ES2232821T3

ES2232821T3 - Mono- y poli-antigenos recombinados para la deteccion del igm especifico del citomegalovirus en los sueros humanos por dosificado inmuno-enzimatico.

Info

Publication number: ES2232821T3
Application number: ES95918148T
Authority: ES
Inventors: Maria Paola Landini; Alessandro Ripalti; Gregory T. Maine; Richard T. Flanders
Original assignee: LANDINI MARIA; Abbott Laboratories
Current assignee: LANDINI MARIA; Abbott Laboratories
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-05-15
Publication date: 2005-06-01
Anticipated expiration: 2015-05-15
Also published as: DE69533442T2; EP0769057B1; ATE275201T1; EP0769057A1; AU2418895A; DE69533442D1; JP3907204B2; JPH10502253A; ITTO940543A1; US6074817A; ITTO940543A0; IT1266740B1; WO1996001321A1

Abstract

SE DESCRIBE UNA MEZCLA DE MATERIALES PROTEICOS MONO Y POLIEPITOPES RECOMBINANTES CAPACES DE SUSTITUIR COMPLETAMENTE LOS ANTIGENOS VIRALES CUANDO SE UTILIZAN EN UN INMUNOENSAYO DE ENZIMA (EIA); LA MEZCLA INCLUYE UNA PROTEINA DE FUSION DE POLI-EPITOPE QUE TIENE UNA PRIMERA REGION FORMADA POR UNA SECUENCIA DE AMINOACIDO (H10) CORRESPONDIENTE A LA DE LOS ULTIMOS 233 AMINOACIDOS DEL TERMINO COOH DE LA PROTEINA VIRAL P52 O A UNA PARTE DE LA MISMA, UNA SEGUNDA REGION FORMADA POR UNA SECUENCIA DE AMINOACIDO (F3) CORRESPONDIENTE A LA DE LOS ULTIMOS 43 AMINOACIDOS DEL TERMINO COOH DE PROTEINA VIRAL PP150 O A UNA PARTE DE LA MISMA, Y UNA TERCERA REGION FORMADA POR UNA SECUENCIA DE AMINOACIDO (A1C2) CORRESPONDIENTE A LA TOMADA DE AA 595 A AA 614, PROCEDIENDO EN DIRECCION 5''-->3'', DE LA MISMA PROTEINA VIRAL PP150; Y, EN COMBINACION, UNA SEGUNDA PROTEINA DE FUSION QUE INCLUYE UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS CORRESPONDIENTES A LOS TOMADOS, PROCEDENTES EN DIRECCION 5''-->3'' DE AA 297 A AA 510 DE LA PROTEINA DEMATRIZ PRINCIPAL VIRAL PP65 CODIFICADA POR EL GEN VIRAL UL83 Y UNA TERCERA PROTEINA DE FUSION QUE INCLUYE UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS CORRESPONDIENTES A LOS TOMADOS, PROCEDENTES EN DIRECCION 5''-->3'' DE AA 117 A AA 373 DE LA PROTEINA DE SEMEJANZA VIRAL PP38 CODIFICADA POR EL GEN VITAL UL80A. ESTAS TRES PROTEINAS DE FUSION PUEDEN SER UTILIZADAS COMBINADAS PARA LA PREPARACION DE UN KIT DE PRUEBA ELISA PARA DETECCION DE IGM DE CYTOMEGALOVIRUS ESPECIFICO EN SUERO HUMANO.

Description

Mono- y poli-antigenos recombinados para la detección del IgM específico del citomegalovirus en los sueros humanos por dosificado inmuno-enzimático.

Campo técnico

La presente invención se refiere a materiales proteicos recombinantes útiles como antígenos artificiales mono y poliepitópicos capaces de detectar inmunoglobulinas específicas del CMVH en sueros humanos, especialmente IgM, en lugar de viriones purificados. En particular, la invención se refiere a la utilización conjunta de tres proteínas de fusión diferentes obtenidas por métodos recombinantes, una primera que incluye epítopos muy inmunogénicos procedentes ambos de la proteína vírica no estructural, de unión a ADN, de 52 kD (pp52) y de la fosfoproteína estructural de 150 kD (pp150), una segunda que incluye un epítopo inmunogénico de la proteína de la matriz principal del citomegalovirus humano (CMVH), a saber la proteína vírica de 65 kD (pp65) codificada por el gen UL83 del virus, y una tercera que incluye un epítopo inmunogénico de la proteína de ensamblaje de 38 kD (pp38) codificada por el gen UL80a del virus. La invención se refiere además a un kit de diagnóstico y a reactivos para diagnóstico derivados de los mismos y a plásmidos que expresan dichos antígenos recombinantes.

Antecedentes

El citomegalovirus humano (CMVH) es un virus herpes ubicuo del hombre. Raramente es patógeno en adultos sanos pero está asociado con varias enfermedades en individuos inmunocomprometidos (tales como personas infectadas con el VIH y receptores de trasplantes). Además, el CMVH es la causa más común de infección congénita en humanos. Las infecciones primarias intrauterinas son la principal causa conocida de retraso mental, después del Síndrome de Down. Complicaciones menos graves son el resultado de infecciones secundarias. Como las infecciones son asintomáticas o bien están acompañadas por síntomas que no son específicos del CMVH (tales como fiebre y leucopenia) las técnicas de laboratorio son el único medio para diagnosticar una infección aguda por CMVH. El diagnóstico de la infección por CMVH puede ser obtenido por una demostración directa del virus o de componentes del virus en materiales patológicos, o bien indirectamente mediante serología [1]. El diagnóstico de la infección primaria por CMVH se realiza exclusivamente por métodos serológicos, esto es la demostración de la aparición de anticuerpos hacia el CMVH en un sujeto previamente seronegativo. La IgM específica de CMVH es un indicador sensible y específico de la infección primaria por CMVH en sujetos inmunocompetentes, mientras que se produce muy a menudo durante la reactivación vírica activa en receptores de trasplantes [2-4]. Sin embargo, su detección varía enormemente y se ha encontrado muy poca concordancia entre los resultados obtenidos con diferentes kits comerciales [5].

Por EP 262531 se conocen porciones inmunogénicas de la fosfoproteína estructural del CMVH de 150 kD codificada por el gen localizado en el fragmento HindIII-Y/N del genoma del virus; de acuerdo con dicha patente europea, tales porciones inmunogénicas de pp150 están codificadas, en particular, por un fragmento EcoRI-PstI de 1,5 kb aproximadamente, localizado dentro de la región del fragmento EcoRI-Y del genoma del CMVH de la cepa AD169. Estudios posteriores y más exhaustivos han demostrado, sin embargo, que las deducciones anteriores eran incorrectas, en cuanto a que (Fig. 1) se ha demostrado que la proteína pp150 está codificada por UL32, mucho más largo de 1,5 kb y, de cualquier forma, bastante fuera de tal fragmento EcoRI-PstI, ya que puede estar definido dentro del fragmento EcoRI-Y de la cepa AD169. Además, el fragmento EcoRI-Y está totalmente fuera del fragmento HindIII-Y/N (en particular, hacia el lateral, en dirección al extremo NH_{2}). Según los solicitantes, existe por tanto una correlación entre las propiedades inmunogénicas mostradas por el material proteico referido en la Patente Europea anterior (la cual, sin embargo, al proporcionar una identificación incorrecta del polipéptido hace que permanezca sustancialmente indeterminado) y la inclusión en el péptido del epítopo A1C2, codificado por los nucleótidos 1783 a 1842 de UL32, en dirección 5'\rightarrow3', esto es, de la región correspondiente a los aminoácidos 595 a 614 de ppUL32, cuya identificación es posterior (Novak, J.P. y col. 1991. Mapping of serologically relevant regions of human cytomegalovirus phosphoprotein pp150 using synthetic peptides. J. Gen. Virol. 72: 1409-1413).

Materiales antigénicos compuestos por proteínas víricas individuales bien caracterizadas, o porciones de las mismas, producidos mediante biología molecular o por química peptídica han demostrado ser herramientas prometedoras para mejorar el diagnóstico serológico [6-14]. El análisis de la respuesta inmune humoral producida durante la infección natural ha demostrado repetidamente que la fosfoproteína básica de 150 kD codificada por UL32 (ppUL32) [15] y localizada en el tegumento del virus es muy inmunogénica y es reconocida por el suero de casi el 100% de los sujetos seropositivos para el CMVH analizados [6,16]. En esta molécula se han identificado al menos dos epítopos, y se ha demostrado que reaccionan eficazmente con inmunoglobulinas humanas. En particular, el análisis de varias proteínas de fusión de ppUL32 mostró que una región localizada en la secuencia entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, leída en dirección 5'\rightarrow3', de la molécula (aa 1006-1048) reacciona con más del 80% de sueros IgM-positivos [9, 11]. Cuando se sintetizó químicamente, otra región localizada entre el aa 595 y el aa 614 produjo una reacción positiva con casi el 100% de los sueros IgG positivos [17]. Cuando se expresó como una proteína recombinante, esta región demostró que reaccionaba muy eficazmente también con IgM específica de CMVH [12]. Las dos regiones codificadoras fueron fusionadas recientemente y se demostró que producían una proteína de fusión de doble epítopo que podía sustituir a la molécula pp150 completa en su capacidad para unirse a IgM [12].

Otra proteína del CMVH que reacciona muy bien con IgM es la fosfoproteína no estructural de unión a ADN de 52 kD [18] codificada por el gen UL44 del virus (ppUL44) [7, 11]. La parte COOH de la molécula muestra una eficaz unión a IgM y no contiene secuencias de aminoácidos relevantes que reaccionen de manera cruzada con la proteína homóloga de otros miembros de la familia Herpesviridae (que están presentes principalmente en la mitad NH_{2}) [19]. La mitad COOH de esta proteína fue expresada y analizada con sueros humanos. La secuencia de ADN que expresa esta región ha sido insertada de hecho en el plásmido pROS (que lleva una secuencia truncada de lacZ) en el sitio de SmaI y clonada en E. coli, obteniendo así una proteína de fusión H10 que ha producido buenos resultados [21].

Además de ppUL32 y ppUL44, otras dos proteínas del CMVH son bien conocidas: la fosfoproteína de la matriz principal de 65 kD codificada por el gen UL83 del virus (ppUL83) y la fosfoproteína de ensamblaje de 38 kD codificada por el gen UL80a del virus (ppUL80a). Se sabe que la primera induce una potente respuesta de IgM y se describieron anticuerpos que reaccionaban exclusivamente con esta proteína durante la infección primaria [7]. De igual modo, las IgM hacia esta segunda proteína son muy a menudo el primer marcador a detectar en pacientes trasplantados seropositivos para el CMVH que experimentan una reactivación vírica [Kraat y col., 1995, manuscrito presentado]. Además, algunos de los solicitantes observaron una potente reactividad de IgM hacia esta proteína en recién nacidos infectados de manera congénita (Lazzarotto y Landini, observación no publicada).

Sin embargo, los estudios anteriores no han conseguido, hasta ahora, producir tal material proteico recombinante, ya que son realmente capaces de sustituir al virus o a los componentes víricos (viriones purificados) en los kits de diagnóstico actualmente en uso.

Descripción de la invención

Un objeto primario de la presente invención es proporcionar un material proteico recombinante, en particular una proteína de fusión, capaz de unirse mediante inmunorreacción a anticuerpos producidos contra el citomegalovirus humano, en particular IgM e IgG, capaz de ser utilizado como antígeno para detectar tales anticuerpos en los ensayos serológicos relevantes con sustancialmente la misma eficacia que el virus y/o los lisados de células infectadas.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar reactivos y kits de diagnóstico derivados de dicho material proteico.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico y/o eucariótico para expresar dicho material proteico recombinante como una proteína de
fusión.

Es también un objeto de la presente invención proporcionar antígenos recombinantes, en particular proteínas de fusión, para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante inmunoensayo enzimático.

Un objeto más de la presente invención es proporcionar reactivos y kits de diagnóstico derivados de dichos materiales proteicos.

Finalmente, un objeto más de la presente invención es proporcionar plásmidos capaces de ser insertados en un organismo huésped procariótico y/o eucariótico con el fin de expresar dicho material proteico recombinante como una proteína de fusión, fusionado en particular con la proteína CKS.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un material proteico recombinante capaz de unirse a anticuerpos contra citomegalovirus (CMVH), caracterizado porque comprende una proteína de fusión que contiene una primera región que lleva una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a anticuerpos contra el CMVH, estando dicha secuencia entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, leída en la dirección 5'\rightarrow3', de la proteína pp52, una segunda región que lleva una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a anticuerpos contra el CMVH, estando dicha secuencia entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, leída en la dirección 5'\rightarrow3', de la proteína pp150, y una tercera región que lleva una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a anticuerpos contra el CMVH, estando dicha secuencia entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, leída en la dirección 5'\rightarrow3', de la proteína pp150; siendo dichas regiones capaces de ser colocadas de manera variable unas con respecto a las otras dentro de la proteína de fusión.

Dichas regiones comprenden preferiblemente dichas secuencias de pp52 y pp150 en su totalidad y, de acuerdo con una realización preferida, no limitante, una proteína de fusión de acuerdo con la invención comprende de manera secuencial, leída en dirección 5'\rightarrow3': dicha primera región, inmediatamente corriente abajo de la misma está situada dicha tercera región, y posteriormente dicha segunda región, corriente abajo de dicha tercera región, estando insertada una secuencia puente entre dicha tercera y dicha segunda región.

En una realización preferida, dicha secuencia puente consta de las series de aminoácidos siguientes, en dirección 5'\rightarrow3': lys leu gln glu phe.

Cualquiera de los materiales proteicos recombinantes anteriores puede contener al menos una porción de \beta-galactosidasa.

La presente invención proporciona también un material proteico recombinante capaz de unirse a anticuerpos contra el citomegalovirus humano (CMVH), que comprende una proteína de fusión, estando codificados al menos parte de los aminoácidos de la misma por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:1, leída desde el nucleótido 001 hasta el 900, o bien por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:3, leída desde el nucleótido 001 hasta el 906.

La presente invención proporciona además un reactivo para diagnosticar la infección por CMVH mediante métodos serológicos, caracterizado porque comprende una proteína de fusión como la definida en la presente anteriormente.

En particular, el reactivo de diagnóstico comprende una proteína de fusión, de la que al menos parte de los aminoácidos están codificados por la secuencia de nucleótidos mostrada en el listado de secuencias como SEC ID Nº:1, leída desde el nucleótido 001 hasta el nucleótido 900.

La presente invención proporciona también un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico que comprende, combinadas entre sí, una primera secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo que se une a una IgM específica del CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína pp52 del CMVH, una segunda secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo que se une a una IgM específica del CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína pp150, y una tercera secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos entre el aa 595 y el 614, ambos inclusive, de la proteína pp150, en el que la secuencia de ADN SEC ID Nº:3 está incluida en su totalidad o está incluida la secuencia de ADN SEC ID Nº:1 desde el nucleótido 002 hasta el nucleótido 907.

Además, de acuerdo con un aspecto mejorado de la presente invención, se proporciona una mezcla de antígenos recombinantes para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante inmunoensayo enzimático, conteniendo dicha mezcla en combinación:

(i) una primera proteína de fusión que comprende: una primera región que lleva una secuencia de aminoácidos (H10) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína pp52 del virus; una segunda región que lleva una secuencia de aminoácidos (F3) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína pp150 del virus; y una tercera región que lleva una secuencia de aminoácidos (A1C2) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, de la misma proteína vírica pp150; estando al menos parte de los aminoácidos de la misma codificados por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:1, leída desde el nucleótido 001 hasta el 900, o bien por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:3, leída desde el nucleótido 001 al 906;

(ii) una segunda proteína de fusión que comprende una región inmunogénica conteniendo una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 297 y el aa 510, ambos inclusive, de la proteína de la matriz principal del virus pp65 codificada por el gen vírico UL83; y

(iii) una tercera proteína de fusión que comprende una región inmunogénica conteniendo una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 117 y el aa 373, de la proteína de ensamblaje del virus pp38 codificada por el gen vírico UL80a.

En particular, dichas regiones incluyen dichas secuencias de aminoácidos de pp52, pp150, pp65 y pp38 en su totalidad, fusionadas preferiblemente con la proteína CKS o con al menos una parte de la misma.

La presente invención proporciona también un material proteico recombinante capaz de unirse a anticuerpos específicos de citomegalovirus humano (CMVH), que comprende una mezcla de proteínas de fusión expresadas en un organismo huésped en el que se ha insertado al menos uno de los plásmidos siguientes: un plásmido como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 13; un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico, que comprende una secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo que se une a IgM específica del CMVH, entre el aa 297 y el aa 510, ambos inclusive, de la proteína de la matriz principal del CMVH pp65 codificada por el gen UL83 del virus, estando unida dicha secuencia al extremo 3' de una segunda secuencia correspondiente a la secuencia desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 240, ambos inclusive, que codifica la proteína CKS; un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico, que comprende una secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo que se une a IgM específica del CMVH, entre el aa 117 y el aa 373, ambos inclusive, de la proteína de ensamblaje del CMVH pp38 codificada por el gen UL80a del virus, estando unida dicha secuencia al extremo 3' de una segunda secuencia correspondiente a la secuencia desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 240, ambos inclusive, que codifica la proteína CKS.

Además, la invención se refiere a un reactivo de diagnóstico adecuado para la detección de IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante inmunoensayo enzimático que comprende una proteína de fusión conteniendo: una primera región que lleva una secuencia de aminoácidos (H10) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína vírica pp52; una segunda región que lleva una secuencia de aminoácidos (F3) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína pp150 del virus; y una tercera región que lleva una secuencia de aminoácidos (A1C2) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, de la misma proteína pp150 del virus; estando codificados al menos parte de los aminoácidos de la misma por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:1, leída desde el nucleótido 001 hasta el 900, o por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:3, leída desde el nucleótido 001 al 906.

Se proporciona también un reactivo de diagnóstico para diagnosticar la infección por CMVH mediante métodos serológicos, que comprende una proteína de fusión conteniendo la secuencia SEC ID Nº:2.

Se proporciona además un reactivo de diagnóstico para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante inmunoensayo enzimático, que comprende cualquiera de las mezclas de proteínas de fusión anteriores.

La presente invención proporciona también un reactivo de diagnóstico para detectar la infección por CMVH mediante métodos serológicos, que comprende una proteína de fusión conteniendo la secuencia SEC ID Nº:4.

Un primer kit de diagnóstico para detectar, mediante métodos serológicos, la presencia de anticuerpos hacia citomegalovirus humano (CMVH) comprende cualquiera de los reactivos de diagnóstico anteriormente indicados, en el que dicho reactivo de diagnóstico está adsorbido sobre un medio sólido.

Un segundo kit de diagnóstico para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante inmunoensayo enzimático comprende una pluralidad de micropartículas, estando revestida cada una de dichas micropartículas con al menos una de las proteínas de fusión de cualquiera de las mezclas indicadas anteriormente.

Otro kit de diagnóstico para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante inmunoensayo enzimático comprende una pluralidad de micropartículas, estando revestida cada una de dichas micropartículas con cualquiera de las mezclas indicadas anteriormente que contiene las tres proteínas de fusión.

Está también proporcionado por la presente invención un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico, que contiene un vector de expresión PRO5 en el cual la secuencia de ADN SEC ID Nº:1 ha sido insertada en el sitio de SmaI, desde el nucleótido 002 al 907, en particular cuando dicho organismo huésped es E. coli.

Está proporcionado además por la presente invención un plásmido capaz de insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico, que contiene un vector de expresión pJO200 según se define en la Figura 10, en el que la secuencia de ADN SEC ID Nº:3 ha sido insertada entre los sitios correspondientes de SacI y BamHI, desde el nucleótido 001 hasta el 906.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un organismo huésped recombinante conteniendo cualquiera de los plásmidos anteriormente mencionados, capaz de producir una proteína de fusión que comprende una primera región, que lleva una secuencia de aminoácidos (H10) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína vírica pp52; una segunda región, que lleva una secuencia de aminoácidos (F3) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína pp150 del virus; y una tercera región, que lleva una secuencia de aminoácidos (A1C2) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, de la misma proteína vírica pp150.

La presente invención proporciona también un método para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante inmunoensayo enzimático, comprendiendo dicho método las etapas de: provisión de una mezcla de proteínas de fusión, comprendiendo la mezcla en combinación:

(i) una primera proteína de fusión que comprende: una primera región que lleva una secuencia de aminoácidos (H10) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína vírica pp52; una segunda región que lleva una secuencia de aminoácidos (F3) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína vírica pp150; y una tercera región que lleva una secuencia de aminoácidos (A1C2) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, de la misma proteína vírica pp150; estando codificados al menos parte de los aminoácidos de la misma por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:1, leída desde el nucleótido 001 al 900, o bien por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:3, leída desde el nucleótido 001 al 906;

(ii) una segunda proteína de fusión que comprende una región inmunogénica consistente en una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 297 y el aa 510, ambos inclusive, de la proteína de la matriz principal del virus pp65 codificada por el gen vírico UL83; y

(iii) una tercera proteína de fusión que comprende una región inmunogénica consistente en una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 117 y el aa 373, de la proteína de ensamblaje del virus pp38 codificada por el gen vírico UL80a,

la puesta en contacto de una muestra de suero humano con dicha mezcla para formar una mezcla de reacción,

la puesta en contacto de dicha mezcla de reacción con un conjugado, comprendiendo dicho conjugado un anticuerpo y un enzima,

la adición de un sustrato para el enzima y

la monitorización de la reacción entre el conjugado y el sustrato para determinar la concentración de IgM específica de citomegalovirus en el suero.

La invención se refiere además a un método para preparar un medio sólido que comprende una mezcla de proteínas de fusión para preparar un kit de diagnóstico para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante un inmunoensayo enzimático, comprendiendo dicho método:

la provisión de una mezcla que contiene en combinación: (i) una primera proteína de fusión que comprende: una primera región que lleva una secuencia de aminoácidos (H10) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína vírica pp52; una segunda región que lleva una secuencia de aminoácidos (F3) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína vírica pp150; y una tercera región que lleva una secuencia de aminoácidos (A1C2) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, de la misma proteína vírica pp150; estando codificados al menos parte de los aminoácidos de la misma por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:1, leída desde el nucleótido 001 al 900, o bien por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:3, leída desde el nucleótido 001 al 906; (ii) una segunda proteína de fusión que comprende una región inmunogénica consistente en una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 297 y el aa 510, ambos inclusive, de la proteína de la matriz principal del virus pp65 codificada por el gen vírico UL83; y (iii) una tercera proteína de fusión que comprende una región inmunogénica consistente en una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 117 y el aa 373, de la proteína de ensamblaje del virus pp38 codificada por el gen vírico UL80a; y

el permitir que dicha mezcla sea adsorbida sobre al menos un medio sólido.

De acuerdo con una realización, cada una de dichas proteínas de fusión de dicha mezcla son adsorbidas separadamente sobre medios sólidos diferentes, una proteína por medio.

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, partiendo de los estudios sobre proteínas de fusión poliepitópicas de algunos de los solicitantes [12], se han preparado una serie de clones operando con el plásmido pROS de acuerdo con técnicas bien conocidas descritas por Maniatis y col. (1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y.); estos clones, una vez insertados en E. coli y activados con IPTG, son capaces de producir un rango completo de proteínas de fusión que contienen una porción de \beta-galactosidasa (\beta-Gal), las cuales fueron posteriormente analizadas comparativamente utilizando técnicas conocidas (Transferencia Western, Inmunotransferencia, ELISA, etc.) con sueros positivos para CMVH con el fin de determinar IgM e IgG específicas de CMVH procedentes de receptores de trasplantes para establecer sus diferentes niveles de detección.

En particular, se ha preparado un primer plásmido, pMB28, capaz de expresar la secuencia de aminoácidos A1C2; un segundo plásmido, pGT1, capaz de expresar una nueva secuencia inmunogénica F3 de ppUL32, que comprende los últimos 44 aminoácidos del extremo COOH de la proteína vírica pp150 y codificada por los nucleótidos 3013 a 3144 de UL32, en dirección 5'\rightarrow3'; y un tercer plásmido, pMB34, capaz de expresar A1C2 y F3 como una única proteína de fusión con \beta-Gal; habiendo sido obtenido dicho primer plásmido mediante la inserción de un fragmento de ADN modificado y amplificado por PCR entre los sitios de SalI y HindIII del sitio de policlonaje del vector de expresión procariótico pROS de acuerdo con Platchter y col. (1992. "Detection of cytomegalovirus..."; J. Clin. Microbiol. 30; 201-206); el segundo plásmido fue obtenido mediante la inserción en el sitio de SmaI de pROS de un fragmento de ADN de EcoRI procedente de un clon de Lambda GT11, alterado adecuadamente mediante mutagénesis por medio del vector p-Alter, con el fin de sustituir un codón de PARADA por un sitio de EcoRI correspondiente. El tercer plásmido fue obtenido a partir del plásmido pMB28, insertando en el mismo el mismo fragmento de EcoRI de 78 pb (pares de bases) que codifica F3 utilizado para pGT1 en el sitio de StuI, permitiendo de este modo, entre dichas dos secuencias de ADN que codifican A1C2 y F3, una secuencia puente que consta de cinco aminoácidos: lys leu gln glu phe (K, L, Q, E y F, de acuerdo con la IUPAC). Además, se ha incluido también en la comparación el conocido epítopo altamente inmunogénico (H10) de la proteína vírica pp52, que consta de los últimos 233 aminoácidos del extremo COOH de la propia proteína.

Con este fin, se obtuvo la secuencia de nucleótidos H10, contenida en el genoma del fago Lambda GT11 entre dos sitios de restricción de EcoRI dispuestos muy próximos, inmediatamente corriente arriba de lacZ, de acuerdo con técnicas bien conocidas descritas por Berg y Kaiser, mediante digestión con EcoRI; posteriormente, se hace que los extremos cohesivos se conviertan en romos mediante una operación de rellenado en presencia de ADN polimerasa, en la que las bases adenina/timina (A/T), no pareadas, son pareadas con los nucleótidos complementarios. Mientras tanto, el plásmido pROS es digerido con SmaI, que produce su apertura y linealización; posteriormente, el fragmento de EcoRI H10 de Lambda GT11 y el plásmido abierto son incubados juntos en presencia de ADN ligasa, haciendo de este modo que el fragmento H10 sea insertado en el sitio de SmaI apropiado proporcionado por pROS y se forme el plásmido pGH10. Este último es a su vez insertado en E. coli por electroporación y clonado.

Finalmente, se preparó a partir de los plásmidos previos un último plásmido "mixto" que comprendía las dos secuencias de ADN que codificaban A1C2 y F3 y la secuencia que codificaba H10. Para este fin, se sintetizó un par de oligonucleótidos para pGH10 y uno para pMB34, respectivamente, permitiendo sus secuencias que los mismos fueran utilizados para amplificación de la cadena con PCR de las secuencias H10 y A1C2-F3, respectivamente; dichos pares de oligonucleótidos, que contenían las secuencias, capaces de introducir sitios de reconocimiento adecuados para enzimas de restricción dados (en este caso en cuestión, EcoRI) en los extremos 5', y secuencias en común entre el 5' y el 3' de H10 y A1C2-F3, respectivamente, en extremos opuestos, fueron utilizados para amplificar un único fragmento de ADN que contenía dichos tres epítopos, ya en el marco de lectura deseado y listos para clonaje en los sitios diana del vector de expresión, en este caso en concreto, en el sitio de SmaI de pROS para que los epítopos fueran expresados como una proteína de fusión con \beta-Gal; en el último análisis, el plásmido resultante, pMB40, comprende por tanto, en el sitio de SmaI, la secuencia de ADN SEC ID Nº:1, correspondiente a los nucleótidos 002 a 907, que codifica una nueva proteína de fusión que contiene, al mismo tiempo, el epítopo más inmunogénico conocido de pp150 (A1C2) y el epítopo más inmunogénico de pp52 (H10), y el nuevo epítopo inmunogénico de pp150 (F3), que deriva de la adición de 19 aminoácidos adicionales al epítopo conocido de pp150, que consta de los últimos 25 aminoácidos (secuencia D1) en el extremo COOH de dicha proteína.

Sorprendentemente, se encontró que dicha nueva proteína de fusión, H10/A1C2/F3, tenía una reactividad con IgG e IgM mucho mayor que la que era obtenible por la combinación apropiada en un único kit de ensayo de las proteínas que contenían los tres epítopos distintos. Tiene lugar, por tanto, un efecto sinérgico debido probablemente al hecho de que, la disposición de tales epítopos, que están normalmente separados, próximos entre sí en la misma proteína vírica (A1C2 y F3 de ppUL32, por ejemplo) o incluso en diferentes proteínas (tal como H10 de ppUL44), hace que se "imiten" epítopos conformacionales que es probable que estén presentes en las proteínas víricas completas originales y/o en los viriones.

La nueva proteína de fusión, conteniendo dichas secuencias, ha demostrado en efecto que es tan activa como los viriones purificados para unirse a IgG e IgM de sujetos infectados, dando lugar de este modo finalmente a un antígeno estandarizado, tanto en calidad como en cantidad, capaz de sustituir realmente a los viriones purificados y/o a las células infectadas en la preparación de kits de diagnóstico para el serodiagnóstico de la infección por CMVH. Obviamente, los epítopos previamente descritos pueden ser incluidos en la nueva proteína de fusión de acuerdo con la presente invención en el orden de la secuencia SEC ID Nº:2, actualmente preferida, o además en cualquier otra secuencia, permitiendo también que secuencias puente sean insertadas entre los mismos, como la correspondiente a los nucleósidos 757 a 771 de la SEC ID Nº:1.

El plásmido pMB40, que expresa tal proteína, puede ser insertado en un organismo huésped procariótico, tal como E. coli. Además, el método específico descrito para obtener el fragmento "mixto" permite además su clonaje en un vector diferente, en particular, después de la digestión con EcoRI, en el sitio correspondiente del vector pHIL-S1, obteniendo así el plásmido pHIL-D1, que permite que la proteína recombinante sea expresada en Pichia pastoris, fusionada con un péptido corto que representa una señal de secreción hacia el exterior de la célula de levadura en el medio de cultivo. Tal manera de expresión permite, entre otras cosas, la inducción de la producción de la proteína de fusión por la adición de metanol, en lugar de IPTG, como se utilizaba para la expresión en E. coli, representando así un método mucho menos caro. Por consiguiente, la producción de la proteína de fusión poliepitópica de acuerdo con la presente invención puede ser a gran escala, sencilla y económica.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, y partiendo de los resultados descritos anteriormente, la proteína poliepitópica de acuerdo con el primer aspecto de la invención ha sido estudiada posteriormente disponiendo dichas regiones de una forma diferente y combinando dicho material recombinante, expresada fusionada a la proteína CKS, con regiones inmunogénicas de otras proteínas del CMVH, obteniendo así una mezcla de proteínas de fusión muy eficaces frente a IgM.

Las proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención pueden ser utilizadas solas o, de acuerdo con el principal aspecto de la presente invención, mezcladas, para la preparación directa de reactivos de diagnóstico para la detección serológica de anticuerpos específicos del CMVH, en cuanto a que su capacidad para unirse eficazmente a IgM anti-CMVH, en particular a aquéllas producidas durante una fase primaria asintomática de la infección, es sustancialmente del 100%. Tales reactivos pueden comprender la mezcla de proteínas de fusión de acuerdo con la invención, eventualmente en combinación con otros antígenos del CMVH, o proteínas de fusión todavía más complejas, incluyendo las secuencias inmunogénicas repetidas muchas veces y de todas formas en combinación unas con otras.

Los materiales proteicos representados por las proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención pueden ser utilizados además para la preparación, por medio de técnicas conocidas, de reactivos de diagnóstico para la detección serológica de citomegalovirus humano y/o de antígenos para la detección del mismo representados por sueros policlonales específicos, o por anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra las proteínas de la invención y obtenidos mediante varios métodos diferentes.

Dichos reactivos de diagnóstico, conteniendo las proteínas de acuerdo con la presente invención, pueden ser utilizados a su vez para la producción de kits de diagnóstico para la demostración, mediante métodos serológicos, de la aparición de anticuerpos hacia el citomegalovirus humano (CMVH), en los cuales el reactivo es adsorbido sobre papel de nitrocelulosa (transferencia). Finalmente, las proteínas de acuerdo con la presente invención pueden ser utilizadas, después de ser purificadas, en ensayos de ELISA, ensayos de aglutinación en látex, RIA, así como en todos los métodos serológicos de selección conocidos para determinar la presencia de IgG e IgM específicas de CMVH, manuales y parcialmente o completamente automatizados.

Breve descripción de las figuras

- La Fig. 1 ilustra esquemáticamente la posición de los fragmentos de ADN que codifican dos de las porciones que caracterizan una de las proteínas de fusión de acuerdo con la invención, en el gen UL32 contenido en el fragmento EcoRI-Y de la cepa vírica AD169;

- las Figs. 2 y 5 ilustran esquemáticamente métodos para preparar los plásmidos utilizados en la invención;

- las Figs. 3 y 4 son representaciones esquemáticas de la construcción de los plásmidos pMB28: lacZ-A1C2 y pMB34: lacZ-A1C2F3;

- las Figs. 6 y 7 muestran dos tablas que comparan los datos experimentales relativos a la detección de IgG e IgM de sujetos infectados con CMVH, mediante un ensayo de ELISA, utilizando el virus completo o diferentes proteínas de fusión recombinantes, incluyendo una de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención;

- la Fig. 8 es una representación esquemática de la construcción de los plásmidos pJO210 y pJO215;

- la Fig. 9 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pMC200;

- la Fig. 10 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pJO200;

- la Fig. 11 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pMB38: lacZpp38(aa106-373);

- la Fig. 12 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pCMV-1A: CKS-A1C2F3-CKS;

- la Fig. 13A muestra la preparación de fragmentos de PCR que contienen las secuencias de ADN de A1C2F3 y H10;

- la Fig. 13B muestra la preparación de fragmentos de PCR que contienen las secuencias de ADN de pp65(aa297-510) y pp38(aa117-373);

- la Fig. 13C es una representación esquemática de la construcción de: el plásmido pCMV-3B:CKS-H10, el plásmido pCMV-4:CKS-A1C2F3-H10, el plásmido pCMV-9:CKS-pp65(aa297-510) y el plásmido pCMV-26:CKS-pp38(aa117-373);

- la Fig. 14A es una representación esquemática de la construcción del plásmido pJO200-\DeltaMluI;

- las Figs. 14B, C, D muestran respectivamente: la secuencia de nucleótidos del plásmido pJO200, incluyendo el sitio de modificación deseado en los residuos del plásmido 151 a 180 (5'-3'); la estructura de doble hebra del oligonucleótido mutagénico, 5'CGCGACGT3', sintetizado para su ligadura en el plásmido pJO200/MluI/CIAP; y la secuencia de nucleótidos del plásmido pJO200\DeltaMluI, que incluye los residuos modificados 151 a 180 (5'-3');

- la Fig. 15 es la representación esquemática de la construcción del plásmido pEE1;

- la Fig. 16A muestra la preparación de fragmentos de PCR que contienen las secuencias de ADN de A1C2F3-H10, pp65(aa297-510) y pp38(aa117-373);

- la Fig. 16B es una representación esquemática de la construcción de: el plásmido pCMV-27:CKS-A1C2F3-H10-CKS, el plásmido pCMV-28:CKS-pp65(aa297-510)-CKS y el plásmido pCMV-29:CKS-pp38(aa117-373)-CKS;

- las Figs. 17A y 17B muestran el seguimiento en seis pacientes trasplantados que experimentaron una infección por CMVH primaria y secundaria, respectivamente, en las que las gráficas A1 y A2 se refieren a receptores de trasplante renal y las gráficas A3, B1, B2 y B3 se refieren a receptores de trasplante de corazón; y

- las Figs. 18 a 25 muestran tablas que comparan datos experimentales relativos a la detección de IgM por EIA.

Modo mejor de llevar a cabo la invención

La presente invención será descrita mejor por medio de ejemplos no limitantes de la misma, con referencia a las figuras acompañantes.

Ejemplos

Reactivos, enzimas y medio de cultivo - Los enzimas de restricción, la ADN ligasa de T4, la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP), la polinucleótido quinasa y el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I fueron adquiridos a New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts o a Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana. Los estándares de peso molecular de ADN y de proteínas, los geles de gradiente de poliacrilamida prefraguados de Dalichi y el Sistema de Transferencia Semiseco con tampones fueron obtenidos de Integrated Separation System, Inc., Natick, Massachusetts. El isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG), la acrilamida, la N-N'-metilén-bis-acrilamida, la N,N,N',N'-tetrametiletiléndiamina (TEMED), el 4-cloro-1-naftol y el dodecilsulfato de sodio (SDS) fueron adquiridos a BioRad Laboratories, Richmond, California. Los anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano picante (HRPO) fueron adquiridos a Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland. Las células de E. coli supercompetentes "EPICUREAN COLI XL-1 Blue" (recA1, endA1, gyrA96, thi-I, hsdR17, supE44, reIAI, lac [F'proAB lalªZdM15 Tn10 (Tet^{r})]), el kit de aislamiento de ADN, el kit de aislamiento de ARN y el kit de Síntesis "ZAP-cDNA" fueron obtenidos de Stratagene Cloning Systems, Inc., La Jolla, California. El kit con reactivos GeneAmp y la ADN polimerasa AmpliTaq fueron adquiridos a Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT. El kit de nucleótidos para la secuenciación de ADN con Sequenasa y 7-deaza-dGTP y la Sequenasa versión 2,0 ADN Polimerasa fueron obtenidos de U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio. El kit de purificación de ARNm PoliA+ fue adquirido a Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, New Jersey. Las placas de Caldo Luria con ampicilina (placas LiSamp) fueron adquiridas a Micro Diagnostics, Inc., Lombard, Illinois. El medio "OPTI-MEM", el suero de ternera fetal, la solución salina tamponada con fosfato (PBS), las células de E. coli DH5\alpha competentes [F^{-} \Phi80dlacZdM15 d(lacZYA-argF)U169 deoR recAI endAI phoAI hsdR17 supE44 \lambda^{-} thi-1 gyrA96 relA1) y la agarosa "ULTRAPURA" fueron adquiridos a GIBCO BRL, Inc., Grand Island, New York. La Bacto-Triptona, el Extracto de Levadura Bacto y el Bacto-Agar fueron obtenidos de Difco Laboratories, Detroit, Michigan. El caldo "NZY" fue adquirido a Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland. El ADN de esperma de salmón, la lisozima, la ampicilina, la N-lauroil sarcosina, el timerosal, los tampones, el hidrolizado ácido de caseína, la urea, los surfactantes como "TWEEN 20", el pirocarbonato de dietilo (DEPC) y las sales inorgánicas fueron adquiridos a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. El caldo "SUPERBROTH II" contenía 11,25 g/l de triptona, 22,5 g/l de extracto de levadura, 11,4 g/l de fosfato de potasio dibásico, 1,7 g/l de fosfato de potasio monobásico, 10 ml/l de glicerol, el pH ajustado a 7,2 con hidróxido de sodio. La solución salina tamponada con Tris (TBS) constaba de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. La solución salina tamponada con Tris "TWEEN 20" constaba de TBS + "TWEEN 20" 0,05%. La solución bloqueante de membranas constaba de un 1% de seroalbúmina bovina, un 1% de hidrolizado ácido de caseína, un 0,05% de "TWEEN 20" en TBS. El tampón de dilución de especímenes de Rubazyme® (SDB Rubazyme®) constaba de Tris 100 mM, pH 7,5, NaCl 135 mM, EDTA 10 mM, "TWEEN 20" 0,2%, timerosal 0,01% y suero bovino de ternera 4%. El tampón de dilución diluyente del conjugado de Rubazyme® constaba de Tris 100 mM, pH 7,5, NaCl 135 mM, timerosal 0,01% y suero bovino de ternera 10%. La solución para la producción de color "HRP" constaba de un 0,06% de 4-cloro-1-naftol, un 0,02% de H_{2}O_{2} y un 0,2% de metanol en TBS. El tampón de carga de la SDS-PAGE constaba de Tris 62 mM, pH 6,8, SDS 2% (Dodecil Sulfato de Sodio), glicerol 10%, \beta-mercaptoetanol 5% y azul bromofenol 0,1%. El tampón TE constaba de Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0.

Propagación del virus y preparación de ADNc. - Las cepas AD169 y Towne de CMV fueron propagadas en fibroblastos humanos cultivados en medio "OPTI-MEM" suplementado con un 5% de suero de ternera fetal. Seis después de la infección, las células infectadas fueron recogidas por centrifugación, lavadas con PBS y homogeneizadas con un homogeneizador de vidrio-PTFE ("TEFLÓN"). El ADN vírico total fue aislado según está descrito en Mocarski, E.S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1266, 1985. El ARN total fue aislado de las células homogeneizadas utilizando el Kit de Aislamiento de ARN (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) y el ARN poliA+ fue aislado utilizando un kit de aislamiento de ARNm (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Se sintetizó ADNc de CMVH a partir del ARNm vírico purificado utilizando el kit de síntesis "ZAP-cDNA" (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).

Métodos generales - Todas las digestiones enzimáticas del ADN fueron llevadas a cabo de acuerdo con las instrucciones de los proveedores. Se utilizaron al menos 5 unidades de enzima por microgramo de ADN, y se dejó un tiempo de incubación suficiente para la digestión completa del ADN. Se siguieron los protocolos de los proveedores de los diferentes kits utilizados en la manipulación de ADN y ARN, y también para la PCR y la secuenciación del ADN. Se utilizaron procedimientos estándar para (1) la preparación a pequeña escala y la preparación a gran escala de ADN plasmídico a partir de E. coli, (2) la preparación de ADN de lisados de fagos procedentes de células de E. coli infectadas con el fago \lambda, (3) la preparación de lisados de fago para la absorción de anticuerpos anti-E. coli, (4) la extracción con fenol-cloroformo, (5) la precipitación de ADN con etanol, (6) el análisis de restricción de ADN en geles de agarosa, (7) la purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa y poliacrilamida, (8) el relleno de los extremos 3' rebajados creados por la digestión del ADN con enzimas de restricción utilizando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, (9) la ligadura de fragmentos de ADN con ADN ligasa de T4 y (10) la preparación de células de E. coli TB1 competentes (F^{-} ara d(lac-proAB) rpsL \Phi80dlacZdM15 hsdR17) según está descrito en Sambrock, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Los fragmentos de ADN para el clonaje en plásmidos que fueron generados mediante amplificación por PCR, fueron extraídos con fenol-cloroformo y precipitados con etanol antes de la digestión con enzimas de restricción de la mezcla de reacción de PCR. Los oligonucleótidos para la PCR y para la secuenciación del ADN fueron sintetizados en un Sintetizador de Oligonucleótidos de Applied Biosystems, Modelo 380B o 394, según el protocolo del fabricante.

Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión de lacZ-H10 pROSH10

Operando con métodos estándar de ADN recombinante, según está descrito por Maniatis y col. (1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y.) y a partir de los plásmidos pROS suministrados por los autores de los mismos (cf. Ellinger y col.), se purificó el genoma de un clon, obtenido del gen temprano que expresa el fago Lambda GT11, que produce una proteína de fusión con \beta-galactosidasa muy reactiva con sueros positivos para CMV. El genoma fue digerido posteriormente con el enzima de restricción EcoRI para extraer el fragmento de ADN expresado por el fago. El fragmento fue clonado posteriormente en el vector pUC18 y secuenciado. La secuencia representaba un fragmento de 699 pares de bases que expresaba 233 aminoácidos del extremo COOH de pp52 (UL44). El fragmento fue clonado posteriormente en el sitio de SmaI del vector de expresión pROS, después de rellenar los extremos de EcoRI del fragmento, según se ilustra esquemáticamente en la Fig. 2. El plásmido así obtenido fue denominado pROSH10.

Ejemplo 2 Construcción del vector de expresión de lacZ-F3 pGT1

Operando con los métodos descritos en el Ejemplo 1, se purificó el genoma de un clon obtenido del gen temprano que expresa el fago Lambda GT11, que produce una proteína de fusión con \beta-galactosidasa, altamente reactiva con sueros positivos para CMV. El genoma fue digerido posteriormente con el enzima de restricción EcoRI para extraer el fragmento de ADN expresado por el fago. El fragmento fue clonado posteriormente en el vector pUC18 y secuenciado. La secuencia representaba un fragmento de 132 pares de bases que expresaba 44 aminoácidos del extremo COOH de p150 (UL32). El fragmento fue luego clonado en el sitio de SmaI del vector de expresión pROS, después de rellenar los extremos de EcoRI del fragmento, según se ilustra esquemáticamente en la Fig. 2 referida al Ejemplo 1. El plásmido así obtenido fue denominado pGT1.

Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión de lacZ-A1C2F3 pMB34

El plásmido pMB34 es un derivado del vector de expresión de lacZ pROS descrito en Ellinger y col., J. Clin. Micro. 27:971, 1989. Este vector contiene una forma truncada del gen lacZ (aminoácidos 1-375) con un sitio de clonaje poliadaptador situado corriente abajo del gen lacZ. El plásmido pMB34 fue construido en dos etapas uniendo dos regiones de ppUL32, que codifica la fosfoproteína básica de 150 kD del CMVH, al extremo 3' del gen lacZ en pROS.

A. Construcción de pMB28: lacZ-A1C2

El plásmido pMB28 es un derivado del plásmido pROS según se muestra en la Fig. 3. Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN que contenía A1C2 del CMVH, obtenido por amplificación mediante PCR de ADN genómico de citomegalovirus humano (CMVH) procedente de la región de ppUL32 que codifica los aminoácidos 595-614 de pp150 (nucleótidos 1763-1842), en la región del poliadaptador de pROS. El ADN plasmídico (pROS) a gran escala fue aislado de células DH5\alpha operando según se describió en los métodos generales. El plásmido pROS fue digerido con SalI y HindIII y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 1783 de ppUL32 conteniendo un sitio de SalI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1842 de ppUL32 conteniendo un sitio de HindIII, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía ADN genómico del CMVH. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con SalI y HindIII, y el fragmento de 60 pares de bases que contenía A1C2 (nucleótidos 1733-1842) fue purificado en un gel de agarosa. Este fragmento purificado fue ligado posteriormente a pROS/SalI/HindIII purificado durante una noche a 16ºC. Al día siguiente, la mezcla de ligadura fue transformada en células DH5\alpha competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia del fragmento de 60 pares de bases en pROS en el extremo del gen lacZ. Se aisló el plásmido pMB28, que contiene el fragmento A1C2. La secuencia de ADN de A1C2 en pMB28 fue confirmada y la región codificadora de A1C2 estaba en marco con la secuencia codificadora de lacZ.

B. Construcción de pMB34: lacZ-A1C2F3

El plásmido pMB34 es un derivado del plásmido pMB28, según se muestra en la Fig. 4. El plásmido pMB34 fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN que contenía F3 del CMVH obtenido a partir de un subclón en \lambdagt11 de ppUL32 que codificaba los aminoácidos 1006-1043 de ppUL32 (nucleótidos 3016-3144) derivado de la biblioteca de \lambdagt11 de Mocarski, E.S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1266, 1985, en la región del poliadaptador de pMB28 justo corriente abajo de la secuencia de ADN de A1C2. Se aisló ADN plasmídico (pMB28) a gran escala a partir de células DH5\alpha según se describió en los métodos generales. Se preparó ADN de lisado del fago a partir del clon \lambda-F3 del fago \lambdagt11 según se describió en los métodos generales. El plásmido pMB28 fue digerido con StuI y el esqueleto del vector con extremos romos fue purificado en un gel de agarosa. El ADN del fago \lambda-F3 fue digerido con EcoRI y los extremos 3' rebajados fueron rellenados con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, dejando extremos romos. El fragmento de \lambda-F3 de 129 pares de bases de extremos romos fue purificado en un gel de agarosa y ligado posteriormente con los extremos romos a pMB28/StuI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente, la mezcla de ligadura fue transformada en células DH5\alpha competentes. La preparación de ADN a pequeña escala fue preparada a partir de los transformantes y sometida a selección por la presencia del fragmento de 129 pares de bases en pMB28 en el extremo del gen lacZ en la orientación correcta. Se aisló el plásmido pMB34, que contiene el fragmento F3 en la orientación correcta. Se confirmó la secuencia de ADN de F3 en el plásmido pMB34 y la región codificadora de F3 estaba en marco con la secuencia codificadora de lacZ-A1C2. La región codificadora de la construcción lacZ-A1C2F3 en pMB34 contiene un puente de 5 aminoácidos entre A1C2 y F3 según se muestra a continuación, utilizando la codificación internacional estándar de una letra para los aminoácidos (según la cual: L es Leu, Q es Gln, K es Lys, E es Glu, F es Phe):

100

Ejemplo 4 Construcción del vector de expresión de lacZ-H10A1C2F3 pMB40

Partiendo de los plásmidos previamente descritos, y operando con tales métodos, según se ha descrito en los Ejemplos 1, 2 y 3 de la presente anteriormente y está ilustrado en la Fig. 5, se sintetizaron dos pares de oligonucleótidos, cuyas secuencias permitían su utilización para amplificación de la cadena, con PCR, de las secuencias de H10 y A1C2-F3, respectivamente, localizadas en los plásmidos pGH10 y pMB34. Las secuencias oligonucleotídicas que componen dichos cebadores son según sigue:

_{Eco}H10: GAA TTC ACA GCC AAT AAC CGC GTC AGT TTC;

H10_{A1C2}: AGG CGT CGG CGT GCC GCA CTT TTG CTT CTT GGT GTT

para amplificar H10 de pGH10, introducir un sitio de EcoRI en 5' en la secuencia amplificada y una secuencia de 12 pares de bases, homóloga a A1C2, en 3' del fragmento amplificado; y

_{H10}A1C2: CAA AAG TGC GGC ACG CCG ACG CCT GTC AAT CCT TCC;

F3_{Eco}: GAA TTC CTA TTC CTC CGT GTT CTT AAT CTT

para amplificar el fragmento A1C2-F3 del plásmido pMB34, introduciendo en el producto amplificado, en 5', una secuencia homóloga a H10 y un sitio de EcoRI en 3'.

Los dos fragmentos resultantes de dichas dos amplificaciones independientes (_{Eco}H10_{A1C2} y _{H10}A1C2-F3_{Eco}) fueron posteriormente mezclados, junto con los cebadores externos _{Eco}H10 y F3_{Eco}, y sometidos a una amplificación adicional. Debido a que las secuencias 3'_{Eco}H10_{A1C2} y 5'_{H10}A1C2-F3_{Eco} son complementarias, el producto amplificado contiene los tres epítopos y tiene un sitio de EcoRI en cada extremo.

La secuencia amplificada fue luego clonada en pROS y el plásmido derivado del mismo, denominado pMB40, incluye, en conexión con el sitio correspondiente de SmaI, la secuencia de ADN SEC ID Nº:1 correspondiente a los nucleótidos 002 a 907.

Ejemplo 5

Los plásmidos descritos en los Ejemplos 1 a 4 en la presente anteriormente fueron insertados en E. coli por electroporación y clonados; la síntesis de la proteína de fusión deseada fue inducida posteriormente por la adición de IPTG y las proteínas así obtenidas se hicieron competentes por la lisis de las células bacterianas y la desnaturalización de los lisados celulares con SDS y \beta-mercaptoetanol; las proteínas fueron procesadas posteriormente en un gel de acrilamida 9%-12% con SDS-PAGE y transferidas posteriormente a nitrocelulosa, en la que tuvieron lugar las inmunorreacciones; se llevó a cabo un proceso de selección preliminar de varias muestras de suero mediante Miniblotter (Immunetics, Cambridge-Mass. EE.UU.); ambas IgG purificadas ("ENDOBULIN", de Immuno AG, Wien, AT) y un grupo de sueros altamente positivos para IgM fueron utilizados a una dilución 1:100. Muestras de suero humano individuales fueron diluidas 1:80 para la detección de IgG e IgM; se utilizó como segundo anticuerpo un anti-cadena g o un anti-cadena \mu conjugado a peroxidasa.

Se utilizaron dos grupos de muestras de suero humano: el primer grupo de sueros constaba de diecisiete muestras positivas para CMVH, ocho de las cuales con un título de IgG hacia CMVH elevado y siete con un nivel medio/bajo de IgG específica de CMVH, según se detectó mediante ELISA; la presencia de IgG específica de CMVH fue confirmada por inmunotransferencia. El segundo grupo de sueros constaba de diecinueve muestras positivas para CMVH, diez de las cuales con un alto título de IgM hacia CMVH y nueve con un nivel medio/bajo de IgM específica de CMVH, según se detectó mediante ELISA; también en este caso, la presencia de IgM específica de CMVH fue confirmada mediante inmunotransferencia.

La evaluación de IgG anti-CMVH se llevó a cabo con un kit de CMV de M.A. Bioproducts (Walkersville, Md, EE.UU.); las placas fueron leídas en un lector automático "microELISA" (Dynatech Products, Alexandria, Va., EE.UU.). Con el fin de realizar un análisis de regresión lineal y para estandarizar el proceso del ensayo, cada placa incluía tres calibradores séricos. La evaluación de IgM anti-CMVH se llevó a cabo con un kit "ELA" para IgM de CMV de Technogenetics (Hamburg, Alemania). Los resultados fueron interpretados según era sugerido por los fabricantes.

Con el fin de evitar resultados positivos falsos, todas las muestras fueron sometidas también a un proceso de ensayo para la detección del factor reumatoide por aglutinación en látex (Rheuma-Wellco Test de Wellcome, Dartford, Gran Bretaña) y solamente las muestras negativas fueron utilizadas para comparación. Los resultados están mostrados en las Tablas 1 y 2 de las Figs. 6 (IgG) y 7 (IgM).

Como está claro a partir de los datos presentados, no solamente han mejorado claramente los resultados obtenidos con H10/A1C2/F, en comparación con los obtenidos con las demás proteínas de fusión, para IgG y para IgM, sino que son totalmente superponibles a los resultados obtenidos con antígenos compuestos por el virus completo.

Ejemplo 6 Construcción del vector de expresión de CKS pJO200

El vector de expresión de CKS pJO200 permite la fusión de proteínas recombinantes a la proteína CMP-KDO sintetasa (CKS). La secuencia de ADN del gen estructural que codifica CKS (el gen kdsB) está publicada en Goldman y col., J. Biol. Chem. 261:15831, 1986. La secuencia de aminoácidos, 248 en total, de CKS derivada de la secuencia de ADN está descrita en el mismo artículo. Este vector pJO200 es construido mediante un procedimiento de tres etapas comenzando con el plásmido pTB201 (Figura 8) descrito en Bolling y Mandecki, Biotechniques 8: 468, 1990. El plan de construcción del plásmido pJO200 implica la eliminación de dos sitios de enzimas de restricción y la adición de un sitio de clonaje múltiple en el extremo 3' del gen de CKS. Esto se realizó con el fin de facilitar el clonaje de genes del CMVH (citomegalovirus humano) que codificaban antígenos proteicos en el extremo 3' de CKS. El vector acabado contiene la secuencia codificadora de 240 aminoácidos del gen kdsB original más 20 aminoácidos adicionales en el extremo del gen de CKS aportados por la secuencia de ADN del poliadaptador, en un total de 260 aminoácidos.

A. Construcción de pJO210

El plásmido, pJO210, es un derivado del vector de expresión de CKS pTB201. Este plásmido fue construido mediante la eliminación de un único sitio de EcoRI presente en pTB201 situado corriente arriba del promotor del gen de CKS. Se aisló ADN plasmídico (pTB201) a gran escala de células TB1 utilizando las técnicas descritas en la sección anterior denominada "Métodos Generales". El ADN fue digerido con EcoRI hasta su totalidad y purificado en un gel de poliacrilamida. El fragmento pTB201/EcoRI purificado fue tratado posteriormente con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I en presencia de desoxinucleótidos trifosfato. Este enzima rellena los extremos 3' rebajados producidos después de la digestión con EcoRI, dejando extremos romos. Después del tratamiento con el fragmento Klenow, el ADN fue extraído con fenol/cloroformo, precipitado con etanol y resuspendido en tampón de ADN ligasa de T4 y ligado a temperatura ambiente con ADN ligasa de T4 durante 4 horas. La mezcla de ligadura fue transformada en células TB1 competentes. La preparación de ADN a pequeña escala se preparó a partir de los transformantes y se sometió a selección por la pérdida del sitio de EcoRI. Se aisló el plásmido pJO210, que ha perdido el sitio de EcoRI.

B. Construcción de pJO215

El plásmido pJO215 es un derivado del plásmido pJO210 (Figura 8). Este plásmido fue construido eliminando un único sitio de BamHI situado en el promotor del gen de CKS utilizando mutagénesis por puente (Mandecki, W., Proc. Nat. Acad. Sci. 83:7177, 1986). Se aisló ADN plasmídico (pJO210) a gran escala de células TB1 según se describió en métodos generales. El ADN fue digerido totalmente con BamHI y purificado en un gel de acrilamida. El fragmento pJO210/BamHI purificado fue mezclado posteriormente con el oligonucleótido mutagénico siguiente:

(2) 5' GGATAACAAT TGGGCATCCA GTAAGGAGGT 3'

que es complementario a una de las hebras de ADN de pJO210 en la región del plásmido que incluye el sitio de BamHI. Este oligonucleótido contiene un cambio de una sola base, subrayada, que destruirá el sitio de BamHI cuando se incorpore al plásmido pJO210. Después de mezclar el oligonucleótido mutagénico con pJO210/BamHI, la mezcla fue llevada a ebullición durante 3 minutos, enfriada a temperatura ambiente durante 5 minutos y transformada posteriormente en células TB1 competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la pérdida del sitio de BamHI. Se aisló el plásmido pJO215 que había perdido el sitio de BamHI.

C. Construcción de pMC200

El plásmido pMC200 es un derivado del plásmido pMW507 descrito por Mandecki y Bolling, Gene 68: 101, 1988 (Figura 9). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un oligonucleótido sintético que contenía un sitio de clonaje múltiple en pMW507 utilizando el método de síntesis génica con FokI descrito por Mandecki y Bolling, 1988. Se aisló ADN plasmídico (pMW507) a gran escala a partir de células TB1 según se describió en los métodos generales. El ADN fue digerido en su totalidad en SmaI y mezclado posteriormente con el oligonucleótido siguiente:

101

que contiene brazos de FokI en el extremo y varios sitios de enzimas de restricción, según sigue:

102

Después de mezclar los oligonucleótidos con pMW507/SmaI, la mezcla se llevó a ebullición durante 3 minutos, se enfrió a temperatura ambiente durante 5 minutos y se transformó posteriormente en células TB1 competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia del sitio de clonaje múltiple. Se aisló el plásmido pMC200, que contiene el sitio de clonaje múltiple. Se confirmó la secuencia de ADN del sitio de clonaje múltiple.

D. Construcción de pJO200

El plásmido pJO200 es un derivado del plásmido pJO215 (Figura 10). Este plásmido fue construido eliminando el sitio de clonaje múltiple de pMC200 y clonando de este sitio en el extremo 3' del gen de CKS en pJO215. Se aisló ADN plasmídico (pMC200 y pJO215) a gran escala a partir de células TB1 según se describió en los métodos generales. El plásmido pJO215 fue digerido en su totalidad con BglII y tratado posteriormente con fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP) para prevenir la recircularización del plásmido durante la reacción de ligadura. El plásmido pMC200 fue digerido con FokI y posteriormente el ADN de pJO215/BglII/CIAP y el ADN de pMC200/FokI que contenía el sitio de clonaje múltiple (106 pares de bases) fueron purificados en un gel de poliacrilamida. La digestión del plásmido pMC200 con FokI libera el ADN del sitio de clonaje múltiple del plásmido. Este ADN contiene extremos adhesivos de BglII que se ligarán fácilmente al ADN de pJO210 digerido con BglII. Estos fragmentos de ADN purificados fueron mezclados y ligados a 16ºC con ADN ligasa de T4 durante una noche. Al día siguiente la mezcla de ligadura fue transformada en células TB1 competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia del sitio de clonaje múltiple en la orientación correcta en el sitio de BglII. Se aisló el plásmido pJO200, que contiene el sitio de clonaje múltiple en la orientación correcta. Se confirmó la secuencia de ADN del sitio de clonaje múltiple en pJO200 en el sitio de
BglII.

Ejemplo 7 Construcción del vector de expresión de lacZ-pp38(aa106-373) pMB38

El plásmido pMB38 es un derivado del vector de expresión de lacZ pROS (Figura 11). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN que contenía pp38 de CMVH(aa106-373), obtenido por amplificación mediante PCR de ADN genómico del CMVH procedente de la región de ppUL80a que codifica los aminoácidos aa106-373 de pp38 (nucleótidos 316-1119), en la región del poliadaptador de pROS. La región de ppUL80a codifica una fosfoproteína de 38 kD del CMVH. El plásmido pROS fue digerido con SalI y HindIII y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 316 de ppUL80a conteniendo un sitio de SalI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1119 de ppUL80a conteniendo un sitio de HindIII, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía ADN genómico del CMVH. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con SalI y HindIII y el fragmento de 804 pares de bases que contenía pp38(aa106-373) fue purificado en un gel de agarosa. Este fragmento purificado fue ligado posteriormente a pROS/SalI/HindIII purificado durante una noche 16ºC. Al día siguiente la mezcla de ligadura fue transformada en células DH5\alpha competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia del fragmento de pp38 de 804 pares de bases (aa106-373) en pROS en el extremo del gen lacZ. Se aisló el plásmido pMB38, que contiene el fragmento de pp38(aa106-373). Se confirmó la secuencia de ADN de pp38 (aa106-373) en pMB38 y la región codificadora de pp38(aa106-373) estaba en marco con la secuencia codificadora de lacZ.

Ejemplo 8 Construcción de vectores de expresión de CKS-CMV basados en pJO200

El vector de expresión de CKS pJO200 es el bloque constitutivo de una serie de cinco construcciones de fusión de genes de CKS-CMV. Se construyeron dos tipos de plásmidos de fusión de genes de CKS-CMV. Se construyó un tipo de plásmido de fusión de genes de CKS-CMV en el que la secuencia del gen de CMV estaba incluida dentro del gen de CKS en el nucleótido 638 de pJO200 (aminoácido 171 de CKS) según se muestra a continuación:

(5) CKS(aa1~171)-CMV-CKS(aa171-260)

Este método de construcción de fusión de genes de CKS-CMV es denominado inclusión epitópica. Las proteínas de fusión expresadas en E. coli a partir de este tipo de construcción contienen los epítopos del antígeno incluidos totalmente dentro de la secuencia de aminoácidos de CKS. El plásmido pCMV-1A fue construido de esta manera.

Se construyó otro tipo de plásmido de fusión de genes de CKS-CMV en el que la secuencia de ADN del gen de CMV estaba ligada al extremo 3' del gen de CKS en el aminoácido 248 según se muestra a continuación:

(6) CKS(aa1-248)-CMV

Los plásmidos pCMV-38, pCMV-4, pCMV-9 y pCMV-26 fueron construidos de esta manera. Se aisló ADN plasmídico (pJO200) a gran escala utilizando los métodos generales para las construcciones descritas a continuación.

A. Construcción de pCMV-1A: CKS-A1C2F3-CKS - El pásmido pCMV-1A es un derivado del plásmido pJO200 (Figura 12). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN que contenía A1C2F3 del CMVH, obtenido por amplificación mediante PCR de ADN de A1C2F3 contenido en el plásmido pMB34, en el sitio de StuI de pJO200. Se aisló ADN plasmídico (pMB34) a gran escala mediante los métodos generales. El plásmido pJO200 fue digerido con StuI y BamHI y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Este digesto elimina una porción del extremo 3' del gen de CKS que será restaurada en la reacción de ligadura. En este esqueleto del vector serán clonados dos fragmentos de ADN derivados de PCR en una reacción de ligadura de tres vías. A1C2F3 será clonado como un fragmento de ADN StuI/MluI y la porción 3' restante del gen de CKS será clonada como un fragmento de ADN MluI/BamHI, restaurando el gen completo de CKS. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 1783 de ppUL32 conteniendo un sitio de StuI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 3144 de ppUL32 conteniendo un sitio de MluI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pMB34. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con StuI y MluI, y el fragmento de 204 pares de bases que contenía A1C2F3 fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 640 de pJO200 y que contenía un sitio de MluI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 905 de pJO200 que contenía un sitio de BamHI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pJO200. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con MluI y BamHI, y el fragmento de 266 pares de bases que contenía la porción 3' del gen de CKS fue purificado en gel. Estos fragmentos de ADN derivados de PCR purificados fueron ligados posteriormente a pJO200/StuI/BamHI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia de A1C2F3 insertado en el sitio de StuI de pJO200. Se aisló el plásmido pCMV-1A, que contiene A1C2F3 insertado en el sitio de StuI. Se confirmó la secuencia de ADN de A1C2F3 y el extremo 3' del gen de CKS. La región codificadora de la construcción CKS-A1C2F3-CKS en pCMV-1A contiene un puente de 2 aminoácidos (treonina y arginina) aportado por el sitio de MluI entre A1C2F3 y el extremo 3' de CKS. Además, el aminoácido 171 de CKS está duplicado en la construcción según se muestra a
continuación:

(7) CKS(aa1-171)-A1C2-K-L-Q-E-F-F3-T-R-CKS(aa171-260)

B. Construcción de pCMV-3B: CKS-H10 - El plásmido pCMV-3B es un derivado del plásmido pJO200 (Figuras 13A y 13C). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN que contenía H10 del CMVH procedente del plásmido pROSH10, descrito en el Ejemplo 1 [ver también: Ripalti y col., J. Virological Methods 46: 39, 1994], en pJO200. La secuencia de ADN de H10 deriva de ppUL44 que codifica la fosfoproteína de 52 kD del CMVH. La porción H10 de ppUL44 en pROSH10 contiene los nucleótidos 604-1299 (aminoácidos 202-434). H10 codifica la mitad C-terminal de la fosfoproteína pp52. El plásmido pCMV-3B fue construido mediante el clonaje del fragmento de ADN de H10 procedente de pROSH10, obtenido mediante amplificación por PCR de la secuencia de ADN de H10, en los sitios de SacI/BamHI de pJO200. El plásmido pJO200 fue digerido con SacI y BamHI y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 604 de ppUL44 conteniendo un sitio de SacI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1299 de ppUL44 conteniendo un codón de parada en el extremo de la secuencia codificadora de H10 y un sitio de BamHI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pROSH10. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con SacI y BamHI, y el fragmento de 696 pares de bases que contenía H10 fue purificado en un gel de agarosa y ligado posteriormente a pJO200/SacI/BamHI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación a pequeña escala de ADN a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia del fragmento de 696 pares de bases en pJO200 en los sitios de SacI/BamHI. Se aisló el plásmido pCMV-3B, que contiene el fragmento de H10 fusionado en marco con el gen de CKS. Se confirmó la secuencia de ADN de H10 y del extremo 3' del gen de CKS. Esta construcción de fusión CKS-CMV está esquematizada a continuación:

(8) CKS(aa1-248)-H10

C. Construcción de pCMV-4: CKS-A1C2F3-H10 - El plásmido pCMV-4 es un derivado de pJO200 (Figuras 13A y 13C). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de fragmentos de ADN amplificados por PCR, que contenían A1C2-K-L-Q-E-F-F3 del CMVH (brevemente: A1C2F3) y H10 del CMVH, derivados de pMB34 y pROSH10, respectivamente, en pJO200. El plásmido pJO200 fue digerido con SacI y BamHI y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. En este esqueleto del vector serán clonados los dos fragmentos de ADN derivados de la PCR en una reacción de ligadura de tres vías. A1C2-puente-F3 será clonado como un fragmento de ADN de SacI/PstI y H10 será clonado como un fragmento de ADN de PstI/BamHI. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 1783 de ppUL32 conteniendo un sitio de SacI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 3144 ppUL32 conteniendo un sitio de PstI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pMB34. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con SacI y PstI, y el fragmento de 204 pares de bases que contenía A1C2F3 fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 604 de ppUL44 conteniendo un sitio de PstI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1299 de ppUL44 conteniendo un codón de parada en el extremo de la secuencia codificadora de H10 y un sitio de BamHI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pROSH10. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con PstI y BamHI, y el fragmento de 696 pares de bases que contenía H10 fue purificado en un gel de agarosa. Estos fragmentos de ADN derivados de PCR purificados fueron ligados posteriormente a pJO200/SacI/BamHI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia de A1C2F3 y H10 insertados en los sitios de SacI/BamHI de pJO200. Se aisló el plásmido pCMV-4, que contiene A1C2F3 y H10 en el extremo del gen de CKS en pJO200. Se confirmó la secuencia de ADN de A1C2-K-L-Q-E-F-F3 y de H10. La región codificadora de la construcción CKS-A1C2F3-H10 en pCMV-4 contiene un puente de dos aminoácidos aportados por el sitio de PstI entre A1C2F3 y H10. Esta construcción de fusión CKS-CMV está esquematizada a continuación:

(9) CKS(aa1-248)-A1C2-K-L-Q-E-F-F3-L-Q-H10

D. Construcción de pCMV-9: CKS-pp65(aa297-510) - El plásmido pCMV-9 es un derivado de pJO200 (Figuras 13B y 13C). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN que contenía pp65(aa297-510) del CMVH, obtenido mediante amplificación por PCR de ADNc de CMVH procedente de la región de ppUL83 que codifica los aminoácidos 297-510 de pp65 (nucleótidos 889-1530), en pJO200. El plásmido pJO200 fue digerido con SacI y BamHI y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Se utilizó una reacción de PCR anidada de dos etapas para generar el fragmento de ADN de pp65(aa297-510) del CMVH utilizando como molde ADNc de CMVH, según sigue. Para la reacción de amplificación por PCR anidada externa, se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 807 de ppUL83 y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1572 de ppUL83, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía ADNc del CMVH. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción de la PCR anidada externa fue utilizada como ADN molde para la reacción de amplificación por PCR anidada interna. Para la reacción de amplificación por PCR anidada interna, se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 889 de ppUL83 conteniendo un sitio de SacI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1530 de ppUL83 conteniendo un codón de parada en el extremo de la secuencia codificadora de pp65(aa297-510) y un sitio de BamHI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía ADN amplificado en la reacción anidada externa. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con SacI y BamHI, y el fragmento de 642 pares de bases que contenía pp65(aa297-510) fue purificado en un gel de agarosa. Este fragmento de ADN purificado fue ligado posteriormente a pJO200/SacI/BamHI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente, la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia de pp65(aa297-510) insertado en los sitios de SacI/BamHI de pJO200. Se aisló el plásmido pCMV-9, que contiene pp65(aa297-510) en el extremo del gen de CKS en pJO200. Se confirmó la secuencia de ADN de pp65(aa297-510). Esta construcción de fusión CKS-CMV está esquematizada a continuación:

(10) CKS(aa1-248)-pp65(aa297-510)

E. Construcción de pCMV-26: CKS-pp38(aa117-373) - El plásmido pCMV-26 es un derivado de pJO200 (Figuras 13B y 13C). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN que contenía pp38(aa117-373) del CMVH, obtenido mediante amplificación por PCR de ADN de pp38 procedente de la región de ppUL80a que codifica los aminoácidos 117-373 de pp38 (nucleótidos 349-1119) derivada de pMB38, en pJO200. Se aisló ADN plasmídico (pMB34) a gran escala según se describió en los métodos generales. El plásmido pJO200 fue digerido con SacI y BamHI y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 349 de ppUL80a conteniendo un sitio de SacI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1119 de ppUL80a conteniendo un sitio de BamHI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía ADN de pMB38. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con SacI y BamHI y el fragmento de 771 pares de bases que contenía pp38(aa117-373) fue purificado en un gel de agarosa. Este fragmento de ADN purificado fue ligado posteriormente a pJO200/SacI/BamHI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente, la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia de pp38(aa117-373) insertado en los sitios de SacI/BamHI de pJO200. Se aisló el plásmido pCMV-26, que contiene pp38(aa117-373) en el extremo del gen de CKS en pJO200. Se confirmó la secuencia de ADN de pp38(aa117-373). Esta construcción de fusión CKS-CMV está esquematizada a continuación:

(11) CKS(aa1-248)-pp38(aa117-373)

Ejemplo 9 Construcción del vector de expresión pEE1 para la inclusión de epítopos en CKS

El vector de expresión pEE1 para la inclusión de epítopos en CKS permite la inclusión de proteínas recombinantes que contienen epítopos en la proteína CKS según está esquematizado a continuación:

(12) CKS(aa1-171)-Proteína Recombinante-T-R-CKS(aa171-260)

Este vector pEE1 fue construido en dos etapas comenzando con el vector de expresión de CKS pJO200. En la primera etapa un oligonucleótido mutagénico es clonado en un par de sitios de MluI adyacentes situados cerca del extremo 5' del gen de CKS en pJO200, eliminando ambos sitios de MluI y un sitio de SalI. Esta modificación de pJO200 permite la utilización de un único sitio de clonaje de MluI para ser introducido luego corriente abajo en el gen de CKS en la etapa siguiente. En la segunda etapa un fragmento de ADN procedente de pCMV-1A es clonado en este vector pJO200 modificado, permitiendo así la inclusión de genes como fragmentos de StuI/MluI en el gen de CKS.

A. Construcción de pJO200-\DeltaMluI - El plásmido pJO200-\DeltaMluI es un derivado del vector de expresión de CKS pJO200 (Figura 14A). Este plásmido fue construido eliminando un par de sitios de MluI adyacentes y un sitio de SalI situado en los nucleótidos 161-174 (aminoácidos 11-15) en la secuencia de ADN de pJO200 mostrada a continuación utilizando un oligonucleótido mutagénico:

103

Nucleótidos 151-180 de la secuencia de ADN del pJO200 nativa tomados en dirección 5'\rightarrow3'

El plásmido pJO200 fue digerido con MluI y posteriormente precipitado con etanol y resuspendido en tampón de fosfatasa alcalina. El plásmido pJO200/MluI fue tratado posteriormente con fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP) con el fin de eliminar los grupos fosfato 5' para de impedir la autoligadura. Después del tratamiento con CIAP, el ADN fue extraído con fenol-cloroformo, precipitado con etanol, resuspendido en tampón TE, y posteriormente el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizó el oligonucleótido mutagénico siguiente en preparación para la ligadura a pJO200/MluI/CIAP:

(14) 5' CGCGACGT 3'

Este oligonucleótido es autocomplementario en su extremo 3' y formará la estructura de doble hebra siguiente después de una etapa de desnaturalización por calor seguida por una etapa de hibridación:

(15) 5' CGCGAGCT 3'

\hskip1.3cm

3' TCGAGCGC 5'

Este oligonucleótido contiene extremos adhesivos de MluI que permiten la ligadura en el ADN de pJO200 digerido con MluI. La secuencia de este oligonucleótido difiere de la secuencia de ADN del pJO200 nativa en que los residuos de "T" y "A" subrayados en la secuencia de pJO200 anterior (13) han sido invertidos en el oligonucleótido mutagénico según está subrayado. Por tanto, el oligonucleótido mutagénico cuando sea clonado en el sitio de MluI de pJO200 destruirá los dos sitios de MluI y el sitio de SalI. Después de la síntesis del oligonucleótido, el oligonucleótido sintético fue fosforilado en su extremo 5' utilizando polinucleótido quinasa. Después del tratamiento con este enzima, el oligonucleótido fosforilado fue calentado a 65ºC durante 20 minutos para inactivar la quinasa. Después de enfriar a temperatura ambiente, el oligonucleótido fosforilado fue mezclado con el pJO200/MluI/CIAP, calentado a 65ºC durante 5 minutos y enfriado posteriormente hasta temperatura ambiente gradualmente para permitir la hibridación del oligonucleótido fosforilado consigo mismo. Se añadieron posteriormente a la mezcla tampón de ligadura y ADN ligasa T4 y se incubaron durante una noche a un rango de temperaturas desde 20ºC hasta 4ºC. Al día siguiente, la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la pérdida de los sitios de MluI y SalI. Se aisló el plásmido pJO200\DeltaMluI, que ha perdido estos sitios de enzimas de restricción. Se confirmó la secuencia de ADN del extremo 5' del gen de CKS. Además de eliminar los sitios de MluI y SalI, el oligonucleótido mutagénico cambia los aminoácidos codificados por los nucleótidos 166-171 de Ser-Thr a Thr-Ser según se muestra a continuación:

104

Nucleótidos 151-180 de la secuencia de ADN de pJO200\DeltaMluI tomados en dirección 5'\rightarrow3'

B. Construcción de pEE1 - El plásmido pEE1 es un derivado del plásmido pJO200\DeltaMluI (Figura 15). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de StuI/BamHI procedente de pCMV-1A, que contiene A1C2F3 del CMVH incluido en el gen de CKS, en los sitios de StuI/BamHI de pJO200\DeltaMluI. Mediante la sustitución del fragmento de ADN de StuI/BamHI dentro de la región codificadora de CKS presente en pJO200\DeltaMluI por el fragmento de StuI/BamHI procedente de pCMV-1A, el plásmido pEE1 resultante contiene A1C2F3 del CMVH incluido en el gen de CKS. El plásmido pEE1 difiere del plásmido pCMV-1A en que pEE1 no contiene los sitios de MluI corriente arriba presentes en el extremo 5' del gen de CKS. Por tanto, la digestión de pEE1 con StuI y MluI liberará el fragmento de ADN de A1C2F3 del CMVH y proporcionará un esqueleto del vector que, después de purificación en gel de agarosa, será capaz de aceptar otros genes para ser incluidos en el gen de CKS como fragmentos de ADN de extremos adhesivos compatibles con romo/MluI. Se aislaron ADNs plasmídicos (pJO200\DeltaMluI y pCMV-1A) a gran escala según se describió en los métodos generales. El plásmido pCMV-1A fue digerido con StuI y BamHI y el fragmento de 461 pares de bases, que contenía A1C2F3 y el extremo 3' del gen de CKS, fue purificado en un gel de agarosa. El plásmido pJO200\DeltaMluI fue digerido con StuI y BamHI y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Estos fragmentos de ADN purificados fueron posteriormente mezclados y ligados durante una noche a 16ºC. Al día siguiente la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia del fragmento de ADN de A1C2F3 de 461 pares de bases en pJO200\DeltaMluI. Se aisló el plásmido pEE1, que contiene el fragmento de ADN de A1C2F3 y no contiene sitios de MluI en el extremo 5' del gen de CKS. Se confirmó la secuencia de ADN del extremo 3' del gen de CKS y del fragmento de A1C2F3. La digestión del plásmido pEE1 con StuI y BamHI, seguido por purificación del esqueleto del vector en un gel de agarosa, elimina completamente el fragmento de ADN de A1C2F3 para preparar la ligadura con otros fragmentos de ADN. Este esqueleto del vector purificado puede aceptar fragmentos de ADN para ser incluidos en el gen de CKS en el marco de lectura correcto en el formato siguiente:

(16) 5' X-Gen de Interés-Y 3'

en el que X es un extremo romo e Y es un extremo adhesivo compatible con MluI, por ejemplo MluI o BssHII.

Ejemplo 10 Construcción de vectores de expresión basados en pEE1 para la inclusión de epítopos en CKS

El vector de expresión de CKS pEE1 es el bloque constitutivo de una serie de tres construcciones de fusión de genes CKS-CMV-CKS. Para cada construcción el plásmido pEE1 fue digerido con StuI y MluI y se purificó el esqueleto del vector. Este esqueleto está listo para aceptar fragmentos de genes de CMV generados por PCR que tengan un sitio de StuI en su extremo 5' y un sitio de MluI en su extremo 3'. Después de la digestión con StuI y MluI, los fragmentos de PCR son clonados en marco en el esqueleto de pEE1/StuI/MluI. Las proteínas de fusión CKS-CMV-CKS expresadas a partir de estos vectores están esquematizadas a continuación, donde T y R son los residuos de treonina y arginina, respectivamente, codificados por el sitio de MluI sintético introducido en el vector:

(17) CKS(aa1-171)-CMV-T-R-CKS(aa171-260)

A. Construcción de pCMV-27: CKS-A1C2F3-H10-CKS - El plásmido pCMV-27 es un derivado de pEE1 (Figuras 16A y 16B). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN amplificado por PCR, que contenía A1C2F3-H10 del CMVH derivado de pCMV-4 (conteniendo por tanto el puente KLQEF entre A1C2 y F3), en pEE1. Se aisló ADN plasmídico (pEE1 y pCMV-4) a gran escala operando según se describió en los métodos generales. El plásmido pEE1 fue digerido con StuI y MluI y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 1783 de ppUL32 conteniendo un sitio de StuI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1299 de ppUL44 conteniendo un sitio de MluI y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pCMV-4. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con StuI y MluI, y el fragmento de 906 pares de bases que contenía A1C2F3-H10 fue purificado en un gel de agarosa. Este fragmento de ADN purificado fue ligado a pEE1/StuI/MluI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia del fragmento de ADN de A1C2F3-H10 insertado en los sitios de StuI/MluI de pEE1. Se aisló el plásmido pCMV-27, que contiene A1C2F3-H10 incluido en los sitios de StuI/MluI de pEE1. Se confirmó la secuencia de ADN de A1C2F3-H10 y la secuencia de ADN de CKS adyacente. Esta construcción de fusión CKS-CMV-CKS está esquematizada a continuación, donde L, Q y T, R son los residuos de leucina, glutamina y treonina, arginina, respectivamente, codificados por los sitios de PstI y MluI sintéticos introducidos en el vector:

(18) CKS(aa1-171)-A1C2-K-L-Q-E-F-F3-L-Q-H10-T-R-CKS(aa171-260)

B. Construcción de pCMV-28: CKS-pp65(aa297-510)-CKS - El plásmido pCMV-28 es un derivado de pEE1 (Figuras 16A y 16B). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN amplificado por PCR, que contenía pp65(aa297-510) de CMVH derivado de pCMV-9, en pEE1. Se aislaron ADNs plasmídicos (pEE1 y pCMV-9) a gran escala mediante los métodos generales. El plásmido pEE1 fue digerido con StuI y MluI y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 889 de ppUL83 conteniendo un sitio de StuI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1530 de ppUL83 conteniendo un sitio de MluI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pCMV-9. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con StuI y MluI y el fragmento de 642 pares de bases que contenía pp65(aa297-510) fue purificado en un gel de agarosa. Este fragmento de ADN purificado fue ligado a pEE1/StuI/MluI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente, la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia del fragmento de ADN de pp65(aa297-510) insertado en los sitios de StuI/MluI de pEE1. Se aisló el plásmido pCMV-28, que contiene pp65(aa297-510) incluido en los sitios de StuI/MluI de pEE1. Se confirmó la secuencia de ADN de pp65(aa297-510) y la secuencia de ADN de CKS adyacente. Esta construcción de fusión CKS-CMV-CKS está esquematizada a continuación, donde T y R son los residuos de treonina y arginina, respectivamente, codificados por los sitios de MluI sintéticos introducidos en el vector:

(19) CKS(aa1-171)-pp65(aa297-510)-T-R-CKS(aa171-260)

C. Construcción de pCMV-29: CKS-pp38(aa117-373)-CKS - El plásmido pCMV-29 es un derivado de pEE1 (Figuras 16A y 16B). Este plásmido fue construido mediante el clonaje de un fragmento de ADN amplificado por PCR, que contenía pp38(aa117-373) de CMVH derivado del pCMV-26, en pEE1. Se aisló ADN plasmídico (pEE1 y pCMV-26) a gran escala según está descrito en los métodos generales. El plásmido pEE1 fue digerido con StuI y MluI y el esqueleto del vector fue purificado en un gel de agarosa. Se sintetizaron un cebador sentido que comenzaba en el nucleótido 349 de ppUL80a conteniendo un sitio de StuI y un cebador antisentido que comenzaba en el nucleótido 1119 de ppUL80a conteniendo un sitio de MluI, y se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pCMV-26. Después de la amplificación por PCR, la mezcla de reacción fue digerida con StuI y MluI, y el fragmento de 771 pares de bases que contenía pp38(aa117-373) fue purificado en un gel de agarosa. Este fragmento de ADN purificado fue ligado a pEE1/StuI/MluI durante una noche a 16ºC. Al día siguiente, la mezcla de ligadura fue transformada en células XL-1 Blue competentes. Se estableció una preparación de ADN a pequeña escala a partir de los transformantes y se sometió a selección por la presencia del fragmento de ADN de pp38(aa117-373) insertado en los sitios de StuI/MluI de pEE1. Se aisló el plásmido pCMV-29, que contiene pp38(aa117-373) incluido en los sitios de StuI/MluI de pEE1. Se confirmó la secuencia de ADN de pp38(aa117-373) y la secuencia de ADN de CKS adyacente. Esta construcción de fusión CKS-CMV-CKS está esquematizada a continuación, donde T y R son los residuos de treonina y arginina, respectivamente, codificados por los sitios de MluI sintéticos introducidos en el vector:

(20) CKS(aa1-171)-pp38(aa117-373)-T-R-CKS(aa171-260)

Ejemplo 11 A. Expresión de genes del CMVH

Clones bacterianos que expresaban las proteínas de fusión de CMVH del Ejemplo 10, expresando la cepa bacteriana control CKS sin fusionar, y clones bacterianos que expresaban las proteínas de fusión de CMVH del Ejemplo 8, fueron cultivados en medio "SUPERBROTH II" que contenía 100 \mug/ml de ampicilina hasta la fase logarítmica y se indujo la síntesis de las proteínas de fusión CKS-CMVH por la adición de IPTG según se ha descrito previamente [22]. Cuatro horas después de la inducción, las células fueron recogidas y las pellas celulares fueron almacenadas a -80ºC hasta la purificación de las proteínas. Los datos relevantes de todas las proteínas expresadas están presentados en la Tabla 3.

B. Purificación de CKS no fusionada y de las proteínas de fusión CKS-CMVH recombinantes

Las proteínas de fusión CKS-CMVH insolubles (rpCMV-1A, rpCMV-3B, rpCMV-4, rpCMV-9, rpCMV-27, rpCMV-28, rpCMV-29) fueron purificadas después de la lisis por una combinación de lavados con detergente que fueron seguidos por solubilización en urea 8 M [22]. Después de la solubilización en urea 8 M, las proteínas de fusión fueron purificadas mediante cromatografía en Q-Sefarosa (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey). La proteína de fusión 4 (rpCMV-4) y la proteína de fusión 9 (rpCMV-9) fueron sometidas a purificación adicional mediante cromatografía en Sephacryl S-200 (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey). La proteína de fusión CKS-CMVH soluble 26 (rpCMV-26) fue purificada después de la lisis celular por SDS-PAGE preparativa utilizando "Prep Cell" de Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA). La proteína CKS soluble fue purificada después de la lisis celular mediante precipitación con sulfato de amonio seguido por cromatografía en DEAE.

Ejemplo 12 Inmunoensayo automatizado de IgM hacia CMVH

La utilización de polipéptidos recombinantes, que contienen epítopos en las regiones de ppUL32, ppUL44, ppUL83 y ppUL80a del genoma del CMVH, proporciona ensayos inmunológicos que tienen una sensibilidad incrementada y que pueden ser más específicos que los inmunoensayos de IgM hacia CMVH que utilizan epítopos del vi-
rus.

En el inmunoensayo automatizado de IgM hacia CMVH, se utilizaron tres proteínas recombinantes expresadas en E. coli, CKS-A1C2F3-H10-CKS (rpCMV-27), CKS-pp65-CKS (rpCMV-28) y CKS-pp38-CKS (rpCMV-29), que representaban cuatro regiones distintas del genoma del CMVH. Cada uno de estos polipéptidos recombinantes fue preparado de acuerdo con el Ejemplo 10 (A, B y C) y con el Ejemplo 11. En el inmunoensayo automatizado, cada uno de estos tres antígenos recombinantes fue revestido separadamente sobre micropartículas de poliestireno, un antígeno por micropartícula. El inmunoensayo automatizado puede ser realizado en un modo de operación secuencial o en un modo de operación combinado. En una modificación del inmunoensayo automatizado, estos tres antígenos recombinantes pueden ser revestidos todos juntos sobre la misma micropartícula de poliestireno, tres antígenos por micropartícula. El inmunoensayo automatizado modificado puede ser realizado en un modo de operación combinado.

Las micropartículas de poliestireno (2,65 \mum de tamaño) en agua destilada fueron introducidas en una solución que contenía Tris 50 mM, cloruro de sodio 137 mM, azida de sodio 0,1%, pH 7,5. Las micropartículas de poliestireno fueron dispensadas posteriormente en tres botellas separadas denominadas rpCMV-27, rpCMV-28 y rpCMV-29. A la botella que contenía rpCMV-27 se añadió rpCMV-27 recombinante en Tris 50 mM, pH 8,5, para dar una concentración final de 25-100 \mug/ml. A la botella que contenía rpCMV-28 se añadió rpCMV-28 recombinante en Tris 50 mM, pH 8,5, para dar una concentración final de 25-100 \mug/ml. A la botella que contenía rpCMV-29 se añadió rpCMV-29 recombinante en Tris 50 mM, pH 8,5, para dar una concentración final de 25-100 \mug/ml. La concentración final de las micropartículas de poliestireno en cada botella fue del 1-3% de sólidos. Las botellas fueron rotadas extremo sobre extremo (30-50 rpm) durante dos horas a temperatura ambiente (19-22ºC) y posteriormente fueron centrifugadas a 10.000-15.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las micropartículas, que estaban en forma de pellas, fueron luego resuspendidas en una mezcla que contenía Tris 90 mM, cloruro de sodio 135 mM, EDTA disódico 100 mM, sacarosa 6%, "TWEEN-20" 0,18%, suero de ternera fetal 50% (libre de anticuerpos hacia CMV), 35 \mug/ml de proteína CKS, pH 7,5, para dar una concentración final del 0,1-0,25% de sólidos. Las micropartículas fueron luego cargadas en botellas de plástico.

Las micropartículas de poliestireno revestidas con rpCMV-27, rpCMV-28 y rpCMV-29 fueron utilizadas en un formato de captura de anticuerpos en un inmunoensayo automatizado realizado en el instrumento "IMx"® de ABBOTT (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois). Las micropartículas revestidas anteriormente mencionadas pueden ser utilizadas también en un formato de captura de anticuerpos en un inmunoensayo automatizado realizado en el instrumento "AxSYM"® de Abbott (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois).

Estos sistemas emplean dispositivos de pipeteo que dispensan automáticamente las muestras de suero y los reactivos. Estos instrumentos emplean un lector óptico que puede medir la reflectancia de la emisión de fluorescencia a 448 nm procedente de la matriz de la muestra. En el modo de operación secuencial, la muestra de suero es incubada separadamente con cada una de las tres micropartículas revestidas. En el modo de operación combinado, volúmenes iguales de cada una de las tres micropartículas revestidas son mezclados antes de la incubación con la muestra de suero. En los dos modos la solución madre de micropartículas apropiada es dispensada en botellas de plástico y posteriormente cargada en el instrumento.

El conjugado preferido es un conjugado de anti-IgM humana producido en cabra con fosfatasa alcalina. El conjugado es titulado para determinar una concentración de trabajo de 1-5 \mug/ml. El diluyente del conjugado incluye Tris 90 mM, cloruro de sodio 135 mM, suero de ternera fetal 5%, azida de sodio 0,1%, pH 7,4. El conjugado es esterilizado por filtración, envasado en botellas de plástico y cargado en el instrumento. El sustrato preferido para el instrumento es 4-metilumbeliferil fosfato.

Se prepara un calibrador de índice anti-CMVH positivo a partir de unidades de plasma positivas para anticuerpos hacia CMVH. El conjunto de unidades incluye plasma con anticuerpos reactivos hacia rpCMV-27, rpCMV-28 y rpCMV-29. Las unidades agrupadas son recalcificadas, alicuotadas y almacenadas a -20ºC o a 2-8ºC. Para cada lote de calibrador de índice positivo, la solución madre es diluida con control negativo conteniendo un 0,1% de azida de sodio como conservante. El material final es esterilizado por filtración y envasado en botellas de plástico.

Se prepara un control anti-CMVH negativo a partir de plasma humano recalcificado negativo para anticuerpos hacia las proteínas rpCMV-27, rpCMV-28 y rpCMV-29 del CMVH. El plasma es también negativo para anticuerpos hacia el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y negativo para el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Las unidades son agrupadas y se añade un 0,1% de azida de sodio como conservante. El material final es esterilizado por filtración y envasado en botellas de plástico.

Las muestras de suero a analizar son añadidas a los recipientes de reacción del instrumento. Se introduce el código apropiado para llevar a cabo el inmunoensayo automatizado de IgM hacia CMV y posteriormente comienza el ensayo. El instrumento diluye la muestra de suero en el diluyente del circuito (fosfato de sodio 0,1 M, azida de sodio 0,1%, pH 7,5 o cloruro de sodio 0,3 M, Tris 0,1 M, azida de sodio 0,1%, pH 7,5) y posteriormente añade las micropartículas a la muestra de suero diluida. Después de una incubación durante 5-10 minutos, la mezcla es transferida posteriormente a la matriz del recipiente de reacción. La matriz es lavada con el diluyente del circuito y posteriormente el conjugado es añadido a la matriz del recipiente de reacción. Después de una incubación durante 8-10 minutos, la matriz es lavada con el diluyente del circuito y posteriormente se añade el sustrato para el conjugado. La reflectancia de la emisión de fluorescencia a 448 nm procedente de la matriz de la muestra es leída inmediatamente y el instrumento proporciona un valor de la intensidad del contaje y un valor índice para cada muestra. El valor índice es igual al valor de la intensidad del contaje de la muestra dividido por el valor de la intensidad del contaje del calibrador de índice positivo.

Con el fin de mantener una especificidad aceptable del ensayo, el valor de corte del ensayo debe ser al menos 3-4 desviaciones estándar por encima de la media de los valores del índice de las muestras negativas. El valor de corte para el inmunoensayo automatizado de IgM hacia el CMVH fue fijado como un valor del índice de 0,6. Cualquier muestra con un valor del índice mayor o igual a 0,5 tenía que ser tratada con el reactivo de neutralización factor reumatoide y posteriormente procesada de nuevo en el instrumento. Las muestras con un valor del índice igual o mayor de 0,6 fueron consideradas positivas para anticuerpos IgM hacia el CMVH. Las muestras con un valor del índice de 0,500-0,599 fueron consideradas equívocas y las muestras con un valor del índice menor de 0,500 fueron consideradas negativas para anticuerpos IgM hacia el CMVH. Las características de las proteínas de fusión utilizadas en el ensayo están presentadas en la Tabla 3.

Funcionamiento del inmunoensayo de IgM hacia CMVH automatizado

El funcionamiento del inmunoensayo automatizado de IgM hacia CMVH fue evaluado analizando siete muestras de suero negativas para IgM hacia el CMVH y once muestras de suero positivas para IgM del CMVH. El título de anticuerpos IgM hacia el CMVH de estas muestras fue determinado inicialmente utilizando el EIA recombinante para microvaloración de IgM hacia el CMVH descrito en el Ejemplo 13. Se confirmó que todas las muestras positivas para IgM hacia el CMVH eran positivas mediante Transferencia Western utilizando un antígeno vírico purificado (ver la Tabla 5). Todas las muestras positivas para IgM hacia el CMVH fueron tratadas con el reactivo de neutralización factor reumatoide antes de procesarlas en los inmunoensayos descritos a continuación en (a) y (b).

(a) - Modo de operación secuencial

En el modo de operación secuencial del inmunoensayo automatizado, cada muestra de suero/plasma es analizada separadamente utilizando las micropartículas revestidas con rpCMV-27, las micropartículas revestidas con rpCMV-28 y las micropartículas revestidas con rpCMV-29.

Una muestra es considerada positiva para anticuerpos IgM hacia el CMVH en el modo de operación secuencial cuando el valor del índice de la muestra es igual o mayor que 0,6 con cualquiera de las micropartículas revestidas con rpCMV-27 o con cualquiera de las micropartículas revestidas con rpCMV-28 o con cualquiera de las micropartículas revestidas con rpCMV-29.

Una muestra es considerada equívoca para anticuerpos IgM hacia el CMVH en el modo de operación secuencial cuando el valor del índice de la muestra es 0,500-0,599 con las micropartículas revestidas con rpCMV-27 o con las micropartículas revestidas con rpCMV-28 o con las micropartículas revestidas con rpCMV-29.

Una muestra es considerada negativa para anticuerpos IgM hacia el CMVH en el modo de operación secuencial cuando el valor del índice de la muestra es menor de 0,500 con las micropartículas revestidas con rpCMV-27, rpCMV-28 y rpCMV-29. Según se muestra en las Tablas 4 y 5, se determinó que todas las muestras negativas eran negativas para anticuerpos IgM hacia el CMVH y se determinó que todas las muestras positivas eran positivas para anticuerpos IgM hacia el CMVH en el modo de operación secuencial del inmunoensayo automatizado de IgM hacia el CMVH.

(b) - Modo de operación combinado

En el modo de operación combinado del inmunoensayo automatizado, cada muestra de suero/plasma es analizada utilizando una mezcla de volúmenes iguales de micropartículas revestidas con rpCMV-27, rpCMV-28 y rpCMV-29 (micropartículas agrupadas). Una muestra es considerada positiva para anticuerpos IgM hacia el CMVH en el modo de operación combinado, cuando el valor del índice de la muestra es igual o mayor que 0,6 con las micropartículas agrupadas. Una muestra es considerada equívoca para anticuerpos IgM hacia el CMVH en el modo de operación combinado cuando el valor del índice de la muestra es 0,500-0,599 con las micropartículas agrupadas. Una muestra es considerada negativa para anticuerpos IgM hacia el CMVH en el modo de operación combinado cuando el valor del índice de la muestra es menor de 0,500 con las micropartículas agrupadas. Según se muestra en las Tablas 4 y 5, se determinó que todas las muestras negativas eran negativas para anticuerpos IgM hacia el CMVH y se determinó que todas las muestras positivas eran positivas para anticuerpos IgM hacia el CMVH en el modo de operación combinado del inmunoensayo automatizado de IgM hacia el CMVH.

Ejemplo 13 Inmunoensayo manual de IgG/IgM hacia CMVH 1. Serología del CMVH

1.1- EIA Convencional (conv-EIA). La evaluación de IgG anti-CMVH se llevó a cabo con un kit comercial ("ENZYGNOST" método alfa de EIA de IgG/anti-CMVH, Behring AG, Marburg, Alemania). Las placas fueron leídas en un lector automático de microEIA (Behring AG, Marburg, Alemania). La evaluación de IgM anti-CMVH fue realizada utilizando el kit para IgM/anti-CMVH "ENZYGNOST" (Behring AG, Alemania). Se utilizaron ambos kits y los resultados fueron interpretados según las sugerencias de los fabricantes.

1.2- Transferencia Western (WB). Extractos de proteína procedentes de partículas víricas purificadas (cepa Towne) fueron procesados en un gel de acrilamida al 9% y los polipéptidos separados electroforéticamente fueron transferidos posteriormente a un papel de nitrocelulosa. La infección de las células, la purificación del virus, la extracción de proteínas, la transferencia y la reacción inmune con los sueros se realizaron según se ha descrito con detalle previamente [16].

1.3- EIA Recombinante (rec-EIA). El EIA fue realizado siguiendo el procedimiento y utilizando los reactivos del kit comercial "ENZYGNOST" para IgG e IgM/anti-CMVH (Behring, Marburg, Alemania). Brevemente, se utilizaron 0,05 \mug de proteína recombinante purificada por pocillo en tampón bicarbonato (pH 9,6) para revestir placas de plástico de EIA (A/S NUNC, Roskilde, Dinamarca). Después de incubación durante una noche a 4ºC, las placas fueron lavadas tres veces con PBS-"TWEEN 20" (0,05%) e incubadas con BSA (1%) en tampón bicarbonato (pH 9,6). Después de un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente, los pocillos fueron lavados tres veces con PBS-"TWEEN 20" (0,05%) e incubados con muestras de suero humano a una dilución de 1:100 y 1:40 en PBS para IgG e IgM, respectivamente (volumen final 50 \mul). La incubación se llevó a cabo a 37ºC durante 2 horas. Después de tres lavados con PBS-"TWEEN 20", se depositaron en los pocillos anticuerpos anti-IgG o IgM humana producidos en cabra conjugados a peroxidasa, y las placas fueron incubadas a 37ºC durante 1,5 horas. Después de tres lavados con PBS-"TWEEN 20", las inmunorreacciones fueron puestas en evidencia por la adición de un cromógeno - TMB (tetrametilén bencidina diclorhidrato). La reacción fue parada después de una hora por la adición de ácido sulfúrico (0,5 N), y los resultados fueron leídos en un lector automático "MICROEIA". Para cada muestra, se consideró que el nivel de inmunorreacción era la diferencia obtenida entre las absorbancias medidas (A antígeno rec. - A antígeno control). El valor de corte para cada proteína de fusión individual fue determinado mediante el análisis de 210 sueros que no contenían IgM hacia el CMVH (determinado utilizando conv-EIA y WB). Los valores de corte para cada proteína de fusión están presentados en la Tabla 3. Para la determinación de anticuerpos IgM, se utilizó "el absorbente de FR" (Behring, Marburg, Alemania) para eliminar el factor reumatoide de las muestras de suero. Con el fin de realizar el análisis de regresión lineal y estandarizar el proceso del ensayo, todas las placas incluían tres calibradores de suero. La reproducibilidad fue controlada mediante la inclusión en cada placa de EIA de seis sueros estándar cuya reactividad se había analizado previamente en cuatro experimentos independientes. Los procesos de los ensayos fueron considerados aceptables cuando el valor de los sueros control interno estaba dentro del intervalo de dos desviaciones estándar del valor medio previamente establecido.

2. Muestras de suero humano

Se utilizaron en este trabajo muchos grupos de muestras de suero humano (sueros). El primer grupo de muestras, que fue utilizado para la determinación de los valores de corte, constaba de 210 sueros procedentes de donantes de sangre (150) y de adultos sanos (60). Mientras que sesenta y ocho sueros eran IgG/IgM-, 142 eran IgG+/IgM- según se estimó por conv-EIA y transferencia Western. El segundo grupo de sueros constaba de 150 muestras positivas para CMVH procedentes de sujetos inmunocompetentes (50 con un elevado título de IgM hacia CMVH según se detectó por conv-EIA, 50 con un nivel medio de IgM y 50 con un nivel bajo de IgM específica de CMVH). La presencia de IgM específica de CMVH en este grupo de sueros fue determinada por conv-EIA y confirmada por Transferencia Western. Un tercer grupo de sueros constaba de 51 sueros procedentes de mujeres embarazadas (18 eran de mujeres no infectadas con CMVH, 26 de mujeres infectadas con CMVH que no transmitieron la infección y 7 de mujeres embarazadas infectadas con CMVH que transmitieron la infección). Todos estos sueros fueron obtenidos entre las 22 y 24 semanas de gestación. Se analizó también un grupo de 35 sueros procedentes de 35 recién nacidos: 6 muestras de suero fueron obtenidas durante la primera semana de vida de 6 recién nacidos infectados congénitamente, 19 sueros eran de recién nacidos (1-8 meses de vida) en los que el virus había sido aislado repetidamente de la orina. Doce recién nacidos tenían diferentes síntomas (erupción maculopapular, encefalopatía, retraso en el crecimiento), los otros eran portadores asintomáticos. Finalmente, diez sueros procedían de recién nacidos no infectados con CMVH durante los primeros 8 meses de vida. Otro grupo de muestras constaba de 104 sueros procedentes de 23 pacientes trasplantados (20 receptores de trasplante de corazón y 3 de riñón) que sufrieron una infección con CMVH durante los 3 primeros meses después del trasplante. Ocho pacientes tenían una infección primaria, mientras que 15 experimentaron una reactivación del virus. El último grupo constaba de 200 muestras de suero seleccionadas aleatoriamente entre sueros procedentes de receptores de trasplante renal (150) y de mujeres embarazadas (150) que vinieron al laboratorio de diagnóstico para la monitorización de CMVH después de un trasplante y durante el
embarazo.

3. Determinación de una infección por CMVH en una mujer embarazada y en recién nacidos

La infección por CMVH en mujeres embarazadas fue determinada mediante uno o más de los parámetros siguientes: aislamiento del virus de la orina, saliva, sangre, seroconversión para anticuerpos anti-CMVH. Una infección congénita por CMVH en un recién nacido fue determinada por aislamiento del CMVH de la orina durante la primera semana de vida. Una infección por CMVH en recién nacidos fue determinada por aislamiento del virus de la
orina.

4. Determinación de la infección por CMVH en pacientes trasplantados

La infección por CMVH en pacientes trasplantados fue determinada por la presencia de PMNL pp65-positivos (antigenemia) en sangre periférica según se determinó mediante inmunofluorescencia indirecta y por la presencia del genoma de CMVH en las mismas células determinada por PCR.

5. Detección virológica del CMVH

Aislamiento del CMVH. Se utilizó el procedimiento del "shell vial" [23] para el aislamiento de CMVH de orina y saliva. Las células inoculadas fueron fijadas 24-48 horas después de la inoculación y teñidas en un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IIF) utilizando un anticuerpo monoclonal que reaccionaba con el producto de los genes IE1/IE2 del CMVH (EI3 de Bioline, Paris, Francia).

Antigenemia. La presencia de pp65 del CMVH (ppUL83) en PMNL fue determinada según fue descrito originalmente por Schirm y col. [24] y modificado por Revello y col. [25] utilizando un grupo de dos anticuerpos monoclonales específicos de pp65 del CMVH (Biotest, Frankfurt, Alemania) en ensayos de IIF.

Determinación de la presencia del genoma de CMVH por PCR. Alícuotas de 5 x 10^{5} PMNL fueron resuspendidas en 100 \mul de tampón de PCR (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 2 mM, gelatina 0,01%), con detergentes no iónicos y Proteinasa K. Las muestras fueron incubadas a 60ºC durante una hora y posteriormente a 95ºC durante 20 minutos para inactivar la proteinasa. Se añadieron 30 \mul de cada muestra a 20 \mul de tampón de reacción que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 2 mM, 0,2 mM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos, 50 picomoles de cada cebador y 1,25 unidades de ADN polimerasa Taq nativa (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, EE.UU.). Los cebadores específicos para CMVH fueron sintetizados por Genset (Paris, Francia). Las secuencias proceden del 4º exón del gen temprano inmediato de CMVH (fragmento J de EcoRI de la cepa AD169) y corresponden a los nucleótidos 1767 a 1786 y del nucleótido 1894 al 1913. Utilizando estos cebadores, se amplificó un fragmento de 147 pares de bases. Un tercer oligonucleótido, que constaba de los nucleótidos 1807-1847, era complementario a la hebra de ADN antisentido en la región entre los sitios de unión de los demás oligonucleótidos y fue utilizado para hibridación [26]. La reacción de amplificación fue llevada a cabo en un ciclador térmico de ADN (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT, EE.UU.) durante 35 ciclos. Cada muestra fue sometida inicialmente a análisis con los cebadores oligonucleotídicos GH26 y GH27 (Perkin Elmer Cetus) (20 pmoles de cada uno), con una región conservada en el flanco del locus HLA-DQa, con el fin de determinar la capacidad del ADN para ser amplificado. Quince microlitros de la mezcla de reacción fueron sometidos a electroforesis en un gel de "NUSIEVE" GTG-agarosa al 1,2% y Seakem LE-agarosa al 0,4% (FMC Bioproducts, Rockland, ME, EE.UU.). El ADN fue visualizado mediante fluorescencia UV después de tinción con bromuro de etidio. Los ácidos nucleicos fueron desnaturalizados y neutralizados utilizando procedimientos estándar y transferidos posteriormente a membranas de nailon (Mybond N, Amersham, R.U.) utilizando un aparato de trans-transferencia (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, California). La hibridación con un oligonucleótido marcado terminalmente se llevó a cabo mediante un kit comercial (sistema de oligomarcaje 3' y detección, ECL, Amersham, R.U.) según las sugerencias de los fabricantes. La sensibilidad y la especificidad de la reacción de PCR fueron determinadas según está descrito en un trabajo previo [27].

6. Resultados

Según está resumido en la Tabla 3, se han analizado comparativamente cinco proteínas de fusión diferentes.

La primera proteína de fusión (rpCMV-1A) lleva fusionadas las dos regiones antigénicas principales de ppUL32. La segunda proteína de fusión (rpCMV-3B) lleva la mitad COOH de ppUL44. La tercera proteína de fusión (rpCMV-4) lleva tres regiones fusionadas (dos regiones de ppUL32 y una de ppUL44). Las proteínas de fusión rpCMV-9 y rpCMV-26 llevan fragmentos grandes de ppUL83 y ppUL80a, respectivamente. Los valores de corte del ensayo manual, para cada proteína recombinante, están presentados en la Tabla 3 y corresponden a valores de Densidad Óptica mayores que el valor máximo obtenido de las 210 muestras de suero (corresponden aproximadamente a los valores medios más 4-5 desviaciones estándar). Con el fin de evaluar la sensibilidad del rec-EIA, se seleccionaron 150 muestras de suero de varios cientos de sueros porque contenían definitivamente IgM hacia CMVH, ya que dieron un resultado positivo para IgM con el conv-EIA y con la WB. Los sueros fueron divididos en tres grupos sobre la base del título de IgM específica de CMVH en el conv-EIA. En particular, se consideró que los sueros con valores de DO entre 210 y 400 tenían un título bajo de IgM; se consideró que aquéllos con una DO (x 10^{3}) de 401 a 800 tenían un título medio y se consideró que aquéllos con una DO (x 10^{3}) mayor de 800 tenían un título elevado de IgM. Según está resumido en la Tabla 6, todos los sueros con títulos medios y elevados de IgM hacia CMVH reaccionaban con una o más proteínas de fusión. Entre los sueros con un título bajo de IgM, solamente dos no fueron detectados por ninguna proteína de fusión. El % de reactividad es por tanto mayor del 98%. La reactividad más elevada obtenida fue contra las proteínas de fusión rpCMV-3B y rpCMV-4, y la combinación de las proteínas rpCMV-4, rpCMV-9 y rpCMV-26 produjo una reactividad del 98%. Solamente un suero no reaccionó con esta combinación, y se encontró que era reactivo con la proteína de fusión rpCMV-3B sola.

Habiendo determinado la elevada sensibilidad del EIA recombinante, se analizaron varios sueros obtenidos de diferentes grupos de sujetos. La Tabla 7 compara los resultados obtenidos mediante el EIA recombinante con cincuenta y un sueros obtenidos de mujeres embarazadas con los resultados obtenidos mediante un conv-EIA con los mismos sueros. Entre dieciocho mujeres embarazadas no infectadas con CMVH, no se encontró ninguna positiva para IgM mediante EIA convencional ni mediante EIA recombinante. Por el contrario, entre las veintiséis mujeres embarazadas infectadas con CMVH que no transmitieron la infección a su descendencia, el EIA recombinante detectó IgM en veinte casos, mientras que el conv-EIA detectó IgM en solamente doce casos. Entre un grupo de ocho mujeres embarazadas infectadas con CMVH que transmitieron la infección, las ocho fueron todas encontradas positivas para IgM mediante el EIA recombinante y seis mediante el conv-EIA. La reactividad más elevada fue siempre obtenida con la proteína de fusión de los tres antígenos (proteína de fusión rpCMV-4). La combinación de las proteínas rpCMV-4, rpCMV-9 y rpCMV-26 produjo la máxima reactividad. Según se muestra en la Tabla 7, se observó una diferencia significativa en el título de IgM para la proteína de fusión rpCMV-4 entre las mujeres embarazadas infectadas con CMVH que no transmitieron la infección (títulos más bajos) y aquéllas que transmitieron la infección (títulos más elevados). Aunque menos significativo, también el título contra rpCMV-26 fue diferente en los dos grupos (Tabla 7). Las diferencias entre los títulos para las proteínas de fusión rpCMV-3B y rpCMV-9 no fueron significativas.

Se analizó también un grupo de treinta y cinco sueros de recién nacidos (Tabla 8). Entre diez recién nacidos no infectados con CMVH, no se encontró ninguno IgM-positivo ni por el EIA convencional ni por el EIA recombinante. Por el contrario, entre seis sueros obtenidos de seis recién nacidos infectados congénitamente durante la primera semana de vida, dos dieron una reacción positiva por el rec-EIA y ninguno con el análisis convencional. La máxima reactividad de IgM observada era específica para las proteínas de fusión rpCMV-9 y rpCMV-26. En otro grupo de diecinueve sueros procedentes de recién nacidos que excretaban persistentemente CMVH en la orina durante el primer año de vida (estos recién nacidos no fueron analizados para determinar CMVH en el momento del nacimiento) el rec-EIA detectó IgM en diez casos, mientras que el conv-EIA detectó IgM en solamente dos casos. La máxima reactividad de IgM obtenida fue contra las proteínas de fusión rpCMV-4 y rpCMV-26 y la combinación de rpCMV-4, rpCMV-9 y rpCMV-26 produjo la máxima reactividad.

En las Figuras 17A y 17B se muestran ejemplos representativos de la monitorización virológica y serológica de la infección por CMVH en receptores de trasplantes. En la Figura 17A se muestran tres casos de infecciones primarias por CMVH y en la Figura 17B se muestran tres casos de infecciones secundarias por CMVH. A1 y A2 son los seguimientos de receptores de trasplante renal, A3, B1, B2 y B3 de receptores de trasplante de corazón. S+T indica Síntomas y Tratamiento con Ganciclovir; PCR+ indica una detección positiva del genoma de CMVH en células polimorfonucleares.

A partir de los datos presentados, la proteína de fusión rpCMV-4 era la que producía la reactividad más elevada con los anticuerpos IgM presentes en el suero de adultos sanos, mujeres embarazadas, recién nacidos infectados y receptores de trasplante. Sin embargo, la proteína de fusión rpCMV-4 sola no podía representar el complejo completo de antígeno vírico que reaccionaba con la IgM anti-CMVH. Por el contrario, la combinación de las proteínas de fusión rpCMV-4, rpCMV-9 y rpCMV-26 puede sustituir eficazmente al virus en la detección de IgM. De hecho, según se muestra en las Tablas 9 y 10, el 99,6% de los sueros positivos para IgM daba una reacción de IgM positiva con una o más de estas proteínas de fusión. Cuando se comparó el rec-EIA con los tres clones con el conv-EIA y la WB, el rec-EIA y la WB dieron los mismos resultados, y ambos procedimientos fueron más sensibles que el conv-EIA. Esto significa que la sensibilidad y la especificidad del rec-EIA de acuerdo con la presente invención son muy similares a las de la WB, que es un procedimiento muy sensible y específico para la detección de IgM hacia CMVH [30, 31].

Lista de referencias

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(1) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 908 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): LOCALIZACIÓN: 1..900

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

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1

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 300 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

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4

5

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(3) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 906 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Citomegalovirus Humano (CMVH)

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: pCMV-27

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..906

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN:/función= "antígeno de CMVH"

\hskip4cm

/producto= "proteína de fusión a1c2f3h10"

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

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6

7

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(4) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 302 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

Claims

1. Un material proteico recombinante, capaz de unirse a anticuerpos contra citomegalovirus (CMVH), caracterizado porque comprende una proteína de fusión que contiene una primera región, que lleva una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a anticuerpos contra el CMVH, estando dicha secuencia entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, leída en la dirección 5'\rightarrow3', de la proteína pp52, una segunda región que lleva una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a anticuerpos contra el CMVH, estando dicha secuencia entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, leída en la dirección 5'\rightarrow3', de la proteína pp150, y una tercera región, que lleva una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a anticuerpos contra el CMVH, estando dicha secuencia entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, leída en la dirección 5'\rightarrow3', de la proteína pp150; siendo dichas regiones capaces de ser colocadas de forma variable unas con respecto de otras dentro de la proteína de fusión.

2. Un material proteico recombinante como el reivindicado en la Reivindicación 1, en el que dichas regiones incluyen la secuencia de aminoácidos completa para cada una de dichas secuencias de la proteína pp52 y de la proteína pp150.

3. Un material proteico recombinante como el reivindicado en la Reivindicación 2, que comprende de una manera secuencial, en dirección 5'\rightarrow3': dicha primera región, inmediatamente corriente abajo de la misma está situada dicha tercera región, y posteriormente dicha segunda región, corriente abajo de dicha tercera región, estando insertada una secuencia puente entre dicha tercera y dicha segunda región.

4. Un material proteico recombinante como el reivindicado en la Reivindicación 3, en el que dicha secuencia puente consta de la serie de aminoácidos siguiente, en dirección 5'\rightarrow3':

lys leu gln glu phe.

5. Un material proteico recombinante como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha proteína de fusión comprende al menos una porción de la \beta-galactosidasa.

6. Un material proteico recombinante capaz de unirse a anticuerpos contra el citomegalovirus humano (CMVH), que comprende una proteína de fusión, estando codificada al menos parte de los aminoácidos de la misma por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:1, leída desde el nucleótido 001 al 900, o por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:3, leída desde el nucleótido 001 al 906.

7. Una mezcla de antígenos recombinantes para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante un inmunoensayo enzimático, conteniendo dicha mezcla en combinación:

(i) una primera proteína de fusión que comprende: una primera región, que lleva una secuencia de aminoácidos (H10) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína vírica pp52; una segunda región, que lleva una secuencia de aminoácidos (F3) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína vírica pp150; y una tercera región que lleva una secuencia de aminoácidos (A1C2) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, de la misma proteína vírica pp150; estando codificada al menos una parte de los aminoácidos de la misma por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:1, leída desde los nucleótidos 001 al 900, o por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:3, leída desde los nucleótidos 001 al 906;

(ii) una segunda proteína de fusión que comprende una región inmunogénica que contiene en una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 297 y el aa 510, ambos inclusive, de la proteína de la matriz principal del virus pp65 codificada por el gen vírico UL83; y

8. Una mezcla de antígenos recombinantes como la reivindicada en la Reivindicación 7, en la que dichas regiones incluyen la secuencia de aminoácidos completa para cada una de dicha primera región H10, dicha segunda región F3, dicha tercera región A1C2, la proteína pp65 y la proteína pp38.

9. Una mezcla de antígenos recombinantes como la reivindicada en la Reivindicación 7 u 8, en la que cada una de dichas proteínas de fusión contiene al menos una porción de la proteína CKS.

10. Un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico, que comprende un vector de expresión pROS, en el que la secuencia de ADN SEC ID Nº:1 ha sido insertada en el sitio de SmaI, desde el nucleótido 002 al 907.

11. Un plásmido de acuerdo con la Reivindicación 10, en el que el organismo huésped es E. coli.

12. Un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico que comprende, combinadas, una primera secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína pp52 del CMVH, una segunda secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína pp150, y una tercera secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, de la proteína pp150, en el que la secuencia de ADN SEC ID Nº:3 está incluida en su totalidad o en el que está incluida la SEC ID Nº:1 desde el nucleótido 002 hasta el nucleótido 907.

13. Un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico, que comprende un vector de expresión pJO200 según está definido en la Figura 10, en el que la secuencia de ADN SEC ID Nº:3 ha sido insertada entre los sitios correspondientes de SacI y BamHI, desde el nucleótido 001 al 906.

14. Un organismo huésped recombinante que contiene un plásmido como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 13, capaz de producir una proteína de fusión que contiene una primera región, que lleva una secuencia de aminoácidos (H10) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína vírica pp52; una segunda región, que lleva una secuencia de aminoácidos (F3) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína vírica pp150; y una tercera región, que lleva una secuencia de aminoácidos (A1C2) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, de la misma proteína pp150 del virus.

15. Un material proteico recombinante, capaz de unirse a anticuerpos específicos del citomegalovirus humano (CMVH), que comprende una mezcla de proteínas de fusión expresadas en un organismo huésped en el que se ha insertado al menos uno de los plásmidos siguientes: un plásmido como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 13; un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico, que contiene un secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo que se une a IgM específica del CMVH, entre el aa 297 y el aa 510, ambos inclusive, de la proteína de la matriz principal de CMVH pp65 codificada por el gen UL83 del virus, estando dicha secuencia ligada en el extremo 3' de una segunda secuencia correspondiente a la secuencia desde el aminoácido 1 al aminoácido 240, ambos inclusive, que codifica la proteína CKS; un plásmido capaz de ser insertado en un organismo huésped procariótico o eucariótico, que comprende una secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 117 y el aa 373, ambos inclusive, de la proteína de ensamblaje del CMVH pp38 codificada por el gen UL80a del virus, estando dicha secuencia ligada al extremo 3' de una segunda secuencia correspondiente a la secuencia desde el aminoácido 1 al aminoácido 240, ambos inclusive, que codifica la proteína CKS.

16. Un reactivo de diagnóstico para diagnosticar una infección por CMVH mediante métodos serológicos, que comprende una proteína de fusión como la reivindicada en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6.

17. Un reactivo de diagnóstico para diagnosticar una infección por CMVH mediante métodos serológicos, que comprende una proteína de fusión conteniendo la secuencia SEC ID Nº:2.

18. Un reactivo de diagnóstico para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante un inmunoensayo enzimático, que comprende la mezcla de proteínas de fusión según se reivindicó en cualquiera de las Reivindicaciones 7 a 9 y 15.

19. Un reactivo de diagnóstico adecuado para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante un inmunoensayo enzimático, que comprende una primera proteína de fusión según se reivindicó en la Reivindicación 7.

20. Un reactivo de diagnóstico para detectar una infección por CMVH mediante métodos serológicos, que comprende una proteína de fusión conteniendo la SEC ID Nº:4.

21. Un kit de diagnóstico para detectar, mediante métodos serológicos, la presencia de anticuerpos hacia el citomegalovirus humano (CMVH), que contiene un reactivo de diagnóstico como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 16 a 20, en el que dicho reactivo de diagnóstico está adsorbido sobre un medio sólido.

22. Un kit de diagnóstico para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante un inmunoensayo enzimático, que comprende una pluralidad de micropartículas, estando revestida cada una de dichas micropartículas con al menos una de las proteínas de fusión de la mezcla según se reivindicó en las Reivindicaciones 7 a 9 y 15.

23. Un kit de diagnóstico para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante un inmunoensayo enzimático, que comprende una pluralidad de micropartículas, estando revestida cada una de dichas micropartículas con la mezcla que contiene las tres proteínas de fusión según se reivindicó en las Reivindicaciones 7 a 9 y 15.

24. Un método para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante un inmunoensayo enzimático, comprendiendo dicho métodos las etapas de:

provisión de una mezcla de proteínas de fusión, conteniendo la mezcla en combinación:

(ii) una segunda proteína de fusión que comprende una región inmunogénica que consta de una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 297 y el aa 510, ambos inclusive, de la proteína de la matriz principal del virus pp65 codificada por el gen vírico UL83; y

(iii) una tercera proteína de fusión que comprende una región inmunogénica que consta de una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 117 y el aa 373, de la proteína de ensamblaje del virus pp38 codificada por el gen vírico UL80a,

la adición de un sustrato para el enzima y

la monitorización de la reacción entre el conjugado y el sustrato con el fin de determinar la concentración de IgM específica de citomegalovirus en el suero.

25. Un método de preparación de un medio sólido conteniendo una mezcla de proteínas de fusión para preparar un kit de diagnóstico para detectar IgM específica de citomegalovirus en sueros humanos mediante inmunoensayo enzimático, comprendiendo dicho método:

el suministro de una mezcla que contiene en combinación: (i) una primera proteína de fusión que comprende: una primera región, que lleva una secuencia de aminoácidos (H10) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 202 y el aa 434, ambos inclusive, de la proteína vírica pp52; una segunda región, que lleva una secuencia de aminoácidos (F3) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 1006 y el aa 1048, ambos inclusive, de la proteína vírica pp150; y una tercera región que lleva una secuencia de aminoácidos (A1C2) correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 595 y el aa 614, ambos inclusive, de la misma proteína vírica pp150; estando codificada al menos una parte de los aminoácidos de la misma por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:1, leída desde los nucleótidos 001 al 900, o por la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº:3, leída desde los nucleótidos 001 al 906; (ii) una segunda proteína de fusión que comprende una región inmunogénica que consta de una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 297 y el aa 510, ambos inclusive, de la proteína de la matriz principal del virus pp65 codificada por el gen vírico UL83; y (iii) una tercera proteína de fusión que comprende una región inmunogénica que consta de una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos un epítopo que se une a IgM específica de CMVH, entre el aa 117 y el aa 373, de la proteína de ensamblaje del virus pp38 codificada por el gen vírico UL80a, y

permitiendo que dicha mezcla sea adsorbida sobre al menos un medio sólido.

26. Un método de acuerdo con la Reivindicación 25, en el que cada una de dichas proteínas de fusión de dicha mezcla son adsorbidas separadamente sobre diferentes medios sólidos, una proteína por medio.