ES2245899B1 - Soporte solido para la union y/o sintesis quimica en fase solida y procedimiento de utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Soporte sólido para la unión y/o síntesis química en fase sólida y procedimiento de utilización. En la presente invención se describe la utilización de un polímero de poliimida como soporte sólido para, o bien inmovilizar moléculas sobre él o sintetizarlas in situ. Los compuestos pueden ser pegados directamente a la superficie del soporte o bien pueden ser activados con moléculas pequeñas que contengan grupos reactivos actuando como espaciadores o "conectores". Los sectores para los cuales la presente invención puede ser de interés son los relacionados con el desarrollo de un nuevo soporte para síntesis en fase sólida (incluyendo la introducción de materiales de partida), inmovilización de moléculas orgánicas (por ejemplo biopolímeros) y la utilización de estos soportes en arrays" y "microarrays".
Description
Soporte sólido para la unión y/o síntesis
química en fase sólida y procedimiento de utilización.
La presente invención está relacionada con la
utilización de un nuevo soporte para síntesis en fase sólida,
inmovilización de moléculas orgánicas y
bio-orgánicas y, la posibilidad de utilizarlo en la
fabricación de arrays (matrices) y microarrays (micromatrices). Más
particularmente, la presente invención se refiere a polímeros de
poliimida como soporte sólido, preferentemente polímeros de
poliimida aromática obtenidos por la condensación de dianhidridos
con diaminas.
En las dos últimas décadas la biotecnología ha
experimentado notables avances en el desarrollo de nuevas
tecnologías para aplicaciones médicas y biológicas. En este campo,
el esfuerzo por obtener mejores dispositivos de investigación ha
aumentado el interés por las aplicaciones de los "arrays"
(matrices) y "microarrays" (micromatrices). Los "arrays" y
"microarrays" son dispositivos con una alta densidad de
biopolímeros (por ejemplo oligonucleótidos, proteínas, péptidos,
oligosacáridos y otras pequeñas moléculas orgánicas. Algunas
aplicaciones específicas de estos dispositivos son el análisis de
mezclas complejas de moléculas, interacciones proteína- proteína,
proteína-ADN, investigación toxicológica,
descubrimiento de fármacos, etc.
El trabajo con "arrays" y
"microarrays" requiere la combinación de muchos componentes.
Algunos de los aspectos críticos son el soporte sólido y la forma
de inmovilizar las biomoléculas sobre dicho soporte. Hay dos vías
fundamentales para la inmovilización de biomoléculas sobre soportes
sólidos:
- a)
- el compuesto puede ser sintetizado "in situ" sobre la superficie del soporte sólido (utilizando técnicas de síntesis en fase sólida) o
- b)
- sintetizar el compuesto fuera del soporte sólido y unirlo posteriormente.
Cada metodología requiere soportes sólidos con
propiedades diferentes, pero, en general, el soporte sólido debe
mostrar un equilibrio entre una buena estabilidad bajo condiciones
extremadamente desfavorables y una moderada activación superficial
para pegar la molécula deseada o sus precursores.
La inmovilización de ADN en soportes sólidos
está siendo un tema muy importante en el desarrollo de sistemas de
ADN. Hay muy pocos ejemplos de fabricación de arrays en superficies
de plásticos. En general, la mayoría de los trabajos de unión de
ADN en este tipo de superficies se han realizado en el formato de
placas de microvaloración de 96 pocillos. En estos estudios se ha
descrito la inmovilización de ADN por adsorción pasiva, por
radiación de luz UV, por formación de enlaces covalentes con
moléculas adsorbidas previamente en la superficie del plástico o
por uniones covalentes a través de las bases nitrogenadas
modificadas.
Otra aproximación es modificar el soporte sólido
introduciendo grupos funcionales o un conector. Existen numerosos
ejemplos en los que se une el ADN de forma covalente a soportes de
poliestireno modificado con grupos funcionales reactivos como
hidroxilos, carboxilos, aminas, aldehidos, hidrazina, epóxidos,
maleimidas, tioles, etc (U.S. Pat. No 5,474,895). Sin embargo,
aunque estos soportes tienen una elevada capacidad de carga,
presentan altos niveles de adsorción inespecífica de los
oligonucleótidos. Más recientemente, se ha descrito la unión
covalente de moléculas de ADN modificado a soportes de
polipropileno activado superficialmente con grupos amino (U.S. Pat.
Nº 6,013,789), y a un polímero hidrofóbico especialmente diseñado
para ello (U.S. Pat. Nº 6,403,368).
El material más utilizado para la fabricación de
microarrays mediante síntesis in situ de oligonucleotidos es
el "vidrio de poro controlado" (Controlled Pore Glass, CPG.
U.S. Pat. Nº 4,458,066). Sin embargo este material inorgánico
presenta algunos problemas, entre los que se puede destacar su baja
capacidad de unión de oligonucleótidos y la posibilidad de obtención
de falsos rendimientos de acoplamiento. Se hace necesario por
tanto, la búsqueda de nuevos materiales, fundamentalmente de
naturaleza orgánica. Entre ellos se puede destacar el polipropileno
activado con grupos amino desarrollado por Beckman tanto para la
unión covalente de oligonucleótidos como para su síntesis in
situ (U.S. Pat. Nº 5,554,501).
Otro de los aspectos que hay que tener en cuenta
en el desarrollo de nuevos soportes sólidos que se pueden utilizar
en la fabricación de microarrays, es el método de detección de los
procesos que se quieren medir en cada caso. Una de las metodologías
más extendidas se basa en la medición de la fluorescencia sobre el
propio microarray. En general, los ensayos basados en la detección
de fluorescencia tienen muchas ventajas frente a otras técnicas,
gran sensibilidad y especificidad, posibilidad de detectar
simultáneamente varias respuestas, seguridad, simplificación de la
instrumentación, etc. Uno de los factores que afectan a la
sensibilidad de la detección de la señal fluorescente es el ruido
de fondo de la superficie sobre la que se está realizando la
detección, por lo que es necesario validar las propiedades ópticas
del soporte sólido utilizado.
\newpage
Recientemente se ha descrito la utilización de
medidas de conductividad en microarrays electroquímicos para la
detección de interacciones entre biomoléculas y/o moléculas
orgánicas (WO 0121635). La ventaja fundamental de este tipo de
técnica es que evita el marcaje de las muestras sin afectar a la
sensibilidad del proceso. Sin embargo, es necesario que el soporte
sólido presente ciertas propiedades conductoras.
Se hace necesario por lo tanto, el desarrollo de
nuevos soportes sólidos que combinen todas las propiedades
necesarias para la fabricación de microarrays que se adapten a los
continuos avances que tienen lugar en el campo de la
biotecnología.
El objeto de la presente invención es un soporte
sólido para la unión y/o síntesis química en fase sólida que
incluye una poliimida capaz de reaccionar con compuestos orgánicos
que contengan grupos nucleófilos en su estructura bajo condiciones
aptas para la formación de un enlace covalente entre ambos. La
poliimida incluye sustancias dopantes que modifican sus propiedades
mecánicas, ópticas, en particular disminuir la emisión de
fluorescencia, su conductividad eléctrica o su conductividad
térmica. Cuando la sustancia dopante es grafito, carbono o sus
derivados y la emisión de fluorescencia disminuye entre un 78% y un
95% respecto a la poliimida sin dopar.
La poliimida se forma mediante condensación de
anhídridos de ácido carboxílico bifuncionales con diaminas
aromáticas primarias seleccionándose los anhídridos entre los
siguientes: anhídrido maleico, anhídrido piromelítico, anhídrido
trimelítico, dianhidrido 2,3,6,7-naftalen
tetracarboxílico, dianhidrido 1,2,5,6-napftalen
tetracarboxílico, dianhidrido 2,2',3,3'-bifenil
tetracarboxílico, dianhidrido 3,3',4,4'-bifenil
tetracarboxílico, dianhidrido
bis(2,3-dicarboxifenil) metano, dianhidrido
bis(3,4-dicarboxifenil) metano, dianhidrido
1,1-bis(2,3-dicarboxifenil)
etano, dianhidrido 1,1-bis
(3,4-dicarboxifenil) etano, dianhidrido
2,2-bis(3,4-dicarboxifenil)
propano, dianhidrido bis(3,4-dicarboxifenil)
propano, dianhidrido 3,4,9,10-perilen
tetracarboxílico, dianhidrido 4,4'-oxidiftalico,
dianhidrido 3,3',4,4'- benzofenona tetracarboxílico, dianhidrido
bis(3,4-dicarboxifenil) sulfona y similares.
Las aminas aromáticas se seleccionan entre las siguientes:
o-diaminobenceno, m-diaminobenceno,
p-diaminobenceno, tolueno diamino,
1,5-diamino naftalene, benzidina,
3,3'-dicloro benzidina, metilendianilina,
2,2-bis(4-aminofenil)
propano, oxidianilina, 4,4'-diamino difenil sulfuro,
3,3'-diamino difenil sulfona,
4,4'-diamino difenil sulfona,
4,4'-diamino difenil N-metil amina,
4,4'-diamino difenil N-fenil amina,
4,4'-diamino difenil silano,
4,4'-diamino difenil dietilsilano, óxido de
4,4'-diamino difenil etil fosfina y similares.
Particularmente preferida es la poliimida formada mediante
condensación de anhídrido piromelítico (PMDA) y oxidianilina
(ODA).
La poliimida puede adoptar geometría diversa tal
como películas, membranas, filamentos, capilares, canales,
partículas, placas de microvaloración, espumas, hilos, mallas,
tamices, hojas, varillas o manguitos.
Constituye otro objeto de la presente invención
un procedimiento de utilización del soporte sólido que incluye una
poliimida que incluye las siguientes etapas:
- -
- poner en contacto la superficie del soporte sólido que tiene grupos imida reactivos con una disolución de un compuesto orgánico que tiene un grupo nucleófilo en su estructura bajo condiciones aptas para la formación de un enlace covalente entre ambos.
- -
- llevar a cabo el análisis objetivo de los compuestos unidos covalentemente al soporte sólido.
Alternativamente, el compuesto orgánico unido
covalentemente al soporte sólido constituye un producto de partida
para procesos de síntesis química que dan lugar al compuesto final
unido covalentemente a dicho soporte sólido. El enlace covalente se
produce entre los grupos nucleófilos del compuesto orgánico que se
va a unir y los carbonos carbonílicos del grupo imida de la
superficie del soporte sólido. La formación de dicho enlace
covalente entre el grupo nucleófilo del compuesto orgánico y la
superficie del soporte sólido da lugar a la apertura del grupo
imida generando enlaces amida repartidos homogéneamente a lo largo
de la superficie del soporte sólido.
El grupo nucleófilo del compuesto orgánico tiene
un par de electrones libres que son compartidos para formar un
nuevo enlace y se selecciona preferentemente entre aminas,
alcoholes, tioles, derivados de P, éteres y tío-éteres.
La disolución del compuesto orgánico puede ser
neutra o básica, en disolventes orgánicos o agua. Cuando las
disoluciones son básicas incluyen bases orgánicas o inorgánicas,
seleccionándose la base orgánica del grupo de aminas alifáticas
terciarias. Cuando la base es inorgánica se selecciona del grupo de
los carbonatos. Cuando el disolvente es orgánico se selecciona de
entre DMF, NMP, CH_{3}CN y MeOH.
Opcionalmente, los compuestos orgánicos incluyen
polímeros de interés biológico (biopolímeros), los productos de
partida necesarios para la síntesis de esos biopolímeros, y
pequeñas moléculas que se pueden utilizar como espaciadores y/o
conectores tanto para los biopolímeros como para los productos de
partida para realizar la síntesis en fase sólida. Los biopolímeros
incluyen péptidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, PNAs, LNAs,
proteínas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos, carbohidratos,
oligosacáridos y mezclas de los mismos y están modificados con un
grupo nucleófilo capaz de formar un enlace covalente con los grupos
imida de la superficie del soporte
sólido.
sólido.
Alternativamente, los biopolímeros están
modificados con un espaciador y/o conector que contiene un grupo
nucleófilo capaz de formar un enlace covalente con los grupos imida
de la superficie del soporte sólido o son los propios biopolímeros
los que están modificados con un grupo capaz de formar un enlace
covalente con el grupo reactivo del espaciador y/o conector unido
al soporte sólido.
Los posibles productos de partida para la
síntesis de biopolímeros incluyen aminoácidos, nucleósidos,
nucleótidos, monosacáridos y los monómeros y sus derivados que se
utilizan en la síntesis de dichos biopolímeros. Dichos productos de
partida están modificados con un grupo nucleófilo capaz de formar
un enlace covalente con los grupos imida de la superficie del
soporte sólido o bien con un espaciador y/o conector que contiene
un grupo nucleófilo capaz de formar un enlace covalente con los
grupos imida de la superficie del soporte sólido. Alternativamente,
los productos de partida están modificados con un grupo capaz de
formar un enlace covalente con el grupo reactivo del espaciador y/o
conector unido al soporte sólido. En este caso, los espaciadores
y/o conectores incluyen moléculas orgánicas con un grupo nucleófilo
que reacciona con la poliimida y otro grupo reactivo donde se une
covalentemente el biopolímero o su producto de partida.
Por último, también pueden los biopolímeros y
sus productos de partida estar modificados con un espaciador y/o
conector que contenga un grupo capaz de formar un enlace covalente
con el grupo reactivo del espaciador y/o conector unido al soporte
sólido.
El proceso de síntesis química que se lleva a
cabo sobre los productos de partida incluye las reacciones químicas
específicas para la obtención del compuesto orgánico de interés y
particularmente las reacciones químicas habituales en la síntesis
de oligonucleótidos.
Dicho proceso de síntesis química incluye uno o
varios ciclos que constan de:
- -
- desprotección de la posición sobre la que se va a elongar la cadena.
- -
- acoplamiento del monómero concreto en cada momento.
- -
- inactivación de las posiciones libres que no han reaccionado.
- -
- oxidación a fosfato.
Opcionalmente se lleva a cabo tras los ciclos de
elongación de la cadena la desprotección de las bases y/o la
separación del soporte sólido.
Sobre el soporte sólido de poliimida con
biomoléculas unidas covalentemente se realizan experimentos de
interacción entre los compuestos unidos y otras biomoléculas y/o
compuestos orgánicos. Dichas interacciones se pueden medir por
fluorescencia, radioactividad o cualquier otro método utilizado
habitualmente.
Los soportes sólidos pueden utilizarse para la
preparación de matrices ("arrays") y micromatrices
("microarrays") de ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos,
proteínas, polisacáridos, y cualquier tipo de librerías de
compuestos químicos ordenados.
La presente invención se refiere a un soporte
sólido formado por un polímero que contiene al menos un grupo
funcional imida capaz de reaccionar con compuestos orgánicos que
contengan grupos nucleófilos en su estructura bajo condiciones
aptas para la formación de un enlace covalente entre ambos. Dicho
polímero incluye sustancias dopantes que modifican sus propiedades
mecánicas, ópticas, su conductividad eléctrica o su conductividad
térmica y se forma mediante condensación de anhídridos de ácido
carboxílico bifuncionales con diaminas aromáticas
primarias.
primarias.
Además el polímero de la presente invención
podría estar dopado con diferentes sustancias que modificasen
alguna de sus propiedades químico-físicas. Entre
estas sustancias se encuentran el carbono, la alúmina, mezcla de
ambas, derivados de plata, oro o estaño, titanato de bario o
cualquier otra sustancia que modificase las propiedades ópticas,
mecánicas, la conductividad térmica o electrónica, etc.
La geometría que pueden adoptar dichos soportes
es diversa: películas, membranas, filamentos, capilares, canales,
partículas, placas de microvaloración, espumas, hilos, mallas,
tamices, hojas, varillas, manguitos, etc.
La metodología de la presente invención
aprovecha la reactividad química de los grupos funcionales imida
que contiene el polímero con un nucleófilo. Este tipo de reacciones
da lugar a la formación de un enlace covalente entre el soporte
sólido de poliimida y la molécula que contiene el grupo nucleófilo.
La formación del nuevo enlace provoca la apertura del grupo imida
generando enlaces amida en el soporte sólido. Los enlaces amida se
sitúan a lo largo de la superficie del polímero. Los grupos
nucleófilos reactivos pueden ser aminas, tioles, derivados de
fósforo, éteres, tioéteres, y otros similares bien conocidos.
Constituye igualmente objeto de la presente
invención el desarrollo de un procedimiento para unir a la
superficie de poliimida de un soporte sólido cualquier tipo de
molécula orgánica que posea funcionalidad química que la haga
comportarse como nucleófila. Como ejemplos de estas moléculas
pueden mencionarse: biopolímeros, monómeros de dichos biopolímeros,
moléculas orgánicas que hagan el papel de espaciadores o conectores
y en general cualesquiera otras moléculas orgánicas de interés.
Una vez unida la molécula orgánica al soporte
sólido, constituye otro objeto de la presente invención la
utilización del sistema para llevar a cabo síntesis química sobre
la molécula pegada. En relación con esto, dicha molécula pegada
puede ser usada como material de partida para la realización de
síntesis en fase sólida y/o como conector o espaciador para unir las
moléculas orgánicas referidas anteriormente. Este ciclo puede
llevarse a cabo todas las veces que se requiera.
La presente invención puede aplicarse a la
inmovilización sobre dichos polímeros de poliimida de ácidos
nucleicos, análogos de ácidos nucleicos como LNAs, PNAs,
polipéptidos, oligonucleótidos, proteínas, glicoproteínas, lípidos,
fosfolípidos, carbohidratos, oligosacáridos, y otras macromoléculas.
Más concretamente, la presente invención tiene como ejemplo de
aplicación preferente la síntesis in situ de
oligonucleotidos. Esta se puede llevar a cabo mediante dos
aproximaciones diferentes:
- unión directa al soporte sólido de un
nucleótido modificado con un grupo nucleófilo terminal.
- unión de un espaciador y/o conector con un
grupo nucleófilo en uno de los extremos y un grupo reactivo en el
otro. El grupo nucleófilo une la molécula al soporte sólido y el
grupo reactivo se unirá al nucleótido sobre el que se alongará la
cadena. El nucleótido podrá o no estar modificado para que
reaccione con el espaciador y/o conector.
En general y salvo que se indique otra cosa,
todos los términos científicos y técnicos que se emplean en este
documento tienen el mismo significado que lo que se entiende
habitualmente cuando se utilizan en entornos relacionados con la
química de polímeros, química orgánica, bioquímica y biología
molecular.
El soporte sólido de poliimida tiene suficiente
estabilidad térmica, compatibilidad con solventes y es químicamente
inerte frente a un amplio espectro de reactivos. En particular, el
polímero de poliimida es estable frente a todas las condiciones de
reacción requeridas en los distintos pasos de la síntesis de
oligonucleótidos.
Constituye un objeto de esta invención la
utilización de polímeros de poliimida como soportes sólidos óptimos
para la utilización de diversos métodos de detección de resultados.
Más concretamente, la utilización de poliimidas dopadas con
distintas sustancias, que se pueden incluir en la síntesis del
polímero de forma individual o como mezclas, que les confieran
distintas propiedades físico-químicas útiles en el
proceso de detección final. Alguna de las propiedades que se pueden
optimizar teniendo en cuenta la posterior aplicación del sistema
del que forma parte el soporte sólido, son: las propiedades
ópticas, la opacidad del sustrato aumenta la sensibilidad en la
detección de la fluorescencia; - la conductividad eléctrica,
pudiéndose utilizar el soporte en la fabricación de microarrays
electrónicos, etc.
Constituye el último objeto de la presente
invención el uso de estos soportes sólidos para la fabricación de
"arrays" y "microarrays" y para sus aplicaciones.
El presente ejemplo muestra la fluorescencia
(ruido de fondo) de 2 polímeros de poliimida medida en un Typhoon
9410 (Amersham Pharmacia Biotech). La tabla I presenta los valores
relativos de la fluorescencia (ruido de fondo) emitida por kapton®
HN (25 \mum) y kapton® CB (25 \mum), respecto a la
fluorescencia emitida por un portaobjetos de vidrio estándar (filas
1 y 2) y relacionándolas entre sí (fila 3). El valor por debajo de
1 de la razón entre el kapton® CB (25 \mum) y el vidrio indica su
menor fluorescencia en todas las combinaciones de radiaciones de
excitación y emisión usadas. Otras variantes de material como el
kapton® HN muestran mayor fluorescencia que el vidrio salvo cuando
se usa luz de excitación de 532 nm y se registra la luz emitida con
un filtro de 526 nm.
El presente ejemplo muestra como se puede
inmovilizar covalentemente un oligonucleótido sobre un polímero de
poliimida. Para realizar el ejemplo se puede obtener un
oligonucleótido sintético de 60 bases modificado en la posición 3'
con un grupo amino y se marca radiactivamente con ^{32}P. Una
lámina de kapton® CB de 25 \mum (DuPont) a temperatura ambiente,
se impregna con una disolución acuosa 0.16 mM del oligonucleótido
anterior. Pasadas 5 h se elimina la solución de la lámina, se lava
con agua 5 veces y se mide la radiactividad. La unión obtenida es
de 31.1 pmol/cm^{2}, lo que corresponde a una densidad de
moléculas de 1.87x10^{13} moléculas/cm^{2}.
Un oligonucleótido sintético de 60 bases
modificado en la posición 3' con un grupo amino, se marca
radiactivamente con ^{32}P. Se prepara una disolución 0.23 mM del
oligonucleótido marcado en tampón carbonato pH 8.5. Con esta
disolución se impregna una lámina de kapton® CB de 25 \mum
(DuPont). Pasadas 5 h se elimina la solución con el oligonucleótido
de la lámina, se lava con agua 5 veces y se mide la radiactividad
como indicación de las moléculas unidas a la superficie. La unión
obtenida es de 4.9 pmol/cm^{2}, lo que corresponde a una densidad
de moléculas de 2.97x10^{12} moléculas/cm^{2}.
El ejemplo siguiente presenta como se puede unir
a un sustrato de poliimida oligonucleótidos marcados. Sobre una
superficie de kapton® CB de 25 \mum (DuPont), se hace circular
una disolución 0.33 mM de
dT-Tamra-NH_{2} comercial en DMF
con un 0.09% DIPEA. Transcurridas 5 h se lava la lámina con DMF y
se mira la fluorescencia en un microscopio Leica DMR (modelo
DC-350F). Se obtiene una superficie repleta de
puntos fluorescentes discretos distribuidos homogéneamente por la
zona donde se hizo pasar la solución del oligonucleótido marcado.
Para descartar la adsorción se realiza el mismo experimento pero
sin añadir DIPEA a la disolución. En este caso no se observa nada
de fluorescencia en la superficie.
En un primer paso se sintetiza
dT-fluoresceína modificada en 3' con un grupo amino
a partir de dT-fluoresceína comercial. Sobre una
superficie de kapton® CB de 25 \mum (DuPont), se hace circular
una disolución 0.33 mM de
dT-fluoresceína-NH_{2} en DMF con
un 0.09% DIPEA. Transcurridas 5h se lava la lámina con DMF y se
mira la fluorescencia en un microscopio Leica DMR (modelo
DC-350F). Se obtiene una superficie fluorescente
homogénea en la zona dónde se hizo pasar la solución del
oligonucleótido marcado.
El siguiente ejemplo muestra como la unión al
sustrato de distintas moléculas puede hacerse a través de un
conector intermediario. Más concretamente, como puede unirse un
conector a la superficie del polímero de poliimida para
posteriormente realizar enlaces a las moléculas de interés, como
puede ser un oligonucleótido. Las láminas de kapton® HN 125 \mum
(DuPont) se sumergen, con agitación, en una disolución 10 mM de
N,N'-dimetil-1,6-hexanodiamina
en CH_{3}CN. Transcurridas 22 h 30 min, la superficie se lava con
CH_{3}CN, se secan a vacío y se guardan a 4ºC bajo argon.
Sobre el grupo amino introducido en el paso
anterior se lleva a cabo la reacción de acoplamiento de un
nucleótido mediante la aproximación del fosforamidito. Una lámina
de kapton "activado" según se ha explicado anteriormente, se
impregna con una disolución de dT-Tamra (1.4 mM) y
5-etiltio-1H-tetrazol
(9.25 mM) en CH_{3}CN. Transcurridos 30 min se lava la superficie
con MeOH y CH_{3}CN y se seca a vacío. Se impregna entonces la
lámina con una disolución 1 M de ^{t}BuOOH/CH_{3}CN con
agitación constante. Pasados 15 min, se lava con CH_{3}CN, se
seca a vacío y se mira en el microscopio de fluorescencia. Se
obtiene una superficie fluorescente homogénea en la zona donde se
hizo pasar la solución del oligonucleótido marcado.
El siguiente ejemplo muestra como puede
realizarse un proceso de síntesis, preferentemente de
oligonucleótidos sobre el sustrato de poliimida. Las reacciones se
llevan a cabo sobre las láminas de kapton® CB de 25 \mum de
espesor del ejemplo 5, a las que se ha unido a su superficie
dT-fluoresceína-NH_{2} preparada
sintéticamente. La lámina se introduce en un sistema fluídico
especialmente diseñado para el proyecto. Los reactivos circulan
sobre la muestra con flujo constante que puede ser diferente en cada
paso. Los pasos de reacción se realizan consecutivamente, bajo Argon
y separados por etapas de lavado con CH_{3}CN. Las condiciones de
reacción de cada paso se indican a continuación:
- -
- Desprotección del OH-5: 3% Cl_{2}CHCO_{2}H/(ClCH_{2})_{2}, 5 min
- -
- Acoplamiento: dT-tamra (1.4 mM), 5-etiltio-1H-tetrazol (9.2 mM) en CH_{3}CN, 20 min
- -
- Oxidación: 1 M tBuOOH en CH_{3}CN, 10 min
Tras el último lavado, se saca la lámina del
sistema y se mira la fluorescencia en condiciones de excitación y
detección específicas para la rodamina, que es el fluoróforo
introducido en el paso de elongación de la cadena. Se obtiene una
superficie con puntos fluorescentes discretos distribuidos
homogéneamente en la zona bañada por los reactivos.
El siguiente ejemplo muestra como puede
realizarse un proceso de hibridación y su posterior detección,
sobre el sustrato de poliimida. La hibridación se lleva a cabo
sobre las láminas de kapton® CB de 25 \mum de espesor a las que
se ha unido a su superficie un oligonucleótido de 60 bases
modificado con un grupo amino. En la hibridación se utilizan dos
oligonucleótidos diferentes de 40 bases cada uno: el antisense como
complementario del oligo previamente unido, y el sense como blanco
para detectar la adsorción. Ambos oligos están marcados con
^{32}P. La hibridación se realiza en 1 x SSC a 66ºC durante 14 h.
La radiactividad se detecta con un phosphoroimager (FUJI
FLA-3000) durante 24 h con el fin de visualizar los
resultados de la hibridación. En el experimento que se hibrida con
el oligonucleótido complementario se observan altos niveles de
radiactividad, mientras que en el que se hibrida con el
"sense" se observan niveles de ruido de fondo.
El siguiente ejemplo muestra como puede
realizarse un proceso de hibridación de oligonucleótidos y su
posterior detección con muestras biológicas, sobre el sustrato de
poliimida. La hibridación se lleva a cabo sobre dos láminas de
kapton® CB de 25 \mum de espesor a las que se ha unido a su
superficie los oligonucleótidos Gal1-NH_{2},
ACT1-NH_{2} respectivamente; una tercera lámina
de kapton® CB se utiliza como blanco. En la hibridación se utilizan
dos muestras de ARN provenientes del cultivo de una estirpe
silvestre de Saccharomyces cerevisiae en dos medios
diferentes, YPD (medio rico con glucosa, el gen GAL1 se encuentra
reprimido) e YPGAL (medio rico con galactosa, el gen GAL1 se
encuentra activado). Antes de su extracción el ARN se marca
radiactivamente tras permeabilizar las células y añadir UTP marcado
con ^{32}P en su fosfato \alpha.
\newpage
Cada uno de los fragmentos de kapton se dividió
en dos partes iguales, para hibridar una de ellos con la muestra
proveniente del cultivo crecido en YPD y la otra con la proveniente
de YPGAL. Tras una prehibridación realizada durante 1 h. a 65ºC en
un horno de hibridación rotatorio, se lleva a cabo la hibridación
con las muestras radiactivas durante 12 h (SSCIx, SDS 0'1%, tRNA
100 \mug/ml).
La radiactividad se detecta y cuantifica con un
phosphororimager FUJI FLA-3000. Los datos de
radiactividad, detraído en nivel de fondo, se muestran en la tabla
II y están representados en la figura 1.
El siguiente ejemplo muestra como puede
realizarse un proceso de unión de una proteína sobre el sustrato de
poliimida. Se prepara una disolución 1 mg/mL de BSA MaxiBind (Abkem
Iberia) en tampón borato pH 9.23 (Panreac). Con esta disolución se
impregna una lámina de kapton® CB de 25 \mum (DuPont). Pasadas 15
h a TA se elimina el líquido con la proteína, se lava 3 veces con
Tween-20 (1%) durante 30 seg y 3 veces con agua
durante 30 seg. La detección de la unión de la proteína a la
superficie del kapton® CB se realiza de forma indirecta por
fluorescencia.
Una lámina de Kapton con proteína unida a su
superficie obtenida según se ha explicado anteriormente, se sumerge
en una disolución de isotiocianato de fluoresceína en tampón borato
pH 9.23 (1 mg/mL). Pasados 75 min se elimina la disolución sobrante
y la lámina se lava con tampón borato pH 9.23 y agua. La
fluorescencia se mide en un microscopio Leica DMR (modelo
DC-350F), obteniéndose una superficie fluorescente
en la zona que estuvo en contacto con la proteína.
Como blanco se utiliza una lámina de kapton® CB
de 25 \mum (DuPont) sometida al mismo proceso de unión del
isotiocianato de fluoresceína. En este caso, en el que la lámina no
ha estado en contacto con la proteína, no se observa fluorescencia
en el microscopio en las mismas condiciones utilizadas
anteriormente.
Claims (37)
1. Soporte sólido para la unión y/o síntesis
química en fase sólida que incluye una poliimida capaz de
reaccionar con compuestos orgánicos que contengan grupos
nucleófilos en su estructura bajo condiciones aptas para la
formación de un enlace covalente entre ambos y caracterizado
porque la poliimida incluye sustancias dopantes que modifican sus
propiedades mecánicas, ópticas, su conductividad eléctrica o su
conductividad térmica.
2. Soporte sólido para la unión y/o síntesis
química en fase sólida según la reivindicación 1,
caracterizado porque la poliimida incluye una sustancia
dopante que permite disminuir la emisión de fluorescencia.
3. Soporte sólido para la unión y/o síntesis
química en fase sólida según la reivindicación 2,
caracterizado porque cuando la sustancia dopante es grafito,
carbono o sus derivados y la emisión de fluorescencia disminuye
entre un 78% y un 95% respecto a la poliimida sin dopar.
4. Soporte sólido para la unión y/o síntesis
química en fase sólida según las reivindicaciones
1-3, caracterizado porque la poliimida se
forma mediante condensación de anhídridos de ácido carboxílico
bifuncionales con diaminas aromáticas primarias.
5. Soporte sólido para la unión y/o síntesis
química en fase sólida según la reivindicación 4,
caracterizado porque los anhídridos se seleccionan entre los
siguientes: anhídrido maleico, anhídrido piromelítico, anhídrido
trimelítico, dianhidrido 2,3,6,7-naftalen
tetracarboxílico, dianhidrido 1,2,5,6-napftalen
tetracarboxílico, dianhidrido 2,2',3,3'-bifenil
tetracarboxílico, dianhidrido 3,3',4,4'-bifenil
tetracarboxílico, dianhidrido
bis(2,3-dicarboxifenil) metano, dianhidrido
bis(3,4-dicarboxifenil) metano, dianhidrido
1,1-bis(2,3- dicarboxifenil) etano,
dianhidrido
1,1-bis(3,4-dicarboxifenil)
etano, dianhidrido
2,2-bis(3,4-dicarboxifenil)
propano, dianhidrido bis(3,4-dicarboxifenil)
propano, dianhidrido 3,4,9,10-perilen
tetracarboxílico, dianhidrido 4,4'-oxidiftalico,
dianhidrido 3,3',4,4'-benzofenona tetracarboxílico,
dianhidrido bis(3,4-dicarboxifenil) sulfona
y similares.
6. Soporte sólido para la unión y/o síntesis
química en fase sólida según la reivindicación 4.,
caracterizado porque las aminas aromáticas se seleccionan
entre los siguientes: o-diaminobenceno,
m-diaminobenceno, p-diaminobenceno, tolueno diamino,
1,5-diamino naftalene, benzidina,
3,3'-dicloro benzidina, metilendianilina,
2,2-bis(4-aminofenil)
propano, oxidianilina, 4,4'-diamino difenil
sulfuro, 3,3'-diamino difenil sulfona,
4,4'-diamino difenil sulfona,
4,4'-diamino difenil N-metil amina,,
4,4'-diamino difenil N-fenil
amina, 4,4'-diamino difenil silano,
4,4'-diamino difenil dietilsilano, óxido de
4,4'-diamino difenil etil fosfina y similares.
7. Soporte sólido para la unión y/o síntesis
química en fase sólida según las reivindicaciones
4-6, caracterizado porque la poliimida se
forma mediante condensación de anhídrido piromelítico (PMDA) y
oxidianilina (ODA).
8. Soporte sólido para la unión y/o síntesis
química en fase sólida según las reivindicaciones
1-7, caracterizado porque la poliimida puede
adoptar geometría diversa tal como películas, membranas,
filamentos, capilares, canales, partículas, placas de
microvaloración, espumas, hilos, mallas, tamices, hojas, varillas o
manguitos.
9. Procedimiento de utilización del soporte
sólido que incluye una poliimida según las reivindicaciones
1-8, caracterizado porque incluye las
siguientes etapas:
- -
- poner en contacto la superficie del soporte sólido que tiene grupos imida reactivos con una disolución de un compuesto orgánico que tiene un grupo nucleófilo en su estructura bajo condiciones aptas para la formación de un enlace covalente entre ambos.
- -
- llevar a cabo el análisis objetivo de los compuestos unidos covalentemente al soporte sólido.
10. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 9, caracterizado porque el
compuesto orgánico unido covalentemente al soporte sólido
constituye un producto de partida para procesos de síntesis química
que den lugar al compuesto final unido covalentemente a dicho
soporte sólido.
11. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 9, caracterizado porque el
enlace covalente se produce entre los grupos nucleófilos del
compuesto orgánico que se va a unir y los carbonos carbonílicos del
grupo imida de la superficie del soporte sólido.
12. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según las reivindicaciones 9 y 11, caracterizado
porque la formación del enlace covalente entre el grupo nucleófilo
del compuesto orgánico y la superficie del soporte sólido da lugar
a la apertura del grupo imida generando enlaces amida repartidos
homogéneamente a lo largo de la superficie del soporte sólido.
13. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según las reivindicaciones 9, 11 y 12 caracterizado
porque el grupo nucleófilo del compuesto orgánico tiene un par de
electrones libres que son compartidos para formar un nuevo
enlace.
14. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 13, caracterizado porque el
grupo nucleófilo se selecciona preferentemente entre aminas,
alcoholes, tioles, derivados de P, éteres y tío-éteres.
15. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 9, caracterizado porque la
disolución del compuesto orgánico puede ser neutra o básica, en
disolventes orgánicos o agua.
16. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 15, caracterizado porque las
disoluciones básicas incluyen bases orgánicas o inorgánicas.
17. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 16, caracterizado porque la
base orgánica se selecciona del grupo de aminas alifáticas
terciarias.
18. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 16, caracterizado porque la
base inorgánica se selecciona del grupo de los carbonatos.
19. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 15, caracterizado porque el
disolvente orgánico se selecciona de entre DMF, NMP, CH_{3}CN y
MeOH.
20. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado
porque los compuestos orgánicos incluyen polímeros de interés
biológico (biopolímeros), los productos de partida necesarios para
la síntesis de esos biopolímeros, y pequeñas moléculas que se
pueden utilizar como espaciadores y/o conectores tanto para los
biopolímeros como para los productos de partida para realizar la
síntesis en fase sólida.
21. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 20, caracterizado porque los
biopolímeros incluyen péptidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos,
PNAs, LNAs, proteínas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos,
carbohidratos, oligosacáridos y mezclas de los mismos.
22. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 21, caracterizado porque los
biopolímeros están modificados con un grupo nucleófilo capaz de
formar un enlace covalente con los grupos imida de la superficie
del soporte sólido.
23. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 21, caracterizado porque los
biopolímeros están modificados con un espaciador y/o conector que
contiene un grupo nucleófilo capaz de formar un enlace covalente
con los grupos imida de la superficie del soporte sólido.
24. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 21, caracterizado porque los
biopolímeros están modificados con un grupo capaz de formar un
enlace covalente con el grupo reactivo del espaciador y/o conector
unido al soporte sólido.
25. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 20, caracterizado porque los
productos de partida incluyen aminoácidos, nucleósidos,
nucleótidos, monosacáridos y los monómeros y sus derivados que se
utilizan en la síntesis de dichos biopolímeros.
26. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 25, caracterizado porque los
productos de partida están modificados con un grupo nucleófilo
capaz de formar un enlace covalente con los grupos imida de la
superficie del soporte sólido.
27. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 25, caracterizado porque los
productos de partida están modificados con un espaciador y/o
conector que contiene un grupo nucleófilo capaz de formar un enlace
covalente con los grupos imida de la superficie del soporte
sólido.
28. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 25, caracterizado porque los
productos de partida están modificados con un grupo capaz de formar
un enlace covalente con el grupo reactivo del espaciador y/o
conector unido al soporte sólido.
29. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 20, caracterizado porque los
espaciadores y/o conectores incluyen moléculas orgánicas con un
grupo nucleófilo que reacciona con la poliimida y otro grupo
reactivo donde se une covalentemente el biopolímero o su producto
de partida.
30. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según las reivindicaciones 23 y 27 caracterizado
porque los biopolímeros y sus productos de partida están
modificados con un espaciador y/o conector que contiene un grupo
capaz de formar un enlace covalente con el grupo reactivo del
espaciador y/o conector unido al soporte sólido.
31. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 10, caracterizado porque el
proceso de síntesis química que se lleva a cabo sobre los productos
de partida incluye las reacciones químicas específicas para la
obtención del compuesto orgánico de interés.
\newpage
32. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 31, caracterizado porque el
proceso de síntesis química incluye las reacciones químicas
habituales en la síntesis de oligonucleótidos.
33. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 31, caracterizado porque el
proceso de síntesis química incluye uno o varios ciclos que constan
de:
- -
- desprotección de la posición sobre la que se va a elongar la cadena.
- -
- acoplamiento del monómero concreto en cada momento.
- -
- inactivación de las posiciones libres que no han reaccionado.
- -
- oxidación a fosfato.
34. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 33, caracterizado porque
opcionalmente se lleva a cabo tras los ciclos de elongación de la
cadena la desprotección de las bases y/o la separación del soporte
sólido.
35. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según las reivindicaciones 9-34,
caracterizado porque sobre el soporte sólido de poliimida
con biomoléculas unidas covalentemente se realizan experimentos de
interacción entre los compuestos unidos y otras biomoléculas y/o
compuestos orgánicos.
36. Procedimiento de utilización del soporte
sólido según la reivindicación 35, caracterizado porque esas
interacciones se pueden medir por fluorescencia, radioactividad o
cualquier otro método utilizado habitualmente.
37. Procedimiento de utilización de un soporte
sólido según las reivindicaciones 9 a 36 para la preparación de
matrices ("arrays") y micromatrices ("microarrays") de
ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, proteínas, polisacáridos,
y cualquier tipo de librerías de compuestos químicos ordenados.
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