ES2235216T3

ES2235216T3 - Metodo y aparato de analisis de imagen.

Info

Publication number: ES2235216T3
Application number: ES97307053T
Authority: ES
Inventors: Stephen Peter c/o Randox Lab. Ltd Fitzgerald; Robert Ivan c/o Randox Lab. Ltd McConnell; John Victor John Victor Randox Lab. Ltd Lamont
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2017-09-11
Also published as: CA2245971A1; EP0902394A1; DE69731629D1; DE69731629T2; AU733347B2; JPH11161775A; KR19990029721A; ZA988024B; US6341182B1; ATE282860T1; JP4221083B2; KR100565472B1; AU8304698A; EP0902394B1; PT902394E

Abstract

SE EXPONE UN PROCEDIMIENTO PARA ANALIZAR UNA IMAGEN A FIN DE OBTENER UN VALOR DE IMAGEN. LA IMAGEN COMPRENDE UNA SERIE DEFINIDA DE VALORES DE PIXEL. EL PROCEDIMIENTO COMPRENDE: (1) DETERMINAR EL VALOR MAS ALTO DE PIXEL DE LA IMAGEN; (2) CALCULAR UN VALOR INFERIOR DE PIXEL DE UMBRAL A PARTIR DEL VALOR DE PIXEL MAS ALTO DETERMINADO EN EL PASO (1) DE ACUERDO CON UN ALGORITMO PREDETERMINADO; Y (3) OBTENER EL VALOR DE LA IMAGEN POR ANALISIS ESTADISTICO DE LOS VALORES DE PIXEL EN LA IMAGEN QUE SE ENCUENTRA EN UN RANGO DEFINIDO POR EL VALOR INFERIOR DE PIXEL DE UMBRAL CALCULADO EN EL PASO (2).

Description

Método y aparato de análisis de imagen.

La presente invención se refiere a un método y aparato para analizar una pluralidad de lugares de reacción localizados, conteniendo cada uno una especie reactiva que reacciona con un analito respectivo y habiéndose expuesto cada uno a una muestra de prueba.

Esta aplicación requiere el análisis de una imagen de una característica localizada o lugar de reacción, por ejemplo, como se describe en US 5.488.567. En particular, puede ser deseable analizar la imagen para determinar el brillo medio de la característica localizada. Sin embargo, la imagen de la característica localizada puede estar más dispersada que la característica original propiamente dicha (por ejemplo, debido a errores en el proceso de formación de imagen tal como fulguración óptica, o luz de la característica original que se refleja sobre zonas adyacentes). Esto produce el problema de que el brillo medio se calcula sobre un área mayor que el área real de la característica original localizada, y como resultado el brillo medio calculado es erróneamente bajo.

Este problema se ha afrontado convencionalmente reduciendo el número de pixeles que se promedian. Por ejemplo, solamente se puede promediar los pixeles que están por encima de un valor de pixel umbral inferior fijo. La desventaja de este acercamiento es que si la imagen del área localizada tiene brillo bajo, los pixeles que se deberán promediar pueden caer por debajo del valor de pixel umbral inferior. Esto da lugar a una reducción de rango dinámico y desviación de linealidad en la medición de brillo medio.

Según un primer aspecto de la presente invención, se facilita un método de analizar una pluralidad de lugares de reacción localizados, conteniendo cada uno una especie reactiva que reacciona con un analito respectivo y habiéndose expuesto cada uno a una muestra de prueba, incluyendo el método detectar radiación de los lugares de reacción para generar una imagen incluyendo una matriz de valores de pixel, siendo indicativa la radiación de cada lugar de reacción de la presencia o ausencia de un analito respectivo en la muestra de prueba; dividir la imagen en una pluralidad de regiones de imagen correspondiendo cada una a un lugar respectivo de los lugares de reacción; y analizar cada región de imagen, obteniendo por ello una pluralidad de valores de imagen siendo cada uno indicativo de la presencia o ausencia de un analito respectivo en la muestra de prueba, donde analizar cada región de imagen para obtener el valor de imagen incluye:

(1) determinar el valor de pixel más alto en la región de imagen;

(2) calcular un valor de pixel umbral inferior a partir del valor de pixel más alto determinado en el paso (1) según un algoritmo predeterminado; y

(3) obtener el valor de imagen analizando estadísticamente los valores de pixel en la región de imagen que están en un rango definido por el valor de pixel umbral inferior calculado en el paso (2).

La presente invención proporciona mejor rango dinámico y linealidad en el análisis de un lugar de reacción de ensayo. Típicamente, el valor de imagen es un parámetro experimental tal como un valor de unidades relativas de luz (RLU).

La invención resuelve el problema esbozado anteriormente calculando el valor de pixel umbral inferior a partir del valor de pixel más alto. En contraposición al acercamiento convencional que usa un valor de pixel umbral inferior fijo, la invención utiliza un valor de pixel umbral inferior variable que se refiere al valor de pixel más alto en la imagen. Esto da lugar a linealidad incrementada y rango dinámico incrementado.

Se puede emplear cualquier método estadístico adecuado en el paso (3), pero el valor de imagen se obtiene preferiblemente en el paso (3) promediando los valores de pixel. La media puede ser una mediana o media de modo, pero preferiblemente la media es un promedio.

Típicamente, los valores de pixel están relacionados con la intensidad de radiación de una imagen original, y en una realización preferida el método incluye además detectar radiación de la imagen original para generar la matriz de valores de pixel. Se puede detectar la intensidad de radiación total, o se puede detectar alternativamente la intensidad en uno o varios rangos de longitud de onda seleccionados.

Se puede producir otro problema si la imagen contiene valores de pixel erróneamente altos (por ejemplo, puntos brillantes). Esto puede dar lugar a que el valor de imagen calculado sea demasiado alto. Este problema se puede resolver calculando un valor de pixel umbral superior, y/o quitando valores de pixel altos antes de realizar el algoritmo, como se explica a continuación.

Por lo tanto, el método puede incluir además calcular un valor de pixel umbral superior a partir del valor de pixel más alto determinado en el paso (1) según un segundo algoritmo predeterminado, donde el paso (3) incluye analizar estadísticamente los valores de pixel en la región de imagen que están en un rango definido por los valores umbral de pixel superior e inferior. En algunos casos, los puntos brillantes pueden ser un orden de magnitud más altos que los valores de imagen en el resto de la región de imagen. Donde la región de imagen se deriva de un lugar de reacción de ensayo, esto puede ser producido por rayos cósmicos. Esto dará lugar a que se use un valor de pixel más alto erróneamente grande. Por lo tanto, en este caso, el método incluye preferiblemente definir previamente la matriz definida de valores de pixel revisando una matriz original de valores de pixel, y quitando uno o varios de los valores de pixel más altos en la matriz original de valores de pixel. Esto se puede hacer automáticamente por análisis estadístico, o por inspección manual. Ambos métodos quitan los puntos brillantes del proceso de promediado y en consecuencia mejoran la exactitud.

El(los) algoritmo(s) predeterminado(s) puede(n) calcular el(los) umbral(es) como cualquier función fija del valor de pixel más alto. Por ejemplo, los umbrales se pueden calcular como la raíz cuadrada del valor de pixel más alto. Alternativamente, se puede introducir el valor de pixel más alto en una tabla de consulta que ha sido previamente cargada con un rango de valores umbral. Sin embargo, los valores umbral de pixel inferior y/o superior se calculan preferiblemente como porcentaje predeterminado del valor de pixel más alto determinado en el paso (1).

Típicamente, el valor de pixel umbral inferior está entre 50% y 90% del valor de pixel más alto determinado en el paso (1), preferiblemente sustancialmente 80%.

Típicamente, el valor de pixel umbral superior está entre 97% y 99% del valor de pixel más alto determinado en el paso (1), preferiblemente sustancialmente 98%.

Puede haber ruido de fondo en los valores de pixel dando lugar a una reducción de la exactitud y rango dinámico. Preferiblemente, el fondo se quita de los valores de pixel, por ejemplo por un método de morfología matemática tal como erosión, dilatación, apertura y/o formación de umbral. El fondo se puede quitar antes o después del paso (1) o el paso (3).

La invención permite procesar rápida y eficientemente un ensayo multianalito.

Típicamente, cada lugar de reacción está situado en un sustrato de estado sólido, y la o cada especie reactiva incluye un ligando unido covalentemente al sustrato.

Típicamente, la superficie del sustrato entre los lugares de reacción es inerte con respecto al analito.

La imagen se puede generar iluminando cada lugar de reacción y detectando la radiación reflejada o transmitida. Sin embargo, la radiación incluye preferiblemente radiación quimiluminiscente, bioluminescente o fluorescente emitida por cada lugar de reacción. En este caso, se puede emplear un filtro para detectar solamente la banda de longitud de onda estrecha de interés.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se facilita un método de realizar un ensayo, incluyendo el método exponer una pluralidad de lugares de reacción localizados a una muestra de prueba, conteniendo cada lugar de reacción una especie reactiva que reacciona con un analito respectivo; analizar el o cada lugar de reacción por un método según el primer aspecto de la presente invención; y calcular la concentración de cada analito a partir de los valores de imagen respectivos.

Según un tercer aspecto de la presente invención, se facilita un aparato para analizar uno o varios lugares de reacción localizados conteniendo cada uno una especie reactiva que reacciona con un analito respectivo y que ha sido expuesto a una muestra de prueba, incluyendo el aparato medios para detectar radiación del o cada lugar de reacción para generar una imagen incluyendo una matriz de valores de pixel, siendo indicativa la radiación del o cada lugar de reacción de la presencia o ausencia de un analito respectivo en la muestra de prueba; medios para dividir la imagen en una pluralidad de regiones de imagen correspondiendo cada una a un lugar respectivo de los lugares de reacción; y medios para analizar cada región de imagen para obtener uno o varios valores de imagen siendo cada uno indicativo de la presencia o ausencia de un analito respectivo en la muestra de prueba, donde los medios de análisis incluyen:

(1) medios para determinar el valor de pixel más alto en la región de imagen;

(2) medios para calcular un valor de pixel umbral inferior del valor de pixel más alto según un algoritmo predeterminado; y

(3) medios para obtener el valor de imagen analizando estadísticamente los valores de pixel en la región de imagen que están en un rango definido por el valor de pixel umbral inferior.

Según un cuarto aspecto de la presente invención, se facilita un aparato para llevar a cabo un ensayo, incluyendo el aparato medios para exponer una pluralidad de lugares de reacción localizados a una muestra de prueba, conteniendo cada lugar de reacción una especie reactiva que reacciona con un analito respectivo; y un aparato según el tercer aspecto de la presente invención para analizar los lugares de reacción; y para calcular la concentración de cada analito a partir de los valores de imagen respectivos.

Un ejemplo de un método y aparato según la presente invención se describirá ahora con referencia a los dibujos anexos, en los que:

La figura 1 es un diagrama esquemático de un sistema analizador integrado.

La figura 2 es una vista en sección transversal de un sistema analizador integrado.

Las figuras 3-5 son ejemplos de sustratos para uso en el sistema analizador.

La figura 6 es un diagrama de flujo que ilustra los pasos de proceso principales en un ensayo.

La figura 7 ilustra la erosión.

La figura 8 ilustra la dilatación.

La figura 9 ilustra la apertura.

La figura 10 es un gráfico de curvas de calibración para cada una de las 12 sulfonamidas individuales explicadas en el ejemplo 1.

Y las figuras 11-16 son gráficos de curvas estándar para ensayos FSH, LH y PL realizados en sustratos de silicio y cerámica y con procesado de imágenes usando técnicas convencionales y usando un método según la presente invención.

La figura 1 es un diagrama esquemático de un sistema analizador integrado para la detección cuantitativa simultánea de un amplio rango de analitos en un formato multianalito. El sistema se puede usar para diagnóstico clínico/veterinario o selección de medicamentos. El sistema incluye una plataforma sustrato 1 que soporta una matriz de sustratos 2. La plataforma 1 es controlada por controles de traslación X-Y 3 que ponen la plataforma en cada etapa del procedimiento analítico. Los controles de traslación 3 pueden estar asociados con un motor paso a paso (no representado) para lograr una exactitud posicional de 10 micras. Una unidad dispensadora 4 incluyendo un depósito de fluido 14 y una bomba 10 dispensa fluidos tales como muestras de prueba, reactivo quimiluminiscente, etc, sobre los sustratos 2. Un sistema de formación de imágenes CCD 5 incluyendo una cámara CCD bidimensional 6 forma imágenes de los sustratos 2 para generar una imagen incluyendo una matriz de valores de pixel que son emitidos en la línea de salida 18. Los controles de traslación 3, la unidad dispensadora 4 y el sistema de formación de imágenes CCD 5 son controlados por un ordenador personal convencional 7, que ejecuta sotfware de tratamiento de imagen para procesar las imágenes adquiridas por la cámara CCD 6.

La figura 2 ilustra un sistema del tipo representado en el diagrama esquemático de la figura 1. La cámara CCD 6 tiene una lente 8 que adquiere una imagen de un sustrato 2 en una posición de formación de imágenes 9. Se dispensan líquidos con una bomba dispensadora 10 sobre un sustrato 2 en una posición de dispensación 11. La lente 8 y la posición de formación de imágenes 9 se encierran en una caja oscura 12.

Los sustratos 2 de la forma ilustrada en las figuras 3-5 se emplean típicamente en el sistema de las figuras 1 y 2. Los sustratos representados en las figuras 3-5 son chips de silicio o cerámica que tienen una superficie plana que ha sido modificada para incorporar una serie de hoyuelos/cavidades/pozos, canales o cámaras en la superficie. Estos contribuyen a incrementar el área superficial de los lugares de reacción, proporcionando por ello la posibilidad de acelerar el tiempo de incubación del ensayo.

Con referencia a la figura 3, un chip 20 tiene un depósito central de muestra de prueba 21 al que se añade una muestra de prueba líquida cuando el chip 20 está en la posición de dispensación 11. Doce canales 22 irradian desde el depósito 21 a respectivos lugares de reacción 23.

Con referencia a la figura 4, el chip 25 tiene cuatro depósitos de muestra de prueba 26-29 a los que se añade muestra de prueba líquida en la posición de dispensación 11, un colector de distribución 30, canales de distribución de muestra de prueba 31 que suministran la muestra de prueba a lugares de reacción (no representados), y un depósito de residuos 32.

Con referencia a la figura 5, un chip 40 tiene doce lugares de reacción circulares 41. El chip 40 es un sustrato cerámico de 1 cm^{2}.

Cada lugar de reacción 23, 41, etc, soporta un ligando unido covalentemente al sustrato, y cada ligando reacciona con un analito diferente respectivo. Los ligandos son inmovilizados en los lugares de reacción definidos espacialmente por medio de dispensación microfluídica del ligando sobre el sustrato, que es activado químicamente. La superficie del sustrato entre los lugares de reacción es inerte con respecto al analito. Se describen con más detalle métodos adecuados de preparar los lugares de reacción en la Solicitud de Patente europea, en tramitación, número 97302707.1. Se prefiere la inmovilización covalente del ligando biológico en el lugar de reacción 23, 41, etc, puesto que las interacciones de absorción pasivas son susceptibles de cambios de pH, temperatura y fuerzas iónicas, y en algunos casos puede dar lugar a la liberación de ligandos débilmente unidos durante los pasos de incubación y lavado, contribuyendo así a una pobre reproducibilidad del ensayo.

Ahora se describirá con referencia a la figura 6 un método de realizar un ensayo usando el sistema de las figuras 1 y 2. En un primer paso 60, se pone un sustrato 2 en la bandeja de muestra 1. El sustrato 2 tiene una pluralidad de lugares de reacción, conteniendo cada uno un ligando que reacciona con un analito respectivo A, B, C, D, etc. En el paso 61, la bandeja de muestra 60 es desplazada por controles de traslación 3 hasta que el sustrato se sitúa en posición de dispensación 11. En 62, la bomba dispensadora 10 dispensa una muestra de prueba líquida sobre el sustrato, por ejemplo, en el caso del sustrato de la figura 3 la muestra de prueba se dispensa al depósito 21. En 62', la bomba dispensadora 10 dispensa un reactivo líquido sobre el sustrato. El reactivo líquido incluye una mezcla de reactivos marcados A', B', C', D', etc, que reaccionan con un analito respectivo de los analitos, es decir, A' reacciona con A, B' reacciona con B, etc. Los reactivos marcados A', B', C', D', etc, también reaccionan con reactivo quimiluminiscente.

La muestra de prueba y los reactivos marcados pasan después a lo largo de los canales 21 a los lugares de reacción 23, exponiendo los varios ligandos a la muestra de prueba. El flujo de muestra de prueba líquida y reactivos marcados se puede lograr por atracción capilar, fuerza centrífuga, fuerza de vacío o flujo electroosmótico. El uso de flujo electroosmótico evitaría la necesidad de válvulas, de manera que no se utilizan partes mecánicas móviles. En 63 el sustrato se lava para quitar la muestra de prueba excedente que no ha reaccionado en un lugar de reacción 23.

En el paso 64 la bomba dispensadora 10 dispensa reactivo quimiluminiscente sobre el sustrato. Éste reacciona con los reactivos marcados A', B', C', D', etc, en una reacción quimiluminiscente. En 65, los controles de traslación 3 mueven la bandeja de muestra 1 hasta que los sustratos están en la posición de formación de imágenes 9. En esta etapa, donde un analito ha reaccionado con un ligando en uno de los lugares de reacción, un reactivo marcado respectivo está emitiendo radiación quimiluminiscente desde dicho lugar de reacción. En 66, la cámara CCD 6 con un filtro adecuado se expone para generar una imagen de la radiación quimiluminiscente emitida por el chip 2 en la posición de formación de imágenes 9, incluyendo la imagen una matriz de valores de pixel. La matriz de valores de pixel se introduce en el ordenador personal 7 mediante una línea de salida de imagen 18, y se almacena en una memoria (no representada) para análisis. En 67, el ordenador personal 7, bajo control de sotfware de tratamiento de imagen, analiza la imagen de la cámara CCD 6 para generar un valor de unidades relativas de luz (RLU) para cada lugar de reacción. En 68, el ordenador personal 7 envía los valores RLU a un monitor o impresora (no representados) y en 69 el ordenador personal 7 calcula una concentración correspondiente para cada analito A, B, C, D, etc, en la muestra de prueba y envía la concentración calculada a la impresora o monitor.

El algoritmo de procesado de imagen 67 prosigue de la siguiente manera:

a): Se divide la imagen en una pluralidad de regiones, conteniendo cada región uno de los lugares de reacción y definiéndose por una matriz bidimensional de pixeles. La imagen se divide con referencia a un mapa almacenado previamente correspondiente a la configuración de los lugares de reacción.

b): Dentro de cada región el ordenador 7 explora y localiza el pixel más intenso. Sea esta intensidad = X.

c): A continuación, calcula 80% de este intensidad de pixel (=0,8X) y, por lo tanto, el rango de 20% superior.

d): Finalmente, identifica todos los pixeles dentro de dicha área de interés que caen dentro de este rango y promedia la intensidad de estos pixeles que envía como la intensidad de señal 20% superior. Se desechan los pixeles que caen fuera del rango.

Señal RLU 20% superior = \frac{\sum\limits^{n}_{i=1} P_{i}}{n}

para todas las intensidades de pixel P_{i}, donde 0, 8X \leq P_{i} \leq X

X = señal superior, n = número de pixeles dentro del rango de 80-100%.

Se puede usar otras bandas, 40% da intensidades razonablemente altas. Además, para quitar los pixeles característicamente altos, se puede examinar rangos de 80%-98%.

En un método alternativo, para tratar valores de pixel anormalmente altos (lo que puede derivar de puntos brillantes producidos por radiación cósmica), se puede llevar a cabo un paso adicional entre el paso a) y el paso b). En este paso adicional, cada región es revisada para determinar si hay valores "extremos". Por ejemplo, con una matriz de cien valores de pixel, noventa y nueve pueden estar entre 0-100 RLUs y un pixel "extremo" puede tener un valor de 2000 RLUs. El pixel extremo (o pixeles) se desecha antes del paso b). Este paso se puede llevar a cabo manualmente, o con un algoritmo estadístico adecuado.

Si hay fondo inherente en la imagen, éste se incluirá en esta señal. Si todas las imágenes son procesadas por este método, esto no será necesariamente un problema, pero podría ser restringir el rango dinámico. Por lo tanto, se utiliza procesado de morfología matemática para quitar el fondo. La morfología matemática se basa en el uso de operadores establecidos (intersección, unión, inclusión, complemento) para transformar una imagen. La imagen procesada tiene generalmente menos detalles, lo que implica una pérdida de información, pero todavía están presentes sus características principales. Una vez simplificada la imagen, se puede realizar análisis cuantitativo.

El principio de una transformación básica se basa en la elección de un "elemento estructurante", caracterizado por una forma, un tamaño y la posición de su centro. Cada objeto de la imagen se comparará con este elemento y esto se consigue desplazando el elemento de tal manera que su centro choque en todos los puntos de la imagen. Por cada posición del elemento, se busca la inclusión del elemento con los objetos de la imagen.

Erosión:: quita puntos aislados y partículas pequeñas, contrae otras partículas, desecha picos en el límite de los objetos y desconecta algunas partículas.

\quad: En la práctica, con el elemento estructurante, cada pixel central se pone alvalor más bajo en dicha posición particular.

\quad: Con referencia a la figura 7, un valor de pixel en la posición de pixel 70 en el centro de un elemento estructurante 3x3 71 se pone al valor más bajo dentro del elemento estructurante 71, en este caso el valor "1".

Dilatación:: llena agujeros pequeños dentro de partículas y golfos en el límite de objetos, amplía el tamaño de las partículas y puede conectar partículas contiguas. En la práctica, dentro del elemento estructurante, cada pixel central se pone al valor más alto en dicha posición particular. Esto se ilustra en la figura 8.

Apertura:: es una transformación que no destruye tanta información como la erosión, y es la combinación de una erosión seguida de una dilatación.

\quad: La apertura da una determinación exacta del fondo y se puede restar posteriormente de la imagen original. El uso adicional de formación de umbral produce posteriormente puntos "limpios". Se ilustra una iteración en la figura 9. Las iteraciones incrementadas mantienen alta la señal de punto y dan bordes más suaves.

Formación de umbral:: establece la intensidad mínima de la que se lee la señal. Esto también contribuye a limpiar la imagen y eliminar fondo que induce a error. Cada punto es marcado individualmente y se promedia la intensidad de todo el punto.

Las ventajas de la morfología son la extracción de fondo inclinado y la capacidad de distinguir entre señal real y fondo circundante. Sin embargo, puesto que se promedia toda la intensidad de punto, la señal real tiende a ser muy baja.

Un rodeo a este problema es utilizar el método de morfología, pero en lugar de promediar todo el punto, se promedia solamente el 20% superior como se ha indicado previamente. Este método da lugar a señales altas, pero también a un mejor rango dinámico debido a la extracción de fondo.

Por ejemplo, considérese un patrón superior de 20.000 RLU y un patrón inferior de 1200 RLU en un fondo de 600 RLU.

Con fondo, el rango dinámico = \frac{20000}{1200} = 16,7

Sin fondo, el rango dinámico = \frac{20000-600}{1200-600} = 32,3

A continuación se describirán dos métodos ilustrativos de preparar sustratos 2 y realizar ensayos usando el sistema de las figuras 1 y 2.

Ejemplo 1 Ensayo multianalito de sulfonamida

En este ejemplo se inmovilizaron 12 anticuerpos individuales, cada anticuerpo específico para una sola sulfonamida, por unión covalente por interacciones de contacto en regiones discretas de una superficie químicamente modificada con epóxido de sustrato cerámico (óxido de aluminio).

Las sustancias cerámicas (1 cm x 1 cm) se limpiaron ultrasónicamente usando un detergente alcalino (RBS35 @ 5% V/V) seguido de agua desionizada doble y se colocaron después en 6M HCI durante 16 horas. Los chips (1 cm^{2}) se colocaron después en ácido crómico durante 1 hora en un baño ultrasónico.

Los chips se lavaron exhaustivamente con agua desionizada doble y acetona y secaron posteriormente en un horno a 120ºC durante 2 horas. Después de este pretratamiento, los chips se silanaron usando el organosilano \gamma-glicidoxypropil trimetoxisilano (10%V/V) en tolueno anhidro, 4-dimetil aminopiridina (1, 25 g/L) y trietilamina (1% V/V). Esta mezcla se sometió a reflujo durante 4 horas y después dejó durante la noche a temperatura ambiente. Los chips se lavaron con tolueno y acetona antes del curado durante 4 horas a 120ºC.

Después del paso de curado, los chips se colocaron en envases y almacenaron a temperatura ambiente hasta que fue necesario para observación de anticuerpos de sulfonamida. Los anticuerpos de sulfonamida se observaron usando un dispensador BIODOT XY3000 en la configuración ilustrada en la figura 5. Las sulfonamidas sometidas a ensayo eran sulfadoxina, sulfametizol, sulfacloropiridacina, sulfametoxipiridacina, sulfameracina, sulfapiridina, sulfisoxazol, sulfatiazol, sulfametacina, sulfaquinoxalina, sulfametoxina, y sulfadiacina.

Se emplearon volúmenes de dispensación de aproximadamente 20 nl para cada anticuerpo de sulfonamida. Los 12 anticuerpos de sulfonamida que formaron 12 zonas discretas en el chip de 1 cm^{2} se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Los chips se lavaron con salina fosfato tamponada (pH 7, 2) conteniendo 2% caseína (WN) y después bloquearon en la misma solución tampón durante la noche a +2-8ºC. Después de lavar con salina fosfato tamponada (PBS) conteniendo PEG300 (0,05% V/V), los chips se colocaron en el soporte de muestra 1.

Se añadieron patrones de multisulfonamida (200 \mul) y un cocktail de conjugados sulfonamida peroxidasa de rábano (100 \mul) a las cavidades del dispositivo según convenía e incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los patrones contenían 5 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml y 100 ng/ml para cada una de las 12 sulfonamidas.

A continuación, se lavaron los chips de multisulfonamida con tampón PBS/PEG para quitar los reactivos excedentes y se introdujeron 300 \mul de sustrato quimiluminiscente [luminol(1, 4mM)/urea peróxido de hidrógeno (9, 6mM)] por chip. Se tomaron imágenes de los chips usando un dispositivo de cámara CCD con un tiempo de exposición de hasta 4 minutos. Se prefiere una cámara CCD retroiluminada para mejorar la eficiencia de captura a la longitud de onda de la luz generada por la reacción de luz quimiluminiscente (aproximadamente 433-445 nm en el caso de luminol). Se obtuvieron las curvas estándar de cada una de las 12 sulfonamidas individuales usando el nuevo método de tratamiento de imágenes. Las curvas de calibración para cada una de las 12 sulfonamidas individuales se representan gráficamente en la figura 13. El valor % B/Bo representado en el eje Y representa la inhibición porcentual del valor RLU (Unidad relativa de luz) cero estándar producido por cada patrón de sulfonamida individual (representado en el eje X como log_{10}).

Este ejemplo muestra un ensayo multianalito para analitos de peso molecular bajo, donde el ensayo se basa en un formato de inmunoensayo competitivo.

Ejemplo 2 Ensayo de multianalito para prolactina (PL), hormona estimulante del folículo (FSH) y hormona luteinizante (LH)

En este ejemplo se realizó un ensayo multianalito para 3 hormonas de peso molecular grande. Este ejemplo representa un ensayo multianalito para un inmunoensayo intercalado. No se observó reactividad cruzada significativa cuando se determinaron las tres hormonas en el mismo panel. El pretratamiento químico y los procedimientos de silanación eran exactamente como se describe en el ejemplo 1.

Los anticuerpos monoclonales PL, FSH o LH individuales (aproximadamente 20 nl anticuerpo dispensado) se inmovilizaron en zonas discretas del sustrato químicamente modificado. Los ensayos multianalito se realizaron en sustratos de silicio y cerámica con una superficie de epóxido como se describe en el ejemplo 1.

Se añadieron en el ensayo 150 \mul de un patrón a base de suero LH/PL, FSH múltiple y 150 \mul de una solución tampón diluyente de ensayo al chip e incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de un paso de lavado, se añadieron 300 \mul de un solo cocktail de conjugados de LH-HRPO/PL-HRPO/FSH-HRPO e incubaron durante 15 minutos. A continuación, se lavaron los chips para quitar los reactivos excedentes y se introdujo el reactivo quimiluminiscente [luminol(1,4mM)/urea peróxido de hidrógeno (9,6mM)].

Se formaron imágenes de los chips usando un dispositivo de cámara CCD con un tiempo de exposición de hasta 4 minutos. Las curvas estándar para cada una de las hormonas se representaron después de procesar las imágenes usando el método tradicional de morfología/umbral y el nuevo método de tratamiento de imágenes.

Las curvas estándar se ilustran gráficamente en las figuras 10-15. Las curvas estándar obtenidas usando el método tradicional de morfología/umbral se marcan 80-85. Las curvas estándar obtenidas usando un ejemplo de un método de tratamiento de imágenes según la presente invención se marcan 86-91. Se puede ver que la linealidad y rango dinámico indicados por las curvas 86-91 es mayor que la linealidad y rango dinámico indicados por las curvas 80-85. La mayor linealidad y rango dinámico ofrece un considerable ahorro de tiempo para el usuario final, puesto que un rango dinámico ancho disminuye la necesidad de volver a comprobar muestras de prueba de concentración muy alta después de los pasos adicionales de dilución, para obtener un resultado exacto. La mejor linealidad/rango dinámico también mejora la presión dentro y entre ensayos para muestras de prueba, puesto que un pequeño cambio de RLU no afecta adversamente a los resultados. El rango dinámico incrementado tiene beneficios adicionales en términos de sensibilidad del ensayo, con mejor discriminación de los valores RLU de los lugares de reacción, permitiendo detectar niveles de analito más bajos.

Claims

1. Un método de analizar una pluralidad de lugares de reacción localizados, conteniendo cada uno una especie reactiva que reacciona con un analito respectivo y habiéndose expuesto cada uno a una muestra de prueba, incluyendo el método

detectar (66) radiación de los lugares de reacción para generar una imagen incluyendo una matriz de valores de pixel, siendo indicativa la radiación de cada lugar de reacción de la presencia o ausencia de un analito respectivo en la muestra de prueba;

dividir (67) la imagen en una pluralidad de regiones de imagen correspondiendo cada una a un lugar respectivo de los lugares de reacción; y

analizar (67) cada región de imagen, obteniendo por ello una pluralidad de valores de imagen siendo cada uno indicativo de la presencia o ausencia de un analito respectivo en la muestra de prueba,

donde analizar cada región de imagen para obtener el valor de imagen incluye:

(1): determinar el valor de pixel más alto en la región de imagen;

(2): calcular un valor de pixel umbral inferior a partir del valor de pixel más alto determinado en el paso (1) según un algoritmo predeterminado; y

(3): obtener el valor de imagen analizando estadísticamente los valores de pixel en la región de imagen que están en un rango definido por el valor de pixel umbral inferior calculado en el paso (2).

2. Un método según la reivindicación 1, incluyendo además calcular un valor de pixel umbral superior a partir del valor de pixel más alto determinado en el paso (1) según un segundo algoritmo predeterminado, donde el paso (3) incluye analizar estadísticamente los valores de pixel en la región de imagen que están en un rango definido por los valores umbral de pixel superior e inferior.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, donde los valores umbral de pixel inferior y/o superior se calculan como porcentaje predeterminado del valor de pixel más alto determinado en el paso (1).

4. Un método según la reivindicación 3, donde el valor de pixel umbral inferior está entre 50% y 90% del valor de pixel más alto determinado en el paso (1).

5. Un método según la reivindicación 4, donde el valor de pixel umbral inferior es 80% del valor de pixel más alto determinado en el paso (1).

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el valor de pixel umbral superior está entre 97% y 99% del valor de pixel más alto determinado en el paso (1).

7. Un método según la reivindicación 6, donde el valor de pixel umbral superior es 98% del valor de pixel más alto determinado en el paso (1).

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, incluyendo además quitar fondo de los valores de pixel.

9. Un método según la reivindicación 8, donde el fondo se quita mediante un proceso de erosión, dilatación, apertura y/o formación de umbral.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el valor de imagen se obtiene en el paso (3) calculando la media de los valores de pixel.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde cada reacción lugar está situado en un sustrato de estado sólido, y donde la o cada especie reactiva incluye un ligando unido covalentemente al sustrato.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la superficie del sustrato entre los lugares de reacción es inerte con respecto al analito.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la radiación incluye radiación quimiluminiscente, bioluminescente o fluorescente emitida desde cada lugar de reacción.

14. Un método de realizar un ensayo, incluyendo el método exponer una pluralidad de lugares de reacción localizados a una muestra de prueba, conteniendo cada lugar de reacción una especie reactiva que reacciona con un analito respectivo; y analizar el o cada lugar de reacción por un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores; y calcular la concentración de cada analito a partir de los valores de imagen respectivos.

15. Aparato para analizar uno o varios lugares de reacción localizados conteniendo cada uno una especie reactiva que reacciona con un analito respectivo y que ha sido expuesto a una muestra de prueba, incluyendo el aparato medios para detectar radiación del o cada lugar de reacción para generar una imagen incluyendo una matriz de valores de pixel, siendo indicativa la radiación del o cada lugar de reacción de la presencia o ausencia de un analito respectivo en la muestra de prueba; medios para dividir (67) la imagen en una pluralidad de regiones de imagen correspondiendo cada una a un lugar respectivo de los lugares de reacción; y medios para analizar cada región de imagen para obtener uno o varios valores de imagen siendo cada uno indicativo de la presencia o ausencia de un analito respectivo en la muestra de prueba, donde los medios de análisis incluyen:

(1) medios para determinar el valor de pixel más alto en la región de imagen;

(2) medios para calcular un valor de pixel umbral inferior a partir del valor de pixel más alto según un algoritmo predeterminado; y

16. Aparato para llevar a cabo un ensayo, incluyendo el aparato medios para exponer una pluralidad de lugares de reacción localizados a una muestra de prueba, conteniendo cada lugar de reacción una especie reactiva que reacciona con un analito respectivo; y un aparato según la reivindicación 15 para analizar los lugares de reacción y para calcular la concentración de cada analito a partir de los valores de imagen respectivos.