ES2248476T3 - Inosina-5'-monofosfato deshidrogenasa y su empleo para la identificacion de compuestos con actividad fungicida. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la identificación de fungicidas, caracterizado porque (a) se pone en contacto una IMP deshidrogenasa de hongos patógenos para las plantas, con un compuesto químico o con una mezcla de compuestos químicos, (b) se compara la actividad biológica de la IMP deshidrogenasa en presencia del compuesto químico o de la mezcla de compuestos químicos con la actividad biológica de la IMP deshidrogenasa en ausencia del compuesto químico o de la mezcla de los compuestos químicos, y (c) se determina el compuesto químico que inhibe de manera específica la actividad biológica de la IMP deshidrogenasa.

Description

Inosina-5'-monofosfato deshidrogenasa y su empleo para la identificación de compuestos con actividad fungicida.

La invención se refiere a polipéptidos procedentes de hongos patógenos para las plantas con la actividad biológica de una inosinamonofosfato deshidrogenasa, a ácidos nucleicos que los codifican, al empleo de los polipéptidos y de los ácidos nucleicos para la identificación de moduladores de los polipéptidos, a procedimientos para la identificación de tales moduladores y al empleo de estos moduladores como fungicidas.

El crecimiento indeseado de los hongos, que conduce en la agricultura anualmente a pérdidas considerables, puede controlarse mediante el empleo de fungicidas. Permanentemente se exigen mayores requisitos a los fungicidas en lo que se refiere a su actividad, a sus costes y, ante todo, a su compatibilidad con respecto al medio ambiente. Por lo tanto existe una necesidad de nuevas substancias o bien de nuevas clases de substancias, que puedan desarrollar fungicidas eficaces y compatibles con el medio ambiente. En general, es usual buscar en ensayos de invernadero tales estructuras conductoras, nuevas. Sin embargo, tales ensayos requieren un trabajo intenso y son caros. El número de las substancias, que pueden ser ensayadas en el invernadero está limitado, de manera correspondiente. Una alternativa a tales ensayos consiste en el empleo de los procedimientos denominados de alta capacidad (HTS = high throughput screening). En este caso se ensaya, en un procedimiento automatizado, un gran número de substancias individuales en lo que se refiere a su actividad sobre las células, sobre productos genéticos individuales o sobre genes. Cuando se detecta una actividad para ciertas substancias, éstas pueden ensayarse según los procedimientos tradicionales de selección y, en caso dado, pueden seguir siendo desarrolladas.

Ventajosamente, los puntos de ataque para los fungicidas se ensayan frecuentemente por vías biosintéticas esenciales. Los fungicidas ideales son, además, aquellos productos que inhiben los productos genéticos, que tienen un significado decisivo durante la expresión de la patogenidad de un hongo.

La tarea de la presente invención consistía, por lo tanto, en identificar y hacer accesible un nuevo punto de ataque, adecuado, para los productos activos potencialmente fungicidas, y poner a disposición un procedimiento que posibilitase la identificación de los moduladores de un punto de ataque, que puedan ser empleados como fungicidas.

La inosinamonofosfato deshidrogenasa (EC 1.1.1.205) denominada a continuación abreviadamente como IMP deshidrogenasa o IMPDH, cataliza la etapa limitadora de la velocidad e irreversible de la síntesis de la de novo GTP. En este caso se transforma el inosina-5'-monofosfato (IMP) con el nicotinamida adenina dinucleótido (NAD^{+}) mediante la IMPDH para dar NADH/H^{+} y XMP (figura 1). El inosina-5'-monofosfato es el producto final de la biosíntesis de de novo purina y es un producto intermedio esencial en la síntesis, anteriormente citada, de los nucleótidos de adenina y de guanina. La IMPDH es, por lo tanto, un enzima clave para la preparación del GTP, que tiene un significado inmenso para las células. El GTP se incorpora en el RNA y en el DNA, sirve como substrato para las GTPasas (por ejemplo en las vías de transducción de señales de las células tales como receptores acoplados con G-proteína), para la guanilato-ciclasa (obtención del mensajero secundario cGMP) así como a modo de cosubstrato en muchas reacciones enzimáticas y juega un papel en la modificación que se realiza tras la transcripción del mRNA (estructura 5'-Cap). La IMPDH es, por lo tanto, ya desde hace ya algún tiempo, un punto de ataque para la busca de productos activos antivirales, inmunosupresores, cancerostáticos y antimicrobianos.

Además existe la indicación de que la IMPDH juega también un papel completamente diferente en las plantas, que está relacionado con la asimilación, con el transporte y con el almacenamiento del nitrógeno. De este modo existe la indicación de que la IMPDH participa en la formación de ureidos y de alantoína.

También se han dado a conocer ya polipéptidos, procedentes de determinados hongos, con la actividad de una IMPDH. A éstos pertenece la IMPDH procedente de Candida albicans, que es un hongo patógeno para los seres humanos, cuya secuencia abarca 521 aminoácidos. La secuencia correspondiente puede obtenerse por ejemplo mediante el banco de datos denominado "trembl" (U85049, AF249293). Del mismo modo puede accederse a las secuencias del hongo Ashbya gossypii, filamentoso, que se emplea frecuentemente para fermentaciones, con 522 aminoácidos (trembl, A94860 o bien EP 0 927 761 A2), Saccharomyces pombe con 524 AS (Z97211) y Saccharomyces cerevisiae con 524 aminoácidos (Z46729) así como el hongo monocelular, patógeno para los seres humanos, Pneumocystis carinii con 529 aminoácidos (AF196975). De manera interesante se han identificado a partir de las levaduras ya varios genes que codifican un polipéptido con la actividad de una IMPDH.

El ácido micofenólico, que es un inhibidor específico conocido de la IMPDH, es un medicamento conocido para la represión de la inmunoreacción por ejemplo tras el transplante de órganos. La estructura de una IMPDH junto con el inhibidor constituido por el ácido micofenólico ya ha podido ser explicada (Sintack et al. (1996) "Structure and Mechanism of Inosine Monophosphate Dehydrogenase in Complex with the Immunosuppressant Mycophenolic Acid". Cell 86, 921), del mismo modo existen trabajos relativos al mecanismo bioquímico de la inhibición de la IMPDH por medio del ácido micofenólico (Fleming et al. (1996) "Inhibition of IMPDH by Mycophenolic Acid: Dissection of Forward and Reverse Pathways Using Capillary Electrophoresis". Biochemistry 35, 6990).

El ácido micofenólico presenta una actividad muy buena frente a la IMPDH de los mamíferos, sin embargo tiene una actividad claramente menor como producto activo antimicrobiano (Digits et al. (1999) "Species Specific Inhibition of Inosine 5'-Monophosphate Dehydrogenase by Mycophenolic Acid." Biochemistry, 38,15388). El ácido micofenólico enlaza en la caja de unión de la nicotinamida el punto de enlace del NAD^{+} sobre el intermedio que se forma por el enlace de XMP procedente del IMP. Debido a la diferencia entre los polipéptidos procedentes de especies diferentes se produce ya, sin embargo, una sensibilidad de la IMPDH humana que es de 20 hasta 450 veces más potente frente a una IMPDH microbiana (véase a este respecto también la publicación de Zhang et al. (1999) "Differential Signatures of Bacterial and Mammalian IMP Dehydrogenase Enzymes." Current Medicinal Chemistry 6, 537).

Otros inhibidores de la IMPDH, que son conocidos en el ámbito de la terapia medicinal son, por ejemplo, la ribovirina, un análogo de la guanosina, que tiene propiedades antivirales, la tiazofurina, un C-nucleósido, que se forma tras la fosforilación del grupo 5'-hidroxilo, un dinucleótido de tiazofurina-adenina similar al NAD y que sirve como cancerostático, o la mizorribina, que se emplea en la medicina de los transplantes para la inmunosupresión (Goldstein und Colby (1999) "IMP Dehydrogenase: Structural Aspects of Inhibitor Binding". Current Medicinal Chemistry 6, 519). Por el contrario, la mizorribina no presenta actividad frente al hongo patógeno para los seres humanos C. albicans y evidentemente no puede emplearse en absoluto como producto activo contra la candidiasis (Ishikawa (1999) "Mizoribine and Mycophenolate Mofetil". Current Medicinal Chemistry 6, 575).

La secuencia de la IMPDH, aislada a partir de C. albicans presenta claramente una similitud secuencial con la IMPDH procedente de S. cerevisiae y de otros organismos. El ORF ("open reading frame", ventana de lectura abierta) del gen C. albicans se interrumpe por medio de un pequeño intrón (289 pares de bases (bp)), que presenta límites exon-intrón típicos (Kohler et al. (1997) Overexpression of a cloned IMP dehydrogenase gene of Candida albicans confers resistance to the specific inhibitor mycophenolic acid. J. Bacteriol. 179, 2331). El crecimiento de las células de C. albicans puede inhibirse por medio de 1 \mug/ml de ácido micofenólico, mientras que tales células, que tienen un plásmido con IMPDH recombinante, son resistentes hasta frente 40 \mug/ml.

En el caso de Pneumocystis carinii pudo demostrarse que el ácido micofenólico puede actuar como inhibidor de la IMPDH procedente de este organismo (O'Gara et al. (1997) "IMP dehydrogenase from Pneumocystis carinii as a potential target". Antimicrob. Agents Chemother. 41, 40) y se ha propuesto el aprovechamiento de la IMPDH como diana sensible de este organismo. La IMPDH de Pneumocystis carinii (secuencia de aminoácido) presenta una homología con respecto a la IMPDH bacteriana (31 hasta 38%), con la IMPDH procedente de los protozoos (48 hasta 59%), de los mamíferos (60 hasta 62%) y de los hongos (62%). La actividad de la IMPDH recombinante pudo inhibirse en un 50% a una concentración de 25 \muM de ácido micofenólico.

Trabajos anteriores muestran, sin embargo, que el ácido micofenólico ciertamente inhibe, como se ha descrito anteriormente, in vitro, el crecimiento de algunos hongos patógenos para los seres humanos (por ejemplo C. albicans, Cryptococcus neoformans), sin embargo el compuesto presenta, al mismo tiempo, ausencia de actividad contra Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, Hansenula anomala y tampoco presenta actividad contra S. cerevisiae (Noto et al. (1969) "Biological properties of mycophenolic acid". J. Antibiot. (Tokyo), 22, 165).

Los resultados muestran, que la IMPDH procedente de mamíferos puede ser perfectamente inhibida con el inhibidor conocido constituido por el ácido micofenólico, mientras que la actividad del inhibidor es débil en el caso de los microorganismos. En el caso de los hongos patógenos para los seres humanos, ensayados, parece que la actividad presenta oscilaciones. Algunos hongos, tal como por ejemplo S. cerevisiae, han sido descritos como insensibles frente a una inhibición por medio de un inhibidor de la IMPDH, en el caso de otros hongos, patógenos para los seres humanos, puede detectarse una actividad, observándose sin embargo un efecto fungiestático más que un efecto fungicida. La adecuación de la IMPDH como proteína diana para fungicidas, o bien para el empleo para la busca de productos activos fungicidas es, por lo tanto, cuestionable. Especialmente ha podido demostrarse hasta el presente una actividad al menos fungistática únicamente en el caso de algunos hongos patógenos para los seres humanos, mientras que no se dispone hasta ahora de una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de una IMPDH a partir de hongos para las plantas, y tampoco se tienen conocimientos de que los hongos patógenos para las plantas reaccionen sensiblemente, bajo ciertas circunstancias, contra un inhibidor de la IMPDH, de manera que pudiesen ser empleados tales inhibidores como fungicidas.

La tarea de la presente invención consistía, por lo tanto, especialmente en hacer accesibles una IMPDH de un hongo patógeno para las plantas, así como procedimientos que fuesen adecuados para identificar inhibidores del enzima, así como para ensayar si tales inhibidores podrían ser empleados como fungicidas en los hongos patógenos para las plantas.

Descripción de las figuras y del protocolo de secuencias

Figura 1: la reacción, catalizada por la IMPDH, es una conversión del inosina-5'-monofosfato (IMP) para dar xantosina-5'-monofosfato (XMP), formándose la NADH a partir del NAD^{+}. Esta reacción, catalizada por la IMPDH, describe su actividad biológica o bien enzimática.

Figura 2: la purificación de la IMPDH procedente de U. maydis puede seguirse con ayuda de una separación sobre un gel. Huella 1: conductor 10 kD; huella 2: extracto de proteína de un cultivo no inducido; huella 3: extracto de proteína de un cultivo inducido al cabo de 1,5 h de incubación; huella 4: sobrenadante soluble del extracto proteico E. coli; huella 5: flujo de la columna de Ni-NTA; huella 6: eluato 1 de la columna de Ni-NTA; huella 7: eluato 2 de la columna Ni-NTA; huella 8: conductor de 10 kD.

Figura 3: cinética de la reacción del NAD^{+} mediante la IMPDH. En un volumen de ensayo de 50 \mul se emplearon 25 \muM del NAD^{+} y 50 \muM del IMP. Las concentraciones empleadas de las proteínas pueden verse en la figura. La conversión se siguió por medio de la fluorescencia del NADH formado. En la figura se ha indicado la fluorescencia relativa.

Figura 4: valor K_{M} determinación para el NAD^{+} con V_{o/max} = velocidad de reacción inicial o bien velocidad de reacción máxima en \muM/(mg^{-1}min^{-1}) y S = concentración de la substancia en \muM.

Figura 5: comparación de las secuencias en el plano de los aminoácidos entre la IMP deshidrogenasa de U. maydis, las secuencias conocidas de S. cerevisiae, y de la IMP deshidrogenasa de Homo sapiens y A. thaliana. La consecuencia típica para la IMP deshidrogenasa en el centro catalítico del enzima se ha representado en trazo grueso.

SEQ ID NO:1:

DNA genómico que codifica la IMP deshidrogenasa de Ustilago maydis. El DNA genómico contiene un intrón.

SEQ ID NO:2:

secuencia de polipéptidos, codificada por el DNA según SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO:3:

cDNA que codifica la IMP deshidrogenasa de Ustilago maydis.

SEQ ID NO:4:

secuencia de polipéptidos, codificada por el DNA según SEQ ID NO:3.

SEQ ID NO:5:

secuencia artificial (iniciador), adecuada para la obtención y/o para la amplificación del DNA según SEQ ID NO: 1 y 3 así como secuencias homólogas con la anterior.

SEQ ID NO:6:

secuencia artificial (iniciador), adecuada para la obtención y/o para la amplificación del DNA según SEQ ID NO: 1 y 3 así como secuencias homólogas con la anterior.

Definiciones

La expresión "identidad", tal como es empleada en este caso, se refiere al número de posiciones de la secuencia que son idénticas en un alineamiento. En la mayoría de los casos se indica en porcentaje de la longitud del alineamiento.

La expresión "similitud", como se emplea en este caso, presupone, por el contrario, la definición de una métrica de similitud, es decir una medida para la similitud que se desea suponer por ejemplo entre una valina y una treonina o una leucina.

La expresión "homología", tal como se emplea en este caso, significa a su vez un parentesco evolucionario. Dos proteínas homólogas se han desarrollado a partir de una secuencia precursora común. La expresión no tiene nada que ver, obligatoriamente, por ejemplo con identidad o con similitud, independientemente de que las secuencias homólogas son, en la mayoría de los casos, más similares (o tienen en una alineación varias proteínas idénticas) que las secuencias no homólogas.

La expresión "IMPDH", tal como se utiliza en este caso, significa IMP deshidrogenasa, que se denomina alternativamente también como inosina-5'-fosfato deshidrogenasa, inosinato deshidrogenasa, inosina-5'-monofosfato deshidrogenasa, monofosfato de inosina deshidrogenasa, IMP óxidoreductasa o monofosfato de inosina óxidoreductasa, y que cataliza la reacción inosina-5'-monofosfato +NAD^{+} + H_{2}O =xantosina-5'-monofosfato + NADH/H^{+}.

La expresión "IMPDH completa", tal como se emplea en este caso, describe la IMPDH, que es codificada por la región completamente codificante de una unidad de transcripción, comenzando con el codón de iniciación ATG y que comprende todas las zonas de exon que portan información del gen presente en el organismo original, que codifica la IMPDH, así como las señales necesarias para una terminación correcta de la transcripción.

La expresión "actividad biológica de una IMPDH", tal como se emplea en este caso, se refiere a la capacidad de un polipéptido para catalizar la reacción anteriormente descrita, es decir la conversión del IMP en XMP bajo conversión simultánea del NAD^{+} en la NADH.

La expresión "fragmento activo", tal como se emplea en este caso, describe ácidos nucleicos que ya no son completos, que codifican la IMPDH, pero que codifican todavía polipéptidos con actividad biológica de una IMPDH, y que pueden catalizar una reacción, característica para la IMPDH, como se ha descrito más arriba. Tales fragmentos son más cortos que los ácidos nucleicos completos, descritos anteriormente, que codifican la IMPDH. En este caso pueden haberse eliminado ácidos nucleicos tanto en el extremo de la secuencia 3'- y/o 5'-, sin embargo pueden haberse eliminado, es decir pueden haberse retirado incluso partes de la secuencia que no influyan negativamente de una manera decisiva sobre la actividad biológica de la IMPDH. En este caso se entenderá como suficiente en el sentido de la expresión, empleada en este caso, una actividad menor o, en caso dado, incluso una actividad mayor, que permita todavía, sin embargo, la caracterización o bien el empleo del fragmento de IMPDH resultante. La expresión "fragmento activo" puede referirse también a la secuencia de aminoácidos de la IMPDH y es válida entonces, de manera análoga a la de las indicaciones anteriores para aquellos polipéptidos que ya no contengan determinadas partes, en comparación con la secuencia completa anteriormente definida, sin que se influya negativamente, de manera decisiva, sobre la actividad biológica del enzima. Los fragmentos pueden tener en este caso longitudes diferentes, por ejemplo al menos 120, al menos 300, al menos 400 o al menos 500 aminoácidos.

La expresión "gen", tal como se emplea en este caso, es la denominación de un segmento del genoma de una célula, que es responsable de la síntesis de una cadena de polipéptido.

La expresión "cDNA", tal como se emplea en este caso, describe DNA complementario, obtenido mediante un mRNA mediante transcripción inversa. Éste contiene únicamente las secuencias correspondientes al exón del DNA genómico. Tras la secuenciación de cDNA puede derivarse en caso dado la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la misma. Tras introducción de un cDNA en una célula pueden sintetizarse grandes cantidades de la proteína correspondiente, codificada por el mismo.

La expresión "hibridación", tal como se emplea en este caso, describe el proceso según el cual una molécula de ácido nucleico, de una sola hebra interviene en un apareamiento de las bases con una hebra complementaria. De este modo pueden aislarse, por ejemplo, fragmentos de DNA procedentes de otros hongos patógenos para las plantas distintos del Ustilago maydis, por ejemplo a partir de la información relativa a la secuencia citada en este caso o deducible, que codifica las IMPDHs, que presentan propiedades iguales o similares a las de una IMPDH según la invención.

Las condiciones para la hibridación se calculan aproximadamente por medio de la fórmula siguiente:

La temperatura de fusión

Tm = 81,5^{o}C + 16,6 \{log[c(Na^{+})]\} + 0,41(% G + C) - (500/n)

(Lottspeich, F., Zorbas H. (editor). (1998). Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlín).

En este caso c es la concentración y n es la longitud del segmento de la secuencia hibridizante en el apareamiento de las bases. Para una secuencia > 100 bp corresponde la expresión 500/n. Se lava con estringencia máxima a una temperatura de 5 a 15ºC por debajo de Tm y una intensidad iónica de 15 mM de Na^{+} (lo que corresponde a 0,1 x SSC). Cuando se utilice para la hibridación una muestra de RNA, el punto de fusión será de 10 a 15ºC mayor.

Las condiciones preferentes para la hibridación se han indicado a continuación:

Solución para la hibridación: DIG Easy Hyb (Roche, ZZ) temperatura para la hibridación: 42ºC hasta 70ºC, preferentemente a 42-65ºC (DNA-DNA) o 50ºC (DNA-RNA). En el caso presente las temperaturas estringentes especialmente adecuadas para la hibridación se encuentran comprendidas entre 50 y 65ºC, representando una temperatura de 65ºC una temperatura estringente especialmente adecuada.

1.

Etapa de lavado: 2 x SSC, 0,1% SDS 2 x 5 min a temperatura ambiente;

2.

Etapa de lavado: 1 x SSC, 0,1% SDS 2 x 15 min a 50ºC; preferentemente 0,5 x SSC, 0,1% SDS 2 x 15 min a 65ºC; de forma especialmente preferente 0,2 x SSC, 2 x 15 min a 68ºC.

El grado de identidad de los ácidos nucleicos se determina, preferentemente, con ayuda del programa NCBI BLASTN Version 2.0.4. (Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389).

La expresión "fungicida como substantivo" o bien "fungicida como adjetivo", tal como se emplea en este caso, se refiere a compuestos químicos que sean adecuados para la lucha contra aquellos hongos que ataquen a las plantas, a las partes de las plantas o a los productos vegetales y que los deterioren o que disminuyan su rendimiento o bien su valor. A las partes de las plantas citadas pertenecen, por ejemplo, las hojas, las semillas y los frutos (tal como por ejemplo bayas, frutos, granos de cereales). A los productos vegetales citados pertenecen las materias primas obtenidas a partir de las plantas o las substancias tales como por ejemplo las maderas o las fibras.

La expresión "promotor heterólogo", tal como se emplea en este caso, se refiere a un promotor, que presenta otras propiedades distintas a las de aquél promotor que controla en el organismo de origen la expresión del gen correspondiente.

La expresión "competidor", tal como se emplea en este caso, se refiere a la propiedad de los compuestos para competir con otros compuestos, en caso dado a ser identificados, en el enlace sobre la IMPDH y expulsarlos del enzima o bien que sean expulsados por el mismo.

La expresión "agonista", tal como se emplea en este caso, se refiere a una molécula que acelera o que refuerza la actividad de la IMPDH.

\newpage

La expresión "antagonista", tal como se emplea en este caso, se refiere a una molécula que ralentiza o que impide la actividad de la IMPDH.

La expresión "modulador", tal como se emplea en este caso, representa la denominación genérica para agonistas o bien antagonistas. Los moduladores pueden ser moléculas órgano-químicas pequeñas, péptidos o anticuerpos, que se enlazan sobre los polipéptidos según la invención o bien que influyen sobre su actividad. Además los moduladores pueden ser pequeñas moléculas órgano-químicas, péptidos o anticuerpos, que estén enlazados sobre una molécula, que esté enlazada, a su vez, sobre un polipéptido según la invención y de este modo influyen su actividad biológica. Los moduladores pueden representar substratos o ligandos naturales o simuladores estructurales o funcionales de los mismos. Preferentemente la expresión "modulador", tal como se emplea en este caso, se refiere, sin embargo, a aquellas moléculas que no representen substratos o bien ligandos naturales.

La expresión "inhibidor" o bien "inhibidor específico", tal como se emplea en este caso, designa una substancia que inhibe directa o indirectamente, al menos una actividad, en caso dado incluso varias actividades enzimáticas de las que han sido citadas anteriormente. Un inhibidor de este tipo es, preferentemente, específico, es decir que inhibe la actividad de la IMPDH a una concentración que es menor que la concentración de un inhibidor, necesario para provocar otro efecto, no relacionado con la misma. Preferentemente la concentración es dos veces menor, especialmente preferente cinco veces menor y, de una manera especialmente preferente, al menos diez veces o 20 veces menor que la concentración de un compuesto, necesaria para provocar un efecto inespecífico.

En el ámbito de la presente invención se identificó y se aisló la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la IMPDH a partir del hongo patógeno para las plantas U. maydis y se obtuvo el polipéptido codificado por el mismo. Además se ha desarrollado un procedimiento, que es adecuado para determinar la actividad de la IMPDH así como para identificar y evaluar inhibidores del enzima incluso en el procedimiento HTS y UHTS. En el ámbito de la presente invención se ha observado, además, que los inhibidores de la IMPDH de hongos patógenos para las plantas pueden emplearse como agentes para la protección de las plantas.

El tizón Ustilago maydis, que es un basidiomiceto, atacas a las plantas de maíz. La enfermedad se presenta en todas las plantaciones de maíz, sin embargo únicamente alcanza en los años de sequía un mayor significado. Los síntomas típicos son la hinchazón en forma de protuberancia, con el tamaño de un puño (protuberancias del tizón), que se forman en todas las partes aéreas de las plantas. Las protuberancias están recubiertas, en primer lugar, por una piel dura, blanco-grisácea. Cuando se desgarra la piel se libera una masa de esporas del tizón negra, inicialmente untosa, y más tarde pulverulenta. Otras especies del género ustílago son, por ejemplo, U. nuda (que provoca el carbón de la cebada y del trigo), U. nigra (que provoca el tizón negro de la cebada), U. hordei (que provoca el tizón duro de la cebada) y U. avenae (que provoca el carbón de la avena).

La IMPDH procedente de U. maydis (denominada a continuación como "Imp1") se extiende a lo largo de 1999 bp. El cDNA codificante tiene una longitud de 1659 bp. La Imp1 contiene por lo tanto un intrón con una longitud de 340 bp. El polipéptido, derivado del ORF del cDNA tiene una longitud de 553 aminoácidos. Esto corresponde a un peso molecular calculado de aproximadamente 60 kD para el monómero.

La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la Impl se ha divulgado en la presente solicitud como SEQ ID NO:1 (secuencia genómica) o bien SEQ ID NO: 3 (cDNA). Los polipéptidos codificados respectivamente por las mismas se han expuesto en la presente solicitud como SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4.

Así pues, se describe en la presente invención por primera vez una IMPDH de un hongo patógeno para las plantas, en este caso el Ustilago maydis. Además de la IMPDH procedente de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Candida albicans, C. neoformans y Pneumocystis carinii, que se han descrito precedentemente, no se han dado a conocer, hasta el presente, secuencias de otros hongos, que codifiquen una IMPDH. Especialmente no se conocía, hasta ahora, la secuencia de un basidiomiceto patógeno para las plantas que codificase una IMPDH.

Una comparación homóloga de la secuencia de U. maydis que codifica la IMPDH según SEQ ID NO: 1 o bien 3 con secuencias conocidas, que codifican la IMPDH, procedentes de otros hongos, de la secuencia humana así como de la secuencia procedente de A. thaliana, indica que la secuencia procedente de S. cerevisiae presenta la máxima homología con la secuencia procedente de U. maydis (tabla I). Esto es interesante especialmente debido a que el ácido micofenólico, precedentemente descrito, que es un inhibidor conocido de la IMPDH humana, que actúa todavía como fungistático en el caso de C. albicans, no presenta actividad en el caso de S. cerevisiae (Noto et al. (1969) "Biological properties of mycophenolic acid". J. Antibiot. (Tokyo), 22, 165). La tabla I enumera de manera comparativa la homología del DNA que codifica la IMPDH procedente de diversos organismos con relación al DNA que codifica la IMPDH procedente de U. Maydis.

TABLA I

Organismo	Homología en %
P. carinii	59
C. neoformans	55
C. albicans	59
S. cerevisiae (imh1)	60
S. cerevisiae(imh2)	63
S. cerevisiae( imh3)	64
H. sapiens	59
A. thaliana	43

En el ámbito de la presente invención se detectó, sorprendentemente, mediante análisis de Knockout en el basidiomiceto Ustilago maydis, que el enzima es importante para la supervivencia del organismo en este hongo patógeno para las plantas. De aquí puede deducirse que la IMPDH juega un papel especial para los hongos patógenos para las plantas o bien para los hongos en general. Resultados correspondientes no han podido ser demostrados hasta ahora en el caso de los hongos, tampoco en el caso de S. cerevisiae, lo que se debería, bajo ciertas circunstancias, a que están presentes en la levadura varios genes que codifican la IMPDH y por lo tanto no se había reconocido el papel de la IMPDH. Por lo tanto se reconoció la IMPDH por primera vez como diana óptima para la busca de nuevos fungicidas, específicos contra los hongos patógenos de las plantas. De este modo se da la posibilidad de identificar con ayuda de esta diana estructuras conductoras en caso dado completamente nuevas, que inhiban la IMPDH y que puedan ser empleadas como agentes para la protección de las plantas o bien como fungicidas.

En el ámbito de la presente invención se ha encontrado, además, que la IMPDH puede ser empleada para la identificación de substancias en procedimientos de ensayo adecuados, que influyan sobre la actividad del enzima, lo cual no se da de una manera evidente en diversas dianas teóricamente interesantes. Además de una IMPDH procedente de un hongo patógeno para las plantas, que se caracteriza por su secuencia de aminoácidos y por la secuencia de ácidos nucleicos que la codifican, se ponen a disposición también procedimientos de ensayo adecuados para la identificación de moduladores del enzima, que son adecuados también para el empleo en el procedimiento HTS.

En el ámbito de la presente invención se ha encontrado, que la IMPDH in vitro puede ser realmente inhibida por productos activos y que incluso puede dañar y destruir a un organismo fúngico tratado con este producto activo mediante el tratamiento con este producto activo. Los inhibidores de una IMPDH de hongos patógenos para las plantas pueden emplearse, por lo tanto, como fungicidas en la protección de las plantas. En la presente invención se demostrará, por ejemplo, que la inhibición de la IMPDH con substancias identificadas con un procedimiento de ensayo anteriormente citado, conduce a la muerte del hongo tratado en medios sintéticos o bien en las plantas.

Tal como se ha indicado ya precedentemente, no se conocía hasta ahora, a pesar de la intensa investigación con las IMPDHs y a pesar de los inhibidores de IMPDH, ya conocidos, que se emplean en la medicina humana, el que la IMPDH pudiese ser una proteína objetivo (una denominada "diana") en los hongos patógenos para las plantas de substancias con actividad fungicida. De este modo se demuestra por primera vez en la presente invención, que la IMPDH representa un enzima importante especialmente para los hongos patógenos de las plantas y que, por lo tanto, es adecuada de una manera especial para ser empleada como proteína objetivo para la busca de otros productos activos y con actividad fungicida mejorada.

Las IMPDHs comparten varios intervalos homólogos. Una de estas regiones se concentra en el centro catalítico, especialmente en una cisteína, que jugaría un papel en el enlace del IMP. Este centro es un motivo secuencial característico de la IMP-deshidrogenasa. Mediante una busca adecuada en el banco de datos PROSITE pudo identificarse un motivo de este tipo (Hofmann K., Bucher P., Falquet L., Bairoch A. (1999) "The PROSITE database, its status in 1999". Nucleic Acids Res. 27, 215). Éste puede representarse de la manera siguiente:

[LIVM]-[RK]-[LIVM]-G-[LIVM]-G-x-G-S-[LIVM]-C-x-T,

PROSITE posibilita la identificación de dominios funcionales de la IMP-deshidrogenasa y es adecuado para predecir la función de un producto genético.

En la representación del Motivo Prosite se utiliza el "código de una letra". El símbolo "x" significa una posición en la que se acepta cada aminoácido. Una posición variable, sobre la que se aceptan diversos aminoácidos, determinados, se representa con "[...]", contándose los aminoácidos posibles en esta posición. Los aminoácidos, que no son aceptados en una posición determinada, se encuentran, por el contrario, entre llaves "{...}". Un guión "-" separa los elementos o bien las posiciones individuales del motivo. Cuando se repita una posición determinada, por ejemplo "x", varias veces sucesivas, podrá representarse esto mediante la indicación del número de repeticiones entre paréntesis a continuación, por ejemplo "x (3)", significa "x-x-x".

Un Motivo Prosite representa, por lo tanto, en último lugar los componentes de una secuencia de consenso, así como las distancias entre los aminoácidos participantes y por lo tanto es típico para una determinada clase de enzima. Por medio de este motivo pueden identificarse o bien asociarse otros polipéptidos procedentes de hongos patógenos para las plantas, a base de los ácidos nucleicos según la invención, que pertenezcan a la misma clase que el polipéptido según la invención.

En el caso de la IMPDH procedente de U. maydis este motivo se presenta, igual que en el caso de S. cerevisiae, Homo sapiens o Arabidopsis thaliana (véase la figura 5), diferenciándose la secuencia de U. maydis de la de S. cerevisiae en una o bien o en dos posiciones. La secuencia de consenso específica para una IMP deshidrogenasa, según la invención, que puede ser utilizada para la identificación o bien para la asociación de otros polipéptidos según la invención, es por lo tanto especialmente preferente

-LRVGMGSGSICIT-.

El Motivo Prosite, anteriormente citado, o bien la secuencia de consenso específica son típicos de los polipéptidos según la invención, que pueden ser definidos estructuralmente por medio de estas secuencias de consenso y, por lo tanto, también pueden identificarse de manera inequívoca.

Por lo tanto se divulgan también polipéptidos de hongos patógenos para las plantas con la actividad biológica de una IMPDH, que abarcan el Motivo Prosite anteriormente citado [LIVM]-[RK]-[LIVM]-G-[LIVM]-G-x-G-S-[LIVM]-C-x-T, preferentemente aquellos polipéptidos que abarcan la secuencia de consenso anteriormente citada -LRVGMGSGSICIT-.

Como consecuencia de los resultados precedentes y de la homología, que se presenta en el caso de ácidos nucleicos específicos que codifican la IMPDH, pueden identificarse y emplearse también IMPDHs de otros hongos patógenos para las plantas, para resolver la tarea anteriormente planteada, es decir que pueden emplearse igualmente para la identificación de inhibidores de la IMPDH, que pueden emplearse, a su vez, como fungicidas para la protección de las plantas. Sin embargo puede imaginarse también el empleo de otro hongo, que no sea patógeno para las plantas, o bien su IMPDH o la secuencia que la codifica, para identificar inhibidores de la IMPDH con acción fungicida. En base a la secuencia, indicada en este caso, según SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o bien el iniciador indicado bajo las SEQ ID NO: 5 y 6 y, en caso dado, con ayuda de la secuencia de consenso mostrada precedentemente o bien del Motivo Prosite es posible que el técnico en la materia obtenga e identifique, por ejemplo mediante PCR, otros ácidos nucleicos, que codifiquen la IMP deshidrogenasa a partir de otros hongos patógenos para las plantas. Tales ácidos nucleicos y su empleo en procedimientos para la identificación de productos activos fungicidas son considerados como abarcados por la presente invención.

Por lo tanto, se divulgan ácidos nucleicos, que codifican polipéptidos completos a partir de hongos patógenos para las plantas con la actividad biológica de una IMPDH. Preferentemente, estos ácidos nucleicos presentan entre sí una identidad de al menos el 60%, al menos del 65%, al menos del 70%, al menos del 75%, al menos del 80%, al menos del 85%, al menos del 90%, al menos del 95% y especialmente al menos del 98% a través de una longitud de 60, 300, 600 o 1.200 pares de bases y, preferentemente, a través de toda la longitud de la secuencia codificante. Los ácidos nucleicos citados abarcan respectivamente, de manera preferente, el Motivo Prosite anteriormente citado o la secuencia de consenso anteriormente citada.

El objeto de la presente invención está constituido, especialmente, por ácidos nucleicos, que codifican IMPDHs a partir de basidiomicetos patógenos para las plantas, preferentemente del género Ustilago.

El objeto de la presente invención está constituido, de una manera muy especialmente preferente, por ácidos nucleicos que codifican IMPDH a partir de Ustilago maydis.

El objeto de la presente invención está constituido, de forma especialmente preferente, por ácidos nucleicos a partir de Ustilago maydis, que codifican un polipéptido según SEQ ID NO: 2 o bien SEQ ID NO: 4 o por fragmentos activos de las mismas. Especialmente constituyen un objeto de la presente invención los ácidos nucleicos según las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3.

Los ácidos nucleicos, según la invención, están constituidos especialmente por ácidos desoxirribonucléicos (DNA) o ácidos ribonucleicos (RNA) de una sola hebra o de doble hebra. Las formas de realización preferentes son fragmentos de DNA genómico, que pueden contener intrones, y cDNAs.

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Preferentemente, los ácidos nucleicos según la invención están constituidos por fragmentos de DNA, que corresponden al cDNA de los ácidos nucleicos según la invención.

De manera especialmente preferente los ácidos nucleicos según la invención abarcan una secuencia procedente de hongos patógenos para las plantas, que codifica un polipéptido con la actividad biológica de una IMPDH, elegida entre

a)

la secuencia según SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3

b)

secuencias, que codifican un polipéptido, que abarca la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

Los ácidos nucleicos según la invención pueden prepararse de manera usual. De manera ejemplificativa pueden sintetizarse las moléculas de los ácidos nucleicos de forma completamente química. También pueden sintetizarse químicamente segmentos cortos de los ácidos nucleicos según la invención tales como por ejemplo los oligonucleótidos según las SEQ ID NO: 5 y 6 y marcarse tales oligonucleótidos de manera radioactiva o con un colorante fluorescente. Estos oligonucleótidos marcados pueden emplearse también para analizar los bancos de cDNA preparados por mRNA por ejemplo a partir de hongos patógenos para las plantas. Se elegirán clones, sobre los cuales se hibridicen los oligonucleótidos marcados, para el aislamiento del fragmento correspondiente de DNA. Tras la caracterización del DNA aislado se obtienen, de manera sencilla, los ácidos nucleicos según la invención.

Los ácidos nucleicos según la invención pueden prepararse también mediante procedimientos PCR con empleo de oligonucleótidos sintetizados químicamente.

La expresión "oligonucleótido(s)", como se emplea en este caso, se refiere a moléculas de DNA, que están constituidas por 10 hasta 50 nucleótidos, preferentemente por 15 hasta 30 nucleótidos. Estas se sintetizan químicamente y pueden emplearse como sondas para ensayos de hibridación o como iniciador para PCR (Polymerase Chain Reaction - reacción en cadena de polimerasa).

Para la obtención de los polipéptidos según la invención, especialmente del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos según la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, pueden cultivarse además, bajo condiciones adecuadas, células huésped, que contengan al menos uno de los ácidos nucleicos según la invención. Los polipéptidos deseados pueden aislarse a continuación de manera usual a partir de las células o del medio de cultivo. Los polipéptidos pueden prepararse también en sistemas in vitro.

Para la obtención de la IMPDH, según la invención, a partir de Ustilago maydis puede expresarse el gen, por ejemplo recombinante en Escherichia coli y puede obtenerse una preparación enzimática a partir de células de E. coli.

De este modo se amplificó para la expresión del polipéptido Impl, que codifica impl, el ORF correspondiente a partir de mRNA de acuerdo con los métodos conocidos por el técnico en la materia a través de iniciadores específicos, que se han mostrado en el protocolo de secuencias como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. El cDNA correspondiente se clonó en el vector pET32a (Novagen, que posibilita la incorporación de un His-Tags (N- o C-terminal) o de un S-Tags). El plásmido resultante, p830, contiene la secuencia codificante completa de impl en una fusión N-terminal con tiorredoxina-Tag procedente del vector. La proteína de fusión Imp1 tiene una masa calculada de 78 kD (ejemplo 1 y figura 2).

El plásmido p830 se empleó entonces para la expresión recombinante de Impl en células de E. coli (ejemplo 1).

Los resultados, que se muestran en este caso por primera vez en el ámbito de la presente invención, son válidos igualmente para otros polipéptidos procedentes de hongos patógenos para las plantas con actividad biológica de una IMPDH. De este modo pueden obtenerse también homólogos de IMPDHs a partir de otras especies diferentes de las que se han indicado anteriormente y emplearse en el procedimiento según la invención.

De manera especialmente preferente, los polipéptidos homólogos están constituidos por aquellos que presentan con respecto a la IMPDH de Ustilago maydis una similitud de al menos el 60%, al menos del 65%, al menos del 70%, al menos del 75%, al menos del 80%, al menos del 85%, al menos del 90%, al menos del 95% y, especialmente, al menos del 98% a lo largo de al menos 20, preferentemente al menos de 25, especialmente al menos de 30 y de forma muy especialmente preferente al menos de 100 aminoácidos sucesivos y de forma especialmente preferente a lo largo de toda la longitud.

Tales polipéptidos homólogos a la IMPDH procedente de Ustilago maydis, especialmente con respecto al polipéptido según la SEQ ID NO: 2 o bien la SEQ ID NO: 4, que pueden ser empleados para la identificación de productos activos fungicidas, no deben representar IMPDHs fúngicas completas sino que pueden ser también únicamente un fragmento de las mismas, en tanto en cuanto presenten al menos todavía la actividad biológica de la IMPDH completa. Los polipéptidos que ejercen una actividad biológica similar a la de la IMPDH con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 son todavía considerados como que corresponden a la invención. Serán considerados todavía como que corresponden a la invención aquellos polipéptidos que correspondan a las IMPDHs por ejemplo de los siguientes hongos patógenos para las plantas, o a fragmentos de los mismos, que tienen todavía su actividad biológica:

Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes, por ejemplo

Tipos de Pythium tales como, por ejemplo, Pythium ultimum, tipos de Phytophthora, tales como, por ejemplo, Phytophthora infestans, tipos de Pseudoperonospora, tales como, por ejemplo, Pseudoperonospora humuli o Pseudoperonospora cubensis, tipos de Plasmopara, tales como, por ejemplo, Plasmopara viticola, tipos de Bremia, tales como, por ejemplo, Bremia lactucae, tipos de Peronospora, tales como, por ejemplo, Peronospora pisi o P. brassicae, tipos de Erysiphe, tales como, por ejemplo, Erysiphe graminis, tipos de Sphaerotheca, tales como, por ejemplo, Sphaerotheca fuliginea, tipos de Podosphaera, tales como, por ejemplo, Podosphaera leucotricha, tipos de Venturia, tales como, por ejemplo, Venturia inaequalis, tipos de Pyrenophora, tales como, por ejemplo, Pyrenophora teres o P. graminea (forma de conidios: Drechslera, sinónimo: Helminthosporium), tipos de Cochliobolus, tales como, por ejemplo, Cochliobolus sativus (forma de conidios: Drechslera, sinónimo: Helminthosporium), tipos de Uromyces, tales como, por ejemplo, Uromyces appendiculatus, tipos de Puccinia, tales como, por ejemplo, Puccinia recondita, tipos de Sclerotinia, tales como, por ejemplo, Sclerotinia sclerotiorum, tipos de Tilletia, tales como, por ejemplo, Tilletia caries; tipos de Ustilago, tales como, por ejemplo, Ustilago nuda o Ustilago avenae, tipos de Pellicularia, tales como, por ejemplo, Pellicularia sasakii, tipos de Pyricularia, tales como, por ejemplo, Pyricularia oryzae, tipos de Fusarium, tales como, por ejemplo, Fusarium culmorum, tipos de Botrytis, tipos de Septoria, tales como, por ejemplo, Septoria nodorum, tipos de Leptosphaeria, tales como, por ejemplo, Leptosphaeria nodorum, tipos de Cercospora, tales como, por ejemplo, Cercospora canescens, tipos de Alternaria, tales como, por ejemplo, Alternaria brassicae o tipos de Pseudocercosporella, tales como, por ejemplo, Pseudocercosporella herpotrichoides.

Tienen un interés especial por ejemplo también Magnaporthe grisea, Cochliobulus heterostrophus, Nectria hematococcus y tipos de Phytophtora.

Preferentemente los polipéptidos según la invención abarcan, por lo tanto, una secuencia de aminoácidos de hongos patógenos para las plantas con una secuencia según la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

La expresión "polipéptido", como se emplea en este caso, se refiere tanto a la cadena corta de aminoácidos, que se denomina usualmente como polipéptido, oligopéptido u oligómero, como también a las cadenas más largas de aminoácidos, que se denominan usualmente como proteínas. La expresión abarca cadenas de aminoácidos que pueden ser modificadas bien mediante procesos naturales, tal como procesamiento post- traduccional, o mediante procedimientos químicos, que constituyen el estado de la técnica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo en diversos puntos y varias veces en un polipéptido, tal como por ejemplo sobre la cadena principal del polipéptido, sobre las cadenas laterales de aminoácidos, sobre el extremo amino y/o sobre el extremo carboxi. Éstas abarcan, por ejemplo, acetalizaciones, acilaciones, ribocilaciones ADP, amidaciones, enlazados covalentes con flavinas, partes inhibidoras, nucleótidos o derivados de nucleótido, lípidos o derivados de lípidos o fosfatidilinositol, ciclaciones, formaciones de puentes de disulfuro, desmetilaciones, formaciones de cisteína, formilaciones, gama-carboxilaciones, glicosilaciones, hidroxilaciones, yodaciones, metilaciones, miristoilaciones, oxidaciones, procesamientos proteolíticos, fosforilaciones, selenoilaciones y adiciones realizadas a través de tRNA de aminoácidos.

Los polipéptidos pueden presentarse en forma de proteínas "puras" o como partes de proteínas mayores, por ejemplo en forma de proteínas de fusión. Además pueden presentar secuencias secretoras o secuencias "conductoras", pro-secuencias, secuencias que posibilitan una purificación sencilla, tales como varios restos de histidina, o aminoácidos estabilizados adicionales. Las proteínas según la invención pueden presentarse, igual que las que se presentan de manera natural en su organismo de origen, a partir del cual pueden obtenerse por ejemplo de manera directa.

Los polipéptidos pueden presentar, en comparación con las regiones correspondientes de las IMPDHs de origen natural, deleciones o substituciones de aminoácidos, en tanto en cuanto presenten al menos todavía la actividad biológica de una IMPDH completa. Son preferentes las substituciones conservadoras. Tales substituciones conservadoras abarcan variaciones, en las que se reemplaza un aminoácido por otro aminoácido del grupo siguiente:

1.

restos pequeños alifáticos, no polares o poco polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly;

2.

restos polares, cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu y Gln;

3.

restos polares, cargados positivamente: His, Arg y Lys;

4.

restos grandes alifáticos, no polares: Met, Leu, Ile, Val y Cys; y

5.

restos aromáticos: Phe, Tyr y Trp.

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La lista siguiente muestra las substituciones conservadoras preferentes:

Resto original	Substitución
Ala	Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala, Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Tyr, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Un procedimiento, posible, para la purificación de la IMPDH, está basado en la electrofórisis preparativa, FPLC, HPLC (por ejemplo con empleo de columnas con filtración a través de gel, columnas con fase inversa o columnas ligeramente hidrófobas), filtración a través de gel, precipitación diferencial, cromatografía con intercambio iónico o cromatografía de afinidad.

Un procedimiento rápido para el aislamiento de los polipéptidos según la invención, que se sintetizan por células huésped con empleo de un ácido nucleico a ser empleado según la invención, comienza con la expresión de una proteína de fusión, pudiéndose purificar por afinidad, de manera sencilla, el participante en la fusión. El participante en la fusión puede ser, por ejemplo, un 6xHis-Tag. La proteína de fusión puede purificarse a continuación sobre una columna de afinidad níquel-NTA. El participante en la fusión puede separarse mediante disociación proteolítica parcial por ejemplo en ADN enlazantes entre el participante en la fusión y el polipéptido según la invención, a ser purificada. El ADN enlazante puede configurarse de tal manera que abarque aminoácidos diana, tales como restos arginina y lisina, que definen puntos para una disociación por la tripsina. Para generar tales ADN enlazantes, pueden emplearse los procedimientos de clonación normalizados con aplicación de oligonucleótidos.

Otros procedimientos de purificación posibles están basados, a su vez, en la electrofórisis preparativa, FPLC, HPLC (por ejemplo con empleo de columnas de filtración a través de gel, de fase inversa o columnas ligeramente hidrófobas), filtración a través de gel, precipitación diferencial, cromatografía con intercambio iónico y cromatografía de
afinidad.

La expresión "aislamiento o purificación", tal como se emplea en este caso, significa que los polipéptidos según la invención son separados de otras proteínas o de otras macromoléculas de la célula o del tejido. Preferentemente, una preparación que contiene los polipéptidos según la invención, está enriquecida al menos 10 veces y de forma especialmente preferente al menos 100 veces con respecto al contenido en proteína frente a una preparación procedente de la célula huésped.

Los polipéptidos según la invención pueden ser purificados por afinidad incluso sin participante en la fusión con ayuda de anticuerpos, que se enlacen sobre los polipéptidos.

El objeto de la presente invención está constituido, por lo tanto, también por un procedimiento para la obtención del polipéptido Impl con la secuencia SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 o polipéptidos homólogos de las mismas procedentes de hongos patógenos para las plantas con la actividad de una IMPDH, que se caracteriza porque

(a)

se cultiva una célula huésped que contiene al menos una secuencia de ácidos nucleicos expresable que codifica un polipéptido de hongos patógenos para las plantas con una actividad biológica de un IMPDH bajo condiciones, que garanticen la expresión de este ácido nucleico, o

(b)

se expresa una secuencia de ácidos nucleicos expresable que codifica un polipéptido de hongos patógenos para las plantas con la actividad biológica de una IMPDH en un sistema in vitro y

(c)

se obtiene el polipéptido a partir de la célula, del medio de cultivo o del sistema in vitro.

El objeto de la presente invención está constituido especialmente por un procedimiento para la obtención del polipéptido Impl con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 o polipéptidos homólogos con las mismas con la actividad de una IMPDH procedente de hongos patógenos para las plantas, en el que

(a)

se transforma una secuencia de aminoácidos, expresable, que codifica un polipéptido procedente de hongos patógenos para las plantas, con una actividad biológica de una IMPDH, en células huésped, adecuadas,

(b)

las células, transformadas, se incuban a una temperatura adecuada, añadiéndose al medio un 0,2% de glucosa,

(c)

se inducen las células durante un período de tiempo adecuado para un crecimiento suficiente de las células,

(d)

las células se recolectan al cabo de un período de tiempo adecuado para la expresión suficiente de los ácidos nucleicos citados en (a) y, en caso dado

(e)

se aísla y se purifica el polipéptido a partir de las células recolectadas.

Las células, obtenidas de este modo, contienen el polipéptido según la invención o el polipéptido purificado, obtenido de este modo, se purifican, para ser empleadas en procedimientos para la identificación de moduladores o bien de inhibidores de la IMPDH.

Así pues, el objeto de la presente invención está constituido, también, por el empleo de los polipéptidos procedentes de hongos patógenos para las plantas, que ejercen al menos una actividad biológica de una IMPDH y que comprenden una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias según SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, en procedimientos para la identificación de inhibidores de un polipéptido procedentes de hongos patógenos para las plantas con la actividad de una IMPDH, pudiéndose emplear los inhibidores de la IMPDH como fungicidas.

Es especialmente preferente el empleo de los polipéptidos procedentes de basidiomicetos patógenos para las plantas, especialmente del género Ustilago, especialmente de Ustilago maydis, siendo especialmente preferente el polipéptido según la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, un procedimiento para la identificación de inhibidores de un polipéptido procedente de hongos patógenos para las plantas con actividad de una IMPDH, pudiéndose emplear los inhibidores de la IMPDH como fungicidas.

Los fungicidas, los productos activos, que se encuentran con ayuda de una de las IMPDHs según la invención, pueden actuar por lo tanto también con IMPDHs procedentes de otras especies de hongo patógenos para las plantas, sin que la interacción con las IMPDHs diferentes, procedentes de estos hongos, tenga que ser siempre de la misma intensidad. Esto explica entre otras cosas la selectividad observada de las substancias activas.

Tal como ya se ha indicado precedentemente, el empleo de los ácidos nucleicos o bien de los polipéptidos según la invención posibilita, en un procedimiento adecuado, el encuentro de compuestos que se enlacen con los polipéptidos según la invención y/o que inhiban al compuesto. Éstos pueden emplearse entonces como fungicidas en las plantas.

El objeto de la presente invención es, por lo tanto, también un procedimiento que es adecuado para la identificación de productos activos fungicidas, que se enlazan sobre los polipéptidos según la invención y/o que modulan, es decir que activan o que inhiben, su actividad biológica.

Los procedimientos, que son adecuados para identificar moduladores, es decir activadores o inhibidores o bien agonistas o antagonistas de los polipéptidos según la invención, están basados, por regla general, en la determinación de la actividad o bien de la funcionalidad biológica del polipéptido. Para ello entran en consideración, en principio, tanto procedimientos basados en células completas (procedimientos in vivo), como también procedimientos que están basados en el empleo del polipéptido aislado de las células, que puede presentarse en forma purificada o parcialmente purificada o incluso como extracto en bruto. Estos procedimientos in vitro, exentos de células, pueden utilizarse, del mismo modo que los procedimientos in vivo, a escala de laboratorio, sin embargo de manera preferente también en los procedimientos HTS o UHTS.

Muchos sistemas de ensayo, que tienen como finalidad el ensayo de compuestos y de extractos naturales están dirigidos preferentemente a elevados índices de caudal para maximizar el número de las substancias ensayadas durante un período de tiempo dado. Los sistemas de ensayo, que están basados en trabajos exentos de células, necesitan proteína purificada o semipurificada. Éstos son adecuados para un ensayo "previo", que tiene como objetivo, en primer lugar, detectar un posible efecto de una substancia sobre la proteína diana. Cuando un ensayo de este tipo tenga éxito y se hayan encontrado uno o varios compuestos, extractos, etc., podrá ensayarse específicamente la actividad de tales compuestos además en el laboratorio. De este modo puede verificarse de nuevo, en una primera etapa, la inhibición o la activación del polipéptido según la invención in vitro para ensayar a continuación la actividad del compuesto sobre el organismo diana, en este caso uno o varios hongos patógenos para las plantas. El compuesto puede emplearse entonces, en caso dado, como producto de partida para la busca ulterior y el desarrollo de compuestos fungicidas, que estén basados en la estructura original, sin embargo optimizados por ejemplo en lo que se refiere a la actividad, a la toxicidad o a la selectividad.

Para encontrar moduladores puede incubarse, por ejemplo, una mezcla de reacción sintética (por ejemplo productos de la transcripción in vitro) o un componente celular, tal como una membrana, un compartimento o cualquier otra preparación, que contenga los polipéptidos según la invención, junto con un substrato o ligando, en caso dado marcado, de los polipéptidos en presencia y en ausencia de una molécula candidata, que puede ser un agonista o un antagonista. La capacidad de la molécula candidata para aumentar o inhibir la actividad de los polipéptidos según la invención puede reconocerse, por ejemplo, por medio de un enlace acrecentado o disminuido del ligando, en caso dado marcado, o en una conversión acrecentada o disminuida del substrato, en caso dado marcado. Las moléculas que conducen a una mayor actividad de los polipéptidos según la invención son agonistas. Las moléculas que inhiben la actividad biológica de los polipéptidos según la invención, son buenos antagonistas.

La detección de la actividad biológica de los polipéptidos según la invención puede mejorarse por medio de un sistema denominado mensajero. Los sistemas mensajeros abarcan, a este respecto, substratos detectables por colorimetría o por fluorimetría, pero no están limitados a los mismos, que se transforman en un producto o un gen mensajero que reacciona a la variación de la actividad o de la expresión de los polipéptidos según la invención u otros ensayos de enlace, conocidos.

Otro ejemplo de un procedimiento, con el cual pueden encontrarse moduladores de los péptidos según la invención, consiste en un ensayo de expulsión, en el cual se combinan, bajo condiciones adecuadas para ello, los polipéptidos según la invención y un modulador potencial con una molécula, que se enlace, de manera conocida, sobre los polipéptidos según la invención, tal como un substrato o ligando natural o un simulador de substrato o de ligando. Los propios polipéptidos, según la invención, pueden ser marcados, por ejemplo mediante fluorimetría o colorimetría, de tal manera que pueda determinarse exactamente el número de polipéptidos que se han enlazado con un ligando o que han intervenido en una conversión. Del mismo modo puede seguirse sin embargo el enlace por medio del substrato, del ligando o bien del análogo del substrato, marcados en caso dado. De este modo puede medirse la efectividad de un agonista o de un antagonista.

Por regla general se ignoran los efectos de la toxicidad celular en estos sistemas in vitro. Los sistemas en ensayo verifican en este caso tanto el efecto inhibidor o bien el efecto supresor de las substancias, como también el efecto estimulante. La eficacia de una substancia puede verificarse mediante series de ensayos en función de la concentración. Las cargas de control sin substancia de ensayo o bien sin enzima pueden emplearse para la evaluación de los efectos.

Mediante las células huésped, disponibles por medio de la presente invención, que contienen ácidos nucleicos que codifican una IMPDH según la invención, se posibilita el desarrollo de sistemas de ensayo, que están basados en células, para la identificación de substancias, que modulan la actividad de los polipéptidos según la invención.

Otra posibilidad para la identificación de substancias, que modulan la actividad de los polipéptidos es también el denominado "Scintillation Proximity Assay" (SPA), véase la publicación EP 015 473. Este sistema de ensayo utiliza la interacción de un polipéptido (por ejemplo la IMPDH de U. Maydis) con un ligando o bien substrato marcados de manera radioactiva. El polipéptido está unido en este caso sobre pequeñas bolitas ("microesfera") o perlas ("Beads"), que están dotadas con moléculas escintilantes. En el transcurso de la caída de la radioactividad se excita la substancia escintilizante en la bolita por medio de partículas subatómicas del marcador radioactivo y emite un fotón detectable. Las condiciones del ensayo se optimizan de tal manera que únicamente conduzcan a una señal aquellas partículas que parten de ligandos que parten de los ligandos enlazados sobre un polipéptido según la invención.

Preferentemente los moduladores a ser identificados están constituidos por pequeños compuestos órgano-químicos.

Un procedimiento para la identificación de un compuesto, que module la actividad de una IMPDH procedente de hongos patógenos para las plantas y que pueda ser empleado como fungicida en la protección de las plantas, consiste, por lo tanto, en

a)

poner en contacto un polipéptido según la invención o una célula huésped que contenga este polipéptido, con un compuesto químico o con una mezcla de compuestos químicos bajo condiciones que permitan la interacción de un compuesto químico con el polipéptido,

b)

comparar la actividad del polipéptido según la invención, en ausencia de un compuesto químico, con la actividad del polipéptido según la invención en presencia de un compuesto químico o de una mezcla de compuestos químicos, y

c)

determinar el compuesto químico que modula específicamente la actividad del polipéptido según la invención.

En este caso se determinará de forma especialmente preferente aquél compuesto que inhiba específicamente la actividad del polipéptido según la invención. La expresión "actividad", tal como se aplica en este caso, se refiere a la actividad biológica del polipéptido según la invención.

La actividad o bien el aumento o la disminución de la actividad del polipéptido según la invención se determina preferentemente por medio de la conversión del substrato NAD^{+} para dar la NADH. En este caso se sigue la actividad disminuida o bien inhibida del polipéptido según la invención por medio de la determinación por fotoespectrometría de la disminución del NAD^{+} o bien del aumento del NADH. Debido a la absorción de la luz del anillo de nicotinamida, el coenzima nicotinamida NADH, reducido, tiene concretamente un máximo de absorción a 340 nm. La forma oxidada del NAD^{+} no presenta, por el contrario, absorción entre 300 y 400 nm. La reacción enzimática según la invención, que conduce a una reducción del NAD^{+} puede seguirse, por lo tanto, por medio del aumento de la absorción, por ejemplo a 340 nm. El efecto de un inhibidor sobre la reacción puede determinarse también de este modo.

Otra posibilidad para la determinación de la actividad o bien de la disminución o del aumento de la actividad por medio de la conversión del substrato NAD^{+} para dar la NADH consiste en la detección del NADHs formado en un ensayo de luciferaza acoplado. En este caso se lleva a cabo una copulación de la reacción con la NADH-FMN óxidoreductasa según el esquema siguiente:

FMNH_{2} + RCHO + O_{2} -> FMN + RCOOH + H_{2}O + hv,

donde R = alquilo (Baldwin et al. (1975): Bacterial Luciferase. Binding of Oxidized Flavin Mononucleotide. J. Biol. Chem., 250, 2763). En este caso la NADH es el electro donador primario. Los electrones se conducen a través del FMN hasta la luciferaza, produciéndose la emisión de luz. La NADH, que se forma en la reacción subsiguiente, puede detectarse perfectamente en un intervalo desde 1 hasta 25 \muM. El rendimiento luminoso de la luciferaza depende claramente el pH, siendo especialmente adecuado un intervalo desde pH 7 hasta pH 8,5.

La actividad o bien la disminución o el aumento de la actividad puede determinarse preferentemente por medio de la conversión del substrato NAD^{+} para dar la NADH, determinándose la actividad disminuida o inhibida del polipéptido según la invención por medio de un ligero aumento de la fluorescencia, que parte de la NADH (véase también la figura 1) que se forma en menor cuantía. La NADH produce una fluorescencia más potente que el NAD^{+}.

Para ello se incuba el polipéptido según la invención en una concentración adecuada, que se encuentra comprendida preferentemente entre 0,1 y 20 ng/\mul, preferentemente entre 0,13 y 10 ng/\mul del enzima con el NAD^{+} en una concentración desde 5 hasta 400 \muM, preferentemente desde 10 hasta 100 \muM, y con IMP en una concentración desde 5 hasta 400 \muM, preferentemente desde 50 hasta 300 \muM, a temperatura adecuada. La concentración del IMP es preferentemente, en cada caso, dos veces mayor que la del substrato NAD^{+}. Debe observarse que para ambos substratos, NAD^{+} e IMP, puede observarse una inhibición del substrato, debiéndose verificar por lo tanto a continuación la concentración empleada de ambos substratos. En este caso la temperatura puede encontrarse en el intervalo desde 8 hasta 37ºC. La medida se lleva a cabo preferentemente a 10 hasta 30ºC, siendo especialmente adecuada también la temperatura ambiente. La reacción se lleva a cabo en un tampón usual ("tampón para ensayos"), que puede contener preferentemente, por ejemplo desde 20 hasta 200 mM de KCl, desde 1 hasta 5 mM de DTE o de DTT, desde 0,01 hasta 1% de BSA, desde 0,01 hasta 0,1% de Tween 20 y desde 2 hasta 10% de glicerina y, por ejemplo, puede ajustarse con 25 hasta 100 mM de tampón Tris hasta un valor del pH de 8 (véase el ejemplo 2). No obstante pueden imaginarse también otras composiciones de tampón, en las cuales tenga todavía el polipéptido según la invención su actividad biológica y puedan llevarse a cabo las reacciones catalizadas por los mismos.

La formación de NADH en el transcurso de la reacción se sigue entonces por medio de la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 360 nm y con una longitud de onda de emisión de 465 nm. El aumento de la fluorescencia en el caso de la presencia de un compuesto químico puede compararse entonces con el aumento de la fluorescencia en ausencia de un compuesto químico. La comparación muestra entonces si en presencia de un compuesto químico, el aumento de fluorescencia es mayor o, en caso dado, mayor que en ausencia del compuesto químico, es decir si el compuesto citado tiene un efecto activador o inhibidor sobre el polipéptido ensayado. El período de tiempo durante el cual se mide el aumento de fluorescencia puede variar en este caso. Puede observarse un aumento lento de la fluorescencia en el transcurso de varias horas, hasta que, finalmente, al cabo de 5 hasta 10 horas se alcance una meseta (véase también la figura 3). A continuación disminuye la fluorescencia, por regla general. Esta velocidad de conversión lenta es conocida, sin embargo, por la literatura y parece ser característica de la IMP deshidrogenasa. En este caso es importante sin embargo elegir el tampón, en el cual se almacena el enzima o bien se lleva a cabo la reacción, de tal manera que se estabilice del mejor modo posible el polipéptido según la invención. Un tampón de este tipo debería contener, por ejemplo KCI, BSA, DTT o DTE y glicerina en una concentración adecuada. El valor del pH se ajustará preferentemente a pH 8. Preferentemente se emplearán desde 10-200 mM de KCI, desde 10-200 mM de Tris, desde 0,02-0,2% de BSA y desde 0,1-5 mM de DTE o de DTT así como desde 12-25% de glicerina.

La medida puede llevarse a cabo también en formatos usuales para los ensayos HTS o UHTS, por ejemplo en plaquetas para microvaloración por volumetría, en las cuales se disponga, por ejemplo, un volumen total de 5 hasta 50 \mul por carga o bien por pocillo y los componentes individuales estén presentes en las concentraciones finales precedentemente indicadas. En este caso se dispondrá el compuesto a ser ensayado, que inhibe o que activa potencialmente la actividad del enzima (molécula candidata) por ejemplo en una concentración adecuada en el tampón para ensayos, anteriormente indicado, que contiene IMP. A continuación se añade el polipéptido según la invención en el tampón para ensayos anteriormente indicado, que contiene el segundo substrato NAD^{+}, y la reacción se inicia de este modo. La carga se incuba a continuación por ejemplo durante 2 o 3 horas a temperatura adecuada y se mide el aumento de la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 360 nm y con una longitud de onda de emisión de 460 nm.

Otra medida se lleva a cabo en una carga correspondiente, sin embargo sin adición de una molécula candidata y sin adición de un polipéptido según la invención (controles negativos). Otra medida se lleva a cabo también en ausencia de una molécula candidata, pero en presencia del polipéptido según la invención (controles positivos). Los controles negativos y positivos proporcionan por lo tanto los valores comparativos de las cargas en las que está presente una molécula candidata.

Para determinar las condiciones óptimas de un procedimiento para la identificación de inhibidores de la IMPDH o bien para la determinación de la actividad de los polipéptidos según la invención, puede ser ventajoso determinar el valor correspondiente K_{M} del polipéptido empleado, según la invención. Este proporciona una indicación sobre la concentración a ser empleada preferentemente del o bien de los substratos. En el caso de la IMPDH procedente de U. maydis pudo determinarse un K_{M} de 25 \muM (véase la figura 4).

Con ayuda del procedimiento descrito precedentemente, de manera ejemplificativa, pudieron identificarse compuestos que inhiben la IMP deshidrogenasa según la invención, especialmente la IMPDH procedente de U. maydis según la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 (véanse los ejemplos 1 y 3).

En la tabla II se muestran compuestos ejemplificativos que pudieron ser identificados como inhibidores de la IMPDH con el procedimiento según la invención.

El valor pI50, allí indicado es el logaritmo decimal negativo del valor denominado IC50, que indica la concentración molar de una substancia que conduce al 50% de la inhibición del enzima.

Un valor pI50 de 8 corresponde, por ejemplo, a una inhibición semimáxima del enzima a una concentración de 10 nM.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA II

1

En el ámbito de la presente invención pudo demostrarse, además, que los inhibidores, identificados con ayuda de un procedimiento según la invención, de una IMPDH según la invención, son adecuados para dañar o para destruir los hongos patógenos para las plantas.

Para ello se depositó por medio de una pipeta, por ejemplo en las cavidades de placas para la microvaloración por volumetría, una solución del producto activo a ser ensayado. Una vez que se había eliminado el disolvente por evaporación, se añadió medio a cada cavidad. El medio se combinó previamente con una concentración adecuada de esporas o bien de micelio del hongo a ser ensayado.

Las concentraciones resultantes del producto activo eran, por ejemplo, de 0,1, de 1, de 10 y de 100 ppm.

Las placas se incubaron a continuación en un dispositivo suministrador de sacudidas, a una temperatura de 22ºC, hasta que se detectó un crecimiento suficiente en los controles no tratados.

La evaluación se llevó a cabo por fotometría a una longitud de onda de 620 nm. A partir de los datos medidos de las diversas concentraciones se calculó la dosis de producto activo que conduce a una inhibición del 50% del crecimiento del hongo frente a los controles no tratados (ED_{50}).

El objeto de la presente invención está constituido, por lo tanto, también por moduladores de los polipéptidos según la invención, especialmente de los compuestos o extractos adecuados para la modulación de la IMPDH procedente de U. maydis según la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, que se han encontrado con ayuda de uno de los procedimientos, indicados en la presente solicitud, para la identificación de moduladores de la IMPDH.

Además, la presente invención abarca procedimientos para encontrar compuestos químicos, que modifiquen la expresión de los polipéptidos según la invención. También tales "moduladores de la expresión" pueden representar nuevos productos activos fungicidas, los moduladores de la expresión pueden ser pequeñas moléculas órgano-químicas, péptidos o anticuerpos, que se enlacen sobre las regiones reguladoras de los ácidos nucleicos que codifican los péptidos según la invención. Además, los modulares de la expresión pueden ser moléculas pequeñas órgano-químicas, péptidos o anticuerpos, que se enlazan sobre una molécula, que se enlaza, a su vez, sobres las regiones reguladoras de los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos según la invención, y de este modo influyen sobre su expresión. Los moduladores de la expresión pueden ser también moléculas antisentido.

La presente invención se refiere, igualmente, al empleo de moduladores de los polipéptidos según la invención o bien a su expresión como fungicidas (véase el ejemplo 3).

El objeto de la presente invención está constituido, igualmente, por moduladores de la expresión de las inosina-monofosfato deshidrogenasas que se han encontrado con ayuda de los procedimientos descritos precedentemente para encontrar los reguladores de la expresión.

El objeto de la invención está constituido, además, por anticuerpos que se enlazan específicamente sobre los polipéptidos según la invención o sobre fragmentos de los mismos. La obtención de tales anticuerpos se lleva a cabo de manera usual. De manera ejemplificativa pueden producirse tales anticuerpos mediante la inyección de un huésped substancialmente inmunocompetente con una cantidad eficaz para la producción de anticuerpos de un polipéptido según la invención o de un fragmento del mismo y mediante obtención subsiguiente de este anticuerpo. Además puede obtenerse una línea celular inmortalizada, en forma en sí conocida, que produzca anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos pueden marcarse, en caso dado, con un reactivo detectable. Los ejemplos preferentes de tales reactivos detectables son enzimas, elementos marcados de manera radioactiva, productos químicos fluorescentes o biotina. En lugar del anticuerpo completo pueden emplearse también fragmentos que muestren las propiedades de enlace específicas, deseadas.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación, expresión y purificación de impl o bien IMP1 a partir de Ustilago maydis

Para la clonación de impl o bien de su expresión se amplificó el ORF procedente de mRNA de U. maydis mediante iniciadores específicos según la SEQ ID NO: 5 y 6. El correspondiente cDNA, que es un amplicón con una longitud de 1675 bp, se clonó de manera intermedia en el vector pCRTOP2.1 de gen in vitro y, a continuación, se clonó por medio de los puntos de corte EcoRV y NotI introducidos por medio del iniciador, en el vector pET32a (Novagen) troceado con EcoRV y con NotI. El plásmido correspondiente p830 contiene la secuencia codificante completa de impl en una fusión N-terminal con la tiorredoxina-Tag, que es parte integrante del vector. La proteína de fusión Impl tiene una masa calculada de 78 kD.

Para la expresión heteróloga se transformó el plásmido p830 en BL21::DE3 de tal manera que la carga de la transformación sirvió directamente como cultivo previo en 50 ml de medio de selección. Estas células se incubaron durante la noche a 37ºC y, a continuación, se diluyeron a 1:100 en medio de selección (medio LB con 100 \mug/ml de ampicilina). Para reprimir la actividad basal del promotor T7, se añadió al medio un 0,2% de glucosa. La temperatura de la célula se redujo a 16ºC con una OD_{600nm} de 0,8 - 1,0 y se indujo al cabo de 10 minutos con 1 mM de IPTG (concentración final). Las células se recolectaron al cabo de 1,5 horas. Los pellets celulares pudieron ser almacenados sin pérdida de actividad durante varios meses a -80ºC. El fraccionamiento se llevó a cabo mediante tratamiento con ultrasonidos en tampón de lisina (200 mM de KCl, 10 mM de imidazol, 50 mM de tris-HCl, pH 8, 15% de glicerina). La purificación se llevó a cabo según el protocolo normalizado del fabricante para columnas Ni-NTA (véase también la figura 2). A continuación se sometió a un cambio de tampón a la proteína purificada en el tampón de almacenamiento (200 mM de KCl, 50 mM de tris-HCl, pH 8, 0,1% de BSA, 1 mM de DTE, 17% de glicerina). A partir de un litro de medio de cultivo pudieron aislarse de este modo aproximadamente 4 mg de proteína soluble que pudo emplearse en procedimientos para la identificación de moduladores de la IMPDH.

Ejemplo 2 (A) Identificación de moduladores de la IMP deshidrogenasa en MTP con 384 pocillos

Para la identificación de los moduladores de la IMPDH a partir de U. mydis (IMP1) se emplearon plaquetas de microvaloración por volumetría con 384 pocillos.

En la primera columna se añadió, por medio de una pipeta, el control negativo. Éste estaba constituido por 5 \mul de tampón para ensayos (100 mM de KCl, 50 mM de tris/HCl, pH 8, 2 mM de DTE, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween 20, 5% de glicerina) con 5% de DMSO, 20 \mul de tampón para ensayos con 200 \muM del IMP y 25 \mul de tampón para ensayos con 100 \muM del NAD^{+}.

En el segundo columna se añadió, por medio de una pipeta, el control positivo. Éste estaba constituido por 5 \mul de tampón para ensayos con 5% de DMSO, 20 \mul de tampón para ensayos con 200 \muM del IMP así como 2 ng/\mul de IMPDH y 25 \mul de tampón para ensayos con 100 \muM del NAD^{+}.

En las columnas remanentes se dispuso una substancia de ensayo a una concentración de 2 \muM en DMSO, empleándose para la dilución de la substancia hasta un volumen de 5 \mul el tampón para ensayos que contiene 200 \muM de IMP. Tras adición de 20 \mul de tampón para ensayos que contienen 200 \muM del IMP y 2 ng/\mul de IMPDH se añadieron, para el inicio de la reacción, 25 \mul de tampón para ensayos, que contienen 100 mM del NAD^{+}. A continuación se llevó a cabo la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas.

La medida de la NADH, formada durante la reacción, se llevó a cabo mediante la determinación de la fluorescencia absoluta en un espectrómetro de fluorescencia Tecan Ultra, adecuado para MTP.

(B) Identificación de los moduladores de la IMP deshidrogenasa en MTP con 1536 pocillos

El procedimiento se llevó a cabo como se ha descrito precedentemente, siendo el volumen total de las cargas únicamente de 8 \mul. Los componentes individuales se adaptaron de manera correspondiente.

Ejemplo 3 Demostración de la acción fungicida de los inhibidores identificados de la IMPDH

Se añadió por medio de una pipeta, en las cavidades de las placas de microvaloración por volumetría una solución metanólica del producto activo identificado por medio del procedimiento según la invención, combinado con un emulsionante. Una vez que el disolvente se había eliminado por evaporación, se añadieron a cada cavidad 200 \mul de Potatoe-Dextrose-Medium. El medio se combinó previamente con concentraciones adecuadas de esporas o bien de micelios del hongo a ser ensayado (véase la tabla III).

Las concentraciones resultantes del producto activo fueron de 0,1, de 1, de 10 y de 100 ppm. La concentración resultante del emulsionante fue de 300 ppm.

Las placas se incubaron, a continuación se dispusieron en un dispositivo suministrador de sacudidas, a una temperatura de 22ºC hasta que se detectó un crecimiento suficiente en los controles no tratados. La evaluación se llevó a cabo por fotometría con una longitud de onda de 620 nm. A partir de los datos medidos de las diversas concentraciones se calcula la dosis del producto activo que conduce a una inhibición del 50% del crecimiento del hongo frente a los controles no tratados (ED_{50}). El compuesto 3 de la tabla II muestra ya una actividad correspondiente con las cantidades de aplicación indicadas en la tabla III.

TABLA III

Organismo	ED_{50} [ppm]
Bortytis cinerea	27,7
Giberella zeae	60,3
Phytophtora cryptogea	55,1
Septoria tritici	43,4

<110> Bayer AG

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<120> Polipéptido para la indentificación de compuestos con actividad fungicida

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<130> Le A 35 733

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<160> 6

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 3063

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<212> DNA

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<213> Ustilago maydis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (582)...(1071)

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<223>

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1412)...(2580)

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<223>

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<400> 1

2

3

4

5

6

7

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<210> 2

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<211> 553

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<212> PRT

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<213> Ustilago maydis

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<400> 2

8

9

10

11

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<210> 3

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<211> 1662

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<212> DNA

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<213> Ustilago maydis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (2)..(1659)

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<400> 3

12

13

14

15

16

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<210> 4

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<211> 553

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<212> PRT

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<213> Ustilago maydis

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<400> 4

17

18

19

20

21

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<210> 5

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> secuencia artificial

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

agatatccct gctagcaacg gtattc

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> secuencia artificial

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcagacaag agaagcatcc gccggcaga

\hfill

28

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Claims (19)

1. Procedimiento para la identificación de fungicidas, caracterizado porque

(a)

se pone en contacto una IMP deshidrogenasa de hongos patógenos para las plantas, con un compuesto químico o con una mezcla de compuestos químicos,

(b)

se compara la actividad biológica de la IMP deshidrogenasa en presencia del compuesto químico o de la mezcla de compuestos químicos con la actividad biológica de la IMP deshidrogenasa en ausencia del compuesto químico o de la mezcla de los compuestos químicos, y

(c)

se determina el compuesto químico que inhibe de manera específica la actividad biológica de la IMP deshidrogenasa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se verifica la actividad fungicida del compuesto determinado en la etapa (c), poniéndose en contacto éste con uno o varios hongos.

3. Empleo de una IMP-deshidrogenasa de hongos patógenos para las plantas para encontrar compuestos fungicidas.

4. Procedimiento para la lucha contra los hongos patógenos para las plantas, caracterizado porque

(a)

se pone en contacto una IMP deshidrogenasa de hongos patógenos para las plantas con un compuesto químico o con una mezcla de compuestos químicos,

(b)

se compara la actividad biológica de la IMP deshidrogenasa en presencia del compuesto químico o de la mezcla de los compuestos químicos con la actividad biológica de la IMP deshidrogenasa en ausencia del compuesto químico o de la mezcla de los compuestos químicos,

(c)

se determina el compuesto químico que inhibe específicamente la actividad biológica de la IMP deshidrogenasa, y

(d)

se pone en contacto el compuesto químico con el hongo patógeno para las plantas.

5. Procedimiento para la lucha contra los hongos patógenos para las plantas, caracterizado porque se tratan los hongos con un inhibidor de una IMPDH fúngica.

6. Empleo de un inhibidor de una IMP deshidrogenasa de hongos patógenos para las plantas para la lucha contra los hongos patógenos para las plantas.

7. Ácidos nucleicos, que codifican una IMP deshidrogenasa de hongos patógenos para las plantas, que comprenden una secuencia elegida entre

a)

la secuencia según SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y

b)

secuencias, que codifican un polipéptido, que comprende la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

8. Constructo de DNA que abarca un ácido nucleico según la reivindicación 7 y un promotor heterólogo.

9. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 7, o un constructo de DNA según la reivindicación 8.

10. Vector según la reivindicación 9, caracterizado porque el ácido nucleico está enlazado funcionalmente con secuencias reguladoras, que garantizan la expresión del ácido nucleico en células procariotas o eucariotas.

11. Célula huésped que contiene un ácido nucleico según la reivindicación 7, un constructor de DNA según la reivindicación 8 o un vector según las reivindicaciones 9 o 10.

12. Célula huésped según la reivindicación 11, caracterizada porque está constituida por una célula procariota.

13. Célula huésped según la reivindicación 11, caracterizada porque esta constituida por una célula eucariota.

14. Polipéptido de hongos patógenos para las plantas con la actividad biológica de una IMP deshidrogenasa, que codifica un ácido nucleico según la reivindicación 7.

15. Polipéptido de hongos patógenos para las plantas con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

16. Procedimiento para la obtención de un polipéptido según las reivindicaciones 14 o 15, que comprende

(a)

el cultivo de una célula huésped según una de las reivindicaciones 11 a 13 bajo condiciones que garanticen la expresión de los ácidos nucleicos según la reivindicación 7, o

(b)

la expresión de un ácido nucleico según la reivindicación 7 en un sistema in vitro, y

(c)

la obtención del polipéptido a partir de la célula, del medio de cultivo o del sistema in vitro.

17. Anticuerpo, que se enlaza específicamente sobre un polipéptido según las reivindicaciones 14 o 15.

18. Procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se emplean polipéptidos según las reivindicaciones 14 o 15 o células huésped según una de las reivindicaciones 11 a 13.

19. Procedimiento para encontrar fungicidas, que modifiquen la expresión de polipéptidos de hongos patógenos para las plantas con la actividad biológica de una IMP deshidrogenasa, que comprende las etapas siguientes:

(a)

la puesta en contacto de una célula huésped, que contiene un ácido nucleico, que codifica una IMP deshidrogenasa de hongos patógenos para las plantas, con un compuesto químico o con una mezcla de compuestos químicos,

(b)

la determinación de la concentración del polipéptido, y

(c)

la determinación del compuesto que influye específicamente la expresión del polipéptido.