ES2233495T3 - Proteinas antigenicas protectoras contra toxinas de antrax mutadas que se dirigen especificamente a celulas que contienen altas cantidades de metaloproteinasas de la superficie celular o receptores del activador de plasminogeno. - Google Patents
Proteinas antigenicas protectoras contra toxinas de antrax mutadas que se dirigen especificamente a celulas que contienen altas cantidades de metaloproteinasas de la superficie celular o receptores del activador de plasminogeno.Info
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Abstract
Un procedimiento in vitro de dirección de un compuesto a una célula que sobreexpresa un activador de plasminógeno, el procedimiento comprendiendo las etapas de: (i) administrar a la célula una proteína de antígeno protector de Bacillus anthracis mutante que comprende un sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno en lugar del sitio de escisión reconocido por la furina del antígeno protector nativo, en la que el antígeno protector de Bacillus anthracis mutante está escindido por un activador de plasminógeno; y (ii)administrar a la célula un compuesto que comprende un polipéptido de factor letal de Bacillus anthracis que comprende un sitio de unión del antígeno protector; en el que el polipéptido del factor letal de Bacillus anthracis se une al antígeno protector escindido y se trasloca en la célula, por lo tanto distribuyendo el compuesto a la célula.
Description
Proteínas antigénicas protectoras contra toxinas
de ántrax mutadas que se dirigen específicamente a células que
contienen altas cantidades de metaloproteinasas de la superficie
celular o receptores de activador de plasminógeno.
Esta solicitud está relacionada con la patente de
Estados Unidos nº 5.591.631; patente de Estados nº 5.677.274; y
documentos USSN 08/937.276, presentado el 15 de septiembre de 1997;
cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva por
referencia en su totalidad. Esta solicitud reivindica prioridad al
documento USSN 60/155.691, presentado el 24 de septiembre de 1999,
que se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su
totalidad.
No aplicable.
La toxina del ántrax es una toxina de tres partes
secretada por Bacillus anthracis constituida por el antígeno
protector (PA, 83 kDa), factor letal (LF, 90 kDa) y factor edema
(EF, 89 kDa) (Smith, H., et al., J. Gen. MIcrobiol.,
29: 517 - 521 (1962); Leppla, S. H., Sourcebook of bacterial
protein toxins, p. 277 - 302 (1991); Leppla, S. H., Handb.
Nat. Toxins, 8: 543 - 572 (1995), que no son individualmente
tóxicas. El mecanismo mediante el cual los componentes individuales
de las toxinas interaccionan para producir toxicidad se revisó
recientemente (Leppla, S. H., Handb. Nat. Toxins, 8: 543 -
572 (1995)). El antígeno protector, reconocido como central,
componente de unión al receptor, se une a un receptor no
identificado (Escuyer, V., et al., Infect. Immun.,
59: 3381 - 3386 (1991)) y se escinde en la secuencia RKKR_{167}
(SEC ID Nº: 1) mediante furina de superficie celular o proteasas de
tipo furina (Klimpel, K. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89: 10277 - 10281 (1992); Molloy, S. S., et al
J. B. Chem., 267: 16396 - 16402 (1992)) en dos fragmentos:
PA63, un fragmento C - terminal de 63 kDa, que mantiene la unión al
receptor; y PA20, un fragmento
\hbox{N -}terminal de 20 kDa que se libera en el medio (Klimpel, K. R., et al., Mol. Microbiol., 13: 1094 - 1100 (1994)). La disociación de PA20 permite que PA63 forme un heptámero (Milne, J. C., et al., J. Biol. Chem., 269: 20607 - 20612 (1994); Benson, E. L., et al., Biochemistry, 37: 3941 - 3948 (1998)) y también se une LF o EF (Leppla, S. H., et al., Bacterial protein toxins, p. 111 - 112 (1988)). El complejo hetero - oligomérico resultante se internaliza mediante endocitosis (Gordon, V. M., et al., Infect. Ummun., 56: 1066 - 1069 (1988)), y acidificación de la vesícula produce la inserción del heptámero PA63 en la membrana endosomal para producir un canal a través del cual LF o EF traslocan al citosol (Friedlander, A. M., J. Biol. Chem., 261: 7123 - 7126 (1986)), donde LF y EF inducen procesos citotóxicos.
Así pues, la combinación de PA + LF, llamada
toxina letal de ántrax, mata animales (Beal, F. A., et al.,
J. Bacteriao., 83: 1274 - 1280 (1962); Ezzell, J. W., et
al., Infect. Immun., 45: 761 - 767 (1984)) y ciertas
células cultivadas (Friedlander, A. M., J. Biol. Chem., 261:
7123 - 7126 (1986); Hanna, P. C., et al., Mol. Biol.
Cell., 3: 1267 - 1277 (1992)), debido a la distribución
intracelular y acción de LF, recientemente demuestra que es una
metaloproteasa dependiente de cinc que se sabe que escinde al menos
dos dianas, quinasa 1 y 2 de la protein quinasa activada por
mitógenos (Duesbery, N. S., et al., Science,
280: 734 - 737 (1998); Vitale, G., et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 248: 706 - 711 (1998)). La combinación
de PA + EF, llamada toxina de edema, inutiliza los fagocitos y
probablemente otras células, debido a la actividad de la adenilato
ciclasa intracelular de EF (Leppla, S. H., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 79: 3162 - 3166 (1982)).
LF y EF tienen homología de secuencias sustancial
en aminoácido (aa) 1 - 250 (Leppla, S. H., Handb. Nat.
Toxins, 8: 543 - 572 (1995)), y un estudio de mutagénesis
mostró que esta región constituye el dominio de unión a PA (Quinn,
C. P., et al. J. Biol. Chem., 166: 20124 - 20130
(1991)). La supresión sistemática de las proteínas de fusión de LF
que contienen el dominio catalítico de la endotoxina A de
Pseudomonas estableció que LF aa 1 - 254 (LFn) son
suficientes para lograr la traslocación de polipéptidos
"pasajeros" al citosol de las células en un procedimiento
dependiente de PA (Arora, N., et al., J. Biol. Chem.,
267: 15542 - 15548 (1992); Arora, N., y col., J. Biol.
Chem., 268: 3334 - 3341(1993)). Se ha desarrollado una
alta toxicidad de la fusión de LFn al dominio de ribosilación de
ADP de la endotoxina A de Pseudomonas, denominada FP59,
(Arora, N., y col., J. Biol. Chem., 268: 3334 -
3341(1993)). Cuando se combina con PA, FP59 destruye
cualquier tipo de célula que contiene receptores para PA mediante
el mecanismo de inhibición de la síntesis de proteínas inicial a
través de ADP que ribosila la inactivación del factor 2 de
elongación (EF - 2), mientras que el LF nativo es altamente
específico para los macrófagos (Leppla, S. H., Handb. Nat.
Toxins, 8: 543 - 572 (1995)). Por esta razón, FP59 es un
ejemplote un potente agente terapéutico cuando se distribuye
específicamente a las células diana con un PA específico de
diana.
La estructura cristalina de PA en 2.1 se resolvió
mediante difracción de rayos X (PDB acceso 1ACC) (Petosa, C., et
al., Nature, 385: 833 - 838 (1997)). PA es una molécula
plana, de cola que tiene cuatro dominios distintos que se pueden
asociar a las funciones previamente definidas mediante análisis
bioquímico. El dominio 1 (aa 1 - 258) contiene dos iones de calcio
unidos estrechamente, y un gran bucle flexible (aa 162 - 175) que
incluye la secuencia RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1), que se escinde
por la furina durante la activación proteolítica. El dominio 2 (aa
259 - 487) contiene varias hebras \beta muy largas y forma el
núcleo del canal insertado en las membranas. También tiene un gran
bucle flexible (aa 303 - 319) implicado en la inserción en las
membrana. El dominio 3 (aa 488 - 595) no tiene función conocida. El
dominio 4 (aa 596 - 735) está débilmente asociado a los otros
dominios y está implicado en la unión a receptores. Para la
escisión en RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1), requerida absolutamente
para las etapas posteriores en acción de las toxinas, debe ser de
gran interés diseñar por ingeniería genética las secuencias de
escisión de algunas proteasas asociadas a enfermedades, tales como
metaloproteinasas de matriz (MMP) y proteasas del sistema de
activación de plasminógeno (por ejemplo, t - PA, u - PA, etc.,
véase, por ejemplo, Romer et al., APMIS 107: 120 -
127 (1999)), que típicamente se sobreexpresan en tumores.
Las MMP y activadores de plasminógenos son
familias de enzimas que juegan un papel conductor tanto en el
rendimiento normal como en la destrucción patológica de la matriz
extracelular, incluyendo remodelación de tejidos (Birkedal - Hansen,
H., Curr Opin Cell Biol, 7: 728 - 735 (1995); Alexander, C.
M., et al., Development, 122:
\hbox{1723 -}1736 (1996)), angiogénesis (Schnaper, H. W., et al., J Cell Physiol, 156: 235 - 246 (1993); Brooks, P. C., et al., Cell, 92: 391 - 400 (1998)), invasión tumoral y formación de metástasis. Los miembros de la familia de MMP son multidominios, que contienen cinc, endopeptidasas neutras e incluyen las colagenasas, estromelisinas, gelatinasas, y metaloproteinasas de tipo membrana (Birkedal - Hansen, H., Curr Opin Cell Biol., 7: 728 - 735 (1995)). Se ha documentado bien en los años recientes que las MMP y las proteínas del sistema de activación de palsminógenos, por ejemplo, receptores de activadores de plasminógenos y activadores de plasminógenos, se sobreexpresan en una diversidad de tejidos tumorales y líneas de células tumorales y están altamente correlacionadas con la invasión tumoral y metástasis (Craw ford, H.C., et al., Invasion Metastasis, 14: 234 - 245(1995); Garbisa, S., et al., Cancer Res., 47: 1523 - 1528(1787); Himelstein, B.P., et al., Invest. Methods, 14: 246 - 258(1995); Juarez, J., et al., Int. J. Cancer, 55: 10 - 18 (1993); Kohhn, E.C., et al., Cancer Res. 55: 1856 - 1862 (1995); Levy, A.T., et al., Cancer Res., 51;439 - 444 (1991); Mignatti, P., et al., Physiol. Rev., 73: 161 - 195 (1993); Montgomery, A.M., et al., Cancer Res., 53: 693 - 700 (1993); Stetler - Stevenson, W.G., et al., Annu Rev Cell Biol, 9: 514 - 573 (1993); Stetler - Stevenson, W.G., Invest. Methods, 14: 4664 - 4671 (1995); Davidson, B., et al., Gynecol. Oncol., 73: 372 - 382 (1999); Webber, M.M., et al., Carcinogenesis, 20: 1185 - 1192 (1999); Johansson, N., et al., Am J Pathol, 154: 469 - 480 (1999); Ries, C., et al., Clin Cancer Res., 5: 1115 - 1124 (1999); Zeng, Z.S., et al., Carcinogenesis, 20: 749 - 755 (1999); Gokaslan, Z.L. et al., Clin Exp Metastasis, 16: 721 - 728 (1998); Forsyth, P.A., et al., Br J Cancer, 79: 1828 - 1835 (1999); Ozdemir, E., et al., J Urol, 161: 1359 - 1363 (1999); Nomura, H., et al., Cancer. Res., 55: 3263 - 3266 (1995); Okada, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92: 2730 - 2734 (1995); Sato, H., et al., Nature, 370: 61 - 65 (1995); Chen, W.T., et al., Ann N Y Acad Sci, 878: 361 - 371 (1999); Sato, T., et al., Br J Cancer, 80: 1137 - 43 (1999); Polette, M., et al., Int J Biochem cell Biol., 30: 1195 - 1202 (1998); Kitagawa, Y., et al., J Urol., 160: 1540 - 1545; Nakada, M., et al., Am J Pathol., 154: 417 - 428 (1999); Sato, H., et al., Thromb Haemost, 78: 497 - 500 (1997)).
Entre las MMP, se reseña que la MMP - 2
(gelatinasa A), la MMP - 9 (gelatinasa B) y la MMP de tipo 1 de
membrana (MT1 - MMP) son las más relacionadas con la invasión y
metástasis en diversos cánceres humanos (Crawford, H. C., et
al., Invasion Metastasis, 14: 234 - 245 (1995); Garbisa,
S., et al., Cancer Res., 47: 1523 - 1528 (1987); Himelstein,
B.P., et al., Invest. Methods, 14: 246 - 258 (1995);
Juarez, J., et al., Int J. Cancer, 55: 10 - 18 (1993);
Kohn, E.C., et al., Cancer Res., 55: 1856 - 1862
(1995); Levy, A.T., et al., Cancer Res., 51: 439 -
444 (1991); Mignatti, P., et al., Physiol. Rev., 73:
161 - 195 (1993); Montgomery, A.M., et al., Cancer
Res., 53: 693 - 700 (1993); Stetler - Stevenson, W.G., et
al., Annu Rev Cell Biol, 9: 541 - 573 (1993); Stetler -
Stevenson, W.G., Invest Methods, 14: 4664 - 4671 (1995);
Davindson, B., et al., Gynecol. Oncol., 73: 372 - 382
(1999); Webber, M.M., et al., Carcinogenesis, 20:
\hbox{1185 -}1192 (1999); Johansson, N., et al., Am J Pathol, 154: 469 - 480 (1999); Ries, C., et al., Clin Cancer Rex., 5: 1115 - 1124 (1999); Zeng, Z.S., et al., Carcinogenesis, 20: 749 - 755 (1999); Gokaslan, Z.L., et al Clin Exp Metastasis, 16: 721 - 728 (1998); Forsyth, P.A., et al., Br J Cancer, 79: 1828 - 1835 (1999); Ozdemir, E., et al., J Urol, 161:
1359 - 1363 (1999), Nomura, H., et al., Cancer. Res., 55: 3263 - 3266 (1995); Okada, Y., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA., 92: 2730 - 2734 (1995); Sato, H., et al., Nature, 370: 60 - 65 (1994); Chen, W.T., et at., Ann N Y Acad Sci, 878: 361 - 371 (1999); Sato, T., et al., Br J Cancer, 80: 1137 - 43 (1999); Polette, M., et al., Int J Biochem cell Biol., 30: 1195 - 1212 (1998); Kitawa, Y., et al., J Urol., 160: 1540 - 1545; Nakada, M., et al., Am J Pathol., 154: 417 - 428 (1999); Sato, H., et al., Thromb Haemost, 78: 497 - 500 (1997)). El papel importante de las MMP durante la invasión tumoral y metástasis es descomponer la matriz extracelular de tejidos y la disolución de membranas basales endoteliales, permitiendo que las células tumorales invadan de un lado a otro el estroma y paredes de los vasos sanguíneos en los sitios primarios y secundarios. Las MMP también participan en al neoangiogénesis tumoral y regulan hacia arriba selectivamente la proliferación de las células endoteliales en los tejidos tumorales (Schnaper, H. W., et al., J Cell Physiol, 156: 235 - 246 (1993); Brooks, P. C., et al., Cell 92: 391 - 400 (1998); Chambers, A. F., et al., J Nat Cancer Inst, 89: 1260 - 1270 (1997)). Además, estas proteasas pueden contribuir al crecimiento sostenido de focos tumorales establecidos mediante la escisión del ectodominio de las proformas unidas a membranas de los factores de crecimiento, péptidos de liberación que son mitógenos para las células tumorales y/o células endoteliales vasculares (Arribas, J., et al., J Biol Chem, 271: 11376 - 11382 (1996); Suzuki, M., et al., J Biol Chem, 273: 31730 - 31737 (1997)).
Sin embargo, las manifestaciones catalíticas de
las MMP y los activadores de plasminógenos están regulados en gran
medida. Por ejemplo, las MMP se expresan como formas de zimógenos
activas y requieren la activación antes de que puedan ejercer sus
actividades proteolíticas. La activación de los zimógenos de las MMP
implica la proteolisis secuencial del propéptido N - terminal que
bloquea la hendidura del sitio activo, mediada por mecanismos
proteolíticos, a menudo conduciendo a un proceso autoproteolítico
(Springman, E. B., et al., Proc Natl Acad Sci USA,
87:
\hbox{364 -}368 (1990); Murphy, G., et al., APMIS, 107: 38 - 44 (1999)). Segundo, una familia de proteínas, los inhibidores de tejidos de las metaloproteinasas (TIMP), se extienden de manera correspondiente en distribución y función de tejidos como inhibidores de las MMP altamente eficaces (Ki aproximadamente 10^{ - 10} M) (Birkedal - Hansen, H., et al., Crit Rev Oral Biol Med, 4: 197 - 250 (1993)). Aunque las actividades de las MMP están estrechamente controladas, las células invasoras de tejidos que utilizan la capacidad degenerativa de las MMP evaden de alguna manera estos controles reguladores negativos, pero los mecanismos no se entienden bien.
Las contribuciones de las MMP en el desarrollo
tumoral y proceso metastático conducen al desarrollo de terapias
que usan inhibidores de síntesis de las MMP (Brown, P. D., Adv
Enzyme Regul, 35: 293 - 301 (1995);
\hbox{Wojtowicz -}Praga S., et al J Clin Oncol, 16: 2150 - 2156 (1998); Drummond, A. H., et al., Ann N Y Acad Sci, 30: 228 - 235 (1999)). Entre una multitud de inhibidores de síntesis generados, Marimastat se emplea ya clínicamente en tratamiento de cáncer (Drummond, A. H., et al., Ann N Y Acad Sci, 30: 228 - 235 (1999)).
En este documento, como alternativa al uso de los
inhibidores de las MMP, los inventores han explorado una estrategia
novedosa usando PA modificados que se podrían solamente activar
mediante las MMP o activadores de plasminógenos para destruir
especialmente las células tumorales que expresan activadores de las
MMP o plasminógenos. Los mutantes de PA se construyen para que el
sitio de reconocimiento de la furina se reemplace por secuencias
susceptibles a escisión mediante las MMP o y activadores de
plasminógenos. Cuando se combinan con LF o una proteína de fusión
LF que comprende el sitio de unión a PA, estos mutantes de PA se
escinden específicamente mediante células cancerosas, que exponen el
sitio de unión a LF y trastocan el LF o la proteína de fusión LF en
la célula, por lo tanto distribuyendo específicamente un compuesto,
por ejemplo, un agente terapéutico o de diagnóstico, a la
célula.
Las metaloproteinasas de matriz ("MMP") y
las proteínas del sistema de activación de plasminógeno (por
ejemplo, t - PAR, u - PAR, u - PA, t - PA) se sobreexpersan en una
diversidad de tejidos tumorales y líneas celulares de tumores y
están altamente correlacionadas con invasión y metástasis tumoral.
Además, estas proteínas se sobreexpresan en otras células tales como
células inflamatorias. En este documento los inventores
construyeron mutantes de antígeno protector (PA) de toxina de
ántrax, en los que el sitio de furina se reemplaza por secuencias
específicamente escindidas por activadores de plasminógenos. Los
mutantes de PA dirigidos por activadores de plasminógenos se
activan solamente mediante células tumorales que expresan
activadores de plasminógenos, de manera que específicamente
distribuyen una toxina, un agente de diagnóstico o terapéutico. La
activación se produce principalmente sobre la superficie celular,
que da como resultado la traslocación y distribución de los
compuestos. Los compuestos pueden ser agentes de diagnóstico o
terapéuticos. Preferiblemente los compuestos se distribuyen a las
células de un sujeto humano que padece cáncer, por lo tanto
destruyendo las células cancerosas y tratando el cáncer.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un procedimiento de dirección de un compuesto a una célula
sobreexpresa un activador de plasminógeno, el procedimiento
comprendiendo las etapas de: (i) administrar a la célula una
proteína de PA mutante que comprende un sitio de escisión
reconocidos por el activador de plasminógeno en lugar del sitio de
escisión reconocido por furina de PA nativa, en el que la PA
mutante se escinde por un activador de plasminógeno; y (ii)
administrar a la célula un compuesto que comprende un polipéptido
de LF que comprende un sitio de unión a PA; en el que el polipéptido
de LF se une a PA escindida y se trasloca en la célula, por lo
tanto distribuyendo los compuestos a la célula.
En una realización, al célula sobreexpresa una
metaloproteínasa de matriz. En otra realización, la
metaloproteínasa de matriz se selecciona entre el grupo constituido
por MMP - 2 (gelatinasa A), MMP - 9 (gelatinasa B) y MMP de tipo 1
de membrana (MT1 - MMP). En otra realización, el sitio de escisión
reconocido por la metaloproteinasa de matriz se selecciona entre el
grupo constituido por GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (EC ID Nº:
3).
En una realización, la célula sobreexpresa un
activador de plasminógeno o receptor de activador de plasminógeno.
En otra realización, el activador de plasminógeno se selecciona
entre el grupo constituido por t - PA (activador de plasminógeno de
tipo de tejido) y u - PA (activador de plasminógeno de tipo
uroquinasa). En otra realización, el sitio de escisión reconocido
por el activador de plasminógeno se selecciona entre el grupo
constituido por PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4), PGSGRSA (SEC ID Nº: 5),
PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), y PQRGRSA (SEC ID Nº: 7).
En una realización, la célula es una célula
cancerosa. En otra realización, el cáncer se selecciona entre el
grupo constituido por cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de
vejiga, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, cáncer de pulmón,
cáncer de pleura, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de
cuello de útero, cáncer de colon, fibrosarcoma, neuroblastoma,
glioma, melanoma, leucemia monocítica, y leucemia mieloide. En otra
realización, la célula es una célula inflamatoria. En otra
realización, la célula es una célula humana.
En una realización, el polipéptido de factor
letal es factor letal nativo. En otra realización, el compuesto es
factor nativo letal.
En una realización, el polipéptido de factor
letal se une a un compuesto heterólogo. En otra realización, el
compuesto es un agente de diagnóstico o terapéutico. En otra
realización, el compuesto es toxina disentérica, la cadena A de
toxina de difteria, o la exotoxina A de Pseudomonas. En otra
realización, el compuesto es un resto a ácido nucleico
detectable.
En una realización el compuesto está de manera
covalente al factor letal mediante un enlace químico. En otra
realización, el compuesto heterólogo se une de manera recombinante
al factor letal.
En una realización, la proteína de PA mutante es
una proteína de fusión que comprende un dominio de unión al
receptor heterólogo. En otra realización, el dominio de unión al
receptor heterólogo se selecciona entre el grupo constituido por un
anticuerpo de cadena individual y un factor de crecimiento.
En un aspecto, la presente invención proporciona
una proteína de antígeno protector mutante aislado que comprende
una metaloproteinasa de matriz o un sitio de escisión reconocido
por el activador de plasminógeno en lugar del sitio de escisión
reconocido por la furina de antígeno protector nativo, en el que el
antígeno protector mutante se escinde por una metaloproteinasa de
matriz o un activador de plasminógeno.
En una realización, la metaloproteinasa de matriz
o sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno se
selecciona entre el grupo constituido por PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4),
PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), PQRGRSA (SEC ID Nº:
7), GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3).
Fig. 1. Generación de mutantes de PA se pueden
procesar específicamente mediante las MMP. (A). Representación
esquemática de mutantes de PA de sustrato de las MMP. El sitio de
escisión por furina RKKR (SEC ID Nº: 1) se reemplazó con secuencias
de sustratos favoritos de gelatinasa GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) en PA
L1 y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3) en PAL2. Las flechas muestran los
sitios de escisión por la furina o las MMP como se indica. (B).
Escisión de PA - L1 mediante las MMP - 2, MMP - 9 y la furina de
forma soluble. Como se describe en materiales y procedimientos, PA
- L1 se incubó con las MMP - 2, MMP - 9 y furina, respectivamente,
se retiraron alícuotas en los instantes indicados, y las muestras
se analizaron mediante transferencia de western con el anticuerpo
policlonal de conejo frente a PA. (C). Escisión de PA - L2 mediante
las MMP - 2, MMP - 9 y la furina de forma soluble. PA - L2 se trató
como en B. (D). Escisión de WT - PA mediante las MMP - 2, MMP - 9 y
la furina de forma soluble. WT - PA se trató como en B.
Fig. 2. Análisis zimográfico de las gelatinasas
asociadas al medio reacondicionado libre de suero (A) o extractos
de Triton X - 100 (B) de células Vero, células HT 1080 y células
A2058. 1 mg de proteína de extracto celular, o volúmenes de medio
reacondicionado (3 - 4 ml) normalizado a la concentración de
proteína de los extractos celulares correspondientes se analizaron
mediante zimografía en gelatina como se describe en materiales y
procedimien-
tos.
tos.
Fig. 3. Citotoxcidad de PA - L1 y PA - L2 (A) o
forma cortada de ellas (B) para las células Vero que no expresa las
MMP. Como se describe en materiales y procedimientos, las células
Vero se cultivaron en placas de 96 pocillos hasta 80 - 100% de
confluencia se lavaron y se reemplazaron con medio DMEM exento de
suero. Después concentraciones diferentes (entre 0 y 1000 ng/ml) de
WT - PA, PA - L1 y PA - L2, o PP - L1 y PA - L2 cortadas por MMP - 2
combinadas con FP59 (constante a 50 ng/ml) se añadieron
separadamente a las células. Las toxinas se dejaron en el medio
durante 48 horas, o se retiraron y se reemplazaron con DMEM
reciente que contiene suero después de 6 horas. Se añadió MTT para
determinar la viabilidad celular a las 48 horas. PA - L1 y PA - L2
cortadas se prepararon mediante la escisión de PA - L1 y PA - L2
por la MMP - 2 activa a 37ºC durante 3 horas como se describe en
materiales y proce-
dimientos.
dimientos.
Fig. 4. Citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 para
las células HT1080 (A) tumorales que expresan MMP, células A2058
(B) y células MDA - MB 231. Como se describe en materiales y
procedimientos, las células HT1080 y A2058 se cultivaron hasta 80 -
100% de confluencia, se lavaron y se reemplazaron con medio DMEM
exento de suero. Después concentraciones diferentes (entre 0 y 1000
ng/ml) de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 combinadas con FP59 (constante
a 50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células y se incubaron
durante 6 horas y 48 horas. Se añadió MTT para determinar la
viabilidad celular a las 48 horas.
Fig. 5. Efecto de inhibidores de MMP sobre la
citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 para las células HT 1080. Las
células HT 1080 se cultivaron hasta 80% de confluencia en placas de
96 pocillos, y se lavaron dos veces con DMEM exento de suero.
Después los inhibidores de MMP GM6001, BB94 y BB2516 se añadieron a
las células a una concentración final de 10 \muM en DMEM exento
de suero. Después de 300 minutos la preincubación con los
inhibidores de MMP, WT - PA, PA - L1 y PA - L2 (300 ng/ml) se
combinaron con FP59 (50 ng/ml) se añadieron separadamente a las
células y se incubaron durante 6 horas. Después de eso, el medio que
contenía las toxinas e inhibidores de MMP se retiraron, y se añadió
medio que contiene suero reciente y la incubación continuó hasta 48
horas. Se añadió MTT para determinar la viabilidad celular como se
describe en materiales y procedimientos.
Fig. 6. PA - L1 y PA - L2 destruían
selectivamente las células tumorales que expresan las MMP en un
modelo de co - cultivo. Como se describe en materiales y
procedimientos, las células Vero, HT 1080, MDA - MB - 231 y A2058 se
cultivaron en las cámaras separadas de portaobjetos de 8 cámaras
hasta 80 a 100% de confluencia. Después los portaobjetos con
particiones retirados se pusieron en placas petri de 100 mm con
medio exento de suero, de manera que las células diferentes estaban
en el mismo ambiente de cultivo. WT - PA, PA - L1 o PA - L2 (300
ng/ml) cada una se combinó con FP59 (50 ng/ml) se añadieron
separadamente a las células, y se incubaron hasta 48 horas. Se
añadió MMT para determinar la viabilidad celular. Inserción,
después 48 horas después de que la MMT de exposición a la toxina se
añadiera a las células, las células vivas convertían MTT en tinte
azul, que precipitaba en el citosol, mientras las células muertas
permanecían sin colorearse.
Fig 7. Unión y activación de procesamiento de PA,
PA - L1 y PA - L2 sobre al superficie de células Vero (A) y HT 1080
(B). Como se describe en materiales y procedimientos, las células
Vero y HT 1080 se cultivaron en placas de 24 pocillos hasta 80 -
100% de confluencia, se lavaron y se cambiaron a medio exento de
suero. Después PA,
\hbox{PA -}L1 y
PA - L2 se añadieron a las células con una concentración final de 100 ng/ml, se incubaron durante tiempos diferentes (0, 10 minutos, 40 minutos, 120 minutos y 360 minutos). Los lisados celulares se prepararon para análisis de transferencia de western usando anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5308) para comprobar el estatus de procesamiento de PA y mutantes de PA.
Fig. 8. El papel de MT1 - MMP transfectadas en la
citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 a células COS - 7. La
citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 a células COS - 7. Como se
describe en materiales y procedimientos, las células COS - 7 se
cultivaron hasta 80 - 100% de confluencia, se lavaron y se
reemplazaron con medio DMEM exento de suero. Después
concentraciones diferentes (entre 0 y 1000 ng/ml) de WT - PA, PA -
L1, PA - L2 combinadas con FP59 (constante a 50 ng/ml) se añadieron
separadamente a las células y se incubaron durante 6 horas y 48
horas. MTT se añadió para determinar la viabilidad celular a las 48
horas. Inserción: análisis zimográfico de extracto celulares y
sobrenadantes de cultivo de COS - 7 como se describe en materiales
y procedimientos, usando sobrenadante de HT 1080 como control. B.
Citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 a CosgMT1. Las células CosgMT1
se trataron de la misma manera que en A. Inserción: Comparación de
la expresión de MT1 - MMP de COS - 7 y células CosgMT1 mediante
transferencia de western usando un anticuerpo anti - MT1 - MMP de
conejo (AB815, CHEMICON Internacional, Inc.).
Fig. 9. Generación de proteínas de PA mutadas que
se pueden escindir específicamente mediante uPA o tPA. Escisión de
PA y proteínas de PA mutadas mediante la forma soluble de purina
(en el panel a), uPA (en el panel b) o tPA (en el panel c). Las
proteínas se incubaron con furina, uPA o tPA, durante los tiempos
indicados y las muestras se analizaron mediante SDS - PAGE y tinción
de Commassie en el panel a, o se diluyeron y se analizaron mediante
transferencia de western con anticuerpo policlonal de conejo frente
a PA en el panel b y c.
Fig. 10. Unión y procesamiento de pro - uPA
mediante diferentes líneas celulares. Células Vero, células Hela,
células A2058, y células Bowes se cultivaron en placas de 24
pocillos hasta confluencia, se lavaron y se incubaron en medio
exento de suero con 1 \mug/ml de pro - uPA y \mug/ml de glu -
plasminógeno durante 1 hora, después los lisados celulares se
prepararon para análisis de transferencia de western con anticuerpo
monoclonal frente a la cadena B de uPA (nº 394).
Fig. 11. Citotoxicidad de proteínas de PA mutadas
para uPAR que expresa células tumorales, células Hela (en el panel
a), células A2058 (en el panel b), y células Bowes (en el panel c)
se cultivaron hasta 50% de confluencia, se lavaron y se
reemplazaron con DMEM exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro
- uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno. Después diferentes
concentraciones (entre 0 y 1000 ng/ml) de PA, pA - U1, PA - U2, PA
- U3, PA - U4, y PA - U7 junto con FP59 (constante a 50 ng/ml) se
incubaron con las células durante 6 horas. Después las toxinas se
retiraron y se reemplazaron con DMEM reciente que contenía suero. Se
añadió MTT para determinar la viabilidad celular a las 48
horas.
Fig. 12. Citotoxicidad de proteínas de PA mutadas
para células Vero que no expresan uPAR. a. Las células Vero se
cultivaron en placas de 96 pocillos hasta 50% de confluencia, se
lavaron y se reemplazaron con DMEM exento de suero que contenía 100
ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno. Después las
células se trataron con toxinas como se ha indicado anteriormente.
Las células Vero se trataron como en el panel a, excepto que PA -
U2 cortada se usó para el ensayo de citotoxicidad. PA - U2 cortada
se preparó mediante escisión de PA - U2 con uPA a 37ºC durante 1
hora como se ha descrito en materiales y procedimientos.
Fig. 13. Unión y activación proteolítica de PA y
PA - U2 sobre la superficie de las células Vero (en el panel a) y
células Hela (en el panel b). Las células Vero y Hela se cultivaron
en placas de 24 pocillos hasta confluencia, se lavaron y se
cambiaron a medio exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro -
uPA y 1 \mug/ml de plasminógeno con o sin PAI - 1 (2 \mug/ml).
Después se añadieron PA y PA - U2 a las células con una
concentración final de 1000 ng/ml, se incubaron durante 30 minutos
o 120 minutos. Los lisados celulares se prepararon para análisis de
transferencia de Western usando anticuerpo policlonal anti - PA
de conejo (nº 5038) para comprobar el estatus de procesamiento de PA
y PA - U2 y el efecto de PAI - 1 sobre él.
Fig. 14. Efectos de PAI - 1sobre la
citotoxicidad de PA - U2 a células tumorales (en el panel a),
células A2058 (en el panel b), y células Bowes (en el panel c) se
cultivaron hasta 50% de confluencia en placas de 96 pocillos, se
lavaron y se incubaron con DMEM exento de suero que contenía 100
ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno con o sin 2
\mug/ml de PAI - 1, durante 30 minutos Después se añadieron a las
células diferentes concentraciones de PA y PA - U2 (entre 0 y 1000
ng/ml) combinadas con FP59 (50 ng/ml) y se incubaron durante 6
horas. Después de eso, se retiraron las toxinas y se reemplazaron
con DEM que contenía suero reciente. Se añadió MMT para determinar
la viabilidad a las 48 horas.
Fig. 15. Efectos de bloqueo de uPAR sobre la
citotoxicidad de PA - U2 a las células tumorales. Efectos de ATE
sobre la citotoxicidad de PA - U2 a células Hela, A2058, y Bowes.
b. Efectos del anticuerpo R3 que bloquea uPAR sobre la
citotoxicidad de PA - U2 a las células Hela, A2058 y Bowes. Las
células se cultivaron hasta 50% de confluencia, se lavaron y se
incubaron con DMEM exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro -
uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno, y diferentes
concentraciones de anticuerpo R3 que bloquea ATF o uPAR. Después PA
y PA - U2 (300 ng/ml) cada una) combinadas con FP59 (50 ng/ml) se
añadieron a las células y se incubaron durante 6 horas. Después de
eso, las toxinas se retiraron y se reemplazaron con DMEM que
contenía suero reciente. Se añadió MTT para determinar la
viabilidad celular a las 48 horas.
Fig. 16. PA - U2 destruyó selectivamente células
Hela que expresan uP AR en un modelo de co - cultivo. Las células
Vero y Hela se cultivaron en las cámaras separadas de portaobjetos
de 8 cámaras hasta confluencia. Después los portaobjetos con
particiones retirados se pusieron en placas petri de 100 con medio
exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro - uPa y 1 \mug/ml de
glu - plasminógeno, de manera que las células diferentes estaban en
el mismo ambiente de cultivo. PA y PA - U2 (1000 ng/ml) cada una
combinadas con FP59 (50 ng/ml) se añadieron separadamente a las
células, y se incubaron hasta 48 horas. Se añadió MTT para
determinar la viabilidad células. Inserción, PA - U2 se activó
selectiva y proteolíticamente sobre células Hela en un modelo de co
- cultivo. Las células se trataron de la misma manera que en A,
excepto que después de 2 horas de incubación con toxinas las
células se lavaron y se lisaron, y el estatus de procesamiento de
las proteínas de PA se detectaron mediante anticuerpo anti.- PA
como en la figura 14.
Fig. 17. Citotoxicidad de PA - U2, PA - U3, y PA
- U4 sobre las células que expresan tPA. Las células Bowes (a) y
células HUVEC (b) se cultivaron hasta 50% de confluencia, se
lavaron y se reemplazaron con DMEM exento de suero sin pro - uPA y
glu - plasminógeno. Después las células se trataron con diferentes
concentraciones (entre 0 y 1000 ng/ml) de PA, PA - U2, PA - U3, y PA
- U4 junto con FP59 (constante a 50 ng/ml) durante 12 horas. Se
añadió MTT para determinar la viabilidad celular a las 48
horas.
La degradación proteolítica de la matriz
extracelular juega un papel crucial tanto en la invasión de cáncer
como en la remodelación del tejido no neoplásico, y en ambos casos
se lleva acabo mediante un número de proteasas. Las mejor conocidas
son el sistema de activación de plasminógeno que conduce a la
formación de la serina proteasa plasmina, y un número de
metaloproteinasa de matriz, incluyendo colagenasas, gelatinasas y
estromelisinas (Dano, K., el al., APMIS, 107: 120 -
127 (1999)). La estrecha asociación entre MMP y la sobreexpersión
de activadores de plasminógenos y metástasis tumoral se han
observado durante una década. Por ejemplo, las contribuciones de las
MMP en el desarrollo tumoral y proceso de metástasis conducen al
desarrollo de las terapias novedosas que usan inhibidores de
síntesis de las MMP (Brown, P. D., Adv Enzyme Regul, 35: 293
- 301 (1995); Wojtowicz - Praga S., et al J Clin
Oncol, 16: 2150 - 2156 (1998); Drummond, A. H., et al.,
Ann N Y Acad Sci, 30: 228 - 235 (1999)). Sin embargo, estos
inhibidores solamente reducen el crecimiento y no erradican los
tumores. El presente estudio es el primer esfuerzo para usar
toxinas bacterianas modificadas para dirigir las MMP y activadores
de plasminógeno, que se expresan en gran medida y se emplean por las
células tumorales para invasión. Las moléculas de PA mutantes en
las que el sitio de escisión por furina se reemplaza por una MMP o
sitio diana del activador de palsminógeno se puede usar para
distribuir compuestos tales como toxinas a la célula, por lo tanto
destruyendo la célula. Los compuestos tienen la capacidad de unirse
a PA mediante su interacción con LF y se traslocan mediante PA en
la célula. Los compuestos que comprenden PA y LF se administran a
las células o sujetos, preferiblemente mamíferos, más
preferiblemente seres humanos, usando técnicas conocidas por los
expertos en la técnica. Opcionalmente, los compuestos que
comprenden PA y LF se administran con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Los compuestos típicamente son bien LF nativo o
proteína de fusión de LF, es decir, aquellos que tiene un sitio de
unión a PA (aproximadamente los primeros 250 aminoácidos de LF,
Arora et al., J. Biol. Chem. 268: 3334 - 3341 (1993))
condensado a otro polipéptido o compuesto de manera que la proteína
o proteína de fusión se une a PA y se trasloca en la célula,
produciendo la muerte celular (por ejemplo, toxina FP59
recombinante, fusión 1 - 254 del residuo de factor letal de la
toxina de ántrax al dominio de ribosilación de ADP de la endotoxina
A de Pseudomonas). La fusión es típicamente química o
recombinante. Los compuestos condensados a LF incluyen, por ejemplo,
un agente terapéutico o de diagnóstico, por ejemplo, LF nativo, una
toxina, una toxina bacteriana, toxina de disentérica, cadena A de
toxina diftérica, endotoxina A de Pseudomonas, una proteasa,
un factor de crecimiento, una enzima, un resto detectable, un
compuesto químico, un ácido nucleico, o un polipéptido de fusión,
etc.
Las moléculas de PA mutantes de la invención se
pueden adicionalmente dirigir a una célula específica produciendo
proteínas de fusión de PA mutantes. En estas proteínas de fusión
mutantes, el dominio de unión al receptor de PA se reemplaza por
una proteína tal como un factor de crecimiento u otro ligando de
receptor de células expresado específicamente sobre las células de
interés. Además, el dominio de unión al receptor de PA se puede
reemplazar por un anticuerpo que se une a un antígeno expresado
específicamente sobre las células de interés.
Estas proteínas proporcionan una forma de
destruir específicamente células tumorales que contienen grandes
cantidades de activadores de MMP o plasminógenos asociados a la
superficie celular. Estas PA mutantes son por lo tanto útiles como
agentes terapéuticos para destruir específicamente células
tumorales.
Los inventores construyeron dos mutantes de PA,
PA - L1 y PA - L2, en los que el sitio de reconocimiento por furina
se reemplaza por las secuencias susceptibles a escisión por las
MMP, especialmente MMP - 2 y MMP - 9. Cuando se combinan con FP59,
estas dos proteínas de PA mutantes destruían específicamente células
tumorales que expresan MMP, tales como HT1080 de fibrosarcoma
humano y A2058 de melanoma humano pero no destruían las células que
no expresan MMP. El ensayo de citotoxicidad en el modelo de co -
cultivo, en el que las células estaban en el mismo ambiente de
cultivo y eran igual de accesibles para las toxinas en el
sobrenadante, mostraron que PA - L1 y PA - L2 destruían
específicamente solamente las células tumorales HT 1080 y A2058 que
expresan MMP, no las células Vero. Este resultado demostró que el
procesamiento de activación de PA - L1 y PA - L2 se producía
principalmente sobre las superficies celulares y contribuían en su
mayoría con las MMP asociadas a membranas, así la citotoxicidad se
restringe a las células tumorales que expresan las MMP. Las TIMP
están ampliamente presentes en medio extracelular e inhiben la
actividad de las MMP en los sobrenadantes. Las proteínas PA se unen
a las células muy rápidamente con un máximo de unión que sucedía
dentro de 60 minutos. En contraste a las MMP secretadas, las MMP
asociadas a membranas expresan sus actividades proteolíticas más
eficazmente anclándose sobre la membrana celular y gozando de dos
propiedades ventajosas distintas, que se localizan en gran medida
sobre los sustratos de matriz extracelular y son más resistentes a
los inhibidores de las proteinasas en el medio extracelular.
Recientemente se ha mostrado que concentraciones
de plasmina pueden activar tanto la MMP - 2 como la
\hbox{MMP -}9 sobre la superficie de la célula de HT1080 mediante un mecanismo independiente de MMP o actividades de proteinasas ácidas (Mazzieri, R., et al., EMBO J., 16: 2319 - 2332 (1997)). En contraste, en la plasmina en fase soluble degrada tanto la MMP - 2 como la MMP - 9 (Mazzieri, R., et al., EMBO J., 16: 2319 - 2332 (1997)). Así pues, la plasmina puede proporcionar un mecanismo que mantiene las actividades de la gelatinasa sobre la superficie celular que promueve la invasión celular. Se ha establecido bien que la MMT - 1 MMP funciona tanto como activador como receptor de la MMP - 2, pero no tiene efecto sobre la MMP - 9 (véase revisión de Polette, M., et al., J Biochem cel Biol., 30:
\hbox{1195 -}1202 (1998); Sato H., et al., Thromb Haemost, 78: 497 - 500 (1997)). Un complejo MMP - 2/TIMP - 2 se une a MT1 - MMP sobre la superficie celular, que sirve como sitio de alta afinidad, después se activa proteolíticamente mediante una MT1 - MMP adyacente, que sirve como activador. Trabajos recientes han mostrado que los receptores de adhesión, tales como la integrina \alphav\beta3 (Brooks, P. C. et al., Cell, 85: 683 - 693 (1996)) y el receptor CD44 de hialuronano de superficie celular (Tu, Q., et al., Gene Development, 13: 35 - 48 (1999)), puede proporcionar medios para retener las MMP - 2 o MMP - 9 activas solubles que invaden la superficie de células tumorales, donde sus actividades proteolíticas promueven lo más probable la invasión celular. Para las actividades de las MMP implicadas en invasión tumoral y metástasis se localizan y/o modulan sobre la superficie celular en la fase soluble, esto hace que las MMP sean una diana ideal para tejidos tumorales.
Originalmente se pensó que el papel de las MMP y
activadores de plasminógenos simplemente descomponían las barreras
titulares para promoverla invasión tumoral y metástasis. Ahora se
entiende, por ejemplo, que las MMP también participan en
neoangiogéensis de tumores y se regulan hacia abajo selectivamente
para la proliferación de células endoteliales. Por lo tanto, éstos
toxinas bacterianas modificadas pueden tener las propiedades
ventajosas de dirigirse a no solamente a las propias células
tumorales sino también las células endoteliales vasculares
divisoras que son esenciales para la neoangiogénesis en tejido
tumorales. Por lo tanto, las toxinas dirigidas a las MMP también
pueden destruir células tumorales mediante la privación a las
células de nutrientes celulares y oxígeno.
Las moléculas de PA mutantes de la invención se
pueden dirigir también específicamente a las células usando
proteínas de fusión de PA mutantes. En estas proteínas de fusión,
el dominio de unión a receptores de PA se reemplaza con un ligando
heterólogo o molécula tal como un anticuerpo que reconoce una
proteína de la superficie celular específica. La proteína de PA
tiene cuatro dominios estructuralmente distintos para realizar las
funciones de unión al receptor y traslocación de los restos
catalíticos a través de las membranas endosomales (Petosa, C.,
et al., Nature, 385: 833 - 838 (1997)). El dominio 4
es el dominio de unión al receptor y tiene contactos limitados con
otros dominios (Petosa, C., et al., Nature, 385: 833 -
838 (1997)). Por lo tanto, PA se puede dirigir específicamente a
receptores o antígenos expresados específicamente por tumores
reemplazando el dominio 4 con las moléculas determinantes de diana,
tales como anticuerpos de cadena sencilla o unas citoquinas usadas
por otras inmunotoxinas (Thrush, G. R., et al., Annu Rev
Immunol, 14: 49 - 71 (1996)). Por ejemplo, PA - L1 y PA - L2 se
dirigen a receptores alternativos, tales como el receptor GM - CSF,
que se expresa en gran medida en células de leucemia y tumores
sólidos incluyendo carcinomas renales, de pulmón, de mama y
gastrointestinal (Thrush, G. R., et al., Annu Rev
Immunol, 14: 49 - 71 (1996)); 74 - 79). Se debe esperar en gran
medida que la combinación de estos dos mecanismos de dirección
independiente debe permitir que los tumores sean dirigidos mas
eficazmente, y los efectos secundarios tales como hepatoxicidad y
síndrome de escape vascular se deben reducir
significativamente.
Con respecto al sistema de activación de
plasminógeno, se conocen dos activadores de plasminógeno, el
activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) y el activador
de plasminógeno de tipo tejido (tPA), de los cuales uPA es el
implicado principalmente en la degradación de matriz intracelular
(Dano, K., et al., APMIS, 107: 120 - 127 (1999)). uPA
es una serina proteasa de 52 kDa que se secreta como una proenzima
de cadena sencilla inactiva (pro - uPA) (Nielsen, L. S., et
al., Biochemistry, 21: 6410 - 6415 (1982); Petersen. L.
C., et al., J. Biol. Chem., 263: 11189 - 11195
(1988)). El dominio de unión de pro - uPAes el fragmento amino
terminal de tipo del factor de crecimiento epidérmico (ATF; aa 1 -
135, 15 kDa) que se une con alta afinidad (Kd = 0,5 mM) al
receptor de activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPAR)
(Cubenllis, M. V., et al., Proc. Natl. Acad Sci. U. S.
A., 86: 4828 - 4832 (1989)), un receptor unido a GPI. uPA es
una glicoproteína de tres dominio de 60 kDa cuyo dominio 1 N -
terminal contiene el sitio de unión de alta afinidad para ATF o pro
- uPA (Ploug, M., et al., J. Biol. Chem., 266: 1926 -
1933 (1991); Behrendt, N., et al., J. Biol. Chem.,
266: 7842 - 7847 (1991)). uPA se sobreexpresa sobre una diversidad
de tumores, incluyendo leucemias monocíticas y mieloide (Lanza, F.,
et al., Br. J. Haematol., 103: 110 - 123 (1998);
Plesner, T., et al., Am. J. Clin. Pathol., 102: 835 -
841 (1994)), y cánceres de mama (Carriero, M. V., et al.,
Clin. Cancer Res., 3: 1299 - 1308 (1997)), de vejiga (Hudson,
M. A., et al., J. Natl. Cancer Inst., 89: 709 - 717
(1997)), de tiroides (Ragno, P., et al., Cancer Res.,
58: 1315 - 1319 (1998)), de hígado (De Petro, G., et al.,
Cancer Res., 58: 2234 - 2239 (1998)), de pleura (Shetty, S.,
et al., Arch. Biochem. Biophys., 356: 265 - 279
(1998)), de pulmón (Morita, S., et al., Int. J.
Cancer, 78: 286 - 292 (1998)), de páncreas (Taniguchi, T., et
al., Cancer Res., 58: 4461 4467 (1998)), y de ovarios
(Sier, C. F., et al., Cancer Res., 58: 1843 - 1849
(1998)). Pro - uPA se une a uPAR mediante ATF, mientras que el
procedimiento de unión no bloquea el dominio catalítico, carboxi
terminal. Mediante la asociación con uPAR, pro - uPA está cerca y
posteriormente activada por cantidades pequeñas de plasmina unida a
la membrana plasmática mediante escisión de la cadena sencilla de
pro - uPA dentro de un bucle intra - molecular mantenido cerrado
mediante un puente disulfuro. Así pues, el uPA activo consiste en
dos cadenas (A + B) mantenidas juntas mediante este enlace
disulfuro (Ellis, V et al., J. Biol., Chem., 264:
2185 - 2188 (1989)).
El plasminógeno está presente a alta
concentración (1,5 - 2,0 \muM) en plasma y fluidos intersticiales
(Dano, K., et al., Adv Cancer Res., 44: 139 - 266
(1985)). La baja afinidad, alta capacidad de unión del plasminógeno
a las proteínas de la superficie celular los sitios de unión a
lisina de kringles de plasminógeno potencia considerablemente la
velocidad de activación de plasminógeno mediante uPA (Ellis, V
et al., J. Biol., Chem., 264: 2185 - 2188 (1989));
Stephens, R. W., et al., J. Cell. Biol., 108: 1987 -
1995 (1989)). La uPA activa tiene alta especificidad para Arg560 -
Val561 unidos en plasminógeno, y escisión entre estos residuos da
lugar a más plasmina que se denomina "activación de zimógeno
recíproco" (Petersen, L. C., Eur. J. Biochem., 245: 316 -
323 (1997)). El resultado de este sistema es la generación eficaz
de uPA activa y plasmina en la superficie celular. En este
contexto, uPAR sirve como molde para la unión y localización de pro
- uPA cerca de su plasminógeno sustrato sobre la membrana
plasmática.
A diferencia de la uPA, la plasmina es una
proteasa no específica, que escinde muchas glicoproteínas y
proteoglicanos de la matriz extracelular, así como fibrina (Liotta,
L. A. et al., Cancer Res., 41: 4629 - 4636 (1981)).
Por lo tanto, la plasmina unida a la superficie celular media la
proteolisis de matriz no específica que facilita la invasión y
metástasis de células tumorales mediante estructuras de tejidos
restringentes. Además, la plasmina puede activar algunas de las
metaloproteasas de matriz que también degradan la matriz tisular
(Werb, Z., et al., N. Engl. J. Med., 296: 1017 - 1023
(1977); DeClerck, Y. A., et al., Enzyme Protein, 49:
72 - 84 (1996)). La plasmina también puede activar factores de
crecimiento, tales como TGF - \beta, que pueden además modular
interacciones estromales en la expresión de enzimas y neo -
angiogénesis de tumores (Lyons, R. M., et al., J.
Cell., 106: 1659 - 1665 (1988)). La activación de plasminógeno
por uPA se regula por dos inhibidores fisiológicos, el inhibidor -
1 y 2 de activador de plasminógeno (PAI - 1 y PAI - 2) (Cubellis,
M. V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 86:
4828 4832 (1989); Ellis, V., et al., J. Biol. Chem.,
265: 9904 - 9908 (1990); Baker, M. S., et al., Cancer
Res., 50: 4676 - 7684 (1990)), mediante la formación de
complejo 1:1 con uPA. La plasmina generada en el sistema de
activación de plasminógeno de la superficie celular está
relativamente protegida de su inhibidor fisiológico principal
\alpha2-antiplasmina (Ellis, V., et al.,
J. Biol. Chem., 266: 12752 - 12758 (1991)).
La invasión de cáncer es esencialmente un proceso
de remodelación de tejido en el que el tejido normal se sustituye
con tejido canceroso. Los datos acumulados de estudios preclínicos
y clínicos sugerían fuertemente que el sistema de activación de
plasminógeno juega un papel central en los procesos que conducen a
la invasión tumoral y metástasis (Andreasen, P. A., et al.,
Int. J. Cancer, 72: 1 - 22 (1997); Chapman, H. A., Curr.
Opin. Cell Biol., 9: 714 - 724 (1997); Schmitt, M., et
al., Thromb. Haemost., 78: 285 - 296 (1997)). Los altos
niveles de uPA, uPAR y PAL - 1, pero de PAI - 2 disminuidos se
asocian al pobre resultado patológico (Schmitt, M., et al.,
Thromb. Haemost., 78: 285 - 296 (1997)). Los estudios de
hibridación in situ de los tejidos tumorales han mostrado
que usualmente células cancerosas expresaban altamente uPAR,
mientras las células estromales tumorales expresaban pro - uPA, que
posteriormente se une a uPAR sobre al superficie de las células
cancerosas donde se activa y por lo tanto genera plasmina (Pyke,
C., et al., Am. J. Pathol., 138: 1059 - 1067 (1991)).
La activación de pro - uPA que se restringe altamente a la
superficie de la célula tumoral, puede ser una diana ideal para
tratamiento de cáncer.
uPA y tPA poseen un grado extremadamente alto de
similitud estructural (Lamba, D., et al., J. Mol.,
Biol., 258: 117 - 135 (1996); Spraggon, G., et al.,
Structure, 3: 681 - 691 (1995)), comparten los mismos
sustratos fisiológicos primarios (plasminógenno) e inhibidores (PAI
- 1 y PAI - 2) (Collen, D., et al., Blood, 78: 3114 -
3124 (1991)), y muestra especificad de sustrato restringida.
Mediante el uso de los planteamiento de la exposición del fago de
sustrato y exposición del fago de sustracción de sustrato, las
investigaciones recientes habían identificado sustratos que
discriminan entre uPA y tPA, que muestran las secuencias de
sustratos de consenso con alta selectividad mediante uPA o tPA (Ke,
S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462
(1997)). Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272:
\hbox{16603 -}16609 (1997)). Para explotar las características únicas del sistema de plasminógeno de uPA y toxina de ántrax en el diseño de citotoxinas selectivas de células tumorales, en el trabajo descrito en esta memoria descriptiva, proteínas de PA de ántrax mutadas se construyeron de manera que el sitio de purina se reemplace por secuencias susceptibles a la escisión específica mediante uPA. Estas proteínas de PA dirigidas por uPAR/uPA se activaron selectivamente sobre la superficie de las células tumorales que expresan uPAR en presencia de pro - uPA, y producían internalización de una citotoxina FR59 recombinante para destruir selectivamente las células tumorales. También, una proteína de PA mutada se generó para que destruyera selectivamente las células que expresan activadores de plasminógeno de tipo tejido.
PA incluye un dominio de unión a receptor
celular, un dominio de traslocación, y un dominio de unión a LF.
Los polipéptidos de PA de la invención tienen al menos un dominio
de traslocación y un dominio de unión a LF. En la presente
invención, PA madura (83 kDa) es una realización preferida. Además
de la PA recombinante de longitud completa, las supresiones amino
terminal hasta el sitio de escisión de 63 kDa o adiciones a la PA
de longitud completa son útiles. Una forma recombinante de PA
tratada es también biológicamente activa y se puede usar en la
presente invención. También se construyen las proteínas de fusión de
PA en las que el dominio de unión a los receptores se ha suprimido,
para dirigir PA a tipos de células específicas. Aunque lo
anteriormente mencionado y la técnica anterior describen la
supresión específica y análisis de función de estructura de PA,
cualquier forma biológicamente activa de PA se puede usar en la
presente invención.
Los residuos amino terminal 1 - 254 de LF son
suficientes para la actividad de unión a PA. Los residuos de
aminoácidos 199 - 253 pueden no todos requerirse para la actividad
de unión de PA. Una realización de LF es los aminoácidos 1 - 254 de
LF nativo. Cualquier realización que contiene al menos
aproximadamente los aminoácidos
\hbox{1 -}254 de LF nativo se pueden usar en la presente invención, por ejemplo, LF nativo. Se prefieren las realizaciones no tóxicas de LF.
Las proteínas de fusión de PA y LF se pueden
producir usando ácidos nucleicos recombinantes que codifican una
proteína de fusión de cadena sencilla. La proteína de fusión se
puede expresar en forma de una cadena sencilla usando sistemas
biológicos in vivo o in vitro. Usando los
procedimientos actuales de síntesis química, los compuestos también
se pueden unir químicamente a PA o LF. La proteína de fusión se
puede ensayar empíricamente para evaluar la unión a receptor, unión
a PA o LF, e internalización siguiendo los procedimientos expuestos
en los ejemplos.
Además, los grupos funcionales capaces de formar
enlaces covalentes con los aminoácidos amino y carboxi terminal o
grupos secundarios de aminoácidos los conocen bien los expertos en
la técnica. Por ejemplo, los grupos funcionales capaces de unir el
grupo amino terminal incluyen anhídridos, carbodiimidas, cloruros
de ácidos y ésteres activados. De manera similar, los grupos al
funcionales capaces de formar enlaces covalentes con el carboxi
terminal incluyen aminas y alcoholes. Tales grupos funcionales se
pueden usar para unir el compuesto a LF en bien el extremo amino o
carboxilo. Los compuestos también se pueden unir a LF a través de
interacciones de grupos secundarios de residuos aminoácidos, tales
como el grupo SH de cisteína (véase, por ejemplo, Thorpe et
al., Monoclonal
\hbox{Antibody -}Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet, en Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, pp. 168 - 190 (1982); Waldmann, Science, 252: 1657 (1991); patentes de Estados Unidos números 4.545.985 y 4.894.443). El procedimiento para unir un agente a un anticuerpo u otra molécula que dirige el polipéptido variará según la estructura química del agente. Como ejemplo, un residuo cisteína puede añadirse en el extremo de LF. Ya que no existen otras cisteínas en LF, esta cisteína individual proporciona un punto de unión conveniente a través del cual se conjugan químicamente otras proteínas a través de enlaces disulfuro. Aunque ciertos de los procedimientos de la invención se han descrito por usar proteínas de fusión LF, se entenderá que otras composiciones que tienen compuestos unidos químicamente se pueden usar en los procedimientos de la invención.
Las proteínas de antígenos protectores se pueden
producir a partir de construcciones de ácidos nucleicos que
codifican mutantes, en los que el sitio de escisión por furina de
origen natural se ha reemplazado por una MMP o un sitio de escisión
activador de plasminógeno. Además, las proteínas LF y PA también se
pueden expresar a partir de construcciones de ácidos nucleicos según
la metodología habitual. Los expertos en al técnica reconocerán una
amplia diversidad de formas para introducir mutaciones en un ácido
nucleico que codifica antígeno protector o para construir un ácido
nucleico que codifica antígeno protector mutante. Tales
procedimientos se conocen bien en la técnica (véase Sambrook et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª edición,
1989); Kriegler, Gene Transfer and Expresión: A Laboratory
Manual (1990); a Current Protocols in Molecular Biology
(Ausubel et al., eds., 1994)). En algunas realizaciones, los
ácidos nucleicos de la invención se generan usando PCR (véase, por
ejemplo, los ejemplos I y III). Por ejemplo, el uso de los ácidos
nucleicos que codifican antígeno protector de PCR superpuesto se
pueden generar sustituyendo la subsecuencia de ácido nucleico que
codifica el sitio de furina con una subsecuencia de ácidos
nucleicos que codifica un sitio de metaloproteinasa de matriz (MMP)
(por ejemplo, GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3))
(véase, por ejemplo, el ejemplo I). De manera similar, un
procedimiento de PCR de superposición se puede usar para construir
las proteínas de antígeno protectoras en las que el sitio de furina
se reemplaza por un sitio de escisión de activador de plasminógeno
(por ejemplo, la secuencia de sustrato fisiológico de uPA tPA
PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4), la secuencia favorita de uPA PGSGRSA (SEC
ID Nº: 5), la secuencia favorita de uPA PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), o
la secuencia favorita de tPA PQRGRSA (SEC ID Nº: 7)) (véase, por
ejemplo, el ejemplo III).
Para obtener expresión de alto nivel de un ácido
nucleico (por ejemplo, ADNc, ADN genómico, producto de PCR, etc, o
las combinaciones de los mismos) que codifican una proteína de
antígeno protector nativa (por ejemplo, PA) o mutante (por ejemplo,
PA - L1, PA - L2, PA - U1, PA - U2, PA - U3, PA - U4, etc), LF, o
una proteína de fusión de PA o LF, se subclona típicamente el
antígeno protector que codifica el ácido nucleico en un vector de
expresión que contiene un fuerte promotor para la transcripción
directa, un terminador de trasncripción/traducción, y si para un
ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión a
ribosoma para el inicio de traducción. Los promotores bacterianos
adecuados se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo,
en Sambrook et al., y Ausubel et al. Los sistemas de
expresión bacterianos para expresar el ácido nucleico que codifica
antígeno protector están disponibles en, por ejemplo, E. coli,
Bacillus sp., y Salmonella (Palva et al.,
Gene 22: 229 - 235 (1983)). Los kits para tales sistemas de
expresión están comercialmente disponibles. Los sistemas de
expresión eucarióticos para células de mamíferos, levaduras, y
células de insectos se conocen bien en la técnica y están también
comercialmente disponibles.
En alguna realización, las proteínas que
contienen antígenos protectores se expresan en cepas no virulentas
de Bacillus usando plásmidos de expresión de Bacillus
que contienen secuencias de ácidos nucleicos que contienen la
proteína de antígeno protector particular (véase, por ejemplo,
Singh, Y., et al., J. Biol. Chem, 264: 19103 - 19107
(1989)). Las proteínas que contienen antígeno protector se pueden
aislar a partir del cultivo de Bacillus usando
procedimientos de purificación de proteínas (véase, por ejemplo,
Varughese, M., et al., Infect Immun, 67: 1860 - 1865
(2999)).
El promotor usado para dirigir la expresión de un
ácido nucleico que codifica el antígeno protector depende de la
aplicación particular. El promotor se posiciona preferiblemente
aproximadamente a la misma distancia del sitio de comienzo de
transcripción heteróloga en su establecimiento natural. Sin embargo,
como se sabe en la técnica, algunas variaciones en esta distancia
se pueden acomodar sin la pérdida de la función promotora. El
promotor típicamente también puede incluir elementos que son
sensibles a la transactivación, por ejemplo, elementos sensibles
Gal4, elementos sensibles represores lac, y similares. El promotor
puede ser constitutivo o inducible, heterólogo u homólogo.
Además del promotor, el vector de expresión
típicamente contiene una unidad de transcripción o módulo de
expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos
para la expresión del ácido nucleico en células hospedadoras. Así
pues un módulo de expresión típico contiene un promotor
operativamente unido, por ejemplo, a la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la proteína que contiene antígeno protector,
y las señales requeridas para la expresión eficaz y terminación y
procesamiento de la transcripción, sitios de unión a ribosomas, y
terminación de la traducción. La secuencia de ácidos nucleicos se
puede unir típicamente a una secuencia de péptidos señal escindible
para promover la secreción de la proteína codificada por la célula
transformada. Tales péptidos señal incluirían, entre otros, los
péptidos señal de proteínas bacterianas, o proteínas de mamíferos
tales como activador de plasminógeno de tejido, insulina, y factor
de crecimiento neuronal, y la estearasa de la hormona juvenil de
Heliothis virescens. Los elementos adicionales del módulo
pueden incluir potenciadores y, si se usa ADN genómico como gen
estructural, intrones con sitios dadores y aceptores de ayuste.
Además de una secuencia promotora, si se desea el
módulo de expresión debe también contener una región de terminación
de la transcripción cadena debajo del gen estructural para
proporcionar la eficiente terminación y procesamiento. La región de
terminación se puede obtener a partir del mismo gen que la secuencia
promotora o se puede obtener a partir de diferentes genes.
El vector de expresión particular usado para
transportar la información genética en las células no es
particularmente crítico. Se puede usar cualquiera de los vectores
convencionales usado para la expresión en células procarióticas o
eucarióticas. Los vectores de expresión bacterianos habituales
incluyen plásmidos tales como plásmidos a base de pBR322, pSKF,
pET23D, y sistemas de expresión de fusión como GST y LacZ. Las
dianas de epítopes también se pueden añadir a proteínas
recombinantes para propocionar procedimientos convenientes de
aislamiento, por ejemplo, c-myc.
Los vectores de expresión que contienen elementos
reguladores de virus eucarióticos se usan típicamente en vectores
de expresión eucarióticos, por ejemplo, vectores SV40, vectores de
virus de papiloma, y vectores derivados del virus de Epstein - Bar.
Otros vectores eucarióticos ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A+,
pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE, y cualquier
otro vector que permiten la expresión de proteínas bajo la
dirección del promotor temprano SV40, promotor tardío SV40,
promotor de metalotioneína, promotor de virus de tumor de mamífero
murino, promotor de virus de sarcoma Rous, promotor de polihedrina,
u otros promotores muestran eficacia para la expresión en células
eucarióticas.
Algunos sistemas de expresión tienen marcadores
que proporcionan ampliación génica tal como timidina quinasa,
higromicina B fosfotransferasa, y dihidrofolato reductasa. Como
alternativa, los sistemas de expresión de alto rendimiento que no
implican ampliación génica son también adecuados, tales como el uso
de un vector de baculovirus en células de insectos, con un ácido
nucleico que codifica antígeno protector bajo la dirección del
promotor de polihedrina u otros promotores fuertes baculovirus.
Los elementos que están típicamente incluidos en
los vectores de expresión también incluyen un replicón que funciona
en E. coli, un gen que codifica resistencia antibiótica para
permitir la selección de bacterias que albergan plásmidos
recombinantes, y sitios de restricción únicos en regiones no
esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias
heterólogas. El gen de resistencia a antibióticos particular
elegido no es crítico, cualquiera de los muchos genes de
resistencia conocidos en la técnica son adecuados. Si es necesario
las secuencias procarióticas se eligen preferiblemente de manera que
no interfieran con la replicación del ADN en células
eucarióticas.
Los procedimientos de transfección habituales se
usan para producir líneas celulares de bacterias, de mamíferos, de
levaduras o de insectos que expresan grandes cantidades de
proteína, que después se purifican usando técnicas habituales
(véase, por ejemplo, Colley et al., J. Biol. Chem.,
264: 17619 - 17622 (1989); Guide to Protein Purification, in
Methos in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). La
transformación de células eucarióticas y procarióticas se realizan
de acuerdo a técnicas habituales (véase, por ejemplo, Morrison,
J. Bact. 132: 349 - 351 (1977); Clark - Curtiss y Curtis,
Methods in Enzymology 101: 347 - 362 (Wu et al., eds,
1983).
Se puede usar cualquiera de los procedimientos
conocidos para introducir secuencias de nucleótidos foráneos en
células hospedadoras. Éstos incluyen el uso de transfección por
fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos,
electroporación, liposomas, microinyección, vectores de plasma,
vectores virales y cualquier y cualquiera de los otros
procedimientos conocidos para introducir ADN genómico clonado,
ADNc, ADN sintético u otro material genético foráneo en una célula
hospedadora (véase, por ejemplo, Sambrook et al.,
anteriormente). Solamente es necesario que el procedimiento de
ingeniería genética particular usado sea capaz de introducir
exitosamente al menos un gen en la célula hospedadora capaz de
expresar la proteína elegida.
Después de que el vector de expresión se
introduzca en las células, las células transfectadas se cultivan en
condiciones que favorecen la expresión de la proteína que contiene
antígeno protector, que se recupera a partir del cultivo usando
técnicas habituales identificadas más adelante.
Las proteínas recombinantes de la invención se
pueden purificar a partir de cualquier sistema de expresión
adecuado, por ejemplo, mediante la expresión de proteínas en B.
anthracis y después purificando la proteína recombinante
mediante técnicas de purificación convencional (por ejemplo,
precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio
iónico, filtración sobre gel, etc.) y/o purificación por afinidad,
por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos que reconocen un
epítope específico sobre la proteína o sobre parte de la proteína
de fusión, o mediante el uso de gel de afinidad a glutatión, que se
une a GST (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification:
Principles and Practice (1982); patente de Estados Unidos nº:
4.673.641; Ausubel et al., anteriormente; y Sambrook et
al., anteriormente). En algunas realizaciones, la proteína
recombinante es una proteína de fusión con GST o Gal4 en el extremo
N. Los expertos en la técnica reconocerán una amplia diversidad de
péptidos y proteínas que se pueden condensar a la proteína que
contiene antígeno protector para facilitar la purificación (por
ejemplo, proteína de unión a maltosa, un péptido de polihistidina,
etc).
Las proteínas recombinantes y nativas se pueden
expresar mediante bacterias transformadas en grandes cantidades,
típicamente después de la inducción promotora; pero la expresión
puede ser constitutiva. La inducción promotora con ITPG es un
ejemplo de un sistema promotor inducible. Las bacterias se
desarrollan según procedimientos habituales en la técnica. Las
células bacterianas recientes o congeladas se usan para aislamiento
de proteína.
Las proteínas expresadas en bacterias pueden
formar agregados insolubles ("cuerpos de inclusión"). Varios
protocolos son adecuados para la purificación de cuerpos de
inclusión. Por ejemplo, la purificación de los cuerpos de inclusión
implica típicamente las extracción, separación y/o purificación de
los cuerpos de inclusión mediante la fragmentación de células
bacterianas, por ejemplo, mediante incubación en un tampón de
Tris/HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, DTT 1 mM, ATP
0,1 mM, y PMSF 1 mM. La suspensión celular se puede lisar usando 2
- 3 pases a través de una prensa francesa, homogeneizar usando un
Polytron (Brinkman Instruments) o sonicar sobre hielo. Los
procedimientos alternativos de lisis bacteriana son aparentes para
los expertos en al técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et
al., anteriormente; Ausubel et al, anteriormente.).
Si es necesario, los cuerpos de inclusión se
solubilizan, y la suspensión celular lisada se centrifuga
típicamente para retirar la materia insoluble no deseada. Las
proteínas que formaban los cuerpos de inclusión se pueden
renaturalizar mediante difusión o diálisis con un tampón compatible.
Los disolventes adecuados incluyen, pero no se limitan a urea
(entre aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M), formamida (al
menos aproximadamente 80%, base volumen/volumen), y clorhidrato de
guanidina (entre aproximadamente 4 M y aproximadamente 8 M).
Algunos disolventes que son capaces de solubilizar proteínas
formadoras de agregados, por ejemplo, SDS (dodecil sulfato sódico),
ácido fórmico al 70%, son inapropiados para uso en este
procedimiento debido a la posibilidad de desnaturalización
irreversible de las proteínas, acompañado de una pérdida de
inmunogenicidad y/o actividad. Aunque el clorhidrato de guanidina y
agentes similares son desnaturalizantes, esta desnaturalización no
es irreversible y la renaturalización puede producirse tras la
eliminación (por ejemplo, mediante diálisis) o dilución del
desnaturalizante, que permite la
\hbox{re -}formación de proteína inmunológica y/o biológicamente activa. Los expertos en la técnica conocen otros tampones adecuados. La proteína elegida se separa de otras proteínas bacterianas mediante técnicas de separación habituales, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, fraccionamiento por sulfato de amonio, etc.
A menudo como etapa inicial, particularmente si
la mezcla de proteínas es compleja, un fraccionamiento por sal
inicial puede separar muchas de las proteínas de las células
hospedadoras no deseadas (o proteínas derivadas del medio de
cultivo celular) de la proteína recombinante de interés. La sal
preferida es sulfato amónico. El sulfato amónico precipita proteínas
reduciendo eficazmente la cantidad de agua en la mezcla de
proteínas. Después las proteínas precipitan en base a su
solubilidad. Cuanto más hidrófoba es una proteína, más
probablemente precipita a menores concentraciones de sulfato de
amonio. Un protocolo típico incluye la adición de sulfato de amonio
saturado a una solución de proteína de manera que la concentración
de amonio resultante está entre 20 - 30%. Esta concentración
precipitará la más hidrófoba de las proteínas. Después el
precipitado se desecha (salvo que la proteína de interés sea
hidrófoba) y se añade sulfato de amonio al sobrenadante hasta una
concentración conocida para precipitar la proteína de interés. Como
alternativa, la proteína de interés en el sobrenadante se puede
después purificar usando las técnicas de purificación de proteínas
habituales. Después el precipitado se solubiliza en tampón y el
exceso de sal se retira si es necesario, a través de diálisis o
diafiltración. Otros procedimientos que dependen de la solubilidad
de proteínas, tal como precipitación con etanol frío, son conocidos
por los expertos en la técnica y se pueden usar para fraccionar
mezclas de proteínas complejas.
El peso molecular de la proteína, por ejemplo, PA
- U1, etc., se puede usar para aislar la proteína de las proteínas
de mayor y menor tamaño usando ultrafiltración a través de
membranas de diferente tamaño de poro (por ejemplo, membranas
Amicon o Millipore). Como primera etapa, la mezcla de proteínas se
ultrafiltra a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene
un valor límite de peso molecular menor que el peso molecular de la
proteína de interés. Lo retenido de la ultrafiltración después se
ultrafiltra frente a una membrana con un valor límite molecular
mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína
recombinante pasará a través de la membrana en el filtrado. Después
el filtrado se puede cromatografiar como se describe más
adelante.
La proteína elegida también se puede separar de
otras proteínas en base a su tamaño, carga superficial neta,
hidrofobicidad, y afinidad para ligandos. Además, los anticuerpos
originados contra proteínas se pueden conjugar a matrices de
columna y las proteínas inmunopurificadas. Todos estos
procedimientos se conocen bien en la técnica. Será evidente por los
expertos en la técnica que las técnicas cromatográficas se pueden
realizar a cualquier escala y usando equipo a partir de muchos
fabricantes diferentes (por ejemplo, Pharmacia Biotech).
En algunas realizaciones, las proteínas se
purifican a partir de sobrenadantes de cultivo de Bacilus
(véase, por ejemplo, los ejemplos I y III). En resumen, las
proteínas se purifican haciendo un sobrenadante de cultivo 5 nM en
EDTA, sulfato de amonio amónico saturado al 35% y 1% en fenilo -
Sefarosa Fast Flor (Pharmacia). El fenilo - Sefarosa Fast Flor se
agita después y se recoge. La resina recogida se lava con sulfato
amónico saturado al 35% y después los antígenos protectores se
eluyeron con HEPES 10 mM EDTA 1 mM (pH 7,5). Después las proteínas
se pueden purificar adicionalmente usando una columna Mono Q
(Pharmacia Biotech). Las proteínas se pueden eluir usando un
gradiente de NaCl en CHES 10 mM
(2-[N-ciclohexilamino]ácido etanosulfónico) -
etanolamina al 0,06% (vol/vol) (pH 9,1). Las fracciones reunidas de
MonoQ después se dializaron frente al tampón elegido para posterior
análisis o aplicaciones.
La administración de una PA funcional y
combinación de LF de la invención a una célula puede inhibir la
proliferación celular de ciertos tipos celulares que sobreexpresan
las MMP y las proteínas del sistema de activación del plasminógeno,
por ejemplo, células cancerosas, células implicadas en inflamación,
y similares. Los expertos en la técnica pueden identificar
fácilmente las proteínas y células funcionales usando procedimientos
que se conocen bien en la técnica. Se pueden determinar cambios en
el crecimiento celular usando una diversidad de ensayos in
vitro e in vivo, por ejemplo, ensayo de MTT, capacidad
para crecer sobre agar blando, cambios en inhibición por contacto y
limitación de densidad de crecimiento, cambios en el factor de
crecimiento o dependencia de suero, cambios en el nivel de
marcadores específicos, cambios en la capacidad invasora en
Matrigel, cambios en el patrón de ciclo celular, cambios en el
desarrollo tumoral in vivo, tal como ratones transgénicos,
etc.
El término "sobreexpersión" se refiere a una
célula que expresa una metaloproteinasa de matriz, un activador de
plasminógeno o un ARNm receptor de activador de plasminógeno o
proteína en cantidades al menos aproximadamente dos veces que
normalmente se producen en un tipo de célula normal de referencia,
por ejemplo, una célula Vero. La sobreexpresión puede producirse,
por ejemplo, a partir de presión selectiva en medio de cultivo,
transformación, activación de genes endógenos, o mediante la
adición de genes exógenos. La sobreexpresión se puede analizar
usando una diversidad de ensayos conocidos por los expertos en la
técnica para determinar si el gen o proteína se sobreexpresa (por
ejemplo, northerns RT - PCR, wexterns, inmunoensayos, ensayos de
citotoxicidad, ensayos de inhibición de crecimiento, ensayos de
enzimas, zimografía en gelatina, etc.). Un ejemplo de una célula
que sobreexpresa una metaloproteinasa de matriz son las líneas
celulares tumorales, HT 1080 de fibrosarcoma, A2058 de melanoma y
\hbox{MDA -}MB - 231 de cáncer de mama. Un ejemplo de una célula que no sobreexpresa una metaloproteinasa de matriz es la línea celular no tumoral Vero. Un ejemplo de una célula que sobreexpresa un receptor de activador de plasminógeno son los tipos de células Hela, A2058, y Bowes que sobreexpresan uP AR. Un ejemplo de una célula que no sobreexpresa un receptor de activador de plasminógeno es la línea celular no tumoral Vero. Un ejemplo de una célula que sobreexpresa un activador de plasminógeno de tipo tejido son tipos de células Bowes de melanoma humano y células endoteliales vasculares primarios humanos. Un ejemplo de una célula que no sobreexpresa un receptor de activador de plasminógeno en la línea celular no tumoral Vero.
Se pueden usar uno o más de los siguientes
ensayos para identificar proteínas de la invención que son capaces
de regular la proliferación celular. La frase "construcciones de
antígeno protector" se refiere a una proteína de antígeno
protector de la invención. Las construcciones de antígeno protector
funcionales identificadas mediante los siguientes ensayos se pueden
usar después para tratar enfermedad y afecciones, por ejemplo, para
inhibir la proliferación y transformación celular anormal. Así
pues, estos ensayos se pueden demandar para las proteínas de
antígeno protector que son útiles junto con las proteínas que
contienen factor letal para inhibir el crecimiento celular de
tumores, cánceres, células cancerosas, y otros tipos de célula
patógenas.
El crecimiento en agar blando o formación de
colonias en ensayos de suspensión se pueden usar para identificar
construcciones de antígeno protector, que cuando se usan junto con
una construcción de LF, inhiben la proliferación y transformación
celular anormal. Típicamente, las células hospedadoras
transformadas (por ejemplo, las células que crecen en agar blando)
se usan en este ensayo. Las técnicas para crecimiento o formación
de colonias en agar blando en ensayos de suspensión se describen en
Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic
Technique, 3ª edición, Wiley - Liss, Nueva York (1994),
incorporada en esta memoria descriptiva como referencia. Véase
también, la sección de procedimientos de Garkavtsev et al.,
(1996) anteriormente, incorporada en esta memoria descriptiva como
referencia.
Las células normales requieren un sustrato sólido
un sustrato sólido para unirse y crecer. Cuando las células se
transforman, pierden su fenotipo y crecen separadas del sustrato.
Por ejemplo, las células transformadas pueden crecer en cultivo en
suspensión agitado o suspendido en medio semi - sólido, tal como
agar semi - sólido o blando. Las células transformadas, cuando se
transfectan con genes supresores tumorales, regeneran el fenotipo
normal y requieren un sustrato sólido para unirse y crecer.
La administración de una proteína de antígeno
protector activa y una proteína que contiene LF activa a células
transformadas reducirían o eliminarían la capacidad de las células
hospedadoras para crecer en cultivo en suspensión agitado o
suspendidas en medio semi - sólido, tal como semi - sólido o blando.
Esto se debe a que las células transformadas regenerarían la
dependencia de anclaje de células normales, y por lo tanto
requieren un sustrato sólido para crecer. Por lo tanto este ensayo
se puede usar para identificar construcciones de antígeno protector
que pueden funcionar con una proteína del factor letal para inhibir
el crecimiento celular. Una vez identificadas, tales construcciones
de antígeno protector se pueden usar en numerosos procedimientos de
diagnósticos o terapéuticos, por ejemplo, en la terapia de cáncer
para inhibir proliferación y transformación celular anormal.
La inhibición de contacto y limitación de
densidad de ensayos de crecimiento se pueden usar para identificar
construcciones de antígeno protector que son capaces de inhibir la
proliferación anormal y transformación en células hospedadoras.
Típicamente, células hospedadoras transformadas (por ejemplo,
células que no están inhibidas por contacto) se usan en este ensayo.
La administración de una construcción de antígeno protector y una
construcción de factor letal a estas células hospedadoras
transformadas darían como resultado células que están inhibidas por
contacto y crecen hasta una densidad de saturación inferior a las
células transformadas. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para
identificar construcciones de antígeno protector que son útiles en
las composiciones para inhibir el crecimiento celular. Una vez
identificadas, tales construcciones de antígeno protector se pueden
usar en terapia de enfermedades para inhibir la proliferación y
transformación celular anormal.
Como alternativa, el índice de marcaje con
[^{3}H] - timidina a densidad de saturación se puede usar para
medir la limitación de densidad de crecimiento. Véase Fresheney
(1994), anteriormente. Las células transformadas, cuando se tratan
con una combinación funcional de PA/L, regeneran un fenotipo normal
y llegar a inhibirse por contacto y crecerían hasta una densidad
menor. En este ensayo, el índice de marcaje con [^{3}H] -
timidina a densidad de saturación es un procedimiento preferido
para medir la limitación de densidad de crecimiento. Las células
hospedadoras transformadas se tratan con una construcción de
antígeno protector y una construcción de factor letal (por ejemplo,
LP59) y se hacen crecer durante 24 horas a densidad de saturación en
condiciones de medio no limitantes. El porcentaje de marcaje de
células con [^{3}H] - timidina se determina
autorradiográficamente. Véase, Freshney (1994), anteriormente. Las
células hospedadoras tratadas con una construcción de antígeno
protector funcional deberían dar lugar a un índice de marcaje menor
comparado con el control (por ejemplo, células hospedadoras
transformadas tratadas con una construcción de antígeno protector
no funcional o construcción de factor letal no funcional).
El factor de crecimiento o dependencia de suero
se puede usar como un ensayo para identificar construcciones de
antígeno protector. Las células transformadas tienen una
dependencia de suero inferior que sus homólogos normales (véase, por
ejemplo, Temin, J. Natl. Cancer Insti. 37: 167 - 175 (1996);
Eagle et al., J. Exp. Med. 131: 836 - 879 (1970));
Freshney, anteriormente. Esto en parte se debe a la liberación de
diversos factores de crecimiento mediante células transformadas.
Cuando un gen supresor de tumores se transfecta y expresa en
células transformadas, las células volverían a adquirir la
dependencia de suero y liberarían factores de crecimiento a menor
nivel. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para identificar
construcciones de antígeno protector que son capaces de actuar
junto con un factor letal que inhibe el crecimiento celular. El
factor de crecimiento o dependencia de suero de células hospedadoras
transformadas que están transfectadas con una construcción de
antígeno protector se puede comparar con la de control (por
ejemplo, células hospedadoras transformadas se tratan con un
antígeno protector no funcional o factor letal no funcional). Las
células hospedadoras transformadas tratadas con un antígeno
protector funcional mostrarían un incremento en el factor de
crecimiento y dependencia de suero comparado con el control.
Las células tumorales liberan una cantidad mayor
de ciertos factores (de aquí en adelante "marcadores específicos
tumorales") que sus homólogos normales. Véase, por ejemplo,
Folkman, Angiogenesis and cancer, Sem Cancer Biol.
(1992)).
Los marcadores específicos tumorales se pueden
ensayar para identificar construcciones de antígeno protector, que
cuando se administran con una construcción de factor letal,
disminuyen el nivel de liberación de estos marcadores se las
células hospedadoras. Típicamente, se usan células hospedadoras
transformadas o tumorigénicas. La administración de un antígeno
protector y un factor letal a estas células hospedadoras reducirían
o eliminarían la liberación de marcadores específicos tumorales de
estas células. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para
identificar construcciones de antígeno protector y son funcionales
en la supresión de tumores.
Diversas técnicas que miden la liberación de
estos factores se describen en el documento de Freshney (1994)
anteriormente. También, véase, Unkless et al., J. Biol.
Chem. 249: 4295 - 4305 (1974); Strickland y Beers, J. Biol.
Chem. 251: 5694 - 5702 (1976); Whur et al., Br. J.
Cancer 42: 305 - 312 (1980); Gulino, Angiogenesis, tumor
vascularization, and potential interference with tumor growth.
En Mihich, E. (ed): "Biological Responses in Cancer". Nueva
York, Plenum (1985); Fresheney Anticancer Res. 5: 111 - 130.
(1985).
La citotoxicidad de una combinación particular de
PA/LF también se puede ensayar usando el ensayo de citotoxicidad de
MTT. Las células se siembran y se hacen crecer hasta 80 a 100% de
confluencia. Después las células se lavan dos veces con DMEM exento
de suero para retirar FCS residual y se ponen en contacto con una
combinación particular de PA/LF. MTT bromuro de
(3-[4,5-dimetiltiazol-2-
il]2,5-difeniltetrazolio) se añade después a
las células y se MTT oxidado (indicativo de una célula viva) se
solubiliza y se cuantifica.
El grado de capacidad invasora en Matrigel o
algún constituyente de matriz extracelular se puede usar como un
ensayo para identificar construcciones de antígeno protector que
son capaces de inhibir la proliferación celular anormal y
crecimiento tumoral. Las células tumorales muestran una buena
correlación entre malignidad y capacidad invasora de las células en
Matrigel o algún otro constituyente de matriz extracelular. En este
ensayo, se usan típicamente las células tumorigénicas. La
administración de una combinación de proteínas de antígeno
protector letal/factor letal de estas células hospedadoras
tumorigénicas disminuirían su capacidad invasora. Por lo tanto, las
construcciones de antígeno protector funcional se pueden identificar
para medir cambios en el nivel de la capacidad invasora entre las
células tumorigénicas antes y después de la administración de
construcciones del antígeno protector y factor letal.
Se pueden usar las técnicas descritas en Feshney
(1994), anteriormente. En resumen, el nivel de invasión de células
tumorigénicas se puede medir usando filtros revestidos con Matrigel
o algún otro constituyente de matriz extracelular. La penetración
en el gel, o a través del lado distal del filtro, se califica como
capacidad invasora, y se califica histológicamente mediante un
número de células y distancia movida, o marcando previamente las
células con ^{125}I y contando la radiactividad en el lado distal
del filtro o fondo de la placa. Véase, por ejemplo, Freshney (1984)
anteriormente.
La detención del ciclo celular G_{0}/G_{1} se
puede usar como un ensayo para identificar una construcción de
antígeno protector funcional. La administración de la construcción
PA/LF puede producir la detención del ciclo celular G1. En este
ensayo, las líneas celulares se pueden usar para seleccionar
construcciones de antígeno protector funcional. Las células se
tratan con una construcción de antígeno protector supuesto y una
construcción de factor letal. Las células se pueden transfectar con
un ácido nucleico que comprende un gen marcador que codifica una
proteína fluorescente verde. La administración de una combinación
de antígeno protector funcional/factor letal produciría la detección
del ciclo celular G_{0}/G_{1}. Los procedimientos conocidos en
la técnica se pueden usar para medir el grado de detención de ciclo
celular G1. Por ejemplo, la señal de yoduro se propidio se puede
usar como una medida del contenido de ADN para determinar los
perfiles de ciclo celular sobre un citómetro de flujo. Se puede
calcular el porcentaje de células en cada ciclo celular calcular.
Las células expuestas a un antígeno protector funcional mostrarían
un alto número de células que se detienen en la fase
G_{0}/G_{1} comparado con el control (por ejemplo, tratadas en
ausencia de un antígeno protector).
Los efectos PA/LF sobre el crecimiento celular se
pueden ensayar en ratones transgénicos o inmunes. Se pueden
preparar ratones transgénicos, en los que un supresor tumoral
(ratones de eliminación genética) o un gen promotor de tumores se
sobreexpresa. Tales ratones se pueden usar para estudiar los efectos
de antígeno protector como un procedimiento en la inhibición de
tumores in vivo.
Los ratones transgénicos de eliminación genética
se pueden preparar mediante la inserción de un gen marcador u otro
gen heterólogo en un sitio génico supresor de tumores en el genoma
del ratón mediante recombinación homóloga. Tales ratones también se
pueden preparar sustituyendo el supresor tumoral endógeno con una
versión mutada del gen supresor de tumores, o mutando el supresor de
tumores endógeno, por ejemplo, mediante la exposición a compuestos
cancerígenos.
Una construcción de ADN se introduce en los
núcleos de células tronco embrionarias. Las células que contienen
la nueva lesión genética modificada por ingeniería genética se
inyectan en un embrión de ratón hospedador, que se re - implanta en
una hembra receptora. Algunos de estos embriones se desarrollan en
ratones quiméricos que poseen células germinales derivadas
parcialmente de la línea celular mutante. Por lo tanto, mediante la
cría de los ratones quiméricos es posible obtener una nueva línea
de ratones que contiene la lesión genética introducida (véase, por
ejemplo, Capecchi et al., Science 244: 1288 (1989)).
Los ratones dirigidos quiméricos se pueden derivar según Hogan et
al., Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Teratocarcinomas and
Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL
Press, Washington, D. C., (1987).
Estos ratones de eliminación genética se pueden
usar como huéspedes para analizar los efectos de diversas
construcciones de antígeno protector sobre el crecimiento celular.
Estos ratones transgénicos con un gen supresor de tumores
eliminados genéticamente desarrollarían proliferación celular
anormal y crecimiento tumoral. Se pueden usar como huéspedes para
analizar los efectos de diversas construcciones de antígeno
protector sobre el crecimiento celular. Por ejemplo, la
introducción de construcciones de antígeno protector y
construcciones de factor letal en estos ratones de eliminación
genética inhibirían la proliferación celular anormal y suprimirían
el desarrollo tumoral.
Como alternativa, se pueden usar diversos
animales hospedadores inmuno - suprimidos o inmuno - deficientes.
Por ejemplo, ratón "desnudo" genéticamente atímico (véase, por
ejemplo, Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 52:
921 (1974)), un ratón SCID, un ratón trimectomizado, o un ratón
irradiado, (véase, por ejemplo, Bradley et al., Br. J.
Cancer 38: 263 (1978)); Selby et al., Br. J.
Cancer 41: 52 (1980)) se pueden usar como un huésped. Las
células tumorales transplantables (típicamente aproximadamente
10^{6} células) inyectadas en huéspedes isogénicos producirán
tumores invasivos en una alta proporción de casos, mientras las
células normales de origen similar no. En los huéspedes que
desarrollan tumores invasivos, las células se exponen a una
combinación de construcción de antígeno protector/factor letal (por
ejemplo, mediante inyección subcutánea). Después de un período de
tiempo adecuado, preferiblemente
\hbox{4 -}8 semanas, se mide el crecimiento tumoral (por ejemplo, por volumen o mediante sus dimensiones mayores) y se comparan con el control. Los tumores que tienen reducción estadísticamente significativa (usando, por ejemplo, el análisis de la t de Student) se dicen que tienen crecimiento inhibido. Usando la reducción del tamaño de tumores como un ensayo, se pueden identificar las construcciones de antígeno protector funcional que son capaces de inhibir la proliferación de células anormales. Este modelo también se puede usar para identificar las versiones mutantes funcionales de antígeno protector.
Las proteínas que contienen antígeno protector y
las proteínas que contienen el factor letal se pueden administrar
directamente al paciente, por ejemplo, para inhibición de células
cancerosas, tumorales, o precancerosas in vivo, etc. La
administración es mediante cualquiera de las vías usadas normalmente
para introducir un compuesto en contacto último con el tejido a
tratar. Los compuestos se administran de una manera adecuada,
preferiblemente con vehículos farmacéuticamente aceptables. Los
procedimientos adecuados de administración tales compuestos están
disponibles y los conocen bien los expertos en la técnica, y,
aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición
particular, una vía particular puede a menudo proporcionar una
reacción más inmediata y más eficaz que otra vía.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables se
determinan en parte mediante la composición particular que se está
administrando, así como mediante el procedimiento particular usado
para administrar la composición. De acuerdo a lo anterior, existe
una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones
farmacéuticas de la presente invención (véase, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 17ª, 1985)). Por
ejemplo, si se desea la distribución in vivo de una proteína
de antígeno protector biológicamente activo, se pueden usar los
procedimientos descritos en Schwarze et al., (véase,
Science 285: 1569 - 1572 (1999).
Los compuestos, solos o en combinación con otros
componentes adecuados, se pueden preparar en formulaciones de
aerosoles (es decir, se pueden "nebulizar") para administrar
mediante inhalación. Las formulaciones de aerosol se pueden colocar
en propulsores aceptables presurizados tales como
diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares.
Las formulaciones adecuadas para la
administración parenteral, tales como, por ejemplo, mediante las
vías intravenosa, intramuscular, intradérmica, y subcutánea,
incluyen soluciones de inyecciones isotónicas estériles acuosas y no
acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones,
bacteriostáticos, y solutos que hacen la formulación isotónica con
la sangre del receptor propuesto, y las suspensiones estériles
acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión,
solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes, y conservantes.
En la práctica de esta invención, las composiciones se pueden
administrar, por ejemplo, mediante infusión intravenosa, vía oral,
tópica, intraperitoneal, intravesical o intratecal. Las
formulaciones de los compuestos se pueden presentar en recipientes
sellados de dosis unitaria o dosis múltiple, tales como ampollas y
viales. Las soluciones y suspensiones para inyección se pueden
preparar a partir de polvos estériles, gránulos, y comprimidos del
tipo descrito previamente. La dosis administrada a un paciente
("cantidad terapéuticamente eficaz"), en el contexto de la
presente invención debe ser suficiente para efectuar una respuesta
terapéutica beneficiosa en el paciente con el tiempo. La dosis se
determinará mediante la eficacia del compuesto particular empleado y
la condición del paciente, así como el peso corporal o área
superficial del paciente a tratar. El tamaño de la dosis también se
determinará mediante la existencia, naturaleza y grado de cualquier
efecto secundario que acompaña a la administración de un compuesto
o vector particular o en un paciente particular.
Cuando se determina la cantidad eficaz del (de
los) compuesto (s) a administrar en el tratamiento o profilaxis de
cáncer, el médico evalúa los niveles en plasma circulante de (de
los) compuesto (s) respectivos, progresión de la enfermedad y la
producción de anticuerpos anti - compuesto. En general, la dosis
equivalente de un compuesto está entre aproximadamente 1 ng/kg y 10
mg/kg para un paciente típico. La administración de compuestos la
conocen bien los expertos en la técnica (véase, por ejemplo,
Bansinath et al., Neurochem Res. 18: 1063 - 1066
(1993); Iwasaki et al., Jpn. J. Cancer Res. 88: 861 -
866 (1997); Tabrizi - Rad et al., Br. J. Pharmacol.
111: 394 - 396 (1994)).
Para la administración, los compuestos de la
presente invención se pueden administrar a una velocidad
determinada mediante la DL - 50 del compuesto particular, y sus
efectos secundarios a diversas concentraciones, como se aplica a la
masa y salud global del paciente. La administración se puede llevar
a cabo mediante dosis individuales o divididas.
Todas las publicaciones y solicitudes de patentes
citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en esta memoria
descriptiva como referencia como si cada publicación individual o
solicitud de patente se indicara específica o individualmente que
se incorpora como referencia.
Aunque la invención anterior se ha descrito en
algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de
claridad de entendimiento, será fácilmente evidente para los
expertos en la técnica a la luz de las descripciones de esta
invención que ciertos cambios y modificaciones se pueden realizar
en ella sin salirse del espíritu o alcance de las reivindicaciones
anexas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de
ilustración solamente y no a modo de limitación. Los expertos en la
técnica reconocerán fácilmente una diversidad de parámetros no
críticos que se pueden cambia o modificar para producir
esencialmente resultados similares.
Las enzimas para la manipulación y modificación
de ADN se compraron en New England Biolabs (Beverly, MA). FP59 y la
furina en forma solubles se prepararon en nuestro laboratorio según
la metodología habitual. La
\hbox{MMP -}2 activa fue un regalo amable del Dr. William Stetler - Stevenson, la forma activa de la MMP - 9 se compró en CALBIOCHEM (San Diego, CA). Los inhibidores de las MMP BB - 94 (Batimastat) y BB - 2516 (Marimastat) eran regalos amables de British Biotechnology Limited, GM 6001 era un regalo amable del Dr. Richard E. Galarday preparado como se ha descrito (Grobelny, D., et al., Biochemistry, 31: 7152 - 7154 (1992)). El anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5308) se preparó en el laboratorio de los inventores. El anti - MT - MMP1 de conejo (AB815) se compró en CHEMICON Internacional, Inc, (Temecula, CA). La secuencia para LF se puede encontrar, por ejemplo, en Robertson y Leppla, Gene 44: 71 - 78 (1986). La secuencia para PA se describe, por ejemplo, en Singh et al., J. Biol. Chem. 264: 19103 - 10107 (1989) (vector de expresión pYS5); Leppla, en Methods in Enzymology, vol. 165, pp. 103 - 116 (Harshman ed., 1988). La mutagénesis dirigida ala sitio de las moléculas de PA se ha descrito previamente (Singh et al., J. Biol. Chem. 269: 29039 - 29046 (1994).
La PCR de superposición se usó para construir los
mutantes de PA con el sitio de furina reemplazado por el
octapéptido de sustrato de MMP GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ
(SEC ID Nº: 3) en PAL2. El plásmido de expresión de PA (WT - PA) de
tipo salvaje pYG5 (Singh, Y., et al., J. Biol. Chem,
264: 19103 - 19107 (1989)) se usó como molde. Los inventores usaron
cebador F en 5' (AAAGGAGAACGTATATGA (SEC ID nº: 8),
subrayada está la secuencia de SD y el codón de inicio de PA) y el
cebador fosforilado R1 (pTGAGTTCGAAGATTTTTGTTTTAATTCTGG (SEC ID Nº:
9), la hibridación a la secuencia correspondiente a P_{154}-
S_{163}) para ampliar el fragmento N. Los inventores usaron el
cebador fosforilado mutagénico H1
(pGGACCATTAGGAATGTGGAGTCAAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº:
10), que codifica el sustrato de MMP GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y
S_{168} - P_{176}) y el cebador inverso R2
ACGTTTATCTCTTATTAAAAT (SEC ID Nº: 1 11), la hibridación a la
secuencia circundante I_{589} - R_{595}) para ampliar el
fragmento mutagénico M1. Los inventores usaron un cebador
mutagénico fosforilado H2
(pGGACCATTAGGATTAGGGCACAAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº:
12), que codifica el sustrato de MMP GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3) y
S_{168} - P_{176}) para ampliar el fragmento mutagénico M2.
Después se usó el cebador F y R2 para ampliar los productos de
ligación de N y M1, N y M2, respectivamente, dando como resultado
los fragmentos mutagénicos L1 y L2, en los que la secuencia
codificante para el sitio de furina (RKKR_{167}; SEC ID Nº: 1) se
reemplazaron por la secuencia de sustrato de las MMP GPLGMLSQ (SEC
ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3), respectivamente. Las
digestiones con HindIII/Pstl de L1 y L2, que incluyen los sitios de
mutación, se clonaron entre el sitio HindIII y Pstl de pYS5. Los
plásmidos de expresión resultante se llamaron pYS - PA - L1 y pYS -
PA - L2, sus productos de expresión, las proteínas mutadas de PA,
se nombraron en consecuencia PA - L1 y PA - L2.
Para expresar WT PA, PA - L1 y PA - L2, los
plásmidos de expresión pYS5, pYS - PA - L1 y pYS - PA - L2 se
transformaron en una cepa no virulenta B. anthracis UM23C1 -
1, y se crecieron en medio de FA (Singh, Y., et al., J.
Biol Chem, 264: 19103 - 19107 (1989)) con 20 \mug/ml de
canamicina durante 16 horas a 37ºC, las proteínas de PA se
purificaron mediante precipitación con sulfato amónico seguido de
cromatografía en columna monoQ (Pharmacia Biotech), como se ha
descrito previamente (Varughese, M., et al., Infect
Immun, 67: 1860 - 1865 (1999)).
Para analizar si PA - L1 y PA - L2 tenían la
capacidad de procesarse mediante la MMP - 2 y la MMP - 9 en lugar
de la furina, se realizó la escisión in vitro de WT - PA, PA
- L1 y PA - L2. Para la escisión por furina, un volumen de 50
\mul de reacción en PBS, pH 7,4, HEPES 25 mM, EDTA 0,2 mM, EGTA
0,2 mM, 100 \mug/ml de ovoalbúmina, CaCl_{2} 1,0 mM,
MgCl_{2}, incluyendo 5 \mug de WT - PA, PA - L1 y PA - L2,
respectivamente. La digestión se comenzó mediante la adición de 0,1
\mug de forma soluble de furina y se incubó a 37ºC, se retiraron
alícuotas (5 \mul) a diferentes momentos. La escisión se detectó
mediante transferencia de western con un anticuerpo anti - PA. Para
transferencia de western, las alícuotas de las muestras se separaron
mediante PAGE usando gel de Tris - glicina en gradiente 10 - 20%
(Novex, San Diego, CA) y se electrotransfirió a una membrana de
nitrocelulosa (Novex, San Diego, CA). La membrana se bloqueó con 5%
(p/v) de leche no grasa y se hibridó usando anticuerpo policlonal
anti - PA de conejo (nº 5308). La mancha se lavó y se incubó con un
anticuerpo anti - conejo de cabra conjugado a HPR (sc - 2004, Santa
Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) y se visualizó mediante
sustrato estabilizado por TMB para HRP (Promega, Madison, WI). Para
la escisión por MMP - 2 y MMP - 9, se incubaron 5 \mug de cada
uno de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 con 0,2 \mug de NEAP - 2 activa
o 0,2 \mug de MMP - 9 activa, respectivamente en 50 \mul de
reacciones que incluyen HEPES 50 mM pH 7,5, CaCl_{2} 10 mM, NaCl
200 mM, Brij al 0,05% (v/v) y ZnSO_{4} 50 \muM. Se retiraron
alícuotas (5 \mul) a diferentes momentos y se analizaron mediante
transferencia de western con anticuerpo policlonal anti - PA de
conejo (nº 5308) como se ha descrito anteriormente.
Se obtuvieron células Vero, células COS - 7,
células HT 1080 de fibrosarcoma humano y células MDA - MB - 231 de
cáncer de mama humano en ATCC (Rockville, Maryland). Todas las
células se desarrollaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM) con glucosa al 0,45%, suero fetal bovino al 10%, glutamina 2
mM. Las células se mantuvieron a 37ºC en un incubador con CO_{2}
al 5%. Las células se disociaron con una solución de tripsina al
0,05%, EDTA al 0,02%, fosfato sódico 0,01 M, pH 7,4, y se
subcultivaron usualmente a una relación de división de 1:4.
Las células se cultivaron en un matraz de 75
cm^{2} hasta 80 - 10% de confluencia a 37ºC en DMEM suplementado
con FCS al 10%. Después las células se lavaron dos veces con DMEM
exento de suero para retirar FCs residual, y se lisaron durante 10
minutos sobre hielo con 1 ml/matraz de Triton X - 100 al 0,5% (v/v)
en Tris - HCl 0,1 M, PH 8,0, y se rasparon con un "rubber
policeman" (tira de goma elástica) de caucho. Los lisados
celulares se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC,
las concentraciones de las proteínas se determinaron mediante el
kit de ensayo de proteínas BCA (PIERCE, Rockford, IL) y se ajustaron
hasta 1 mg/ml mediante tampón de lisis. Para la recogida del medio
reacondicionado, las células se incubaron durante 24 horas con 4 ml
(matraz de DMEM exento de suero. Los sobrenadantes del cultivo se
cosecharon y los desechos celulares se retiraron mediante
centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Los lisados
celulares y medio reacondicionado se congelaron a -70ºC o se
trataron inmediatamente para análisis zimográfico.
Los extractos celulares (1 mL) o medio
reacondicionado normalizados hasta concentraciones de proteínas del
correspondiente extracto celular (3 - 4 ml) se incubaron a 4ºC
durante 1 hora en un mezclador de tambor vertical con 50 \mul de
gelatina - sefarosa 4B (Pharmacia Biotech AB) equilibrados con Tris
- HCl 50 mM, CaCl_{2} 5 mM, Twenn - 20 al 0,02% (v/v), EDTA 10
mM, pH 7,5. Después de cuatro lavados con 1 ml de tampón de
equilibrio que contenía NaCL 200 mM, las perlas se resuspendieron
en 30 \mul de tampón de muestra no reductor 4X, centrifugado para
recogen los sobrenadantes y se cargaron en gel de zimograma de
gelatina al 10% (Novex, san Diego, CA). Después de la
electroforesis, el gel se sumergió en tampón renaturalizante
(Novex, San Diego, CA) durante dos veces con 30 minutos cada una
para renaturalizar las gelatinasas a temperatura ambiente. Después
el gel se equilibró en tampón de desarrollo (Novex, San Diego, CA),
que añadió otra vez un catión de metal divalente requerido para la
actividad enzimática, primero durante 30 minutos a temperatura
ambiente y después en tampón nuevo a 37ºC durante toda una noche.
Después el gel se tiñó durante una noche con azul brillante
Commassie R - 250 al 0,5% (p/v) en metanol al 45% (v/v), ácido
acético al 10% y desteñido en la misma solución sin tiente.
La citotoxicidad de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 a
las células de ensayo de realizó en placas de 96 pocillos. Las
células se sembraron apropiadamente en placas de 96 pocillos de
manera que alcanzaron 80 a 100% de confluencia el día siguiente.
Las células se lavaron dos veces con DMEM exento de suero para
retirar el FCS residual. Después se diluyeron en serie WT - PA, PA -
L1 y PA - L2 (entre 0 y 1000 ng/ml) combinado con FP59 (50 ng/ml)
en DMEN exento de suero se añadieron a las células para
proporcionar un volumen total de 200 \mul/pocillo. Un grupo de
células se expusieron a las toxinas durante 6 horas, después se
retiraron la toxinas y se reemplazaron con DMEM reciente
suplementado con FCS al 10%. Para evaluar la acción citotóxica de
FP59 se depende de la inhibición de la síntesis de proteínas
inicial mediante EF - 2 que ribosila ADP y usualmente necesita 24 -
48 horas para mostrar la toxicidad, la citotoxicidad se dejó
desarrollar durante 48 horas. Después esa viabilidad celular se
ensayó añadiendo 50 \mul de 2,5 mg/ml de MTT bromuro de
(3-[4,5-dimettiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio.
Las células se incubaron con MTT durante 45 minutos a 37ºC, las
células vivas oxidaban el MTT hasta un tinte azul precipitaban en
citosol mientras las células muertas permanecía decoloradas.
Después el medio se retiraba y el precipitado azul se solubilizaba
con 100 \mul/pocillo de SDS al 0,5% (p/v), HCl 25 mM, en
isopropanol al 90% (v/v). Las placas se agitaron en un aparato
vortex y la intensidad de la MMT oxidada se leyó a 570 nm usando el
lector de microplacas. Otro grupo de células se expuso a las
toxinas durante 48 horas en DMEM exento de suero, después la
viabilidad se determinó mediante ensayo de citotoxicidad con MTT
como se ha descrito anteriormente.
Los inventores diseñaron un modelo de co -
cultivo para imitar la condición in vivo para verificar PA -
L1 y PA - L2 mataban específicamente las células tumorales que
expresan las MMP, no las células que no expresan las MMP. Las
células Vero, HT 1080, A2058 y MD - MB - 231 se cultivaron en las
diferentes cámaras del portaobjetos de 8 cámaras (Nalge Nunc
Internacional, Naperville, IL) hasta 80 - 100% de confluencia.
Después la s células se lavaron dos veces con DEMEM exento de
suero, se retiró la partición de la cámara, y el portaobjetos se
puso en una placa de cultivo petri con medio exento de suero, de
manera de las células diferentes estaban en el mismo ambiente de
cultivo. PA, PA - L1 o PA - L2 (300 ng/ml) cada una más FP59 (50
ng/ml), o FP59 (50 ng/ml) solo se añadieron a las células y se
incubaron hasta 48 horas. Después se añadió MTT (0,5 mg/ml) durante
45 minutos a 37ºC, la partición se remontó, la MTT oxidada se
disolvió como se ha descrito anteriormente para determinar la
viabilidad celular para cada
cámara.
cámara.
Se ensayó la unión y procesamiento de WT - PA, PA
- L1 y PA - L2 sobre la superficie de células Vero y células HT
1080. Las células Vero y HT1080 se desarrollaron en una placa de 24
pocillos hasta 80 - 100% de confluencia y se lavaron dos veces con
DMEM para retirar FCS residual. Después las células se incubaron
con 1000 ng/ml de WT - PA, PA - L1 y PA - L2, respectivamente,
durante un período de tiempo diferente (0, 10 min, 40 min, 120 min
y 360 min) a 37ºC en DMENM exento de suero. Después las células se
lavaron para retirar las proteínas de PA no unidas. Las células se
lisaron en 100 \mul/pocillo de tampón de lisis RIPA modificado
(Tris - HCl 50 mM, pH 7,4, NP40 al 1%, desoxicolato sódico 0,25,
NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMFS 1 mM. 1 mg/ml de cada uno de
aprotinina, leupeptina y pepstatina sobre hielo durante 10 minutos.
Se separaron cantidades iguales de proteína a partir de los lisados
celulares mediante PAGe usando geles de Tris - glicina de gradiente
10 - 20% (Novex, San Diego, CA). Después de transferir a membranas
de nitrocelulosa, se realizó bloqueo con lecha no grasa al 5%. La
transferencia de western usó anticuerpo policlonal anti - PA de
conejo (nº 5308). La mancha se lavó y se incubó con un anticuerpo
\hbox{anti -}conejo de cabra conjugado por HPR (sc - 2004) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) y se visualizó mediante EL (PIERCE, Rockford IL).
El ADNc de MT1 - MMP era un regalo generoso de J.
Windson, AB. El vector de expresión de mamíferos pEGFPN1 (Clontech
Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), se usó para condensar el
extremo C de MT1 - MMP al extremo N de EGFP (variante cambiada a
rojo de la proteína fluorescente verde). La secuencia que codifica
MT1 - MMP se aisló con Tht III y después se llenó con Pfu y se
insertó en el sitio SmaI de pEGFPN1. Las células
\hbox{COS -}7 (2 x 10^{5} por placa) se trasnfectaron con vectores de expresión (2 \mug) por medio de SuperFect (10 ml) (Qiagen). Las células se incubaron durante 3 horas con complejo ADN - SuperFect en presencia de suero y medio que contiene antibiótico. El complejo que contiene medio se retiró y las células se crecieron en suero fresco que contenían medio durante 48 horas. Después de esto las células se desarrollaron en G418 (Life Technologies, Inc) que contenía medio. Las células que expresan la proteína de fusión MT1 - MMP/GFP, llamada COSgMT1, se distribuyeron a partir de células que no se expresan mediante flujocitometría con un FACstar Plus (Becton Dickinson), excitación a
488 nm.
La estructura cristalina de PA mostró que el
sitio de escisión por furina RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) está en el
medio de una superficie flexible, bucle expuesto a disolvente
compuesto de aa 162 - 175 (Petosa, C., et al.,
Nature, 385: 833 - 838 (1997)). La escisión en este bucle por
las proteasas de tipo furina es esencialmente para toxicidad. Para
construir mutantes de PA específicamente tratados por las MMP,
especialmente la MMP - 2 y al MMP - 9, en lugar del sitio de furina
RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplazó por las secuencias
favoritas de las MMP - 2 y MMP - 9, GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y
GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3), respectivamente, dando como resultados dos
mutantes, PA - L1 y PA - L2 (Fig. 1a). Estos dos octapéptidos de
sustrato de MMP se diseñaron basándose en los estudios de Netzel -
Arnett et al., J. Biol. Chem. 266: 6747 - 6755
(1991); Netzel - Arnett S., et al., Biochemistry,
32:
6427 - 6432 (1993)), en los que la especificidad de secuencia de MMP - 2, MMP - 9, matrilisina, MMP - 1 y MMP - 8 humanas se han examinado midiendo la velocidad de hidrólisis de aproximadamente 50 oligopéptidos sintéticos. Estos dos octapéptidos son sustratos favoritos de las MMP - 2 y MMP - 9, pero se superponen a otras especies de MMP (Netzel - Arnett, S., et al., J. Biol. Chem. 266: 6747 - 6755 (1991): Netzel - Arnett S., et al., Biochemistry, 32:
6427 - 6432 (1993)), en los que la especificidad de secuencia de MMP - 2, MMP - 9, matrilisina, MMP - 1 y MMP - 8 humanas se han examinado midiendo la velocidad de hidrólisis de aproximadamente 50 oligopéptidos sintéticos. Estos dos octapéptidos son sustratos favoritos de las MMP - 2 y MMP - 9, pero se superponen a otras especies de MMP (Netzel - Arnett, S., et al., J. Biol. Chem. 266: 6747 - 6755 (1991): Netzel - Arnett S., et al., Biochemistry, 32:
\hbox{6427 -}6432 (1993)). Éstos también son sustratos potenciales para MTI - MMP (Hill, H., et al., J. Biol. Chem, 271:
\hbox{17119 -}17123 (1996)). Las secuencias que codifican PA - L1 y PA - L2 se construyeron mediante PCR de superposición, se clonaron en vector de transferencia de E. coli - Bacillus pYS5, y se expresó eficazmente en Bacillus antthracis UM23C1. Los productos de expresión se secretaron en los sobrenadantes del cultivo y alcanzaron hasta 20 a 50 mg/l. Estas dos proteínas mutantes de PA se purificaron toscamente mediante precipitación por sulfato de amonio seguido de cromatografía mono Q. Las proteínas de PA mutadas purificadas PA - L1 y PA - L2 se comportaron como
\hbox{WT -}PA en SDS - PAGE, pero migraron más rápido que WT - PA en gel nativo debido a los cuatro residuos cargados positivamente RKKR (SEC ID Nº 1) del sitio de furina se reemplazaron en los octapéptidos de MMP no cargados (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Para caracterizar WT - PA y estos dos mutantes de
PA en susceptibilidad a proteasas, se sometieron a la escisión con
la furina de forma soluble, MMP - 2 y MMP - 9 de forma activa in
vitro. WT - PA era muy sensible a furina, pero resistente
completamente a MMP - 2 y MMP - 9 (Fig. 1b). Por el contrario, PA -
L1 y PA - L2 eran completamente resistentes a furina, pero no
conseguían la nueva característica de procesarse eficazmente en dos
fragmentos, PA63 y PA20, mediante MMP - 2 y MMP - 9 (Fig. 1 c y 1
d). No había ninguna diferencia evidente entre los dos mutantes con
relación a los patrones de procesamiento por la furina, MMP - 2 y
MMP - 9. Sin embargo, parecía que las PA - L1 y PA - L2 se
procesaban más eficazmente mediante la MMP - 2 que mediante la MMP -
9.
Para analizar la hipótesis de que las PA - L1 y
PA - L2 solamente matan las células tumorales que expresan las MMP,
pero no las células que no expresan las MMP, tres líneas ce células
tumorales humanas, HT 1080 de fibrosarcoma, A2058 de melanoma y MDA
- MB - 231 de cáncer de mama, y una línea de células no tumorales
Vero, se emplearon en ensayo de citotoxicidad. La zimografía sobre
gelatina mostró que HT 1080 expresaba tanto MMP - 2 como MMP - 9,
A2058 solamente expresaba MMP - 2, MDA - MB - 231 solamente
expresaba MMP - 9, en ambos medios exentos de suero
reacondicionados y los extractos celulares, que reflejan las
gelatinasas expresadas por estas tres líneas de células tumorales se
secretaron en el medio y también se pueden asociar con la
superficie celular (Fig. 2). Por el contrario, las células Vero
tenían muy pocos antecedentes de expresión de MMP (Fig. 2).
La citotoxicidad de WT - PA y los mutantes de PA
a estas células se realizaron sobre placas de 96 pocillos. Cuando
las células se desarrollaron hasta 80 - 100% de confluencia,
concentraciones diferentes (entre 0 y 1000 ng/ ml) de
WT - PA, PA - L1 y PA - L2 combinadas con FP59 (constante a 50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células y se expusieron las células durante 6 horas y 48 horas. Para la citotoxicidad dependiente de FP59 depende de la inhibición de la síntesis de las proteínas iniciales mediante la ribosilación de EF - 2, la citotoxicidad se dejó que se desarrollara durante 48 horas. La CE_{50} (concentración necesaria para matar la mitad de las células) de PA y los mutantes de PA se resumen en la tabla 1. La figura 3 a mostró que las células Vero que no expresan las MMP eran completamente resistentes a PA - L1 y PA - L2, pero muy sensibles a PA de tipo salvaje de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, las PA - L1 y PA - L2 cortadas por la MMP - 2 in vitro mataban eficazmente las células Vero incluso 6 horas de exposición a toxina de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3 b), demostrando la no toxicidad de PA - L1 y PA - L2 a las células Vero pierden la capacidad de procesarlas en la forma activa PA63. Los inventores muestran más tarde (en la Fig. 7) que WT - PA, PA - L1 y PA - L2 se unen rápidamente a las células Vero, pero solamente WT - PA se pueden procesar por las células Vero a la forma activa PA63, mientras PA - L1 y PA - L2 no. Al contrario que las células Vero, las células tumorales que expresan las dos MMP, Ht 1080, A2058 y MDA - MB - 231, eran completamente susceptibles a WT - PA así como PA - L1 y PA - L2 (Fig. 4a, 4b y 4c), y la sensibilidad a estos mutantes PA parecían correlacionarse directamente con los niveles de expresión global de las MMP de estas células tumorales (Fig. 2).
WT - PA, PA - L1 y PA - L2 combinadas con FP59 (constante a 50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células y se expusieron las células durante 6 horas y 48 horas. Para la citotoxicidad dependiente de FP59 depende de la inhibición de la síntesis de las proteínas iniciales mediante la ribosilación de EF - 2, la citotoxicidad se dejó que se desarrollara durante 48 horas. La CE_{50} (concentración necesaria para matar la mitad de las células) de PA y los mutantes de PA se resumen en la tabla 1. La figura 3 a mostró que las células Vero que no expresan las MMP eran completamente resistentes a PA - L1 y PA - L2, pero muy sensibles a PA de tipo salvaje de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, las PA - L1 y PA - L2 cortadas por la MMP - 2 in vitro mataban eficazmente las células Vero incluso 6 horas de exposición a toxina de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3 b), demostrando la no toxicidad de PA - L1 y PA - L2 a las células Vero pierden la capacidad de procesarlas en la forma activa PA63. Los inventores muestran más tarde (en la Fig. 7) que WT - PA, PA - L1 y PA - L2 se unen rápidamente a las células Vero, pero solamente WT - PA se pueden procesar por las células Vero a la forma activa PA63, mientras PA - L1 y PA - L2 no. Al contrario que las células Vero, las células tumorales que expresan las dos MMP, Ht 1080, A2058 y MDA - MB - 231, eran completamente susceptibles a WT - PA así como PA - L1 y PA - L2 (Fig. 4a, 4b y 4c), y la sensibilidad a estos mutantes PA parecían correlacionarse directamente con los niveles de expresión global de las MMP de estas células tumorales (Fig. 2).
\newpage
Para demostrar adicionalmente que la
citotoxicidad de los mutantes de PA a las células tumorales era
dependiente de la actividad de las MMP expresada por las células
diana, los inventores caracterizaron los efectos de los inhibidores
de MMP bien descritos, BB94 (Batimastat), BB - 2516 (Marimastat)),
y GM6001, sobre la citotoxicidad de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 a
las células HT 1080. Todos estos inhibidores de las MMP,
especialmente GM6001, conferían una clara protección a las células
HT 1080 frente a la exposición con PA - L1 y PA - L2 más FP59, pero
no protegían las células contra WT - PA más FP59 (Fig. 5). Así
pues, la muerte de las células tumorales mediante PA - L1 y PA - L2
eran realmente dependientes de la actividad de las MMP expresadas
por las células diana.
Los inventores diseñaron un modelo de co -
cultivo para imitar la condición in vivo para verificar si
PA - L1 y PA - L2 específicamente matan las células tumorales que
expresan las MMP, no las células que no expresan las MMP. Las
células Vero, HT 1080, MDA - MB - 231 y A2058 se cultivaron en las
cámaras diferentes de portaobjetos de 8 cámaras. Cuando las células
alcanzaron la confluencia, se retiró la partición de la cámara y el
portaobjetos se puso en una placa de cultivo petri con medio exento
de suero, de manera que las células diferentes estaban en el mismo
ambiente de cultivo. PA - L1 o pA - L2 (300 ng/ml) más FP59 (50
ng/ml), o FP59 (50 ng/ml) solo se añadieron separadamente a las
células y se incubaron durante 48 horas para ensayo de fototoxicidad
como se describe en materiales y procedimientos. Los resultados
mostraban que WT - PA mataba no selectivamente todas las células,
mientras que PA - L1 y PA - L2 solamente mataban las células HT
1080, MDA - MB - 231 y A2058, pero no dañaban las células Vero que
no expresaban las MMP (Fig. 5). Este resultado definía las
contribuciones relativas de las MMP asociadas a membranas frente a
las solubles, indicaban que el procesamiento de activación de los
mutantes de PA principalmente sucedía sobre la superficie de las
células tumorales en lugar de en el sobrenadante. La unión y
procesamiento de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 sobre la superficie de
las células Vero que no expresan las MMP y las células HT 1080 que
expresan las MMP estaban también directamente determinadas. Las
células Vero y HT 1080 se incubaron con WT - PA, PA - L1 y PA - L2
durante 0, 10 minutos, 40 minutos, 120 minutos y 360 minutos a
37ºC, respectivamente. Después las células se lavaron y los lisados
celulares se prepararon para análisis de trasnferencia de western
para comprobar la transformación de
WT - PA y mutantes de PA a la forma activa PA63. Los datos mostraban que WT - PA y PA - L2 se podían detectar en los lisados de las células Vero y HT 1080 tan pronto como 10 minutos después de la incubación, demostrando que
WT - PA y los mutantes de PA se podían unir rápidamente a la superficie celular (Fig. 7a, 7b). WT - PA se procesó mediante ambas de estas dos líneas celulares. En contraste, PA - L1 y PA - L2 solamente se trataban mediante las células HT 1080 que expresan las MMP pero no las células Vero que no expresan las MMP (Fig. 7a, 7b), siendo consistente con los resultados previos que PA - L1 y PA - L2 se podían tratar a las MMP (Fig. 1b y 1c) y selectivamente mataban las células tumorales que expresan las MMP (Fig. 6). Sin embargo las células HT 1080 procesaron WT - LA, PA - L1 y PA - L2, pero los resultados mostraban que las células procesaron WT - PA más eficazmente que PA - L1 y PA - L2 (Fig. 7b), que reflejan la actividad de las proteasas de tipo furina era más alta que las MMP sobre la superficie celular. Los inventores también analizaron que el estatus de procesamiento de PA - L1 y PA - L2 en los sobrenadantes de cultivo de las células HT 1080, y no se puede detectar su forma activa PA63 en los sobrenadantes de cultivo durante toda la noche, pero cuando pasa el tiempo los productos de descomposición al azar aparecían (datos no mostrados).
WT - PA y mutantes de PA a la forma activa PA63. Los datos mostraban que WT - PA y PA - L2 se podían detectar en los lisados de las células Vero y HT 1080 tan pronto como 10 minutos después de la incubación, demostrando que
WT - PA y los mutantes de PA se podían unir rápidamente a la superficie celular (Fig. 7a, 7b). WT - PA se procesó mediante ambas de estas dos líneas celulares. En contraste, PA - L1 y PA - L2 solamente se trataban mediante las células HT 1080 que expresan las MMP pero no las células Vero que no expresan las MMP (Fig. 7a, 7b), siendo consistente con los resultados previos que PA - L1 y PA - L2 se podían tratar a las MMP (Fig. 1b y 1c) y selectivamente mataban las células tumorales que expresan las MMP (Fig. 6). Sin embargo las células HT 1080 procesaron WT - LA, PA - L1 y PA - L2, pero los resultados mostraban que las células procesaron WT - PA más eficazmente que PA - L1 y PA - L2 (Fig. 7b), que reflejan la actividad de las proteasas de tipo furina era más alta que las MMP sobre la superficie celular. Los inventores también analizaron que el estatus de procesamiento de PA - L1 y PA - L2 en los sobrenadantes de cultivo de las células HT 1080, y no se puede detectar su forma activa PA63 en los sobrenadantes de cultivo durante toda la noche, pero cuando pasa el tiempo los productos de descomposición al azar aparecían (datos no mostrados).
El análisis zimográfico mostraba que las células
COS - 7 expresaban cantidades muy insignificantes de gelatinasas
(Fig. 8a inserción). Así pues, justo como se esperaba, las células
COS - 7 eran resistentes a PA - L1 y PA - L2 más FP59, pero
susceptible a WT - PA más FP59 (Fig. 8a). Para examinar el papel de
MT1 - MMP en la activación de
PA - L1 y PA - L2, que codifican la secuencia de MT1 - MMP se transfectó en células COS - 7, dando como resultado un COSgMT1 transfectante estable en dicha expresión de MT1 - MMP se detectó mediante transferencia de western (Fib. 8b inserción). En contraste a las células COS - 7, COSgMT1 de hizo más sensible a PA - L1 y PA - L2 (Fig. 8b), indicando que MT1 - MMP jugaban un papel en la activación de estos mutantes de PA, bien mediante procesamiento directo de los mutantes de PA unidos a las células, o mediante una forma indirecta que activaban pro - MMP - 2 u otras MMP primero, que a su vez trataban los mutantes de PA a sus forma activa PA_{63}. Parecía improbable la última, para las células COS - 7 expresaban una cantidad insignificante de las MMP.
PA - L1 y PA - L2, que codifican la secuencia de MT1 - MMP se transfectó en células COS - 7, dando como resultado un COSgMT1 transfectante estable en dicha expresión de MT1 - MMP se detectó mediante transferencia de western (Fib. 8b inserción). En contraste a las células COS - 7, COSgMT1 de hizo más sensible a PA - L1 y PA - L2 (Fig. 8b), indicando que MT1 - MMP jugaban un papel en la activación de estos mutantes de PA, bien mediante procesamiento directo de los mutantes de PA unidos a las células, o mediante una forma indirecta que activaban pro - MMP - 2 u otras MMP primero, que a su vez trataban los mutantes de PA a sus forma activa PA_{63}. Parecía improbable la última, para las células COS - 7 expresaban una cantidad insignificante de las MMP.
Las proteínas de PA mutantes se construyeron y se
ensayaron como se describe en el ejemplo I, sustituyendo uno de los
siguientes sitios de escisión de activador de plasminógeno de la
tabla 2 para los sitios de escisión de las MMP descritos
anteriormente. Las genotecas de visualización de fago se usaron para
identificar secuencias que tenían especificidad para una proteasa
particular (véase, por ejemplo, Coombs et al., J. Biol.
Chem. 273: 4323 - 4328 (1998); Ke et al., J. Biol.
Chem. 272: 20456 - 20462 (1997); Ke et al., J. Biol.
Chem. 272: 16603 - 16609 (1997)). Estas genotecas se pueden usar
por los expertos en la técnica para seleccionar secuencias
reconocidas específicamente por MMP y las proteasas activadoras de
plasminógenos.
Las enzimas para la manipulación y modificación
de ADN se compraron en New England Biolabs (Beverly, MA). FP59 y
una forma soluble de furina se prepararon en el laboratorio de los
inventores como de describe (Gordon, V. M., et al.,
Infect. Immun., 65: 4130 - 4134 (1997)). El anticuerpo
policlonal anti - PA de conejo (nº 5308) se preparó en el
laboratorio de los inventores. Pro - uPA (uPA de cadena sencilla,
nº 107), uPA (nº 124), uPA (nº 116), fragmento amino - terminal de
uroquinasa humana (ATF) (nº 146), glu - plasminógeno humano (nº
410), PAI - 1 humano (nº 1094), plasmina humana (nº 421),
anticuerpo monoclonal frente a uPA N - cadena humana (nº 394) se
compraron en America Diagnostica Inc (Greenwich, CT). Anticuerpo
policlonal de cabra frente t - PA humana (sc - 5241) se compró en
Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). El anticuerpo
monoclonal de uPAR R3 fue un regalo.
Un procedimiento de PCR de superposición
modificado se usó para construir las proteínas de PA mutadas en las
que el sitio de furina se reemplaza por la secuencia de sustrato
fisiológico de uPA y tPA PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4) en PA - U1,
secuencias favoritas de uPA PGSGRSA (SEC ID Nº: 5) y PGSGKSA (SEC ID
Nº: 6) en PA - U2 y PA - U3, respectivamente, secuencia favorita de
tPA PQRGRSA (SEC ID Nº: 7) en PA - U4. El plásmido pYS5 de
expresión de PA (Singh, Y., et al., J. Biol. Chem,
264: 19103 - 19107 (1989)) se usó como molde. Un cebador en 5' G,
AAAGGAGAACGTATATGA (SEC ID Nº: 8) (Shine - Dalgarno y
codones de inicio están subrayados), y el cebador inverso
fosforilado R1, pTGGTGAGTTCGAAGATTTTTGTTTTAATTCTGG (SEC ID Nº: 13)
(los primeros tres nucleótidos codifican P, los otros se hibridan a
la secuencia correspondiente a P_{154} - S_{163}), se usaron
para ampliar un fragmento designado "N". Un cebador
fosforilado mutagénico H1,
pTGTCCAGGAAGAGTAGTTGGAGGAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCA G (SEC ID: 14),
que codifica CPGRVVGG (SEC ID Nº: 15) y S_{168} - P_{176}, y
cebador inverso R2, ACGTTTATCTCTTATTAAAAT (SEC ID Nº: 11), que se
hibrida a la secuencia que codifica I_{589} -
R_{595}, se usaron para ampliar un fragmento mutagénico "M1". Un cebador mutagénico fosforilado H2, pGGAAGTGGAAGATCAGCAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 16), que codifica GSGRSA (SEC ID Nº. 17), y S_{168} - P_{176}, y el cebador inverso R2 se usó para ampliar un fragmento mutagénico "M2". Un cebagor mutagénico fosforilado H3, pGGAAGTGGAAAATCAGCAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 18), que codifica GSGKSA (SEC ID Nº: 19) y S_{168}- P_{176}, y el cebador inverso R2, se usaron para ampliar un fragmento mutagénico "M3". Un cebador mutagénico fosforilado H4, pCAGAGAGGAAGATCAGCAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 20), que codifica QRGRSA (SEC ID Nº: 21) y S_{168} - P_{176}, y el cebador inverso R2, se usaron para ampliar un fragmento mutagénico "M4". Los cebadores F y R2 se usaron para ampliar los productos ligados de N + M1, N + M2, N + M3 y N + M4, respectivamente, dando como resultado los fragmentos mutagenizados U1, U2, U3, y U4 en las que la secuencia codificada para el sitio de furina (RKKR_{167}; SEC ID Nº: 1) se reemplaza por sustrato uPA o tPA. Las digestiones de HindIII/Pstl de U1, U2, U3 y U4 se clonaron entre los sitios HindIII/Pstl de pYS5. Los plásmidos de expresión resultantes se llamaron pYS - PA - U1, pYS - PA - U2, pYS - PA - U3, y pYS -
PA - U4, y sus productos de expresión, las proteínas de PA mutadas, se llamaron de acuerdo a lo anterior PA - U1, PA - U2, PA - U3, y PA - U4. Un plásmido de expresión codificaba un mutante en el que RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplaza por PGG, se espera que no se escinda por ninguna proteasa. Su plásmido de expresión y producto de expresión se llamaron pYS - PA - U7 y PA - U7, respectivamente.
R_{595}, se usaron para ampliar un fragmento mutagénico "M1". Un cebador mutagénico fosforilado H2, pGGAAGTGGAAGATCAGCAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 16), que codifica GSGRSA (SEC ID Nº. 17), y S_{168} - P_{176}, y el cebador inverso R2 se usó para ampliar un fragmento mutagénico "M2". Un cebagor mutagénico fosforilado H3, pGGAAGTGGAAAATCAGCAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 18), que codifica GSGKSA (SEC ID Nº: 19) y S_{168}- P_{176}, y el cebador inverso R2, se usaron para ampliar un fragmento mutagénico "M3". Un cebador mutagénico fosforilado H4, pCAGAGAGGAAGATCAGCAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 20), que codifica QRGRSA (SEC ID Nº: 21) y S_{168} - P_{176}, y el cebador inverso R2, se usaron para ampliar un fragmento mutagénico "M4". Los cebadores F y R2 se usaron para ampliar los productos ligados de N + M1, N + M2, N + M3 y N + M4, respectivamente, dando como resultado los fragmentos mutagenizados U1, U2, U3, y U4 en las que la secuencia codificada para el sitio de furina (RKKR_{167}; SEC ID Nº: 1) se reemplaza por sustrato uPA o tPA. Las digestiones de HindIII/Pstl de U1, U2, U3 y U4 se clonaron entre los sitios HindIII/Pstl de pYS5. Los plásmidos de expresión resultantes se llamaron pYS - PA - U1, pYS - PA - U2, pYS - PA - U3, y pYS -
PA - U4, y sus productos de expresión, las proteínas de PA mutadas, se llamaron de acuerdo a lo anterior PA - U1, PA - U2, PA - U3, y PA - U4. Un plásmido de expresión codificaba un mutante en el que RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplaza por PGG, se espera que no se escinda por ninguna proteasa. Su plásmido de expresión y producto de expresión se llamaron pYS - PA - U7 y PA - U7, respectivamente.
Para expresar PA, PA - U1, PA - U2, PA - U3, PA -
U7, los plásmidos de expresión pYS5, pYS - PA - U1, pYS -
PA - U2, pYS - PA - U3, pYS - PA - U4, y pYS - PA - U7, se transformaron en la cepa no virulenta B. anthracis UM23Cl - 1 y se desarrollaron en medio FA (Shing, Y., J. Biol. Chem., 264: 19103 - 19107 (1989)) con 20 \mug/ml de canamicina durante 16 horas a 37ºC. Los productos de expresión se secretaron en los sobrenadantes de cultivo. Las proteínas de PA mutadas se concentraron y se purificaron mediante cromatografía sobre una columna MonoQ (Anersham Pharmacia Biotech, Pisactaway, NJ),como se ha descrito previamente (Varughese, M., et al., Mol. Med., 4: 87 - 95 (1998)).
PA - U2, pYS - PA - U3, pYS - PA - U4, y pYS - PA - U7, se transformaron en la cepa no virulenta B. anthracis UM23Cl - 1 y se desarrollaron en medio FA (Shing, Y., J. Biol. Chem., 264: 19103 - 19107 (1989)) con 20 \mug/ml de canamicina durante 16 horas a 37ºC. Los productos de expresión se secretaron en los sobrenadantes de cultivo. Las proteínas de PA mutadas se concentraron y se purificaron mediante cromatografía sobre una columna MonoQ (Anersham Pharmacia Biotech, Pisactaway, NJ),como se ha descrito previamente (Varughese, M., et al., Mol. Med., 4: 87 - 95 (1998)).
Se incubaron mezclas de reacción de 50 \mul que
contenían 50 \mug de las proteínas de PA a 37ºC con 5 \mul de
furina soluble o 0,5 \mug de uPA o tPA. La escisión por furina se
realizó en HEPES 25 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 0,2 mM, EGTA 0,2
mM, 100 \mug/ml de ovoalbúmina, CaCl_{2} 1,0 mM, y MgCl_{2}
1,0 mM. Se retiraron alícuotas (5 \mul) a intervalos mediante
electroforesis sobre gel de poliacrilamida (PAGE) usando gel de
Tris - glicina con gradiente 10 - 20% (Novex, San Diego, CA) y se
visualizaron mediante tinción con Commassie. La escisión con uPA o
tPA se hizo en NaCl 150 mM, Tris - HCl 10 mM (pH 7,5). Las
alícuotas retiradas a intervalos se diluyeron 1:1000 y se separaron
mediante PAGE usando gel de Tris - glicina con gradiente 10 - 20%
(Novex, San Diego, CA) y se electrotransfirió a una membrana de
celulosa (Novex, San Diego, CA). La escisión se valoró mediante
transferencia de western con anticuerpo anti - PA de conejo. Las
membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% (p/v), se incubó
secuencialmente con anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº
5308) y anticuepo anti - conejo de cabra conjugado a peroxidasa de
rábano picante (cs - 2004, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa
Cruz, CA), y se visualizó mediante ECL (Pierce, Rockford, IL).
Células Vero, células Hela de adenocarcinoma de
cuello uterino humano, células A2058 de melanoma humano, células
Bowes de melanoma humano, y células HT 1080 de fibrosarcoma humano
se obtuvieron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas,
Virginia). Todas las células se desarrollaron en medio esencial
mínimo de Dulbecco (DMEM) con glucosa al 0,45%, suero fetal bovino
al 10%, glutamina 2 mM, y 50 \mug/ml de gentamicina. Las células
endoteliales vasculares primarias humanas se obtuvieron y se
cultivaron según la metodología habitual. Las células se
mantuvieron a 37ºC en un ambiente de CO_{2} al 5%.
Se cultivaron células Vero, células Hela, células
A2058, y células Bowes en placas de 24 pocillos hasta confluencia,
se lavaron y se incubaron en medio exento de suero con 1 \mug/ml
de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno durante 1 h,
después los lisados celulares se prepararon para análisis de
transferencia de western con anticuerpo monoclonal frente iPA B -
cadena (nº 394).
Se sembraron células en placas de 96 pocillos a
aproximadamente 25% de confluencia. El día siguiente, las células
se lavaron dos veces con DMEM exento de suero para retirar el suero
residual. Las diluciones en serie de PA, proteínas mutadas de PA (0
a 1000 ng/ml) combinadas con FP59 (ng/ml) en DMEN exento de suero
(si se dirige el sistema de activación de plasminógeno de
uroquinasa, se añadieron 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de
glu - plasminógeno) a las células para proporcionar un volumen total
de 200 \mul/pocillo. En algunos experimentos, PAI - 1, se añadió
30 minutos antes de la adición de toxina. Las células se incubaron
con las toxinas durante 6 horas, después de lo cual el medio se
reemplazó con DMEN reciente suplementado con FCS al 10%. La
viabilidad celular después se ensayó mediante la adición de 50
\mul de 2,5 mg/ml de MTT (bromuro de
(3-[4,5-dimettiltiazol-2-il]-2,5-
difeniltetrazolio). Las células se incubaron con MTT durante 45
minutos a 37ºC, el medio se retiró, y el pigmento azul producido
por las células viables se solubilizó con 100 \mul/pocillo de SDS
al 0,5% (p/v), HCl 25 mM, en isopropanol al 90% (v/v). Las placas
se agitaron en aparato Vortex y el MMT oxidado se midió como
A_{570} usando un lector de microplacas.
Se crecieron células en placas de 24 pocillos
hasta confluencia y se lavaron dos veces con DMEM exento de suero
para retirar el suero residual. Después las células se incubaron
con 1 \mug/ml de PA y PA - U2 a 37ºC en DMEM exento de suero que
contenía 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno
durante diferentes período de tiempo. Cuando se ensayó PAI - 1, se
incubó con células durante 30 minutos antes de la adición de
proteínas de PA. Las células se lavaron cinco veces para retirar
las proteínas de PA no unidas. Las células se lisaron en 100
\mul/pocillo de tampón de lisis RIPA (Tris - HCl 50 mM, pH 7,4,
NP40 al 1%, Na - desoxicolato al 0,25%, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM,
fenilmetil sulfonil fluoruro 1 mM, 1 \mug/ml de cada uno de
aprotinina, leupeptina y pepstatina) sobre hielo durante 10
minutos. Se separaron cantidades iguales de proteína de los lisados
celulares mediante PAGE usando ges de Tris - glicina en gradiente
al 10 - 20% (Novex, San Diego, CA). La transferencia de western para
detectar PA y sus productos de escisión se realizó como se ha
descrito anteriormente.
Se diseño un co - cultivo para imitar la
condición in vivo para verificar si PA - U2 mataba las
células tumorales que sobreexpresan uP AR aunque no afectaba a las
células que no expresan uP AR. Se cultivaron células Vero, Hela en
cámaras separadas de portaobjetos de 8 cámaras (Nalge Nunc
Internacional, Naperville, IL) hasta 80 - 1005 de confluencia. Las
células se lavaron dos veces con DMEM exento de suero, la partición
de las cámaras se retiró, y el portaobjetos se puso en una placa de
cultivo con medio exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro -
uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno, de manera que las células
se bañaron en el mismo medio, PA y PA - U2 (300 ng/ml) y FP59 (50
ng/ml) se añadieron individualmente o en combinación y las células
se expusieron durante 48 horas. Después MTT (0,5 mg/ml) se añadió
durante 45 minutos a 37ºC, las particiones se remontaron, y el MTT
oxidado en cada cámara se disolvió como se ha descrito
anteriormente para determinar la viabilidad de cada tipo celular.
Los lisados celulares de diferentes cámaras se prepararon también
para transferencia de western para detectar las proteínas de PA y
sus especies PA63 de productos de escisión.
La estructura cristalina de PA muestra que el
sitio de furina, RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1), es una bucle
flexible, expuesto a la superficie compuesto de aa 162 a 175
(Petosa, C., et al., Nature, 385: 833 - 838 (1997)).
La escisión en este bucle por la furina o proteasas de tipo furina
es esencial para la toxicidad. Las proteínas de PA mutadas se
construyeron de manera que la secuencia sensible a furina
RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplace por las secuencias de
sustrato ePA o tPA. En la proteína de PA mutada PA - U1, PCPGRVVGG
(SEC ID Nº: 4), un péptido de P5 a P4' en el plasminógeno del
sustrato fisiológico, se usó para reemplazar RKKR_{167} (SEC ID
Nº: 1). En PA - U2, RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplazó por un
péptido, PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), que contenía la secuencia de
consenso SGRSA (SEC ID Nº: 22) entre P3 y P2', que se identificó
recientemente como el mejor sustrato minimizado para uPA (Ke, S.
H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462
(1997)). Debido a que el péptido SGRSA (SEC ID Nº: 22) se escinde
1363 veces más eficientemente que un péptido control que contiene
el sitio de escisión fisiológico presente en el plasminógeno
mediante uPA, y muestra una selectividad uPA/tPA de 20 (Ke, S. H.,
et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 -
20462 (1997)), PA - U2 se esperaba que fuera un sustrato favorito de uPA. La selectividad de uPA/tPA del péptido SGRSA (SEC ID Nº: 22) se puede además potenciar mediante la colocación de lisina en la posición P1 (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)), así pues, el péptido PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), que muestra una selectividad de uPA/tPA de 121 (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)), se usó para reemplazar RKKR_{167}(SEC ID Nº: 1) para construir una proteína de PA mutada, PA - U3, con incluso una actividad selectiva de uPA más alta que PA - U2. La investigación mostraba que los residuos P3 y P4 eran los determinantes primarios de la capacidad de un sustrato para discriminar entre yPA y uPA, y una mutación de tanto P4 glicina y P3 serina del sustrato de uPA más lábil (GSGRSA; SEC ID Nº: 17) a glutamina y arginina, respectivamente, disminuía la selectividad de uPA/tPA mediante un factor de 1200 y realmente convertía el péptido en un sustrato selectivo de tPA (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)). Basándose en este estudio, una proteína de PA mutada, PA - U4, se construyó. PA - U4 se esperaba que fuera un sustrato favorito de tPA, en el que el péptido PQRGRSA se usó para reemplazar RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1). Una proteína de PA mutada PA - U7, también se construyó de manera que RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplazaba por la secuencia al azar PGG, se esperaba que no se escindiera por ninguna de las proteasas conocidas, se usó un control en este estudio. Las designaciones de las proteínas de PA mutadas junto con las propiedades esperadas se resumen en la tabla 3.
20462 (1997)), PA - U2 se esperaba que fuera un sustrato favorito de uPA. La selectividad de uPA/tPA del péptido SGRSA (SEC ID Nº: 22) se puede además potenciar mediante la colocación de lisina en la posición P1 (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)), así pues, el péptido PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), que muestra una selectividad de uPA/tPA de 121 (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)), se usó para reemplazar RKKR_{167}(SEC ID Nº: 1) para construir una proteína de PA mutada, PA - U3, con incluso una actividad selectiva de uPA más alta que PA - U2. La investigación mostraba que los residuos P3 y P4 eran los determinantes primarios de la capacidad de un sustrato para discriminar entre yPA y uPA, y una mutación de tanto P4 glicina y P3 serina del sustrato de uPA más lábil (GSGRSA; SEC ID Nº: 17) a glutamina y arginina, respectivamente, disminuía la selectividad de uPA/tPA mediante un factor de 1200 y realmente convertía el péptido en un sustrato selectivo de tPA (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)). Basándose en este estudio, una proteína de PA mutada, PA - U4, se construyó. PA - U4 se esperaba que fuera un sustrato favorito de tPA, en el que el péptido PQRGRSA se usó para reemplazar RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1). Una proteína de PA mutada PA - U7, también se construyó de manera que RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplazaba por la secuencia al azar PGG, se esperaba que no se escindiera por ninguna de las proteasas conocidas, se usó un control en este estudio. Las designaciones de las proteínas de PA mutadas junto con las propiedades esperadas se resumen en la tabla 3.
Los plásmidos que codifican estas proteínas de PA
mutadas se construyeron mediante un procedimiento de PCR de
superposición, se clonaron en un vector de transferencia E. coli
- Bacillus PYS5, y se expresaron de manera eficaz en B.
anthracis UM23C1 - 1. Los productos de expresiones secretaron en
los sobrenadantes del cultivo a 20 - 50 mg/l Las proteínas mutadas
de PA se concentraron y se purificaron mediante cromatografía MonoQ
hasta una banda prominente en la masa molecular esperada de 83 kDA
que migraba conjuntamente con PA en SDS - PAGE. Así pues, usando un
protocolo de producción que es ahora patrón para PA, estas
proteínas de PA mutadas se pueden expresar y purificar fácilmente,
con alto rendimiento y pureza.
Para verificar que las proteínas de PA mutadas
tenían la susceptibilidad esperada a las proteasas, se sometieron a
escisión con una forma soluble de furina, uPA y tPA. Como se
esperaba, estas proteínas de PA mutadas, habían perdido
completamente la susceptibilidad a furina. Por el contrario, la PA
de tipo salvaje era muy sensible a furina y procesaba la forma
activa PA63 (Fig. 9a). Los perfiles de escisión de estas proteínas
de PA mutadas mediante uPA y tPA eran completamente consistente con
al obtenida de los sustrato de los péptidos (Fig. 9b, 9c). PA - U2
estaba escindida eficazmente por uPA, a la que seguía PA - U3. PA -
U3 se puede escindir solamente mediante uPA, pero no mediante tPA,
que muestra alta especificidad de uPA. Sin embargo, PA - U2 también
se escindía ligeramente mediante tPA, siendo un sustrato débil para
tPA. Por el contrario, PA - U4 era un sustrato muy débil para uPA,
pero un buen sustrato PATRA tPA. PA - U7 así como PA - U1 eran
ambos completamente resistentes a uPA y tPA. PA era completamente
resistente a tPA, pero era un sustrato débil para uPA (Fig. 9b).
Estos resultados implicaban PA - U2 y PA - U3 que se pueden activar
selectivamente mediante uPA pueden ser útiles para dirigir el
sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de
las células tumorales para la terapia de tumores, mientras PA - U4
puede ser tóxica a las células que expresan tPA que usualmente se
producen en neuroblastomas.
uPAR se sobreexpresa típicamente en líneas
tumorales cancerosas y tejido tumorales, y es al parte central del
sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de
las células que es esencial a la invasión tumoral y metástasis.
Para analizar la hipótesis que PA - U2 y PA - U3 matarían
preferiblemente las células tumorales que sobreexpresan uPAR, se
realizaron ensayos de citotoxicidad con tres líneas tumorales
humanas: Hela de carcinoma de cuello de útero, A2058 de melanoma, y
Bowes de melanoma. Una línea celular de mono no tumoral, Vero, se
usó como control. La expresión se uPAR mediante estas tres líneas
celulares tumorales pero no mediante las células Vero se evidenció
mediante la unión y procesamiento de pro - uPA a ala forma activa de
uPA de dos cadenas mediante estas tres células tumorales pero no
mediante las células Vero. La Fig. 10 mostró que después de 1 hora
de incubación con las células, pro - uPA y la forma procesada uPA
de cadena B se puede detectar a partir de estos tres lisados de
células tumorales pero no a partir de células Vero.
La citotoxicidad de PA y las proteínas de PA
mutadas a estas células se midió en placas de 96 pocillos. En
tejidos tumorales, las células tumorales sobreexpresan típicamente
uPAER, mientras que las células estromales tumorales expresan pro -
uPA que se une y por lo tanto se activa sobre la superficie de las
células tumorales, por lo tanto, en el ensayo de citotoxididad 100
ng/ml de pro - uPA se añadió a las células tumorales para imitar el
papel de las células estromales tumorales in vivo. Además,
el plasminógeno es un componente importante del sistema de
activación de plasminógeno, y presente a alta concentración (1,5 -
2,0 \muM) en plasma y fluidos instersticiales, que representan una
fuente abundante potencial de actividad de plasmina. Por lo tanto,
1 \mug/ml de glu - plasminógeno también se añadió en el ensayo de
citotoxicidad. PA y las proteínas de PA mutadas combinadas con FP59
se incubaron con las células durante 6 horas, y la viabilidad de
midió después de 48 horas. Los valores de CE_{50}
(concentraciones necesarias para matar la mitad de las células) para
PA y las proteínas de PA mutadas se resumen en la tabla 4. Las tres
células tumorales que expresan uPAR, Hela, A2058, y Bowes eran muy
susceptibles a AP así como a PA - U2 y PA - U3, y menos
susceptibles a PA - U4 (Fig, 11 a, b, c). Por el contrario, estas
células tumorales eran completamente resistentes a PA - U1 y PA -
U7 (Fig, 11 a, b, c). El orden de la citotoxicidad de proteínas de
PA mutadas a estas células tumorales: PA - U2 > PA - U3 > PA
- U4 >> PA - U1, PA - U7, se correlacionaban bien con el
perfil de escisión de uPA mostrado en la Fig. 9b. Al contrario que
las células tumorales, las células Vero que no expresan uPAR eran
completamente resistentes a todas las proteínas de PA mutadas, pero
sensibles a PA de una manera dependiente de la dosis (Fig 12 a).
Sin embargo, PA - U2 que estaba primero cortada por uPA in
vitro mataba eficazmente las células Vero (Fig. 11 b). Esto
demostraba que la resistencia de las células Vero a PA - U2 era
debido a la incapacidad de las células a activar proteolóticamente
las proteínas mutadas PA.
También se evaluó la unión y procesamiento
proteolítico de PA y PA - U2 sobre la superficie celular. Se
incubaron células Vero y Hela con PA y PA - U2 durante diversos
períodos de tiempos. Después de eso los lisados celulares se
prepararon y se examinaron mediante transferencia de Western para
detectar el estatus de unión y procesamiento de las proteínas PA a
las especies PA63 activas. PA se procesó mediante ambos tipos de
células, y esto no podría inhibirse por PAI - 1 (Fig. 13 a, b). Por
el contrario, PA - U2 se procesó por las células Hela pero no por
las células Vero, y esto se podría bloquear completamente por PAI -
1 (Fig. 13 a, b), demostrando la escisión de PA - U2 sobre la
superficie de las células Hela se debía a uPA activada sobre la
superficie. Aunque las células Hela procesaban proteolíticamente PA
así como PA - U2, la última se escindía más lentamente
aparentemente debido a que su escisión era secundaria a la
activación de pro - uPA (fig. 13 b).
Para demostrar adicionalmente que la
citotoxicidad de las proteínas PA mutadas era dependiente del
sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de
las células tumorales, se caracterizaron los efectos del inhibidor
específico y bloquentes del sistema. PAI - 1 confirió fuertes
protecciones a todas estas células tumorales frente a la exposición
con PA - U2 más FP59, pero no protegía las células de PA más FP59
(Fig. 14 a, b, c). ATF, el fragmento amino terminal y el dominio de
unión uPAR de uPA, que compite con el sitio de unión sobre uPAR con
pro - uPA, protegía las tres células tumorales de PA - U2 más FP59
de una manera dependiente de la dosis (Fig. 15 a). De manera
similar, uPAR que bloquea el anticuerpo monoclonal R3 que
específicamente interfiere la unión entre pro - UPA y uPAR, también
protegía las células tumorales en los tres casos de PA - U2 más
FP59 (Fig. 15 b). Estos resultados demuestran que la muerte se
estas células tumorales por UP - U2 dependía del sistema de
activación de plasminógeno asociado a la superficie de las células
tumorales.
Se diseñó un modelo de co - cultivo para imitar
las condiciones in vivo, para analizar si PA - U2 puede
matar selectivamente células Hela pero no las células transeúntes.
Las células Vero y Helo se cultivaron en compartimientos separados
de portaobjetos de 8 cámaras. Cuando las células alcanzaron la
confluencia, las particiones de la cámara se retiraron y los
portaobjetos se pusieron en placas de cultivo con medio exento de
suero que contiene 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu -
plasminógeno de manera que las células sobre el portaobjetos se
bañaron en el mismo medio. PA y PA - U2 (cada una a 300 ng/ml) más
FP59 (50 ng/ml), o FP59 solo se añadieron a las placas de cultivo y
se incubaron durante 48 horas antes de medir la viabilidad. Los
resultados mostraron que PA se procesó para activar PA63 y mataba
ambas células, mientras PA - U2 se procesaba para activar PA63 y
solamente mataba células Hela, mientras que no afectaba a las
células Vero que no expresan uPAR (Fig. 16 inserción). Estos
resultados mostraron que PA - U2 no se activa en el medio de cultivo
de tejidos mediante uPA no unida a uPAR, ni las proteínas PA
proteolíticamente activadas sobre la superficie de una célula se
disocian y se vuelven a unir sobre otras células. uPA activa en el
sobrenadante del cultivo no habría conducido a la muerte de células
Vero, debido a que la Fig. 12 mostraba que PA - U escindida en
solución se hacía tóxica.
La Fig. 9 mostró que PA - U4 es un buen sustrato
de tPA entre estas proteínas de PA mutadas y se espera que sean
tóxicas para las células que expresan tPA. Para ensayar esta
hipótesis, se realizó un ensayo de citotoxicidad sobre dos células
que expresan tPA: células Bowes de melanoma y endoteliales
vasculares primarias humanas (HUVEC). La expresión de tPA por estas
células se evidenció mediante análisis de transferencia de Western
de los sobrenadantes de cultivo usando un anticuerpo policlonal
contra tPA humana (datos no mostrados). Las células se cultivaron
hasta 50% de confluencia, después se realizó el ensayo de
citotoxicidad en DMEM exento de suero que no contenía pro - uPA y
glu - plasminógeno. Se incubaron diferentes concentraciones (entre 0
y 100 ng/ml) de PA, PA - U2, PA - U3, y PA - U4 combinadas con FP59
(50 ng(ml) con células durante 12 horas, y se midió la
viabilidad después de 48 horas. Los valores de CE_{50} para las
proteínas de PA se resumen en la tabla 5. PA - U4 era tóxica para
las células que expresan tPA, mientras que PA - U2 y PA - U3
mostraron una toxicidad muy baja para ellas (Fig. 17 a, b y la tabla
5). Éstos y los resultados anteriores mostraban claramente que la,
susceptibilidad de uPA y tPA se diferencian entre estas proteínas
de PA mutadas. PA - U2 y PA - U3 que específicamente dirigen el
sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de
las células tumorales pueden ser muy útiles para la terapia
tumoral. Mientras que PA - U4 se podrían activar mediante tPA se
puede aplicar para algunos tumores de neurosistema que usualmente
sobreexpresan tPA.
Se ha acumulado evidencia creciente de que los
componentes del sistema de activación de plasminógeno de uroquinasa
están implicados en la proliferación de las células tumorales,
invasión, y metástasis desde 1976 cuando se descubrió que uPA se
producía y se liberaba de las células cancerosas (Schmitt, M., et
al., Thromb. Haemost., 78:
285 - 296 (1997)). Datos recientes sugieren que los factores de invasión pueden también servir como dianas para nuevos tratamientos para prevenir invasión de cáncer y metástasis (Schmitt, M., et al., Thromb. Haemost., 78:
285 - 296 (1997)). Datos recientes sugieren que los factores de invasión pueden también servir como dianas para nuevos tratamientos para prevenir invasión de cáncer y metástasis (Schmitt, M., et al., Thromb. Haemost., 78:
\hbox{285 -}296 (1997)). Diversos y diferentes planteamientos que interfieren con la expresión o la actividad de uPA, uPAR, y PAI - 1 a nivel de genes o proteínas se ensayaron in vitro o en ratones con éxito incluyendo oligonucleótidos de polaridad opuesta, anticuerpos, inhibidores, y análogos de uPA y uPAR recombinantes o sintéticos (Schmitt, M., et al., Thromb. Haemost., 78: 285 - 296 (1997)). Sin embargo, se espera que estos planteamientos deberían solamente reducir el crecimiento de tumores, sin tener una acción citotóxica directa que podría erradicarlas células malignas. El presente estudio es el primero que explota el sistema de plasminógeno asociado a la superficie de las células tumorales para lograr la dirección selectiva de tipo celular de las proteínas de fusión de toxina bacteriana citotóxica. En este estudio, proteínas de antígeno protector (PA) de toxinas de ántrax mutadas, PA - U2, PA - U3, y PA - U4, se construyeron para que el sitio de reconocimiento por furina se reemplazara por secuencias susceptibles escindidas por uPA
\hbox{(PA -}U2 y PA - U3) o tPA (PA - U4) más eficazmente que los péptidos control que contienen la secuencia fisiológica diana presente en el plasminógeno. Más interesante es que la susceptibilidad hacia uPA y tPA diferenciaba entre estas proteínas de PA mutadas, es decir, PA - U2 y PA - U3 se activaban principalmente por uPA, mientras que UP - U4 se activaba principalmente por tPA. Así pues, cuando se combinan con FP59, una toxina de fusión recombinante derivada del factor letal de ántrax y la exotoxina A de Pseudomonas, PA - U2 y PA - U3 mataban selectivamente las células tumorales que sobreexpresan uPAR en presencia de pro - uPA, y mientras tanto mostraban muy baja toxicidad para las células que expresan tPA tales como las células endoteliales vasculares. Debido a que tPA se secreta como una enzima activa principalmente por células endoteliales vasculares in vivo (Mann, K., et al., Annu. Rev. Biochem., 57: 915 - 956 (1988)), la diferenciación de citotoxicidad entre estas proteínas de PA mutadas a las células de expresión de uPA a tPA es tan importante que evita el daño a las células endoteliales vasculares cuando PA - U2 y PA - U3 se usan in vivo.
Las siguientes líneas de evidencia demuestran
claramente que la activación proteolítica de estas proteínas de PA
mutadas asociadas a uPA se produce sobre la superficie de las
células tumorales que era dependiente de la actividad del sistema
de activación de plasminógeno asociado a la superficie de las
células tumorales: 1. Pro uPA solamente se podría unir y por lo
tanto activar proteolíticamente sobre la superficie de las células
tumorales que expresan uPAR pero no las células Vero que no
expresan uPAR; 2. PA - U2 solamente se podrían procesar
proteolíticamente a la forma activa PA63 sobre las células que
expresan uP AR (tales como células Hela) pero no las células Vero
que no expresan uPAR, y este procesamiento se podría inhibir
completamente mediante el inhibidor específico de uPA PAI - 1; 3.
La toxicidad de PA - U2 a las células tumorales se eliminó mediante
el reactivo de bloqueo específico de uPAR ATF, el anticuerpo de
boqueo de uPAR R3, y PAI - 1, demuestran que la activación de PA -
U2 dependía enteramente de la activación de pro - uPA sobre la
superficie de las células tumorales; 4. los ensayos de
citotoxicidad en un modelo de co - cultivo, en el que las células
eran igualmente accesibles a las toxinas en el sobrenadante,
mostraban que PA - U2 mataba solamente las células Hela que
sobreexpresan uPAR y no las células Vero transeúntes, demostrando
que al activación las proteínas de PA mutadas activadas por uPA se
producían principalmente sobre las superficies de las células,
debido a que la forma activa de las proteínas de PA en solución
también podrían matar las células Vero.
Las proteínas de PA se unen a las células
rápidamente y con alta afinidad (Kd aproximadamente 1 nM), por lo
tanto, incluso a bajas concentraciones de PA, los receptores de PA
estarán altamente ocupados. Como resultado, si hubiera cualquier PA
que se llegara a activar en el sobrenadante o disociarse de una
célula después de la escisión sería incapaz de localizar un receptor
libre mediante el cual se uniera a las células e internalizase
FP59.
Así pues, la citotoxicidad de estas citotoxinas
se dirigirá selectivamente a las células tumorales que
sobreexpresan uPAR. PA - U4, que se podrían activar por tPA, se
puede aplicar para terapia intratumoral de algunos tumores de
neurosistemas no reseccionable que usualmente sobreeexpresan
tPA.
Las citotoxinas selectivas de células tumorales
se han creado reemplazando los dominios de reconocimiento del
receptor de proteína bacteriana y vegetal con citoquinas, factores
de crecimiento, y anticuerpos (Kreitman, R. J., Curr,. Opin.
Immunol., 11: 570 - 578 (1999). Las toxinas proteicas usadas
contienen un dominio enzimático que actúa en el citosol para
inhibir la síntesis y un dominio que logra la traslocación de este
catalizador desde un compartimiento vesicular al citosol, así como
el dominio de dirección de células que se reemplaza o altera de
manera que se logra la especificidad de las células tumorales.
Ciertas de estas "inmunotoxinas" derivadas de toxina de
difteria, exotoxina A de Psedomonas, y ricina han mostrado
eficacia y se han aprobado para uso clínico. Sin embargo, un
problema recurrente con estos materiales es que las dosis
terapéuticas dañan típicamente otros tejidos y células (Frankel, A.
E., et al., Semen. Cancer. Biol., 6: 307 - 317
(1995)). Esto no es sorprendente debido a que muy pocos de los
receptores superficiales de las células tumorales o antígenos que
están dirigidos están totalmente ausentes en el tejido normal. Por
lo tanto, incluso en los mejores casos, alguna captación de toxina
se producirá en células transeúntes normales. Debido a que estas
toxinas actúan catalíticamente, incluso una pequeña cantidad de la
toxina internalizada pueden dañar seriamente el tejido normal.
Incluso una sola molécula administrada al citosol puede matar una
célula (Yamaizumi, M., et al., Cell, 15: 245 - 250
(1978)). Esfuerzos previos para desarrollar proteínas de fusión de
toxinas de ántrax como agentes terapéuticos se han centrado sobre
la modificación del dominio 4, el dominio de unión de receptor de
PA. El trabajo está en curso para crear agentes citotóxicos
específicos del tipo celular mediante la modificación o reemplazo
del dominio 4 para dirigir PA que alternen receptores (Varughese,
M., et al., Mol. Med., 4: 87 - 95 (1998); Varughese,
M., et al., Infect. Immun., 67: 1860 - 1865 (1999).
Este trabajo sigue el ejemplo del desarrollo de inmunotoxinas a
partir de otras toxinas proteicas (Kreitman, R. J., Cuu. Opin,
Immunol., 11: 570 - 578 (1999)). Los inventores sugieren que
combinando dos estrategias de dirección conceptualmente distintas
en una proteína de PA individual producirá agentes que tienen
índices terapéuticos superiores. Una proteína que está tanto
redirigida a una proteína de la superficie de las células tumorales
y dependiente del sistema de activación de plasminógeno de la
superficie celular para la activación pueden lograr efectos
terapéuticos mientras están libres de los efectos secundarios
observados con muchos de las inmunotoxinas existentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Un procedimiento in vitro de dirección
de un compuesto a una célula que sobreexpresa un activador de
plasminógeno, el procedimiento comprendiendo las etapas de:
- (i)
- administrar a la célula una proteína de antígeno protector de Bacillus anthracis mutante que comprende un sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno en lugar del sitio de escisión reconocido por la furina del antígeno protector nativo, en la que el antígeno protector de Bacillus anthracis mutante está escindido por un activador de plasminógeno; y
- (ii)
- administrar a la célula un compuesto que comprende un polipéptido de factor letal de Bacillus anthracis que comprende un sitio de unión del antígeno protector; en el que el polipéptido del factor letal de Bacillus anthracis se une al antígeno protector escindido y se trasloca en la célula, por lo tanto distribuyendo el compuesto a la célula.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el activador de plasminógeno se selecciona entre el grupo
constituido por t - PA y u - PA.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en el que el sitio de escisión reconocido por el activador de
plasminógeno se selecciona entre el grupo constituido por PCPGRVVGG
(SEC ID Nº: 4), PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), y
PQRGRSA (SEC ID Nº: 7).
4. El procedimiento según la reivindicación 1, 2
ó 3, en el que la célula es una célula cancerosa.
5. El procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el cáncer se selecciona entre el grupo constituido cáncer de
pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de tiroides,
cáncer de hígado, cáncer de pleura, cáncer pancreático, cáncer de
ovario, cáncer de cuello de útero, cáncer de colon, fibrosarcoma,
neuroblastoma, glioma, melanoma, leucemia monocítica, y leucemia
mieloide.
6. El procedimiento según la reivindicación 1, 2
ó 3, en el que la célula es una célula inflamatoria.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido de factor letal es
factor letal nativo.
8. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto es factor letal
nativo.
9. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido de factor letal
está unido a un compuesto heterólogo.
10. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que el compuesto es la toxina disentérica, una cadena de
toxina de difteria, o la exotoxina A de Pseudomonas.
11. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que el compuesto es un resto detectable.
12. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que el compuesto es un ácido nucleico.
13. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que el compuesto está unido de manera covalente a un factor
letal mediante un enlace químico.
14. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que el compuesto heterólogo está unido de manera recombinante
al factor letal.
15. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el compuesto es un agente
de diagnóstico o terapéutico.
16. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la célula es una célula
humana.
17. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la proteína del antígeno protector mutante es una
proteína de fusión que comprende un dominio de unión receptor
heterólogo.
18. El procedimiento según la reivindicación 17,
en el que el dominio de unión receptor heterólogo se selecciona
entre el grupo constituido por un anticuerpo de cadena sencilla y
un factor de crecimiento.
19. Una proteína de antígeno protector mutante
aislado que comprende un sitio de escisión reconocido por el
activador de plasminógeno en lugar del sitio de escisión reconocido
por la furina de antígeno protector nativo, en el que el antígeno
protector mutante de Bacillus anthracis está escindido por un
activador de plasminógeno.
20. La proteína según la reivindicación 19, en la
que el sitio de escisión reconocido por el activador de
plasminógeno se selecciona entre el grupo constituido por PCPGRVVGG
(SEC ID Nº: 4), PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), PGSGKSA (SEC ID Nº: 6),
PQRGRSA (SEC ID Nº: 7), GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID
Nº: 3).
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