ES2248088T3 - Linea celular que comprende el promotir de la ciclooxigenasa-2 (cox-2) y un gen testigo y su empleo en la busqueda de inhibidores selectivos de la induccion transcripcional de cox-2. - Google Patents
Linea celular que comprende el promotir de la ciclooxigenasa-2 (cox-2) y un gen testigo y su empleo en la busqueda de inhibidores selectivos de la induccion transcripcional de cox-2.Info
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Abstract
La línea celular comprende una construcción de DNA que comprende la totalidad o parte de una secuencia promotora del gen de la ciclooxigenasa 2 (cox-2) y un gen testigo, unidos operativamente entre sí, de manera que dicha secuencia promotora del gen de la cox-2 dirige la expresión de dicho gen testigo en respuesta a un estímulo adecuado. El método de ensayo comprende poner en contacto dicha línea celular con el compuesto a ensayar y determinar la existencia de una señal indicativa de la expresión de actividad debida al gen testigo. Este método es adecuado para la búsqueda de inhibidores selectivos de la inducción a nivel transcripcional de la cox-2 por estímulos apropiados.
Description
Línea celular que comprende el promotor de la
ciclooxigenasa-2 (cox-2) y un gen
testigo y su empleo en la búsqueda de inhibidores selectivos de la
inducción transcripcional de cox-2.
Esta invención se relaciona, en general, con la
búsqueda de productos con potenciales aplicaciones terapéuticas. En
particular, la invención se refiere a un método para la búsqueda de
compuestos inhibidores selectivos de la inducción a nivel
transcripcional de la ciclooxigenasa-2 que comprende
el empleo de una línea celular que expresa de forma estable una
construcción de DNA en la que la secuencia promotora del gen de la
ciclooxigenasa-2 dirige la expresión de un gen
testigo en respuesta a los estímulos apropiados.
La ciclooxigenasa (cox) es una enzima implicada
en numerosos procesos. Se conocen dos isoformas de la cox, la
ciclooxigenasa 1 (cox-1) y la ciclooxigenasa 2
(cox-2). Aunque ambas isoformas están relacionadas
con la producción de prostaglandinas involucradas en procesos
fisiológicos, parece ser que la cox-2 es la isoforma
predominante implicada en diversas patologías como la inflamación,
la carcinogénesis, la angiogénesis y algunos procesos
neurodegenerativos.
La inducción a nivel transcripcional de la
cox-2 se produce en respuesta a numerosos factores,
entre los que se encuentran, la expresión de oncogenes, el
tratamiento con promotores de tumores, mitógenos, estímulos
proinflamatorios, factores de crecimiento y citoquinas [revisado en
Smith and DeWitt, 1996; Griswold and Adams, 1996; Jouzeau et
al., 1997 (véase el apartado relativo a la BIBLIOGRAFÍA)]. En la
mayoría de los casos la inducción de esta enzima se traduce en un
aumento en la síntesis de prostaglandinas, aunque no se pueden
descartar otros modos de actuación.
La capacidad de ciertas drogas de la familia de
los antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs) de inhibir la
cox-2 explica sus efectos terapéuticos [revisado en
Smith and DeWitt, 1996; Griswold and Adams, 1996; Jouzeau et
al., 1997]. Asimismo, existen evidencias crecientes de que la
inhibición de la cox-2 tanto por NSAIDs como por
glucocorticoides o por ciclosporina A posee propiedades
inmunosupresoras [Iñiguez et al., 1998; Hall and Wolf, 1997;
Zhou et al., 1994; y las revisiones citadas anteriormente].
Otras acciones de la inducción de la cox-2 se
refieren a la implicación de ésta en cáncer, angiogénesis y procesos
neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer. Se ha comprobado
que tanto la inhibición de la inducción a nivel transcripcional
cox-2 como la inhibición enzimática de la
cox-2 atenúan estos procesos [Shiff et al.,
1996; Tsujii et al., 1997 y 1998; Subbaramiah et al.,
1998; Pasinetti, 1998].
Tras el descubrimiento de la isoforma inducible
cox-2 de la enzima ciclooxigenasa, los métodos de
identificación de nuevos fármacos antiinflamatorios han tenido como
objetivo seleccionar compuestos inhibidores selectivos de la
actividad enzimática cox-2 frente a la isoforma
constitutiva cox-1. Existen varios tipos de sistemas
al respecto. Unos utilizan ensayos in vitro utilizando enzima
cox-2 purificada o semipurificada [Famaey, 1997;
Noreen et al., 1998]. Otros autores utilizan líneas celulares
animales o humanas que expresan predominantemente la isoforma
cox-2 en condiciones naturales o tras la inducción
con estímulos [Famaey, 1997; Berg et al., 1997]. Algunos
emplean líneas celulares de origen animal o humano en las que
sobreexpresan la proteína cox-2 mediante
transfección estable del cDNA de la misma [Lora et al., 1997;
O'Neill et al., 1995; Cromlish and Kennedy, 1996]. En algún
caso se ha llegado a determinar mediante el análisis del mRNA si
tales compuestos inhiben a nivel transcripcional la inducción de la
cox-2 [Tao et al., 1998; Subbaramiah et
al., 1998]. También se han establecido sistemas de estudio de
compuestos inhibidores mediante ensayos in vivo, ya sea con
sangre entera o con células purificadas de donantes sanos [Famaey,
1997; Brideau et al., 1996].
En cualquier caso, la mayor limitación de estos
sistemas radica en que permiten seleccionar compuestos inhibidores
de la actividad enzimática de la enzima cox-2, sin
atender a sus efectos sobre la inducción de la producción de la
proteína, paso previo a la producción de prostaglandinas por esta
enzima. Además de esta limitación, ha quedado demostrado que las
potencias relativas de estos compuestos varían para el mismo fármaco
entre diferentes tipos de ensayos. Asimismo, un aspecto importante a
considerar tiene que ver con la inhibición de la actividad
cox-2 fisiológica, que también se vería inhibida por
el tipo de compuestos identificados por los sistemas mencionados, lo
que podría derivar en efectos secundarios adversos.
A partir del documento WO 98/37235, se conoce un
procedimiento de rastreo de agentes como candidatos para fármacos
los cuales suprimen la inducción del promotor COX-2.
Este procedimiento de rastreo depende del uso de un vector
recombinante que comprende una construcción que contiene 1432 bases
desde el sitio de inicio de transcripción de COX-2
(-1432 a +59) ligado al gen de la luciferasa.
El documento Huang, J-C. y
M.Y. Dawood (1988) Fertility and Sterility 70:
734-739 describe la determinación del efecto de
PMA e IL-1\beta sobre el promotor
COX-2 basado en la medida de la actividad luciferasa
generada en células endometriales estromales transfectadas con un
vector que contiene un testigo de luciferasa y una secuencia
promotora de 900 pares de bases (-891 a +9 en relación al sitio de
transcripción) correspondientes al gen humano.
El documento Inoue, H. y T. Tanabe (1998)
Biochem. Biophys. Res. Comm. 244: 143-148
estudia la determinación del papel transcripcional del sitio
NF-kB del gen COX-2 en células U937
empleando vector testigo de luciferasa dirigido por la región
promotora del COX-2 humano (nucleótidos -327 a +59)
transfectado de forma estable en las células U937.
Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar un
método para la búsqueda de compuestos inhibidores selectivos de la
inducción a nivel transcripcional de la cox-2 por
diferentes estímulos que supere los inconvenientes arriba
mencionados.
Esta invención proporciona una solución a la
necesidad existente que consiste en el desarrollo de un sistema de
ensayo para la búsqueda de compuestos inhibidores selectivos de la
inducción a nivel transcripcional de la cox-2 por
diferentes estímulos. Este criterio permite seleccionar compuestos
que inhiben la producción de la cox-2, con lo que
actuarán como inhibidores de las acciones derivadas del incremento
de la expresión de la cox-2 y del consiguiente
aumento de la producción de prostaglandinas que desencadenan
diversos procesos patológicos. Entre otros procesos, se pueden
destacar procesos inflamatorios, proliferación celular incontrolada,
angiogénesis, carcinogénesis y patologías neurodegenerativas, tal y
como se describió anteriormente. El criterio para la selección de
compuestos según esta invención radica en la inhibición de la
actividad inducible del promotor de la cox-2, con lo
cual no se seleccionarán aquellos compuestos que inhiban la
actividad basal fisiológica de producción de la
cox-2.
Para el desarrollo de la solución aportada por
esta invención, ha sido necesario construir una línea celular que
expresa de forma estable una construcción de DNA en la que la
secuencia promotora del gen de la cox-2 dirige la
expresión del gen testigo en respuesta a un estímulo adecuado. La
regulación de la expresión del gen de la cox-2 viene
determinada por la actividad reguladora de su promotor, mientras que
la medida de la actividad del gen testigo proporciona una medida
indirecta de la actividad del promotor de la cox-2
en respuesta a diferentes agentes.
Por consiguiente, un objeto de esta invención lo
constituye una construcción de DNA (o DNA recombinante) que
comprende una secuencia promotora del gen de la
cox-2 y un gen testigo, operativamente unidos entre
sí, de manera que dicha secuencia promotora del gen dirige la
expresión del gen testigo en respuesta a un estímulo adecuado.
Un objeto adicional de esta invención lo
constituye un vector, tal como un plásmido o un vector de expresión,
que comprende dicha construcción de DNA.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye una línea celular que contiene dicha construcción de DNA,
o dicho plásmido que contiene dicha construcción de DNA, y la
expresa de forma estable.
Finalmente, otro objeto adicional de esta
invención lo constituye un método para la búsqueda de compuestos
inhibidores selectivos de la inducción a nivel transcripcional de la
ciclooxigenasa-2 que comprende el empleo de dicha
línea celular que expresa de forma estable dicha construcción de
DNA.
La Figura 1 muestra la secuencia de la zona
promotora del gen cox-2. Las flechas indican las
secuencias de hibridación de los oligonucleótidos utilizados en la
reacción de PCR [reacción en cadena de la polimerasa].
La Figura 2 muestra la estrategia de clonaje de
la región promotora del gen cox-2 en el plásmido
pXP2 para obtener la construcción
prom2-1906-LUC.
La Figura 3 muestra los resultados del análisis
por RT-PCR [transcripción
inversa-reacción en cadena de la polimerasa] de la
expresión del mRNA de cox-2 en células Jurkat. En la
Figura 3(A) se muestra el efecto del tratamiento con PMA y
con PMA + Ionóforo de calcio A23187, en adelante PMA+Ion, en la
expresión del mRNA de cox-2. En la Figura
3(B) se muestra la inhibición por ciclosporina de la
inducción transcripcional de cox-2. Como control en
ambos casos se muestra el resultado obtenido para los mRNAs no
inducibles de la isoforma cox-1 y de la
glicerol-aldehído deshidrogenasa (GAPDH).
La Figura 4 muestra el resultado de la
estimulación por PMA o por PMA+Ion de la actividad luciferasa en
células Jurkat transfectadas transitoriamente con la construcción
prom2-1906-LUC. Como control se
comprueba que tanto la construcción
prom1-898-LUC como el plásmido vacío
pXP2 no son inducibles.
La Figura 5 muestra el resultado de la inhibición
por ciclosporina A (CsA) de la estimulación causada por PMA+Ion de
la construcción prom2-1906-LUC en la
transfección transitoria en células Jurkat.
La Figura 6 muestra los resultados de un
experimento de transfección transitoria con la construcción
prom2-1906-LUC y tratamiento con
dexametasona.
La Figura 7 muestra los resultados de la
actividad luciferasa de los diferentes clones obtenidos tras la
transfección estable con la construcción
prom2-1906-LUC.
La Figura 8 muestra los resultados de la
inhibición por ciclosporina A (CsA) de la estimulación por PMA+Ion
de la actividad luciferasa de los clones estables de
Jurkat-1906LUC.
La Figura 9 muestra los resultados obtenidos para
la inhibición por el glucocorticoide Dexametasona (Dex) sobre la
estimulación por PMA+Ion de la actividad luciferasa de los clones
estables de Jurkat-1906LUC.
La Figura 10 muestra la inhibición por
Resveratrol (Res) de la inducción de la actividad luciferasa de los
clones estables como control del sistema de ensayo.
Esta invención proporciona una construcción de
DNA (o DNA recombinante) que comprende la totalidad o parte de una
secuencia promotora del gen de la ciclooxigenasa 2
(cox-2) y un gen testigo, operativamente unidos
entre sí, de manera que dicha secuencia promotora del gen de la
cox-2 dirige la expresión de dicho gen testigo en
respuesta a un estímulo adecuado.
La secuencia promotora del gen
cox-2 puede tener cualquier origen, aunque
preferentemente dicha secuencia procederá del gen humano de la
cox-2.
Como gen testigo puede utilizarse cualquier gen
testigo capaz de producir una señal fácilmente detectable, de los
habitualmente utilizados en este tipo de ensayos de trasfección, por
ejemplo, el gen de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT), el gen
de la beta galactosidasa (\beta-gal), el gen de la
luciferasa, por ejemplo, de luciérnaga o de Renilla. En una
realización particular de esta invención dicho gen testigo es el gen
de la luciferasa de luciérnaga por la extrema sensibilidad, rapidez,
facilidad y bajo coste del ensayo de detección de la misma.
La invención también proporciona un vector, tal
como un plásmido o un vector de expresión, que contiene la
construcción de DNA previamente mencionada. En principio, puede
utilizarse cualquier vector apropiado para insertar en él dicha
construcción de DNA. Estos vectores son útiles para transformar
células.
La línea celular proporcionada por esta invención
comprende, y expresa de forma estable, dicha construcción de DNA que
comprende la totalidad o parte de una secuencia promotora del gen de
la cox-2 y un gen testigo, operativamente unidos
entre sí, de manera que dicha secuencia promotora del gen de la
cox-2 dirige la expresión de dicho gen testigo en
respuesta a un estímulo adecuado.
La línea celular transformada que contiene la
construcción de DNA previamente mencionada puede proceder de
cualquier línea celular adecuada capaz de expresar de forma estable
dicha construcción de DNA, por ejemplo, de una línea celular de
origen humano tal como una línea de células de tipo linfocito T,
células Hep-G2 derivadas de un carcinoma
hepatocelular, células Hela derivadas de un adenocarcinoma de
cervix, células tipo monocito-macrófago, por
ejemplo, las líneas U937 y THP-1, etc. En una
realización particular de esta invención, se ha seleccionado la
línea celular Jurkat (descrita originalmente por Schneider et
al., 1977) como ejemplo representativo de una línea celular
transformada de tipo linfocito T como modelo de estudio de la
expresión de un gen relacionado con la respuesta inmune. Además,
dicha línea celular es fácil de crecer y proporciona un elevado
rendimiento de células por unidad de tiempo y por volumen (ml) de
cultivo.
La línea celular proporcionada por esta invención
puede utilizarse como sistema de ensayo para la búsqueda e
identificación (screening) de compuestos inhibidores selectivos de
la inducción a nivel transcripcional de la cox-2 por
diferentes estímulos.
La línea celular proporcionada por esta invención
puede obtenerse fácilmente mediante procedimientos convencionales de
Ingeniería Genética, por ejemplo, mediante un procedimiento que
comprende (i) el aislamiento de la secuencia promotora del gen de la
cox-2, (ii) el clonaje de dicha secuencia en un
vector que contiene el gen testigo, en una posición en la que dicha
secuencia promotora es capaz de dirigir la expresión de dicho gen
testigo, y (iii) la transfección de una línea celular adecuada con
dicho plásmido. En el Ejemplo 3 se describe detalladamente una forma
concreta de obtener unos clones individuales de células Jurkat
transformadas que expresan el gen testigo (luciferasa) de forma
estable, denominados
Jurkat-C3-1906LUC,
Jurkat-F9-1906LUC y
Jurkat-C7-1906LUC, en los que se
determinó la actividad luciferasa basal y se comprobó que la
expresión del gen testigo (luciferasa) se inducía en respuesta a los
mismos estímulos que el promotor de la cox-2 tal y
como se había establecido previamente con células transfectadas
transitoriamente.
El sistema de ensayo (línea celular)
proporcionado por esta invención ha sido validado previamente
mediante la transfección transitoria de la construcción
prom2-1906-LUC y el análisis de la
actividad luciferasa bajo estímulos e inhibidores diferentes. Los
resultados obtenidos se compararon con un control no inducible de
una construcción similar en la que en lugar del promotor de la
cox-2 se sitúa el promotor de la isoforma
cox-1 y con el vector vacío pXP2. También se ha
procedido a determinar, bajo los mismos estímulos el comportamiento
del gen endógeno cox-2 mediante experimentos de
RT-PCR en los que se analiza la expresión del mRNA.
Como control no inducible se determinó el comportamiento del gen
endógeno de la isoforma cox-1 y del gen no inducible
de la glicerol-aldehido-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH). Los principales tratamientos fueron con
activadores tales como el éster de forbol PMA (10 ng/ml) y con la
combinación de PMA y el Ionóforo de calcio A23187 [PMA+Ion] (1
\muM). El tratamiento con fármacos inhibidores de la inducción por
PMA+Ion se llevó a cabo con dexametasona (1 \muM), y con
ciclosporina A (100 ng/ml).
El Ejemplo 2 incluye unos ensayos de validación
del sistema de ensayo proporcionado por esta invención en
transfección transitoria, así como de la expresión de los genes
endógenos en células Jurkat. También se recogen en los Ejemplos 3 y
4 unos ensayos realizados con los clones estables obtenidos, con
compuestos inductores e inhibidores de la inducción del promotor de
la cox-2.
El sistema de ensayo proporcionado por esta
invención es útil en la búsqueda e identificación (screening) de
compuestos inhibidores selectivos de la inducción a nivel
transcripcional de la cox-2 por diferentes
estímulos. Este tipo de inhibidores selectivos de la
cox-2 puede tener numerosas aplicaciones
terapéuticas potenciales ya que las implicaciones derivadas de la
inducción de la cox-2 no sólo inciden en la
respuesta inflamatoria, sino también en procesos relacionados con la
proliferación celular incontrolada y formación de tumores (por
ejemplo, la aparición de adenomas, el cáncer de colon y el
desarrollo de pólipos y la angiogénesis, entre otros), con acciones
inmunosupresoras y con procesos neurodegenerativos como la
enfermedad de Alzheimer. Por consiguiente, cabe suponer que los
compuestos inhibidores selectivos de la inducción transcripcional de
la cox-2 puedan ser útiles como agentes
antiinflamatorios, como compuestos capaces de atenuar la
proliferación celular incontrolada y/o el proceso de tumorigénesis,
como inmunosupresores o como potenciales fármacos con propiedades
terapéuticas en la enfermedad de Alzheimer.
La invención también proporciona un método de
ensayo para la búsqueda e identificación (screening) de compuestos
inhibidores selectivos de la inducción a nivel transcripcional de la
cox-2 por un estímulo apropiado (descrito en el
Ejemplo 4) que comprende poner en contacto la línea celular
proporcionada por esta invención (sistema de ensayo) con el
compuesto a ensayar, es decir, con el compuesto cuya potencial
actividad inhibidora selectiva de la inducción a nivel
transcripcional de la cox-2 se desea ensayar, bajo
condiciones que permiten la transcripción de la
cox-2, y detectar, y/o medir, la señal indicativa de
la expresión de actividad debida al gen testigo. Alternativamente,
si se desea, el método de ensayo objeto de esta invención puede
llevarse a cabo poniéndose en contacto la línea celular, el sistema
de ensayo y un compuesto activador de la inducción transcripcional
de la cox-2.
En el método de ensayo proporcionado por esta
invención, la regulación de la expresión del gen de la
cox-2 viene determinada por la actividad reguladora
de su promotor, mientras que la medida de la actividad del gen
testigo proporciona una medida indirecta de la actividad del
promotor de la cox-2 en respuesta a diferentes
agentes.
El método de ensayo para la búsqueda e
identificación de compuestos inhibidores selectivos de la inducción
a nivel transcripcional de la cox-2 por un estímulo
apropiado proporcionado por esta invención permite seleccionar
compuestos que inhiben la producción de la cox-2
mediante un criterio que radica en la inhibición de la actividad
inducible del promotor de la cox-2, con lo cual no
se seleccionan aquellos compuestos que inhiban la actividad basal
fisiológica de producción de la cox-2.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar
formas preferidas de realizar la invención sin que deban ser
considerados como limitativos del alcance de la misma.
En primer lugar se procedió al clonaje de la
secuencia promotora del gen humano de la cox-2, a
partir de la secuencia descrita por Tazawa [Tazawa et al.,
1994] representada en la Figura 1.
Se utilizó la técnica de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), usando oligonucleótidos cebadores o
"primers" diseñados para la amplificación selectiva del
fragmento de DNA correspondiente a la secuencia promotora de este
gen. Como DNA molde se utilizó DNA genómico de la línea celular
linfocítica humana Jurkat. Los oligonucleótidos utilizados fueron
los identificados como SEC.ID.Nº.: 1 y SEC.ID.No.: 2 [véase el
apartado relativo a la LISTA DE SECUENCIAS].
Estos oligonucleótidos amplifican una secuencia
que abarca desde el nucleótido -1796 al nucleótido +104 de la zona
promotora del gen cox-2 (véase la Figura 1). Para la
reacción de PCR se usó el Advantage cDNA PCR kit [Clontech]
con 30 ciclos repetitivos de 45 segundos a 94ºC y 3 minutos a 68ºC
en un termociclador PTC-200 [MJ Research].
Los fragmentos generados tras la amplificación
fueron subclonados en el plásmido pXP2 [Nordeen, 1988] que contiene
la secuencia codificante del gen de la luciferasa que se utilizará
como gen testigo (véase la Figura 2). Los oligonucleótidos se
diseñaron de tal forma que en el extremo 5' contienen una secuencia
adicional de reconocimiento por enzimas de restricción. Tras la
amplificación se generan extremos de doble cadena que contienen las
dianas de restricción BamHI en el extremo 5' y BglII en el extremo
3'. El vector pXP2 contiene en el sitio múltiple de clonaje una
diana BglII, que genera extremos compatibles tanto con extremos
BglII como BamHI. Tras la digestión con los enzimas BglII y BamHI
del inserto obtenido por PCR conteniendo la secuencia promotora, y
del vector pXP2 con BglII, se procedió a la ligación de estas
secuencias. De este modo se obtuvo el plásmido
prom2-1906-LUC en el que la
secuencia (-)1796-(+)104 del promotor de la cox-2 se
sitúa por delante del gen de la luciferasa, dirigiendo su expresión.
Esta construcción se secuenció para comprobar la fidelidad de la
secuencia del promotor y
\hbox{verificar el sitio de
clonaje.}
Con el fin de estudiar la regulación de la
expresión del gen cox-2 endógeno en la línea celular
Jurkat se procedió al análisis de la expresión de su mRNA mediante
experimentos de RT-PCR. A su vez, con el fin de
validar la construcción
prom2-1906-LUC y comprobar que la
regulación del promotor clonado se corresponde con la esperada, se
realizaron experimentos de transfección transitoria de la
construcción prom2-1906-LUC
utilizando la línea celular Jurkat. En ambos experimentos las
células se trataron con compuestos estimuladores e inhibidores de la
inducción del promotor de cox-2.
El tratamiento con compuestos activadores se
llevó a cabo utilizando el éster de forbol PMA (Phorbol
12-Myristate 13-Acetate) (10 ng/ml)
(Sigma) y la combinación de PMA y el ionóforo de Calcio A23187 (1
\muM) (Sigma), en adelante PMA+Ion.
El tratamiento con fármacos inhibidores de la
inducción por PMA+Ion se llevó a cabo con ciclosporina A (CsA) (100
ng/ml), o el glucocorticoide sintético Dexametasona (Dex) (1 \muM)
(Sigma).
Los resultados obtenidos del análisis por
RT-PCR de la expresión del mRNA de
cox-2 en células Jurkat se muestran en la Figura 3,
donde puede observarse lo siguiente:
a) el tratamiento con PMA (10 ng/ml) produce un
ligero incremento de la expresión del mRNA de cox-2,
mientras que el tratamiento combinado con PMA+Ion produce el mayor
aumento en la expresión de este gen a nivel transcripcional [Figura
3(A)]; y
b) la inhibición por CsA (100 ng/ml) de la
inducción transcripcional de cox-2 [Figura
3(B)].
Como control en ambos casos se muestra el
resultado obtenido para los mRNAs no inducibles de la isoforma
cox-1 y de la glicerol aldehído fosfato
deshidrogenasa (GAPDH).
Se ha analizado la actividad luciferasa en
células Jurkat transfectadas transitoriamente con la construcción
prom2-1906-LUC utilizando el agente
Lipofectina [Life Technologies]. Las células fueron estimuladas con
PMA (10 ng/m) (Sigma) y con la combinación PMA+Ion (1 \muM)
(Sigma).
Como control no inducible se utilizó una
construcción similar en la que en lugar del promotor de la
cox-2 se situó el promotor de la isoforma
cox-1
[prom1-898-LUC] y con el vector
vacío pXP2.
La actividad luciferasa se determinó utilizando
el kit "Luciferase Assay System" [Promega], con 1x10^{6}
células que se lisaron en 50 \mul de tampón de lisis. En los
extractos obtenidos se midió la emisión de luz producida con un
luminómetro Monolight 2010 [Analytical Luminiscence Laboratory] con
un sistema de inyección automática de 100 \mul de reactivo.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura
4. Como puede apreciarse en dicha figura, los resultados obtenidos
en este ensayo son comparables a los obtenidos en el análisis del
mRNA de cox-2 [Ejemplo 2.1], es decir, el
tratamiento con PMA+Ion produce el mayor aumento en el número de
veces de inducción de la actividad luciferasa (aproximadamente 12
veces la basal). Estos datos demuestran que la secuencia promotora
clonada se comporta de forma similar al gen endógeno. Como control
se comprueba que tanto la construcción
prom1-898-LUC como el plásmido vacío
pXP2 no son inducibles.
Se ha analizado la inhibición de la estimulación
por PMA (10 ng/m) (Sigma) o PMA+Ion (1 \muM) (Sigma) sobre la
actividad luciferasa en células Jurkat transfectadas
transitoriamente con la construcción
prom2-1906-LUC, mediante el empleo
del fármaco inmunosupresor ciclosporina A (CsA) (100 ng/ml). Los
resultados obtenidos se muestran en la Figura 5 donde se pone de
manifiesto que el tratamiento con CsA (100 ng/ml) disminuye la
estimulación del promotor de la cox-2 en respuesta a
PMA+Ion hasta valores similares a los basales.
Asimismo, se ha analizado la inhibición de la
estimulación por PMA+Ion (1 \muM) (Sigma) sobre la actividad
luciferasa en células Jurkat transfectadas transitoriamente con la
construcción prom2-1906 mediante el glucocorticoide
dexametasona (1 \muM) (Sigma). Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 6 donde se pone de manifiesto que el
tratamiento con dexametasona (1 \muM) (Dex) disminuye la
estimulación del promotor de cox-2 en respuesta a
PMA+Ion.
Para la creación de la línea celular que expresa
de forma estable la construcción
prom2-1906-LUC, se cotransfectaron
células Jurkat con el vector
prom2-1906-LUC y un vector
denominado pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen) que contiene el gen de
resistencia a la higromicina. La transfección se realizó mediante la
técnica de electroporación en cubetas de 0,4 cm (BioRad) con 15 x
10^{6} células en 0,5 ml de medio completo [medio RPMI
suplementado con 10% de suero fetal, L-Glutamina 2
mM y una mezcla de antibióticos] (Todos estos productos fueron
adquiridos a Life Technologies). Las células se incubaron en hielo
durante 10 minutos con 25 \mug del plásmido
prom2-1906-LUC y 5 \mug del vector
pCDNA3.1./Hygro. Tras este periodo, las células se electroporaron en
un aparato Gene Pulser II (BioRad) a 1.500 \muFaradios de
capacitancia y 280 Voltios de corriente. A continuación, las células
se incubaron en hielo durante 10 minutos antes de añadir 10 ml de
medio completo. Las células se cultivaron en este medio en frascos
de cultivo (Nunc) de 75 cm^{2} durante 48 horas en un incubador de
células a 37ºC, con una humedad del 95% y 5% de CO_{2}. En este
momento se cambió el medio por medio completo sin antibióticos al
que se añadió higromicina (Boehringer Mannheim) a una concentración
de 200 \mug/ml. Las células se cultivaron en este medio durante 30
días con sucesivos cambios de medio. Durante este periodo se
selecciona la población resistente que sobrevive al tratamiento con
el antibiótico selectivo, es decir los transfectantes estables para
el gen de resistencia al antibiótico higromicina. En esta población
se analizó la expresión del gen de la luciferasa con el fin de
determinar la presencia de transfectantes estables para el plásmido
prom2-1906-LUC. Para ello,
1x10^{6} células se lisaron en 50 \mul de tampón de lisis
(Promega) y con los extractos obtenidos se procedió a determinar la
actividad luciferasa con los reactivos contenidos en el kit de
"Luciferase Assay System" [Promega]. La medición de la emisión
de luz producida se determinó en un luminómetro MonoLight 2010
(Analytical Luminiscence Laboratory) con un sistema de inyección
automática de 100 \mul de
reactivo.
reactivo.
De esta población policlonal
(Jurkat-pool-1906LUC) se realizó una
dilución límite en placas de 96 pocillos en medio completo con
higromicina con el fin de obtener clones individuales que expresaran
el gen de la luciferasa de forma estable. Estos clones se crecieron
hasta obtener al menos 1x10^{6} células con las que realizar la
medición de la actividad luciferasa tal como se ha descrito
anteriormente. De esta forma se obtuvieron tres clones individuales
denominados Jurkat-C3-1906LUC,
Jurkat-F9-1906LUC y
Jurkat-C7-1906LUC. En estos clones
se determinó la actividad luciferasa basal en RLUs (unidades
relativas de luminiscencia) y se comprobó que la expresión del
testigo luciferasa se inducía en respuesta a los mismos estímulos
que el promotor de cox-2 tal y como se había
establecido previamente con células transfectadas de forma
transitoria (véase la Figura 7). En los tres clones, los valores
basales de actividad luciferasa se incrementan de 3 a 6 veces con un
tratamiento de 6 horas con el éster de forbol PMA y hasta 10 - 20
veces con un tratamiento combinado de PMA+Ion, de forma similar a
los resultados obtenidos en las transfecciones
transitorias.
transitorias.
Los clones se cultivaron en placas de 96 pocillos
a una densidad de 1x10^{5} células en 200 \mul de medio RPMI
suplementado con 2% de suero fetal, L-Glutamina 2 mM
y una mezcla de antibióticos. Las células se trataron durante 6
horas con diferentes concentraciones de los compuestos cuya
actividad se pretende ensayar. En el caso del ensayo de la actividad
de estos compuestos sobre la inducción de la actividad del promotor
de cox-2, las células se trataron con PMA+Ion
durante 5 horas, tras 1 hora de pretratamiento con el compuesto a
ensayar. Tras este periodo las células se lisaron en 50 \mul de
tampón de lisis y se determinó su actividad luciferasa utilizando 20
\mul en un luminómetro tal y como se describió en el Ejemplo 2.2.
A continuación se muestran algunos resultados obtenidos con
compuestos previamente descritos como inhibidores de la estimulación
del promotor de cox-2.
La Figura 8 muestra los resultados obtenidos con
el compuesto ciclosporina A (CsA) el cual produce una inhibición de
la estimulación obtenida con PMA+Ion en los clones estables de
Jurkat, de forma similar a lo previamente descrito (Iñiguez et
al., 1998), y a lo observado en las transfecciones transitorias
ilustradas en el Ejemplo 2.3.
La Figura 9 muestra los resultados obtenidos con
el compuesto Dexametasona (Dex), que, como glucocorticoide y
anti-inflamatorio, produce una inhibición de la
estimulación obtenida con PMA+Ion en los clones estables de Jurkat,
como corresponde a lo ya descrito (Smith and DeWitt, 1996) y a lo
observado previamente en las transfecciones transitorias del Ejemplo
2.3.
La Figura 10 muestra los resultados obtenidos con
el compuesto Resveratrol (Res), descrito recientemente como
inhibidor de la estimulación por PMA del gen cox-2
(Subbaramiah, et al., 1998). Este compuesto produce una
inhibición de la estimulación obtenida con PMA+Ion en los clones
estables de Jurkat.
De esta forma queda demostrada la validez del
sistema de ensayo por el comportamiento similar de los clones
obtenidos, de las transfecciones transitorias y de los resultados
obtenidos con el mRNA endógeno. Con el uso de compuestos cuya
actividad sobre el promotor de cox-2 es conocida, ya
sean estimuladores o inhibidores, queda establecido que es posible
detectar compuestos no descritos previamente que regulen tanto
positivamente como negativamente la expresión basal o inducida del
gen cox-2 con el sistema de ensayo desarrollado en
la presente invención.
Una muestra de una línea celular Jurkat,
denominada J-1906-F9, que expresa
de forma estable una construcción de DNA que comprende una secuencia
promotora del gen de la cox-2 y el gen de la
luciferasa, ha sido depositada en la European Collection of Animal
Cell Cultures (ECACC) [Salisbury, R. Unido] el 24 de marzo de 1999 y
ha recibido el número de acceso ECACC 99032405.
Una muestra del plásmido
prom2-1906-LUC, insertado en
Escherichia coli DH5, denominada DH5
prom2-1906-LUC, ha sido depositada
en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) [Burjassot,
Valencia] el 24 de marzo de 1999 y ha recibido el número de acceso
CECT 5145.
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different mechanism of action from cyclosporin A. J. Immunol.
153:5026.
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Laboratorios del Dr. Esteve, S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCION: Avda. Mare de Deu de Montserrat, 221
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Barcelona
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: España
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 08041
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELEFONO: 93 446 60 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 93 450 32 02
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCION: LINEA CELULAR QUE COMPRENDE EL PROMOTOR DE LA CICLOOXIGENASA-2 (COX-2) Y UN GEN TESTIGO, Y SU EMPLEO EN LA BÚSQUEDA DE INHIBIDORES SELECTIVOS DE LA INDUCCIÓN TRANSCRIPCIONAL DE COX-2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MEDIO: Diskete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION DE LA SECUENCIA IDENTIFICADA Nº
[SEC.ID.Nº]: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE CADENAS: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGATCCG GATTCTAACA TGGCTTCTAA CCC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA IDENTIFICADA
Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE CADENAS: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: DNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAGATCTG GTAGGCTTTG CTGTCTGAGG
\hfill30
Claims (8)
1. Una construcción de DNA que comprende la
secuencia que se encuentra entre el nucleótido -1796 y el nucleótido
+104 del promotor del gen humano de la ciclooxigenasa 2
(cox-2) y un gen testigo, operativamente unidos
entre sí, de manera que dicha secuencia promotora del gen de la
cox-2 dirige la expresión de dicho gen testigo en
respuesta a un estímulo adecuado.
2. Una construcción de acuerdo con la
reivindicación 1, en la cual dicho gen testigo se selecciona del gen
de la luciferasa, el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa y el
gen de la beta galactosidasa.
3. Un vector que comprende una construcción de
DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
4. Una línea celular que comprende una
construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2
o transformada con un vector de acuerdo a la reivindicación 3.
5. Una línea celular de acuerdo con la
reivindicación 4, en la cual dicha línea celular se deriva de una
línea celular de origen humano.
6. Una línea celular de acuerdo con la
reivindicación 5, en la cual dicha línea celular de origen humano es
una línea de células Jurkat.
7. Una línea celular de acuerdo con las
reivindicaciones 4 a 6 la cual expresa de modo estable la
construcción de DNA de las reivindicaciones 1 a 2.
8. Método de ensayo para la búsqueda de
compuestos inhibidores selectivos de la inducción a nivel
transcripcional de la ciclooxigenasa-2 por un
estímulo apropiado, que comprende poner en contacto una línea
celular según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, con un
compuesto cuya potencial actividad inhibidora selectiva de la
inducción a nivel transcripcional de la cox-2 se
desea ensayar, bajo condiciones que permiten la transcripción de la
cox-2, y detectar, y/o medir, la señal indicativa de
la expresión de actividad debida al gen testigo.
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| EP1201766B1 (en) | 2005-09-07 |
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