ES2246175B1

ES2246175B1 - "PROCEDURE TO PRODUCE RECOMBINANT CAPRINE CHEMOSINE FOR COAGULATION OF GOAT MILK IN CHEESE MANUFACTURE".

Info

Publication number: ES2246175B1
Application number: ES200402025A
Authority: ES
Inventors: Felix Claverie Martin; Jesus Villar Hernandez; M. Candelaria Vega Hernandez
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2024-07-30
Also published as: ES2246175A1

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir quimosina caprina recombinante para la coagulación de la leche de cabra en la fabricación de queso. El cDNA que codifica la pro-quimosina de Capra hircus se sintetizó a partir del RNA extraído del abomaso de cabritos lactantes usando cebadores diseñados a partir de la secuencia de DNA de la pro-quimosina bovina. El producto amplificado por PCR fue clonado en el plásmido pUC19 y secuenciado. La secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia del DNA difiere en 21 residuos de la pro-quimosina bovina. El DNA que codifica la pro-quimosina caprina fue insertado en el vector de expresión pSPGK1. Los sobrenadantes de los cultivos de dos cepas de Kluyveromyces lactis transformadas con el plásmido recombinante fueron activados a pH ácido. La quimosina recombinante de cabrito mostró especificidad sobre las cadenas de K caseína de la leche y actividad coaguladora de la leche.The present invention relates to a process for producing recombinant goat chymosin for coagulation of goat's milk in cheese making. The cDNA encoding Capra hircus pro-chymosin was synthesized from RNA extracted from the abomasum of lactating kids using primers designed from the bovine pro-chymosin DNA sequence. The PCR amplified product was cloned into plasmid pUC19 and sequenced. The amino acid sequence deduced from the DNA sequence differs in 21 bovine pro-chymosin residues. The DNA encoding caprine pro-chymosin was inserted into the expression vector pSPGK1. The culture supernatants of two strains of Kluyveromyces lactis transformed with the recombinant plasmid were activated at acidic pH. Recombinant kid's chymosin showed specificity on milk casein K chains and milk coagulation activity.

Description

Procedimiento para producir quimosina caprina recombinante para la coagulación de la leche de cabra en la fabricación de queso.Procedure to produce goat chymosin recombinant for clotting goat's milk in the cheese making

La presente invención se refiere a la identificación molecular de un cDNA que codifica para la pre-pro-quimosina caprina y un procedimiento para producir quimosina caprina recombinante para la coagulación de la leche en la fabricación de queso. El cDNA que codifica la pro-quimosina de Capra hircus se sintetizó a partir del ARN extraído del abomaso de cabritos lactantes usando cebadores diseñados a partir de la secuencia de ADN de la pre-pro-quimosina bovina. El producto amplificado por PCR fue donado en el plásmido pUC19 y secuenciado. La secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia del ADN difiere en 21 residuos de la pro-quimosina bovina. El ADN que codifica la pro-quimosina caprina fue insertado en el vector de expresión pSPGK-1. Los sobrenadantes de cultivos de dos cepas de Kluyveromyces lactis transformadas con el plásmido recombinante, fueron activados a pH ácido. La quimosina recombinante de cabrito mostró especificidad sobre las cadenas de k-caseína de la leche y actividad coaguladora de la leche.The present invention relates to the molecular identification of a cDNA encoding caprine pre-pro-chymosin and a method for producing recombinant goat chymosin for milk coagulation in cheese making. The cDNA encoding Capra hircus pro-chymosin was synthesized from RNA extracted from the abomasum of lactating kids using primers designed from the bovine pre-pro-chymosin DNA sequence. The PCR amplified product was donated in plasmid pUC19 and sequenced. The amino acid sequence deduced from the DNA sequence differs in 21 bovine pro-chymosin residues. The DNA encoding caprine pro-chymosin was inserted into the pSPGK-1 expression vector. The culture supernatants of two strains of Kluyveromyces lactis transformed with the recombinant plasmid were activated at acidic pH. Recombinant kid's chymosin showed specificity on milk k-casein chains and milk coagulation activity.

Background of the invention

El primer paso en la fabricación del queso implica esencialmente la coagulación, derivada de la rotura de las caseínas de la leche. Los agentes coagulantes que se utilizan son preparaciones de enzimas proteoliticas, proteinasas de ácido aspártico, algunas de las cuales se llevan utilizando durante miles de años. El principal agente activo del cuajo es la quimosina, una proteasa específica que digiere las cadenas de k-caseína de la leche. La quimosina se sintetiza en células del cuarto estómago de terneras y cabritos lactantes, y su secreción es máxima durante los primeros días de vida. La manera en que actúa la quimosina es rompiendo un enlace específico (fenilalanina 105-metionina 106) de la k-caseína, que da lugar a la precipitación de las \alpha y \beta caseínas, y por tanto, a la coagulación de la leche. Hoy en día el agente coagulante que más se utiliza es el cuajo de ternera, pero el mercado de los enzimas recombinantes producidos por la fermentación de microorganismos sigue aumentando de manera considerable.The first step in cheese making essentially involves coagulation, derived from the breakage of the milk caseins. The clotting agents used are proteolytic enzyme preparations, acid proteinases aspartic, some of which have been used for thousands of years. The main active agent of rennet is chymosin, a specific protease that digests the chains of K-casein of milk. Chymosin is synthesized in fourth stomach cells of calves and lactating kids, and their secretion is maximum during the first days of life. The way in that chymosin acts is breaking a specific bond (phenylalanine 105-methionine 106) of the k-casein, which results in the precipitation of α and β caseins, and therefore, to the coagulation of the milk. Nowadays the coagulant agent that is most used is the Veal rennet, but the market for recombinant enzymes produced by the fermentation of microorganisms continues to increase considerably.

La quimosina recombinante se introdujo en el mercado hace unos veinte años. Se produce en microorganismos, a los que se les ha introducido el ADN complementario (cDNA) que codifica la quimosina de ternera. La quimosina recombinante se comporta de la misma manera que la del cuajo de ternera, con la ventaja de que su actividad es más uniforme, tiene menos impurezas, no contiene agentes infecciosos y se puede producir en grandes cantidades. Hoy en día, los agentes coagulantes que más emplean las industrias queseras son cuajos estándar de ternera, cuajo natural de cabritos lactantes, cuajos comerciales de origen microbiano o quimosina recombinante de ternera. Tradicionalmente, la coagulación de los quesos fabricados con leche de cabra se obtiene añadiendo a la leche el cuajo de cabritos lactantes (C. hircus). Para la obtención del cuajo de cabrito, es necesario sacrificar a los animales cuando tienen solo unos días de edad. Además, la actividad coagulante de estos cuajos varia en función de la edad y la ingesta que haya realizado cada cabrito. Estos problemas se podrían evitar utilizando una quimosina recombinante de C. hircus. Por otra parte, y aunque el cuajo de ternera es similar al de cabrito, éste seria más apropiado para coagular la leche de cabra. Por tanto, puede ser interesante para el sector elaborador de quesos de cabra, el disponer de una quimosina idéntica a la de los cabritos lactantes pero producida biotecnológicamente por levaduras.Recombinant chymosin was introduced to the market about twenty years ago. It is produced in microorganisms, to which the complementary DNA (cDNA) that encodes veal chymosin has been introduced. Recombinant chymosin behaves in the same way as that of calf rennet, with the advantage that its activity is more uniform, has less impurities, does not contain infectious agents and can be produced in large quantities. Today, the clotting agents that are most used by the cheese industries are standard rennet of calf, natural rennet of nursing kids, commercial rennet of microbial origin or recombinant calmosin chymosin. Traditionally, coagulation of cheeses made with goat's milk is obtained by adding the rennet of lactating kids (C. hircus) to the milk. To obtain kid's rennet, it is necessary to sacrifice the animals when they are only a few days old. In addition, the coagulant activity of these rennet varies depending on the age and intake that each kid has made. These problems could be avoided using a recombinant chymosin of C. hircus . On the other hand, and although the calf rennet is similar to that of the kid, it would be more appropriate to coagulate the goat's milk. Therefore, it may be interesting for the goat cheese making sector to have a chymosin identical to that of lactating kids but biotechnologically produced by yeasts.

Brief exposition of the invention

El cDNA que codifica la pre-pro-quimosina de C. hircus se sintetizó a partir del ARN extraído del abomaso de cabritos lactantes usando cebadores diseñados a partir de la secuencia de ADN de la pre-pro-quimosina bovina. El producto amplificado por PCR fue clonado en el plásmido pUC19 y secuenciado (SEQ IQ NO:1). El ADN que codifica la pro-quimosina caprina fue insertado en el vector de expresión pSPGK-1. Los sobrenadantes de cultivos de dos cepas de K lactis transformadas con el plásmido recombinante, fueron activados a pH ácido. La quimosina recombinante de cabrito mostró especificidad sobre las cadenas de k-caseína de la leche y actividad coaguladora de la leche.The cDNA encoding the pre-pro-chymosin of C. hircus was synthesized from RNA extracted from the abomasum of lactating kids using primers designed from the bovine pre-pro-chymosin DNA sequence. The PCR amplified product was cloned into plasmid pUC19 and sequenced (SEQ IQ NO: 1). The DNA encoding caprine pro-chymosin was inserted into the pSPGK-1 expression vector. The culture supernatants of two strains of K lactis transformed with the recombinant plasmid were activated at acidic pH. Recombinant kid's chymosin showed specificity on milk k-casein chains and milk coagulation activity.

Detailed description of the invention

Para la presente invención se aisló ARN del estómago de dos cabritos lactantes (de cinco a siete días) de C. hircus, usando el High Pure RNA isolation kit siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. La primera hebra de cDNA fue sintetizada a 42ºC durante una hora usando la transcriptasa inversa de AMV y la pareja de oligonucleótidos Quils-2 y Qui 9a diseñados a partir de la secuencia de la quimosina bovina (ver Tabla 1).For the present invention RNA was isolated from the stomach of two lactating kids (five to seven days) from C. hircus , using the High Pure RNA isolation kit following the protocol recommended by the manufacturer. The first strand of cDNA was synthesized at 42 ° C for one hour using the AMV reverse transcriptase and the Quils-2 and Qui 9a oligonucleotide pair designed from the bovine chymosin sequence (see Table 1).

TABLE 1 Oligonucleótidos usados para RT-PCR, PCR y secuenciación del cDNA de la pre-pro-quimosina caprina (los nucleótidos extras añadidos al extremo 5' están en minúscula, la región correspondiente al sitio de restricción EcoRI está subrayada)Oligonucleotides used for RT-PCR, PCR and sequencing of the caprine pre-pro-chymosin cDNA (the extra nucleotides added to the 5 'end are lowercase, the region corresponding to the EcoR I restriction site is underlined)

1one

La mezcla de reacción (50 microlitros) contenía 0,2 mM de cada primer, 2 mM de MgCl2 y 2.5 U de Pfu DNA polimerasa. La reacción de PCR se llevó a cabo en un GeneAmp PCR system 9700 con una incubación a 94ºC durante 2 min, 35 ciclos de 94ºC durante 1 min, 58ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2,5 min y una incubación final a 72ºC durante 5 minutos. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1% y se clonaron en el sitio Sma I del plásmido pUC19. El plásmido recombinante se denominó pQC 1. El fragmento clonado fue confirmado por secuenciación (SEQ IQ NO:1) (Nº de acceso de la base GeneBank M14069 y P00794).The reaction mixture (50 microliters) contained 0.2 mM of each first, 2 mM MgCl2 and 2.5 U of Pfu DNA polymerase. The PCR reaction was carried out in a GeneAmp PCR system 9700 with an incubation at 94 ° C for 2 min, 35 cycles of 94 ° C for 1 min, 58 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 2.5 min and a final incubation at 72 ° C for 5 min. minutes The PCR products were run on a 1% agarose gel and cloned into the Sma I site of plasmid pUC19. The recombinant plasmid was called pQC 1. The cloned fragment was confirmed by sequencing (SEQ IQ NO: 1) (GeneBank base accession number M14069 and P00794).

De la secuencia de este ADN se predice una proteína de 381 aminoácidos con homología a las quimosinas, con un péptido señal de 16 aminoácidos, un pro-segmento de 42 aminoácidos y una proteína activa de 323 aminoácidos (SEQ IQ NO:2). El polipéptido de la quimosina caprina se sintetizaría en forma de pre-pro-quimosina caprina, un precursor enzimáticamente inactivo. Durante el proceso de secreción, la prepro-quimosina sería procesada por la peptidasa señal a pro-quimosina, la forma inactiva. A pH ácido la pro-quimosina sería procesada por rotura autocatálitica del pro-segmento dando lugar a la quimosina activa. La secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia del ADN caprino difiere de la secuencia bovina en 23 residuos: uno en el péptido señal, cuatro en el pro-segmento y 18 en la enzima activa.The sequence of this DNA predicts a 381 amino acid protein with chymosin homology, with a 16 amino acid signal peptide, a pro-segment of 42 amino acids and an active protein of 323 amino acids (SEQ IQ NO: 2). The goat chymosin polypeptide would be synthesized in pre-pro-chymosin form goat, an enzymatically inactive precursor. During the process of secretion, prepro-chymosin would be processed by the signal peptidase to pro-chymosin, the form inactive At acidic pH the pro-chymosin would be processed by autocatalytic rupture of pro-segment giving rise to active chymosin. The amino acid sequence deduced from the goat DNA sequence differs from the bovine sequence in 23 residues: one in the peptide signal, four in the pro-segment and 18 in the enzyme active

Para la expresión de pro-quimosina caprina en K. lactis se utilizó un vector que permite la secreción extracelular del gen clonado en pauta de lectura con la secuencia de un péptido señal, bajo el control de un promotor constitutivo y un terminador del gen PGK. El plásmido empleado contiene un único sitio EcoRI para la clonación, un marcador de ampicilina para la selección en E. coli y el marcador URA para la selección en levaduras auxótrofas. El fragmento de 1.1 kb, que abarca por completo la región codificante de la pro-quimosina caprina, fue amplificado por PCR con los oligonucleótidos Ecoqui5' y EcoQui3' (Tabla 1) y el plásmido pQC1 como molde. Después de amplificado y purificado el fragmento de ADN fue digerido con la enzima de digestión EcoRI, ligado en el sitio EcoRI del plásmido de expresión y transformado en células E. coli. La orientación del fragmento fue confirmada por secuenciación y la construcción así obtenida se denominó pQSec1. Esta, fue utilizada para transformar K lactis por el procedimiento del acetato de litio. Los transformantes URA fueron crecidos a 30ºC hasta fase estacionaria en medio completo (SCM) que contenía 0.1% de medio sintético de levadura sin uracilo, 0.67% de base nitrogenada sin aminoácidos y 2% de glucosa, y usados como precultivos para 50 ml de medio YPD (2% glucosa, 1% extractos de levadura y 2% de bacto-triptona). Estos cultivos para la expresión fueron crecidos a 30ºC durante 4 días.For the expression of caprine pro-chymosin in K. lactis a vector was used that allows the extracellular secretion of the cloned gene in reading pattern with the sequence of a signal peptide, under the control of a constitutive promoter and a PGK gene terminator. The plasmid used contains a single EcoR I site for cloning, an ampicillin marker for selection in E. coli and the URA marker for selection in auxotrophic yeasts. The 1.1 kb fragment, which completely covers the coding region of caprine pro-chymosin, was amplified by PCR with oligonucleotides Ecoqui5 'and EcoQui3' (Table 1) and plasmid pQC1 as template. After amplified and purified the DNA fragment was digested with the digestion enzyme EcoR I, ligated into the EcoR I site of the expression plasmid and transformed into E. coli cells. The orientation of the fragment was confirmed by sequencing and the construction thus obtained was called pQSec1. This was used to transform K lactis by the lithium acetate procedure. The URA transformants were grown at 30 ° C to stationary phase in complete medium (SCM) containing 0.1% synthetic yeast medium without uracil, 0.67% nitrogenous base without amino acids and 2% glucose, and used as precultures for 50 ml of medium YPD (2% glucose, 1% yeast extracts and 2% bacto-tryptone). These cultures for expression were grown at 30 ° C for 4 days.

Los sobrenadantes de los cultivos, que contenían la pro-quimosina secretada, fueron recogidos por centrifugación y sometidos a un proceso de activación con el fin de obtener la proteína madura. Este proceso consistió en una acidificación a pH 2 con 1 M de HCl e incubación a temperatura ambiente durante 3 horas, y neutralización a pH 6.2 con 1M de NaOH e incubación a temperatura ambiente. Los sobrenadantes así activados fueron utilizados como fuente enzimática para valorar la actividad coaguladora de la quimosina de cabra. Para ello se añadieron alícuotas de sobrenadantes que contenían de 0.5 a 1 \mug de proteína total, a una solución de 200 \mul de leche desnatada al 12% en 10 mM de CaCl_{2}. El ensayo se llevó a cabo en agitación suave y a 37ºC. Se comprobó la actividad proteolítica de la quimosina de cabra sobre la k-caseína, empleando k-caseína a una concentración de 1.5 mg/ml en 67 mM de NaH_{2}PO4 pH 6.8. Las reacciones se llevaron a cabo a 37ºC durante 3 horas. Las muestras fueron analizadas en SDS-PAGE. Como control se usó la quimosina bovina.The crop supernatants, which contained the secreted pro-chymosin, were collected by centrifugation and subjected to an activation process in order to Get the mature protein. This process consisted of a acidification at pH 2 with 1 M HCl and incubation at temperature ambient for 3 hours, and neutralization at pH 6.2 with 1M NaOH and incubation at room temperature. The supernatants as well activated were used as an enzymatic source to assess the coagulating activity of goat chymosin. To do this added aliquots of supernatants containing 0.5 to 1 µg of total protein, to a solution of 200 µl of milk 12% skimmed in 10 mM CaCl2. The test was carried out in gentle agitation and at 37 ° C. Proteolytic activity was checked. of goat chymosin on k-casein, using k-casein at a concentration of 1.5 mg / ml in 67 mM NaH2PO4 pH 6.8. The reactions led to out at 37 ° C for 3 hours. The samples were analyzed in SDS-PAGE. As a control, chymosin was used bovine

A continuación se ilustra más ampliamente la invención mediante los siguientes Ejemplos no limitativos:The following illustrates more fully the invention by the following non-limiting Examples:

Example 1 Construction of a vector for chymosin expression goat

Una secuencia que contiene la región codificante de la pro-quimosina de C. hircus fue amplificada por PCR utilizando Taq o Pfu ADN polimerasa y los cebadores específicos (Ecoqui5' y EcoQui3') que contenían el sitio EcoRI en los extremos 5'. El fragmento de ADN purificado y digerido con EcoRI fue clonado en el sitio EcoRI del plásmido de expresión pSPGK1, de tal manera que el segmento codificante para la pro-quimosina se encontraba en pauta de lectura con el péptido señal de la toxina "killer", bajo el control del promotor constitutivo y el terminador del gen PGK. El plásmido recombinante se purificó a partir de la cepa de E. coli XL-1 Blue y se introdujo en K lactis PM5-3C o en la cepa supersecretora K. lactis M\Delta2/1 sel1.A sequence containing the pro-chymosin coding region of C. hircus was amplified by PCR using Taq or Pfu DNA polymerase and the specific primers (Ecoqui5 'and EcoQui3') containing the EcoR I site at the 5 'ends. The DNA fragment purified and digested with EcoR I was cloned into the EcoR I site of the expression plasmid pSPGK1, such that the pro-chymosin coding segment was in reading pattern with the "killer toxin signal peptide"", under the control of the constitutive promoter and terminator of the PGK gene. The recombinant plasmid was purified from E. coli strain XL-1 Blue and introduced into K lactis PM5-3C or into the supersecretory strain K. lactis M Δ2 / 1 sel1.

Example 2 Production of goat chymosin using K lactis

La cepa PM5-3C o la cepa supersecretora de K lactis M\Delta2/1 sel1 transformada con el vector de secreción pQSec1 se creció en YPD a 30ºC durante 4 días. Después de centrifugar a 10.000 g durante 5 minutos y a 15.000 g durante 15 minutos, los sobrenadantes se sometieron a activación a pH 2 con 1M HCl durante 3 horas y neutralización a pH 6.2 con 1M de NaOH. Una vez neutralizados estos sobrenadantes se conservaron a 4ºC o a -20ºC hasta su utilización.The strain PM5-3C or the supersecretory strain of K lactis MΔ2 / 1 sel1 transformed with the secretion vector pQSec1 was grown in YPD at 30 ° C for 4 days. After centrifuging at 10,000 g for 5 minutes and 15,000 g for 15 minutes, the supernatants were subjected to activation at pH 2 with 1M HCl for 3 hours and neutralization at pH 6.2 with 1M NaOH. Once these supernatants were neutralized, they were stored at 4 ° C or -20 ° C until used.

Example 3 Milk coagulation using the recombinant chymosin of C. hircus

A la leche de cabra pasteurizada o leche de vaca desnatada se le añadió una alícuota de sobrenadante activado procedente de un cultivo de K. lactis PM5-3C o K lactis M\Delta2/1 sel1 transformada con el plásmido pQSec1. La incubación a 37ºC en agitación suave se prolongó hasta que se formó el coagulo.An aliquot of activated supernatant from a culture of K. lactis PM5-3C or K lactis M Δ2 / 1 sel1 transformed with plasmid pQSec1 was added to the pasteurized goat's milk or skimmed cow's milk. Incubation at 37 ° C under gentle agitation was prolonged until the clot formed.

<110> Claverie Martín, Félix<110> Claverie Martín, Felix

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Villar Hernández, Jesús

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Villar Hernández, Jesus

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Vega Hernández, María C

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Vega Hernández, María C

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<120> Procedimiento para producir quimosina caprina recombinante para la coagulación de la leche de cabra en la fabricación de queso<120> Procedure to produce recombinant goat chymosin for milk coagulation of goat in cheese making

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<130> 01-00001<130> 01-00001

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<140> P200402025<140> P200402025

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<141> 2004-07-30<141> 2004-07-30

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<160> 2<160> 2

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<170> PatentIn version 3.3<170> PatentIn version 3.3

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<213> Capra hircus <213> Capra hircus

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<221> sig_peptide<221> sig_peptide

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<222> (50)..(97)<222> (50) .. (97)

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<221> prosegment<221> prosegment

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<222> (98)..(226)<222> (98) .. (226)

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<301> Vega-Hernández MC, Gómez-Coello A, Villar J, Claverie-Martín F<301> Vega-Hernández MC, Gómez-Coello A, Villar J, Claverie-Martín F

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<302> Molecular cloning and expression in yeast of caprine prochymosin<302> Molecular cloning and expression in yeast of caprine prochymosin

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<303> J Biotechnol. 2004 oct 19;(1-2):69-79.<303> J Biotechnol. 2004 Oct 19; (1-2): 69-79.

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<304> 114<304> 114

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<307> 2004-10-19<307> 2004-10-19

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<308> PMID/15464600<308> PMID / 15464600

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<309> 2004-10-19<309> 2004-10-19

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<313> (50)..(1195)<313> (50) .. (1195)

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<400> 1<400> 1

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22

33

44

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<210> 2<210> 2

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<211> 381<211> 381

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<212> PRT<212> PRT

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<213> Capra hircus <213> Capra hircus

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<400> 2<400> 2

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Claims

1. Process for the production of pre-pro-chymosin, pro-chymosin or goat chymosin, which includes next steps:

(a) Cloning of the DNA encoding the caprine pre-pro-chymosin starting of RNA extracted from the abomasum of lactating kids.

(b) Cloning of the DNA encoding the pro-chymosin or goat chymosin.

(c) Construction of an expression vector that contain pre-pro-chymosin, pro-chymosin or goat chymosin with the sequences of DNA for protein expression.

(d) Transformation of a host cell with the expression vector.

(e) Growth of the transformed cell under conditions under which the coding sequence is expressed.

(f) Collection and activation of pre-pro-chymosin, Pro-chymosin and chymosin goats.

2. Method according to claim 1, in which the nucleotide sequence encodes a protein from merger containing the pre-pro-chymosin, Pro-chymosin and chymosin goats.

3. Process according to claim 2 in which the fusion protein contains the toxin signal peptide "killer" of yeasts.

4. Process according to claims 1-3 where the pre-pro-chymosin, pro-chymosin and chymosin caprines or a protein fusion is secreted through the cell membrane Guest.

5. Process according to claims 1-4, in which the microorganism used is Kluyveromyces lactis .

6. Process according to claims 1-5, in which the microorganism used is the strain Kluyveromyces lactis PM5-3C.

7. Process according to claims 1-5, in which the microorganism used is the strain Kluyveromyces lactis M Δ2 / 1 sel1.

8. Process according to claims 1-4, in which the microorganism used is Saccharomyces cerevisiae .

9. A DNA construct containing the sequence encoding a signal peptide for the secretion of pre-pro-chymosin, Pro-chymosin and chymosin goats.

10. A construction that contains a sequence encoder derived from the sequence of the pre-pro-chymosin, Pro-chymosin and chymosin goats.

11. A construction according to claim 10 where the coding sequence comes from a DNA sequence natural that has been modified in one or more substitutions of silent nucleotides

12. A host cell transformed with the DNA construction according to any of the claims 1-11.

13. Process to coagulate milk using recombinant kid's chymosin or any of the activities enzymatic obtained from the claims 1-12.

14. Process for making cheese that includes a milk coagulation process in which recombinant kid's chymosin is used or any of the enzymatic activities obtained from the claims
1-13.

15. Process according to claim 14, wherein goat, cow and / or sheep milk is used.