ES2239230T3 - Metodo de ensayo para el factor de activacion de plaquetas. - Google Patents
Metodo de ensayo para el factor de activacion de plaquetas.Info
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Abstract
Un método para tratar una muestra biológica para medir la cantidad de factor de activación de plaquetas (PAF) representado por la siguiente fórmula: donde R1 es un grupo hidrocarburo no cíclico saturado o insaturado o un grupo acilo derivado de un ácido graso saturado o insaturado, y R3 es fosfocolina, fosfoetanolamina, fosfomonometiletanolamina o fosfodimetiletanolamina, contenido en dicha muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de a) mezclar la muestra biológica con un disolvente orgánico soluble en agua y separar la mezcla por centrifugación, b) extraer el PAF contenido en el sobrenadante obtenido de dicha centrifugación con un disolvente orgánico insoluble en agua; y c) introducir el PAF extraído en el disolvente orgánico insoluble en agua en una columna en fase sólida de gel de sílice directamente o después de ajustar a una concentración apropiada, y realizar el lavado y la elución con una mezcla de hexano/2-propanol/agua para purificar el PAF en muestras biológicas.
Description
Método de ensayo para el factor de activación de
plaquetas.
La presente invención se refiere a un método de
ensayo para PAF por el que PAF se ensaya de un modo altamente
eficaz y específico en base a la extracción selectiva y
purificación de PAF de una muestra biológica, seguido por un método
de cromatografía de gases-espectrometría de masas
(GC-MS) y un método de cromatografía
líquida-espectrometría de masas
(LC-MS). El método de la invención puede usarse
para medir concentraciones de PAF en muestras biológicas para
dilucidar el papel de PAF en diversas afecciones patológicas.
Además, se espera que facilite el diagnóstico de diversas
enfermedades asociadas con la fluctuación de PAF, contribuyendo
también a la evaluación de los efectos terapéuticos en las
enfermedades anteriores.
PAF se descubrió en 1972 como un factor humoral
de activación de plaquetas que se libera de basófilos de conejo
sensibilizados con IgE por estimulación antigénica, y la estructura
de PAF obtenida de basófilos de conejo en 1972 se determinó que era
1-O-alquil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina.
Desde entonces se ha intentado detectar y ensayar PAF de diversas
muestras biológicas, y en la presente fase se han identificado las
diversas especies moleculares en la familia PAF.
PAF se expresa mediante la siguiente fórmula.
(donde R_{1} es un grupo
hidrocarburo no cíclico saturado o insaturado o un grupo acilo
derivado de un ácido graso saturado o insaturado, y R_{3} es
fosfocolina, fosfoetanolamina, fosfomonometiletanolamina o
fosfodimetiletanolamina). Por tanto, PAF es un tipo de fosfolípido,
que tiene una estructura donde un grupo hidrocarburo no cíclico
saturado o insaturado o un grupo acilo derivado de un ácido graso
saturado o insaturado está unido al átomo de oxígeno en el C1 de la
estructura glicerol para formar un enlace éter, éster o viniléter,
y un grupo acetilo se une a él en el C2, y fosfocolina,
fosfoetanolamina, fosfomonometiletanolamina o
fosfodimetiletanolamina se une a él en el C3. Los grupos
hidrocarburo no cíclicos saturados o insaturados o grupos ácidos
derivados de ácidos grasos saturados o insaturados en el carbono C1
se sabe que tienen 12-18 átomos de carbono. Se ha
sabido que cada una de las especies moleculares muestra su
actividad biológica diferente, y
1-O-hexadecil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina
(C_{16}-PAF) muestra la actividad biológica más
fuerte entre estas especies moleculares. Las funciones fisiológicas
principales de PAF son la activación de plaquetas, la migración y
activación de leucocitos, promoción de la permeabilidad vascular y
similares, y se cree que es un factor que contribuye a los síntomas
alérgicos tales como asma bronquial, choque por endotoxinas y
diversas afecciones inflamatorias. Para determinar claramente si
PAF está implicado o no en estos síntomas, es indispensable medir
las concentraciones de PAF en muestras biológicas tomadas de
pacientes con estos síntomas, y después examinar las fluctuaciones
en esas concentraciones. Sin embargo, es difícil ensayar PAF debido
a las concentraciones extremadamente bajas de PAF en muestras
biológicas y la coexistencia de altas concentraciones de
componentes biológicos con estructuras muy similares a PAF y, por
lo tanto, actualmente aún no se ha dilucidado la implicación de PAF
en diversas
afecciones.
Los métodos para ensayar PAF de los que se ha
informado hasta ahora se han clasificado principalmente en tres
categorías: métodos de ensayo de actividad biológica, métodos de
ensayo inmunológicos y métodos de ensayo fisicoquímicos tales como
métodos GC-MS y LC-MS ("Kesshoban
Kasseika Inshi" Platelet-Activating Factor],
Gendai Kaguku, Edición Especial 17, 25-34, 1989).
Casi todos los métodos de ensayo de actividad biológica están
basados en la agregación plaquetaria. Sin embargo, como hay
componentes biológicos que también muestran agregación plaquetaria
aparte de PAF, aunque las diferencias en las especies moleculares
de PAF dan lugar a diferentes actividades de agregación plaquetaria,
actualmente no es posible determinar específicamente PAF por
métodos de ensayo de actividad biológica. Con métodos de ensayo
inmunológicos, como la fosfatidilcolina (PC) y la
lisofosfatidilcolina (LysoPC), que tienen estructuras muy similares
a PAF, también coexisten en las muestras biológicas con altas
concentraciones, y estos fosfolípidos dan lugar a la reacción
cruzada con el anticuerpo frente a PAF, no se ha podido conseguir
ensayar PAF de manera precisa y segura en muestras biológicas por
el uso de métodos de ensayo inmunológicos.
Con respecto a los métodos de ensayo
fisicoquímicos, Ramesha C.M. et al. han desarrollado un
método altamente sensible para cuantificar PAF por
GC-MS (Biomed. Environ. Mass Spectrom. 13,
107-111, 1986). Hidrolizaron el grupo fosfocolina
en el C3 de C_{16}-PAF usando fosfolipasa C, y
después introdujeron un grupo pentafluorobenzoílo en el grupo
hidroxilo del compuesto glicerol resultante, y lo sometieron a
análisis GC-MS. Como este método permite la
detección de PAF con alta sensibilidad, muchos investigadores han
usado este método para cuantificar PAF por
GC-MS.
GC-MS.
Sin embargo, incluso aplicando este método
GC-MS al ensayo de concentraciones de
C_{16}-PAF en muestras biológicas, las
concentraciones de C_{16}-PAF en muestras
biológicas tales como sangre, de las que se ha informado hasta
ahora, han sido mucho más altas que los niveles reales a causa de
los fosfolípidos contaminantes que no pueden retirarse
completamente. Por tanto, la situación actual es que no hay método
práctico desarrollado para medir concentraciones de PAF en muestras
biológicas y, por lo tanto, se desea el desarrollo de un método de
ensayo de PAF con alta sensibilidad y alta especificidad.
La presente invención resuelve los problemas
descritos anteriormente, y su objeto es proporcionar un método
altamente sensible, altamente específico para la cuantificación de
PAF en cualquier muestra que se sospeche que contiene incluso
análogos de PAF, tales como muestras biológicas (en adelante estas
se mencionaran colectivamente como simplemente "muestras
biológicas"), por el método GC-MS y método
LC-MS altamente reproducible y fiable.
Más específicamente, la invención proporciona un
sistema de disolvente que extrae PAF de muestras biológicas con
eficacia máxima para análisis.
La invención también proporciona un método para
retirar eficazmente análogos de PAF de muestras biológicas usando
una columna de gel de sílice y lavando y eluyendo específicamente
las soluciones.
La invención también proporciona adicionalmente
un método para hidrolizar selectivamente PAF en una muestra
biológica en la que coexiste LysoPC, que no se retira por la
columna de gel de sílice mencionada anteriormente, usando
fosfolipasa C y volviendo a separar el compuesto glicerol resultante
del LysoPC no cambiado, en el caso de que el método
GC-MS se emplee en el análisis.
La invención también proporciona adicionalmente
un método para la reacción de hidrólisis de PAF con fosfolipasa C,
de modo que en la acción de pentafluorobenzoílo para el análisis
del compuesto glicerol por cromatografía de gases, el derivado
resultante no incluya los isómeros mostrados en las figuras
4-B, C, y D.
La invención también proporciona adicionalmente
un método LC-MS para medir PAF en una muestra
biológica, de manera rápida y segura, con una alta sensibilidad y
sin ningún pretratamiento adicional de la muestra biológica, después
de retirar los análogos de PAF de la muestra biológica por uso de
la columna de gel de sílice mencionada anteriormente, con la
combinación específica de los disolventes de lavado y elución.
Figura 1. Registros de cromatografía de
gases-monitorización selectiva de iones
(GC-SIM) que verifica la uniformidad del pico de PAF
obtenido de la muestra de sangre humana del Ejemplo 3 por su
tratamiento con rhPAF-AH.
Figura 2. Registros de GC-SIM que
comparan el método de extracción de la invención de acuerdo con el
Ejemplo 4 con el de Bligh y Dyer (metanol/cloroformo/agua).
Figura 3. Registros de GC-SIM que
comparan el método de purificación de la invención de acuerdo con
el Ejemplo 5 usando una columna en fase sólida normal con el de
Weintraub, S.T. et al.
Figura 4. Registros de GC-SIM que
muestran la producción del isómero por la dependencia del pH de los
medios de incubación para hidrolizar PAF con fosfolipasa C de
acuerdo con el Ejemplo 6.
Figura 5. Curva de calibración para cuantificar
la concentración de PAF de sangre humana en el intervalo de
0-181 pg/ml, y para estimar el nivel en sangre de
PAF endógeno en el intervalo de 0-20,2 pg/ml de
acuerdo con el Ejemplo 7.
Figura 6. Registros de cromatografía
líquida-monitorización selectiva de reacción que
mide PAF en sangre humana de acuerdo con el Ejemplo 8.
La presente invención puede aplicarse como método
de ensayo de PAF para métodos de ensayo de actividad biológica,
métodos de ensayos inmunológicos o métodos de ensayo
fisicoquímicos, pero se prefieren los métodos GC-MS
y métodos LC-MS debido a la alta sensibilidad y
especificidad.
\newpage
Para ensayar PAF en una muestra biológica primero
es necesario extraer de manera eficaz el PAF de la muestra y
después separar de manera adecuada los análogos de PAF
coexistentes.
Específicamente, cuando se extrae el PAF de la
muestra biológica, se supone que también pueden coexistir grandes
cantidades de componentes biológicos además de PAF. Por lo tanto,
en la etapa de purificación adicional del extracto con una columna
de extracción en fase sólida o similares, es necesario la
optimización de las condiciones de lavado y elución para separar
PAF de análogos de PAF. Por ejemplo, el método de Yamada K. et
al. descrito en J. Chromatogr. 433,
243-247, 1988, adopta el método de Bligh y Dyer
(Can. J. Biochem. 37, 911-917, 1959), que se
ha usado exclusivamente en la técnica anterior como método de
extracción de fosfolípidos, donde se añade metanol y se mezcla con
la sangre, y después de centrifugación, se añade cloroformo al
sobrenadante y se separa la fase inferior. Después, se usa una
columna de extracción en fase sólida normal para purificar el PAF
usando soluciones de lavado y elución basadas en
cloroformo/metanol/agua. Sin embargo, se ha demostrado que se
extraen numerosos componentes biológicos además de PAF por este
método, y que la separación y purificación inadecuada de PAF de sus
análogos da como resultado una sobreestimación de concentraciones
de PAF en sangre humana de 10-30 pg/ml, que es
superior a los niveles reales.
Por tanto, la primera etapa fue investigar
activamente sistemas de disolvente para la extracción eficaz de PAF
de muestras biológicas, y métodos de purificación para la
purificación adicional de los extractos para retirar completamente
los análogos de PAF.
Se ha demostrado adicionalmente que, en caso de
cuantificación de PAF por un método GC-MS, la
precisión y exactitud de un ensayo de PAF se ve enormemente
afectado por las condiciones de reacción para la hidrólisis con
fosfolipasa C de PAF que se ha extraído y purificado de una muestra
biológica. Los métodos más convencionales han ajustado el pH de la
reacción a neutro o en el intervalo ligeramente alcalino. Sin
embargo, se ha descubierto que cuando el pH de la solución de
reacción es neutro o ligeramente alcalino, se producen isómeros
durante la hidrólisis de PAF, y esto no sólo disminuye el
rendimiento del compuesto glicerol de PAF, sino como también se
producen isómeros de componentes biológicos además de PAF, aparecen
numerosos picos de interferencia, que complican adicionalmente el
análisis de PAF.
También se ha descubierto que el tratamiento con
fosfolipasa C también produce los mismos compuestos glicerol de
análogos de PAF (fosfolípidos que tienen la fosfocolina en la
posición C3 reemplazada con fosfoetanolamina,
fosfomonometiletanolamina o fosfodimetiletanolamina) como obtenidos
de PAF, y que estos también tienen una influencia significativa en
la precisión de medida, dando como resultado una sobreestimación de
las concentraciones de PAF.
La presente invención se completó en base a estos
descubrimientos, y comprende las siguientes etapas.
(1) Mezclar una muestra para ensayar su
concentración de PAF (por ejemplo, una muestra que se sospecha que
también contiene análogos de PAF, y especialmente una muestra
biológica) con un disolvente orgánico soluble en agua, tal como
tetrahidrofurano, como disolvente completamente diferente del usado
para el método de Bligh y Dyer, y conseguir la separación por
centrifugación o similares;
(2) Añadir un disolvente orgánico insoluble en
agua, tal como acetato de etilo, al sobrenadante obtenido de la
separación, y realizar la separación por centrifugación o similares
para extraer el PAF en el sobrenadante con un rendimiento alto;
(3) Cargar el extracto en una columna de
extracción en fase sólida de gel de sílice o similares
(preferiblemente una columna de extracción en fase sólida normal)
para purificar PAF del extracto, y después realizar un lavado y
elución con una mezcla hexano/2-propanol/agua para
purificar el PAF y separarlo de los análogos de PAF
coexistentes.
(4) Cuando se emplea un método
GC-MS para la cuantificación, hidrolizar el PAF
purificado con fosfolipasa C, preferiblemente en condiciones en las
que no se hidroliza LysoPC;
(5) Separar el PAF hidrolizado de los compuestos
no hidrolizados (por ejemplo, LysoPC no hidrolizado);
(6) Convertir el compuesto glicerol producido por
la hidrólisis a un derivado pentafluorobenzoílo y después
cuantificar su cantidad por GC-MS;
(6') Cuando se emplea un método
LC-MS para la cuantificación, el PAF purificado de
la etapa (3) se somete al método LC-MS sin
purificación adicional; y
(7) Si es necesario, compararlo con una curva de
calibrado obtenida sometiendo una concentración conocida de PAF a
las etapas (1) a (6), para cuantificar la cantidad de PAF en la
muestra.
Como muestras a ensayar por el método de la
invención pueden mencionarse muestras biológicas tales como fluidos
biológicos (sangre, suero, plasma, saliva, orina, bilis, jugo
pancreático, etc) y tejidos. Como la sangre es más fácilmente
obtenible y útil para el diagnóstico de enfermedades entre dichas
muestras, los ejemplos que usan sangre se mencionarán principalmente
para explicar el modo preferido de la invención.
De acuerdo con la invención, se usa una
combinación de un disolvente orgánico soluble en agua y un
disolvente orgánico insoluble en agua para la extracción de alto
rendimiento de PAF de sangre.
El tetrahidrofurano es ideal como disolvente
soluble en agua porque inactiva rápidamente la PAF acetilhidrolasa
en sangre y permite la completa recuperación del PAF en el
sobrenadante obtenido por centrifugación de la muestra. El
tetrahidrofurano usado preferiblemente tiene los peróxidos
retirados. Como alternativa, puede usarse acetonitrilo,
2-propanol, dioxano, acetona, etanol o similares
como disolvente orgánico soluble en agua. La muestra y el disolvente
orgánico soluble en agua se mezclan en una proporción de volumen de
aproximadamente 1:1-1:10 y se agita a temperatura
ambiente durante aproximadamente 30 segundos, y después se
centrifuga la mezcla (por ejemplo, 3000 rpm, 15 minutos, 4ºC) y se
obtiene el sobrenadante.
Como los componentes sanguíneos solubles en agua
excepto PAF están incluidos en el extracto obtenido con el
disolvente orgánico soluble en agua (en el sobrenadante después de
centrifugación), se añade un disolvente orgánico insoluble en agua
para retirar los componentes sanguíneos solubles en agua. Los
disolventes orgánicos apropiados incluyen hexano, ciclohexano,
xileno, tolueno, benceno, éter dietílico, acetato de etilo y
similares. Cuando se añade el disolvente orgánico insoluble en agua
al extracto de tetrahidrofurano mencionado anteriormente y se
mezcla y se centrifuga la mezcla, PAF se recupera casi
cuantitativamente en el sobrenadante, con los componentes sanguíneos
solubles en agua migrando a la fase inferior, permitiendo de este
modo la separación de PAF de los componentes sanguíneos solubles en
agua. El extracto de disolvente orgánico soluble en agua y el
disolvente orgánico insoluble en agua se mezclan en una proporción
de volumen de aproximadamente 1:0,5-1:10 y se agita
a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 segundos, y
después se centrifugan (por ejemplo, 3000 rpm, 15 min, 4ºC) para
obtener el extracto de PAF.
En la combinación del disolvente orgánico soluble
en agua y el disolvente orgánico insoluble en agua de la invención,
el tetrahidrofurano como el disolvente orgánico soluble en agua
mejora drásticamente el rendimiento de extracción de PAF de una
mezcla en comparación con el disolvente empleado en el método de
Bligh y Dyer, que es una combinación de metanol, cloroformo y agua,
y se ha usado por el método de Yamada et al. (J. Chromatogr.
433, 243-247, 1988),
El PAF en el extracto después se purifica con una
columna de extracción en fase sólida. La columna usada es
preferiblemente una columna en gel de sílice de tipo de fase normal
y, por ejemplo, puede usarse el producto Bond Elut SI^{TM}
disponible en el mercado. Como resultado de la investigación de los
disolventes de lavado de columna y disolventes de elución, se ha
descubierto que realizar el lavado y la elución con una mezcla de
hexano/2-propanol/agua como disolvente de lavado de
columna y disolvente de elución es eficaz para la purificación
selectiva de PAF. La proporción preferida para
n-hexano/2-propanol/agua es
1/0,5-1/0,05-0,2 para la etapa de
lavado y 1/2-20/0,2-2 para la etapa
de elución.
La selección de este sistema de disolvente
permite separar los análogos de PAF de un modo mucho más
satisfactorio que por purificación de PAF con la solución de lavado
y la solución de elución basadas en cloroformo/metanol/agua usados
en el método de Yamada K. et al. (J. Chomatogr. 433,
243-247, 1988). Además, como el sobrenadante del
disolvente orgánico insoluble en agua puede cargarse directamente
en la columna de extracción en fase sólida de la etapa (2)
anterior, se puede mejorar enormemente la eficacia de la
operación.
Puede usarse el método de extracción y
purificación para medición usando métodos de ensayo de actividad
biológica, métodos de ensayo inmunológicos y métodos de ensayo
fisicoquímicos incluyendo LC-MS. Para la medición
por GC-MS que tiene sensibilidad y especificidad
superiores, es necesario el siguiente tratamiento adicional.
El PAF purificado por (3) anterior se trata con
fosfolipasa C para hidrolizar la fosfocolina en la posición C3 de
PAF para convertirlo en un derivado volátil apropiado para
GC-MS.
Se sabe que sucede una reacción de reordenamiento
entre el grupo acetilo en la posición C2 de PAF y el grupo
pentafluorobenzoílo en la posición C3 seguido por derivatización
durante este procedimiento, como se muestra en las figuras
4-B, C y D, produciendo un isómero. La producción
del isómero disminuye la intensidad del pico para PAF y también
aumenta los picos de interferencia obtenidos de componentes
biológicos, dando como resultado un límite de detección y
especificidad reducidos. Por consiguiente, esta reacción de
reordenamiento debe minimizarse. Se cree que esta reacción de
reordenamiento está causada por la etapa de pentafluorobenzoilación
del compuesto glicerol producido por hidrólisis de PAF por
fosfolipasa C como informa Haroldsen P.E. et al. (J. Lipid
Res. 32, 723-729, 1991) o la etapa de
purificación por cromatografía en gel de sílice en fase normal como
informa Christman B.W. et al. (Biomed. Environ. Mass
Spectrom. 18, 258-264, 1989). Sin embargo,
como resultado de la investigación concienzuda de la causa de la
reacción de reordenamiento, se ha descubierto que esta
isomerización está causada por una etapa diferente de las
mencionadas anteriormente y, por tanto, ha tenido éxito en minimizar
la reacción de reordenamiento.
Específicamente, el método de la invención ajusta
el pH de la solución de reacción a acidez ligera para el
tratamiento del PAF por fosfolipasa C. Se ha descubierto que esta
condición es esencial para suprimir la reacción de reordenamiento
no deseable. El intervalo de pH ligeramente ácido preferido es
aproximadamente 4-7 y más preferiblemente
aproximadamente 6. El tratamiento de PAF con fosfolipasa C puede
realizarse en condiciones con, por ejemplo, al menos 0,2 unidades,
a 25-40ºC durante 15 minutos a 24 horas.
Como hay pequeños contaminantes de componentes
biológicos en la muestra purificada obtenida por la etapa (3), el
PAF puede hidrolizarse con una cantidad más pequeña de fosfolipasa
C que la dosis convencional.
Las condiciones para tratar PAF con fosfolipasa C
establecidas en (4) anterior tienen el siguiente significado
técnico. Específicamente, el PAF purificado obtenido en (3)
anterior puede contener cantidades residuales de LysoPC que no se
ha retirado suficientemente. Para retirarlo, las condiciones de
reacción se establecieron en base a la diferencia de reactividades
entre PAF y LysoPC para fosfolipasa C, de modo que PAF se hidroliza
mientas que LysoPC no lo hace. Específicamente, ha habido un
problema en los métodos convenciones porque la adicción de éter
(Ramesha, C.M. et al., Biomed. Environ. Mass Spectrom.
13, 107-111, 1986) a la solución de reacción
para la hidrólisis de PAF también resulta de manera no deseable en
la hidrólisis de LysoPC y la aparición de múltiples picos de
interferencia en el registro de iones seleccionados de
cromatografía de gases. Una de las características de la presente
invención es que no usa disolventes insolubles en agua tales como
éter de los que se ha informado hasta ahora para acelerar la
hidrólisis de PAF.
Además, se ha establecido un método para la
separación del compuesto glicerol de LysoPC en la solución de
reacción usando una columna de extracción en fase sólida inversa
para el lavado/elución con una mezcla acetonitrilo/agua. La columna
de extracción en fase sólida de fase inversa usada puede ser un
producto disponible en el mercado tal como Bond Elut C18^{TM}. El
intervalo de proporción preferido de acetonitrilo/agua para el
lavado es 10/90-90/10, y como disolvente de
dilución puede usarse metanol, etanol, acetonitrilo,
1-propanol, tetrahidrofurano o similares.
El hidrolizado de PAF mencionado anteriormente se
convierte a un pentafluorobenzoílo u otro derivado y después se
amplifica con una columna de extracción en fase sólida normal y se
analiza por GC-MS. Están disponibles en el mercado
numerosos agentes de derivatización para GC-MS y no
hay restricciones particulares en su uso, pero se prefieren agentes
pentafluorobenzoilación desde el punto de vista de sensibilidad.
También puede usarse un producto disponible en el mercado para la
columna de extracción de columna en fase sólida inversa normal.
Como la muestra preparada por el método descrito
anteriormente tiene baja inclusión de componentes sanguíneos y un
alto rendimiento de PAF, permite la detección de PAF por el método
altamente sensible de monitorización selectiva de iones/captura
electrónica/ionización química/de iones negativos, usando un
espectrómetro de masas tetrapolo compacto y barato. La precisión de
medida puede mejorarse significativamente utilizando una curva de
calibrado construida usando un patrón interno. Es particularmente
preferido usar un compuesto de PAF marcado con isótopo estable
([^{2}H_{4}] PAF) como patrón interno.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de los
aparatos de GC-MS, condiciones de cromatografía de
gases y condiciones de espectrometría de masas.
Cromatógrafo de gases: TraceGC (ThermoQuest)
Espectrómetro de masas: TraceMS
(ThermoQuest).
Columna: HP-1MS (20 m X 0,25 mm:
espesor de membrana: 0,25 \mum; Hellett-Packard
Corp.)
Modo de programación de temperatura: 150ºC (2
min) \rightarrow 50ºC/min \rightarrow 260ºC (13 min)
\rightarrow 50ºC/min \rightarrow 310ºC (5 min)
Temperatura del puerto de inyección: 300ºC
Caudal de gas helio: 1,2 ml/min
Volumen de inyección: 2 \mul (sin división)
Tiempo de ciclo de inyección: 22 min.
Método de ionización: ionización química en modo
negativo/captura de electrones
Método de medición: Monitorización selectiva de
iones
Gas de reacción: metano
Monitorización de iones: PAF; m/z 552,
[^{2}H_{4}]PAF; m/z 556
Multiplicador de tensión: 500 V
Transferencia lineal de temperatura: 300ºC
Temperatura de la cámara de ionización:
130ºC.
Para verificar la conveniencia del método de la
invención y, particularmente, la especificidad de detección, se
extrajo y se purificó PAF en muestras por el método descrito
anteriormente, se trató posteriormente con factor de activación de
plaquetas humano recombinante acetilhidrolasa (abreviado
anteriormente como rhPAF-AH), y después se confirmó
si la medida de PAF estaba originada por el PAF endógeno o no en
las muestras. Se descubrió que las concentraciones de PAF endógeno
en sangre humana por el método de la invención fueron
aproximadamente 1 pg/ml, que son significativamente inferiores que
las de 10-30 pg/ml de las que informó Yamada, K.
et al. en el único informe disponible de esta medición por
GC-MS (J. Chromatogr. 433,
243-247, 1988), demostrando que la concentración de
PAF endógeno es extremadamente baja. De acuerdo con la invención,
por tanto, ha llegado a ser posible por primera vez conseguir un
ensayo del nivel de PAF altamente sensible y específico por los
procedimientos de extracción, purificación y derivatización
mencionados anteriormente.
(6') Puede usarse el PAF purificado de la etapa
(3) anterior para la cuantificación por un método
LC-MS sin someterlo a pretratamiento adicional.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de los
aparatos LC-MS, condiciones de cromatografía
líquida y condiciones de espectrometría de masas.
Cromatógrafo de líquidos: HP 1100 SERIES (Hewlett
Packard)
Espectrómetro de masas: API 3000 (Applied
Biosystems).
Columna: Inertsil SIL 150-5 (1,2
x 250 mm, GL Science)
Fase móvil: cloroformo/metanol/acetato amónico 10
mM = 70/40/5
Caudal: 0,2 ml/min.
Volumen de inyección: 20 \mul.
Ionización por: ionización por
electropulverización
Medición por: monitorización selectiva de
reacción (SRM)
Monitorización de iones: ión negativo precursor
\rightarrow ión negativo producto, PAF; m/z 508 \rightarrow m/z
59, [^{2}H_{4}]PAF; m/z 512 \rightarrow m/z 59
Tensión de pulverización de iones: -4500 V
Tensión de orificio: -91 V
Energía de colisión: -61 eV.
La presente invención se explicará ahora con
mayor detalle por medio de los siguientes ejemplos, que no se
pretende que sean limitantes de la invención. El PAF y sus
compuestos marcados usados en los ejemplos fueron los
siguientes.
PAF:
1-O-Hexadecil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina
[^{3}H]-PAF:
1-O-Hexadecil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina,
[1-O-hexadecil-1',2'-^{3}H(N)]
[^{14}C]-fosfatidilcolina
(PC): Fosfatidilcolina,
L-a-dipalmitoilo,
[dipalmitoil-1-^{14}C]
[^{14}C]-lisofosfatidilcolina
(LysoPC): Lisopalmitoilfosfatidilcolina,
L-1-[Palmitoil-1-^{14}C].
La Tabla 1 muestra los rendimientos de PAF, PC y
LysoPC a través del procedimiento total, usando sangre humana.
Después de añadir 1 ml de sangre humana a un tubo que contenía 4 ml
de tetrahidrofurano se añadieron [^{3}H]-PAF,
[^{14}C]-PC y [^{14}C]-LysoPC y
la mezcla se agitó y se centrifugó (3000 rpm x 15 min, 4ºC). Se
añadió una porción de 4 ml de acetato de etilo al sobrenadante
resultante y la mezcla se agitó y se centrifugó. El sobrenadante
resultante se cargó en Bond Elut SI^{TM}, y después se lavó con 8
ml de hexano/2-propanol/agua = 70/40/5 y se eluyó
con 3 ml de hexano/2-propanol/agua = 30/60/16. La
fracción eluida se evaporó a 60ºC en una corriente de nitrógeno y
el residuo resultante se disolvió con 0,9 ml de tampón
Bis-Tris 0,1 mM (pH = 6,0, CaCl_{2} 10 mM, Triton
X-100 al 0,1%), se añadió 0,1 ml de una solución de
fosfolipasa C (10 U/ml), y la mezcla resultante se incubó a 37ºC
durante una hora. La mezcla de reacción se cargó en una columna
Bond Elut 18^{TM}, y después de lavar la columna con 8 ml de
acetonitrilo/agua purificada = 60/40, la elución se realizó con 1
ml de acetonitrilo. La muestra se evaporó en una corriente de
nitrógeno, se añadieron 0,1 ml de solución de
n-hexano que contenía solución de anhídrido
pentafluobenzoico (2 mg/ml de solución de n-hexano)
y 0,9 ml de piridina al 1,1% al residuo resultante, y la mezcla de
reacción se dejó a temperatura ambiente durante una hora. La
solución de reacción se cargó en una columna Bond Elut SI^{TM}, y
después se lavó con 8 ml de n-hexano/benceno =
60/40 y se eluyó con 3 ml de benceno. El eluido se evaporó en una
corriente de nitrógeno y el residuo resultante se redisolvió en 20
\mul de acetato de etilo.
Se descubrió que el rendimiento de PAF en todo el
procedimiento fue del 45%. Como se muestra en la Tabla 1, se retiró
completamente PC por el procedimiento de purificación con Bond Elut
SI^{TM}, mientras que se retiró completamente LysoPC por el
procedimiento de purificación con Bond Elut C18^{TM}.
Se añadió una muestra de 1 ml de sangre humana a
cada tubo que contenía 4 ml de disolventes diferentes, y después se
añadió [^{3}H]-PAF antes de la agitación. La
muestra se centrifugó (3000 rpm x 15 min, 4ºC) y se midió la
radioactividad (^{3}H-PAF) en el sobrenadante,
para dar los resultados mostrados en la Tabla 2.
El rendimiento de [^{3}H-PAF]
en el sobrenadante fue el más alto con tetrahidrofurano, seguido
por dioxano, acetonitrilo y 2-propanol.
| Rendimiento de [^{3}H]-PAF (%) | |
| Tetrahidrofurano | 98,1 \pm 4,5 |
| Dioxano | 97,1 \pm 3,1 |
| Acetonitrilo | 95,1 \pm 2,5 |
| 2-propanol | 93,2 \pm 5,5 |
| Acetona | 85,3 \pm 5,0 |
| Etanol | 85,0 \pm 3,3 |
| Metanol | 77,0 \pm 4,0 |
| Media \pm SD (n=3) |
La uniformidad del pico de PAF con cromatografía
de gases se verificó usando rhPAF-AH, y los
resultados se muestran en la Figura 1. Después de extraer PAF de 1
ml de sangre humana usando tetrehidrofurano y acetato de etilo de
acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, el extracto de
acetato de etilo resultante se purificó con Bond Elut SI^{TM}. La
muestra se disolvió en 0,5 ml de solución de tampón que contenía 40
\mug de rhPAF-AH, y la solución se incubó a 37ºC
durante una hora. Después se trató de acuerdo con el método descrito
en el Ejemplo 1, se sometió a pentafluorobenzoilación, y se sometió
a análisis por GC-MS.
Para la muestra no tratada con
rhPAF-AH, aparecieron picos para PAF y el patrón
interno ([^{2}H_{4}]PAF)a los tiempos de retención
de 13,72 minutos y 13,70 minutos, respectivamente, como se muestra
en la Figura 1-A. Para la muestra tratada con
rhPAF-AH, sin embargo, estos picos habían
desaparecido completamente como se muestra en la Figura
1-B. Estos resultados indicaron que el pico
detectado de acuerdo con el presente método se origina de PAF en la
sangre, y que no había componentes biológicos además de PAF.
La Figura 2 muestra los resultados de comparar el
método de la presente invención con un método convencional de Bligh
y Dyer para la extracción de PAF con una solución
cloroformo/metanol/agua. El método se realizó del mismo modo que en
el Ejemplo 1, excepto para la etapa de extracción convencional, que
fue del siguiente modo. Se añadió una muestra de 1 ml de sangre
humana a un tubo que contenía 4 ml de metanol, y la mezcla se agitó
y se centrifugó (3000 rpm x 15 min, 4ºC). Después de añadir 4 ml de
cloroformo y 1 ml de agua destilada al sobrenadante resultante, la
mezcla se agitó y se centrifugó otra vez. La fase inferior
resultante se purificó con un Bond Elut SI^{TM} de acuerdo con el
método descrito en el Ejemplo 1, y se siguió por hidrolización con
fosfolipasa C, pentafluorobenzoilación y análisis por
GC-MS.
El nivel de PAF endógeno en sangre humana, cuando
se midió por el método de la invención, se descubrió que fue 2,1
pg/ml, como se muestra en la Figura 2-A. Por otro
lado, para una muestra obtenida por extracción de una muestra de
sangre humana idéntica con una solución de cloroformo/metanol/agua,
el nivel sanguíneo de PAF endógeno fue 29,6 pg/ml, como se muestra
en la Figura 2-B, confirmando claramente de este
modo que PAF y análogos de PAF no pueden separarse por el método
convencional de Bligh y Dyer usando una solución de
cloroformo/metanol/agua.
El método de la invención se comparó con el
método de Weintraub, S.T. et al. (J. Am. Soc. Mass Spectrom.
11, 176-181, 2000) con respecto a la etapa de
purificación con una columna en fase sólida normal. Weintraub, S.T.
et al informaron de un ensayo de concentración de PAF por su
método en células cultivadas, en el que PAF se extrae de células
cultivadas usando metanol y cloroformo, y el extracto se cargó en
una columna en fase sólida normal y después se lavó con
n-hexano/2-propanol/agua =
46,75/46,75/6,5 seguido por elución con cloroformo/metanol/agua =
1/2/0,8.
Para comparar la presente invención con la
purificación en una columna en fase sólida normal como se describe
en esta publicación, se usó sangre humana idéntica a la del Ejemplo
4 como muestra, y se realizó el procedimiento completo del mismo
modo que en el ejemplo 1, excepto en la solución de lavado y
solución de elución usada en la etapa de purificación en columna en
fase sólida normal. La solución de lavado usada en la columna en
fase sólida normal para la etapa de purificación fue
n-hexano/2-propanol/agua =
46,75/46,75/6,5 y la solución de elución fue
cloroformo/metanol/agua = 1/2/0,8.
Como se muestra en la Figura 3, se descubrió que
el nivel sanguíneo de PAF endógeno humano fue 10,9 pg/ml por el
método de Weintraub, S.T. et al. Como este resultado fue
mucho superior que el de 2,1 pg/ml mostrado en la Figura 2A del
Ejemplo 4, o la concentración de PAF endógeno humano media de 1,1
pg/ml (n=21) mencionado a continuación en el Ejemplo 7, se
demuestra que PAF y análogos de PAF no pueden separarse en la
columna en fase sólida normal usando condiciones de lavado y
elución de acuerdo con el método de Weintraub, S.T. et
al.
La Figura 4 muestra las condiciones de reacción
para inhibir la producción de isómeros de PAF cuando PAF se
hidroliza con fosfolipasa C. Se disolvió PAF en soluciones tampón
(que contenían Bis-Tris 100 mM o HEPES 100 mM,
CaCl_{2} 10 mM y Triton X-100 al 0,1%) a pH 6,0,
7,0, 7,5 y 8,0, y del mismo modo que en el Ejemplo 1, se sometió a
hidrólisis con fosfolipasa C, se sometió a pentafluorobenzoilación
y se analizó por GC-MS.
Como se muestra en la Figura 4-A
no se produjo isómero de PAF en la solución de reacción a pH 6,0,
pero aumentó con pH superior. El área de pico de PAF alcanzó el
máximo a pH 6,0 y disminuyó con pH superior. Esto demostró por tanto
que el isómero se produce en el intervalo de pH convencional
(7,5-8,0) de soluciones de hidrolización por
fosfolipasa C, dando como resultado la disminución de la intensidad
del pico. Por el método de la invención, sin embargo, fue posible
inhibir la reacción de reordenamiento ajustando el pH de la solución
de reacción a ligera acidez.
Después de añadir PAF y un patrón interno
([^{2}H_{4}]PAF) a sangre humana a las concentraciones
de 0-181 pg/ml y 10 pg/ml, respectivamente, las
muestras a cada concentración se ensayaron con realizaciones por
triplicado por el método descrito en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Figura 5-A,
se calculó que el coeficiente de correlación de la curva de
calibrado fue 0,9992, y se obtuvo una linealidad satisfactoria en
el intervalo de 0-181 pg/ml. Los coeficientes de
variación (CV) para la medida a cada concentración fueron pequeños
en el intervalo de 3,7-11,4%. Se descubrió que la
media del nivel sanguíneo de PAF humano endógeno y la desviación
estándar medida a este tiempo fue 1,1 \pm 1,0 pg/ml (n = 21).
Se añadió PAF a sangre humana en el intervalo de
0-20,2 pg/ml y se construyó una curva de calibrado.
Como se muestra en la Figura 5-B, la ecuación de
regresión para este caso se representa como Y = 1,114 x pico de
concentración de PAF + 0,7711; por tanto, el nivel sanguíneo de PAF
endógeno estimado se extrapoló a 0,77 pg/ml cuando la cantidad
máxima (x) de PAF fue cero. El nivel extrapolado se correspondía
prácticamente con el nivel sanguíneo de PAF endógeno de 1,1 pg/ml.
Esto sostiene adicionalmente la conveniencia de los valores de
ensayo.
El método de extracción y purificación de PAF
descrito en el Ejemplo 1 se aplicó a cromatografía
líquida-espectrometría de masas
(LC-MS) que permite el análisis directo sin
derivatización de PAF. Se añadió una porción de 1 ml de sangre
humana a un tubo que contenía 4 ml de tetrahidrofurano. Se añadió un
patrón interno de 50 pg/ml ([^{2}H_{3}]PAF) a la sangre,
y a esto siguió agitación y centrifugación (3000 rpm x 15 min,
4ºC). Después de añadir 4 ml de acetato de etilo al sobrenadante
resultante, la mezcla se agitó y se centrifugó. El sobrenadante
resultante se cargó en una columna Bond Elut SI^{TM},se lavó con
8 ml de hexano/2-propanol/agua = 70/40/5 y se eluyó
con 3 ml de hexano/2-propanol/agua = 30/60/16. La
fracción eluida se evaporó a 60ºC en una corriente de nitrógeno y
el residuo se disolvió con 50 \mul de una fase móvil de HPLC
(cloroformo/metanol/acetato amónico 10 mM = 70/40/5). Se introdujo
una porción de 20 \mul de la muestra en el siguiente sistema
LC-MS. Se usó un HP1100 SERIES (Hewlett Packard)
para HPCL, con Inertsil SIL 150-5 (2,1 x 250 mm, GL
Science) como columna y cloroformo/metanol/acetato amónico 10 mM =
70/50/5 como fase móvil, a un caudal de 0,2 ml/min. La
espectrometría de masas se realizó usando un API3000 (Applied
Biosystems), y se efectuó la ionización con un sistema de turbo
pulverización de iones. La monitorización selectiva de reacción
(SRM) se realizó usando el ión negativo precursor y el ión negativo
de producto a valores m/z de 508 y 59 para PAF y 512 y 59 para
([^{2}H_{4}]PAF).
Como se muestra en la Figura 6-A,
se detectó un pico de [^{2}H_{4}]PAF a un tiempo de
retención de 21,5 min para la muestra obtenida añadiendo 50 pg/ml de
([^{2}H_{4}]PAF) a la sangre, y no hubo picos de
contaminantes sanguíneos en ese tiempo de retención. Por otro lado,
como se muestra en la Figura 6-B, los picos para
PAF y [^{2}H_{4}]PAF se detectaron para las muestras
obtenidas añadiendo 100 pg/ml de PAF y 50 pg/ml de
[^{2}H_{4}]PAF a la sangre. Estos resultados indicaron
que PAF sanguíneo puede ensayarse incluso por
LC-MS/MS usando el método de extracción y
purificación de la invención.
Se ha demostrado que el método de la invención
permite una medida específica y precisa de concentraciones de PAF
en muestras biológicas. Se ha señalado que el ensayo de PAF es
difícil en la técnica anterior debido a la coexistencia de grandes
cantidades de fosfolípidos con una estructura similar a PAF en
muestras biológicas, y debido a los niveles muy bajos de PAF en el
cuerpo. Se ha completado la presente invención con el
descubrimiento de un método para la extracción y purificación
selectivas de PAF de muestras biológicas, y por el establecimiento
de un método de ensayo de PAF altamente sensible con excelente
reproducibilidad y fiabilidad. La presente invención puede emplearse
para medir niveles de PAF en muestras biológicas para dilucidad el
papel de PAF en diversas afecciones patológicas. Además, se espera
que facilite el diagnóstico de diversas enfermedades asociadas con
la fluctuación de PAF, y también que contribuya a la evaluación de
efectos terapéuticos en dichas enfermedades.
Claims (13)
1. Un método para tratar una muestra biológica
para medir la cantidad de factor de activación de plaquetas (PAF)
representado por la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde R_{1} es un grupo
hidrocarburo no cíclico saturado o insaturado o un grupo acilo
derivado de un ácido graso saturado o insaturado, y R_{3} es
fosfocolina, fosfoetanolamina, fosfomonometiletanolamina o
fosfodimetiletanolamina,
contenido en dicha muestra biológica,
comprendiendo el método las etapas de
a) mezclar la muestra biológica con un disolvente
orgánico soluble en agua y separar la mezcla por
centrifugación,
b) extraer el PAF contenido en el sobrenadante
obtenido de dicha centrifugación con un disolvente orgánico
insoluble en agua; y
c) introducir el PAF extraído en el disolvente
orgánico insoluble en agua en una columna en fase sólida de gel de
sílice directamente o después de ajustar a una concentración
apropiada, y realizar el lavado y la elución con una mezcla de
hexano/2-propanol/agua para purificar el PAF en
muestras biológicas.
2. El método de la reivindicación 1, donde el
disolvente orgánico soluble en agua de la etapa a) es
tetrahidrofurano.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde el
disolvente orgánico insoluble en agua de la etapa b) es acetato de
etilo.
4. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde el lavado de la etapa c) se realiza
con una mezcla de hexano/2-propanol/agua a
1/0,5-1/0,05-2.
5. El método de la reivindicación 4, donde la
elución de la etapa c) se realiza con una mezcla de
hexano/2-propanol/agua a
1/2-20/0,2-2.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde el método para medir la cantidad de
PAF es cromatografía de gases-espectrometría de
masas.
7. El método de la reivindicación 6, que
comprende las etapas adicionales de d) hidrolizar el PAF purificado
en la etapa c) con fosfolipasa C y e) purificar el hidrolizado de
PAR resultante (mencionado anteriormente como compuesto
glicerol).
8. El método de la reivindicación 7, donde la
hidrólisis con fosfolipasa C se realiza en condiciones ligeramente
ácidas.
9. El método de la reivindicación 7 u 8, donde la
purificación del compuesto glicerol se consigue lavando por lavado
y elución con una columna de gel de sílice de fase inversa usando
una mezcla de acetonitrilo/agua.
10. Un método para medir la cantidad de PAF en
una muestra biológica, donde después de la purificación del
compuesto glicerol por la etapa e) de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9, se somete a una etapa de f) convertirlo
en un derivado apropiado para cromatografía de
gases-espectrometría de masas, con purificación de
dicho derivado si es necesario, separarlo por cromatografía de
gases y someter los componentes separados a espectrometría de
masas.
11. El método de la reivindicación 10, que
también comprende una etapa para cuantificar la cantidad de PAF de
la muestra biológica comparando los valores medidos obtenidos de la
muestra biológica con una curva de calibrado obtenida de realizar
las etapas a) a f) por adición de cantidades conocidas de una
muestra patrón de PAF del mismo modo que para la muestra
biológica.
12. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde el método para medir la cantidad de
PAF es cromatografía líquida-espectrometría de
masas.
13. El método de la reivindicación 12, que
también comprende una etapa para determinar el contenido de PAF de
la muestra biológica comparando los valores medidos obtenidos para
la muestra biológica con una curva de calibrado obtenida por la
adición de cantidades conocidas de una muestra patrón de PAF del
mismo modo que para la muestra biológica.
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