. Braun, Biotech, Alemania). Esta cámara helicoidal se diseñó estrechamente idéntica con cámara de armazón pero operando en condiciones estériles. La cámara helicoidal se conectó con suministro de energía y después se expuso en 7 voltios, 2 MHz de campo CA durante 30 segundos seguida por 60 voltios, pulsos triples de tiempos de 15 segundos de duración de campo CC. Las células se expusieron después a 7 voltios, 2 MHz de campo CA durante 30 segundos como alineamiento post-fusión.

La mezcla de fusión se eliminó después mediante flujo de la cámara helicoidal con medio de cultivo RPMI 1640 y dividido igualmente en una placa de 24 pocillos. Las células se incubaron durante toda una noche a 37ºC. El medio de cultivo de RPMI 1640 suplementado con HAT (hipoxantina a 0,1 mmol/l, aminopterina a 0,4 \mumol/l y timidina a 16,0 \mumol/l) se reemplazaron después de cultivo de 24 horas y las células se mantuvieron en este medio selectivo durante un periodo de 10 días. La mezcla de fusión celular se cultivó después en medio de cultivo de RPMI 1640 suplementado con HT (hipoxantina a 0,1 mmol/l y 16,0 \mumol/l de timidina) y las células se mantuvieron en este medio hasta que las colonias de híbridos se vieron bajo observación microscópica.

Las colonias de células híbridas normalmente aparecieron después de 10 a 20 días de fusión como se observó bajo un microscopio invertido. Las colonias se mantuvieron durante otros 10-20 días antes de que el medio se reemplazase durante 24 horas antes de rastrear. Un procedimiento de rastreo simple se usó para seleccionar células secretoras de insulina híbridas a partir de mezcla de fusión. Con el fin de determinar con seguridad la concentración de insulina en las muestras, se prepararon controles usando medios de cultivo solos o medios de cultivo de 24 horas de células parentales. Esta aproximación permite corrección automática de la posible presencia de insulina o sustancias que interfieren en el medio de cultivo.

Se eliminaron alícuotas de 200 \mul de medio de cultivo por duplicado y la concentración de insulina liberada en medio de cultivo se midió mediante radioinmunoensayo como se describe más adelante. Se seleccionaron los pocillos que contienen células secretoras de insulina híbridas y se cosecharon células de cada pocillo y se dividieron en placas de 24 pocillos para la siguiente etapa de rastreo.

Las líneas celulares secretoras de insulina humanas novedosas se cultivaron en medio de cultivo de RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (v/v) y antibióticos (penicilina a 100 \mug/ml y estreptomicina a 0,1 g/l). Las células se mantuvieron bajo condición de cultivo (37ºC, CO_{2} al 5% y 95% de aire) antes de que las células se usaran para experimentos. Donde las células apropiadas se criopreservaron y almacenaron.

Las células se cosecharon con la ayuda de tripsina y después se resuspendieron a una densidad de 5 x 10^{5} células por pocillo en placas de 6 pocillos y se dejaron unir durante toda una noche en el incubador a 37ºC. Tras la eliminación del medio de cultivo de tejidos, las monocapas de células que crecen se examinaron entonces usando un microscopio de contraste de fase (Zeiss, Alemania) y las imágenes se capturaron mediante paquete de software de Imagedok versión 2.0 (Kinetic Imaging Ltd., Reino Unido).

Las incubaciones estáticas agudas a 37ºC se llevaron a cabo usando monocapas de células secretoras de insulina. Veinticuatro horas antes de experimentación, las células se recogieron y después se resuspendieron en medio de cultivo de tejidos RPMI-1640. Aproximadamente se sembraron 2,5 x 10^{5} células después en cada pocillo de multiplacas de 24 pocillos (Iwaki Glass, Japón). Después del cultivo a 37ºC y la unión de células durante toda una noche, el medio de cultivo se eliminó, y se añadió cuidadosamente a cada pocillo 1 ml de tampón KRBB (pH 7,4) suplementado con seroalbúmina bovina (BSA) al 1% (p/v) y glucosa a 1,1 mmoles/l. Las células se incubaron a 37ºC durante 40 minutos, después de lo cual el tampón se eliminó y reemplazó con 0,5 KRBB de tampón de prueba. El tampón de prueba KRBB se suplementó con 0,5 g/l (p/v) de seroalbúmina bovina (BSA) y glucosa a 1,1 mol/l junto con los moduladores establecidos de la función de las células B pancreáticas. Después de incubación durante 60 minutos a 37ºC, una alícuota de 450 \mul de tampón de prueba KRBB se retiró de cada pocillo en un tubo de 2 ml de polipropileno (Lip Plastics, Inglaterra) y se centrifugó a 900 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se recogió después de cada tubo y se almacenaron entonces alícuotas de 200 \mul a -20ºC para determinación de insulina subsiguiente mediante radioinmunoensayo.

Después de recoger, las células se resuspendieron en medio de cultivo tisular, se sembraron a una densidad de 2,5 x 10^{5} células por pocillo, y se dejaron unir durante toda la noche para formar monocapas en multiplacas de 24 pocillos (Iwaki Glass, Japón). El medio de cultivo se eliminó completamente y se añadieron 500 \mul de disolución de etanol-ácido (1,5% (v/v) de HCl, 75% (v/v) de etanol, 23,5% (v/v) de H_{2}O). Las células se desbarataron con la ayuda de una pipeta Pasteur y se incubaron durante toda una noche a 4ºC antes de centrifugación a 900 r.p.m. durante 5 minutos. Los sobrenadantes se almacenaron a -20ºC para la determinación subsiguiente del contenido en insulina mediante inmunoensayo.

La insulina se midió mediante radioinmunoensayo de carbón activo-dextrano modificado (Albano y col., 1972) como se describe por Flatt y Bailey (1981). Se usó tampón fosfato de radioinmunoensayo de trabajo (40 mmol/l de tampón fosfato sódico, pH 7,4 suplementado con 0,5% (p/v) de seroalbúmina bovina) para diluir estándares de insulina humanos, anticuerpo de insulina, insulina unida a ^{125}I y muestras según sea apropiado. Los estándares de insulina humana se prepararon en un intervalo de diluciones seriadas 2 veces de 5,0 ng/ml a 0,009 ng/ml usando estándar de insulina humana (Sigma Chemical, Reino Unido). Se mezclan 200 \mul de la muestra estándar (pipeteada por triplicado) o muestra desconocida (pipeteada por duplicado) con 100 \mul de antisuero anti-insulina bovina de conejillo de Indias a dilución de aproximadamente 1:100.000) y se incubó durante 24 horas a 4ºC antes de la adición de 100 \mul de ^{125}I-insulina (aproximadamente 100 Pg). Este antisuero se seleccionó específicamente por alta afinidad con estándar de insulina humana.

Después de 24 horas adicionales de incubación a 4ºC, se añadió 1 ml de carbón activo al 5% (p/v) recubierto con dextrano T:70 1:10 en tampón fosfato de sodio (40 mmol/l, pH 7,4) a cada tubo. Después de 20 minutos de incubación (4ºC), cada tubo se centrifugó a 2500 r.p.m. durante 20 minutos (4ºC). El sobrenadante se decantó y las cuentas de ^{125}I-insulina unida a carbón activo se registraron usando un contador gamma (Contador Multigamma 1261, LKB Wallac, Turku, Finlandia) ligada a un ordenador (Olivetti PCS 286). Las cuentas unidas a anticuerpo (cuentas totales promedio menos cuentas unidas a carbón activo) son inversamente proporcionales a la concentración de insulina en la muestra estándar o desconocida. La concentración desconocida se determinó por medio de la curva estándar, se construyó a partir del estándar de insulina de rata conocido usando un algoritmo de ajuste de curva de tira. Esta ensayo da un 10%, 50% y 90% de caída en cuentas unidas con una adición de insulina humana a 19 pg/ml, 250 pg/ml y 2,5 ng/ml, respectivamente.

La concentración de proteínas se determinó usando una modificación del procedimiento descrito por Bradford (1979). El ensayo de proteínas de Bio-Rad es un ensayo de unión a tinción basado el cambio de absorbancia diferencial de Azul Brillante de Coomassie G250 bajo condiciones ácidas en respuesta a diversas concentraciones de proteína. El reactivo de ensayo de proteína de Bio-Rad se diluyó con agua destilada y ácido acético glacial en la razón de 4:5:1 respectivamente. Esto se filtró después a través de filtro de grado Whatman Nº.: 1 antes de usar. Los estándares conocidos se prepararon en el intervalo de 1-20 \mug/\mul de seroalbúmina bovina en agua destilada. El reactivo (200 \mul) y la muestra de 25 \mul (proteína estándar o desconocida) se mezclaron varias veces mediante inversión suave en placa de microtitulación. Después de un periodo de 30 minutos, la absorbancia a 595 nm se midió en un lector de placa de microtitulación (Thermo, Reino Unido). Se produjo una curva estándar de la BSA estándar cada vez que se llevó a cabo el ensayo, y se determinó la concentración de proteína de muestra.

Las líneas celulares (parental y clonal) se recogieron (aproximadamente 5 x 10^{7} células por preparación) y resuspendieron en medio salino tamponado con fosfato, a pH 7,4. Tras 6 ciclos de sonicación (10 segundos/ciclo) usando un Soniprep 150 (MSE, Reino Unido), los lisados celulares se centrifugaron durante 10 minutos a 10.000 r.p.m. (Ultracentrífuga Beckman, EE.UU.). El sobrenadante se recogió y centrifugó durante otra hora a 45.000 r.p.m. Los sobrenadantes de membrana obtenidos se resuspendieron en PBS y se midió la concentración de proteína de membrana mediante el ensayo de Bio-Rad como se describe anteriormente.

Las células de secreción de insulina se recogieron (aproximadamente 4 x 10^{7} células por preparación) y resuspendieron en medio de sonicación enfriado en hielo (Hepes a 20 mmol/l, manitol a 210 mmol/l, sacarosa a 70 mmol/l, ajustado a pH 7,4 usando KOH, suplementado con 1 mol/l de ditiotreitol y glicerol al 5%). Las células se sonicaron después (Soniprep 150, MSE, Reino Unido) durante 30 segundos a 4ºC. Una fracción citoplásmica soluble se obtuvo mediante tres etapas de centrifugación sucesivas a 4ºC de 5.000 r.p.m., 10.000 r.p.m., y 45.000 r.p.m., respectivamente (Lenzen y col., 1985). La concentración de proteína glucoquinasa se determinó usando el espectrofotómetro de UV/VISIBLE Varían Cary (Phillips, Reino Unido), registrando la formación de NADPH. Las velocidades de fosforilación de glucosa en las fracciones citoplásmicas solubles de 45.000 r.p.m. se sometieron a ensayo a 37ºC (pH 7,4) registrando el incremento en la absorbancia a 340 nm en mezcla de 500 ul que contiene Hepes a 20 mmol/l (ajustado a pH 7,4 con KOH), KCl a 125 mmol/l KCl, MgCl_{2} a 7,5 mmol/l, ATP a 5 mmol/l, NADP a 0,5 mmol/l, 700 U/I de glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa, 10 U/I de 6-P-gluconatodeshidrogenasa más sobrenadante citoplásmico (50 \mul) a partir de cada alícuota de células. La actividad hexoquinasa se sometió a ensayo en presencia de D-glucosa a 1 mmol/l y se sustrajo de la actividad total registrada a 100 mmol/l de D-glucosa para dar actividad glucoquinasa (Lernzen y col., 1985). Una unidad de actividad enzimática se definió como 1 \mumolar de glucosa-6-fosfato formada a partir de glucosa y ATP por minuto a 37ºC. La determinación de proteína se llevó a cabo en el sobrenadante de citoplasma usando el ensayo de Bio-Rad, como se describió previamente.

Las células secretoras de insulina se sembraron a una concentración de 2 x 10^{5} células/pocillo en placas de 35 mm^{2} de cultivo de tejidos (Nunclon, Dinamarca) y se cultivaron durante 24 horas a 37ºC. Se dieron a las células dos lavados rápidos en medio salino tamponado con fosfato y después se preincubaron durante 30 minutos a 37ºC en KBBB suplementado con glucosa a 1,1 mol/l y BSA al 0,1%. Las células se incubaron después con 0,5 ml de KRBB suplementado con 3-O-metil-D-[1-^{3}H]-glucosa (Amersham Pharmacia, EE.UU.) durante 0, 5, 10, 20, 60, 120, 240 y 360 segundos en 37ºC. Las concentraciones probadas de 3-O-metil-D-[1-^{3}H]-glucosa 1\muCi/ml se usaron en KRBB que contenía D-glucosa a 1,1 y 16,7 mmol/l. Durante la incubación, las placas se colocaron en una placa caliente calentada a 37ºC. La captación de tritio con 3-O-metil-D-[1-^{3}H]-glucosa se terminó con 3 lavados rápidos usando 0,5 ml de KRBB congelado en hielo que contiene glucosa a 100 mmol/l. Las células se lisaron después con 1 ml de dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,5% y se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadió (3 ml) el líquido de centelleo (HiSafe, BHD) al lisado y se mezcló bien. Los viales se dejaron durante 3 horas en la oscuridad para permitir elevarse a todas las burbujas a la superficie. Las cuentas de radiactividad en el lisado se cuantificaron mediante cuenta de centelleo líquido (contador de centelleo líquido Wallac 1409, Finlandia).

Se usó una modificación del procedimiento desarrollado por Keen y col. (1963) para determinar metabolismo de glucosa oxidativo a CO_{2}. En principio, el procedimiento implicó incubación de células en tazas de vidrio especialmente diseñadas suspendidas dentro de viales de cuenta estándar con un tapón de caucho hermético. Se situó un disco de papel de filtro (Whatman Nº.: 1) en la base de un vial de cuenta. Para cada muestra, se incubaron 2,0 x 10^{5} células en la presencia de cualquiera de glucosa a 1,1, 5,6, 11,1, 16,7 mmol/l y D-[U-^{14}C]glucosa para dar una concentración final de 0,25 \muCi (volumen total de 40 \mul de volumen total). El efecto de 1,5-tioglucosa a 2 mmol/l se probó también en glucosa a 1,1 y 16,7 mol/l. Los blancos se establecieron donde las células se omitieron y reemplazaron con KRBB para dar una concentración final de glucosa bien a 1,1 ó bien a 16,7 mmol/l. Los estándares constan de glucosa marcada con ^{14}C (0,5 \muCi) añadida al papel de filtro en la base del vial de cuenta. Los viales de vidrio se sellaron con las tapaderas de caucho y se situaron a 37ºC durante 1 hora. La reacción se paró mediante la adición de HCl 0,2 M (50 \mul) inyectado a través de la tapadera de goma directamente en el relleno del pocillo usando una jeringuilla de Hamilton. Se añadió (100 \mul) de feniletilamina (PEA) a través de la tapa sellada sobre el papel de filtro en la base del vial. Se tomó cuidado para evitar la contaminación del relleno del pocillo con PEA. Los viales se situaron después a 37ºC durante 1 hora. Las tapaderas de caucho y los rellenos de los pocillos se eliminaron y se añadieron 5 ml de líquido de centelleo (BHD) a cada vial en la parte de arriba del papel de filtro. Los viales se taparon y se determinó la radiactividad de la glucosa marcada con ^{14}C mediante contador de centelleo.

Se llevaron a cabo experimentos en tazas de vidrio especialmente diseñadas suspendidas dentro de viales de cuenta estándar con un tapón de caucho hermético. Para cada muestra, se incubaron 2,0 x 10^{5} células en la presencia de cualquiera de glucosa a 1,1, 5,6, 11,1, 16,7 mmol/l y D-[U-^{14}C]glucosa para dar una concentración final de 0,25 \muCi (volumen total de 40 \mul de volumen total). Los efectos de 1,5-tioglucosa a 2 mmol/l se probaron también en glucosa a 1,1 y 16,7 mol/l. Los blancos se establecieron donde las células se omitieron y reemplazaron con KRBB para dar una concentración final de glucosa bien a 1,1 ó bien a 16,7 mmol/l. Los estándares constan de glucosa marcada con ^{14}C (0,5 \muCi) añadida en la base del vial de cuenta. Los blancos se establecieron donde las células se omitieron y reemplazaron con KRBB para dar una concentración final de glucosa bien a 1,1 ó bien a 16,7 mmol/l. Los estándares constan de glucosa marcada con D-[5-H^{3}] (0,5 \muCi) añadida a la base del vial de cuenta. Los viales de vidrio se sellaron con las tapaderas de caucho y se situaron a 37ºC durante 1 hora. La reacción se paró mediante la adición de HCl 0,2 M (50 \mul) inyectado a través de la tapadera de goma directamente en el pocillo central usando una jeringuilla de Hamilton. Se añadió agua desionizada (500 \mul) a través de la tapa sellada en la base del vial. Los viales se situaron después a 37ºC durante 15 horas. Las tapaderas de caucho y los pocillos centrales se eliminaron y se añadieron 5 ml de líquido de centelleo (BHD) a cada vial en la parte de arriba del papel de filtro. Los viales se taparon y se determinó la radiactividad de la glucosa marcada con ^{3}H mediante contador de centelleo.

Preparación de gel de SDS-PAGE

Se preparan los siguientes reactivos y tampón:

Tampón de gel inferior:	Tris-HCl a 1,5 mmol/l, pH 8,8
Tampón de gel superior:	Tris-HCl a 0,5 mmol/l, pH 6,8
Tampón de electrodos:	Tris a 25 mol/l, glicina a 192 mmol/l y SDS al 0,1% (p/v).
Tampón de muestra:	\begin{minipage}[t]{105mm} Tris 125 mol/l, pH 6,8 que contienen dodecil sulfato sódico (SDS), glicerol al 30% (v/v),azul de bromofenol al 0,002% (p/v) y 2\beta mercaptoetanol. \end{minipage}
Acrilamida:	acrilamida al 30% (p/v).

Un aparato de minigel de bloque vertical (Bio-rad) se usó para este análisis. El gel se moldea en un cartucho de vidrio, con lámina de perspex mantenida unida en el aparato de gel. Las dimensiones del gel fueron 80 mm x 73 mm x 1 mm. La parte frontal y la trasera de vidrio se lavaron con detergente decon, se aclararon con agua del grifo y después con agua destilada y finalmente se lavaron con acetona y se dejaron para secar al aire. El cartucho se ensambló y sujetó con abrazaderas en posición vertical.

El gel inferior se preparó mezclando los siguientes reactivos en un tubo universal de 25 ml: tampón de gel inferior (2,5 ml), agua destilada (4,2 ml), SDS al 10% (p/v) (100 \mul), acrilamida (3,3 ml) y persulfato de amonio al 10% (p/v) (50 \mul). La polimerización se inició mediante la adición de 5 \mul de N,N,N',N'-tetrametil-etilendiamina (TEMED). La disolución se vertió en el cartucho a una altura de 10 cm. Una capa fina de agua destilada se situó en la cima de la disolución de gel para asegurar una interfase plana entre el gel superior y el inferior. La polimerización del gel inferior se completó en 60-90 minutos, tiempo al cual la fase de agua se elimina.

El gel apilado superior se preparó mezclando los siguientes reactivos en un tubo universal de 25 ml: tampón de gel superior (1,25 ml), agua destilada (3,05 ml), SDS al 10% (p/v) (50 \mul), acrilamida (670 \mul) y persulfato de amonio al 10% (p/v) (25 \mul), La polimerización se inició mediante la adición de 5 \mul de N,N,N',N'-tetrametil-etilendiamina (TEMED) y el gel apilado superior se vertió en el cartucho encima del gel inferior. Un peine de perspex se introdujo dentro del gel superior para formar los pocillos de muestra y después de aproximadamente 30 minutos el gel había polimerizado. El contenido en proteínas se determinó usando en procedimiento de Bradford como se describe previamente. Las muestras (GLUT-1 y preparaciones de proteína glucoquinasa) se hirvieron después durante 5 minutos en un baño de agua para desnaturalizar la proteína antes de cargar dentro de los pocillos de muestra. El peine se eliminó subsiguientemente formando pocillos de muestra dentro de los cuales se cargaron la muestra de proteínas (que contiene 100 \mug de proteína) y el marcador de peso molecular biotinilado de proteína (Amersham, Reino Unido). El cartucho se situó después dentro del tanque de electroforesis. El tanque se ensambló después y el tapón de electrodos se situó en los reservorios superior e inferior.

La electroforesis se llevó a cabo inmediatamente tras la carga de la muestra a una corriente constante de 40 mA, 120 voltios usando un alimentador de corriente de Pharmacia EPS500/400 (Pharmacia, EE.UU.) hasta que la banda de azul de bromofenol ha migrado al borde inferior del gel que corre inferior, la corriente se apagó después. El cartucho se retiró después del tanque de electroforesis y las placas de vidrio se separaron, el gel inferior se separó del gel superior apilado y se usó para la transferencia de proteínas sobre nitrocelulosa para análisis de bandas de Western.

Los siguientes tampones se prepararon para análisis mediante prueba de bandas de Western y detección. El tampón de transferencia comprende Tris (20 mmol/l), glicina (150 mmol/l) y un 15% de metanol (v/v). El tampón de lavado comprende medio salino tamponado con fosfato (PBS) suplementado con monolaurato de sorbitán polioxietileno (Tween-20) al 0,2%. El tampón de bloqueo comprende PBS suplementado con leche desnatada en polvo al 2,5% (p/v).

Para análisis de Western, el gel que corre inferior se eliminó del cartucho y se situó en el tampón de transferencia (30 ml) durante 30 minutos para permitir al tampón permear el gel y reemplazar el tampón de electrodos. Durante este tiempo el gel se encogió según se equilibró con el tampón de transferencia. Después de la equilibración, el gel se eliminó y se situó dentro del cartucho de transferencia. El cartucho se preparó bajo tampón de transferencia y todas las burbujas de aire se eliminaron apisonando con un tubo de prueba de vidrio.

Una vez ensamblado, el cartucho se situó dentro de un tanque de transferencia con la lámina de nitrocelulosa lo más cerca del electrodo positivo. La transferencia se llevó a cabo a una corriente constante de 350 mA, 100 voltios durante 90 minutos usando Sistema Transblot de Bio-rad (Richmond, CA, EE.UU.) de acuerdo al procedimiento de Towbin y col. (1979). El cartucho se abrió y la membrana de nitrocelulosa se situó dentro de 25 ml del tampón de bloqueo y se balanceó durante una hora seguida por incubación durante toda una noche a 4ºC.

La nitrocelulosa se lavó en disolución de PBS-T cinco veces durante 5 minutos cada una, tras la incubación durante 1 hora con el anticuerpo GLUT-1 primario (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) o anticuerpo de glucoquinasa (S. Lenzen, Hanover, Alemania) diluido (1:1000) en PBS. Las etapas de lavado se repitieron antes de una hora de incubación de la membrana con anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano picante (Amersham, Reino Unido) diluida en PBS (1:1000). Las membranas se lavaron e incubaron después durante una hora en conjugado estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) diluido (1:1500) en PBS. Después de las etapas de lavado finales (que constan de 3 lavados de 5 minutos de duración en tampón de lavado, seguidos por 2 lavados en PBS solo) la señal de expresión de proteínas se visualizó usando el sistema de detección de quimioluminiscencia potenciada (ECL) de Amersham. Básicamente, este sistema trabaja sobre la oxidación catalizada por HRP/H_{2}O_{2} de luminol en condiciones alcalinas, en presencia de potenciadores químicos tales como fenoles. La luz producida mediante esta reacción de quimioluminiscencia potenciada se puede detectar mediante la exposición corta (30 segundos) a película de autorradiografía sensible a luz azul , Hyperfilm ECL (Amersham, Reino Unido).

Antes de los estudios inmunoquímicos, cada línea celular se plaqueó sobre láminas de incubación "supercelulares" que contienen 8 cámaras de plastico separadas por lámina (BDH/Merck, Reino Unido) y se situó en cultivo a 37ºC durante toda una noche para permitir a las células adherirse a las láminas. Las cámaras de plástico que tienen el medio de cultivo de tejido se eliminaron cuidadosamente y las laminas se lavaron brevemente en medio salino tamponado con fosfato (PBS, Oxoid) antes de fijación en 4% de paraformaldehído enfriado en hielo (BDH/Merck)/PBS durante 20 minutos. Después de lavar con PBS, las células se permeabilizaron en una disolución de tritón X-100 al 0,3% (Sigma Chemicals) durante 15 minutos. Lavados adicionales en PBS se siguieron por bloquear las células con suero de cabra normal al 2% (Vector Laboratories, CA, EE.UU.)/BSA al 1%/PBS durante 90 minutos a temperatura ambiente. La incubación con el anticuerpo primario (antisuero antiporcino de conejillo de indias de insulina y glucagón del Profesor PR. Flatt, usado a una disolución de 1:1000; anticuerpo policlonal de cabra purificado con afinidad por Glut 1 de Santa Cruz biotechnology CA, EE.UU., usado a una dilución de 1:100; antisueros de conejo frente a somatoestatina y amilina humanas de Penninsula Laboratories Inc., Belmont, CA, EE.UU., usados todos a una disolución de 1:200, antisueros policlonales de glucoquinasa de rata, proporcionados por el Profesor Sigurd Lenzen (Hannover, Alemania), usados a una dilución de 1:1000) se llevaron a cabo durante 1 hora a 37ºC, todas las diluciones se hicieron en suero normal de cabra al 0,2%/BSA al 0,1%/PBS. Después de lavado cuidadoso en PBS se incubaron células con IgG anticonejo de fluoresceína (H+L) hecho en cabra (Vector Laboratories, CA, EE.UU.) a una dilución de 1:40 en PBS, durante 45 minutos a 37ºC. Se dio a las láminas 5 lavados x 5 minutos en PBS y se montaron bajo un cubreobjetos de vidrio en una disolución de glicerol al 50% (Sigma Chemicals)/PBS al 50%. La tinción inmunohistoquímica se visualizó usando un microscopio Nikon OP-5 y las imágenes se registraron usando el programa Imagedok para PC.

El procedimiento para rastreo se resume en la figura 1. Las células híbridas producidas mediante electrofusión se seleccionaron a través de un procedimiento de rastreo basado en un alto nivel de producción de insulina. Básicamente, para un experimento de electrofusión la mezcla de fusión celular se dividió en 24 pocillos y la medición de la producción de insulina se tomó sobre las 24 horas finales de los días 30 a 35 de periodo de cultivo. Los experimentos iniciales se llevaron a cabo usando los compañeros de fusión de células humanas derivadas de islotes inmortales, TRM-1, HAP5 y B6 proporcionados por el Profesor Hayek (California, EE.UU.). Los resultados de 2 experimentos de fusión entre células TRM-1 sensibles a HAT y células de islotes humanos se resumen en la figura 2. La selección de post-fusión reveló que los híbridos celulares supervivientes en 24 pocillos, con 13 pocillos que contienen híbridos secretores de insulina a los 40 días. Los intentos de clonar los híbridos de liberación de insulina se frustraron por declinar rápidamente la velocidad de crecimiento indicando que la línea celular TRM-1 no se inmortalizó totalmente. Se obtuvieron resultados similares usando células HAP5 y B6 (datos no mostrados), al menos ilustrando un rendimiento esperado de aproximadamente 10 células humanas híbridas por fusión. Dos fusiones con células HAP5 produjeron 12 y 11 híbridos de los cuales 4 y 6 produjeron insulina a 12 días. Las dos fusiones de células B6 produjeron 15 y 13 híbridos con 5 y 3 liberando insulina en el día 6.

En vista de los problemas con los compañeros de fusión adoptados previamente (TRM-1, HAP5 y B6), se centró la atención en el uso de células de adenocarcinoma pancreático humano, PANC-1 y Hup-T_{3}, obtenidos a partir de la European Collection of Animal Cell Culture (ECACC). Se establecieron para estas líneas celulares los clones sensibles a HAT y los parámetros de electrofusión. El procedimiento de rastreo el cual implica fusión entre PANC-1 y células de islotes humanos reveló 5 híbridos de colonias híbridas positivas del total de 25 colonias híbridas (figura 1, 3A, 4A). Las células del pocillo A y el pocillo B se seleccionaron para evaluación adicional. Después una serie de etapas de clonación, se aislaron los clones 1.1B4, 11E7 y 1.4E7 (figuras 3B-4B). Los otros 16 clones de liberación de insulina se criopreservaron pero no se estudiaron adicionalmente.

La línea celular 1.1E7 se produjo mediante fusión de células de islotes humanos con una línea celular establecida PANC-1, 1.4E7, P27, 07052001.

La línea celular 1.4E7 se produjo mediante fusión de células de islotes humanos con una línea celular establecida PANC-1, 1.4E7, P29, 07112001.

Se tomaron procedimientos de rastreo similares para fusión entre líneas celulares Hup-T_{3} y células de islotes humanos (figura 1). El primer rastreo después de 30 días de fusión mostró 13 pocillos de un total de 48 pocillos que contenían colonias híbridas, 4 de las cuales fueron híbridos insulina-positivos (figura 5A). Se seleccionaron las células híbridas del pocillo C para una serie de etapas de clonación, después de las cuales el clon deliberación de insulina 1.2B4 se aisló (figura 5B). Los otros 7 clones que liberan insulina se criopreservaron.

La línea celular 1.2B4 se produjo por fusión de células de islotes humanos con una línea celular Hup-T_{3} establecida, 1.2B4, P27, 07102001.

Como se muestra en las figuras 6-8, PANC-1, Hup-T_{3} parentales y los clones de células de islotes humanos derivados crecieron en forma de monocapas en cultivo de tejidos. Cuando confluyen cada línea celular adquiere un patrón pavimental como se observa rutinariamente con líneas celulares epiteliales. Las líneas celulares híbridas de islotes humanos mostraron patrones de crecimiento consistentes con tiempos que aproximadamente se doblan de 23 \pm 1,7 horas para células 1.1B4, 23 \pm 1,9 para células 1.1E7, 26 \pm 1,5 horas para células 1.4E7 y 36 \pm 2,1 horas para células 1.2B4 (n = 4). Todas las líneas celulares derivadas de islotes mantuvieron su apariencia morfológica gruesa y doblaron los tiempos en el canal 40. Los tiempos que aproximadamente se doblan de las células no fusionadas PANC-1 y Hup-T_{3} fueron 21 \pm 1,6 y 30 \pm 2,3 horas (n = 4), respectivamente.

Como se muestra en la figura 9, el contenido de insulina celular (media \pm SEM, n = 12) de células 1.1B4, 1.1E7, 1,4E7 y 1.2B4 en el canal 17 fue de 0,394 \pm 0,019, 0,354 \pm 0,021, 0,351 \pm 0,023 y 0,363 \pm 0,017 ng/10^{6} células respectivamente. En el canal 40, no hubo cambios significativos en el contenido de insulina celular de cada línea celular. Los contenidos de insulina a 0,408 \pm 0,024, 0,314 \pm 0,018, 0,361 \pm 0,02 y 0,306 \pm 0,02 ng/10^{6} células se observaron para células 1,1B4, 1.1E7, 1.4E7 y 1.2B4, respectivamente. Las células PANC-1 y Hup-T_{3} no contenían insulina inmunorreactiva.

Los efectos de glucosa en la secreción de insulina a partir de cada una de las 4 células de las líneas celulares de islotes humanos novedosas se muestran en la figura 10. Cada línea celular mostró un patrón y magnitud diferentes de capacidad de respuesta a exposición a concentraciones de glucosa agudas. Las células 1.1B4 mostraron una respuesta secretora de insulina de 2,3 veces por etapas para concentración de glucosa incrementante por encima del intervalo de 0 mmol/l a 16,7 mmol/l de glucosa, con un umbral para liberación de insulina a 5,6 mmol/l de glucosa. Tanto células 1.1E7 como células 1.4E7 mostraron respuesta secretora máxima de 1,6 y 1,5 veces a 11,1 mmol/l y 5,6 mmol/l de glucosa, respectivamente. En contraste células 1,2B4 derivadas de Hup-T_{3}, no mostraron respuesta de insulina significativa a glucosa por encima del intervalo de 0 mmol/l a 16,7 mmol/l de glucosa.

La liberación de insulina de clones derivados de islotas humanos en glucosa a 1,1 mmol/l como un % del contenido en insulina celular se mostró en figura 11. La de secreción de insulina basal para cada uno de los clones derivados de islotes humanos representa entre el 9% y el 11% de los contenidos de insulina celular.

La figura 12 muestra respuesta secretora de insulina a glucosa de cada una de las cuatro líneas celulares en presencia de isobutilmetilxantina (IBMX). La inclusión de 200 \muM/IBMX en el tampón de pruebas con diversas concentraciones de glucosa de 0 mmoles/l a 16,7 mmol/l potenciaron grandemente el efecto estimulador de glucosa sobre 1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7. Como se muestra en la figura 13-15, la respuesta secretora se incrementó significativamente del 20 al 100% mediante estimulación 1,3-2 veces (p < 0,001) de células 1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7. Sin embargo, la inclusión de IBMX no afectó significativamente a la insulina liberada de 1.2B4 (figura 16).

Los efectos de 5-tioglucosa sobre la capacidad de respuesta a glucosa aguda de las líneas celulares humanas se muestra en la figura 17. La capacidad de respuesta de todos los cuatro tipos de célula para incremento de las concentraciones de glucosa se mejoró mediante la inclusión de 5-tioglucosa en el tampón de incubación. Aunque 5-tioglucosa no parece incrementar el efecto estimulador de la glucosa, redujo grandemente la liberación basal de insulina y causó un cambio correcto generalizado en la capacidad de respuesta a glucosa de las líneas celulares 1.1B4, 1.1E7 y 1.2B4 hacia más concentraciones fisiológicas. La comparación de velocidades absolutas de liberación de insulina indicó que la inclusión de 5-tioglucosa bajó significativamente la producción de insulina de 1.4B4, 1.1E7 y 1.2B4 en un 20-50% (p < 0,05 a p < 0,001; figuras 18, 19, 21). De las líneas celulares probadas, las células 1.4E7 se afectaron menos por inclusión de 5-tioglucosa en las incubaciones (figura 19).

Como se muestra en figuras 22-25, los efectos de un intervalo de secretagogos nutrientes y farmacéuticos se probaron a dos diferentes concentraciones de glucosa (5,6 mmol/l y 11,1 mmol/l). Cada línea celular mostró diferencias tanto en la magnitud como en el patrón de capacidad de respuesta.

Las respuestas secretoras de células 1.1B4 a un intervalo de moduladores probados a 5,6 mmol/l de glucosa se muestran en la figura 22A. Todos los estimuladores, que incluyen gliceraldehído, leucina, KIC, arginina, alanina, tolbutamida y una concentración despolarizante de KCl, incrementan significativamente (p < 0,05 a p < 0,001) la secreción de insulina en 1,2-2 veces. Como se muestra en la figura 22B, el incremento de la concentración de glucosa de 5,6 mmol/l a 11,1 mmol/l incrementó significativamente (p < 0,01 a p < 0,001) los efectos de leucina, arginina y tolbutamida en un 30, 17, y 20%, respectivamente.

Las respuestas secretoras de insulina de células 1.1E7 al mismo intervalo de estimuladores se muestran en la figura 23. A 5,6 mmol/l de glucosa, gliceraldehído, arginina y KCl provocan significativamente respuestas secretoras de insulina 1.,2-1,8 veces (p < 0,05 a p < 0,001; figura 23A). Sin embargo cuando se sometieron a prueba a concentración de glucosa mayor de glucosa a 11,1 mmol/l, todos los estimuladores facilitaron una producción de insulina de incremento significativo (p < 0,05 a p < 0,001; figura 23B). Las respuestas a leucina, KIC, alanina y arginina fueron significativamente mayores a 11,1 mmol/l de glucosa comparadas con sus efectos a 5,6 mmol/l de glucosa (p < 0,05 a p < 0,001).

Las respuestas secretoras de insulina de células 1.4E7 y 1.1B4 a un intervalo de agentes fueron similares (figura 24 y 25). Así a 5,6 mmol/l de glucosa, ambas líneas celulares mostraron respuestas a insulina de 1,2-1,7 veces significativas (p < 0,05 a p < 0,001) cuando se probaron con gliceraldehído, arginina, tolbutamida o KCl. En presencia de glucosa a 11,1 mmol/l, las acciones estimuladoras de todos los agentes probados se incrementaron significativamente (p < 0,05 a p < 0,001; figura 24B y 25B). Además leucina, KIC y alanina indujeron cada uno secreción de insulina a partir de células 1.4E7 y 1.2B4 cuando se sometieron a prueba a la concentración de glucosa más alta (p < 0,05 a p < 0,001).

Los efectos del abridor del canal K^{+}-ATP, diazóxido en liberación de insulina de células 1.1B4, 1.1E7, 1.4E7 y 1.2B4 a 16,7 mmol/l de glucosa se muestran en la figura 26. El diazóxido (400 \mumol/l) causó una inhibición significativa del 20-50% de la liberación de insulina a partir de las líneas celulares (p < 0,01 a p < 0,001).

La inclusión del bloqueante del canal de Ca^{2+} dependiente de voltaje (VDCC), verapamilo inhibió de forma similar la liberación de insulina en un 20-40% (p < 0,05 a p < 0,001) para cada una de las líneas celulares (figura 26). Para evaluar la importancia del Ca^{2+} extracelular para la liberación de insulina inducida por glucosa, se empleó un tampón libre de Ca^{2+} suplementado con el quelante de Ca^{2+}, EGTA. Como se muestra en la figura 26 la depleción de Ca^{2+} disminuyó significativamente en secreción de insulina en un 20-40% (p < 0,01 a p < 0,001).

Como se muestra en la figura 27, no se registran diferencias significativas entre el canal 17 y el canal 40 en términos de liberación de insulina basal y capacidad de respuesta secretora frente a glucosa y KCl. Así todas las cuatro líneas celulares derivadas de islotes humanos fueron capaces de mantener capacidad de respuesta (p < 0,05 a p < 0,001) a glucosa o KCl en el canal 40. Como se muestra previamente (figura 9), el contenido celular de insulina fue estable a número de canal creciente.

Los estudios de caracterización de actividad secretora de insulina han establecido claramente que las cuatro líneas celulares de islotes humanos derivadas de electrofusión expresan muchos de los atributos funcionales importantes de la célula B parental. Los siguientes estudios proporcionaron una caracterización molecular fundamental de las vías acopladas de estímulos-secreción en estas líneas celulares nuevas.

La actividad transportadora de glucosa se considera generalmente como el primer prerrequisito para detectar glucosa en la célula B pancreática (Tiedge y col., 1993). La presencia de transportador de glucosa (GLUT-1) se confirmó mediante análisis con prueba de bandas de Western con SDS-PAGE usando un anticuerpo sensible frente a la proteína GLUT-1. Como se muestra en la figura 28, el anticuerpo detectó una proteína de aproximadamente 48 kDa en cada línea celular. Sin embargo, mientras que las células 1.1B4, 1.1E7, 1.4E7 y 1.2B4 expresaron niveles significativos de proteína (particularmente 1.1B4), el transportador GLUT-1 no fue demostrable en células PANC-1 ni en células Hup-T_{3} parentales.

Después del transporte de glucosa, el siguiente paso en el mecanismo de detección de glucosa implica la acción de la enzima de fosforilación de glucosa, glucoquinasa (Lenzen y Tiedge, 1994). La evaluación de la expresión de proteína glucoquinasa en células parentales y células híbridas que usan análisis con prueba de bandas de Western se muestra en la figura 29. Usando un anticuerpo específico dirigido contra la glucoquinasa, se detectó una proteína de 50 kDa en cada línea celular. No fue demostrable ninguna expresión de glucoquinasa en las células parentales PANC-1 y Hup-T_{3}.

El análisis adicional del aparato detector de glucosa, intentó unir los aspectos moleculares y funcionales de estas líneas celulares secretoras de insulina novedosas. La primera etapa implicó la caracterización de la capacidad de transporte de glucosa de células parentales y cada una de las líneas celulares.

Las células 1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7 mostraron diferentes perfiles de transporte de 3-O-metil-D-[1-^{3}H]glucosa (3-O-MG) a 1,1 y 16,7 mmol/l (figuras 30-32) consistentes con la presencia de GLUT-1 unido a la membrana funcional comparadas con células parentales (PANC-1). Como se muestra en las figuras 30-32, la capacidad de captación de glucosa fue significativamente mayor (p < 0,05 a p < 0,001) a 16,7 mmol/l de glucosa comparada con la de células parentales (PANC-1). Cuando la captación de glucosa se probó a 1,1 mmol/l de glucosa, sólo las células 1.1B4 registraron una capacidad de captación de glucosa significativamente mayor (p < 0,05) comparadas con células PANC-1 (figura 30).

Un patrón similar en términos generales de perfiles de captación de glucosa se registró en células 1.2B4 (figura 33). Esta línea celular mostró diferentes perfiles de transporte comparados con células parentales (Hup-T_{3}). A 16,7 mmol/l, la capacidad de captación de glucosa fue significativamente mayor en células 1.2B4 comparadas con células parentales (Hup-T_{3}). Sin embargo, cuando las células se sometieron a prueba en 3-O-MG a 1,1 mmol/l, no se registraron diferencias significativas.

Las propiedades de transporte de glucosa de cada línea celular de islotes humanos novedosa y las células parentales se compararon en base a su velocidad inicial de captación de 3-O-MG. Como se muestra en la tabla 2, la línea celular 1.2B4 exhibió incrementos de 5 a 6 veces en su velocidad inicial a 16,7 mmol/l de glucosa comparada con glucosa a 1,1 mmol/l. Las células parentales (Hup-T_{3}) presentaron un incremento en la velocidad de 5,2 veces. En presencia de glucosa a 16,7 mmol/l, las células 1.2B4 mostraron velocidad de captación inicial significativamente más alta (p < 0,05) comparadas con líneas celulares Hup-T_{3}. Sin embargo, cuando la captación 3-O-MG se considera por encima de 360 segundos, no se registraron diferencias significativas en la mitad del tiempo de equilibración máxima en 3-O-MG a 1,1 ó 16,6 mmol/l (tabla 2).

La velocidad inicial de captación de 3-O-MG por células 1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7 fue 5,1, 6,1 y 5,4 veces mayor a 16,7 mmol/l que a 1,1 mmol/l, respectivamente (tabla 2). En comparación, las células PANC-1 exhibieron incrementos de 4,6 veces en la velocidad inicial a 16,7 mmol/l de glucosa. Tanto a 1,1 mmol/l como a 16,7 mmol/l, se registraron diferencias significativas en captación de 3-O-MG entre PANC-1 y células 1.4B4en los primeros 10 segundos. En células 1.1E7 y 1.4E7, se registraron diferencias significativas (p < 0,05) sólo a 3-O-MG a 16,7 mmol/l. En términos de mitad del tiempo de equilibración máxima en 360 segundos tras las medidas, sólo 1.1B4 mostró una diferencia significativa (p < 0,05) (tabla 3).

Como se muestra en las figuras 34 y 35, los compañeros inmortales parentales y las líneas celulares de islotes mostraron diferencias considerables en las contribuciones relativas de glucoquinasa y hexoquinasa a la actividad total fosforilante de glucosa. La figura 34 muestra el porcentaje de actividad hexoquinasa representada (media \pm SEM, n = 3) 98,5 \pm 9,3, 57,4 \pm 4,6, 57,4 \pm 14,5 y 72,6 \pm 5,3% de la actividad total obtenida de PANC-1, 1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7, respectivamente. En células Hup-T_{3} y 1.2B4, el porcentaje de la actividad hexoquinasa representada (media \pm SEM, n = 6) es 45,2 \pm 5,5 y 63,8 \pm 9,9, respectivamente (figura 35). Las actividades de fosforilación de la glucosa en porcentaje de células PANC-1, 1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7, atribuidas a actividad glucoquinasa fueron 1,5 \pm 0,8, 42,6 \pm 9,6, 42,6 \pm 11,3 y 27,5 \pm 7,0%, respectivamente. En las células Hup-T_{3}y células 1.2B4 derivadas clonales, las actividades glucoquinasa en porcentaje fueron 54,7 \pm 7,4 y 36,1 \pm 6,4%, respectivamente. Con la excepción de las células 1.2B4, todas las líneas celulares novedosas exhibieron glucoquinasa significativamente más alta (p < 0,01-0,001) y hexoquinasa significativamente más baja (p < 0,01 a p < 0,001) (expresadas como porcentaje) comparadas con células PANC-1.

Los experimentos dirigidos a valorar la cantidad de glucosa que se oxida y utiliza en presencia de concentraciones variantes de glucosa y 5-tioglucosa, mostraron interesantes diferencias entre las células parentales y las líneas celulares de islotes humanos derivadas.

La línea celular 1.1B4 mostró los niveles más altos de oxidación de glucosa presentando un pico a 95,4 \pm 4 ,5 pmol/1000 células/hora a 11,1 mmol/l de glucosa (figura 36). A niveles de 16,7 mmol/l de glucosa la oxidación se parece estrechamente a aquella a 5,6 mmol/l. La inclusión de 5-tioglucosa fue capaz de inhibir la oxidación de glucosa tanto a 1,1 mmol/l como a 16,7 mmol/l de glucosa (figura 37). La utilización de glucosa por esta línea celular siguió un patrón ligeramente diferente con los niveles de utilización más altos registrándose a 136,5 \pm 1,7 pmol/1000 células/hora a 16,7 mol/l de glucosa (figura 38). La 5-tioglucosa no afecta a la utilización a 1,1 mmol/l de glucosa pero se muestra que reduce oxidación a 16,7 mmol/l de glucosa (figura 38).

La oxidación de glucosa mediante la línea celular 1.1E7 fue máxima a 16,7 mmol/l de glucosa dando un valor de 60,4 \pm 5,4 pmol/1000 células/hora (figura 36). A diferencia de en células 1.1E7, la 5-tioglucosa sólo inhibió de forma marginal la oxidación de glucosa en células 1.1B4 (figura 37). Sin embargo, los niveles más altos de utilización de glucosa se registraron en esta línea celular, 181,9 \pm 15,3 pmol/1000 células/hora a 16,7 mmol/l de glucosa y de nuevo 5-tioglucosa sólo afectó utilización a 16,7 mmol/l (figura 38).

La línea celular 1.4E7 se parecía a 1.1B4, mostrando altos niveles de oxidación a 11,1 mmol/l de glucosa con 5-tioglucosa inhibiendo claramente oxidación tanto a 1,1 como a 16,7 mmol/l de glucosa (figuras 36 y 37). La utilización de glucosa por esta línea celular presentó un pico a 16,7 mmol/l de glucosa y no se afectó por la inclusión de 5-tioglucosa (figura 38).

La línea celular 1.2B4, clonada a partir de las Hup-T_{3} parentales, mostró oxidación pobre de glucosa a todas las concentraciones probadas, alcanzando sólo 7,0 \pm 0,9 pmol/1000 células/hora a 16,7 mmol/l (figura 37). La 5-tioglucosa inhibió oxidación a 16,7 mmol/l (figura 40). Sorprendentemente, las velocidades de utilización de glucosa para 1.2B4 se parecieron estrechamente a aquellas de las otras líneas celulares alcanzando un valor de 127,5 \pm 12,8 pmol/1000 células/hora a 16,7 mmol/l de glucosa (figura 41). La 5-tioglucosa no ha afectado a las utilización de glucosa por esta línea celular.

De las líneas celulares parentales, los valores de oxidación de glucosa para PANC-1 fueron con mucho fueron con mucho más altos que para Hup-T_{3}. Las células PANC-1 mostraron niveles de oxidación más altos a 11,1 mmol/l de glucosa con inhibición significativa de oxidación tanto a 1,1 como a 16,7 mmol/l. Como con las líneas celulares de la progenie clonal, la utilización de glucosa PANC-1 fue más alta a 16,7 mmol/l -163,7 \pm 23,5 pmol/1000 células/hora. La 5-tio-D-glucosa fue también capaz de inhibir la utilización sólo a esta concentración. Contrastando los valores de oxidación para Hup-T_{3} se parecen estrechamente a aquel para su línea celular progenie 1.2B4, que muestra un valor de oxidación máxima de 12,6 \pm 7,2 pmol/1000 células/hora a 11,1 mmol/l de glucosa. En un experimento por separado 5-tioglucosa fue capaz de inhibir oxidación tanto a 11,1 mmol/l de glucosa como a 16,7 mmol/l de glucosa. De nuevo de forma similar a 1.2B4, los valores de utilización fueron similares a aquellos de las otras líneas celulares alcanzando un pico de 131,2 \pm 13,2 pmol/1000 células/hora a 16,7 mmol/l de glucosa. 5-tioglucosa no inhibió la utilización de glucosa en células Hup-T_{3}.

La tabla 3 muestra el flujo de metabolismo relativo a través de metabolismo de glucosa oxidativo para las líneas celulares parentales y cada una de las líneas celulares de islotes humanos derivadas. La importancia de este índice (razón de oxidación de glucosa:utilización de glucosa) es que el metabolismo de glucosa a través de la vía oxidativa está unido más estrechamente a secreción de insulina (Malaisse, 1992). Las razones de todas las líneas celulares de islotes fueron significativamente más altas que las de las células parentales Hup-T_{3} o PANC-1 (tabla 4). Las células 1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7 mostraron un incremento significativo en la razón en adición de 5-tioglucosa.

La proteína glucoquinasa se detectó en todas las 6 líneas celulares estudiadas y en contraste con la insulina apareció como manchas punteadas pequeñas de fluorescencia dispersas alrededor del citoplasma (figura 42). La tinción con anticuerpo para esta enzima parece ser diferente en intensidad entre líneas celulares. La tinción positiva para insulina se detectó a niveles de intensidad altos en líneas celulares 1.1B4, 1.4E7 con menor intensidad en 1.1E7 y 1.2B4 (figura 43). A partir de las imágenes se puede ver que la proteína insulina se localiza en diversos sitios por todo el citoplasma, apareciendo bajo fluorescencia como parches brillantes difusos. En las líneas celulares parentales (PANC-1 y Hup-T_{3}), ninguna célula fuera del campo entero mostró ninguna tinción para insulina. De forma similar a tinción con insulina, el polipéptido amiloide de islotes (IAPP) apareció como manchas brillantes localizados en el citoplasma. De nuevo todas las cuatro líneas celulares mostraron una señal positiva para IAPP con niveles mayores de tinción en 1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7 (figura 44). No se vio ninguna tinción positiva por encima de las antecedentes bien para glucagón o bien para somatostatina en cualquiera de las líneas celulares probadas (figuras 45 y 46). Las características de inmunotinción de todas las 6 líneas celulares se resumen en la tabla 5.

Cada realización descrita describe la producción y caracterización de líneas celulares de secreción de insulina humanas híbridas generadas mediante técnicas de electrofusión. Las fusiones se llevaron a cabo usando células compañeras inmortales PANC-1 o Hup-T_{3} dando como resultado la producción de 38 híbridos (figura 1). De los 27 clones que producen insulina producidos, los cuatro primeros se han caracterizado a través de una serie de estudios morfológicos y secretores, que analizan la capacidad de cada línea celular novedosa para responder a glucosa y otros reguladores de la función de células B. Las cuatro líneas novedosas generadas mediante electrofusión, y caracterizadas en este Capítulo se designan provisionalmente como células 1.1B4, 1.1E7, 1.4E7 y 1,2B4. Los intentos de generar híbridos usando TRM-1, HAP-5 o B6 como células compañeras inmortales se frustraron por fallo de estas células en continuar proliferando en cultivo de tejidos.

Las tres líneas celulares generadas a partir de PANC-1 (1.1B4, 1.1E7 y 1.4E7) y la línea celular producida mediante electrofusión con células Hup-T_{3} (1.2B4) crecieron todas como monocapas en cultivo de tejido mostrando un patrón pavimental cuando confluyen, característico de células epiteliales. Los tiempos que se doblan específicos fueron aproximadamente 23 \pm 1,7 horas para células 1.1B4, 23 \pm 1,9 horas para células1,1E7, 26 \pm 1,5 horas para células 1.4E7 y 36 \pm 2,1 horas para células 1.2B4 (n = 4). Estas diferencias inherentes en el patrón de crecimiento sustentan al punto de vista de que cada una representa una línea celular clonal única y novedosa. Las cuatro líneas celulares se mostraron para expresar insulina, glucoquinasa e IAPP mediante inmunocitoquímica. No fue evidente ninguna tinción visible para glucagón o somatostatina.

La glucosa es un regulador principal de la secreción de insulina a partir de la célula B pancreática (Meglasson y Matschinsky, 1986). La incubación estática de las diversas líneas celulares de islotes humanos novedosas durante 60 minutos con un intervalo de concentraciones crecientes de glucosa reveló diferencias sustanciales en capacidad de respuesta secretora de insulina de cada línea celular. Las células 1.1B4 mostraron un patrón por etapas más apropiado de producción de insulina comparado con las otras líneas celulares, con un umbral a 5,6 mmol/l de glucosa. Las líneas celulares 1E7 y 1.4E7 mostraron respuestas pico 11,1 y 5,6 mmol/l de glucosa, respectivamente. La caída de la producción de insulina a concentración de glucosa más alta refleja posiblemente la acción dual de glucosa de incrementar el secuestro de Ca^{2+} intracelular y el influjo de Ca^{2+}, como se han implicado para la fase inhibidora transitoria inicial demostrable en células B normales (Hellman y col., 1992). Este fenómeno se observa también en otras líneas celulares secretoras de insulina derivadas de animales que incluyen HIT-T15, BRIN-BG5 y BRIN-BG7 (Poitout y col., 1996; McClenaghan y col., 1996). En contraste, a las otras tres líneas celulares de islotes humanos derivadas de electrofusión, no se observó respuesta secretora de insulina significativa en respuesta a glucosa en células 1.2B4 bajo condiciones de incubación estándar.

La producción de insulina en respuesta a glucosa se potenció significativamente en presencia de IBMX a 200 \mumol/l en 1.4B4, 1.1E7 e 1.4E7. El inhibidor de fosfodiesterasa IBMX potenció la secreción de insulina en un 20-60% y elevó en umbral a 5,6 mmol/l de glucosa en células 1.1E7. La acción mediada por IBMX para elevar cAMP y potenciar la liberación de insulina mediada por Ca^{2+} como en células B pancreáticas normales (Hellman y col., 1992). IBMX también potenció modestamente la secreción de insulina a partir de células 1.1B4 y 1.4E7 en ausencia de glucosa. Este efecto estimulador refleja más probablemente la capacidad de concentraciones más altas de AMP cíclico para estimular la secreción a través de movilización de Ca^{2+} intracelular y promoción de influjo de Ca^{2+}, como se nota también para las células B-pancreáticas (Hellman, y col., 1992). Las células 1.2B4 derivadas de Hup-T_{3} fueron insensibles a IBMX.

La inclusión de 5-tioglucosa a 2 mmol/l, un análogo de glucosa que es un potente inhibidor de hexoquinasa, causó un cambio en la respuesta a dosis de glucosa de la insulina para cada línea celular. En células 1.1B4, 1.1E7 y 1.2B4, los efectos fueron significativos (p < 0,01 a p < 0,001), constando de una reducción del 20 al 50% de secreción de insulina a 0 mmol/l-11,1 mmol/l de glucosa. Además, la inclusión de 5-tioglucosa causó un cambio en capacidad de respuesta a glucosa de las células 1.1E7 con una concentración umbral para estimulación de liberación de insulina 5,6 mmol/l de glucosa. En presencia de 5-tioglucosa, la liberación de insulina estimulada por glucosa llegó a ser también patente en células 1.2B4 derivadas de Hup-T_{3}. Estas observaciones sugieren que los efectos beneficiosos de 5-tioglucosa en secreción se deben a la inhibición de hexoquinasa con una proporción mayor de flujo de glucosa catalizada por glucoquinasa tal que el potencial de señalar del metabolismo de la glucosa se incrementa (Hohmeier y col., 1997). La producción de insulina y la respuesta a glucosa de células 1.4E7 no se afectó por 5-tioglucosa.

La caracterización adicional de cada línea celular implicó evaluación de la actividad insulinotrópica de un número de aminoácidos que incluyen aminoácidos eléctricamente neutros (L-alanina, L-leucina) y aminoácidos catiónicos (L-arginina). Aunque se han llevado a cabo muchos estudios para dilucidar el mecanismo de la secreción de insulina inducida por aminoácidos (Henquin y Meissner, 1981; Malaisse y col., 1991), los efectos de muchos aminoácidos que incluyen L-alanina y glicina se entienden pobremente. Cuando se prueban a una concentración no estimuladora de glucosa (5,6 mmol/l), la secreción de L-arginina estimuló significativamente secreción de insulina en cada una de las líneas celulares derivadas de islotes humanos. Se observaron efectos significativos de L-leucina y L-alanina sobre la secreción de insulina a 5,6 mmol/l sólo en células 1.1B4 reflejando posiblemente que estos aminoácidos sirven como potenciadores más que como iniciadores potentes de liberación de insulina sobre células de islotes humanos (Yada, 1994).

Cuando se prueban a 11,1 mmol/l de glucosa, cada aminoácido probado, leucina, KIC, arginina y alanina causaron incrementos significativos en liberación de insulina. Esto indica que las células novedosas poseen cada uno de los diversos sistemas transportadores de aminoácidos y vías de reconocimiento de señal relacionadas descritas en células B pancreáticas normales (Hellman y col., 1971; Yada, 1994). Adicionalmente estos hallazgos demostraron que los aminoácidos probados pueden utilizar la glucosa estimuladora para sus acciones insulinotrópicas en estas células de islotes humanos novedosas. Esto confirma observaciones recientes de que los aminoácidos pueden actuar en una forma dependiente de glucosa, a saber que glucosa actúe como un combustible a través de su metabolismo, lo cual potencia la captación y utilización de ciertos aminoácidos (McClenaghan y Flatt, 1999). Es también interesante destacar que gliceraldehído, un azúcar triosa, fue capaz de estimular significativamente la secreción de insulina a partir de cada una de las líneas celulares novedosas. Como glucosa, el gliceraldehído estimula la liberación de insulina mediante su metabolismo glicolítico y subsiguiente generación de ATP (Halban y Wollheim, 1980). La despolarización de membrana plasmática mediante una alta concentración de KCl o bloqueo de canal de potasio sensible a ATP (K^{+}-ATP) con glibenclamida o tolbutamida provocó también la liberación de insulina a partir de las líneas celulares novedosas como se estableció previamente de las células B normales (Kramer y col., 1996).

Con el fin de estudiar adicionalmente el papel de la glucolisis y los canales K^{+}-ATP en la secreción de insulina inducida por glucosa, se evaluaron los efectos de diazóxido. Este agente se conoce por abrir los canales K^{+}-ATP y así actuar para repolarizar la membrana celular de las células B e inhibir la liberación de insulina (Henquin y col., 1992). Como se esperaba, este agente redujo significativamente la producción de insulina de todas las cuatro líneas celulares a 16,7 mmol/l de glucosa, indicando la importancia del canal K^{+}-ATP en regulación de secreción de insulina a partir de cada una de las líneas de células B clonales.

Se ha conocido durante muchos años que Ca^{2+} juega un papel importante en la secreción de insulina inducida por nutrientes (Hellman, 1975). La importancia del flujo de entrada de Ca^{2+} en la secreción de insulina inducida por glucosa se destaca a través de incubaciones llevadas a cabo en ausencia de Ca^{2+} extracelular y con el quelante de Ca^{2+} EGTA. La depleción de Ca^{2+} inhibió significativamente la secreción de insulina a 16,7 mmol/l de glucosa a partir de cada una de las cuatro líneas celulares. El bloqueo de los canales de Ca^{2+} dependientes (VDCC) usando verapamilo redujo de forma similar la secreción de insulina inducida por glucosa. Estos resultados indican claramente la importancia de los canales de Ca^{2+} y los canales de Ca^{2+} dependientes de voltaje en la regulación de secreción de insulina a partir de las líneas celulares híbridas novedosas. También es posible por lo tanto inferir a partir de estos estudios funcionales que las células expresan canales K^{+}-ATP, SUR, Kir y VDCC.

Igualmente importante, se mostraron contenido de insulina y respuestas secretoras de todas las cuatro líneas de células B derivadas de islotes humanos para permanecer estables a bajo y alto número de canal. Así el contenido de insulina celular, la liberación de insulina basal y los efectos secretores de glucosa y KCl fueron similares en los canales 17 y 40. Tal estabilidad funcional parece ser un atributo significativo derivado de electrofusión comparado con líneas de células B pancreáticas transfectadas.

La disponibilidad de las sondas moleculares permitió el análisis de bandas de Western de todas las cuatro líneas celulares de islotes humanos novedosas y líneas de células parentales que usan anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína transportadora GLUT-1 y contra glucoquinasa. Las proteínas de aproximadamente 48 kDa y 50 kDa, se detectaron respectivamente en todas las cuatro líneas celulares pero no en células PANC-1 ni Hup-T_{3} parentales. Se sabe que el transportador GLUT-1 juega un papel importante en captación de glucosa, actuando en conjunción con glucoquinasa para formar el así llamado mecanismo de detección de glucosa de las células B en las células B pancreáticas (Shibasaki y col., 1990).

Las medidas de GLUT-1 y de la proteína glucoquinasa se acompañaron por medidas funcionales de actividad valoradas mediante evaluación de transporte de glucosa y contribución de glucoquinasa/hexoquinasa a las actividades totales de fosforilación de glucosa de las diversas líneas celulares. Estos estudios revelaron que los clones derivados de islotes humanos novedosas mostraron características de transporte de glucosa eficientes las cuales, a diferencia de las células parentales, no se sobrepasan incrementando la concentración de glucosa extracelular de 1,1 a 16,7 mmol/l. Esta característica se ha definido previamente como una característica distintiva de las células B pancreáticas (Hellman y col., 1974). Los estudios moleculares más recientes consideran que el transporte de glucosa no es limitante de velocidad en células B-pancreáticas normales excepto bajo las circunstancias más extremas (Ohneda y col., 1994).

La glucoquinasa se cree generalmente que es uno de los determinantes más importantes de sensibilidad de glucosa en la célula B pancreática (Lenzen y Tiedge, 1994). En particular, una contribución elevada de glucoquinasa a la actividad fosforilante total (según se yuxtapone a hexoquinasa) es una característica que sirve como punto de referencia del funcionamiento de células secretoras de insulina normalmente. En el presente estudio, la glucoquinasa contribuyó < 2% a la actividad de fosforilación de glucosa de las células PANC-1 parentales. De forma consistente con los datos de prueba de manchas de Western, la contribución de glucoquinasa de las 1.1B4, 1.1E7, 1.4E7 derivadas varían entre el 27-43%. La otra línea celular, 1.2B4 se caracterizó por contribución del 36% de glucoquinasa a la actividad de fosforilación total. Hay comparadas medidas bastante favorablemente con el valor comunicado del 50% para las células B-normales (Lenzen, 1990), e indican claramente transporte y metabolismo eficiente de glucosa en las células B compañeras humanas.

El metabolismo de glucosa por la célula B representa una culminación del transporte de glucosa y las actividades de fosforilación. La evaluación de la respuesta metabólica en líneas celulares parentales y derivadas indicó un incremento por etapas en oxidación/utilización de glucosa con incremento de la concentración de glucosa. La inhibición de la actividad hexoquinasa usando 5-tioglucosa también mostró efectos inhibidores como se comunicó en otro lugar (Hohmeier y col, 1997). Dado que la estimulación por glucosa de secreción de insulina está unida estrechamente a generación de ATP, el flujo relativo del metabolismo de glucosa a través de vías oxidativas se ha considerado como un indicador particularmente digno de mención de la integridad funcional de las células B-pancreáticas (Malaisse, 1992). El cálculo de las razones oxidación de glucosa/utilización de glucosa mostró valores más altos en cada una de las células híbridas comparadas con las células parentales PANC-1 o Hup-T_{3}. Tales efectos estuvieron ligados en términos generales a las actividades glucoquinasa relativas de las diversas líneas celulares.

Aunque los resultados de inmunoquímica fueron sólo parte de los estudios tempranos de la expresión de los marcadores de células B, es tranquilizador que la tinción positiva para insulina se detectase mediante el antisuero de insulina en todas las líneas celulares híbridas clonales, Como se ve a partir de las imágenes de FITC las células no parecen tener tinción de insulina uniforme. Esto refleja probablemente la incapacidad de esta aproximación particular para detectar niveles bajos de insulina presentes en algunas de las células. La tinción para insulina que usa el mismo anticuerpo en páncreas de rata mostró fuerte señal fluorescente (resultados no mostrados) pero las monocapas de células B contenían niveles menores con mucho de insulina, estimados en menos del 5% de las células de islotes pancreáticos normales.

La proteína glucoquinasa se detectó mediante inmunocitoquímica en todas las líneas celulares en manchas pequeñas, granulares de fluorescencia dispersas por todo el citoplasma. Como con insulina fue difícil cuantificar visualmente los niveles de glucoquinasa a partir de estos experimentos, sin embargo un examen cuidadoso de cada línea celular indicó que los niveles de tinción positiva se aumentaron de nuevo en células de islotes híbridas comparadas con las líneas celulares parentales. IAPP se encontró en todas las líneas celulares y apareció también en pequeñas manchas de tinción positiva alrededor del citoplasma y fue menos intensa que la tinción vista para glucoquinasa. No se vio ninguna tinción positiva bien para glucagón o bien para somatostatina en ninguna de las líneas celulares sometidas a prueba que sustentan el punto de vista de que los híbridos representan una población pura de las células B pancreáticas clonales.

La presente invención comunica la generación y caracterización de cuatro líneas de células B pancreáticas secretoras de insulina humana derivadas de electrofusión novedosas. La valoración funcional de estas células únicas indica que muchas de las características de la célula B pancreática humana normal se han heredado por las células híbridas de los donantes humanos (tabla 6).

El perfil de identificación de DNA de las cuatro líneas de células B pancreáticas secretoras de insulina humana derivadas de electrofusión indican que las líneas celulares 1.1E7, 1.4E7 y 1.1B4 tienen perfiles de DNA similares mientras que 1.2B4 tiene un perfil diferente.

Las tabla 7, 8, 9 y 10 muestran los resultados del perfil de identidad de 1.1E7, 1.4E7, 1.1B4 y 1.2B4 respectivamente.

Esto perfiles indican que las líneas celulares producidas mediante el procedimiento de electrofusión las cuales muestran las características de las células B pancreáticas no requieren compartir identidad genética idéntica.

Las líneas celulares producidas parecen tener cualidades funcionales superiores para muchas líneas celulares animales existentes las cuales se pueden atribuir a la presencia de componentes claves de la vía de acoplamiento de estímulo-secreción de las células B pancreáticas normales. Estas diversas observaciones, combinadas con estabilidad funcional, indican que los clones de células B pancreáticas humanas derivadas de electrofusión serán de beneficio sustancial para la investigación de la diabetes. Además, estas líneas celulares permitirán el uso de ingeniería celular usando células B pancreáticas derivadas de electrofusión para proporcionar terapia para diabetes de tipo 1.

Claims

1. Una línea celular humana pancreática producida mediante electrofusión de células de islotes humanos normales con células de al menos una línea celular humana inmortal en la que la línea celular pancreática humana es capaz de segregar insulina.

2. Una línea celular humana pancreática capaz de segregar insulina elegida a partir de un grupo de líneas celulares que constan de la línea celular depositada con el número de acceso 00112811 en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire el 28 de noviembre de 2000 y las líneas celulares depositadas con los números de acceso PTA 3523, PTA 3524 y PTA 3525 en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20100-2209, EE.UU. el 17 de julio de 2001.

3. Un procedimiento para la producción de líneas celulares pancreáticas humanas capaz de segregar insulina, el procedimiento incluye las etapas de electrofusión de una mezcla de células de islotes humanos normales con células de al menos una línea celular humana inmortal e incubar la mezcla para generar células híbridas.

4. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 3 en el que las células de islotes humanos y las células humanas inmortales se mezclan en una razón 1:1.

5. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 3 ó 4 en el que la electrofusión tiene lugar en una cámara helicoidal.

6. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 en el que la etapa de electrofusión incluye exponer las células a una primera fase de pulso de campo CA, una segunda fase de pulso de campo CC y una tercera fase de pulso de campo CA.

7. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 6 en el que la primera fase de pulso consta de 7 voltios, 2 MHZ de campo CA durante 30 segundos.

8. El procedimiento como se reivindica en las reivindicaciones 6 ó 7 en el que la segunda fase de pulso consta de 60 voltios, pulsos triples de campo CC con cada uno de los pulsos triples siendo de 15 segundos de duración.

9. El procedimiento como se reivindica en las reivindicaciones 6, 7 u 8 en el que la tercera fase de pulso está comprendida en 7 voltios, 2 MHZ de campo CA durante 30 segundos.

10. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9 en el que los medios en los cuales se incuban las células comprenden hipoxantina, aminopterina y timidina.

11. El procedimiento como se reivindican en la reivindicación 10 en el que la hipoxantina está presente en los medios de incubación a una concentración de entre 0,05 \mumol/l-0,5 \mumol/l.

12. El procedimiento como se reivindica en las reivindicaciones 10 u 11 en el que la aminopterina está presente en los medios de incubación a una concentración de entre 0,2-0,6 \mumol/l.

13. El procedimiento como se reivindica en las reivindicaciones 10, 11 ó 12 en el que la timidina está presente en los medios de incubación a una concentración de entre 10-20 \mumol/l.

14. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13 en el que la incubación se lleva a cabo en presencia de al menos un secretagogo elegido del grupo que comprende glucosa, gliceraldehído, arginina, leucina y alanina.

15. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14 en el que la incubación se lleva a cabo en presencia de al menos una sustancia elegida del grupo que comprende KCl, IBMX, tioglucosa, tolbutamida, diazoxido y verapamilo.

16. Una línea celular producida mediante un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 la cual muestra características de transporte de glucosa tan eficientes como células B pancreáticas normales.

17. Una línea celular producida mediante un procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 la cual muestra actividad fosforilante de glucosa consistente con células B pancreáticas normales.

18. Las células que producen insulina producidas mediante el procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 para usar en terapia génica para diabetes de tipo 1.

19. El uso de células que producen insulina producidas mediante el procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 15 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes.

20. Uso de una línea celular como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 16 o 17 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes.

21. Uso de una línea celular como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 16 ó 17 para la producción de insulina.