ES2249167B1

ES2249167B1 - ADDITIVE FOR FEEDS OF CROP FISH AND FEED CONTAINING SUCH ADDITIVE TO TREAT AND PREVENT OXIDATIVE STRESS AND TOXICITY OF PARASITICIDE TREATMENTS.

Info

Publication number: ES2249167B1
Application number: ES200402118A
Authority: ES
Inventors: Samuel Peña Llopis; Juan B. Peña Forner
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2004-09-01
Filing date: 2004-09-01
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2024-09-01
Also published as: WO2006032717A1; ES2249167A1

Abstract

La presente invención proporciona el uso de un aditivo para piensos destinado al cultivo de peces y un pienso que contiene dicho aditivo, que es efectivo en contrarrestar el estrés oxidativo, y especialmente, la toxicidad ocasionada por los tratamientos con plaguicidas utilizados en la eliminación de los parásitos de los teleósteos. El aditivo para piensos consiste en una cantidad efectiva de N-acetilcisteína, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, que es capaz de estimular la síntesis intracelular de glutatión e inducir la actividad glutatión S-transferasa en los peces.The present invention provides the use of a feed additive intended for fish culture and a feed containing said additive, which is effective in counteracting oxidative stress, and especially, the toxicity caused by pesticide treatments used in the elimination of parasites of the teleosts. The feed additive consists of an effective amount of N-acetylcysteine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, that is capable of stimulating intracellular synthesis of glutathione and inducing glutathione S-transferase activity in fish.

Description

Aditivo para piensos de peces de cultivo y pienso que contiene dicho aditivo para tratar y prevenir el estrés oxidativo y la toxicidad de los tratamientos parasiticidas.Feed additive for farmed fish and I think it contains this additive to treat and prevent stress Oxidative and toxicity of parasiticidal treatments.

Technical sector

Destinado al sector de la acuicultura continental y marina. La presente invención proporciona un aditivo de piensos de peces y un pienso que contiene dicho aditivo para mitigar los procesos oxidativos inherentes al cultivo de teleósteos, y especialmente, para prevenir y tratar intoxicaciones por los parasiticidas empleados en las piscifactorías.For the aquaculture sector Continental and marine. The present invention provides an additive of fish feed and a feed containing said additive for mitigate the oxidative processes inherent in the cultivation of teleosts, and especially, to prevent and treat poisonings by parasiticides used in fish farms.

State of the art

El rápido crecimiento y desarrollo de la acuicultura ha sido paralelo a la utilización de sustancias químicas para mejorar la salud animal. Las infecciones de parásitos causan en los peces estrés y susceptibilidad a desarrollar otras patologías que suponen importantes pérdidas para la industria. Entre las medicinas y productos químicos existentes, los plaguicidas organofosforados como el azametifós han sido extensivamente empleados como antiparasitarios en cultivos como el del salmón para tratar las infecciones por la pulga de mar (O'Halloran y Hogans, 1996, Can. Vet. J. 37: 610-611; Roth et al., 1996, Aquaculture 140: 217-239; Revie et al., 2002, Vet. Rec. 151: 753-757). Además el azametifós ha mostrado su eficacia y seguridad frente a ectoparásitos en la anguila, la lubina y la trucha (Pretti et al., 2002, J. Vet. Pharmacol. Ther. 25: 155-157; Intorre et al., 2004, Pharmacol. Res. 49: 171-176). No obstante, en el tratamiento de los ectoparásitos de peces se utilizan otros compuestos que también son neurotóxicos, como son las piretrinas o piretroides, entre las que destacan la cipermetrina y deltametrina (Roth, 2000, Contrib. Zool. 69: 109-118). Además, se ha demostrado que tanto los plaguicidas organofosforados como piretroides producen una disminución de los niveles de glutatión y conducen a un estado de estrés oxidativo a nivel celular (Bagchi et al., 1995, Toxicology 104: 129-140; Gupta et al., 1999, J. Appl. Toxicol. 19: 67-72).The rapid growth and development of aquaculture has paralleled the use of chemicals to improve animal health. Parasitic infections cause stress and susceptibility to other pathologies in fish that pose significant losses to the industry. Among existing medicines and chemicals, organophosphorus pesticides such as azametephos have been extensively used as antiparasitics in crops such as salmon to treat flea infections (O'Halloran and Hogans, 1996, Can. Vet. J. 37: 610-611; Roth et al ., 1996, Aquaculture 140: 217-239; Revie et al ., 2002, Vet. Rec. 151: 753-757). In addition, azametifós has shown its efficacy and safety against ectoparasites in eel, sea bass and trout (Pretti et al ., 2002, J. Vet. Pharmacol. Ther. 25: 155-157; Intorre et al ., 2004, Pharmacol. Res. 49: 171-176). However, in the treatment of fish ectoparasites, other compounds that are also neurotoxic are used, such as pyrethrins or pyrethroids, among which cypermethrin and deltamethrin (Roth, 2000, Contrib. Zool. 69: 109-118) . In addition, it has been shown that both organophosphorus and pyrethroid pesticides produce a decrease in glutathione levels and lead to a state of oxidative stress at the cellular level (Bagchi et al ., 1995, Toxicology 104: 129-140; Gupta et al . , 1999, J. Appl. Toxicol. 19: 67-72).

El estrés oxidativo se produce cuando existe un desequilibrio entre la generación de radicales libres y su eliminación por parte de los antioxidantes celulares. Éste está caracterizado por la inactivación de proteínas (y por tanto de enzimas), peroxidación de los lípidos de membrana y daños en el ADN. El glutatión (GSH) es un tripéptido compuesto por glutamato, cisteína y glicina que es indispensable en la mayoría de organismos vivos, ya que interviene en varios fenómenos celulares de gran importancia, tales como la destoxificación de xenobióticos, la eliminación de radicales libres, el mantenimiento del estado reducido en los grupos tioles de las proteínas (al actuar como un tampón redox), la modulación de la función inmune y la síntesis de ADN (Meister y Anderson, 1983, Annu. Rev. Biochem. 52: 711-760). El GSH tiene transportadores específicos para exportarse fuera de las células, pero en cambio no lo tiene para su importación, necesitando ser catabolizado para luego ser sintetizado intracelularmente. Puesto que numerosas enfermedades y situaciones fisiopatológicas se caracterizan por presentar bajos niveles intracelulares de glutatión, para aumentar estos niveles es necesario proporcionar un precursor de su síntesis.Oxidative stress occurs when there is a imbalance between the generation of free radicals and their elimination by cellular antioxidants. This is characterized by the inactivation of proteins (and therefore of enzymes), peroxidation of membrane lipids and damage to the DNA Glutathione (GSH) is a tripeptide composed of glutamate, cysteine and glycine that is indispensable in most organisms alive, as it intervenes in several large cell phenomena importance, such as detoxification of xenobiotics, the free radical removal, state maintenance reduced in thiol groups of proteins (by acting as a redox buffer), modulation of immune function and synthesis of DNA (Meister and Anderson, 1983, Annu. Rev. Biochem. 52: 711-760). The GSH has specific conveyors to export out of cells, but instead you don't have it for its import, needing to be catabolized and then be synthesized intracellularly. Since numerous diseases and pathophysiological situations are characterized by presenting low intracellular glutathione levels, to increase these levels is It is necessary to provide a precursor to its synthesis.

La N-acetilcisteína (NAC) destaca entre los antioxidantes actuales ya que no sólo es capaz de eliminar directamente a los radicales libres, sino que también es capaz de ser desacetilada intracelularmente para dar lugar al aminoácido L-cisteína, que es el limitante en la síntesis de glutatión. Se conocen composiciones farmacéuticas que contienen N-acetilcisteína para tratar la deficiencia de glutatión y/o el estrés oxidativo en humanos y otros mamíferos, tales como las patentes US 2002/0142991 (N-acetylcysteine compositions and methods for the treatment and prevention of drug toxicity; fecha de publicación 2002-10-03) y EP1171112 (Use of N-acetylcysteine for the preparation of a medicament suitable for the intravenous administration to prevent oxidative stress in dialysed patients; fecha de publicación 2002-01-16). Sin embargo, la investigación enfocada a paliar el estrés oxidativo o los efectos tóxicos de los parasiticidas para que los peces tengan un mayor estado de salud es escasa. Por esta razón, hay un gran interés en la búsqueda de un nuevo aditivo para piensos que confiera una mayor tolerancia al estrés oxidativo y a la toxicidad de los parasiticidas empleados en los peces de cultivo. Los inventores previamente descubrieron que la administración de la N-acetilcisteína por vía intraperitoneal permite la regeneración de los niveles de glutatión y aumenta la tolerancia de los peces al plaguicida organofosforado diclorvós (Peña-Llopis et al., 2003, Aquat. Toxicol. 65: 337-360). Además, cuando se administra la N-acetilcisteína mediante baños terapéuticos permite una mayor recuperación de los peces tras una intoxicación por este grupo de plaguicidas (Peña-Llopis et al., 2003, Dis. Aquat. Organ. 55: 237-245). A pesar del bajo coste de la N-acetilcisteína, es más factible proporcionar este compuesto en el pienso de los peces que administrarlo mediante baños terapéuticos y, por supuesto, mediante inyecciones. No obstante, la eficacia de la N-acetilcisteína administrada como aditivo de piensos en peces no ha sido descrita hasta la actualidad y sus resultados no se pueden deducir de las observaciones previas ya que no se puede generalizar que la NAC aumenta la síntesis de glutatión intracelular en peces cuando se administra por vía intraperitoneal o por baños. Hay que considerar que según cada vía de administración se obtienen unos resultados diferentes. N - acetylcysteine (NAC) stands between current antioxidants because it is not only able to directly eliminate the free radicals, but also capable of being deacetylated intracellularly to yield the amino acid L-cysteine, which is the limiting in glutathione synthesis Pharmaceutical compositions containing N- acetylcysteine for treating glutathione deficiency and / or oxidative stress in humans and other mammals are known, such as US patents 2002/0142991 ( N- acetylcysteine compositions and methods for the treatment and prevention of drug toxicity ; publication date 2002-10-03) and EP1171112 (Use of N- acetylcysteine for the preparation of a medicament suitable for the intravenous administration to prevent oxidative stress in dialysed patients; publication date 2002-01-16). However, research focused on alleviating oxidative stress or the toxic effects of parasiticides so that fish have a better state of health is scarce. For this reason, there is great interest in the search for a new feed additive that confers a greater tolerance to oxidative stress and the toxicity of parasiticides used in farmed fish. The inventors previously discovered that the administration of N- acetylcysteine intraperitoneally allows the regeneration of glutathione levels and increases the tolerance of fish to dichlorvos organophosphorus pesticide (Peña-Llopis et al ., 2003, Aquat. Toxicol. 65: 337-360). In addition, when N- acetylcysteine is administered through therapeutic baths, it allows greater recovery of the fish after poisoning by this group of pesticides (Peña-Llopis et al ., 2003, Dis. Aquat. Organ. 55: 237-245). Despite the low cost of N- acetylcysteine, it is more feasible to provide this compound in fish feed than to administer it by therapeutic baths and, of course, by injections. However, the efficacy of N- acetylcysteine administered as a feed additive in fish has not been described until now and its results cannot be deduced from previous observations since it cannot be generalized that NAC increases the synthesis of intracellular glutathione in fish when administered intraperitoneally or by baths. It should be considered that different results are obtained according to each route of administration.

La inyección intraperitoneal permite la distribución del fármaco por todos los tejidos. Por esa razón se ha observado un aumento de la síntesis de glutatión tanto en el hígado como en el músculo de los peces.Intraperitoneal injection allows distribution of the drug throughout all tissues. For that reason it has observed an increase in glutathione synthesis both in the liver as in the muscle of the fish.

Los baños terapéuticos permiten una absorción cutánea del fármaco. Así, se ha observado que los baños de NAC aumentan los niveles de glutatión en el músculo esquelético pero no en el hígado de los peces. La cantidad de NAC que llega al torrente sanguíneo a través de la absorción no es suficiente para aumentar la síntesis hepática de glutatión.Therapeutic baths allow absorption Cutaneous drug. Thus, it has been observed that NAC baths glutathione levels increase in skeletal muscle but not in the liver of the fish. The amount of NAC that reaches the bloodstream through absorption is not enough to Increase hepatic glutathione synthesis.

Respecto a la vía oral, cabría esperar que el fármaco se absorbiese en el intestino y llegase al hígado por la vena porta. Por lo tanto no se puede inferir que el resultado observado en la vía oral sea obvio a partir de las anteriores vías de administración.Regarding the oral route, one would expect the drug was absorbed in the intestine and reached the liver by the portal vein Therefore it cannot be inferred that the result observed in the oral route be obvious from the previous routes of administration.

Igualmente, cabe destacar el propio metabolismo de la síntesis de glutatión. La síntesis intracelular de glutatión está regulada por retroalimentación negativa, en la que el exceso de GSH inhibe la síntesis del propio GSH.Likewise, it is worth mentioning the metabolism itself of glutathione synthesis. The intracellular synthesis of glutathione is regulated by negative feedback, in which the excess of GSH inhibits the synthesis of GSH itself.

Además, la síntesis tiene lugar principalmente en el hígado porque es el único órgano que contiene las enzimas necesarias para realizar la transsulfuración, es decir, pasar la metionina a cisteína, que es el aminoácido limitante en la síntesis de GSH. De esta manera, sólo en el caso en el que haya una disminución de los niveles basales de GSH (que son diferentes en cada especie) a causa de una enfermedad o exposición a un xenobiótico, por ejemplo, habrá un aumento en la síntesis de GSH, a no ser que el aporte de la dieta sea insuficiente para proporcionar la cisteína intracelular necesaria. Así por ejemplo, la NAC administrada por vía oral a voluntarios sanos no produce un aumento de GSH plasmático. Sin embargo, al presentar un GSH disminuido a causa de un tratamiento con paracetamol, es cuando tiene efecto la NAC para aumentar la síntesis de GSH (Burgunder et al., 1989, Eur. J. Clin. Pharmacol. 36: 127-131). Por esta razón, conocer si los piensos comerciales para peces contienen los nutrientes suficientes para mantener una síntesis elevada de GSH en los peces no es algo que resulte evidente a partir del estado de la
técnica.In addition, the synthesis takes place mainly in the liver because it is the only organ that contains the enzymes necessary to perform transsulfurization, that is, transferring methionine to cysteine, which is the limiting amino acid in the synthesis of GSH. Thus, only in the case where there is a decrease in baseline levels of GSH (which are different in each species) due to a disease or exposure to a xenobiotic, for example, will there be an increase in the synthesis of GSH , unless the contribution of the diet is insufficient to provide the necessary intracellular cysteine. For example, the NAC administered orally to healthy volunteers does not produce an increase in plasma GSH. However, when presenting a decreased GSH because of a treatment with paracetamol, it is when the NAC has an effect to increase the synthesis of GSH (Burgunder et al ., 1989, Eur. J. Clin. Pharmacol. 36: 127-131) . For this reason, knowing if commercial fish feed contains enough nutrients to maintain a high synthesis of GSH in fish is not something that is evident from the state of
technique.

En la presente invención también se señala el aumento de la destoxificación celular (y en concreto de los plaguicidas) mediante la inducción de la actividad glutatión S-transferasa GST) por la NAC. En la patente WO03/024487 se pone de manifiesto la destoxificación celular, pero ésta se obtiene a partir de la administración de un ingrediente activo seleccionado entre los glucósidos iridoides y lignanos, pero no por la NAC. Por esta razón, el hecho de que la NAC administrada en el pienso aumente la actividad GST, y por tanto la destoxificación celular, no está contemplado en el estado de la técnica y no se puede deducir de ésta.The present invention also indicates the increase in cell detoxification (and in particular of pesticides) by inducing glutathione activity S-transferase GST) by the NAC. In the patent WO03 / 024487 reveals cell detoxification, but this is obtained from the administration of an ingredient active selected between iridoid and lignans glycosides, but not by the NAC. For this reason, the fact that the NAC administered in the feed increase GST activity, and therefore the cell detoxification, is not contemplated in the state of the technique and cannot be deduced from it.

En la patente WO03/024487 (Method of increasing the presence of glutathione in cells, solicitante: N.V. NUTRICIA) han sido extrapolados resultados obtenidos en humanos para el caso de ganado y aves. Las diferencias evolutivas entre los mamíferos y vertebrados inferiores como los peces son demasiado grandes por lo que no se pueden extrapolar estos resultados y por lo tanto no resulta evidente a partir del estado de la técnica.In WO03 / 024487 (Method of increasing the presence of glutathione in cells, applicant: N.V. NUTRICIA) results obtained in humans have been extrapolated for that matter of cattle and birds. The evolutionary differences between mammals and lower vertebrates like fish are too big so that these results cannot be extrapolated and therefore not It is evident from the state of the art.

Description of the invention Descripción brevebrief description

La presente invención proporciona el uso de un aditivo de piensos destinado al cultivo de peces y un pienso que contiene dicho aditivo, caracterizado por contener una cantidad efectiva del antioxidante N-acetilcisteína para (1) aumentar la síntesis de glutatión, (2) aumentar la destoxificación celular, (3) mitigar los efectos tóxicos producidos por los parasiticidas utilizados en el cultivo de los peces y (4) proporcionar una mayor tolerancia a los procesos oxidativos generados por infecciones o condiciones naturales como la exposición a la radiación ultravioleta. Las propiedades de este pienso lo hacen idóneo para alimentar a peces que son frecuentemente tratados con parasiticidas que disminuyen los niveles de glutatión y producen estrés oxidativo.The present invention provides the use of a feed additive intended for fish culture and a feed containing said additive, characterized in that it contains an effective amount of the antioxidant N- acetylcysteine to (1) increase glutathione synthesis, (2) increase the cell detoxification, (3) mitigate the toxic effects produced by parasiticides used in fish culture and (4) provide greater tolerance to oxidative processes generated by infections or natural conditions such as exposure to ultraviolet radiation. The properties of this feed make it ideal for feeding fish that are frequently treated with parasiticides that lower glutathione levels and produce oxidative stress.

Descripción detalladaDetailed description

El glutatión es el tiol de bajo peso molecular más abundante y el principal antioxidante de todas las formas eucariotas de vida. Además, permite la regeneración de otros antioxidantes como las vitaminas C y E (Chan, 1993, Can. J. Physiol. Pharmacol. 71: 725-731). El glutatión está presente mayoritariamente en las células en su forma activa y reducida (GSH). Sin embargo, como consecuencia de las condiciones oxidantes, dos moléculas de GSH que hayan captado un radical libre se pueden unir por un puente disulfuro para generar una molécula de glutatión oxidado o disulfuro (GSSG) y eliminar dichos radicales. Si se acumula el GSSG, éste se exporta fuera de las células para evitar cambios en el estado redox celular que podrían dar lugar a la muerte celular. Esto supone una disminución en los niveles totales de glutatión. Por otra parte, el GSH se puede conjugar a una gran variedad de compuestos tóxicos, tanto de manera espontánea como catalizado por la glutatión S-transferasa (GST), lo que implica el consumo irreversible de GSH.Glutathione is the low molecular weight thiol most abundant and the main antioxidant of all forms Eukaryotes of life. In addition, it allows the regeneration of others antioxidants such as vitamins C and E (Chan, 1993, Can. J. Physiol Pharmacol 71: 725-731). Glutathione is present mostly in cells in their active form and reduced (GSH). However, as a result of the conditions oxidants, two molecules of GSH that have captured a free radical they can be joined by a disulfide bridge to generate a molecule of oxidized glutathione or disulfide (GSSG) and eliminate these radicals. If the GSSG accumulates, it is exported outside the cells to avoid changes in the cellular redox state that could lead to cell death This means a decrease in levels total glutathione On the other hand, GSH can be conjugated to a wide variety of toxic compounds, both spontaneously as catalyzed by glutathione S-transferase (GST), which implies the irreversible consumption of GSH.

Teniendo en cuenta que la síntesis intracelular de glutatión está regulada por retroalimentación negativa, en la que el exceso de GSH inhibe la síntesis de este tripéptido (Richman y Meister, 1975, J. Biol. Chem. 250: 1422-1426), los inventores han tenido éxito en encontrar que la administración de NAC como aditivo de piensos es capaz de aumentar los niveles de GSH de los peces. Esto implica que el pienso control con el que se alimentan normalmente los peces no está capacitado para proporcionar suficiente L-cisteína a nivel intracelular como para saturar la síntesis de GSH. De esta manera, el aumento en el contenido de glutatión y en la relación GSH/GSSG encontrado en los peces alimentados con el aditivo para piensos del presente invento permite eliminar más eficazmente a los radicales libres y tener una mayor tolerancia frente a una posible situación de estrés oxidativo. Los peces cultivados en jaulas flotantes están sometidos continuamente a radiaciones ultravioleta, las cuales generan radicales libres y pueden causar estrés oxidativo, fotoactivación de contaminantes orgánicos y fotosensibilidad (Zagarese y Williamson, 2001, Fish Fisheries 2: 250-260). Además, se ha observado que una infección parasitaria también puede producir estrés oxidativo en los peces (Belló et al., 2000, Dis. Aquat. Org. 42: 233-236). El estrés oxidativo puede conducir a los peces a situaciones de anemia o de infecciones oportunistas. Ante esto, la presente invención proporciona un aditivo para piensos que es efectivo para combatir el estrés oxidativo en los peces.Given that the intracellular synthesis of glutathione is regulated by negative feedback, in which excess GSH inhibits the synthesis of this tripeptide (Richman and Meister, 1975, J. Biol. Chem. 250: 1422-1426), the inventors They have succeeded in finding that the administration of NAC as a feed additive is able to increase the GSH levels of the fish. This implies that the control feed with which fish normally feed is not able to provide enough intracellular L-cysteine to saturate the synthesis of GSH. In this way, the increase in glutathione content and the GSH / GSSG ratio found in fish fed with the feed additive of the present invention makes it possible to eliminate free radicals more effectively and have a greater tolerance against a possible situation of oxidative stress. Fish grown in floating cages are continuously subjected to ultraviolet radiation, which generate free radicals and can cause oxidative stress, photoactivation of organic pollutants and photosensitivity (Zagarese and Williamson, 2001, Fish Fisheries 2: 250-260). In addition, it has been observed that a parasitic infection can also cause oxidative stress in fish (Belló et al ., 2000, Dis. Aquat. Org. 42: 233-236). Oxidative stress can lead fish to situations of anemia or opportunistic infections. Given this, the present invention provides a feed additive that is effective in combating oxidative stress in fish.

Los inventores han descubierto sorprendentemente que el aditivo para piensos de la presente invención es capaz de inducir la actividad glutatión S-trasferasa (GST) en los tejidos de los peces de cultivo. El incremento en la actividad GST junto a niveles más altos de GSH permite destoxificar una gran variedad de contaminantes con una mayor eficacia. Por esta razón, el aditivo para piensos de la presente invención contribuye significativamente a que los peces tengan una mayor tolerancia a los xenobióticos.The inventors have surprisingly discovered that the feed additive of the present invention is capable of inducing glutathione S- transferase (GST) activity in the tissues of farmed fish. The increase in GST activity together with higher levels of GSH allows detoxifying a wide variety of contaminants with greater efficiency. For this reason, the feed additive of the present invention contributes significantly to fish having a greater tolerance to xenobiotics.

El principal mecanismo de acción de los plaguicidas organofosforados es la inhibición de la actividad acetilcolinesterasa (AChE) de una manera dosis-dependiente. Los inventores han descubierto inesperadamente que el aditivo para piensos de la presente invención mantiene o aumenta la actividad AChE del cerebro de los peces durante las 6 primeras horas tras una etapa de desparasitación con el plaguicida azametifós, mientras que esta actividad se ve sensiblemente inhibida en los peces alimentados con el pienso control. Esto significa que estos peces se encuentran en condiciones más óptimas de afrontar una situación adversa como una exposición a plaguicidas y se recuperan antes de su intoxicación. Además, los peces alimentados con el pienso que contiene el aditivo para piensos de la presente invención presentaron una menor pérdida y oxidación del glutatión, al igual que presentaron una mayor capacidad de destoxificación al inducir la actividad GST.The main mechanism of action of Organophosphorus pesticide is the inhibition of activity acetylcholinesterase (AChE) in a way dose-dependent The inventors have discovered unexpectedly that the feed additive of the present invention maintains or increases the AChE activity of the brain of the fish during the first 6 hours after a stage of deworming with the pesticide azametifós, while this activity is significantly inhibited in fish fed with I think control. This means that these fish are found in most optimal conditions of facing an adverse situation as a exposure to pesticides and recover before poisoning. In addition, fish fed with the feed containing the additive for feeds of the present invention they presented a lower loss and oxidation of glutathione, just as they presented a increased detoxification capacity by inducing GST activity.

El aditivo para piensos de la presente invención se puede formular tal cual o como una sal farmacéuticamente aceptable de la N-acetilcisteína. El término "sal farmacéuticamente aceptable" significa todas aquellas sales que son aptas para el contacto de los tejidos animales sin que se produzca toxicidad, irritación, reacción alérgica y están acorde con una relación riesgo/beneficio razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas por un especialista en la técnica, siendo la sal sódica la más común.The feed additive of the present invention can be formulated as is or as a pharmaceutically acceptable salt of N- acetylcysteine. The term "pharmaceutically acceptable salt" means all those salts that are suitable for the contact of animal tissues without toxicity, irritation, allergic reaction and are in accordance with a reasonable risk / benefit ratio. Pharmaceutically acceptable salts are well known to a person skilled in the art, with sodium salt being the most common.

Compuestos que son capaces de aumentar los niveles intracelulares de glutatión son bien conocidos e incluyen, pero no están limitados a, la N-acetilcisteína, el ácido \alpha-lipoico, los ésteres de glutatión, la N-(2-mercaptopropionil) glicina, el ácido 2-oxotiazolidina-4-carboxílico y sus ésteres.Compounds which are capable of increasing intracellular levels of glutathione are well known and include, but are not limited to, acetylcysteine N, acid \ alpha-lipoic acid , esters of glutathione, N - (2-mercaptopropionyl) glycine, 2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid and its esters.

El aditivo para piensos de la presente invención puede utilizarse para preparar piensos para peces mediante una mezcla uniforme de los ingredientes y una posterior extrusión o granulación. Asimismo, la NAC puede microencapsularse previamente a la extrusión o granulación para disminuir su solubilidad en el pienso y así aumentar su estabilidad. Además, la adición del aditivo de la presente invención puede llevarse a cabo mediante una pulverización de un pienso comercial con una disolución de NAC, que se dejaría secar para que se retenga el aditivo en el pienso. Estos métodos son bien conocidos por los especializados en la materia.The feed additive of the present invention can be used to prepare fish feed by uniform mixing of the ingredients and subsequent extrusion or granulation. Likewise, the NAC can be microencapsulated before extrusion or granulation to decrease its solubility in the I think and thus increase its stability. In addition, the addition of additive of the present invention can be carried out by means of a spraying of a commercial feed with a NAC solution, that would be allowed to dry so that the additive is retained in the feed. These methods are well known to those specialized in matter.

La presente invención es aplicable a cualquier tipo de pez en cuyo cultivo se presenten problemas de estrés oxidativo o haya algún tratamiento por parasiticidas que disminuyan los niveles de glutatión o produzcan un estrés oxidativo en los peces. De destacar son los cultivos de la anguila, salmón, trucha, lubina y dorada.The present invention is applicable to any type of fish in whose culture stress problems occur oxidative or there is some treatment for parasiticides that decrease glutathione levels or produce oxidative stress in the fishes. Of note are the eel, salmon, trout, sea bass and gold.

Brief description of the content of the figures

Figuras 1A y 1B - Contenido en glutatión reducido (GSH) (1A) y nivel del estado redox del glutatión (GSH/GSSG) (1B) en el hígado de las anguilas alimentadas durante 6 meses con las dietas experimentales y expuestas a 0,1 \mug/L de azametifós durante 30 min. Estas figuras muestran una disminución del contenido de GSH, y especialmente, una oxidación del estado redox del glutatión en el hígado de los peces alimentados con el pienso control tras la intoxicación con el plaguicida, mientras que se mantienen estos niveles en los animales alimentados con N-acetilcisteína. Los asteriscos expresan las diferencias significativas entre tratamientos para un mismo tiempo según los contrastes dentro del ANOVA de dos factores, siendo *,**, P < 0,05 y 0,01, respectivamente. Los valores representan la media \pm el error estándar (n=6 animales).Figures 1A and 1B - Reduced glutathione (GSH) (1A) content and level of glutathione redox status (GSH / GSSG) (1B) in the liver of eels fed for 6 months with experimental diets exposed to 0.1 \ mug / L of azametifós for 30 min. These figures show a decrease in the GSH content, and especially, an oxidation of the redox state of glutathione in the liver of fish fed with the control feed after pesticide poisoning, while these levels are maintained in animals fed with N -acetylcysteine. The asterisks express the significant differences between treatments for the same time according to the contrasts within the ANOVA of two factors, being *, **, P <0.05 and 0.01, respectively. The values represent the mean ± the standard error (n = 6 animals).

Figuras 2A y 2B - Contenido en glutatión reducido (GSH) (2A) y nivel del estado redox del glutatión (GSH/GSSG) (2B) en el músculo de las anguilas alimentadas durante 6 meses con las dietas experimentales y expuestas a 0,1 \mug/L de azametifós durante 30 min. Estas figuras muestran una disminución y oxidación de los niveles de glutatión en el músculo de los peces como consecuencia de la etapa de desparasitación, existiendo una disminución de GSH mayor en los animales alimentados con la dieta control respecto a los alimentados con el pienso que contiene N-acetilcisteína. Los asteriscos expresan las diferencias significativas entre tratamientos para un mismo tiempo según los contrastes dentro del ANOVA de dos factores, siendo *,**, P < 0,05 y 0,01, respectivamente. Los valores representan la media \pm el error estándar (n=6 animales).Figures 2A and 2B - Content in reduced glutathione (GSH) (2A) and level of the redox state of glutathione (GSH / GSSG) (2B) in the eel muscle fed for 6 months with experimental diets and exposed to 0.1 \ mug / L of azametifós for 30 min. These figures show a decrease and oxidation of glutathione levels in the fish muscle as a result of the deworming stage, there being a greater decrease in GSH in animals fed with the control diet compared to those fed with feed containing N -acetylcysteine. The asterisks express the significant differences between treatments for the same time according to the contrasts within the ANOVA of two factors, being *, **, P <0.05 and 0.01, respectively. The values represent the mean ± the standard error (n = 6 animals).

Figuras 3A y 3B - Actividad glutatión S-transferasa (GST) en el hígado (3A) y músculo (3B) de las anguilas alimentadas durante 6 meses con las dietas experimentales y expuestas a 0,1 \mug/L de azametifós durante 30 min. Estas figuras muestran como la actividad GST se induce en el hígado y músculo de los peces alimentados con el pienso suplementado con N-acetilcisteína, por lo que dichos animales tienen mayor capacidad para destoxificar al plaguicida. Los asteriscos expresan las diferencias significativas entre tratamientos para un mismo tiempo según los contrastes dentro del ANOVA de dos factores, siendo *, **, ***, P < 0,05, 0,01 y 0,001, respectivamente. Los valores representan la media \pm el error estándar (n=6 animales).Figures 3A and 3B - Glutathione S -transferase (GST) activity in the liver (3A) and muscle (3B) of the eels fed for 6 months with the experimental diets and exposed to 0.1 µg / L of azametifos for 30 min . These figures show how GST activity is induced in the liver and muscle of fish fed with feed supplemented with N- acetylcysteine, so that these animals have a greater capacity to detoxify the pesticide. The asterisks express the significant differences between treatments for the same time according to the contrasts within the ANOVA of two factors, being *, **, ***, P <0.05, 0.01 and 0.001, respectively. The values represent the mean ± the standard error (n = 6 animals).

Figura 4 - Actividad acetilcolinesterasa (AChE) en el cerebro de las anguilas alimentadas durante 6 meses con las dietas experimentales y expuestas a 0,1 \mug/L de azametifós durante 30 min. Esta figura muestra la inhibición de la actividad acetilcolinesterasa como consecuencia de la toxicidad del plaguicida organofosforado y como se va recuperando dicha actividad respecto al tiempo. Sin embargo, los peces alimentados con el pienso enriquecido con N-acetilcisteína presentaron una recuperación más rápida. Los asteriscos expresan las diferencias significativas entre tratamientos para un mismo tiempo según los contrastes dentro del ANOVA de dos factores, siendo *, **, ***, P < 0,05, 0,01 y 0,001, respectivamente. Los valores representan la media \pm el error estándar (n=6
animales).Figure 4 - Acetylcholinesterase (AChE) activity in the brain of eels fed for 6 months with experimental diets and exposed to 0.1 µg / L of azamethylphos for 30 min. This figure shows the inhibition of acetylcholinesterase activity as a result of the toxicity of the organophosphorus pesticide and how this activity is recovering with respect to time. However, fish fed the feed enriched with N- acetylcysteine showed a faster recovery. The asterisks express the significant differences between treatments for the same time according to the contrasts within the ANOVA of two factors, being *, **, ***, P <0.05, 0.01 and 0.001, respectively. The values represent the mean ± the standard error (n = 6
animals).

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Examples of embodiment of the invention Example 1 Effect of the addition of N- acetylcysteine in fish diets in increasing glutathione levels and GST activity

Para preparar el pienso de la presente invención se utilizó como base un pienso comercial formulado para la alimentación de anguilas, que está compuesto a base de productos de pescado, aceites y grasas, harina de sangre, productos y subproductos de semillas oleaginosas, subproductos y granos de cereales y minerales. Esta dieta está enriquecida además por vitaminas (Tabla 1). La N-acetil-L-cisteína fue añadida a una concentración final de 1,5 g por kilogramo de pienso (0,15%), equivalente a 9,2 mmoles de N-acetil-L-cisteína por kg de pienso. Los piensos se fabricaron según el método de extrusión descrito en la patente europea EP0169126 (Process for treating material by extrusion and apparatus for preparing a composite foodstuff; fecha de publicación 1986-01-22). Un pienso control de las mismas características se obtuvo mediante la extrusión del pienso base pero sin la adición de N-acetil-L-cisteína. Las dietas se mantuvieron refrigeradas a 4ºC o congeladas a -30°C hasta su uso.To prepare the feed of the present invention, a commercial feed formulated for feeding eels was used as a base, which is composed of fish products, oils and fats, blood meal, oilseed products and by-products, by-products and grains of cereals and minerals. This diet is also enriched by vitamins (Table 1). The N- acetyl-L-cysteine was added to a final concentration of 1.5 g per kilogram of feed (0.15%), equivalent to 9.2 mmol of N- acetyl-L-cysteine per kg of feed. The feed was manufactured according to the extrusion method described in European patent EP0169126 (Process for treating material by extrusion and apparatus for preparing a composite foodstuff; publication date 1986-01-22). A control feed of the same characteristics was obtained by extrusion of the base feed but without the addition of N- acetyl-L-cysteine. The diets were kept refrigerated at 4 ° C or frozen at -30 ° C until use.

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TABLE 1 Composición del pienso comercialComposition of commercial feed

Análisis de la composiciónAnalysis of the composition %% Proteína BrutaCrude protein 5656 Materias Grasas BrutasSubjects Crude Fats 20twenty Cenizas BrutasAshes Gross 99 Celulosa BrutaCellulose Gross 0,90.9 AditivosAdditives Por KgBy Kg Vitamina AVitamin A 10.000 UI10,000 IU Vitamina D3Vitamin D3 1.500 UI1,500 IU Vitamina E (\alpha-tocoferol)Vitamin E (α-tocopherol) 150 mg150 mg

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Como animal de estudio se utilizó la anguila europea (Anguilla anguilla). Éstas se obtuvieron con un peso de 5 a 8 g y fueron acondicionadas durante 2 semanas a las condiciones de laboratorio alimentándose con el pienso control. Posteriormente, 200 anguilas se distribuyeron aleatoriamente en dos tanques de 450 L de fibra de vidrio provistos de un circuito semicerrado de recirculación, filtración y calentamiento del agua, para mantener un caudal de agua dulce constante a 21 \pm 1°C. Los tanques disponían de aireación continua, con una cantidad de oxígeno disuelto de 7,6 \pm 0,5 mg/L. Los peces fueron alimentados durante 6 meses hasta la saciedad dos veces al día de lunes a viernes y una vez durante los fines de semana.The European eel ( Anguilla anguilla ) was used as a study animal. These were obtained with a weight of 5 to 8 g and were conditioned for 2 weeks to the laboratory conditions by feeding with the control feed. Subsequently, 200 eels were randomly distributed in two 450 L fiberglass tanks equipped with a semi-closed water recirculation, filtration and heating circuit, to maintain a constant freshwater flow at 21 ± 1 ° C. The tanks had continuous aeration, with an amount of dissolved oxygen of 7.6 ± 0.5 mg / L. The fish were fed for 6 months until satiety twice a day from Monday to Friday and once during the weekends.

Los niveles de glutatión, tanto total como oxidado, se determinaron según un ensayo colorimétrico sensible y específico (Baker et al., 1990, Anal. Biochem. 190: 360-365). Las actividades enzimáticas se analizaron según Peña- Llopis et al. (2003, Aquat. Toxicol. 65: 337-360). El contenido de proteínas se determinó por el kit de Bio-Rad basado en el procedimiento colorimétrico de Bradford (1976, Anal. Biochem. 72: 248-254), usando albúmina sérica bovina como estándar. El análisis de la varianza (ANOVA) de dos factores se realizó mediante modelos lineales generales (GLM) multivariantes en el SPSS 11.5, utilizando el peso de los individuos como covariable. Para comparar las medias de los tratamientos correspondientes a un determinado tiempo se utilizaron contrastes a priori entre determinados niveles de los factores.Glutathione levels, both total and oxidized, were determined according to a sensitive and specific colorimetric assay (Baker et al ., 1990, Anal. Biochem. 190: 360-365). Enzymatic activities were analyzed according to Peña-Llopis et al . (2003, Aquat. Toxicol. 65: 337-360). Protein content was determined by the Bio-Rad kit based on the Bradford colorimetric procedure (1976, Anal. Biochem. 72: 248-254), using bovine serum albumin as standard. The analysis of the variance (ANOVA) of two factors was performed using general linear multivariate models (GLM) in the SPSS 11.5, using the weight of the individuals as covariate. To compare the means of the treatments corresponding to a certain time, a priori contrasts were used between certain levels of the factors.

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Para estudiar el efecto del pienso enriquecido con NAC, se tomaron muestras al azar de 6 peces de cada uno de los dos tanques al cabo de 1, 3 y 6 meses de alimentar a los animales con las dietas experimentales. Éstos fueron anestesiados en hielo (para que ningún producto químico pudiese interferir con el metabolismo del glutatión) y se les diseccionó el hígado y el músculo, que se almacenaron a -80°C hasta que se realizaron los análisis bioquími-
cos.To study the effect of feed enriched with NAC, random samples of 6 fish were taken from each of the two tanks after 1, 3 and 6 months of feeding the animals with the experimental diets. These were anesthetized on ice (so that no chemical could interfere with glutathione metabolism) and the liver and muscle were dissected, which were stored at -80 ° C until biochemical analyzes were performed.
cos.

Los peces que fueron alimentados con el pienso suplementado en un 0,15% con N-acetilcisteína presentaron unos niveles significativamente mayores de GSH, de la relación GSH/GSSG y de la actividad glutatión S-transferasa en el hígado y músculo (Tabla 3). En cambio no se observaron diferencias en el tiempo transcurrido de la alimentación con las dietas experimentales ni con la interacción del tratamiento con NAC y el tiempo de alimentación. El contenido de GSH y el estado redox del glutatión en el hígado y músculo de las anguilas alimentadas con el pienso enriquecido con NAC fue significativamente mayor al cabo del primer mes de alimentación (Tabla 2). La actividad GST del hígado de las anguilas alimentadas con NAC también fue significativamente más alta al cabo del primer mes de alimentación, pero las diferencias con el pienso control en el caso de la actividad GST en el músculo de las anguilas fue significativo al cabo de 6 meses de alimentación.The fish that were fed the feed supplemented in 0.15% with N- acetylcysteine had significantly higher levels of GSH, the GSH / GSSG ratio and the glutathione S- transferase activity in the liver and muscle (Table 3) . On the other hand, no differences were observed in the elapsed time of feeding with experimental diets or with the interaction of NAC treatment and feeding time. The content of GSH and the redox state of glutathione in the liver and muscle of eels fed with NAC-enriched feed was significantly higher after the first month of feeding (Table 2). The GST activity of the liver of the NAC-fed eels was also significantly higher after the first month of feeding, but the differences with the control feed in the case of the GST activity in the eel muscle was significant after 6 months of feeding

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TABLE 2 Contenido en glutatión reducido (GSH, nmol GSx/mg proteínas), oxidado (GSSG, nmol GSx/mg proteínas), nivel del estado redox del glutatión (GSH/GSSG) y actividad glutatión S-transferasa (GST, mU/mg proteínas) en el hígado y músculo de las anguilas alimentadas durante 1, 3 y 6 meses con las dietas experimentales (media \pm error estándar)Reduced glutathione (GSH, nmol GSx / mg proteins), oxidized (GSSG, nmol GSx / mg proteins) content, glutathione redox status level (GSH / GSSG) and glutathione S -transferase activity (GST, mU / mg proteins) in the liver and muscle of eels fed for 1, 3 and 6 months with experimental diets (mean ± standard error)

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1one

TABLE 3 Efecto del tratamiento con N-acetilcisteína, el tiempo de alimentación y la interacción tratamiento-tiempo en los niveles de glutatión y actividad glutatión S-transferasa en el hígado y músculo de las anguilasEffect of N- acetylcysteine treatment, feeding time and treatment-time interaction on glutathione levels and glutathione S -transferase activity in the liver and eel muscle

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22

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Ejemplo 2Example 2

Effect of the addition of N- acetylcysteine in fish diets in increasing tolerance and recovery to the pesticide azametifós

En este caso se estudió el efecto de la alimentación de las anguilas con las dietas experimentales en la tolerancia a un tratamiento con un parasiticida. El plaguicida organofosforado azametifós (fosforotioato de S-6-cloro-2,3-dihidro-2-oxo-1,3-oxazol [4,5-b] piridin-3-ilmetil O,O-dimetilo) se administró en forma de Alfacrón® 50 WP (Novartis Sanidad Animal S.L., Barcelona), que consiste en azametifós al 50% en peso. Las anguilas fueron expuestas a 0,1 \mug de azametifós por litro de agua (0,1 ppm/L) durante 30 minutos, que es la concentración que normalmente se utiliza en las tareas de desparasitación de los peces. Posteriormente, las anguilas se transfirieron a tanques de 450 L. Seis anguilas de cada grupo de alimentación fueron sacadas de los tanques a las 0, 3, 6, 12, 24 y 96 horas tras la intoxicación con el plaguicida y analizadas como en el Ejemplo 1, salvo que se determinó además la actividad acetilcolinesterasa (AChE) del cerebro, ya que se trata del mejor biomarcador de toxicidad a plaguicidas organofos-
forados.In this case, the effect of feeding eels with experimental diets on tolerance to a treatment with a parasiticide was studied. The organophosphorus pesticide azametiphos ( S- 6-chloro-2,3-dihydro-2-oxo-1,3-oxazol [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl O, O-dimethyl phosphorothioate) was administered as Alfacrón® 50 WP (Novartis Sanidad Animal SL, Barcelona), which consists of 50% azametifós by weight. The eels were exposed to 0.1 µg of azametephos per liter of water (0.1 ppm / L) for 30 minutes, which is the concentration normally used in the deworming of fish. Subsequently, the eels were transferred to 450 L tanks. Six eels from each feeding group were removed from the tanks at 0, 3, 6, 12, 24 and 96 hours after pesticide poisoning and analyzed as in Example 1, except that the brain acetylcholinesterase (AChE) activity was also determined, since it is the best biomarker of organophosphate pesticide toxicity.
forados.

Los peces que fueron alimentados durante 6 meses con el pienso suplementado en un 0,15% con N-acetil-L-cisteína y expuestos durante 30 minutos a 0,1 ppm/L del parasiticida azametifós presentaron un mayor contenido de GSH y actividad GST en el hígado y músculo que las anguilas alimentadas con el pienso control (Tabla 4). Además, se observó que las anguilas alimentadas con NAC tenían una mayor relación del GSH/GSSG a nivel hepático y especialmente una menor inhibición de la actividad acetilcolinesterasa del cerebro, por lo que presentaban menores síntomas de toxicidad. Mientras que la intoxicación con el plaguicida disminuyó los niveles de GSH en el hígado y músculo (Figuras 1A y 2A), los peces alimentados con NAC mostraron un aumento del contenido en GSH entre las 3 y 6 horas, siendo también significativas las diferencias respecto al GSH hepático de los individuos alimentados con el pienso control a las 12, 48 y 96 h tras la exposición. El estado redox del glutatión en el hígado (Figura 1B) fue significativamente mayor a partir de las 48 h tras la intoxicación, mientras que en el músculo lo fue a las 3 h (Figura 2B). La actividad GST en el hígado de los peces alimentados con NAC aumentó con el tiempo tras la intoxicación, siendo las diferencias significativas a partir de las 48 h (Figura 3A), por lo que se observa un efecto temporal y también una interacción entre el tratamiento con NAC y el tiempo (Tabla 4). La actividad GST en el músculo aumentó significativamente en las anguilas tratadas con NAC a las 3, 48 y 96 h tras la exposición al parasiticida (Figura 3B). La exposición al plaguicida inhibió la actividad acetilcolinesterasa del cerebro, observándose una recuperación con el tiempo (Tabla 4 y Figura 4), que fue mayor en los peces alimentados con NAC, especialmente durante las primeras 3 h tras la intoxicación con el plaguicida y a partir de las 48 h. Así, se observó en estos peces una mayor recuperación de la toxicidad del
parasiticida.The fish that were fed for 6 months with the feed supplemented in 0.15% with N- acetyl-L-cysteine and exposed for 30 minutes at 0.1 ppm / L of the parasiticide azametifós had a higher content of GSH and GST activity in the liver and muscle that the eels fed with the control feed (Table 4). In addition, it was observed that the NAC-fed eels had a higher relationship of the GSH / GSSG at the liver level and especially a lower inhibition of the brain's acetylcholinesterase activity, so they had lower toxicity symptoms. While pesticide poisoning decreased levels of GSH in the liver and muscle (Figures 1A and 2A), fish fed with NAC showed an increase in GSH content between 3 and 6 hours, the differences with respect to Hepatic GSH of the individuals fed the control feed at 12, 48 and 96 h after exposure. The redox state of glutathione in the liver (Figure 1B) was significantly higher after 48 h after intoxication, while in the muscle it was at 3 h (Figure 2B). The GST activity in the liver of fish fed with NAC increased over time after poisoning, the differences being significant after 48 h (Figure 3A), so a temporary effect and also an interaction between the treatment is observed with NAC and time (Table 4). GST activity in muscle increased significantly in eels treated with CAP at 3, 48 and 96 h after exposure to parasiticide (Figure 3B). Exposure to the pesticide inhibited the acetylcholinesterase activity of the brain, with a recovery observed over time (Table 4 and Figure 4), which was greater in fish fed with NAC, especially during the first 3 hours after pesticide poisoning and from 48 h. Thus, a greater recovery of the toxicity of the fish was observed in these fish.
parasiticide.

TABLE 4 Efecto del tratamiento con N-acetil-L-cisteína, el tiempo de recuperación tras la exposición de 30 min a 0,1 ppm de azametifós y la interacción tratamiento-tiempo en los niveles de glutatión y actividades enzimáticasEffect of treatment with N- acetyl-L-cysteine, recovery time after exposure of 30 min at 0.1 ppm of azamethylphos and treatment-time interaction in glutathione levels and enzymatic activities

33

Claims

1. A feed additive for farmed fish characterized by being constituted by N- acetylcysteine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

2. Feed for farmed fish characterized in that it contains a feed additive according to claim 1.

3. Feed for farmed fish according to claim 2, characterized in that the N- acetylcysteine is incorporated in an amount of between 0.1 and 50 g (0.01 to 5%) and more preferably 0.5 and 5 g (from 0.05 to 0.5%) per kilogram of weight.

4. Feed according to any of claims 2 and 3, characterized in that the feed additive is incorporated into the feed in an extruded form.

5. Feed according to any of claims 2 and 3, characterized in that the feed additive is incorporated into the feed in granulated, microencapsulated or powdered form.

6. Use of a feed additive or feed containing said additive according to any of the Claims 1 to 5 for feeding fish culture.

7. Use of a feed additive or feed containing said additive according to claim 6, characterized in that it increases the intracellular glutathione levels of farmed fish.

8. Use of a feed additive or feed containing said additive according to claim 6, characterized in that it increases the cellular detoxification of contaminants from farmed fish.

9. Use of a feed additive or feed containing said additive according to claim 6, characterized in that it increases the tolerance of farmed fish to oxidative stress.

10. Use of a feed additive or feed containing said additive according to claim 9, characterized in that it increases the tolerance of farmed fish to oxidative stress caused by pesticides.

11. Use of a feed additive or feed containing said additive according to claim 6, characterized in that it increases the resistance of farmed fish to pesticides.

12. Use of a feed additive or feed containing said additive according to claim 6, characterized in that it favors the recovery of farmed fish after pesticide poisoning.

13. Use of a feed additive or feed containing said additive according to any of claims 10 to 12, characterized in that the pesticide produces oxidative stress and / or a decrease in glutathione levels in farmed fish .

14. Use of a feed additive or feed containing said additive according to any of claims 10 to 13, characterized in that the pesticide is a parasiticide used against parasites that infect fish.

15. Use of a feed additive or feed containing said additive according to any of claims 10 to 14, characterized in that the pesticide is an organophosphorus and / or pyrethroid.

16. Use of a feed additive or of a feed containing said additive according to any of claims 10 to 14, characterized in that the pesticide is azamethylphos.

17. Use of a feed additive or of a feed containing said additive according to any of claims 10 to 16, characterized in that one or more pesticides are administered concomitantly or simultaneously.

18. Use of a feed additive or feed containing said additive according to claim 6, characterized in that the culture fish is eel.

19. Use of a feed additive or feed containing said additive according to claim 6, characterized in that the farmed fish are teleost, among others, salmon, trout, sea bass and sea bream.