ES2233495T3 - Proteinas antigenicas protectoras contra toxinas de antrax mutadas que se dirigen especificamente a celulas que contienen altas cantidades de metaloproteinasas de la superficie celular o receptores del activador de plasminogeno. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro de dirección de un compuesto a una célula que sobreexpresa un activador de plasminógeno, el procedimiento comprendiendo las etapas de: (i) administrar a la célula una proteína de antígeno protector de Bacillus anthracis mutante que comprende un sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno en lugar del sitio de escisión reconocido por la furina del antígeno protector nativo, en la que el antígeno protector de Bacillus anthracis mutante está escindido por un activador de plasminógeno; y (ii)administrar a la célula un compuesto que comprende un polipéptido de factor letal de Bacillus anthracis que comprende un sitio de unión del antígeno protector; en el que el polipéptido del factor letal de Bacillus anthracis se une al antígeno protector escindido y se trasloca en la célula, por lo tanto distribuyendo el compuesto a la célula.

Description

Proteínas antigénicas protectoras contra toxinas de ántrax mutadas que se dirigen específicamente a células que contienen altas cantidades de metaloproteinasas de la superficie celular o receptores de activador de plasminógeno.

Referencia a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud está relacionada con la patente de Estados Unidos nº 5.591.631; patente de Estados nº 5.677.274; y documentos USSN 08/937.276, presentado el 15 de septiembre de 1997; cada una de las cuales se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su totalidad. Esta solicitud reivindica prioridad al documento USSN 60/155.691, presentado el 24 de septiembre de 1999, que se incorpora en esta memoria descriptiva por referencia en su totalidad.

Declaración sobre derechos de las invenciones realizadas bajo investigación y desarrollo patrocinadas federalmente

No aplicable.

Antecedentes de la invención

La toxina del ántrax es una toxina de tres partes secretada por Bacillus anthracis constituida por el antígeno protector (PA, 83 kDa), factor letal (LF, 90 kDa) y factor edema (EF, 89 kDa) (Smith, H., et al., J. Gen. MIcrobiol., 29: 517 - 521 (1962); Leppla, S. H., Sourcebook of bacterial protein toxins, p. 277 - 302 (1991); Leppla, S. H., Handb. Nat. Toxins, 8: 543 - 572 (1995), que no son individualmente tóxicas. El mecanismo mediante el cual los componentes individuales de las toxinas interaccionan para producir toxicidad se revisó recientemente (Leppla, S. H., Handb. Nat. Toxins, 8: 543 - 572 (1995)). El antígeno protector, reconocido como central, componente de unión al receptor, se une a un receptor no identificado (Escuyer, V., et al., Infect. Immun., 59: 3381 - 3386 (1991)) y se escinde en la secuencia RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) mediante furina de superficie celular o proteasas de tipo furina (Klimpel, K. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10277 - 10281 (1992); Molloy, S. S., et al J. B. Chem., 267: 16396 - 16402 (1992)) en dos fragmentos: PA63, un fragmento C - terminal de 63 kDa, que mantiene la unión al receptor; y PA20, un fragmento

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terminal de 20 kDa que se libera en el medio (Klimpel, K. R., et al., Mol. Microbiol., 13: 1094 - 1100 (1994)). La disociación de PA20 permite que PA63 forme un heptámero (Milne, J. C., et al., J. Biol. Chem., 269: 20607 - 20612 (1994); Benson, E. L., et al., Biochemistry, 37: 3941 - 3948 (1998)) y también se une LF o EF (Leppla, S. H., et al., Bacterial protein toxins, p. 111 - 112 (1988)). El complejo hetero - oligomérico resultante se internaliza mediante endocitosis (Gordon, V. M., et al., Infect. Ummun., 56: 1066 - 1069 (1988)), y acidificación de la vesícula produce la inserción del heptámero PA63 en la membrana endosomal para producir un canal a través del cual LF o EF traslocan al citosol (Friedlander, A. M., J. Biol. Chem., 261: 7123 - 7126 (1986)), donde LF y EF inducen procesos citotóxicos.

Así pues, la combinación de PA + LF, llamada toxina letal de ántrax, mata animales (Beal, F. A., et al., J. Bacteriao., 83: 1274 - 1280 (1962); Ezzell, J. W., et al., Infect. Immun., 45: 761 - 767 (1984)) y ciertas células cultivadas (Friedlander, A. M., J. Biol. Chem., 261: 7123 - 7126 (1986); Hanna, P. C., et al., Mol. Biol. Cell., 3: 1267 - 1277 (1992)), debido a la distribución intracelular y acción de LF, recientemente demuestra que es una metaloproteasa dependiente de cinc que se sabe que escinde al menos dos dianas, quinasa 1 y 2 de la protein quinasa activada por mitógenos (Duesbery, N. S., et al., Science, 280: 734 - 737 (1998); Vitale, G., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 248: 706 - 711 (1998)). La combinación de PA + EF, llamada toxina de edema, inutiliza los fagocitos y probablemente otras células, debido a la actividad de la adenilato ciclasa intracelular de EF (Leppla, S. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79: 3162 - 3166 (1982)).

LF y EF tienen homología de secuencias sustancial en aminoácido (aa) 1 - 250 (Leppla, S. H., Handb. Nat. Toxins, 8: 543 - 572 (1995)), y un estudio de mutagénesis mostró que esta región constituye el dominio de unión a PA (Quinn, C. P., et al. J. Biol. Chem., 166: 20124 - 20130 (1991)). La supresión sistemática de las proteínas de fusión de LF que contienen el dominio catalítico de la endotoxina A de Pseudomonas estableció que LF aa 1 - 254 (LFn) son suficientes para lograr la traslocación de polipéptidos "pasajeros" al citosol de las células en un procedimiento dependiente de PA (Arora, N., et al., J. Biol. Chem., 267: 15542 - 15548 (1992); Arora, N., y col., J. Biol. Chem., 268: 3334 - 3341(1993)). Se ha desarrollado una alta toxicidad de la fusión de LFn al dominio de ribosilación de ADP de la endotoxina A de Pseudomonas, denominada FP59, (Arora, N., y col., J. Biol. Chem., 268: 3334 - 3341(1993)). Cuando se combina con PA, FP59 destruye cualquier tipo de célula que contiene receptores para PA mediante el mecanismo de inhibición de la síntesis de proteínas inicial a través de ADP que ribosila la inactivación del factor 2 de elongación (EF - 2), mientras que el LF nativo es altamente específico para los macrófagos (Leppla, S. H., Handb. Nat. Toxins, 8: 543 - 572 (1995)). Por esta razón, FP59 es un ejemplote un potente agente terapéutico cuando se distribuye específicamente a las células diana con un PA específico de diana.

La estructura cristalina de PA en 2.1 se resolvió mediante difracción de rayos X (PDB acceso 1ACC) (Petosa, C., et al., Nature, 385: 833 - 838 (1997)). PA es una molécula plana, de cola que tiene cuatro dominios distintos que se pueden asociar a las funciones previamente definidas mediante análisis bioquímico. El dominio 1 (aa 1 - 258) contiene dos iones de calcio unidos estrechamente, y un gran bucle flexible (aa 162 - 175) que incluye la secuencia RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1), que se escinde por la furina durante la activación proteolítica. El dominio 2 (aa 259 - 487) contiene varias hebras \beta muy largas y forma el núcleo del canal insertado en las membranas. También tiene un gran bucle flexible (aa 303 - 319) implicado en la inserción en las membrana. El dominio 3 (aa 488 - 595) no tiene función conocida. El dominio 4 (aa 596 - 735) está débilmente asociado a los otros dominios y está implicado en la unión a receptores. Para la escisión en RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1), requerida absolutamente para las etapas posteriores en acción de las toxinas, debe ser de gran interés diseñar por ingeniería genética las secuencias de escisión de algunas proteasas asociadas a enfermedades, tales como metaloproteinasas de matriz (MMP) y proteasas del sistema de activación de plasminógeno (por ejemplo, t - PA, u - PA, etc., véase, por ejemplo, Romer et al., APMIS 107: 120 - 127 (1999)), que típicamente se sobreexpresan en tumores.

Las MMP y activadores de plasminógenos son familias de enzimas que juegan un papel conductor tanto en el rendimiento normal como en la destrucción patológica de la matriz extracelular, incluyendo remodelación de tejidos (Birkedal - Hansen, H., Curr Opin Cell Biol, 7: 728 - 735 (1995); Alexander, C. M., et al., Development, 122:

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1736 (1996)), angiogénesis (Schnaper, H. W., et al., J Cell Physiol, 156: 235 - 246 (1993); Brooks, P. C., et al., Cell, 92: 391 - 400 (1998)), invasión tumoral y formación de metástasis. Los miembros de la familia de MMP son multidominios, que contienen cinc, endopeptidasas neutras e incluyen las colagenasas, estromelisinas, gelatinasas, y metaloproteinasas de tipo membrana (Birkedal - Hansen, H., Curr Opin Cell Biol., 7: 728 - 735 (1995)). Se ha documentado bien en los años recientes que las MMP y las proteínas del sistema de activación de palsminógenos, por ejemplo, receptores de activadores de plasminógenos y activadores de plasminógenos, se sobreexpresan en una diversidad de tejidos tumorales y líneas de células tumorales y están altamente correlacionadas con la invasión tumoral y metástasis (Craw ford, H.C., et al., Invasion Metastasis, 14: 234 - 245(1995); Garbisa, S., et al., Cancer Res., 47: 1523 - 1528(1787); Himelstein, B.P., et al., Invest. Methods, 14: 246 - 258(1995); Juarez, J., et al., Int. J. Cancer, 55: 10 - 18 (1993); Kohhn, E.C., et al., Cancer Res. 55: 1856 - 1862 (1995); Levy, A.T., et al., Cancer Res., 51;439 - 444 (1991); Mignatti, P., et al., Physiol. Rev., 73: 161 - 195 (1993); Montgomery, A.M., et al., Cancer Res., 53: 693 - 700 (1993); Stetler - Stevenson, W.G., et al., Annu Rev Cell Biol, 9: 514 - 573 (1993); Stetler - Stevenson, W.G., Invest. Methods, 14: 4664 - 4671 (1995); Davidson, B., et al., Gynecol. Oncol., 73: 372 - 382 (1999); Webber, M.M., et al., Carcinogenesis, 20: 1185 - 1192 (1999); Johansson, N., et al., Am J Pathol, 154: 469 - 480 (1999); Ries, C., et al., Clin Cancer Res., 5: 1115 - 1124 (1999); Zeng, Z.S., et al., Carcinogenesis, 20: 749 - 755 (1999); Gokaslan, Z.L. et al., Clin Exp Metastasis, 16: 721 - 728 (1998); Forsyth, P.A., et al., Br J Cancer, 79: 1828 - 1835 (1999); Ozdemir, E., et al., J Urol, 161: 1359 - 1363 (1999); Nomura, H., et al., Cancer. Res., 55: 3263 - 3266 (1995); Okada, Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92: 2730 - 2734 (1995); Sato, H., et al., Nature, 370: 61 - 65 (1995); Chen, W.T., et al., Ann N Y Acad Sci, 878: 361 - 371 (1999); Sato, T., et al., Br J Cancer, 80: 1137 - 43 (1999); Polette, M., et al., Int J Biochem cell Biol., 30: 1195 - 1202 (1998); Kitagawa, Y., et al., J Urol., 160: 1540 - 1545; Nakada, M., et al., Am J Pathol., 154: 417 - 428 (1999); Sato, H., et al., Thromb Haemost, 78: 497 - 500 (1997)).

Entre las MMP, se reseña que la MMP - 2 (gelatinasa A), la MMP - 9 (gelatinasa B) y la MMP de tipo 1 de membrana (MT1 - MMP) son las más relacionadas con la invasión y metástasis en diversos cánceres humanos (Crawford, H. C., et al., Invasion Metastasis, 14: 234 - 245 (1995); Garbisa, S., et al., Cancer Res., 47: 1523 - 1528 (1987); Himelstein, B.P., et al., Invest. Methods, 14: 246 - 258 (1995); Juarez, J., et al., Int J. Cancer, 55: 10 - 18 (1993); Kohn, E.C., et al., Cancer Res., 55: 1856 - 1862 (1995); Levy, A.T., et al., Cancer Res., 51: 439 - 444 (1991); Mignatti, P., et al., Physiol. Rev., 73: 161 - 195 (1993); Montgomery, A.M., et al., Cancer Res., 53: 693 - 700 (1993); Stetler - Stevenson, W.G., et al., Annu Rev Cell Biol, 9: 541 - 573 (1993); Stetler - Stevenson, W.G., Invest Methods, 14: 4664 - 4671 (1995); Davindson, B., et al., Gynecol. Oncol., 73: 372 - 382 (1999); Webber, M.M., et al., Carcinogenesis, 20:

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1192 (1999); Johansson, N., et al., Am J Pathol, 154: 469 - 480 (1999); Ries, C., et al., Clin Cancer Rex., 5: 1115 - 1124 (1999); Zeng, Z.S., et al., Carcinogenesis, 20: 749 - 755 (1999); Gokaslan, Z.L., et al Clin Exp Metastasis, 16: 721 - 728 (1998); Forsyth, P.A., et al., Br J Cancer, 79: 1828 - 1835 (1999); Ozdemir, E., et al., J Urol, 161:
1359 - 1363 (1999), Nomura, H., et al., Cancer. Res., 55: 3263 - 3266 (1995); Okada, Y., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA., 92: 2730 - 2734 (1995); Sato, H., et al., Nature, 370: 60 - 65 (1994); Chen, W.T., et at., Ann N Y Acad Sci, 878: 361 - 371 (1999); Sato, T., et al., Br J Cancer, 80: 1137 - 43 (1999); Polette, M., et al., Int J Biochem cell Biol., 30: 1195 - 1212 (1998); Kitawa, Y., et al., J Urol., 160: 1540 - 1545; Nakada, M., et al., Am J Pathol., 154: 417 - 428 (1999); Sato, H., et al., Thromb Haemost, 78: 497 - 500 (1997)). El papel importante de las MMP durante la invasión tumoral y metástasis es descomponer la matriz extracelular de tejidos y la disolución de membranas basales endoteliales, permitiendo que las células tumorales invadan de un lado a otro el estroma y paredes de los vasos sanguíneos en los sitios primarios y secundarios. Las MMP también participan en al neoangiogénesis tumoral y regulan hacia arriba selectivamente la proliferación de las células endoteliales en los tejidos tumorales (Schnaper, H. W., et al., J Cell Physiol, 156: 235 - 246 (1993); Brooks, P. C., et al., Cell 92: 391 - 400 (1998); Chambers, A. F., et al., J Nat Cancer Inst, 89: 1260 - 1270 (1997)). Además, estas proteasas pueden contribuir al crecimiento sostenido de focos tumorales establecidos mediante la escisión del ectodominio de las proformas unidas a membranas de los factores de crecimiento, péptidos de liberación que son mitógenos para las células tumorales y/o células endoteliales vasculares (Arribas, J., et al., J Biol Chem, 271: 11376 - 11382 (1996); Suzuki, M., et al., J Biol Chem, 273: 31730 - 31737 (1997)).

Sin embargo, las manifestaciones catalíticas de las MMP y los activadores de plasminógenos están regulados en gran medida. Por ejemplo, las MMP se expresan como formas de zimógenos activas y requieren la activación antes de que puedan ejercer sus actividades proteolíticas. La activación de los zimógenos de las MMP implica la proteolisis secuencial del propéptido N - terminal que bloquea la hendidura del sitio activo, mediada por mecanismos proteolíticos, a menudo conduciendo a un proceso autoproteolítico (Springman, E. B., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 87:

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368 (1990); Murphy, G., et al., APMIS, 107: 38 - 44 (1999)). Segundo, una familia de proteínas, los inhibidores de tejidos de las metaloproteinasas (TIMP), se extienden de manera correspondiente en distribución y función de tejidos como inhibidores de las MMP altamente eficaces (Ki aproximadamente 10^{ - 10} M) (Birkedal - Hansen, H., et al., Crit Rev Oral Biol Med, 4: 197 - 250 (1993)). Aunque las actividades de las MMP están estrechamente controladas, las células invasoras de tejidos que utilizan la capacidad degenerativa de las MMP evaden de alguna manera estos controles reguladores negativos, pero los mecanismos no se entienden bien.

Las contribuciones de las MMP en el desarrollo tumoral y proceso metastático conducen al desarrollo de terapias que usan inhibidores de síntesis de las MMP (Brown, P. D., Adv Enzyme Regul, 35: 293 - 301 (1995);

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Praga S., et al J Clin Oncol, 16: 2150 - 2156 (1998); Drummond, A. H., et al., Ann N Y Acad Sci, 30: 228 - 235 (1999)). Entre una multitud de inhibidores de síntesis generados, Marimastat se emplea ya clínicamente en tratamiento de cáncer (Drummond, A. H., et al., Ann N Y Acad Sci, 30: 228 - 235 (1999)).

En este documento, como alternativa al uso de los inhibidores de las MMP, los inventores han explorado una estrategia novedosa usando PA modificados que se podrían solamente activar mediante las MMP o activadores de plasminógenos para destruir especialmente las células tumorales que expresan activadores de las MMP o plasminógenos. Los mutantes de PA se construyen para que el sitio de reconocimiento de la furina se reemplace por secuencias susceptibles a escisión mediante las MMP o y activadores de plasminógenos. Cuando se combinan con LF o una proteína de fusión LF que comprende el sitio de unión a PA, estos mutantes de PA se escinden específicamente mediante células cancerosas, que exponen el sitio de unión a LF y trastocan el LF o la proteína de fusión LF en la célula, por lo tanto distribuyendo específicamente un compuesto, por ejemplo, un agente terapéutico o de diagnóstico, a la célula.

Sumario de la invención

Las metaloproteinasas de matriz ("MMP") y las proteínas del sistema de activación de plasminógeno (por ejemplo, t - PAR, u - PAR, u - PA, t - PA) se sobreexpersan en una diversidad de tejidos tumorales y líneas celulares de tumores y están altamente correlacionadas con invasión y metástasis tumoral. Además, estas proteínas se sobreexpresan en otras células tales como células inflamatorias. En este documento los inventores construyeron mutantes de antígeno protector (PA) de toxina de ántrax, en los que el sitio de furina se reemplaza por secuencias específicamente escindidas por activadores de plasminógenos. Los mutantes de PA dirigidos por activadores de plasminógenos se activan solamente mediante células tumorales que expresan activadores de plasminógenos, de manera que específicamente distribuyen una toxina, un agente de diagnóstico o terapéutico. La activación se produce principalmente sobre la superficie celular, que da como resultado la traslocación y distribución de los compuestos. Los compuestos pueden ser agentes de diagnóstico o terapéuticos. Preferiblemente los compuestos se distribuyen a las células de un sujeto humano que padece cáncer, por lo tanto destruyendo las células cancerosas y tratando el cáncer.

En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de dirección de un compuesto a una célula sobreexpresa un activador de plasminógeno, el procedimiento comprendiendo las etapas de: (i) administrar a la célula una proteína de PA mutante que comprende un sitio de escisión reconocidos por el activador de plasminógeno en lugar del sitio de escisión reconocido por furina de PA nativa, en el que la PA mutante se escinde por un activador de plasminógeno; y (ii) administrar a la célula un compuesto que comprende un polipéptido de LF que comprende un sitio de unión a PA; en el que el polipéptido de LF se une a PA escindida y se trasloca en la célula, por lo tanto distribuyendo los compuestos a la célula.

En una realización, al célula sobreexpresa una metaloproteínasa de matriz. En otra realización, la metaloproteínasa de matriz se selecciona entre el grupo constituido por MMP - 2 (gelatinasa A), MMP - 9 (gelatinasa B) y MMP de tipo 1 de membrana (MT1 - MMP). En otra realización, el sitio de escisión reconocido por la metaloproteinasa de matriz se selecciona entre el grupo constituido por GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (EC ID Nº: 3).

En una realización, la célula sobreexpresa un activador de plasminógeno o receptor de activador de plasminógeno. En otra realización, el activador de plasminógeno se selecciona entre el grupo constituido por t - PA (activador de plasminógeno de tipo de tejido) y u - PA (activador de plasminógeno de tipo uroquinasa). En otra realización, el sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno se selecciona entre el grupo constituido por PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4), PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), y PQRGRSA (SEC ID Nº: 7).

En una realización, la célula es una célula cancerosa. En otra realización, el cáncer se selecciona entre el grupo constituido por cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pleura, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de cuello de útero, cáncer de colon, fibrosarcoma, neuroblastoma, glioma, melanoma, leucemia monocítica, y leucemia mieloide. En otra realización, la célula es una célula inflamatoria. En otra realización, la célula es una célula humana.

En una realización, el polipéptido de factor letal es factor letal nativo. En otra realización, el compuesto es factor nativo letal.

En una realización, el polipéptido de factor letal se une a un compuesto heterólogo. En otra realización, el compuesto es un agente de diagnóstico o terapéutico. En otra realización, el compuesto es toxina disentérica, la cadena A de toxina de difteria, o la exotoxina A de Pseudomonas. En otra realización, el compuesto es un resto a ácido nucleico detectable.

En una realización el compuesto está de manera covalente al factor letal mediante un enlace químico. En otra realización, el compuesto heterólogo se une de manera recombinante al factor letal.

En una realización, la proteína de PA mutante es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión al receptor heterólogo. En otra realización, el dominio de unión al receptor heterólogo se selecciona entre el grupo constituido por un anticuerpo de cadena individual y un factor de crecimiento.

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de antígeno protector mutante aislado que comprende una metaloproteinasa de matriz o un sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno en lugar del sitio de escisión reconocido por la furina de antígeno protector nativo, en el que el antígeno protector mutante se escinde por una metaloproteinasa de matriz o un activador de plasminógeno.

En una realización, la metaloproteinasa de matriz o sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno se selecciona entre el grupo constituido por PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4), PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), PQRGRSA (SEC ID Nº: 7), GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3).

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. Generación de mutantes de PA se pueden procesar específicamente mediante las MMP. (A). Representación esquemática de mutantes de PA de sustrato de las MMP. El sitio de escisión por furina RKKR (SEC ID Nº: 1) se reemplazó con secuencias de sustratos favoritos de gelatinasa GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) en PA L1 y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3) en PAL2. Las flechas muestran los sitios de escisión por la furina o las MMP como se indica. (B). Escisión de PA - L1 mediante las MMP - 2, MMP - 9 y la furina de forma soluble. Como se describe en materiales y procedimientos, PA - L1 se incubó con las MMP - 2, MMP - 9 y furina, respectivamente, se retiraron alícuotas en los instantes indicados, y las muestras se analizaron mediante transferencia de western con el anticuerpo policlonal de conejo frente a PA. (C). Escisión de PA - L2 mediante las MMP - 2, MMP - 9 y la furina de forma soluble. PA - L2 se trató como en B. (D). Escisión de WT - PA mediante las MMP - 2, MMP - 9 y la furina de forma soluble. WT - PA se trató como en B.

Fig. 2. Análisis zimográfico de las gelatinasas asociadas al medio reacondicionado libre de suero (A) o extractos de Triton X - 100 (B) de células Vero, células HT 1080 y células A2058. 1 mg de proteína de extracto celular, o volúmenes de medio reacondicionado (3 - 4 ml) normalizado a la concentración de proteína de los extractos celulares correspondientes se analizaron mediante zimografía en gelatina como se describe en materiales y procedimien-
tos.

Fig. 3. Citotoxcidad de PA - L1 y PA - L2 (A) o forma cortada de ellas (B) para las células Vero que no expresa las MMP. Como se describe en materiales y procedimientos, las células Vero se cultivaron en placas de 96 pocillos hasta 80 - 100% de confluencia se lavaron y se reemplazaron con medio DMEM exento de suero. Después concentraciones diferentes (entre 0 y 1000 ng/ml) de WT - PA, PA - L1 y PA - L2, o PP - L1 y PA - L2 cortadas por MMP - 2 combinadas con FP59 (constante a 50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células. Las toxinas se dejaron en el medio durante 48 horas, o se retiraron y se reemplazaron con DMEM reciente que contiene suero después de 6 horas. Se añadió MTT para determinar la viabilidad celular a las 48 horas. PA - L1 y PA - L2 cortadas se prepararon mediante la escisión de PA - L1 y PA - L2 por la MMP - 2 activa a 37ºC durante 3 horas como se describe en materiales y proce-
dimientos.

Fig. 4. Citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 para las células HT1080 (A) tumorales que expresan MMP, células A2058 (B) y células MDA - MB 231. Como se describe en materiales y procedimientos, las células HT1080 y A2058 se cultivaron hasta 80 - 100% de confluencia, se lavaron y se reemplazaron con medio DMEM exento de suero. Después concentraciones diferentes (entre 0 y 1000 ng/ml) de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 combinadas con FP59 (constante a 50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células y se incubaron durante 6 horas y 48 horas. Se añadió MTT para determinar la viabilidad celular a las 48 horas.

Fig. 5. Efecto de inhibidores de MMP sobre la citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 para las células HT 1080. Las células HT 1080 se cultivaron hasta 80% de confluencia en placas de 96 pocillos, y se lavaron dos veces con DMEM exento de suero. Después los inhibidores de MMP GM6001, BB94 y BB2516 se añadieron a las células a una concentración final de 10 \muM en DMEM exento de suero. Después de 300 minutos la preincubación con los inhibidores de MMP, WT - PA, PA - L1 y PA - L2 (300 ng/ml) se combinaron con FP59 (50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células y se incubaron durante 6 horas. Después de eso, el medio que contenía las toxinas e inhibidores de MMP se retiraron, y se añadió medio que contiene suero reciente y la incubación continuó hasta 48 horas. Se añadió MTT para determinar la viabilidad celular como se describe en materiales y procedimientos.

Fig. 6. PA - L1 y PA - L2 destruían selectivamente las células tumorales que expresan las MMP en un modelo de co - cultivo. Como se describe en materiales y procedimientos, las células Vero, HT 1080, MDA - MB - 231 y A2058 se cultivaron en las cámaras separadas de portaobjetos de 8 cámaras hasta 80 a 100% de confluencia. Después los portaobjetos con particiones retirados se pusieron en placas petri de 100 mm con medio exento de suero, de manera que las células diferentes estaban en el mismo ambiente de cultivo. WT - PA, PA - L1 o PA - L2 (300 ng/ml) cada una se combinó con FP59 (50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células, y se incubaron hasta 48 horas. Se añadió MMT para determinar la viabilidad celular. Inserción, después 48 horas después de que la MMT de exposición a la toxina se añadiera a las células, las células vivas convertían MTT en tinte azul, que precipitaba en el citosol, mientras las células muertas permanecían sin colorearse.

Fig 7. Unión y activación de procesamiento de PA, PA - L1 y PA - L2 sobre al superficie de células Vero (A) y HT 1080 (B). Como se describe en materiales y procedimientos, las células Vero y HT 1080 se cultivaron en placas de 24 pocillos hasta 80 - 100% de confluencia, se lavaron y se cambiaron a medio exento de suero. Después PA,

\hbox{PA -}

L1 y
PA - L2 se añadieron a las células con una concentración final de 100 ng/ml, se incubaron durante tiempos diferentes (0, 10 minutos, 40 minutos, 120 minutos y 360 minutos). Los lisados celulares se prepararon para análisis de transferencia de western usando anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5308) para comprobar el estatus de procesamiento de PA y mutantes de PA.

Fig. 8. El papel de MT1 - MMP transfectadas en la citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 a células COS - 7. La citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 a células COS - 7. Como se describe en materiales y procedimientos, las células COS - 7 se cultivaron hasta 80 - 100% de confluencia, se lavaron y se reemplazaron con medio DMEM exento de suero. Después concentraciones diferentes (entre 0 y 1000 ng/ml) de WT - PA, PA - L1, PA - L2 combinadas con FP59 (constante a 50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células y se incubaron durante 6 horas y 48 horas. MTT se añadió para determinar la viabilidad celular a las 48 horas. Inserción: análisis zimográfico de extracto celulares y sobrenadantes de cultivo de COS - 7 como se describe en materiales y procedimientos, usando sobrenadante de HT 1080 como control. B. Citotoxicidad de PA - L1 y PA - L2 a CosgMT1. Las células CosgMT1 se trataron de la misma manera que en A. Inserción: Comparación de la expresión de MT1 - MMP de COS - 7 y células CosgMT1 mediante transferencia de western usando un anticuerpo anti - MT1 - MMP de conejo (AB815, CHEMICON Internacional, Inc.).

Fig. 9. Generación de proteínas de PA mutadas que se pueden escindir específicamente mediante uPA o tPA. Escisión de PA y proteínas de PA mutadas mediante la forma soluble de purina (en el panel a), uPA (en el panel b) o tPA (en el panel c). Las proteínas se incubaron con furina, uPA o tPA, durante los tiempos indicados y las muestras se analizaron mediante SDS - PAGE y tinción de Commassie en el panel a, o se diluyeron y se analizaron mediante transferencia de western con anticuerpo policlonal de conejo frente a PA en el panel b y c.

Fig. 10. Unión y procesamiento de pro - uPA mediante diferentes líneas celulares. Células Vero, células Hela, células A2058, y células Bowes se cultivaron en placas de 24 pocillos hasta confluencia, se lavaron y se incubaron en medio exento de suero con 1 \mug/ml de pro - uPA y \mug/ml de glu - plasminógeno durante 1 hora, después los lisados celulares se prepararon para análisis de transferencia de western con anticuerpo monoclonal frente a la cadena B de uPA (nº 394).

Fig. 11. Citotoxicidad de proteínas de PA mutadas para uPAR que expresa células tumorales, células Hela (en el panel a), células A2058 (en el panel b), y células Bowes (en el panel c) se cultivaron hasta 50% de confluencia, se lavaron y se reemplazaron con DMEM exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno. Después diferentes concentraciones (entre 0 y 1000 ng/ml) de PA, pA - U1, PA - U2, PA - U3, PA - U4, y PA - U7 junto con FP59 (constante a 50 ng/ml) se incubaron con las células durante 6 horas. Después las toxinas se retiraron y se reemplazaron con DMEM reciente que contenía suero. Se añadió MTT para determinar la viabilidad celular a las 48 horas.

Fig. 12. Citotoxicidad de proteínas de PA mutadas para células Vero que no expresan uPAR. a. Las células Vero se cultivaron en placas de 96 pocillos hasta 50% de confluencia, se lavaron y se reemplazaron con DMEM exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno. Después las células se trataron con toxinas como se ha indicado anteriormente. Las células Vero se trataron como en el panel a, excepto que PA - U2 cortada se usó para el ensayo de citotoxicidad. PA - U2 cortada se preparó mediante escisión de PA - U2 con uPA a 37ºC durante 1 hora como se ha descrito en materiales y procedimientos.

Fig. 13. Unión y activación proteolítica de PA y PA - U2 sobre la superficie de las células Vero (en el panel a) y células Hela (en el panel b). Las células Vero y Hela se cultivaron en placas de 24 pocillos hasta confluencia, se lavaron y se cambiaron a medio exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de plasminógeno con o sin PAI - 1 (2 \mug/ml). Después se añadieron PA y PA - U2 a las células con una concentración final de 1000 ng/ml, se incubaron durante 30 minutos o 120 minutos. Los lisados celulares se prepararon para análisis de transferencia de Western usando anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5038) para comprobar el estatus de procesamiento de PA y PA - U2 y el efecto de PAI - 1 sobre él.

Fig. 14. Efectos de PAI - 1sobre la citotoxicidad de PA - U2 a células tumorales (en el panel a), células A2058 (en el panel b), y células Bowes (en el panel c) se cultivaron hasta 50% de confluencia en placas de 96 pocillos, se lavaron y se incubaron con DMEM exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno con o sin 2 \mug/ml de PAI - 1, durante 30 minutos Después se añadieron a las células diferentes concentraciones de PA y PA - U2 (entre 0 y 1000 ng/ml) combinadas con FP59 (50 ng/ml) y se incubaron durante 6 horas. Después de eso, se retiraron las toxinas y se reemplazaron con DEM que contenía suero reciente. Se añadió MMT para determinar la viabilidad a las 48 horas.

Fig. 15. Efectos de bloqueo de uPAR sobre la citotoxicidad de PA - U2 a las células tumorales. Efectos de ATE sobre la citotoxicidad de PA - U2 a células Hela, A2058, y Bowes. b. Efectos del anticuerpo R3 que bloquea uPAR sobre la citotoxicidad de PA - U2 a las células Hela, A2058 y Bowes. Las células se cultivaron hasta 50% de confluencia, se lavaron y se incubaron con DMEM exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno, y diferentes concentraciones de anticuerpo R3 que bloquea ATF o uPAR. Después PA y PA - U2 (300 ng/ml) cada una) combinadas con FP59 (50 ng/ml) se añadieron a las células y se incubaron durante 6 horas. Después de eso, las toxinas se retiraron y se reemplazaron con DMEM que contenía suero reciente. Se añadió MTT para determinar la viabilidad celular a las 48 horas.

Fig. 16. PA - U2 destruyó selectivamente células Hela que expresan uP AR en un modelo de co - cultivo. Las células Vero y Hela se cultivaron en las cámaras separadas de portaobjetos de 8 cámaras hasta confluencia. Después los portaobjetos con particiones retirados se pusieron en placas petri de 100 con medio exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro - uPa y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno, de manera que las células diferentes estaban en el mismo ambiente de cultivo. PA y PA - U2 (1000 ng/ml) cada una combinadas con FP59 (50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células, y se incubaron hasta 48 horas. Se añadió MTT para determinar la viabilidad células. Inserción, PA - U2 se activó selectiva y proteolíticamente sobre células Hela en un modelo de co - cultivo. Las células se trataron de la misma manera que en A, excepto que después de 2 horas de incubación con toxinas las células se lavaron y se lisaron, y el estatus de procesamiento de las proteínas de PA se detectaron mediante anticuerpo anti.- PA como en la figura 14.

Fig. 17. Citotoxicidad de PA - U2, PA - U3, y PA - U4 sobre las células que expresan tPA. Las células Bowes (a) y células HUVEC (b) se cultivaron hasta 50% de confluencia, se lavaron y se reemplazaron con DMEM exento de suero sin pro - uPA y glu - plasminógeno. Después las células se trataron con diferentes concentraciones (entre 0 y 1000 ng/ml) de PA, PA - U2, PA - U3, y PA - U4 junto con FP59 (constante a 50 ng/ml) durante 12 horas. Se añadió MTT para determinar la viabilidad celular a las 48 horas.

Descripción detallada I. Introducción

La degradación proteolítica de la matriz extracelular juega un papel crucial tanto en la invasión de cáncer como en la remodelación del tejido no neoplásico, y en ambos casos se lleva acabo mediante un número de proteasas. Las mejor conocidas son el sistema de activación de plasminógeno que conduce a la formación de la serina proteasa plasmina, y un número de metaloproteinasa de matriz, incluyendo colagenasas, gelatinasas y estromelisinas (Dano, K., el al., APMIS, 107: 120 - 127 (1999)). La estrecha asociación entre MMP y la sobreexpersión de activadores de plasminógenos y metástasis tumoral se han observado durante una década. Por ejemplo, las contribuciones de las MMP en el desarrollo tumoral y proceso de metástasis conducen al desarrollo de las terapias novedosas que usan inhibidores de síntesis de las MMP (Brown, P. D., Adv Enzyme Regul, 35: 293 - 301 (1995); Wojtowicz - Praga S., et al J Clin Oncol, 16: 2150 - 2156 (1998); Drummond, A. H., et al., Ann N Y Acad Sci, 30: 228 - 235 (1999)). Sin embargo, estos inhibidores solamente reducen el crecimiento y no erradican los tumores. El presente estudio es el primer esfuerzo para usar toxinas bacterianas modificadas para dirigir las MMP y activadores de plasminógeno, que se expresan en gran medida y se emplean por las células tumorales para invasión. Las moléculas de PA mutantes en las que el sitio de escisión por furina se reemplaza por una MMP o sitio diana del activador de palsminógeno se puede usar para distribuir compuestos tales como toxinas a la célula, por lo tanto destruyendo la célula. Los compuestos tienen la capacidad de unirse a PA mediante su interacción con LF y se traslocan mediante PA en la célula. Los compuestos que comprenden PA y LF se administran a las células o sujetos, preferiblemente mamíferos, más preferiblemente seres humanos, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Opcionalmente, los compuestos que comprenden PA y LF se administran con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos típicamente son bien LF nativo o proteína de fusión de LF, es decir, aquellos que tiene un sitio de unión a PA (aproximadamente los primeros 250 aminoácidos de LF, Arora et al., J. Biol. Chem. 268: 3334 - 3341 (1993)) condensado a otro polipéptido o compuesto de manera que la proteína o proteína de fusión se une a PA y se trasloca en la célula, produciendo la muerte celular (por ejemplo, toxina FP59 recombinante, fusión 1 - 254 del residuo de factor letal de la toxina de ántrax al dominio de ribosilación de ADP de la endotoxina A de Pseudomonas). La fusión es típicamente química o recombinante. Los compuestos condensados a LF incluyen, por ejemplo, un agente terapéutico o de diagnóstico, por ejemplo, LF nativo, una toxina, una toxina bacteriana, toxina de disentérica, cadena A de toxina diftérica, endotoxina A de Pseudomonas, una proteasa, un factor de crecimiento, una enzima, un resto detectable, un compuesto químico, un ácido nucleico, o un polipéptido de fusión, etc.

Las moléculas de PA mutantes de la invención se pueden adicionalmente dirigir a una célula específica produciendo proteínas de fusión de PA mutantes. En estas proteínas de fusión mutantes, el dominio de unión al receptor de PA se reemplaza por una proteína tal como un factor de crecimiento u otro ligando de receptor de células expresado específicamente sobre las células de interés. Además, el dominio de unión al receptor de PA se puede reemplazar por un anticuerpo que se une a un antígeno expresado específicamente sobre las células de interés.

Estas proteínas proporcionan una forma de destruir específicamente células tumorales que contienen grandes cantidades de activadores de MMP o plasminógenos asociados a la superficie celular. Estas PA mutantes son por lo tanto útiles como agentes terapéuticos para destruir específicamente células tumorales.

Los inventores construyeron dos mutantes de PA, PA - L1 y PA - L2, en los que el sitio de reconocimiento por furina se reemplaza por las secuencias susceptibles a escisión por las MMP, especialmente MMP - 2 y MMP - 9. Cuando se combinan con FP59, estas dos proteínas de PA mutantes destruían específicamente células tumorales que expresan MMP, tales como HT1080 de fibrosarcoma humano y A2058 de melanoma humano pero no destruían las células que no expresan MMP. El ensayo de citotoxicidad en el modelo de co - cultivo, en el que las células estaban en el mismo ambiente de cultivo y eran igual de accesibles para las toxinas en el sobrenadante, mostraron que PA - L1 y PA - L2 destruían específicamente solamente las células tumorales HT 1080 y A2058 que expresan MMP, no las células Vero. Este resultado demostró que el procesamiento de activación de PA - L1 y PA - L2 se producía principalmente sobre las superficies celulares y contribuían en su mayoría con las MMP asociadas a membranas, así la citotoxicidad se restringe a las células tumorales que expresan las MMP. Las TIMP están ampliamente presentes en medio extracelular e inhiben la actividad de las MMP en los sobrenadantes. Las proteínas PA se unen a las células muy rápidamente con un máximo de unión que sucedía dentro de 60 minutos. En contraste a las MMP secretadas, las MMP asociadas a membranas expresan sus actividades proteolíticas más eficazmente anclándose sobre la membrana celular y gozando de dos propiedades ventajosas distintas, que se localizan en gran medida sobre los sustratos de matriz extracelular y son más resistentes a los inhibidores de las proteinasas en el medio extracelular.

Recientemente se ha mostrado que concentraciones de plasmina pueden activar tanto la MMP - 2 como la

\hbox{MMP
-}

9 sobre la superficie de la célula de HT1080 mediante un mecanismo independiente de MMP o actividades de proteinasas ácidas (Mazzieri, R., et al., EMBO J., 16: 2319 - 2332 (1997)). En contraste, en la plasmina en fase soluble degrada tanto la MMP - 2 como la MMP - 9 (Mazzieri, R., et al., EMBO J., 16: 2319 - 2332 (1997)). Así pues, la plasmina puede proporcionar un mecanismo que mantiene las actividades de la gelatinasa sobre la superficie celular que promueve la invasión celular. Se ha establecido bien que la MMT - 1 MMP funciona tanto como activador como receptor de la MMP - 2, pero no tiene efecto sobre la MMP - 9 (véase revisión de Polette, M., et al., J Biochem cel Biol., 30:

\hbox{1195 -}

1202 (1998); Sato H., et al., Thromb Haemost, 78: 497 - 500 (1997)). Un complejo MMP - 2/TIMP - 2 se une a MT1 - MMP sobre la superficie celular, que sirve como sitio de alta afinidad, después se activa proteolíticamente mediante una MT1 - MMP adyacente, que sirve como activador. Trabajos recientes han mostrado que los receptores de adhesión, tales como la integrina \alphav\beta3 (Brooks, P. C. et al., Cell, 85: 683 - 693 (1996)) y el receptor CD44 de hialuronano de superficie celular (Tu, Q., et al., Gene Development, 13: 35 - 48 (1999)), puede proporcionar medios para retener las MMP - 2 o MMP - 9 activas solubles que invaden la superficie de células tumorales, donde sus actividades proteolíticas promueven lo más probable la invasión celular. Para las actividades de las MMP implicadas en invasión tumoral y metástasis se localizan y/o modulan sobre la superficie celular en la fase soluble, esto hace que las MMP sean una diana ideal para tejidos tumorales.

Originalmente se pensó que el papel de las MMP y activadores de plasminógenos simplemente descomponían las barreras titulares para promoverla invasión tumoral y metástasis. Ahora se entiende, por ejemplo, que las MMP también participan en neoangiogéensis de tumores y se regulan hacia abajo selectivamente para la proliferación de células endoteliales. Por lo tanto, éstos toxinas bacterianas modificadas pueden tener las propiedades ventajosas de dirigirse a no solamente a las propias células tumorales sino también las células endoteliales vasculares divisoras que son esenciales para la neoangiogénesis en tejido tumorales. Por lo tanto, las toxinas dirigidas a las MMP también pueden destruir células tumorales mediante la privación a las células de nutrientes celulares y oxígeno.

Las moléculas de PA mutantes de la invención se pueden dirigir también específicamente a las células usando proteínas de fusión de PA mutantes. En estas proteínas de fusión, el dominio de unión a receptores de PA se reemplaza con un ligando heterólogo o molécula tal como un anticuerpo que reconoce una proteína de la superficie celular específica. La proteína de PA tiene cuatro dominios estructuralmente distintos para realizar las funciones de unión al receptor y traslocación de los restos catalíticos a través de las membranas endosomales (Petosa, C., et al., Nature, 385: 833 - 838 (1997)). El dominio 4 es el dominio de unión al receptor y tiene contactos limitados con otros dominios (Petosa, C., et al., Nature, 385: 833 - 838 (1997)). Por lo tanto, PA se puede dirigir específicamente a receptores o antígenos expresados específicamente por tumores reemplazando el dominio 4 con las moléculas determinantes de diana, tales como anticuerpos de cadena sencilla o unas citoquinas usadas por otras inmunotoxinas (Thrush, G. R., et al., Annu Rev Immunol, 14: 49 - 71 (1996)). Por ejemplo, PA - L1 y PA - L2 se dirigen a receptores alternativos, tales como el receptor GM - CSF, que se expresa en gran medida en células de leucemia y tumores sólidos incluyendo carcinomas renales, de pulmón, de mama y gastrointestinal (Thrush, G. R., et al., Annu Rev Immunol, 14: 49 - 71 (1996)); 74 - 79). Se debe esperar en gran medida que la combinación de estos dos mecanismos de dirección independiente debe permitir que los tumores sean dirigidos mas eficazmente, y los efectos secundarios tales como hepatoxicidad y síndrome de escape vascular se deben reducir significativamente.

Con respecto al sistema de activación de plasminógeno, se conocen dos activadores de plasminógeno, el activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) y el activador de plasminógeno de tipo tejido (tPA), de los cuales uPA es el implicado principalmente en la degradación de matriz intracelular (Dano, K., et al., APMIS, 107: 120 - 127 (1999)). uPA es una serina proteasa de 52 kDa que se secreta como una proenzima de cadena sencilla inactiva (pro - uPA) (Nielsen, L. S., et al., Biochemistry, 21: 6410 - 6415 (1982); Petersen. L. C., et al., J. Biol. Chem., 263: 11189 - 11195 (1988)). El dominio de unión de pro - uPAes el fragmento amino terminal de tipo del factor de crecimiento epidérmico (ATF; aa 1 - 135, 15 kDa) que se une con alta afinidad (Kd = 0,5 mM) al receptor de activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPAR) (Cubenllis, M. V., et al., Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A., 86: 4828 - 4832 (1989)), un receptor unido a GPI. uPA es una glicoproteína de tres dominio de 60 kDa cuyo dominio 1 N - terminal contiene el sitio de unión de alta afinidad para ATF o pro - uPA (Ploug, M., et al., J. Biol. Chem., 266: 1926 - 1933 (1991); Behrendt, N., et al., J. Biol. Chem., 266: 7842 - 7847 (1991)). uPA se sobreexpresa sobre una diversidad de tumores, incluyendo leucemias monocíticas y mieloide (Lanza, F., et al., Br. J. Haematol., 103: 110 - 123 (1998); Plesner, T., et al., Am. J. Clin. Pathol., 102: 835 - 841 (1994)), y cánceres de mama (Carriero, M. V., et al., Clin. Cancer Res., 3: 1299 - 1308 (1997)), de vejiga (Hudson, M. A., et al., J. Natl. Cancer Inst., 89: 709 - 717 (1997)), de tiroides (Ragno, P., et al., Cancer Res., 58: 1315 - 1319 (1998)), de hígado (De Petro, G., et al., Cancer Res., 58: 2234 - 2239 (1998)), de pleura (Shetty, S., et al., Arch. Biochem. Biophys., 356: 265 - 279 (1998)), de pulmón (Morita, S., et al., Int. J. Cancer, 78: 286 - 292 (1998)), de páncreas (Taniguchi, T., et al., Cancer Res., 58: 4461 4467 (1998)), y de ovarios (Sier, C. F., et al., Cancer Res., 58: 1843 - 1849 (1998)). Pro - uPA se une a uPAR mediante ATF, mientras que el procedimiento de unión no bloquea el dominio catalítico, carboxi terminal. Mediante la asociación con uPAR, pro - uPA está cerca y posteriormente activada por cantidades pequeñas de plasmina unida a la membrana plasmática mediante escisión de la cadena sencilla de pro - uPA dentro de un bucle intra - molecular mantenido cerrado mediante un puente disulfuro. Así pues, el uPA activo consiste en dos cadenas (A + B) mantenidas juntas mediante este enlace disulfuro (Ellis, V et al., J. Biol., Chem., 264: 2185 - 2188 (1989)).

El plasminógeno está presente a alta concentración (1,5 - 2,0 \muM) en plasma y fluidos intersticiales (Dano, K., et al., Adv Cancer Res., 44: 139 - 266 (1985)). La baja afinidad, alta capacidad de unión del plasminógeno a las proteínas de la superficie celular los sitios de unión a lisina de kringles de plasminógeno potencia considerablemente la velocidad de activación de plasminógeno mediante uPA (Ellis, V et al., J. Biol., Chem., 264: 2185 - 2188 (1989)); Stephens, R. W., et al., J. Cell. Biol., 108: 1987 - 1995 (1989)). La uPA activa tiene alta especificidad para Arg560 - Val561 unidos en plasminógeno, y escisión entre estos residuos da lugar a más plasmina que se denomina "activación de zimógeno recíproco" (Petersen, L. C., Eur. J. Biochem., 245: 316 - 323 (1997)). El resultado de este sistema es la generación eficaz de uPA activa y plasmina en la superficie celular. En este contexto, uPAR sirve como molde para la unión y localización de pro - uPA cerca de su plasminógeno sustrato sobre la membrana plasmática.

A diferencia de la uPA, la plasmina es una proteasa no específica, que escinde muchas glicoproteínas y proteoglicanos de la matriz extracelular, así como fibrina (Liotta, L. A. et al., Cancer Res., 41: 4629 - 4636 (1981)). Por lo tanto, la plasmina unida a la superficie celular media la proteolisis de matriz no específica que facilita la invasión y metástasis de células tumorales mediante estructuras de tejidos restringentes. Además, la plasmina puede activar algunas de las metaloproteasas de matriz que también degradan la matriz tisular (Werb, Z., et al., N. Engl. J. Med., 296: 1017 - 1023 (1977); DeClerck, Y. A., et al., Enzyme Protein, 49: 72 - 84 (1996)). La plasmina también puede activar factores de crecimiento, tales como TGF - \beta, que pueden además modular interacciones estromales en la expresión de enzimas y neo - angiogénesis de tumores (Lyons, R. M., et al., J. Cell., 106: 1659 - 1665 (1988)). La activación de plasminógeno por uPA se regula por dos inhibidores fisiológicos, el inhibidor - 1 y 2 de activador de plasminógeno (PAI - 1 y PAI - 2) (Cubellis, M. V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 86: 4828 4832 (1989); Ellis, V., et al., J. Biol. Chem., 265: 9904 - 9908 (1990); Baker, M. S., et al., Cancer Res., 50: 4676 - 7684 (1990)), mediante la formación de complejo 1:1 con uPA. La plasmina generada en el sistema de activación de plasminógeno de la superficie celular está relativamente protegida de su inhibidor fisiológico principal \alpha2-antiplasmina (Ellis, V., et al., J. Biol. Chem., 266: 12752 - 12758 (1991)).

La invasión de cáncer es esencialmente un proceso de remodelación de tejido en el que el tejido normal se sustituye con tejido canceroso. Los datos acumulados de estudios preclínicos y clínicos sugerían fuertemente que el sistema de activación de plasminógeno juega un papel central en los procesos que conducen a la invasión tumoral y metástasis (Andreasen, P. A., et al., Int. J. Cancer, 72: 1 - 22 (1997); Chapman, H. A., Curr. Opin. Cell Biol., 9: 714 - 724 (1997); Schmitt, M., et al., Thromb. Haemost., 78: 285 - 296 (1997)). Los altos niveles de uPA, uPAR y PAL - 1, pero de PAI - 2 disminuidos se asocian al pobre resultado patológico (Schmitt, M., et al., Thromb. Haemost., 78: 285 - 296 (1997)). Los estudios de hibridación in situ de los tejidos tumorales han mostrado que usualmente células cancerosas expresaban altamente uPAR, mientras las células estromales tumorales expresaban pro - uPA, que posteriormente se une a uPAR sobre al superficie de las células cancerosas donde se activa y por lo tanto genera plasmina (Pyke, C., et al., Am. J. Pathol., 138: 1059 - 1067 (1991)). La activación de pro - uPA que se restringe altamente a la superficie de la célula tumoral, puede ser una diana ideal para tratamiento de cáncer.

uPA y tPA poseen un grado extremadamente alto de similitud estructural (Lamba, D., et al., J. Mol., Biol., 258: 117 - 135 (1996); Spraggon, G., et al., Structure, 3: 681 - 691 (1995)), comparten los mismos sustratos fisiológicos primarios (plasminógenno) e inhibidores (PAI - 1 y PAI - 2) (Collen, D., et al., Blood, 78: 3114 - 3124 (1991)), y muestra especificad de sustrato restringida. Mediante el uso de los planteamiento de la exposición del fago de sustrato y exposición del fago de sustracción de sustrato, las investigaciones recientes habían identificado sustratos que discriminan entre uPA y tPA, que muestran las secuencias de sustratos de consenso con alta selectividad mediante uPA o tPA (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)). Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272:

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16609 (1997)). Para explotar las características únicas del sistema de plasminógeno de uPA y toxina de ántrax en el diseño de citotoxinas selectivas de células tumorales, en el trabajo descrito en esta memoria descriptiva, proteínas de PA de ántrax mutadas se construyeron de manera que el sitio de purina se reemplace por secuencias susceptibles a la escisión específica mediante uPA. Estas proteínas de PA dirigidas por uPAR/uPA se activaron selectivamente sobre la superficie de las células tumorales que expresan uPAR en presencia de pro - uPA, y producían internalización de una citotoxina FR59 recombinante para destruir selectivamente las células tumorales. También, una proteína de PA mutada se generó para que destruyera selectivamente las células que expresan activadores de plasminógeno de tipo tejido. II. Procedimientos de producción de construcciones de PA y LF A. Construcción de ácidos nucleicos que codifican mutantes de PA, LF, y proteínas de fusión de LF

PA incluye un dominio de unión a receptor celular, un dominio de traslocación, y un dominio de unión a LF. Los polipéptidos de PA de la invención tienen al menos un dominio de traslocación y un dominio de unión a LF. En la presente invención, PA madura (83 kDa) es una realización preferida. Además de la PA recombinante de longitud completa, las supresiones amino terminal hasta el sitio de escisión de 63 kDa o adiciones a la PA de longitud completa son útiles. Una forma recombinante de PA tratada es también biológicamente activa y se puede usar en la presente invención. También se construyen las proteínas de fusión de PA en las que el dominio de unión a los receptores se ha suprimido, para dirigir PA a tipos de células específicas. Aunque lo anteriormente mencionado y la técnica anterior describen la supresión específica y análisis de función de estructura de PA, cualquier forma biológicamente activa de PA se puede usar en la presente invención.

Los residuos amino terminal 1 - 254 de LF son suficientes para la actividad de unión a PA. Los residuos de aminoácidos 199 - 253 pueden no todos requerirse para la actividad de unión de PA. Una realización de LF es los aminoácidos 1 - 254 de LF nativo. Cualquier realización que contiene al menos aproximadamente los aminoácidos

\hbox{1 -}

254 de LF nativo se pueden usar en la presente invención, por ejemplo, LF nativo. Se prefieren las realizaciones no tóxicas de LF.

Las proteínas de fusión de PA y LF se pueden producir usando ácidos nucleicos recombinantes que codifican una proteína de fusión de cadena sencilla. La proteína de fusión se puede expresar en forma de una cadena sencilla usando sistemas biológicos in vivo o in vitro. Usando los procedimientos actuales de síntesis química, los compuestos también se pueden unir químicamente a PA o LF. La proteína de fusión se puede ensayar empíricamente para evaluar la unión a receptor, unión a PA o LF, e internalización siguiendo los procedimientos expuestos en los ejemplos.

Además, los grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes con los aminoácidos amino y carboxi terminal o grupos secundarios de aminoácidos los conocen bien los expertos en la técnica. Por ejemplo, los grupos funcionales capaces de unir el grupo amino terminal incluyen anhídridos, carbodiimidas, cloruros de ácidos y ésteres activados. De manera similar, los grupos al funcionales capaces de formar enlaces covalentes con el carboxi terminal incluyen aminas y alcoholes. Tales grupos funcionales se pueden usar para unir el compuesto a LF en bien el extremo amino o carboxilo. Los compuestos también se pueden unir a LF a través de interacciones de grupos secundarios de residuos aminoácidos, tales como el grupo SH de cisteína (véase, por ejemplo, Thorpe et al., Monoclonal

 \hbox{Antibody -} 

Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet, en Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, pp. 168 - 190 (1982); Waldmann, Science, 252: 1657 (1991); patentes de Estados Unidos números 4.545.985 y 4.894.443). El procedimiento para unir un agente a un anticuerpo u otra molécula que dirige el polipéptido variará según la estructura química del agente. Como ejemplo, un residuo cisteína puede añadirse en el extremo de LF. Ya que no existen otras cisteínas en LF, esta cisteína individual proporciona un punto de unión conveniente a través del cual se conjugan químicamente otras proteínas a través de enlaces disulfuro. Aunque ciertos de los procedimientos de la invención se han descrito por usar proteínas de fusión LF, se entenderá que otras composiciones que tienen compuestos unidos químicamente se pueden usar en los procedimientos de la invención.

Las proteínas de antígenos protectores se pueden producir a partir de construcciones de ácidos nucleicos que codifican mutantes, en los que el sitio de escisión por furina de origen natural se ha reemplazado por una MMP o un sitio de escisión activador de plasminógeno. Además, las proteínas LF y PA también se pueden expresar a partir de construcciones de ácidos nucleicos según la metodología habitual. Los expertos en al técnica reconocerán una amplia diversidad de formas para introducir mutaciones en un ácido nucleico que codifica antígeno protector o para construir un ácido nucleico que codifica antígeno protector mutante. Tales procedimientos se conocen bien en la técnica (véase Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expresión: A Laboratory Manual (1990); a Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la invención se generan usando PCR (véase, por ejemplo, los ejemplos I y III). Por ejemplo, el uso de los ácidos nucleicos que codifican antígeno protector de PCR superpuesto se pueden generar sustituyendo la subsecuencia de ácido nucleico que codifica el sitio de furina con una subsecuencia de ácidos nucleicos que codifica un sitio de metaloproteinasa de matriz (MMP) (por ejemplo, GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3)) (véase, por ejemplo, el ejemplo I). De manera similar, un procedimiento de PCR de superposición se puede usar para construir las proteínas de antígeno protectoras en las que el sitio de furina se reemplaza por un sitio de escisión de activador de plasminógeno (por ejemplo, la secuencia de sustrato fisiológico de uPA tPA PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4), la secuencia favorita de uPA PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), la secuencia favorita de uPA PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), o la secuencia favorita de tPA PQRGRSA (SEC ID Nº: 7)) (véase, por ejemplo, el ejemplo III).

B. Expresión de LF, PA y LF y proteínas de fusión de PA

Para obtener expresión de alto nivel de un ácido nucleico (por ejemplo, ADNc, ADN genómico, producto de PCR, etc, o las combinaciones de los mismos) que codifican una proteína de antígeno protector nativa (por ejemplo, PA) o mutante (por ejemplo, PA - L1, PA - L2, PA - U1, PA - U2, PA - U3, PA - U4, etc), LF, o una proteína de fusión de PA o LF, se subclona típicamente el antígeno protector que codifica el ácido nucleico en un vector de expresión que contiene un fuerte promotor para la transcripción directa, un terminador de trasncripción/traducción, y si para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión a ribosoma para el inicio de traducción. Los promotores bacterianos adecuados se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., y Ausubel et al. Los sistemas de expresión bacterianos para expresar el ácido nucleico que codifica antígeno protector están disponibles en, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229 - 235 (1983)). Los kits para tales sistemas de expresión están comercialmente disponibles. Los sistemas de expresión eucarióticos para células de mamíferos, levaduras, y células de insectos se conocen bien en la técnica y están también comercialmente disponibles.

En alguna realización, las proteínas que contienen antígenos protectores se expresan en cepas no virulentas de Bacillus usando plásmidos de expresión de Bacillus que contienen secuencias de ácidos nucleicos que contienen la proteína de antígeno protector particular (véase, por ejemplo, Singh, Y., et al., J. Biol. Chem, 264: 19103 - 19107 (1989)). Las proteínas que contienen antígeno protector se pueden aislar a partir del cultivo de Bacillus usando procedimientos de purificación de proteínas (véase, por ejemplo, Varughese, M., et al., Infect Immun, 67: 1860 - 1865 (2999)).

El promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico que codifica el antígeno protector depende de la aplicación particular. El promotor se posiciona preferiblemente aproximadamente a la misma distancia del sitio de comienzo de transcripción heteróloga en su establecimiento natural. Sin embargo, como se sabe en la técnica, algunas variaciones en esta distancia se pueden acomodar sin la pérdida de la función promotora. El promotor típicamente también puede incluir elementos que son sensibles a la transactivación, por ejemplo, elementos sensibles Gal4, elementos sensibles represores lac, y similares. El promotor puede ser constitutivo o inducible, heterólogo u homólogo.

Además del promotor, el vector de expresión típicamente contiene una unidad de transcripción o módulo de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del ácido nucleico en células hospedadoras. Así pues un módulo de expresión típico contiene un promotor operativamente unido, por ejemplo, a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína que contiene antígeno protector, y las señales requeridas para la expresión eficaz y terminación y procesamiento de la transcripción, sitios de unión a ribosomas, y terminación de la traducción. La secuencia de ácidos nucleicos se puede unir típicamente a una secuencia de péptidos señal escindible para promover la secreción de la proteína codificada por la célula transformada. Tales péptidos señal incluirían, entre otros, los péptidos señal de proteínas bacterianas, o proteínas de mamíferos tales como activador de plasminógeno de tejido, insulina, y factor de crecimiento neuronal, y la estearasa de la hormona juvenil de Heliothis virescens. Los elementos adicionales del módulo pueden incluir potenciadores y, si se usa ADN genómico como gen estructural, intrones con sitios dadores y aceptores de ayuste.

Además de una secuencia promotora, si se desea el módulo de expresión debe también contener una región de terminación de la transcripción cadena debajo del gen estructural para proporcionar la eficiente terminación y procesamiento. La región de terminación se puede obtener a partir del mismo gen que la secuencia promotora o se puede obtener a partir de diferentes genes.

El vector de expresión particular usado para transportar la información genética en las células no es particularmente crítico. Se puede usar cualquiera de los vectores convencionales usado para la expresión en células procarióticas o eucarióticas. Los vectores de expresión bacterianos habituales incluyen plásmidos tales como plásmidos a base de pBR322, pSKF, pET23D, y sistemas de expresión de fusión como GST y LacZ. Las dianas de epítopes también se pueden añadir a proteínas recombinantes para propocionar procedimientos convenientes de aislamiento, por ejemplo, c-myc.

Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucarióticos se usan típicamente en vectores de expresión eucarióticos, por ejemplo, vectores SV40, vectores de virus de papiloma, y vectores derivados del virus de Epstein - Bar. Otros vectores eucarióticos ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE, y cualquier otro vector que permiten la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano SV40, promotor tardío SV40, promotor de metalotioneína, promotor de virus de tumor de mamífero murino, promotor de virus de sarcoma Rous, promotor de polihedrina, u otros promotores muestran eficacia para la expresión en células eucarióticas.

Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan ampliación génica tal como timidina quinasa, higromicina B fosfotransferasa, y dihidrofolato reductasa. Como alternativa, los sistemas de expresión de alto rendimiento que no implican ampliación génica son también adecuados, tales como el uso de un vector de baculovirus en células de insectos, con un ácido nucleico que codifica antígeno protector bajo la dirección del promotor de polihedrina u otros promotores fuertes baculovirus.

Los elementos que están típicamente incluidos en los vectores de expresión también incluyen un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica resistencia antibiótica para permitir la selección de bacterias que albergan plásmidos recombinantes, y sitios de restricción únicos en regiones no esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias heterólogas. El gen de resistencia a antibióticos particular elegido no es crítico, cualquiera de los muchos genes de resistencia conocidos en la técnica son adecuados. Si es necesario las secuencias procarióticas se eligen preferiblemente de manera que no interfieran con la replicación del ADN en células eucarióticas.

Los procedimientos de transfección habituales se usan para producir líneas celulares de bacterias, de mamíferos, de levaduras o de insectos que expresan grandes cantidades de proteína, que después se purifican usando técnicas habituales (véase, por ejemplo, Colley et al., J. Biol. Chem., 264: 17619 - 17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methos in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). La transformación de células eucarióticas y procarióticas se realizan de acuerdo a técnicas habituales (véase, por ejemplo, Morrison, J. Bact. 132: 349 - 351 (1977); Clark - Curtiss y Curtis, Methods in Enzymology 101: 347 - 362 (Wu et al., eds, 1983).

Se puede usar cualquiera de los procedimientos conocidos para introducir secuencias de nucleótidos foráneos en células hospedadoras. Éstos incluyen el uso de transfección por fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, liposomas, microinyección, vectores de plasma, vectores virales y cualquier y cualquiera de los otros procedimientos conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético foráneo en una célula hospedadora (véase, por ejemplo, Sambrook et al., anteriormente). Solamente es necesario que el procedimiento de ingeniería genética particular usado sea capaz de introducir exitosamente al menos un gen en la célula hospedadora capaz de expresar la proteína elegida.

Después de que el vector de expresión se introduzca en las células, las células transfectadas se cultivan en condiciones que favorecen la expresión de la proteína que contiene antígeno protector, que se recupera a partir del cultivo usando técnicas habituales identificadas más adelante.

III. Purificación de polipéptidos de la invención

Las proteínas recombinantes de la invención se pueden purificar a partir de cualquier sistema de expresión adecuado, por ejemplo, mediante la expresión de proteínas en B. anthracis y después purificando la proteína recombinante mediante técnicas de purificación convencional (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, filtración sobre gel, etc.) y/o purificación por afinidad, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos que reconocen un epítope específico sobre la proteína o sobre parte de la proteína de fusión, o mediante el uso de gel de afinidad a glutatión, que se une a GST (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); patente de Estados Unidos nº: 4.673.641; Ausubel et al., anteriormente; y Sambrook et al., anteriormente). En algunas realizaciones, la proteína recombinante es una proteína de fusión con GST o Gal4 en el extremo N. Los expertos en la técnica reconocerán una amplia diversidad de péptidos y proteínas que se pueden condensar a la proteína que contiene antígeno protector para facilitar la purificación (por ejemplo, proteína de unión a maltosa, un péptido de polihistidina, etc).

A. Purificación de proteínas a partir de bacterias recombinantes

Las proteínas recombinantes y nativas se pueden expresar mediante bacterias transformadas en grandes cantidades, típicamente después de la inducción promotora; pero la expresión puede ser constitutiva. La inducción promotora con ITPG es un ejemplo de un sistema promotor inducible. Las bacterias se desarrollan según procedimientos habituales en la técnica. Las células bacterianas recientes o congeladas se usan para aislamiento de proteína.

Las proteínas expresadas en bacterias pueden formar agregados insolubles ("cuerpos de inclusión"). Varios protocolos son adecuados para la purificación de cuerpos de inclusión. Por ejemplo, la purificación de los cuerpos de inclusión implica típicamente las extracción, separación y/o purificación de los cuerpos de inclusión mediante la fragmentación de células bacterianas, por ejemplo, mediante incubación en un tampón de Tris/HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, DTT 1 mM, ATP 0,1 mM, y PMSF 1 mM. La suspensión celular se puede lisar usando 2 - 3 pases a través de una prensa francesa, homogeneizar usando un Polytron (Brinkman Instruments) o sonicar sobre hielo. Los procedimientos alternativos de lisis bacteriana son aparentes para los expertos en al técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., anteriormente; Ausubel et al, anteriormente.).

Si es necesario, los cuerpos de inclusión se solubilizan, y la suspensión celular lisada se centrifuga típicamente para retirar la materia insoluble no deseada. Las proteínas que formaban los cuerpos de inclusión se pueden renaturalizar mediante difusión o diálisis con un tampón compatible. Los disolventes adecuados incluyen, pero no se limitan a urea (entre aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M), formamida (al menos aproximadamente 80%, base volumen/volumen), y clorhidrato de guanidina (entre aproximadamente 4 M y aproximadamente 8 M). Algunos disolventes que son capaces de solubilizar proteínas formadoras de agregados, por ejemplo, SDS (dodecil sulfato sódico), ácido fórmico al 70%, son inapropiados para uso en este procedimiento debido a la posibilidad de desnaturalización irreversible de las proteínas, acompañado de una pérdida de inmunogenicidad y/o actividad. Aunque el clorhidrato de guanidina y agentes similares son desnaturalizantes, esta desnaturalización no es irreversible y la renaturalización puede producirse tras la eliminación (por ejemplo, mediante diálisis) o dilución del desnaturalizante, que permite la

\hbox{re -}

formación de proteína inmunológica y/o biológicamente activa. Los expertos en la técnica conocen otros tampones adecuados. La proteína elegida se separa de otras proteínas bacterianas mediante técnicas de separación habituales, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, fraccionamiento por sulfato de amonio, etc. B. Técnicas de separación de proteínas habituales para purificar proteínas de la invención Fraccionamiento de la solubilidad

A menudo como etapa inicial, particularmente si la mezcla de proteínas es compleja, un fraccionamiento por sal inicial puede separar muchas de las proteínas de las células hospedadoras no deseadas (o proteínas derivadas del medio de cultivo celular) de la proteína recombinante de interés. La sal preferida es sulfato amónico. El sulfato amónico precipita proteínas reduciendo eficazmente la cantidad de agua en la mezcla de proteínas. Después las proteínas precipitan en base a su solubilidad. Cuanto más hidrófoba es una proteína, más probablemente precipita a menores concentraciones de sulfato de amonio. Un protocolo típico incluye la adición de sulfato de amonio saturado a una solución de proteína de manera que la concentración de amonio resultante está entre 20 - 30%. Esta concentración precipitará la más hidrófoba de las proteínas. Después el precipitado se desecha (salvo que la proteína de interés sea hidrófoba) y se añade sulfato de amonio al sobrenadante hasta una concentración conocida para precipitar la proteína de interés. Como alternativa, la proteína de interés en el sobrenadante se puede después purificar usando las técnicas de purificación de proteínas habituales. Después el precipitado se solubiliza en tampón y el exceso de sal se retira si es necesario, a través de diálisis o diafiltración. Otros procedimientos que dependen de la solubilidad de proteínas, tal como precipitación con etanol frío, son conocidos por los expertos en la técnica y se pueden usar para fraccionar mezclas de proteínas complejas.

Filtración diferencial por tamaño

El peso molecular de la proteína, por ejemplo, PA - U1, etc., se puede usar para aislar la proteína de las proteínas de mayor y menor tamaño usando ultrafiltración a través de membranas de diferente tamaño de poro (por ejemplo, membranas Amicon o Millipore). Como primera etapa, la mezcla de proteínas se ultrafiltra a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene un valor límite de peso molecular menor que el peso molecular de la proteína de interés. Lo retenido de la ultrafiltración después se ultrafiltra frente a una membrana con un valor límite molecular mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasará a través de la membrana en el filtrado. Después el filtrado se puede cromatografiar como se describe más adelante.

Cromatografía en columna

La proteína elegida también se puede separar de otras proteínas en base a su tamaño, carga superficial neta, hidrofobicidad, y afinidad para ligandos. Además, los anticuerpos originados contra proteínas se pueden conjugar a matrices de columna y las proteínas inmunopurificadas. Todos estos procedimientos se conocen bien en la técnica. Será evidente por los expertos en la técnica que las técnicas cromatográficas se pueden realizar a cualquier escala y usando equipo a partir de muchos fabricantes diferentes (por ejemplo, Pharmacia Biotech).

En algunas realizaciones, las proteínas se purifican a partir de sobrenadantes de cultivo de Bacilus (véase, por ejemplo, los ejemplos I y III). En resumen, las proteínas se purifican haciendo un sobrenadante de cultivo 5 nM en EDTA, sulfato de amonio amónico saturado al 35% y 1% en fenilo - Sefarosa Fast Flor (Pharmacia). El fenilo - Sefarosa Fast Flor se agita después y se recoge. La resina recogida se lava con sulfato amónico saturado al 35% y después los antígenos protectores se eluyeron con HEPES 10 mM EDTA 1 mM (pH 7,5). Después las proteínas se pueden purificar adicionalmente usando una columna Mono Q (Pharmacia Biotech). Las proteínas se pueden eluir usando un gradiente de NaCl en CHES 10 mM (2-[N-ciclohexilamino]ácido etanosulfónico) - etanolamina al 0,06% (vol/vol) (pH 9,1). Las fracciones reunidas de MonoQ después se dializaron frente al tampón elegido para posterior análisis o aplicaciones.

IV. Ensayos para medir cambios en desarrollo celular

La administración de una PA funcional y combinación de LF de la invención a una célula puede inhibir la proliferación celular de ciertos tipos celulares que sobreexpresan las MMP y las proteínas del sistema de activación del plasminógeno, por ejemplo, células cancerosas, células implicadas en inflamación, y similares. Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente las proteínas y células funcionales usando procedimientos que se conocen bien en la técnica. Se pueden determinar cambios en el crecimiento celular usando una diversidad de ensayos in vitro e in vivo, por ejemplo, ensayo de MTT, capacidad para crecer sobre agar blando, cambios en inhibición por contacto y limitación de densidad de crecimiento, cambios en el factor de crecimiento o dependencia de suero, cambios en el nivel de marcadores específicos, cambios en la capacidad invasora en Matrigel, cambios en el patrón de ciclo celular, cambios en el desarrollo tumoral in vivo, tal como ratones transgénicos, etc.

El término "sobreexpersión" se refiere a una célula que expresa una metaloproteinasa de matriz, un activador de plasminógeno o un ARNm receptor de activador de plasminógeno o proteína en cantidades al menos aproximadamente dos veces que normalmente se producen en un tipo de célula normal de referencia, por ejemplo, una célula Vero. La sobreexpresión puede producirse, por ejemplo, a partir de presión selectiva en medio de cultivo, transformación, activación de genes endógenos, o mediante la adición de genes exógenos. La sobreexpresión se puede analizar usando una diversidad de ensayos conocidos por los expertos en la técnica para determinar si el gen o proteína se sobreexpresa (por ejemplo, northerns RT - PCR, wexterns, inmunoensayos, ensayos de citotoxicidad, ensayos de inhibición de crecimiento, ensayos de enzimas, zimografía en gelatina, etc.). Un ejemplo de una célula que sobreexpresa una metaloproteinasa de matriz son las líneas celulares tumorales, HT 1080 de fibrosarcoma, A2058 de melanoma y

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MB - 231 de cáncer de mama. Un ejemplo de una célula que no sobreexpresa una metaloproteinasa de matriz es la línea celular no tumoral Vero. Un ejemplo de una célula que sobreexpresa un receptor de activador de plasminógeno son los tipos de células Hela, A2058, y Bowes que sobreexpresan uP AR. Un ejemplo de una célula que no sobreexpresa un receptor de activador de plasminógeno es la línea celular no tumoral Vero. Un ejemplo de una célula que sobreexpresa un activador de plasminógeno de tipo tejido son tipos de células Bowes de melanoma humano y células endoteliales vasculares primarios humanos. Un ejemplo de una célula que no sobreexpresa un receptor de activador de plasminógeno en la línea celular no tumoral Vero. A. Ensayos para cambios en el crecimiento celular mediante la administración de antígeno protector y factor letal

Se pueden usar uno o más de los siguientes ensayos para identificar proteínas de la invención que son capaces de regular la proliferación celular. La frase "construcciones de antígeno protector" se refiere a una proteína de antígeno protector de la invención. Las construcciones de antígeno protector funcionales identificadas mediante los siguientes ensayos se pueden usar después para tratar enfermedad y afecciones, por ejemplo, para inhibir la proliferación y transformación celular anormal. Así pues, estos ensayos se pueden demandar para las proteínas de antígeno protector que son útiles junto con las proteínas que contienen factor letal para inhibir el crecimiento celular de tumores, cánceres, células cancerosas, y otros tipos de célula patógenas.

Crecimiento en agar blando o formación de colonias en suspensión

El crecimiento en agar blando o formación de colonias en ensayos de suspensión se pueden usar para identificar construcciones de antígeno protector, que cuando se usan junto con una construcción de LF, inhiben la proliferación y transformación celular anormal. Típicamente, las células hospedadoras transformadas (por ejemplo, las células que crecen en agar blando) se usan en este ensayo. Las técnicas para crecimiento o formación de colonias en agar blando en ensayos de suspensión se describen en Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique, 3ª edición, Wiley - Liss, Nueva York (1994), incorporada en esta memoria descriptiva como referencia. Véase también, la sección de procedimientos de Garkavtsev et al., (1996) anteriormente, incorporada en esta memoria descriptiva como referencia.

Las células normales requieren un sustrato sólido un sustrato sólido para unirse y crecer. Cuando las células se transforman, pierden su fenotipo y crecen separadas del sustrato. Por ejemplo, las células transformadas pueden crecer en cultivo en suspensión agitado o suspendido en medio semi - sólido, tal como agar semi - sólido o blando. Las células transformadas, cuando se transfectan con genes supresores tumorales, regeneran el fenotipo normal y requieren un sustrato sólido para unirse y crecer.

La administración de una proteína de antígeno protector activa y una proteína que contiene LF activa a células transformadas reducirían o eliminarían la capacidad de las células hospedadoras para crecer en cultivo en suspensión agitado o suspendidas en medio semi - sólido, tal como semi - sólido o blando. Esto se debe a que las células transformadas regenerarían la dependencia de anclaje de células normales, y por lo tanto requieren un sustrato sólido para crecer. Por lo tanto este ensayo se puede usar para identificar construcciones de antígeno protector que pueden funcionar con una proteína del factor letal para inhibir el crecimiento celular. Una vez identificadas, tales construcciones de antígeno protector se pueden usar en numerosos procedimientos de diagnósticos o terapéuticos, por ejemplo, en la terapia de cáncer para inhibir proliferación y transformación celular anormal.

Inhibición de contacto y limitación de densidad de crecimiento

La inhibición de contacto y limitación de densidad de ensayos de crecimiento se pueden usar para identificar construcciones de antígeno protector que son capaces de inhibir la proliferación anormal y transformación en células hospedadoras. Típicamente, células hospedadoras transformadas (por ejemplo, células que no están inhibidas por contacto) se usan en este ensayo. La administración de una construcción de antígeno protector y una construcción de factor letal a estas células hospedadoras transformadas darían como resultado células que están inhibidas por contacto y crecen hasta una densidad de saturación inferior a las células transformadas. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para identificar construcciones de antígeno protector que son útiles en las composiciones para inhibir el crecimiento celular. Una vez identificadas, tales construcciones de antígeno protector se pueden usar en terapia de enfermedades para inhibir la proliferación y transformación celular anormal.

Como alternativa, el índice de marcaje con [^{3}H] - timidina a densidad de saturación se puede usar para medir la limitación de densidad de crecimiento. Véase Fresheney (1994), anteriormente. Las células transformadas, cuando se tratan con una combinación funcional de PA/L, regeneran un fenotipo normal y llegar a inhibirse por contacto y crecerían hasta una densidad menor. En este ensayo, el índice de marcaje con [^{3}H] - timidina a densidad de saturación es un procedimiento preferido para medir la limitación de densidad de crecimiento. Las células hospedadoras transformadas se tratan con una construcción de antígeno protector y una construcción de factor letal (por ejemplo, LP59) y se hacen crecer durante 24 horas a densidad de saturación en condiciones de medio no limitantes. El porcentaje de marcaje de células con [^{3}H] - timidina se determina autorradiográficamente. Véase, Freshney (1994), anteriormente. Las células hospedadoras tratadas con una construcción de antígeno protector funcional deberían dar lugar a un índice de marcaje menor comparado con el control (por ejemplo, células hospedadoras transformadas tratadas con una construcción de antígeno protector no funcional o construcción de factor letal no funcional).

Factor de crecimiento o dependencia de suero

El factor de crecimiento o dependencia de suero se puede usar como un ensayo para identificar construcciones de antígeno protector. Las células transformadas tienen una dependencia de suero inferior que sus homólogos normales (véase, por ejemplo, Temin, J. Natl. Cancer Insti. 37: 167 - 175 (1996); Eagle et al., J. Exp. Med. 131: 836 - 879 (1970)); Freshney, anteriormente. Esto en parte se debe a la liberación de diversos factores de crecimiento mediante células transformadas. Cuando un gen supresor de tumores se transfecta y expresa en células transformadas, las células volverían a adquirir la dependencia de suero y liberarían factores de crecimiento a menor nivel. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para identificar construcciones de antígeno protector que son capaces de actuar junto con un factor letal que inhibe el crecimiento celular. El factor de crecimiento o dependencia de suero de células hospedadoras transformadas que están transfectadas con una construcción de antígeno protector se puede comparar con la de control (por ejemplo, células hospedadoras transformadas se tratan con un antígeno protector no funcional o factor letal no funcional). Las células hospedadoras transformadas tratadas con un antígeno protector funcional mostrarían un incremento en el factor de crecimiento y dependencia de suero comparado con el control.

Niveles de marcadores específicos de tumores

Las células tumorales liberan una cantidad mayor de ciertos factores (de aquí en adelante "marcadores específicos tumorales") que sus homólogos normales. Véase, por ejemplo, Folkman, Angiogenesis and cancer, Sem Cancer Biol. (1992)).

Los marcadores específicos tumorales se pueden ensayar para identificar construcciones de antígeno protector, que cuando se administran con una construcción de factor letal, disminuyen el nivel de liberación de estos marcadores se las células hospedadoras. Típicamente, se usan células hospedadoras transformadas o tumorigénicas. La administración de un antígeno protector y un factor letal a estas células hospedadoras reducirían o eliminarían la liberación de marcadores específicos tumorales de estas células. Por lo tanto, este ensayo se puede usar para identificar construcciones de antígeno protector y son funcionales en la supresión de tumores.

Diversas técnicas que miden la liberación de estos factores se describen en el documento de Freshney (1994) anteriormente. También, véase, Unkless et al., J. Biol. Chem. 249: 4295 - 4305 (1974); Strickland y Beers, J. Biol. Chem. 251: 5694 - 5702 (1976); Whur et al., Br. J. Cancer 42: 305 - 312 (1980); Gulino, Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth. En Mihich, E. (ed): "Biological Responses in Cancer". Nueva York, Plenum (1985); Fresheney Anticancer Res. 5: 111 - 130. (1985).

Ensayo de citotoxicidad con MTT

La citotoxicidad de una combinación particular de PA/LF también se puede ensayar usando el ensayo de citotoxicidad de MTT. Las células se siembran y se hacen crecer hasta 80 a 100% de confluencia. Después las células se lavan dos veces con DMEM exento de suero para retirar FCS residual y se ponen en contacto con una combinación particular de PA/LF. MTT bromuro de (3-[4,5-dimetiltiazol-2- il]2,5-difeniltetrazolio) se añade después a las células y se MTT oxidado (indicativo de una célula viva) se solubiliza y se cuantifica.

Capacidad invasora en Matrigel

El grado de capacidad invasora en Matrigel o algún constituyente de matriz extracelular se puede usar como un ensayo para identificar construcciones de antígeno protector que son capaces de inhibir la proliferación celular anormal y crecimiento tumoral. Las células tumorales muestran una buena correlación entre malignidad y capacidad invasora de las células en Matrigel o algún otro constituyente de matriz extracelular. En este ensayo, se usan típicamente las células tumorigénicas. La administración de una combinación de proteínas de antígeno protector letal/factor letal de estas células hospedadoras tumorigénicas disminuirían su capacidad invasora. Por lo tanto, las construcciones de antígeno protector funcional se pueden identificar para medir cambios en el nivel de la capacidad invasora entre las células tumorigénicas antes y después de la administración de construcciones del antígeno protector y factor letal.

Se pueden usar las técnicas descritas en Feshney (1994), anteriormente. En resumen, el nivel de invasión de células tumorigénicas se puede medir usando filtros revestidos con Matrigel o algún otro constituyente de matriz extracelular. La penetración en el gel, o a través del lado distal del filtro, se califica como capacidad invasora, y se califica histológicamente mediante un número de células y distancia movida, o marcando previamente las células con ^{125}I y contando la radiactividad en el lado distal del filtro o fondo de la placa. Véase, por ejemplo, Freshney (1984) anteriormente.

Análisis de detección de ciclo celular G_{0}/G_{1}

La detención del ciclo celular G_{0}/G_{1} se puede usar como un ensayo para identificar una construcción de antígeno protector funcional. La administración de la construcción PA/LF puede producir la detención del ciclo celular G1. En este ensayo, las líneas celulares se pueden usar para seleccionar construcciones de antígeno protector funcional. Las células se tratan con una construcción de antígeno protector supuesto y una construcción de factor letal. Las células se pueden transfectar con un ácido nucleico que comprende un gen marcador que codifica una proteína fluorescente verde. La administración de una combinación de antígeno protector funcional/factor letal produciría la detección del ciclo celular G_{0}/G_{1}. Los procedimientos conocidos en la técnica se pueden usar para medir el grado de detención de ciclo celular G1. Por ejemplo, la señal de yoduro se propidio se puede usar como una medida del contenido de ADN para determinar los perfiles de ciclo celular sobre un citómetro de flujo. Se puede calcular el porcentaje de células en cada ciclo celular calcular. Las células expuestas a un antígeno protector funcional mostrarían un alto número de células que se detienen en la fase G_{0}/G_{1} comparado con el control (por ejemplo, tratadas en ausencia de un antígeno protector).

Crecimiento tumoral in vivo

Los efectos PA/LF sobre el crecimiento celular se pueden ensayar en ratones transgénicos o inmunes. Se pueden preparar ratones transgénicos, en los que un supresor tumoral (ratones de eliminación genética) o un gen promotor de tumores se sobreexpresa. Tales ratones se pueden usar para estudiar los efectos de antígeno protector como un procedimiento en la inhibición de tumores in vivo.

Los ratones transgénicos de eliminación genética se pueden preparar mediante la inserción de un gen marcador u otro gen heterólogo en un sitio génico supresor de tumores en el genoma del ratón mediante recombinación homóloga. Tales ratones también se pueden preparar sustituyendo el supresor tumoral endógeno con una versión mutada del gen supresor de tumores, o mutando el supresor de tumores endógeno, por ejemplo, mediante la exposición a compuestos cancerígenos.

Una construcción de ADN se introduce en los núcleos de células tronco embrionarias. Las células que contienen la nueva lesión genética modificada por ingeniería genética se inyectan en un embrión de ratón hospedador, que se re - implanta en una hembra receptora. Algunos de estos embriones se desarrollan en ratones quiméricos que poseen células germinales derivadas parcialmente de la línea celular mutante. Por lo tanto, mediante la cría de los ratones quiméricos es posible obtener una nueva línea de ratones que contiene la lesión genética introducida (véase, por ejemplo, Capecchi et al., Science 244: 1288 (1989)). Los ratones dirigidos quiméricos se pueden derivar según Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) y Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL Press, Washington, D. C., (1987).

Estos ratones de eliminación genética se pueden usar como huéspedes para analizar los efectos de diversas construcciones de antígeno protector sobre el crecimiento celular. Estos ratones transgénicos con un gen supresor de tumores eliminados genéticamente desarrollarían proliferación celular anormal y crecimiento tumoral. Se pueden usar como huéspedes para analizar los efectos de diversas construcciones de antígeno protector sobre el crecimiento celular. Por ejemplo, la introducción de construcciones de antígeno protector y construcciones de factor letal en estos ratones de eliminación genética inhibirían la proliferación celular anormal y suprimirían el desarrollo tumoral.

Como alternativa, se pueden usar diversos animales hospedadores inmuno - suprimidos o inmuno - deficientes. Por ejemplo, ratón "desnudo" genéticamente atímico (véase, por ejemplo, Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 52: 921 (1974)), un ratón SCID, un ratón trimectomizado, o un ratón irradiado, (véase, por ejemplo, Bradley et al., Br. J. Cancer 38: 263 (1978)); Selby et al., Br. J. Cancer 41: 52 (1980)) se pueden usar como un huésped. Las células tumorales transplantables (típicamente aproximadamente 10^{6} células) inyectadas en huéspedes isogénicos producirán tumores invasivos en una alta proporción de casos, mientras las células normales de origen similar no. En los huéspedes que desarrollan tumores invasivos, las células se exponen a una combinación de construcción de antígeno protector/factor letal (por ejemplo, mediante inyección subcutánea). Después de un período de tiempo adecuado, preferiblemente

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8 semanas, se mide el crecimiento tumoral (por ejemplo, por volumen o mediante sus dimensiones mayores) y se comparan con el control. Los tumores que tienen reducción estadísticamente significativa (usando, por ejemplo, el análisis de la t de Student) se dicen que tienen crecimiento inhibido. Usando la reducción del tamaño de tumores como un ensayo, se pueden identificar las construcciones de antígeno protector funcional que son capaces de inhibir la proliferación de células anormales. Este modelo también se puede usar para identificar las versiones mutantes funcionales de antígeno protector. V. Administración de composiciones farmacéuticas

Las proteínas que contienen antígeno protector y las proteínas que contienen el factor letal se pueden administrar directamente al paciente, por ejemplo, para inhibición de células cancerosas, tumorales, o precancerosas in vivo, etc. La administración es mediante cualquiera de las vías usadas normalmente para introducir un compuesto en contacto último con el tejido a tratar. Los compuestos se administran de una manera adecuada, preferiblemente con vehículos farmacéuticamente aceptables. Los procedimientos adecuados de administración tales compuestos están disponibles y los conocen bien los expertos en la técnica, y, aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular puede a menudo proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte mediante la composición particular que se está administrando, así como mediante el procedimiento particular usado para administrar la composición. De acuerdo a lo anterior, existe una amplia diversidad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 17ª, 1985)). Por ejemplo, si se desea la distribución in vivo de una proteína de antígeno protector biológicamente activo, se pueden usar los procedimientos descritos en Schwarze et al., (véase, Science 285: 1569 - 1572 (1999).

Los compuestos, solos o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden preparar en formulaciones de aerosoles (es decir, se pueden "nebulizar") para administrar mediante inhalación. Las formulaciones de aerosol se pueden colocar en propulsores aceptables presurizados tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por ejemplo, mediante las vías intravenosa, intramuscular, intradérmica, y subcutánea, incluyen soluciones de inyecciones isotónicas estériles acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto, y las suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes, y conservantes. En la práctica de esta invención, las composiciones se pueden administrar, por ejemplo, mediante infusión intravenosa, vía oral, tópica, intraperitoneal, intravesical o intratecal. Las formulaciones de los compuestos se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitaria o dosis múltiple, tales como ampollas y viales. Las soluciones y suspensiones para inyección se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos, y comprimidos del tipo descrito previamente. La dosis administrada a un paciente ("cantidad terapéuticamente eficaz"), en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente con el tiempo. La dosis se determinará mediante la eficacia del compuesto particular empleado y la condición del paciente, así como el peso corporal o área superficial del paciente a tratar. El tamaño de la dosis también se determinará mediante la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario que acompaña a la administración de un compuesto o vector particular o en un paciente particular.

Cuando se determina la cantidad eficaz del (de los) compuesto (s) a administrar en el tratamiento o profilaxis de cáncer, el médico evalúa los niveles en plasma circulante de (de los) compuesto (s) respectivos, progresión de la enfermedad y la producción de anticuerpos anti - compuesto. En general, la dosis equivalente de un compuesto está entre aproximadamente 1 ng/kg y 10 mg/kg para un paciente típico. La administración de compuestos la conocen bien los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Bansinath et al., Neurochem Res. 18: 1063 - 1066 (1993); Iwasaki et al., Jpn. J. Cancer Res. 88: 861 - 866 (1997); Tabrizi - Rad et al., Br. J. Pharmacol. 111: 394 - 396 (1994)).

Para la administración, los compuestos de la presente invención se pueden administrar a una velocidad determinada mediante la DL - 50 del compuesto particular, y sus efectos secundarios a diversas concentraciones, como se aplica a la masa y salud global del paciente. La administración se puede llevar a cabo mediante dosis individuales o divididas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en esta memoria descriptiva como referencia como si cada publicación individual o solicitud de patente se indicara específica o individualmente que se incorpora como referencia.

Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente evidente para los expertos en la técnica a la luz de las descripciones de esta invención que ciertos cambios y modificaciones se pueden realizar en ella sin salirse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración solamente y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una diversidad de parámetros no críticos que se pueden cambia o modificar para producir esencialmente resultados similares.

Ejemplo I Construcción de PA mutante con sitios de escisión de metaloproteinasas de matriz A. Materiales

Las enzimas para la manipulación y modificación de ADN se compraron en New England Biolabs (Beverly, MA). FP59 y la furina en forma solubles se prepararon en nuestro laboratorio según la metodología habitual. La

\hbox{MMP -}

2 activa fue un regalo amable del Dr. William Stetler - Stevenson, la forma activa de la MMP - 9 se compró en CALBIOCHEM (San Diego, CA). Los inhibidores de las MMP BB - 94 (Batimastat) y BB - 2516 (Marimastat) eran regalos amables de British Biotechnology Limited, GM 6001 era un regalo amable del Dr. Richard E. Galarday preparado como se ha descrito (Grobelny, D., et al., Biochemistry, 31: 7152 - 7154 (1992)). El anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5308) se preparó en el laboratorio de los inventores. El anti - MT - MMP1 de conejo (AB815) se compró en CHEMICON Internacional, Inc, (Temecula, CA). La secuencia para LF se puede encontrar, por ejemplo, en Robertson y Leppla, Gene 44: 71 - 78 (1986). La secuencia para PA se describe, por ejemplo, en Singh et al., J. Biol. Chem. 264: 19103 - 10107 (1989) (vector de expresión pYS5); Leppla, en Methods in Enzymology, vol. 165, pp. 103 - 116 (Harshman ed., 1988). La mutagénesis dirigida ala sitio de las moléculas de PA se ha descrito previamente (Singh et al., J. Biol. Chem. 269: 29039 - 29046 (1994). Construcción de mutantes de sustrato de PA MMP

La PCR de superposición se usó para construir los mutantes de PA con el sitio de furina reemplazado por el octapéptido de sustrato de MMP GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3) en PAL2. El plásmido de expresión de PA (WT - PA) de tipo salvaje pYG5 (Singh, Y., et al., J. Biol. Chem, 264: 19103 - 19107 (1989)) se usó como molde. Los inventores usaron cebador F en 5' (AAAGGAGAACGTATATGA (SEC ID nº: 8), subrayada está la secuencia de SD y el codón de inicio de PA) y el cebador fosforilado R1 (pTGAGTTCGAAGATTTTTGTTTTAATTCTGG (SEC ID Nº: 9), la hibridación a la secuencia correspondiente a P_{154}- S_{163}) para ampliar el fragmento N. Los inventores usaron el cebador fosforilado mutagénico H1 (pGGACCATTAGGAATGTGGAGTCAAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 10), que codifica el sustrato de MMP GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y S_{168} - P_{176}) y el cebador inverso R2 ACGTTTATCTCTTATTAAAAT (SEC ID Nº: 1 11), la hibridación a la secuencia circundante I_{589} - R_{595}) para ampliar el fragmento mutagénico M1. Los inventores usaron un cebador mutagénico fosforilado H2 (pGGACCATTAGGATTAGGGCACAAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 12), que codifica el sustrato de MMP GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3) y S_{168} - P_{176}) para ampliar el fragmento mutagénico M2. Después se usó el cebador F y R2 para ampliar los productos de ligación de N y M1, N y M2, respectivamente, dando como resultado los fragmentos mutagénicos L1 y L2, en los que la secuencia codificante para el sitio de furina (RKKR_{167}; SEC ID Nº: 1) se reemplazaron por la secuencia de sustrato de las MMP GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3), respectivamente. Las digestiones con HindIII/Pstl de L1 y L2, que incluyen los sitios de mutación, se clonaron entre el sitio HindIII y Pstl de pYS5. Los plásmidos de expresión resultante se llamaron pYS - PA - L1 y pYS - PA - L2, sus productos de expresión, las proteínas mutadas de PA, se nombraron en consecuencia PA - L1 y PA - L2.

Expresión y purificación de WT - PA, PA y PA - L2

Para expresar WT PA, PA - L1 y PA - L2, los plásmidos de expresión pYS5, pYS - PA - L1 y pYS - PA - L2 se transformaron en una cepa no virulenta B. anthracis UM23C1 - 1, y se crecieron en medio de FA (Singh, Y., et al., J. Biol Chem, 264: 19103 - 19107 (1989)) con 20 \mug/ml de canamicina durante 16 horas a 37ºC, las proteínas de PA se purificaron mediante precipitación con sulfato amónico seguido de cromatografía en columna monoQ (Pharmacia Biotech), como se ha descrito previamente (Varughese, M., et al., Infect Immun, 67: 1860 - 1865 (1999)).

Escisión in vitro de WT - PA, PA y PA - L2 mediante furina, MMP - 2 y MMP - 9

Para analizar si PA - L1 y PA - L2 tenían la capacidad de procesarse mediante la MMP - 2 y la MMP - 9 en lugar de la furina, se realizó la escisión in vitro de WT - PA, PA - L1 y PA - L2. Para la escisión por furina, un volumen de 50 \mul de reacción en PBS, pH 7,4, HEPES 25 mM, EDTA 0,2 mM, EGTA 0,2 mM, 100 \mug/ml de ovoalbúmina, CaCl_{2} 1,0 mM, MgCl_{2}, incluyendo 5 \mug de WT - PA, PA - L1 y PA - L2, respectivamente. La digestión se comenzó mediante la adición de 0,1 \mug de forma soluble de furina y se incubó a 37ºC, se retiraron alícuotas (5 \mul) a diferentes momentos. La escisión se detectó mediante transferencia de western con un anticuerpo anti - PA. Para transferencia de western, las alícuotas de las muestras se separaron mediante PAGE usando gel de Tris - glicina en gradiente 10 - 20% (Novex, San Diego, CA) y se electrotransfirió a una membrana de nitrocelulosa (Novex, San Diego, CA). La membrana se bloqueó con 5% (p/v) de leche no grasa y se hibridó usando anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5308). La mancha se lavó y se incubó con un anticuerpo anti - conejo de cabra conjugado a HPR (sc - 2004, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) y se visualizó mediante sustrato estabilizado por TMB para HRP (Promega, Madison, WI). Para la escisión por MMP - 2 y MMP - 9, se incubaron 5 \mug de cada uno de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 con 0,2 \mug de NEAP - 2 activa o 0,2 \mug de MMP - 9 activa, respectivamente en 50 \mul de reacciones que incluyen HEPES 50 mM pH 7,5, CaCl_{2} 10 mM, NaCl 200 mM, Brij al 0,05% (v/v) y ZnSO_{4} 50 \muM. Se retiraron alícuotas (5 \mul) a diferentes momentos y se analizaron mediante transferencia de western con anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5308) como se ha descrito anteriormente.

Células y medio de cultivo

Se obtuvieron células Vero, células COS - 7, células HT 1080 de fibrosarcoma humano y células MDA - MB - 231 de cáncer de mama humano en ATCC (Rockville, Maryland). Todas las células se desarrollaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con glucosa al 0,45%, suero fetal bovino al 10%, glutamina 2 mM. Las células se mantuvieron a 37ºC en un incubador con CO_{2} al 5%. Las células se disociaron con una solución de tripsina al 0,05%, EDTA al 0,02%, fosfato sódico 0,01 M, pH 7,4, y se subcultivaron usualmente a una relación de división de 1:4.

Preparación de extractos celulares y medios de condición para zimografía sobre gelatina

Las células se cultivaron en un matraz de 75 cm^{2} hasta 80 - 10% de confluencia a 37ºC en DMEM suplementado con FCS al 10%. Después las células se lavaron dos veces con DMEM exento de suero para retirar FCs residual, y se lisaron durante 10 minutos sobre hielo con 1 ml/matraz de Triton X - 100 al 0,5% (v/v) en Tris - HCl 0,1 M, PH 8,0, y se rasparon con un "rubber policeman" (tira de goma elástica) de caucho. Los lisados celulares se centrifugaron a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC, las concentraciones de las proteínas se determinaron mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (PIERCE, Rockford, IL) y se ajustaron hasta 1 mg/ml mediante tampón de lisis. Para la recogida del medio reacondicionado, las células se incubaron durante 24 horas con 4 ml (matraz de DMEM exento de suero. Los sobrenadantes del cultivo se cosecharon y los desechos celulares se retiraron mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Los lisados celulares y medio reacondicionado se congelaron a -70ºC o se trataron inmediatamente para análisis zimográfico.

Zimografía sobre gelatina

Los extractos celulares (1 mL) o medio reacondicionado normalizados hasta concentraciones de proteínas del correspondiente extracto celular (3 - 4 ml) se incubaron a 4ºC durante 1 hora en un mezclador de tambor vertical con 50 \mul de gelatina - sefarosa 4B (Pharmacia Biotech AB) equilibrados con Tris - HCl 50 mM, CaCl_{2} 5 mM, Twenn - 20 al 0,02% (v/v), EDTA 10 mM, pH 7,5. Después de cuatro lavados con 1 ml de tampón de equilibrio que contenía NaCL 200 mM, las perlas se resuspendieron en 30 \mul de tampón de muestra no reductor 4X, centrifugado para recogen los sobrenadantes y se cargaron en gel de zimograma de gelatina al 10% (Novex, san Diego, CA). Después de la electroforesis, el gel se sumergió en tampón renaturalizante (Novex, San Diego, CA) durante dos veces con 30 minutos cada una para renaturalizar las gelatinasas a temperatura ambiente. Después el gel se equilibró en tampón de desarrollo (Novex, San Diego, CA), que añadió otra vez un catión de metal divalente requerido para la actividad enzimática, primero durante 30 minutos a temperatura ambiente y después en tampón nuevo a 37ºC durante toda una noche. Después el gel se tiñó durante una noche con azul brillante Commassie R - 250 al 0,5% (p/v) en metanol al 45% (v/v), ácido acético al 10% y desteñido en la misma solución sin tiente.

Ensayo de citotoxicidad con MTT

La citotoxicidad de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 a las células de ensayo de realizó en placas de 96 pocillos. Las células se sembraron apropiadamente en placas de 96 pocillos de manera que alcanzaron 80 a 100% de confluencia el día siguiente. Las células se lavaron dos veces con DMEM exento de suero para retirar el FCS residual. Después se diluyeron en serie WT - PA, PA - L1 y PA - L2 (entre 0 y 1000 ng/ml) combinado con FP59 (50 ng/ml) en DMEN exento de suero se añadieron a las células para proporcionar un volumen total de 200 \mul/pocillo. Un grupo de células se expusieron a las toxinas durante 6 horas, después se retiraron la toxinas y se reemplazaron con DMEM reciente suplementado con FCS al 10%. Para evaluar la acción citotóxica de FP59 se depende de la inhibición de la síntesis de proteínas inicial mediante EF - 2 que ribosila ADP y usualmente necesita 24 - 48 horas para mostrar la toxicidad, la citotoxicidad se dejó desarrollar durante 48 horas. Después esa viabilidad celular se ensayó añadiendo 50 \mul de 2,5 mg/ml de MTT bromuro de (3-[4,5-dimettiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio. Las células se incubaron con MTT durante 45 minutos a 37ºC, las células vivas oxidaban el MTT hasta un tinte azul precipitaban en citosol mientras las células muertas permanecía decoloradas. Después el medio se retiraba y el precipitado azul se solubilizaba con 100 \mul/pocillo de SDS al 0,5% (p/v), HCl 25 mM, en isopropanol al 90% (v/v). Las placas se agitaron en un aparato vortex y la intensidad de la MMT oxidada se leyó a 570 nm usando el lector de microplacas. Otro grupo de células se expuso a las toxinas durante 48 horas en DMEM exento de suero, después la viabilidad se determinó mediante ensayo de citotoxicidad con MTT como se ha descrito anteriormente.

Ensayo de citotoxicidad en el modelo de co - cultivo

Los inventores diseñaron un modelo de co - cultivo para imitar la condición in vivo para verificar PA - L1 y PA - L2 mataban específicamente las células tumorales que expresan las MMP, no las células que no expresan las MMP. Las células Vero, HT 1080, A2058 y MD - MB - 231 se cultivaron en las diferentes cámaras del portaobjetos de 8 cámaras (Nalge Nunc Internacional, Naperville, IL) hasta 80 - 100% de confluencia. Después la s células se lavaron dos veces con DEMEM exento de suero, se retiró la partición de la cámara, y el portaobjetos se puso en una placa de cultivo petri con medio exento de suero, de manera de las células diferentes estaban en el mismo ambiente de cultivo. PA, PA - L1 o PA - L2 (300 ng/ml) cada una más FP59 (50 ng/ml), o FP59 (50 ng/ml) solo se añadieron a las células y se incubaron hasta 48 horas. Después se añadió MTT (0,5 mg/ml) durante 45 minutos a 37ºC, la partición se remontó, la MTT oxidada se disolvió como se ha descrito anteriormente para determinar la viabilidad celular para cada
cámara.

Unión de células y ensayo de procesamiento de WT - PA, PA - L1 y PA - L2

Se ensayó la unión y procesamiento de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 sobre la superficie de células Vero y células HT 1080. Las células Vero y HT1080 se desarrollaron en una placa de 24 pocillos hasta 80 - 100% de confluencia y se lavaron dos veces con DMEM para retirar FCS residual. Después las células se incubaron con 1000 ng/ml de WT - PA, PA - L1 y PA - L2, respectivamente, durante un período de tiempo diferente (0, 10 min, 40 min, 120 min y 360 min) a 37ºC en DMENM exento de suero. Después las células se lavaron para retirar las proteínas de PA no unidas. Las células se lisaron en 100 \mul/pocillo de tampón de lisis RIPA modificado (Tris - HCl 50 mM, pH 7,4, NP40 al 1%, desoxicolato sódico 0,25, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMFS 1 mM. 1 mg/ml de cada uno de aprotinina, leupeptina y pepstatina sobre hielo durante 10 minutos. Se separaron cantidades iguales de proteína a partir de los lisados celulares mediante PAGe usando geles de Tris - glicina de gradiente 10 - 20% (Novex, San Diego, CA). Después de transferir a membranas de nitrocelulosa, se realizó bloqueo con lecha no grasa al 5%. La transferencia de western usó anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5308). La mancha se lavó y se incubó con un anticuerpo

\hbox{anti -}

conejo de cabra conjugado por HPR (sc - 2004) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) y se visualizó mediante EL (PIERCE, Rockford IL). Construcción y transfección de MT1 - MMP en células COS – 7

El ADNc de MT1 - MMP era un regalo generoso de J. Windson, AB. El vector de expresión de mamíferos pEGFPN1 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), se usó para condensar el extremo C de MT1 - MMP al extremo N de EGFP (variante cambiada a rojo de la proteína fluorescente verde). La secuencia que codifica MT1 - MMP se aisló con Tht III y después se llenó con Pfu y se insertó en el sitio SmaI de pEGFPN1. Las células

\hbox{COS
-}

7 (2 x 10^{5} por placa) se trasnfectaron con vectores de expresión (2 \mug) por medio de SuperFect (10 ml) (Qiagen). Las células se incubaron durante 3 horas con complejo ADN - SuperFect en presencia de suero y medio que contiene antibiótico. El complejo que contiene medio se retiró y las células se crecieron en suero fresco que contenían medio durante 48 horas. Después de esto las células se desarrollaron en G418 (Life Technologies, Inc) que contenía medio. Las células que expresan la proteína de fusión MT1 - MMP/GFP, llamada COSgMT1, se distribuyeron a partir de células que no se expresan mediante flujocitometría con un FACstar Plus (Becton Dickinson), excitación a
488 nm. B. Resultados Generación de mutantes de PA que se activaron mediante las MMP

La estructura cristalina de PA mostró que el sitio de escisión por furina RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) está en el medio de una superficie flexible, bucle expuesto a disolvente compuesto de aa 162 - 175 (Petosa, C., et al., Nature, 385: 833 - 838 (1997)). La escisión en este bucle por las proteasas de tipo furina es esencialmente para toxicidad. Para construir mutantes de PA específicamente tratados por las MMP, especialmente la MMP - 2 y al MMP - 9, en lugar del sitio de furina RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplazó por las secuencias favoritas de las MMP - 2 y MMP - 9, GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3), respectivamente, dando como resultados dos mutantes, PA - L1 y PA - L2 (Fig. 1a). Estos dos octapéptidos de sustrato de MMP se diseñaron basándose en los estudios de Netzel - Arnett et al., J. Biol. Chem. 266: 6747 - 6755 (1991); Netzel - Arnett S., et al., Biochemistry, 32:
6427 - 6432 (1993)), en los que la especificidad de secuencia de MMP - 2, MMP - 9, matrilisina, MMP - 1 y MMP - 8 humanas se han examinado midiendo la velocidad de hidrólisis de aproximadamente 50 oligopéptidos sintéticos. Estos dos octapéptidos son sustratos favoritos de las MMP - 2 y MMP - 9, pero se superponen a otras especies de MMP (Netzel - Arnett, S., et al., J. Biol. Chem. 266: 6747 - 6755 (1991): Netzel - Arnett S., et al., Biochemistry, 32:

\hbox{6427
-}

6432 (1993)). Éstos también son sustratos potenciales para MTI - MMP (Hill, H., et al., J. Biol. Chem, 271:

\hbox{17119 -}

17123 (1996)). Las secuencias que codifican PA - L1 y PA - L2 se construyeron mediante PCR de superposición, se clonaron en vector de transferencia de E. coli - Bacillus pYS5, y se expresó eficazmente en Bacillus antthracis UM23C1. Los productos de expresión se secretaron en los sobrenadantes del cultivo y alcanzaron hasta 20 a 50 mg/l. Estas dos proteínas mutantes de PA se purificaron toscamente mediante precipitación por sulfato de amonio seguido de cromatografía mono Q. Las proteínas de PA mutadas purificadas PA - L1 y PA - L2 se comportaron como

\hbox{WT -}

PA en SDS - PAGE, pero migraron más rápido que WT - PA en gel nativo debido a los cuatro residuos cargados positivamente RKKR (SEC ID Nº 1) del sitio de furina se reemplazaron en los octapéptidos de MMP no cargados (datos no mostrados).

\vskip1.000000\baselineskip

Para caracterizar WT - PA y estos dos mutantes de PA en susceptibilidad a proteasas, se sometieron a la escisión con la furina de forma soluble, MMP - 2 y MMP - 9 de forma activa in vitro. WT - PA era muy sensible a furina, pero resistente completamente a MMP - 2 y MMP - 9 (Fig. 1b). Por el contrario, PA - L1 y PA - L2 eran completamente resistentes a furina, pero no conseguían la nueva característica de procesarse eficazmente en dos fragmentos, PA63 y PA20, mediante MMP - 2 y MMP - 9 (Fig. 1 c y 1 d). No había ninguna diferencia evidente entre los dos mutantes con relación a los patrones de procesamiento por la furina, MMP - 2 y MMP - 9. Sin embargo, parecía que las PA - L1 y PA - L2 se procesaban más eficazmente mediante la MMP - 2 que mediante la MMP - 9.

PA - L1 y PA - L2 mataban las células tumorales que expresan las MMP pero no las células que no expresan las MMP

Para analizar la hipótesis de que las PA - L1 y PA - L2 solamente matan las células tumorales que expresan las MMP, pero no las células que no expresan las MMP, tres líneas ce células tumorales humanas, HT 1080 de fibrosarcoma, A2058 de melanoma y MDA - MB - 231 de cáncer de mama, y una línea de células no tumorales Vero, se emplearon en ensayo de citotoxicidad. La zimografía sobre gelatina mostró que HT 1080 expresaba tanto MMP - 2 como MMP - 9, A2058 solamente expresaba MMP - 2, MDA - MB - 231 solamente expresaba MMP - 9, en ambos medios exentos de suero reacondicionados y los extractos celulares, que reflejan las gelatinasas expresadas por estas tres líneas de células tumorales se secretaron en el medio y también se pueden asociar con la superficie celular (Fig. 2). Por el contrario, las células Vero tenían muy pocos antecedentes de expresión de MMP (Fig. 2).

La citotoxicidad de WT - PA y los mutantes de PA a estas células se realizaron sobre placas de 96 pocillos. Cuando las células se desarrollaron hasta 80 - 100% de confluencia, concentraciones diferentes (entre 0 y 1000 ng/ ml) de
WT - PA, PA - L1 y PA - L2 combinadas con FP59 (constante a 50 ng/ml) se añadieron separadamente a las células y se expusieron las células durante 6 horas y 48 horas. Para la citotoxicidad dependiente de FP59 depende de la inhibición de la síntesis de las proteínas iniciales mediante la ribosilación de EF - 2, la citotoxicidad se dejó que se desarrollara durante 48 horas. La CE_{50} (concentración necesaria para matar la mitad de las células) de PA y los mutantes de PA se resumen en la tabla 1. La figura 3 a mostró que las células Vero que no expresan las MMP eran completamente resistentes a PA - L1 y PA - L2, pero muy sensibles a PA de tipo salvaje de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, las PA - L1 y PA - L2 cortadas por la MMP - 2 in vitro mataban eficazmente las células Vero incluso 6 horas de exposición a toxina de una manera dependiente de la dosis (Fig. 3 b), demostrando la no toxicidad de PA - L1 y PA - L2 a las células Vero pierden la capacidad de procesarlas en la forma activa PA63. Los inventores muestran más tarde (en la Fig. 7) que WT - PA, PA - L1 y PA - L2 se unen rápidamente a las células Vero, pero solamente WT - PA se pueden procesar por las células Vero a la forma activa PA63, mientras PA - L1 y PA - L2 no. Al contrario que las células Vero, las células tumorales que expresan las dos MMP, Ht 1080, A2058 y MDA - MB - 231, eran completamente susceptibles a WT - PA así como PA - L1 y PA - L2 (Fig. 4a, 4b y 4c), y la sensibilidad a estos mutantes PA parecían correlacionarse directamente con los niveles de expresión global de las MMP de estas células tumorales (Fig. 2).

\newpage

TABLA 1

1

Para demostrar adicionalmente que la citotoxicidad de los mutantes de PA a las células tumorales era dependiente de la actividad de las MMP expresada por las células diana, los inventores caracterizaron los efectos de los inhibidores de MMP bien descritos, BB94 (Batimastat), BB - 2516 (Marimastat)), y GM6001, sobre la citotoxicidad de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 a las células HT 1080. Todos estos inhibidores de las MMP, especialmente GM6001, conferían una clara protección a las células HT 1080 frente a la exposición con PA - L1 y PA - L2 más FP59, pero no protegían las células contra WT - PA más FP59 (Fig. 5). Así pues, la muerte de las células tumorales mediante PA - L1 y PA - L2 eran realmente dependientes de la actividad de las MMP expresadas por las células diana.

PA - L1 y PA - L2 mataban específicamente las células tumorales que expresan las MMP en un modelo de co - cultivo

Los inventores diseñaron un modelo de co - cultivo para imitar la condición in vivo para verificar si PA - L1 y PA - L2 específicamente matan las células tumorales que expresan las MMP, no las células que no expresan las MMP. Las células Vero, HT 1080, MDA - MB - 231 y A2058 se cultivaron en las cámaras diferentes de portaobjetos de 8 cámaras. Cuando las células alcanzaron la confluencia, se retiró la partición de la cámara y el portaobjetos se puso en una placa de cultivo petri con medio exento de suero, de manera que las células diferentes estaban en el mismo ambiente de cultivo. PA - L1 o pA - L2 (300 ng/ml) más FP59 (50 ng/ml), o FP59 (50 ng/ml) solo se añadieron separadamente a las células y se incubaron durante 48 horas para ensayo de fototoxicidad como se describe en materiales y procedimientos. Los resultados mostraban que WT - PA mataba no selectivamente todas las células, mientras que PA - L1 y PA - L2 solamente mataban las células HT 1080, MDA - MB - 231 y A2058, pero no dañaban las células Vero que no expresaban las MMP (Fig. 5). Este resultado definía las contribuciones relativas de las MMP asociadas a membranas frente a las solubles, indicaban que el procesamiento de activación de los mutantes de PA principalmente sucedía sobre la superficie de las células tumorales en lugar de en el sobrenadante. La unión y procesamiento de WT - PA, PA - L1 y PA - L2 sobre la superficie de las células Vero que no expresan las MMP y las células HT 1080 que expresan las MMP estaban también directamente determinadas. Las células Vero y HT 1080 se incubaron con WT - PA, PA - L1 y PA - L2 durante 0, 10 minutos, 40 minutos, 120 minutos y 360 minutos a 37ºC, respectivamente. Después las células se lavaron y los lisados celulares se prepararon para análisis de trasnferencia de western para comprobar la transformación de
WT - PA y mutantes de PA a la forma activa PA63. Los datos mostraban que WT - PA y PA - L2 se podían detectar en los lisados de las células Vero y HT 1080 tan pronto como 10 minutos después de la incubación, demostrando que
WT - PA y los mutantes de PA se podían unir rápidamente a la superficie celular (Fig. 7a, 7b). WT - PA se procesó mediante ambas de estas dos líneas celulares. En contraste, PA - L1 y PA - L2 solamente se trataban mediante las células HT 1080 que expresan las MMP pero no las células Vero que no expresan las MMP (Fig. 7a, 7b), siendo consistente con los resultados previos que PA - L1 y PA - L2 se podían tratar a las MMP (Fig. 1b y 1c) y selectivamente mataban las células tumorales que expresan las MMP (Fig. 6). Sin embargo las células HT 1080 procesaron WT - LA, PA - L1 y PA - L2, pero los resultados mostraban que las células procesaron WT - PA más eficazmente que PA - L1 y PA - L2 (Fig. 7b), que reflejan la actividad de las proteasas de tipo furina era más alta que las MMP sobre la superficie celular. Los inventores también analizaron que el estatus de procesamiento de PA - L1 y PA - L2 en los sobrenadantes de cultivo de las células HT 1080, y no se puede detectar su forma activa PA63 en los sobrenadantes de cultivo durante toda la noche, pero cuando pasa el tiempo los productos de descomposición al azar aparecían (datos no mostrados).

MT1 - MMP jugaban un papel en la activación de PA - L1 y PA - L2

El análisis zimográfico mostraba que las células COS - 7 expresaban cantidades muy insignificantes de gelatinasas (Fig. 8a inserción). Así pues, justo como se esperaba, las células COS - 7 eran resistentes a PA - L1 y PA - L2 más FP59, pero susceptible a WT - PA más FP59 (Fig. 8a). Para examinar el papel de MT1 - MMP en la activación de
PA - L1 y PA - L2, que codifican la secuencia de MT1 - MMP se transfectó en células COS - 7, dando como resultado un COSgMT1 transfectante estable en dicha expresión de MT1 - MMP se detectó mediante transferencia de western (Fib. 8b inserción). En contraste a las células COS - 7, COSgMT1 de hizo más sensible a PA - L1 y PA - L2 (Fig. 8b), indicando que MT1 - MMP jugaban un papel en la activación de estos mutantes de PA, bien mediante procesamiento directo de los mutantes de PA unidos a las células, o mediante una forma indirecta que activaban pro - MMP - 2 u otras MMP primero, que a su vez trataban los mutantes de PA a sus forma activa PA_{63}. Parecía improbable la última, para las células COS - 7 expresaban una cantidad insignificante de las MMP.

Ejemplo II Construcción de PA mutante con sitios de escisión de metaloproteinasas de matriz

Las proteínas de PA mutantes se construyeron y se ensayaron como se describe en el ejemplo I, sustituyendo uno de los siguientes sitios de escisión de activador de plasminógeno de la tabla 2 para los sitios de escisión de las MMP descritos anteriormente. Las genotecas de visualización de fago se usaron para identificar secuencias que tenían especificidad para una proteasa particular (véase, por ejemplo, Coombs et al., J. Biol. Chem. 273: 4323 - 4328 (1998); Ke et al., J. Biol. Chem. 272: 20456 - 20462 (1997); Ke et al., J. Biol. Chem. 272: 16603 - 16609 (1997)). Estas genotecas se pueden usar por los expertos en la técnica para seleccionar secuencias reconocidas específicamente por MMP y las proteasas activadoras de plasminógenos.

TABLA 2

2

Ejemplo III Construcción de PA mutante con sitios de escisión de activadores de plasminógeno A. materiales

Las enzimas para la manipulación y modificación de ADN se compraron en New England Biolabs (Beverly, MA). FP59 y una forma soluble de furina se prepararon en el laboratorio de los inventores como de describe (Gordon, V. M., et al., Infect. Immun., 65: 4130 - 4134 (1997)). El anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5308) se preparó en el laboratorio de los inventores. Pro - uPA (uPA de cadena sencilla, nº 107), uPA (nº 124), uPA (nº 116), fragmento amino - terminal de uroquinasa humana (ATF) (nº 146), glu - plasminógeno humano (nº 410), PAI - 1 humano (nº 1094), plasmina humana (nº 421), anticuerpo monoclonal frente a uPA N - cadena humana (nº 394) se compraron en America Diagnostica Inc (Greenwich, CT). Anticuerpo policlonal de cabra frente t - PA humana (sc - 5241) se compró en Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). El anticuerpo monoclonal de uPAR R3 fue un regalo.

Construcción de proteínas de PA mutadas

Un procedimiento de PCR de superposición modificado se usó para construir las proteínas de PA mutadas en las que el sitio de furina se reemplaza por la secuencia de sustrato fisiológico de uPA y tPA PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4) en PA - U1, secuencias favoritas de uPA PGSGRSA (SEC ID Nº: 5) y PGSGKSA (SEC ID Nº: 6) en PA - U2 y PA - U3, respectivamente, secuencia favorita de tPA PQRGRSA (SEC ID Nº: 7) en PA - U4. El plásmido pYS5 de expresión de PA (Singh, Y., et al., J. Biol. Chem, 264: 19103 - 19107 (1989)) se usó como molde. Un cebador en 5' G, AAAGGAGAACGTATATGA (SEC ID Nº: 8) (Shine - Dalgarno y codones de inicio están subrayados), y el cebador inverso fosforilado R1, pTGGTGAGTTCGAAGATTTTTGTTTTAATTCTGG (SEC ID Nº: 13) (los primeros tres nucleótidos codifican P, los otros se hibridan a la secuencia correspondiente a P_{154} - S_{163}), se usaron para ampliar un fragmento designado "N". Un cebador fosforilado mutagénico H1, pTGTCCAGGAAGAGTAGTTGGAGGAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCA G (SEC ID: 14), que codifica CPGRVVGG (SEC ID Nº: 15) y S_{168} - P_{176}, y cebador inverso R2, ACGTTTATCTCTTATTAAAAT (SEC ID Nº: 11), que se hibrida a la secuencia que codifica I_{589} -
R_{595}, se usaron para ampliar un fragmento mutagénico "M1". Un cebador mutagénico fosforilado H2, pGGAAGTGGAAGATCAGCAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 16), que codifica GSGRSA (SEC ID Nº. 17), y S_{168} - P_{176}, y el cebador inverso R2 se usó para ampliar un fragmento mutagénico "M2". Un cebagor mutagénico fosforilado H3, pGGAAGTGGAAAATCAGCAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 18), que codifica GSGKSA (SEC ID Nº: 19) y S_{168}- P_{176}, y el cebador inverso R2, se usaron para ampliar un fragmento mutagénico "M3". Un cebador mutagénico fosforilado H4, pCAGAGAGGAAGATCAGCAAGTACAAGTGCTGGACCTACGGTTCCAG (SEC ID Nº: 20), que codifica QRGRSA (SEC ID Nº: 21) y S_{168} - P_{176}, y el cebador inverso R2, se usaron para ampliar un fragmento mutagénico "M4". Los cebadores F y R2 se usaron para ampliar los productos ligados de N + M1, N + M2, N + M3 y N + M4, respectivamente, dando como resultado los fragmentos mutagenizados U1, U2, U3, y U4 en las que la secuencia codificada para el sitio de furina (RKKR_{167}; SEC ID Nº: 1) se reemplaza por sustrato uPA o tPA. Las digestiones de HindIII/Pstl de U1, U2, U3 y U4 se clonaron entre los sitios HindIII/Pstl de pYS5. Los plásmidos de expresión resultantes se llamaron pYS - PA - U1, pYS - PA - U2, pYS - PA - U3, y pYS -
PA - U4, y sus productos de expresión, las proteínas de PA mutadas, se llamaron de acuerdo a lo anterior PA - U1, PA - U2, PA - U3, y PA - U4. Un plásmido de expresión codificaba un mutante en el que RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplaza por PGG, se espera que no se escinda por ninguna proteasa. Su plásmido de expresión y producto de expresión se llamaron pYS - PA - U7 y PA - U7, respectivamente.

Expresión y purificación de PA y proteínas de PA mutadas

Para expresar PA, PA - U1, PA - U2, PA - U3, PA - U7, los plásmidos de expresión pYS5, pYS - PA - U1, pYS -
PA - U2, pYS - PA - U3, pYS - PA - U4, y pYS - PA - U7, se transformaron en la cepa no virulenta B. anthracis UM23Cl - 1 y se desarrollaron en medio FA (Shing, Y., J. Biol. Chem., 264: 19103 - 19107 (1989)) con 20 \mug/ml de canamicina durante 16 horas a 37ºC. Los productos de expresión se secretaron en los sobrenadantes de cultivo. Las proteínas de PA mutadas se concentraron y se purificaron mediante cromatografía sobre una columna MonoQ (Anersham Pharmacia Biotech, Pisactaway, NJ),como se ha descrito previamente (Varughese, M., et al., Mol. Med., 4: 87 - 95 (1998)).

Escisión in vivo de PA y proteínas de PA mutadas mediante uPA, tPA, y furina

Se incubaron mezclas de reacción de 50 \mul que contenían 50 \mug de las proteínas de PA a 37ºC con 5 \mul de furina soluble o 0,5 \mug de uPA o tPA. La escisión por furina se realizó en HEPES 25 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 0,2 mM, EGTA 0,2 mM, 100 \mug/ml de ovoalbúmina, CaCl_{2} 1,0 mM, y MgCl_{2} 1,0 mM. Se retiraron alícuotas (5 \mul) a intervalos mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida (PAGE) usando gel de Tris - glicina con gradiente 10 - 20% (Novex, San Diego, CA) y se visualizaron mediante tinción con Commassie. La escisión con uPA o tPA se hizo en NaCl 150 mM, Tris - HCl 10 mM (pH 7,5). Las alícuotas retiradas a intervalos se diluyeron 1:1000 y se separaron mediante PAGE usando gel de Tris - glicina con gradiente 10 - 20% (Novex, San Diego, CA) y se electrotransfirió a una membrana de celulosa (Novex, San Diego, CA). La escisión se valoró mediante transferencia de western con anticuerpo anti - PA de conejo. Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% (p/v), se incubó secuencialmente con anticuerpo policlonal anti - PA de conejo (nº 5308) y anticuepo anti - conejo de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (cs - 2004, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA), y se visualizó mediante ECL (Pierce, Rockford, IL).

Células y medio de cultivo

Células Vero, células Hela de adenocarcinoma de cuello uterino humano, células A2058 de melanoma humano, células Bowes de melanoma humano, y células HT 1080 de fibrosarcoma humano se obtuvieron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Virginia). Todas las células se desarrollaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) con glucosa al 0,45%, suero fetal bovino al 10%, glutamina 2 mM, y 50 \mug/ml de gentamicina. Las células endoteliales vasculares primarias humanas se obtuvieron y se cultivaron según la metodología habitual. Las células se mantuvieron a 37ºC en un ambiente de CO_{2} al 5%.

Unión y procesamiento de pro - PA mediante células cultivadas

Se cultivaron células Vero, células Hela, células A2058, y células Bowes en placas de 24 pocillos hasta confluencia, se lavaron y se incubaron en medio exento de suero con 1 \mug/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno durante 1 h, después los lisados celulares se prepararon para análisis de transferencia de western con anticuerpo monoclonal frente iPA B - cadena (nº 394).

Ensayo de citotoxicidad con MTT

Se sembraron células en placas de 96 pocillos a aproximadamente 25% de confluencia. El día siguiente, las células se lavaron dos veces con DMEM exento de suero para retirar el suero residual. Las diluciones en serie de PA, proteínas mutadas de PA (0 a 1000 ng/ml) combinadas con FP59 (ng/ml) en DMEN exento de suero (si se dirige el sistema de activación de plasminógeno de uroquinasa, se añadieron 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno) a las células para proporcionar un volumen total de 200 \mul/pocillo. En algunos experimentos, PAI - 1, se añadió 30 minutos antes de la adición de toxina. Las células se incubaron con las toxinas durante 6 horas, después de lo cual el medio se reemplazó con DMEN reciente suplementado con FCS al 10%. La viabilidad celular después se ensayó mediante la adición de 50 \mul de 2,5 mg/ml de MTT (bromuro de (3-[4,5-dimettiltiazol-2-il]-2,5- difeniltetrazolio). Las células se incubaron con MTT durante 45 minutos a 37ºC, el medio se retiró, y el pigmento azul producido por las células viables se solubilizó con 100 \mul/pocillo de SDS al 0,5% (p/v), HCl 25 mM, en isopropanol al 90% (v/v). Las placas se agitaron en aparato Vortex y el MMT oxidado se midió como A_{570} usando un lector de microplacas.

Unión y procesamiento de PA y PA - U2 por células cultivadas

Se crecieron células en placas de 24 pocillos hasta confluencia y se lavaron dos veces con DMEM exento de suero para retirar el suero residual. Después las células se incubaron con 1 \mug/ml de PA y PA - U2 a 37ºC en DMEM exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno durante diferentes período de tiempo. Cuando se ensayó PAI - 1, se incubó con células durante 30 minutos antes de la adición de proteínas de PA. Las células se lavaron cinco veces para retirar las proteínas de PA no unidas. Las células se lisaron en 100 \mul/pocillo de tampón de lisis RIPA (Tris - HCl 50 mM, pH 7,4, NP40 al 1%, Na - desoxicolato al 0,25%, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, fenilmetil sulfonil fluoruro 1 mM, 1 \mug/ml de cada uno de aprotinina, leupeptina y pepstatina) sobre hielo durante 10 minutos. Se separaron cantidades iguales de proteína de los lisados celulares mediante PAGE usando ges de Tris - glicina en gradiente al 10 - 20% (Novex, San Diego, CA). La transferencia de western para detectar PA y sus productos de escisión se realizó como se ha descrito anteriormente.

Ensayo de citotoxicidad en un sistema de co - cultivo

Se diseño un co - cultivo para imitar la condición in vivo para verificar si PA - U2 mataba las células tumorales que sobreexpresan uP AR aunque no afectaba a las células que no expresan uP AR. Se cultivaron células Vero, Hela en cámaras separadas de portaobjetos de 8 cámaras (Nalge Nunc Internacional, Naperville, IL) hasta 80 - 1005 de confluencia. Las células se lavaron dos veces con DMEM exento de suero, la partición de las cámaras se retiró, y el portaobjetos se puso en una placa de cultivo con medio exento de suero que contenía 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno, de manera que las células se bañaron en el mismo medio, PA y PA - U2 (300 ng/ml) y FP59 (50 ng/ml) se añadieron individualmente o en combinación y las células se expusieron durante 48 horas. Después MTT (0,5 mg/ml) se añadió durante 45 minutos a 37ºC, las particiones se remontaron, y el MTT oxidado en cada cámara se disolvió como se ha descrito anteriormente para determinar la viabilidad de cada tipo celular. Los lisados celulares de diferentes cámaras se prepararon también para transferencia de western para detectar las proteínas de PA y sus especies PA63 de productos de escisión.

B. Resultados Dirección de proteolisis específica a la secuencia de uPA o tPA a PA de ántrax

La estructura cristalina de PA muestra que el sitio de furina, RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1), es una bucle flexible, expuesto a la superficie compuesto de aa 162 a 175 (Petosa, C., et al., Nature, 385: 833 - 838 (1997)). La escisión en este bucle por la furina o proteasas de tipo furina es esencial para la toxicidad. Las proteínas de PA mutadas se construyeron de manera que la secuencia sensible a furina RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplace por las secuencias de sustrato ePA o tPA. En la proteína de PA mutada PA - U1, PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4), un péptido de P5 a P4' en el plasminógeno del sustrato fisiológico, se usó para reemplazar RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1). En PA - U2, RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplazó por un péptido, PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), que contenía la secuencia de consenso SGRSA (SEC ID Nº: 22) entre P3 y P2', que se identificó recientemente como el mejor sustrato minimizado para uPA (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)). Debido a que el péptido SGRSA (SEC ID Nº: 22) se escinde 1363 veces más eficientemente que un péptido control que contiene el sitio de escisión fisiológico presente en el plasminógeno mediante uPA, y muestra una selectividad uPA/tPA de 20 (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 -
20462 (1997)), PA - U2 se esperaba que fuera un sustrato favorito de uPA. La selectividad de uPA/tPA del péptido SGRSA (SEC ID Nº: 22) se puede además potenciar mediante la colocación de lisina en la posición P1 (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)), así pues, el péptido PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), que muestra una selectividad de uPA/tPA de 121 (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)), se usó para reemplazar RKKR_{167}(SEC ID Nº: 1) para construir una proteína de PA mutada, PA - U3, con incluso una actividad selectiva de uPA más alta que PA - U2. La investigación mostraba que los residuos P3 y P4 eran los determinantes primarios de la capacidad de un sustrato para discriminar entre yPA y uPA, y una mutación de tanto P4 glicina y P3 serina del sustrato de uPA más lábil (GSGRSA; SEC ID Nº: 17) a glutamina y arginina, respectivamente, disminuía la selectividad de uPA/tPA mediante un factor de 1200 y realmente convertía el péptido en un sustrato selectivo de tPA (Ke, S. H., et al., J. Biol. Chem., 272: 20456 - 20462 (1997)). Basándose en este estudio, una proteína de PA mutada, PA - U4, se construyó. PA - U4 se esperaba que fuera un sustrato favorito de tPA, en el que el péptido PQRGRSA se usó para reemplazar RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1). Una proteína de PA mutada PA - U7, también se construyó de manera que RKKR_{167} (SEC ID Nº: 1) se reemplazaba por la secuencia al azar PGG, se esperaba que no se escindiera por ninguna de las proteasas conocidas, se usó un control en este estudio. Las designaciones de las proteínas de PA mutadas junto con las propiedades esperadas se resumen en la tabla 3.

Los plásmidos que codifican estas proteínas de PA mutadas se construyeron mediante un procedimiento de PCR de superposición, se clonaron en un vector de transferencia E. coli - Bacillus PYS5, y se expresaron de manera eficaz en B. anthracis UM23C1 - 1. Los productos de expresiones secretaron en los sobrenadantes del cultivo a 20 - 50 mg/l Las proteínas mutadas de PA se concentraron y se purificaron mediante cromatografía MonoQ hasta una banda prominente en la masa molecular esperada de 83 kDA que migraba conjuntamente con PA en SDS - PAGE. Así pues, usando un protocolo de producción que es ahora patrón para PA, estas proteínas de PA mutadas se pueden expresar y purificar fácilmente, con alto rendimiento y pureza.

Para verificar que las proteínas de PA mutadas tenían la susceptibilidad esperada a las proteasas, se sometieron a escisión con una forma soluble de furina, uPA y tPA. Como se esperaba, estas proteínas de PA mutadas, habían perdido completamente la susceptibilidad a furina. Por el contrario, la PA de tipo salvaje era muy sensible a furina y procesaba la forma activa PA63 (Fig. 9a). Los perfiles de escisión de estas proteínas de PA mutadas mediante uPA y tPA eran completamente consistente con al obtenida de los sustrato de los péptidos (Fig. 9b, 9c). PA - U2 estaba escindida eficazmente por uPA, a la que seguía PA - U3. PA - U3 se puede escindir solamente mediante uPA, pero no mediante tPA, que muestra alta especificidad de uPA. Sin embargo, PA - U2 también se escindía ligeramente mediante tPA, siendo un sustrato débil para tPA. Por el contrario, PA - U4 era un sustrato muy débil para uPA, pero un buen sustrato PATRA tPA. PA - U7 así como PA - U1 eran ambos completamente resistentes a uPA y tPA. PA era completamente resistente a tPA, pero era un sustrato débil para uPA (Fig. 9b). Estos resultados implicaban PA - U2 y PA - U3 que se pueden activar selectivamente mediante uPA pueden ser útiles para dirigir el sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de las células tumorales para la terapia de tumores, mientras PA - U4 puede ser tóxica a las células que expresan tPA que usualmente se producen en neuroblastomas.

PA - U2 y PA - U3 selectivamente matan las células tumorales mediante la dirección del sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de las células tumorales

uPAR se sobreexpresa típicamente en líneas tumorales cancerosas y tejido tumorales, y es al parte central del sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de las células que es esencial a la invasión tumoral y metástasis. Para analizar la hipótesis que PA - U2 y PA - U3 matarían preferiblemente las células tumorales que sobreexpresan uPAR, se realizaron ensayos de citotoxicidad con tres líneas tumorales humanas: Hela de carcinoma de cuello de útero, A2058 de melanoma, y Bowes de melanoma. Una línea celular de mono no tumoral, Vero, se usó como control. La expresión se uPAR mediante estas tres líneas celulares tumorales pero no mediante las células Vero se evidenció mediante la unión y procesamiento de pro - uPA a ala forma activa de uPA de dos cadenas mediante estas tres células tumorales pero no mediante las células Vero. La Fig. 10 mostró que después de 1 hora de incubación con las células, pro - uPA y la forma procesada uPA de cadena B se puede detectar a partir de estos tres lisados de células tumorales pero no a partir de células Vero.

La citotoxicidad de PA y las proteínas de PA mutadas a estas células se midió en placas de 96 pocillos. En tejidos tumorales, las células tumorales sobreexpresan típicamente uPAER, mientras que las células estromales tumorales expresan pro - uPA que se une y por lo tanto se activa sobre la superficie de las células tumorales, por lo tanto, en el ensayo de citotoxididad 100 ng/ml de pro - uPA se añadió a las células tumorales para imitar el papel de las células estromales tumorales in vivo. Además, el plasminógeno es un componente importante del sistema de activación de plasminógeno, y presente a alta concentración (1,5 - 2,0 \muM) en plasma y fluidos instersticiales, que representan una fuente abundante potencial de actividad de plasmina. Por lo tanto, 1 \mug/ml de glu - plasminógeno también se añadió en el ensayo de citotoxicidad. PA y las proteínas de PA mutadas combinadas con FP59 se incubaron con las células durante 6 horas, y la viabilidad de midió después de 48 horas. Los valores de CE_{50} (concentraciones necesarias para matar la mitad de las células) para PA y las proteínas de PA mutadas se resumen en la tabla 4. Las tres células tumorales que expresan uPAR, Hela, A2058, y Bowes eran muy susceptibles a AP así como a PA - U2 y PA - U3, y menos susceptibles a PA - U4 (Fig, 11 a, b, c). Por el contrario, estas células tumorales eran completamente resistentes a PA - U1 y PA - U7 (Fig, 11 a, b, c). El orden de la citotoxicidad de proteínas de PA mutadas a estas células tumorales: PA - U2 > PA - U3 > PA - U4 >> PA - U1, PA - U7, se correlacionaban bien con el perfil de escisión de uPA mostrado en la Fig. 9b. Al contrario que las células tumorales, las células Vero que no expresan uPAR eran completamente resistentes a todas las proteínas de PA mutadas, pero sensibles a PA de una manera dependiente de la dosis (Fig 12 a). Sin embargo, PA - U2 que estaba primero cortada por uPA in vitro mataba eficazmente las células Vero (Fig. 11 b). Esto demostraba que la resistencia de las células Vero a PA - U2 era debido a la incapacidad de las células a activar proteolóticamente las proteínas mutadas PA.

También se evaluó la unión y procesamiento proteolítico de PA y PA - U2 sobre la superficie celular. Se incubaron células Vero y Hela con PA y PA - U2 durante diversos períodos de tiempos. Después de eso los lisados celulares se prepararon y se examinaron mediante transferencia de Western para detectar el estatus de unión y procesamiento de las proteínas PA a las especies PA63 activas. PA se procesó mediante ambos tipos de células, y esto no podría inhibirse por PAI - 1 (Fig. 13 a, b). Por el contrario, PA - U2 se procesó por las células Hela pero no por las células Vero, y esto se podría bloquear completamente por PAI - 1 (Fig. 13 a, b), demostrando la escisión de PA - U2 sobre la superficie de las células Hela se debía a uPA activada sobre la superficie. Aunque las células Hela procesaban proteolíticamente PA así como PA - U2, la última se escindía más lentamente aparentemente debido a que su escisión era secundaria a la activación de pro - uPA (fig. 13 b).

Para demostrar adicionalmente que la citotoxicidad de las proteínas PA mutadas era dependiente del sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de las células tumorales, se caracterizaron los efectos del inhibidor específico y bloquentes del sistema. PAI - 1 confirió fuertes protecciones a todas estas células tumorales frente a la exposición con PA - U2 más FP59, pero no protegía las células de PA más FP59 (Fig. 14 a, b, c). ATF, el fragmento amino terminal y el dominio de unión uPAR de uPA, que compite con el sitio de unión sobre uPAR con pro - uPA, protegía las tres células tumorales de PA - U2 más FP59 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 15 a). De manera similar, uPAR que bloquea el anticuerpo monoclonal R3 que específicamente interfiere la unión entre pro - UPA y uPAR, también protegía las células tumorales en los tres casos de PA - U2 más FP59 (Fig. 15 b). Estos resultados demuestran que la muerte se estas células tumorales por UP - U2 dependía del sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de las células tumorales.

Selectividad retenida de PA - U2 para las células que expresan uPAR en un modelo de co - cultivo

Se diseñó un modelo de co - cultivo para imitar las condiciones in vivo, para analizar si PA - U2 puede matar selectivamente células Hela pero no las células transeúntes. Las células Vero y Helo se cultivaron en compartimientos separados de portaobjetos de 8 cámaras. Cuando las células alcanzaron la confluencia, las particiones de la cámara se retiraron y los portaobjetos se pusieron en placas de cultivo con medio exento de suero que contiene 100 ng/ml de pro - uPA y 1 \mug/ml de glu - plasminógeno de manera que las células sobre el portaobjetos se bañaron en el mismo medio. PA y PA - U2 (cada una a 300 ng/ml) más FP59 (50 ng/ml), o FP59 solo se añadieron a las placas de cultivo y se incubaron durante 48 horas antes de medir la viabilidad. Los resultados mostraron que PA se procesó para activar PA63 y mataba ambas células, mientras PA - U2 se procesaba para activar PA63 y solamente mataba células Hela, mientras que no afectaba a las células Vero que no expresan uPAR (Fig. 16 inserción). Estos resultados mostraron que PA - U2 no se activa en el medio de cultivo de tejidos mediante uPA no unida a uPAR, ni las proteínas PA proteolíticamente activadas sobre la superficie de una célula se disocian y se vuelven a unir sobre otras células. uPA activa en el sobrenadante del cultivo no habría conducido a la muerte de células Vero, debido a que la Fig. 12 mostraba que PA - U escindida en solución se hacía tóxica.

PA - U4 era tóxica para las células que expresan tPA mientras que PA - U2 y PA - U3 no lo son

La Fig. 9 mostró que PA - U4 es un buen sustrato de tPA entre estas proteínas de PA mutadas y se espera que sean tóxicas para las células que expresan tPA. Para ensayar esta hipótesis, se realizó un ensayo de citotoxicidad sobre dos células que expresan tPA: células Bowes de melanoma y endoteliales vasculares primarias humanas (HUVEC). La expresión de tPA por estas células se evidenció mediante análisis de transferencia de Western de los sobrenadantes de cultivo usando un anticuerpo policlonal contra tPA humana (datos no mostrados). Las células se cultivaron hasta 50% de confluencia, después se realizó el ensayo de citotoxicidad en DMEM exento de suero que no contenía pro - uPA y glu - plasminógeno. Se incubaron diferentes concentraciones (entre 0 y 100 ng/ml) de PA, PA - U2, PA - U3, y PA - U4 combinadas con FP59 (50 ng(ml) con células durante 12 horas, y se midió la viabilidad después de 48 horas. Los valores de CE_{50} para las proteínas de PA se resumen en la tabla 5. PA - U4 era tóxica para las células que expresan tPA, mientras que PA - U2 y PA - U3 mostraron una toxicidad muy baja para ellas (Fig. 17 a, b y la tabla 5). Éstos y los resultados anteriores mostraban claramente que la, susceptibilidad de uPA y tPA se diferencian entre estas proteínas de PA mutadas. PA - U2 y PA - U3 que específicamente dirigen el sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de las células tumorales pueden ser muy útiles para la terapia tumoral. Mientras que PA - U4 se podrían activar mediante tPA se puede aplicar para algunos tumores de neurosistema que usualmente sobreexpresan tPA.

Discusión

Se ha acumulado evidencia creciente de que los componentes del sistema de activación de plasminógeno de uroquinasa están implicados en la proliferación de las células tumorales, invasión, y metástasis desde 1976 cuando se descubrió que uPA se producía y se liberaba de las células cancerosas (Schmitt, M., et al., Thromb. Haemost., 78:
285 - 296 (1997)). Datos recientes sugieren que los factores de invasión pueden también servir como dianas para nuevos tratamientos para prevenir invasión de cáncer y metástasis (Schmitt, M., et al., Thromb. Haemost., 78:

\hbox{285 -}

296 (1997)). Diversos y diferentes planteamientos que interfieren con la expresión o la actividad de uPA, uPAR, y PAI - 1 a nivel de genes o proteínas se ensayaron in vitro o en ratones con éxito incluyendo oligonucleótidos de polaridad opuesta, anticuerpos, inhibidores, y análogos de uPA y uPAR recombinantes o sintéticos (Schmitt, M., et al., Thromb. Haemost., 78: 285 - 296 (1997)). Sin embargo, se espera que estos planteamientos deberían solamente reducir el crecimiento de tumores, sin tener una acción citotóxica directa que podría erradicarlas células malignas. El presente estudio es el primero que explota el sistema de plasminógeno asociado a la superficie de las células tumorales para lograr la dirección selectiva de tipo celular de las proteínas de fusión de toxina bacteriana citotóxica. En este estudio, proteínas de antígeno protector (PA) de toxinas de ántrax mutadas, PA - U2, PA - U3, y PA - U4, se construyeron para que el sitio de reconocimiento por furina se reemplazara por secuencias susceptibles escindidas por uPA

\hbox{(PA -}

U2 y PA - U3) o tPA (PA - U4) más eficazmente que los péptidos control que contienen la secuencia fisiológica diana presente en el plasminógeno. Más interesante es que la susceptibilidad hacia uPA y tPA diferenciaba entre estas proteínas de PA mutadas, es decir, PA - U2 y PA - U3 se activaban principalmente por uPA, mientras que UP - U4 se activaba principalmente por tPA. Así pues, cuando se combinan con FP59, una toxina de fusión recombinante derivada del factor letal de ántrax y la exotoxina A de Pseudomonas, PA - U2 y PA - U3 mataban selectivamente las células tumorales que sobreexpresan uPAR en presencia de pro - uPA, y mientras tanto mostraban muy baja toxicidad para las células que expresan tPA tales como las células endoteliales vasculares. Debido a que tPA se secreta como una enzima activa principalmente por células endoteliales vasculares in vivo (Mann, K., et al., Annu. Rev. Biochem., 57: 915 - 956 (1988)), la diferenciación de citotoxicidad entre estas proteínas de PA mutadas a las células de expresión de uPA a tPA es tan importante que evita el daño a las células endoteliales vasculares cuando PA - U2 y PA - U3 se usan in vivo.

Las siguientes líneas de evidencia demuestran claramente que la activación proteolítica de estas proteínas de PA mutadas asociadas a uPA se produce sobre la superficie de las células tumorales que era dependiente de la actividad del sistema de activación de plasminógeno asociado a la superficie de las células tumorales: 1. Pro uPA solamente se podría unir y por lo tanto activar proteolíticamente sobre la superficie de las células tumorales que expresan uPAR pero no las células Vero que no expresan uPAR; 2. PA - U2 solamente se podrían procesar proteolíticamente a la forma activa PA63 sobre las células que expresan uP AR (tales como células Hela) pero no las células Vero que no expresan uPAR, y este procesamiento se podría inhibir completamente mediante el inhibidor específico de uPA PAI - 1; 3. La toxicidad de PA - U2 a las células tumorales se eliminó mediante el reactivo de bloqueo específico de uPAR ATF, el anticuerpo de boqueo de uPAR R3, y PAI - 1, demuestran que la activación de PA - U2 dependía enteramente de la activación de pro - uPA sobre la superficie de las células tumorales; 4. los ensayos de citotoxicidad en un modelo de co - cultivo, en el que las células eran igualmente accesibles a las toxinas en el sobrenadante, mostraban que PA - U2 mataba solamente las células Hela que sobreexpresan uPAR y no las células Vero transeúntes, demostrando que al activación las proteínas de PA mutadas activadas por uPA se producían principalmente sobre las superficies de las células, debido a que la forma activa de las proteínas de PA en solución también podrían matar las células Vero.

Las proteínas de PA se unen a las células rápidamente y con alta afinidad (Kd aproximadamente 1 nM), por lo tanto, incluso a bajas concentraciones de PA, los receptores de PA estarán altamente ocupados. Como resultado, si hubiera cualquier PA que se llegara a activar en el sobrenadante o disociarse de una célula después de la escisión sería incapaz de localizar un receptor libre mediante el cual se uniera a las células e internalizase FP59.

Así pues, la citotoxicidad de estas citotoxinas se dirigirá selectivamente a las células tumorales que sobreexpresan uPAR. PA - U4, que se podrían activar por tPA, se puede aplicar para terapia intratumoral de algunos tumores de neurosistemas no reseccionable que usualmente sobreeexpresan tPA.

Las citotoxinas selectivas de células tumorales se han creado reemplazando los dominios de reconocimiento del receptor de proteína bacteriana y vegetal con citoquinas, factores de crecimiento, y anticuerpos (Kreitman, R. J., Curr,. Opin. Immunol., 11: 570 - 578 (1999). Las toxinas proteicas usadas contienen un dominio enzimático que actúa en el citosol para inhibir la síntesis y un dominio que logra la traslocación de este catalizador desde un compartimiento vesicular al citosol, así como el dominio de dirección de células que se reemplaza o altera de manera que se logra la especificidad de las células tumorales. Ciertas de estas "inmunotoxinas" derivadas de toxina de difteria, exotoxina A de Psedomonas, y ricina han mostrado eficacia y se han aprobado para uso clínico. Sin embargo, un problema recurrente con estos materiales es que las dosis terapéuticas dañan típicamente otros tejidos y células (Frankel, A. E., et al., Semen. Cancer. Biol., 6: 307 - 317 (1995)). Esto no es sorprendente debido a que muy pocos de los receptores superficiales de las células tumorales o antígenos que están dirigidos están totalmente ausentes en el tejido normal. Por lo tanto, incluso en los mejores casos, alguna captación de toxina se producirá en células transeúntes normales. Debido a que estas toxinas actúan catalíticamente, incluso una pequeña cantidad de la toxina internalizada pueden dañar seriamente el tejido normal. Incluso una sola molécula administrada al citosol puede matar una célula (Yamaizumi, M., et al., Cell, 15: 245 - 250 (1978)). Esfuerzos previos para desarrollar proteínas de fusión de toxinas de ántrax como agentes terapéuticos se han centrado sobre la modificación del dominio 4, el dominio de unión de receptor de PA. El trabajo está en curso para crear agentes citotóxicos específicos del tipo celular mediante la modificación o reemplazo del dominio 4 para dirigir PA que alternen receptores (Varughese, M., et al., Mol. Med., 4: 87 - 95 (1998); Varughese, M., et al., Infect. Immun., 67: 1860 - 1865 (1999). Este trabajo sigue el ejemplo del desarrollo de inmunotoxinas a partir de otras toxinas proteicas (Kreitman, R. J., Cuu. Opin, Immunol., 11: 570 - 578 (1999)). Los inventores sugieren que combinando dos estrategias de dirección conceptualmente distintas en una proteína de PA individual producirá agentes que tienen índices terapéuticos superiores. Una proteína que está tanto redirigida a una proteína de la superficie de las células tumorales y dependiente del sistema de activación de plasminógeno de la superficie celular para la activación pueden lograr efectos terapéuticos mientras están libres de los efectos secundarios observados con muchos de las inmunotoxinas existentes.

TABLA 3

3

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TABLA 4

4

TABLA 5

5

Claims (20)

1. Un procedimiento in vitro de dirección de un compuesto a una célula que sobreexpresa un activador de plasminógeno, el procedimiento comprendiendo las etapas de:

(i)

administrar a la célula una proteína de antígeno protector de Bacillus anthracis mutante que comprende un sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno en lugar del sitio de escisión reconocido por la furina del antígeno protector nativo, en la que el antígeno protector de Bacillus anthracis mutante está escindido por un activador de plasminógeno; y

(ii)

administrar a la célula un compuesto que comprende un polipéptido de factor letal de Bacillus anthracis que comprende un sitio de unión del antígeno protector; en el que el polipéptido del factor letal de Bacillus anthracis se une al antígeno protector escindido y se trasloca en la célula, por lo tanto distribuyendo el compuesto a la célula.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el activador de plasminógeno se selecciona entre el grupo constituido por t - PA y u - PA.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno se selecciona entre el grupo constituido por PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4), PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), y PQRGRSA (SEC ID Nº: 7).

4. El procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la célula es una célula cancerosa.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el cáncer se selecciona entre el grupo constituido cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, cáncer de pleura, cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de cuello de útero, cáncer de colon, fibrosarcoma, neuroblastoma, glioma, melanoma, leucemia monocítica, y leucemia mieloide.

6. El procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la célula es una célula inflamatoria.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido de factor letal es factor letal nativo.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el compuesto es factor letal nativo.

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido de factor letal está unido a un compuesto heterólogo.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el compuesto es la toxina disentérica, una cadena de toxina de difteria, o la exotoxina A de Pseudomonas.

11. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el compuesto es un resto detectable.

12. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el compuesto es un ácido nucleico.

13. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el compuesto está unido de manera covalente a un factor letal mediante un enlace químico.

14. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que el compuesto heterólogo está unido de manera recombinante al factor letal.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el compuesto es un agente de diagnóstico o terapéutico.

16. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula es una célula humana.

17. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteína del antígeno protector mutante es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión receptor heterólogo.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que el dominio de unión receptor heterólogo se selecciona entre el grupo constituido por un anticuerpo de cadena sencilla y un factor de crecimiento.

19. Una proteína de antígeno protector mutante aislado que comprende un sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno en lugar del sitio de escisión reconocido por la furina de antígeno protector nativo, en el que el antígeno protector mutante de Bacillus anthracis está escindido por un activador de plasminógeno.

20. La proteína según la reivindicación 19, en la que el sitio de escisión reconocido por el activador de plasminógeno se selecciona entre el grupo constituido por PCPGRVVGG (SEC ID Nº: 4), PGSGRSA (SEC ID Nº: 5), PGSGKSA (SEC ID Nº: 6), PQRGRSA (SEC ID Nº: 7), GPLGMLSQ (SEC ID Nº: 2) y GPLGLWAQ (SEC ID Nº: 3).