ES2231039B1 - Modelos animales transgenicos en drosophila para enfermedades geneticas humanas provocadas por expansiones de microsatelites que contienen el trinucleotido ctg. - Google Patents
Modelos animales transgenicos en drosophila para enfermedades geneticas humanas provocadas por expansiones de microsatelites que contienen el trinucleotido ctg. Download PDFInfo
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Abstract
La invención describe modelos animales transgénicos en Drosophila para enfermedades en cuyo estado patológico sea relevante la presencia de expansiones de microsatélites basados en la secuencia CTG, como por ejemplo la distrofia miotónica de tipo 1 y 2, la ataxia espinocerebelar 8 y la HDL2. La invención trata de la aplicación de un transgén que incluye, total o parcialmente, una secuencia microsatélite basada en la secuencia CTG, a un modelo animal transgénico. Este modelo transgénico se ha obtenido mediante la integración estable del transgén en el genoma de Drosophila melanogaster. En dichos animales, el transgén se expresa fenotípicamente, de forma controlada, en cualquiera de sus estadios de desarrollo. Los modelos animales de la invención son de aplicación en la investigación de los mecanismos de patogénesis en las enfermedades en cuyo estado patológico sean relevantes las expansiones de microsatélites que contengan la secuencia CTG, como dispositivos de ensayo de posibles compuestosterapéuticos para el tratamiento de dichas enfermedades y como dispositivos de validación in vivo de tratamientos potenciales de las mismas.
Description
Modelos animales transgénicos en
Drosophila para enfermedades genéticas humanas provocadas
por expansiones de microsatélites que contienen el trinucleótido
CTG.
Esta invención tiene utilidad en el sector de la
Biomedicina y en el sector Biofarmacéutico. Dentro de estos
sectores, el campo específico de utilidad es el uso de animales
transgénicos como modelos que permitan investigar las enfermedades
hereditarias humanas, el desarrollo de tratamientos contra las
mismas y la validación de tratamientos farmacológicos
potenciales.
Las expansiones aberrantes de secuencias
microsatélite en el genoma humano, entendidos éstos como
repeticiones de una secuencia de entre dos y siete nucleótidos, son
el origen de un número creciente de enfermedades hereditarias. De
entre ellas destacan las distrofias miotónicas (DM), un tipo de
distrofia frecuente en personas adultas, las ataxias, en especial
la ataxia espinocerebelar 8 (SCA8), y una enfermedad muy semejante
a la enfermedad de Huntington (HDL2 o "Huntington
disease-like 2") todas ellas debidas a la
expansión de un microsatélite que contiene la secuencia CTG. Las
distrofias miotónicas constituyen un grupo de enfermedades
autosómicas dominantes multisistémicas que se caracterizan,
principalmente, por miotonía (incapacidad para relajar los
músculos) y miopatía (degeneración muscular). Las ataxias son un
grupo complejo de enfermedades neurodegenerativas que conducen a
una descoordinación generalizada de extremidades, del modo de
andar y el habla. Los estudios moleculares han identificado varias
expansiones de microsatélites como responsables de estas
enfermedades. En concreto del trinucleótido CTG en la región 3' no
traducida del gen DMPK (DM tipo 1) o en una región no traducida del
transcrito Sca8 (SCA8), o el tetranucleótido CCTG en el primer
intron del gen ZNF9 (DM tipo 2). En el caso de la HDL2 la situación
es menos clara, pero se sabe que por maduración alternativa de los
tránscritos primarios del gen junctofilina-3 se
pueden generar transcritos que contienen entre 51 y 57 repeticiones
del triplete CTG en el intron 1 o en la región 3' no traducida.
En estudios recientes realizados in vitro
e in vivo sobre biopsias de pacientes afectados por DM
(Miller y col., 2000; Mankodi y col. 2001; Fardaei y col. 2002) se
ha demostrado que las expansiones asociadas a las distrofias
miotónicas se unen a las proteínas homólogas a la proteína
Muscleblind (Mbl) del insecto Drosophila melanogaster. Este
hallazgo ha llevado a proponer el siguiente modelo de patogénesis:
las expansiones secuestran todas, o parte, de las proteínas de la
familia Mbl que se encuentran en el núcleo de las células humanas y
este secuestro impide que las proteínas Mbl lleven a cabo su función
fisiológica normal (todavía no aclarada). De este modo, sería la
ausencia de las proteínas Mbl libres la responsable del inicio de la
patogénesis en los pacientes afectados por la distrofia miotónica.
Esta idea viene apoyada por el hecho de que las moscas mutantes para
el gen muscleblind muestran defectos similares a los que presentan
los pacientes afectados por la distrofia miotónica, como es la
ausencia de una estructura de los sarcómeros (los motores
moleculares de los músculos) denominada disco Z. De manera análoga,
las larvas mutantes de Drosophila presentan una
hipercontracción de los músculos, lo cual es homólogo a la miotonía
que muestran los pacientes afectados por las distrofias miotónicas
(Artero y col., 1998). Sin embargo, también se han propuesto otras
rutas de patogénesis que probablemente contribuyen a la
manifestación clínica de estas enfermedades. Así, se ha propuesto
que la expansión de los microsatélites CTG en el gen DMPK podría
llevar a una reducción en la proteína DMPK (hipótesis de la
haploinsuficiencia de DMPK) y que el microsatélite podría tener un
efecto local sobre la estructura de la cromatina conduciendo a una
reducción en la expresión de genes cercanos y/o una alteración en
los dominios de actuación de elementos intensificadores de la
transcripción cercanos (hipótesis del efecto local sobre la
cromatina).
En estos momentos no hay disponible ningún
tratamiento farmacológico específico para los enfermos afectados
por cualquiera de las distrofias miotónicas o por SCA8. Los únicos
tratamientos disponibles están encaminados a aliviar los síntomas
de los pacientes. Sin embargo, los estudios sobre el mecanismo de
patogénesis de las expansiones de microsatélites que incluyen la
secuencia CTG abren la puerta para encontrar posibles dianas
terapéuticas. Los pasos críticos en la identificación y desarrollo
de nuevos agentes terapéuticos son: (a) generar los agentes
terapéuticos candidatos; y (b) la búsqueda sistemática entre los
compuestos candidatos de aquellos que sean seguros y eficaces. Con
la llegada de las metodologías basadas en la química combinatoria,
se pueden generar grandes cantidades de compuestos potencialmente
terapéuticos, conocidas como librerías (colecciones) de compuestos.
Igualmente, basándonos en la diversidad biológica que presenta la
Biosfera, existen colecciones de extractos de plantas, de animales
marinos, etc. Dichas colecciones constituyen conjuntos ordenados de
agentes terapéuticos potenciales. Tras generar los compuestos
potencialmente terapéuticos, se debe buscar sistemáticamente en
estas colecciones aquellos candidatos prometedores, es decir, con
una actividad biológica deseada.
Se han desarrollado protocolos para las
búsquedas sistemáticas de alto rendimiento in vitro. Sin
embargo, estos ensayos para búsquedas sistemáticas deben
complementarse con ensayos in vivo. Dado que no es
éticamente aceptable ensayar directamente en las personas
compuestos con una actividad terapéutica potencial, un paso
importante en la identificación de compuestos con una actividad
biológica deseable en humanos es su empleo previo en búsquedas
sistemáticas en modelos animales no humanos. Como tales, los
modelos animales no humanos de enfermedades hereditarias tales como
las distrofias miotónicas y SCA8 pueden jugar un papel importante
en el descubrimiento de agentes terapéuticos para combatir tales
enfermedades.
Una estrategia complementaria en la búsqueda de
compuestos con una actividad biológica deseable es dilucidar la
ruta molecular de patogénesis de la enfermedad. Es decir,
establecer las relaciones causaefecto que llevan al desarrollo de
los síntomas de esa patología. Cuantos más elementos de la ruta de
patogénesis se identifiquen y se establezcan sus relaciones
causaefecto, más posibilidades existirán de intervenir de una
manera predecible en la corrección del defecto molecular. Una
estrategia adecuada para dilucidar la ruta de patogénesis de una
enfermedad (que además no exige ningún conocimiento a priori
del mecanismo molecular de la misma) es el análisis genético.
Un tipo de animal modelo no humano que se puede
emplear para búsquedas sistemáticas de agentes terapéuticos para el
tratamiento de enfermedades hereditarias y el análisis genético de
las mismas son los modelos animales en mamíferos no humanos, por
ejemplo el ratón. Sin embargo, los ratones son caros de mantener,
tienen un tiempo de reproducción lento y producen una descendencia
reducida. Así pues, el ratón no es un organismo ideal para las
búsquedas sistemáticas de alto rendimiento ni para el análisis
genético.
Por todo lo anterior, existe una necesidad de
describir animales modelo adicionales como modelo de las
enfermedades humanas englobadas como causadas por expansiones de
microsatélites que contengan la secuencia CTG. De interés
particular sería un modelo animal con una longevidad corta, un
ciclo de reproducción rápido y que produzca una gran cantidad de
descendencia. Preferentemente, tal animal debería ser relativamente
simple y barato de mantener en el laboratorio.
Patentes relevantes para esta solicitud son:
Patente estadounidense "Transposable elements as transformation
vectors" con número 4,670,388 y la patente estadounidense
"In vivo high throughput toxicology screening method"
con número 6,365,129. También es relevante la solicitud de patente
Española con número P200201454 y fecha de prioridad 18 de junio de
2002 titulada "Modelos animales transgénicos en Drosophila
para las distrofias miotónicas", a nombre de este mismo
solicitante.
Los métodos para la producción de animales
transgénicos en Drosophila melanogaster se describen en:
Spradling, AC, y Rubin, GM (1982). Science 218,
341-347; Brand, AH y Perrimon, N (1993).
Development 118, 401-415; Phelps y Brand (1998).
Methods 14, 367-379; Steller y Pirrotta (1986).
Mol. Cell. Biol. 6, 1640-1649. Véase también
Spradling AC, P element mediated transformation in Drosophila: A
practical approach (ed. D.D. Roberts, IRL Press, Oxford) (1986) pp.
175-179.
Los artículos en los que se describe el gen
muscleblind y sus funciones son: Artero, R.D. (1995).
Caracterización molecular de la región 54A de Drosophila
melanogaster. Tesis Doctoral Universitat de Valencia; Artero,
R, Prokop, A, Paricio, N, Begemann, G, Pueyo, I, Mlodzik, M,
Pérez-Alonso, M, Baylies, M (1998). Dev. Biol. 195,
131-143; Begemann, G, Paricio, N, Artero, R, Kiss,
Pérez-Alonso, M y Mlodzik, M (1997). Development,
124, 4321-4331. García Casado, Z (2002).
Caracterización funcional del gen muscleblind: valoración de
Drosophila como modelo para el estudio de la Distrofia
Miotónica. Tesis Doctoral (en preparación). Universitat de
Valencia.
Los artículos en los que se describe la relación
entre el comportamiento molecular de las expansiones responsables
de las distrofias miotónicas y las proteínas muscleblind son:
Fardaei M, Larkin K, Brook JD y Hamshere MG (2001). Nucleic Acids
Research 29, 2766-2771; Mankodi y col. (2001).
Human Molecular Genetics 10, 2165-2170; Fardaei, M,
Rogers, MT, Thorpe, HM, Larkin, K, Hamshere, MG, Harper, PS y
Brook, JD (2002). Human Molecular Genetics 11,
805-814; Miller, JW, Urbinati, CR,
Teng-umnuay, P, Stenberg, MG, Byrne, BJ, Thornton, A
y Swanson, MS (2000). The EMBO J. 19,
4439-4448.
Artículos en los que se describen microsatélites
como responsables de enfermedades humanas y una posible función de
los microsatélites con secuencia CTG: Ranun, LPW y Day, JW (2002).
Current Opinion in Genetics & Development 12:
266-271; Philips, AV, Timchenko, LT y Cooper, TA
(1998). Science 280: 737-741; Richards, RI (2001).
Human Molecular Genetics 10: 2187-2194; Cummings,
CJ, Zoghbi, HY (2000). Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 1:
281-328; Filippova, GN y col. (2001). Nature
Genetics 28:335-343; Koob, MD y col. (1999). Nature
Genetics 21: 379-384.
Artículos en los que se describen otros modelos
animales para las distrofias miotónicas son: Mankodi, A et al
(2000). Science 289, 1769-1772; Seznec y col.
(2001). Human Molecular Genetics 10, 2717-2726.
Artículos en los que se utiliza la técnica
genética de búsqueda sistemática de modificadores genéticos de un
fenotipo dado son: Hays, TS y col. (1989). Molecular and Cellular
Biology 9, 875-84; Deuring, R, Robertson, B, Prout,
M y Fuller, M T (1989). Mol. Cell. Biol. 9, 875-84;
Fuller, M T y col. (1989). Cell Mot. Cyto. 14,
128-35; y Rottgen G, Wagner T, Hinz U (1998). Mol.
Gen. Genet. 257, 442-51.
Artículos en los que se describen técnicas de
terapia génica son Ozawa CR, Springer ML, Blau HM (2000). Annu.
Rev. Pharmacol. Toxicol. 40, 295-317; Furth y col.
(1992), Anal Biochem 205, 365-368; y Tang y col.
(1992), Nature 356, 152-154.
En esta invención se proporcionan animales
transgénicos invertebrados, en particular del insecto Drosophila
melanogaster. Estos animales se caracterizan porque expresan un
microsatélite CTG, clonado a partir de expansiones sintéticas, en
diferentes tejidos o momentos de la vida del animal. Dicho
microsatélite se ha introducido de forma estable en el genoma del
organismo receptor, Drosophila melanogaster, obteniendo así animales
transgénicos que expresan RNAs que contienen dicho microsatélite de
forma controlada. Esta expresión se puede controlar mediante el
empleo del sistema Gal4/UAS. Al microsatélite introducido le
denominamos en lo sucesivo "el transgén". Esta expresión del
transgén genera un efecto morfológico y/o fisiológico en el insecto
que depende de la cantidad de expresión que se induzca. A este
efecto lo denominamos fenotipo. Se proporcionan métodos para
emplear estos animales transgénicos, en los que se ha provocado un
fenotipo, para las búsquedas sistemáticas de compuestos con una
actividad biológica modificadora del mencionado fenotipo. Asimismo,
estos animales transgénicos pueden ser empleados para la búsqueda
sistemática de genes relacionados con la función alterada al
expresar el transgén, utilizando para ello técnicas genéticas
conocidas para una persona versada en la técnica. Finalmente, estas
moscas transgénicas pueden ser empleadas para la validación de
terapias farmacológicas potenciales.
Esta invención proporciona un modelo animal
invertebrado en el que es posible generar un fenotipo sensibilizado
por expresión controlada de un microsatélite que contiene la
secuencia CTG. Este fenotipo resulta de la expresión de un transgén
en un tejido dado. Por un fenotipo sensibilizado se entiende que el
modelo animal invertebrado transgénico presenta un fenotipo cuya
intensidad depende del grado de expresión del transgén. Este animal
transgénico cae dentro del ámbito de esta invención,
independientemente de su estadio de desarrollo, con tal de que
desarrolle un fenotipo provocado por la expresión del transgén en
algún momento de su vida. Los animales transgénicos con el fenotipo
sensibilizado objeto de protección se caracterizan por tener las
siguientes características fenotípicas: (1) el desarrollo de un
fenotipo cuyo grado de intensidad depende del grado de expresión
del transgén (2) un cambio en la expresión de un gen relacionado
funcionalmente con el transgén provoca una modificación en el
fenotipo.
Los animales transgénicos objeto de protección
son animales invertebrados. De particular interés son aquellos del
phylum artrópodos, y en concreto los miembros de la clase insectos.
El animal transgénico objeto de protección pertenece a la especie
Drosophila melanogaster. La descripción que se hace de los
mismos en la presente memoria posibilita que un experto pueda
reproducir la invención. No obstante, el material biológico
mencionado (en total, 18 líneas de Drosophila) está a
disposición del público en la Colección de Líneas de
Drosophila del Departamento de Genética de Facultad de
Biología de la Universidad de Valencia, Calle Doctor Moliner, nº 50
en la ciudad de Burjasot, provincia de Valencia (España), con
Números de Referencia con el formato P(60)x.y para
las líneas portadoras de un transgén con 60 repeticiones y
P(480)x.y para las líneas portadoras de 480
repeticiones. En ambos casos, x hace referencia al número del
animal inyectado mientras que y hace referencia al número de orden
del animal que muestra el marcador fenotípico de que contiene el
transgén en la descendencia del cruce para detectar las moscas
transgénicas.
Un aspecto crítico de los animales transgénicos
objeto de protección es que los animales portan un transgén
integrado de forma estable en su genoma y cuya expresión puede
controlarse en el espacio y en el tiempo, de tal manera que se
genera un fenotipo por la interferencia que provoca la expresión
del microsatélite que contiene la secuencia CTG. El término
"transgén" describe un material genético que ha sido o va a
ser insertado artificialmente en el genoma de la célula. Respecto a
la expresión espacial del transgén, esta expresión incluye,
generalmente, a los discos imaginales de la larva y estructuras
embrionarias como la musculatura embrionaria.
El transgén expresa un producto que, cuando se
dirige en un patrón espacial apropiado, da lugar a un fenotipo
sensibilizado. El transgén puede ser una secuencia larga de
repeticiones del trinucleótido CTG, generalmente más de 60, bien
generada artificialmente o presente ya en la naturaleza. Como tal,
un transgén incluye al menos una porción de su secuencia de
nucleótidos que es sustancialmente similar a los microsatélites que
contienen repeticiones de CTGs presentes en la naturaleza, donde
sustancialmente similar significa una secuencia de ADN con una
identidad de secuencia con la versión natural de estos
microsatélites de, al menos, el 40%, normalmente al menos del 50%
y, más frecuentemente, al menos un 55%, donde la identidad de
secuencia está determinada con el programa BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool que se puede encontrar en la siguiente
dirección de internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) en sus
ajustes por defecto. En realizaciones de esta invención, el
transgén es un microsatélite que contiene la secuencia CTG
procedente de la naturaleza o que tiene una secuencia
sustancialmente similar a éste, aunque puede contener otras
secuencias intercaladas, tener origen artificial o sintético y
llevar secuencias adosadas (codificantes o no) tales como un gen
chivato (conocido en inglés como "reporter") o una etiqueta
(conocida en ingles como "tag"). Un ejemplo de ambas
secuencias es la proteína fluorescente verde GFP y sus
variantes.
Los transgenes objeto de protección están
representados por SEQ ID NO: 1 y 2 incorporadas a esta
solicitud.
El transgén conteniendo las repeticiones CTG
está integrado de forma estable en el genoma del animal de una
manera tal que su expresión está controlada en el espacio en el
tipo celular deseado. Específicamente, el transgén está integrado
de forma estable en el genoma del animal detrás de las secuencias
UAS de levadura (SEQ ID NO: 3 y 4; representado como
UAS-CTG). Estas secuencias UAS sirven como lugares
de unión del factor de transcripción Gal4 de levadura (SEQ ID NO: 7
y 8), de modo que el patrón de expresión del transgén está
determinado por el patrón de expresión del transgén Gal4. El
transgén UAS-CTG puede estar bajo el control de
cualquier promotor conveniente que proporcione el requisito de un
patrón de expresión deseado, donde este promotor puede ser exógeno
o endógeno, pero generalmente será endógeno. Un promotor adecuado
es el promotor localizado en el cromosoma 2 en el genoma de
Drosophila melanogaster que regula la expresión de GAL4
según el patrón normal del gen sevenless en la línea con número de
referencia 2023 (número de referencia de Bloomington
Drosophila Stock Center de la Universidad de Indiana,
EEUU).
El transgén puede estar integrado en el genoma
de este insecto de una manera tal que puede ser usado para la
activación de la expresión por parte del promotor de una manera
directa o indirecta, es decir, de tal manera que el promotor ejerce
su activación sobre el transgén en cis o en trans. En otras
palabras, la expresión del transgén puede estar mediada
directamente por el promotor, o bien mediante uno o más factores
transactivadores. Cuando el transgén está bajo el control directo
del promotor, es decir, el promotor regula la expresión del
transgén en cis, el transgén está integrado de forma estable en el
genoma de la mosca en un lugar suficientemente próximo al promotor
y en fase con el promotor de tal modo que la regulación en cis del
promotor puede tener lugar.
En otras realizaciones de esta invención donde
la expresión del transgén está indirectamente mediada por un
promotor endógeno, el promotor controla la expresión del transgén
mediante uno o más factores transactivadores, normalmente un factor
transactivador, es decir, un factor cuya expresión está controlada
directamente por el promotor y el cual se une a una región del
transgén de una manera apropiada para activar la expresión de ese
transgén. Se puede emplear cualquier factor de transactivación
conveniente, pero generalmente se usa el sistema de transactivación
Gal4 y se hace referencia a este sistema en realizaciones de esta
invención.
En aquellas realizaciones de la invención objeto
de protección en las cuales las moscas transgénicas utilizan el
sistema de expresión dirigida Gal4/UAS, la secuencia codificante
para la proteína Gal4 está integrada de forma estable en el genoma
del animal de una manera tal que está unida funcionalmente al
promotor endógeno que controla la expresión
espacio-temporal. Un ejemplo de este tipo de animal
es la línea número 2023, disponible en Bloomington
Drosophila Stock Center en la Universidad de Indiana, EEUU
(http://flvbase.bio.indiana.edu/). El transgén está integrado
de forma estable en una posición diferente en el genoma,
generalmente una posición al azar en el genoma, donde el transgén
está unido funcionalmente a una secuencia activadora aguas arriba
(las secuencias UAS), a las cuales el factor de transcripción de
levadura Gal4 se une y activa la expresión del transgén. Las
personas conocedoras de la técnica emplean comúnmente moscas
transgénicas poseedoras de un sistema de transactivación UAS/Gal4.
Este sistema se describe en detalle en Brand y Perrimon (1993).
Las moscas objeto de protección se pueden
obtener utilizando cualquier protocolo adecuado para la integración
estable del transgén en el genoma de la mosca de una manera que
permita el requisito de la expresión espacial controlada del
transgén, es decir, en aquellos lugares en los que sea de interés
experimental. Se pueden emplear varias estrategias para la
integración del transgén con el requisito de la expresión espacial
controlada. Generalmente, los métodos para producir estas moscas
transgénicas implican la integración estable del transgén en el
genoma de la mosca. La integración estable se puede conseguir
introduciendo primero el transgén en una célula o células de la
mosca, por ejemplo, en el embrión del animal. El transgén está
generalmente presente en un vector adecuado, tal como un plásmido.
La introducción del transgén puede conseguirse usando un protocolo
adecuado, donde protocolos adecuados pueden ser: electroporación,
microinyección, y semejantes. Siguiendo a la introducción del
transgén en la célula(s), el transgén se integra de forma
estable en el genoma de la célula. La integración estable puede ser
bien específica de lugar o al azar, pero es generalmente al azar.
La integración estable del transgén en el genoma del animal puede
seguirse macroscópicamente por la expresión de un gen marcador
incorporado en el DNA quimérico que incluye el transgén, por
ejemplo el gen white (SEQ ID: 9), del modo estándar conocido por
las personas versadas en esta la técnica.
Cuando la integración es al azar, el transgén se
integra típicamente mediante el uso de una fuente de transposasa.
La transposasa es un enzima (SEQ ID NO: 6) que cataliza la
integración específica de las moléculas de ADN que contengan las
repeticiones invertidas terminales del elemento transponible P,
tanto en transposones naturales como en transposones artificiales.
En estas realizaciones experimentales, el transgén se introduce en
la célula mediante un vector que incluye el requisito de poseer las
repeticiones invertidas terminales (de 31 pares de bases) del
elemento transponible P de Drosophila melanogaster (SEQ ID
NO: 5). Cuando la célula en la que el transgén tiene que integrarse
no contiene una fuente de transposasa endógena, se incluye junto
con el plásmido que contiene el transgén un vector con la secuencia
codificante para la transposasa, por ejemplo, un plásmido llamado
"helper" en el que se ha clonado el gen para la transposasa de
Drosophila, tal como pTURBO (tal como se describe en Steller y
Pirrotta, 1986). Los métodos para la integración al azar de
transgenes en el genoma de una célula(s) diana de
Drosophila melanogaster se describen en Spradling (1986) y
en la patente estadounidense número 4,670,388, la cual se incluye
en esta solicitud como referencia.
En aquellas realizaciones experimentales en las
que el transgén está integrado de forma estable en el genoma de la
mosca, se proporciona también la metodología necesaria para la
expresión controlada del transgén durante el desarrollo de la mosca
tanto en el espacio como en el tiempo. En otras palabras, se
proporcionan los métodos para la expresión dirigida del transgén.
Para obtener la expresión dirigida deseada de un transgén integrado
al azar, se puede incluir un promotor particular aguas arriba del
transgén como una sola unidad en el vector de transformación
empleado. Alternativamente, se puede emplear un transactivador que
regule la expresión del transgén. De interés particular es el
empleo del sistema Gal4 descrito en Brand y Perrimon (1993).
En esta realización experimental particular, los
animales transgénicos objeto de protección se han obtenido
mediante: (1) generación de dos líneas de moscas transgénicas
separadas: (a) una primera línea que expresa el factor de
transcripción de levadura Gal4 principalmente en ojo, es decir,
bajo el control de un promotor endógeno de la mosca localizado en
el cromosoma 2 (tal como la línea de Drosophila con número de
identificación 5793 en el Bloomington Drosophila Stock
Center); y (b) una segunda línea en la cual el transgén está
integrado de forma estable en el genoma celular y fusionado con un
dominio UAS; (2) cruzar las dos líneas; y (3) identificar la
progenie con el fenotipo deseado, esto es, un defecto morfológico o
fisiológico observable que puede ser un ojo compuesto que presenta
un aspecto externamente rugoso. Los pasos descritos arriba son de
conocimiento general para aquellas personas versadas en esta
técnica. Véase también Brand y Perrimon (1993) y Phelps y Brand
(1998).
La estrategia anterior se emplea para obtener
huevos fertilizados que incluyen un transgén integrado de forma
estable en su genoma de manera tal que el transgén se expresa de
una manera espacio-temporal apropiada para que los
huevos den lugar a adultos que exhiban el efecto morfológico y/o
fisiológico deseado (fenotipo). Generalmente, se permite que los
huevos fertilizados progresen en su desarrollo en las condiciones
que conducen al fenotipo
deseado.
deseado.
El fenotipo de interés de los animales se puede
modular variando las condiciones en las cuales se permite a los
animales madurar. Por ejemplo, se puede modificar la temperatura
para modular la intensidad del fenotipo obtenido. Los embriones o
larvas cultivados a 29-30 grados Celsius de
temperatura suelen presentar un fenotipo más fuerte (que puede
llegar incluso a la muerte del animal) que los crecidos a 25 grados
y el fenotipo de éstos suele ser más fuerte que el de los
individuos desarrollados a 17-19 grados.
Las moscas objeto de protección pueden ser
usadas en una variedad de aplicaciones, que incluyen: (1) como
herramienta para dilucidar el mecanismo genético alterado en
cualquier enfermedad debida, en su totalidad o en parte, a la
expansión de microsatélites basados en la secuencia CTG, como por
ejemplo las distrofias miotónicas, realizando búsquedas genéticas
sistemáticas de genes relacionados funcionalmente con los genes
responsables del fenotipo provocado por la expresión del
microsatélite basado en la secuencia CTG del modo descrito más
abajo; (2) como herramienta para la búsqueda sistemática de
compuestos terapéuticos para el tratamiento de cualquier enfermedad
debida, en su totalidad o en parte, a la expansión de
microsatélites basados en la secuencia CTG, como por ejemplo las
distrofias miotónicas; y (3) como herramienta para la validación
in vivo de tratamientos potenciales, incluso obtenidos por
cualquier otro método, de enfermedades que discurran por
alteraciones en microsatélites basados en la secuencia CTG (es
decir, como animales modelo de enfermedades humanas tales como la
Distrofia Miotónica de tipo 1 ó 2, Sca8 o HDL2).
Tal como se ha mencionado más arriba, las moscas
transgénicas objeto de protección son especialmente útiles para la
búsqueda sistemática de compuestos con una actividad terapéutica
contra las distrofias miotónicas. Una estrategia terapéutica
potencial para aliviar los síntomas de los pacientes con distrofia
miotónica consiste en potenciar la función de las proteínas humanas
homólogas a muscleblind (entre ellas el gen MBNL1). Es decir, que
la proteína MBNL1 no unida a trinucleótidos CUG funcione más
eficientemente. Otras estrategias terapéuticas potenciales
consisten en activar los mecanismos moleculares que conducen a una
reducción en el tamaño de las expansiones del microsatélite basado
en la secuencia CTG objeto de esta patente, o diseñar péptidos
sintéticos que compitan con MBNL1 en su unión con las secuencias
microsatélite a las que queda secuestrada en situaciones
patológicas. En nuestro modelo en Drosophila sabemos que
cuando aumentamos la expresión del microsatélite basado en la
secuencia CTG (para ello aumentamos el nivel de expresión del
transgén) el efecto fenotípico se incrementa. Por tanto, podemos
emplear unas condiciones experimentales en las que tenemos un
defecto morfológico intermedio y administrar una batería de
compuestos con actividad biológica potencial a nuestro modelo
animal. Aquellos compuestos que supriman el defecto morfológico son
moléculas que pueden potencialmente colaborar en la función
molecular de la proteína MBNL in vivo, inhibir el efecto
patológico de las expansiones de microsatélites basados en la
secuencia CTG o potenciar la pérdida de parte del microsatélite
objeto de ensayo. Para confirmar la especificidad del efecto
observado, podemos ensayar los compuestos con una actividad en el
primer ensayo en otro tejido, por ejemplo en otros órganos tales
como el ala, donde podemos realizar un ensayo cuantitativo, a fin
de confirmar la observación. Asimismo, podemos validar la
efectividad de un compuesto sobre la actividad de muscleblind
ensayando su efecto sobre moscas mutantes para el gen muscleblind.
Los compuestos que tengan un efecto positivo sobre la actividad de
la proteína Muscleblind o del gen deberán mejorar el fenotipo del
organismo mutante muscleblind.
Así pues, mediante el uso de las moscas
transgénicas objeto de protección (o células derivadas de ellas
dependiendo del tipo particular de búsqueda sistemática que se
esté llevando a cabo), se pueden identificar compuestos que tengan
una actividad con respecto a las distrofias miotónicas o Sca8. Los
compuestos tienen una actividad con respecto a las distrofias
miotónicas o Sca8 si modulan o tienen algún efecto en al menos un
parámetro o síntoma de estas enfermedades, tales como descargas
miotónicas en un electromiograma o rigidez en los músculos
(miotonía), donde la actividad moduladora puede reducir o potenciar
la magnitud del síntoma, dependiendo de la naturaleza de la
enfermedad y del síntoma. Además, los métodos para la búsqueda
sistemática utilizando las moscas objeto de protección pueden ser
empleados para identificar compuestos que modulen la progresión de
la enfermedad, por ejemplo uniéndose, modulando, potenciando o
reprimiendo la actividad de una proteína o péptido implicado en la
progresión de la enfermedad. Con esta aproximación también podemos
identificar compuestos que mejoren, alivien o incluso eliminen los
síntomas de la enfermedad, donde tal actividad puede tener o no que
ver con el mecanismo de patogenicidad de la enfermedad. La búsqueda
sistemática de compuestos, aún sin un efecto sobre las distrofia
miotónica o Sca8, o el ensayo de compuestos identificados por
cualquier otro método, en las moscas objeto de protección también
es de interés. Nuestra invención permite identificar compuestos
que: (1) aun no estando relacionados con modular la actividad de un
elemento de la ruta de patogenicidad de la enfermedad, tengan un
efecto positivo con respecto de los síntomas de la enfermedad y
como tales sean potencialmente terapéuticos, por ejemplo,
compuestos que alivien la miotonía de los pacientes; (2) compuestos
identificados por cualquier otro método (por ejemplo ensayos in
vitro) que provoquen un efecto adverso con respecto a la
enfermedad y por tanto deban ser evitados como agentes terapéuticos
o (3) compuestos que identificados usando otros métodos alivien,
mejoren o supriman totalmente los síntomas de la enfermedad y sean
por tanto agentes terapéuticos de elección.
En los métodos de búsquedas sistemáticas con los
animales transgénicos objeto de protección, generalmente se
administra oralmente a la mosca una cierta cantidad de compuesto
candidato. Tras la administración oral, se determina el efecto del
compuesto sobre el fenotipo provocado por expresión de uno de los
transgenes, ya sea un microsatélite presente en la naturaleza, de
una porción del mismo, o de una versión artificial, siempre que
obtengamos un fenotipo. La determinación del efecto se realiza
generalmente por comparación con un control, es decir, una mosca
transgénica a la cual no se ha administrado el compuesto candidato.
El efecto del compuesto candidato se determina averiguando si una o
más características fenotípicas debidas a la expresión del transgén
del microsatélite basado en la secuencia CTG se ven potenciadas o
aliviadas en la mosca objeto de experimentación en comparación con
la mosca control, donde características en las que se puede
observar un cambio pueden ser la morfología del ojo del adulto, de
sus alas o patas, su comportamiento (capacidad para andar, etc.),
longevidad, fisiología y características semejantes. El compuesto
candidato se administra oralmente a la mosca generalmente mezclando
el compuesto con el medio nutritivo de la mosca, es decir, agua,
una solución acuosa con elementos nutritivos adicionales, etc., y
colocando el medio en presencia de la mosca, (bien sea la larva o
el adulto aunque generalmente es el adulto) de tal manera que la
mosca se alimenta de ese medio. La administración del compuesto
también puede utilizar otras vías de administración como pueden ser
la vía respiratoria o la inyección en la hemolinfa del insecto,
entre otras. Generalmente se ensayan en paralelo múltiples mezclas
con diferentes concentraciones del compuesto para obtener una
respuesta diferente con cada concentración del agente candidato.
Típicamente, una de esas concentraciones sirve como control
negativo, por ejemplo, al no incorporar el compuesto candidato. Los
métodos reivindicados pueden adaptarse a búsquedas sistemáticas de
alto rendimiento en las cuales se ensayan un gran número de
compuestos candidatos en paralelo usando un gran número de moscas.
Por "un gran número" se entiende una pluralidad, donde
pluralidad significa al menos 10 ó 50, usualmente al menos 100, y
más normalmente al menos 1000, pudiendo llegar a ser entre 10000 ó
50000 o más pero que en muchas ocasiones no excederá de 5000.
De particular interés en algunas realizaciones
de esta invención es el uso de las moscas transgénicas objeto de
protección en búsquedas sistemáticas de alto rendimiento en ensayos
de toxicidad, tal como se describe en la patente americana de número
6,365,129 y que se incorpora como referencia. En tales búsquedas
sistemáticas de alto rendimiento, se ensaya simultáneamente la
toxicidad, si existe, de una pluralidad de compuestos, usualmente
al menos 10 diferentes, poniéndolos en contacto con una población
de los animales transgénicos objeto de protección que presentan un
fenotipo debido a la expresión del microsatélite basado en la
secuencia CTG, y determinando el efecto de tales compuestos en los
animales. Dichas búsquedas sistemáticas de alto rendimiento
resultan especialmente útiles para encontrar agentes potencialmente
terapéuticos para el tratamiento de las distrofias miotónicas y
Sca8 ya que sólo se identifican como positivos para estudios
ulteriores aquellos compuestos que tratan la enfermedad pero son
suficientemente poco tóxicos como para permitir vivir al
animal.
Los métodos objeto de protección pueden usarse
en la búsqueda sistemática de diferentes agentes candidatos
potencialmente terapéuticos. Estos agentes candidatos abarcan
numerosas clases de productos químicos, aunque típicamente son
moléculas orgánicas, preferentemente pequeños compuestos orgánicos
con un peso molecular de más de 50 y menos de 2500 Dalton. Estos
agentes candidatos presentan grupos funcionales necesarios para la
interacción física con proteínas, particularmente puentes de
hidrógeno, y típicamente incluyen al menos una amina, carbonilo,
hidroxilo o grupo carboxilo, aunque preferentemente presentan al
menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes
candidatos a menudo incluyen estructuras cíclicas o heterocíclicas
de carbono y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas
con uno o más de los grupos funcionales mencionados previamente.
Los agentes candidatos también se encuentran entre las biomoléculas
incluyendo, pero no estando limitadas a: péptidos, sacáridos,
ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, sus derivados,
análogos estructurales o combinaciones de ellos.
Los agentes candidatos pueden obtenerse de
varias fuentes que incluyen las colecciones de compuestos naturales
o sintéticos. Por ejemplo, se dispone de técnicas para la síntesis
dirigida y aleatoria de una amplia variedad de compuestos orgánicos
y biomoléculas, incluyendo colecciones aleatorias de oligopéptidos
y oligonucleótidos. Alternativamente, se pueden obtener o producir
colecciones de compuestos naturales en forma de extractos de
bacterias, hongos, plantas y animales. Adicionalmente, las
librerías de productos naturales o sintéticos, o sus componentes
individuales, pueden modificarse mediante técnicas bioquímicas,
físicas o químicas convencionales y pueden usarse para producir
colecciones combinatorias. Los agentes fármacológicos conocidos
pueden someterse a modificaciones químicas aleatorias o dirigidas,
tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación,
etc. para producir análogos estructurales. También se pueden crear
nuevos agentes potencialmente terapéuticos usando métodos tales
como el diseño racional de drogas o de bioquímica estructural.
Las búsquedas sistemáticas pueden dirigirse a
compuestos conocidos activos farmacológicamente o a análogos
químicos de los mismos, o a agentes nuevos con propiedades
desconocidas tales como aquellos creados mediante diseño racional
de drogas. Los agentes candidatos con actividad terapéutica con
respecto a las distrofias miotónicas y Sca8 pueden identificarse
sobre la base de su capacidad para potenciar uno o más aspectos del
fenotipo de las moscas transgénicas objeto de protección, tales
como un fenotipo de ojo rugoso, alas defectuosas, longevidad
re-
ducida, problemas locomotores y semejantes, tal como se describe más arriba.
ducida, problemas locomotores y semejantes, tal como se describe más arriba.
De interés particular es el uso de los métodos
objeto de protección para identificar agentes terapéuticos contra
las distrofias miotónicas, Sca8 y HDL2 que exhiben una baja
toxicidad pero son efectivos en la potenciación de la actividad de
la proteína Muscleblind. Estos métodos exigen una gran especificidad
por parte del agente terapéutico para que, al mismo tiempo que
ejerce un efecto sobre la función de la proteína Muscleblind, los
efectos secundarios indeseables sean lo suficientemente limitados
como para permitir sobrevivir a la mosca.
Los métodos de búsquedas sistemáticas en moscas
pueden formar parte de un proceso de búsqueda sistemática de
múltiples pasos en el que la evaluación de la eficacia (y
seguridad) de un agente terapéutico candidato se lleva a cabo en
más de un organismo modelo. En búsquedas sistemáticas de múltiples
pasos en las que se utilicen las moscas transgénicas objeto de
protección, un compuesto candidato o colección de compuestos se
somete a evaluación en un segundo modelo in vivo, por
ejemplo un modelo en ratón. Modelos de distrofia miotónica en ratón
se han generado con ratones transgénicos que expresan grados
variables de la expansión CTG en el gen DMPK humano y que se
describen en detalle en Mankodi y col. (2001) y en Seznec y col.
(2001). Además, también se puede emplear una búsqueda sistemática
in vitro previa a la utilización de animales modelo para la
enfermedad. En estos casos, el compuesto se somete primero a una
búsqueda sistemática in vitro, ensayando su potencial como
agente terapéutico en el tratamiento de las distrofias miotónicas.
Se puede emplear cualquier ensayo conveniente para una búsqueda
sistemática in vitro de una actividad deseable para aliviar
o eliminar síntomas asociados a las distrofias miotónicas, Sca8 u
otras enfermedades genéticas causadas por la expansión de
microsatélites basados en la secuencia CTG. Una persona versada en
la materia conoce los ensayos convenientes.
Además de su uso como animales modelo para la
búsqueda sistemática de agentes terapéuticos candidatos, las moscas
transgénicas objeto de protección pueden emplearse en la
identificación de genes implicados funcionalmente en desencadenar
el fenotipo debido a expresión del transgén objeto de protección.
Entre estos genes se encuentra el gen muscleblind. Los genes
relevantes para el fenotipo de expresión de microsatélites basados
en la secuencia CTG pueden identificarse llevando a cabo análisis
tradicionales de supresores y potenciadores en las moscas objeto de
protección. En estos análisis, se mutan los genes de las moscas
transgénicas objeto de protección para identificar aquellos que
potencian o suprimen el fenotipo de expresión del transgén. Los
métodos para mutar genes y llevar a término búsquedas sistemáticas
de supresores y potenciadores son conocidos para las personas
versadas en la técnica (Hays y col., 1989; Deuring y col., 1989;
Fuller y col., 1989; y Rottgen y col., 1998).
Los genes que mutan para suprimir el fenotipo de
expresión del microsatélite basado en la secuencia CTG de una
manera recesiva identifican a proteínas potencialmente terapéuticas
para el tratamiento de las distrofias miotónicas, Sca8 y HDL2 ya
que reducir el producto génico normal de tales genes aliviaría
potencialmente la enfermedad. Se puede interferir en la actividad
de estos genes mediante muchos métodos que van desde deleccionar el
ADN del gen a inhibir su transcripción, su traducción o bien su
actividad proteica. Para búsquedas sistemáticas de agentes
candidatos, se pueden producir pequeñas moléculas antagonistas de
estos genes y evaluar su eficacia en el modelo animal mediante
administración oral. Alternativamente, los antagonistas moleculares
grandes pueden usarse mediante terapia génica tal como se describe
más abajo. Los genes que mutan para potenciar el fenotipo de
expresión del microsatélite basado en la secuencia CTG de una
manera recesiva identifican dianas para aumentar la actividad de
tales genes pues ello conllevaría potencialmente una mejora en los
síntomas de las distrofias miotónicas y Sca8.
Junto con las moscas transgénicas objeto de
protección se incluyen kits utilizables para llevar a término los
métodos de búsquedas sistemáticas. Tales kits incluyen una
pluralidad de moscas transgénicas de esta invención, o los medios
para producir tal pluralidad de moscas, es decir, una mosca macho y
una mosca hembra transgénicas de la presente invención, los
vectores portadores de los genes requeridos, tales como los
transgenes, un gen para el gen de la transposasa, GAL4, etc. Las
moscas se pueden confinar en contenedores apropiados, es decir,
viales. Los presentes kits pueden también incluir un medio
nutritivo para los animales, es decir, medio de cultivo para
Drosophila.
La presente invención incluye también los
agentes terapéuticos para el uso en el tratamiento de las
distrofias miotónicas y Sca8, así como las formulaciones
farmacéuticas a partir de ellos. Los agentes terapéuticos de la
presente invención son aquellos identificados usando los métodos de
búsqueda sistemática descritos más arriba que muestren una
actividad moduladora con respecto al fenotipo de expresión del
microsatélite basado en la secuencia CTG (o los agentes conocidos
que tengan un efecto en la expresión de un gen identificado como
modulador del fenotipo de expresión del microsatélite basado en la
secuencia CTG, donde para la identificación de estos genes también
se emplean animales no transgénicos descritos en esta
solicitud).
También se incluyen las formulaciones
farmacéuticas de los agentes terapéuticos objeto de protección. En
las formulaciones farmacéuticas o composiciones de la presente
invención, los agentes descritos anteriormente se formulan en
composiciones farmacéuticas por combinación con los excipientes o
diluyentes apropiados y aceptados para la preparación de fármacos,
que puedan formularse en preparaciones en forma sólida, semisólida,
líquida o gaseosa, tales como tabletas, cápsulas, polvos, gránulos,
ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalados y
aerosoles. En sus dosis farmacéuticas, los agentes pueden
administrarse en sus sales aceptadas para la preparación de
fármacos, o pueden también usarse solos o en las asociaciones
apropiadas, así como en combinación con otros compuestos
farmacológicos activos. Los siguientes métodos y excipientes son
meramente ejemplos y en ningún modo son limitantes.
Para las preparaciones orales, los agentes
pueden usarse solos o en combinación con los excipientes o
aditivos apropiados para hacer tabletas, polvos, gránulos o
cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales tales como
lactosa, manitol, almidón de maíz o patata; con aditivos
agregantes, tales como celulosa cristalina, derivados de la
celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con aditivos
dispersadores, tales como almidón de maíz, almidón de patata o
carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, tales como estearato
de magnesio o talco; y si se desea, con diluyentes, agentes
tamponadores, agentes hidratantes, conservadores o sabores
artificiales.
Los agentes se pueden formular en preparaciones
para inyección al disolverlos, suspenderlos o crear emulsiones en
un solvente acuoso o no acuoso, tales como aceites vegetales o
aceites similares, glicéridos ácidos alifáticos sintéticos, ésteres
de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea,
con aditivos convencionales tales como solubilizadores, agentes
isotónicos, agentes para mantener en suspensión, agentes
emulsificantes, estabilizantes y conservantes.
Los agentes pueden utilizarse en una formulación
aerosólica para ser administrados por inhalación. Los compuestos
de la presente invención pueden formularse en propelentes
presurizados aceptables tales como propano, nitrógeno y
semejantes.
Además, los agentes terapéuticos pueden
formularse en supositorios al mezclarlos con una variedad de bases
tales como bases emulsificantes o bases solubles en agua. Los
compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía
rectal utilizando supositorios. Los supositorios pueden incluir
excipientes tales como manteca de coco, polietilenglicol y
carboceras, los cuales se funden a la temperatura del cuerpo pero
permanecen sólidos a temperatura ambiente.
En la presentación de la dosis unitaria para la
administración oral o rectal, tales como jarabes, elixires y
suspensiones, cada dosis unitaria, por ejemplo una cucharilla, una
tableta o un supositorio, contiene una cantidad predeterminada de
la composición pudiendo contener uno o más inhibidores. De modo
semejante, las dosis unitarias en forma de inyecciones o
administración intravenosa pueden incluir el/los inhibidores en la
composición como una solución en agua estéril, suero salino u otro
medio aceptable farmacológicamente.
El término "presentación de la dosis
unitaria" tal como se usa aquí, se refiere a unidades
físicamente discretas apropiadas como dosis unitarias para los
individuos humanos y animales, cada unidad conteniendo una cantidad
predeterminada de compuestos de la presente invención calculada
como suficiente para producir el efecto deseado en asociación con
el diluyente, vehículo o excipiente farmacológicamente aceptable.
Las especificaciones para una nueva presentación de la dosis
unitaria de la presente invención dependen del compuesto particular
que está siendo empleado y del afecto a conseguir, así como de la
farmacodinámica asociada con cada compuesto en el huésped.
Los excipientes aceptables farmacológicamente,
tales como vehiculantes, adyuvantes, transportadores o diluyentes,
están disponibles al público. Además, también están disponibles al
público las sustancias auxiliares aceptables farmacológicamente,
tales como agentes tamponantes o para el ajuste del pH, agentes
para ajustar la fuerza iónica, estabilizantes, agentes hidratantes
y semejantes.
Cuando el agente es un polipéptido,
polinucleótido, análogo o cualquier compuesto que pueda mimetizar
la función endógena de cualquier gen identificado mediante el uso
de esta invención (identificados usando los protocolos de análisis
de búsquedas sistemáticas de mutantes descritos previamente) éste
puede introducirse en los tejidos o células del huésped por varias
vías, las cuales incluyen la infección viral, la microinyección, la
fusión de vesículas o la terapia génica mediada por mioblastos (tal
como se describe en Ozawa y col., 2000). También se puede usar para
la administración intramuscular la inyección a chorro, tal como se
describe en Furth y col. (1992). El ADN se dispone recubriendo
micropartículas de oro, y se distribuye intradérmicamente mediante
un aparato que bombardea estas partículas contra la piel, o
"pistola génica", tal como se describe en la literatura
científica (véase, por ejemplo, Tang y col. (1992), donde los
microproyectiles de oro se recubren con el ADN y posteriormente se
bombardean las células de la piel).
Las personas versadas en la técnica reconocerán
que las dosis pueden variar dependiendo del compuesto específico,
la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a los
efectos secundarios. La dosificación recomendada para cada
compuesto la podrán determinar aquellas personas versadas en la
técnica utilizando una gran variedad de medios.
Se proporcionan kits con dosis unitarias del
agente activo, normalmente en dosis orales o inyectables. En estos
kits, además de los recipientes con las dosis unitarias habrá un
prospecto informativo que describa el uso y los efectos
beneficiosos esperados del uso de la droga en el tratamiento de la
enfermedad de interés.
También se proporcionan los métodos para tratar
las distrofias miotónicas, Sca8, HDL2 y en general enfermedades
genéticas causadas por la expansión de microsatélites basados en la
secuencia CTG usando los agentes activos objeto de protección. En
los métodos objeto de protección, se le administra al huésped que
está siendo tratado una cantidad efectiva de un agente activo de la
invención objeto de protección. Por "cantidad efectiva" se
entiende una dosis suficiente para producir un resultado deseado,
donde el resultado deseado es generalmente una mejora o alivio,
incluso el cese completo, de uno o más síntomas de, por ejemplo, la
distrofia miotónica, Sca8 o HDL2 que está siendo tratada. La
administración de los agentes se puede llevar a cabo de varias
maneras, incluyendo vía bucal, oral, parenteral, rectal,
intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, cutánea, etc. Se puede
tratar una variedad de huéspedes con los métodos objeto de
protección. Generalmente tales huéspedes son mamíferos, donde este
término se usa en un sentido amplio para describir los organismos
dentro de la clase mamíferos, que incluye el grupo de los
carnívoros (por ejemplo perros y gatos), los roedores (por ejemplo,
ratones y ratas), los herbívoros (por ejemplo, caballos y vacas) y
los primates (por ejemplo, humanos, chimpancés y monos). En muchas
realizaciones los huéspedes serán humanos.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como mera
ilustración y no deben entenderse en absoluto como
limitaciones.
Dos expansiones sintéticas del trinucleótido CTG
con 60 y 480 repeticiones (descritas respectivamente en Miller y
col. 2000 y Philips y col. 1998), se clonaron en el sitio de
clonación múltiple de pUAST de tal manera que las secuencias UAS
del vector quedaron adyacentes al extremo 5' del microsatélite
(Brand y Perrimon, 1993; descrito arriba). La transcripción de la
construcción queda bajo el control de Gal4, el cual tiene que
unirse a la secuencia UAS para activar la expresión de la secuencia
que se ha clonado en el vector pUAST. Las construcciones
UAS-(CTG)_{60} y UAS-(CTG)_{480}
(SEQ ID Nos: 1 y 2, respectivamente) se integraron en el genoma de Drosophila melanogaster mediante procedimientos de microinyección estándar (Spradling y Rubin, 1982). La fuente de transposasa usada para posibilitar la integración de las construcciones UAS-(CTG)_{60} y UAS-(CTG)_{480} en el genoma se proporcionó coinyectando el vector pTURBO (tal como se describe en Steller y Pirrota, 1986).
(SEQ ID Nos: 1 y 2, respectivamente) se integraron en el genoma de Drosophila melanogaster mediante procedimientos de microinyección estándar (Spradling y Rubin, 1982). La fuente de transposasa usada para posibilitar la integración de las construcciones UAS-(CTG)_{60} y UAS-(CTG)_{480} en el genoma se proporcionó coinyectando el vector pTURBO (tal como se describe en Steller y Pirrota, 1986).
Las moscas portadoras de las construcciones
UAS-(CTG)_{60} y UAS-(CTG)_{480} se cruzaron
independientemente con diferentes moscas productoras de Gal4 para
obtener expresión dirigida del transgén en tejidos seleccionados
del modo descrito en Brand y Perrimon (1993) y se permitió a su
descendencia desarrollarse. Se cruzaron varias líneas transgénicas,
entre ellas la P(480)3.5 (número de referencia en la
Colección de Líneas de Drosophila del Departamento de
Genética de Facultad de Biología de la Universidad de Valencia),
con la línea productora de Gal4 sevenless-Gal4
(sev-Gal4; número de referencia 2023 en el
Bloomington Drosophila Stock Center de la Universidad de Indiana.
Véase también la dirección de internet
http://flvbase.bio.indiana.edu). Se permitió a las moscas
desarrollarse hasta adultos y se documentaron los defectos
morfológicos externos observados. La figura 1 muestra el resultado
de este experimento en el que se compara un ojo compuesto de mosca
silvestre con el de una mosca que expresa UAS-(CTG)_{480}
poniendo de manifiesto un fenotipo de ojos rugosos. Las imágenes se
generaron por microscopia óptica (A-B) de ojos
adultos de individuos normales (línea Oregón R) y ojos de individuos
que expresan el transgén UAS-(CTG)_{480} en los
precursores del ojo. La parte anterior está a la izquierda y la
parte dorsal arriba. El grado de manifestación fenotípica provocada
por la expresión del transgén, observable de forma directa al
microscopio, es variable si se emplean líneas transgénicas que
expresan distintas cantidades de repeticiones CTG, líneas Gal4 que
expresan el activador transcripcional con diferentes intensidad,
así como si se utilizan diferentes temperaturas de cultivo.
La figura 2 muestra un experimento de expresión
del transgén semejante al descrito en la Figura 1 pero utilizando
una línea Gal4 diferente, en este caso la GMR-Gal4
descrita en XX. Las moscas portadoras de la construcción Gal4
manifiestan un fenotipo de ojo rugoso incluso en heterozigosis y se
incluyen en la figura como control. Este fenotipo, sin embargo, se
ve notablemente incrementado al expresar el transgén
UAS-(CTG)_{480} indicando que la expresión del
microsatélite que contiene la secuencia CTG del transgén está
interfiriendo con el desarrollo normal del ojo de Drosophila.
De modo semejante, la figura 3 muestra el
fenotipo generado cuando se expresa el transgen
UAS-(CTG)_{480} en la musculatura de moscas Drosophila
melanogaster. Para ello se empleó la línea descrita en XX que
expresa Gal4 con el patrón de expresión del gen de la cadena pesada
de la miosina y se permitió a la descendencia del cruce
desarrollarse a 29ºC.
Resulta evidente de los resultados y discusión
presentados más arriba que la invención objeto de protección
proporciona una herramienta valiosa para la búsqueda sistemática de
agentes potencialmente terapéuticos para el tratamiento de, por
ejemplo, las distrofias miotónicas, Sca8 y HDL2. Las ventajas de
usar las moscas transgénicas de esta invención para la búsqueda
sistemática de agentes terapéuticos potenciales incluyen: la
posibilidad de adaptar las moscas objeto de protección a protocolos
de búsquedas sistemáticas de alto rendimiento, la simplicidad y bajo
coste de mantenimiento de dichas moscas transgénicas, la capacidad
de las moscas de esta invención de identificar agentes terapéuticos
activos por vía oral, la reproducción rápida, y la capacidad de las
moscas de esta invención de producir grandes cantidades de
descendencia. Por todo ello, esta invención llena un vacío
existente en el arsenal de herramientas para llevar a cabo
búsquedas sistemáticas de compuestos terapéuticos porque
proporciona un método para realizar dichas búsquedas in vivo
y con protocolos de alto rendimiento. Una ventaja significativa
adicional es la posibilidad de usar las moscas objeto de protección
para identificar compuestos que no exhiban toxicidad (o muy baja)
en células normales pero aún así sean efectivos en el tratamiento
de las distrofias miotónicas, Sca8 o HDL2 u otras enfermedades en
las que la expansión de repeticiones basadas en la secuencia CTG
sea relevante. Como tales, los métodos de búsquedas sistemáticas
objeto de protección proporcionan una manera de identificar agentes
terapéuticos contra estas enfermedades que exhiban baja o nula
toxicidad en las células normales. Por lo tanto, la presente
invención representa un avance en el estado de la técnica.
Aunque la invención presentada anteriormente se
ha descrito en algún detalle mediante ilustraciones y la
descripción de ejemplos en aras de la claridad, resulta evidente
para las personas versadas en la técnica, y a la luz de dichas
descripciones, que se pueden realizar ciertos cambios y
modificaciones en esta invención sin que ello los desvíe del
espíritu y el ámbito de las siguientes reivindicaciones.
Figura 1. Ojo compuesto de una mosca silvestre
(A) comparado con el ojo rugoso provocado por expresión del
transgén UAS-(CTG)_{480} con el patrón de expresión de
sev-Gal4 (B).
Figura 2. Resultado de la expresión del transgén
UAS-(CTG)_{480} (línea P(480)1.1) en un
patrón general en los precursores del ojo compuesto de
Drosophila. Para controlar la expresión se utilizó la línea
GMR-Gal4 y los cultivos se mantuvieron a 25ºC. En
(A) se muestra un individuo control heterozigoto para la
construcción GMR-Gal4 en el que se puede observar
que esta construcción, por sí sola, da un fenotipo rugoso en el ojo
compuesto. Este fenotipo, sin embargo, se ve notablemente
potenciado cuando GMR-Gal4 activa el transgén
UAS-(CTG)_{480} como puede observarse en la imagen (B) por
una reducción del tamaño del ojo y mayor presencia de omatidios
colapsados.
Figura 3. Fenotipo provocado por la expresión
del transgén. Se compara el fenotipo de los individuos normales de
la cepa OrR (A) frente al fenotipo provocado al expresar el
transgén UAS-(CTG)_{480} en la línea
P(480)1.1 en la musculatura de moscas adultas,
siguiendo el patrón de expresión de MHC-Gal4 (B). El
transgén MHC-Gal4 sigue el patrón de expresión del
gen de la cadena pesada de la miosina muscular (línea L82
perteneciente a la Colección de Líneas de Drosophila del
Departamento de Genética de la Universidad de Valencia). La
descendencia se desarrolló a 29ºC.
<110> Universitat de Valencia
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MODELOS ANIMALES TRANSGÉNICOS EN
DROSOPHILA PARA ENFERMEDADES HUMANAS PROVOCADAS
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipPOR EXPANSIONES DE MICROSATELITES QUE CONTIENEN
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipEL TRINUCLEOTIDO CTG
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20) .. (36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39) .. (55)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58) .. (74)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (77) .. (93)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal TATA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (109) .. (355)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> hsp70 caja TATA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región repetida
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (371) .. (550)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CTG microsatélite de repetición
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> secuencia de terminación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (592) .. (1442)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> terminación SV40
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20) .. (36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39) .. (55)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58) .. (74)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intensificador de la
transcripción
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (77) .. (93)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitios de unión Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal TATA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (109) .. (355)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> hsp70 caja TATA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> región repetida
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (398) .. (1953)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> microsatélite de repetición CTG
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> secuencia de terminación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1967) .. (2822)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> terminación SV40
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sitio de unión
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5906) .. (6027)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila melanogaster
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgatgaaa taacataagg tggtcccgtc g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 766
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Drosophila melanogaster
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11066
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (220) .. (2865)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región codificadora Gal4
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4872) .. (5489)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia codificante del gen
white
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 881
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> construcción artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Transgén caracterizado porque incluye
un microsatélite que contiene la secuencia CTG, seleccionado entre
SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, que se expresa en la mosca Drosophila
melanogaster según el patrón de expresión del factor de
transcripción de levaduras Gal4, bajo el control directo o
indirecto de un promotor adecuado, exógeno o endógeno, provocando
dicha expresión un efecto morfológico o fisiológico en el fenotipo
de la mosca medible de forma proporcional al nivel de expresión del
transgén.
2. Transgén según la reivindicación 1
caracterizado porque se expresa bajo el control de cualquier
promotor endógeno capaz de regular la expresión de Gal4 según el
patrón normal de Drosophila melanogaster seleccionado entre
otros, de genes tales como el gen sevenless o el gen apterous.
3. Transgén según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2 caracterizado porque se expresa a
través de uno o más factores transactivadores, preferentemente
pertenecientes al sistema de transactivación Gal4.
4. Método de obtención de moscas Drosophila
melanogaster transgénicas caracterizado por:
- a)
- Generar una primera línea de moscas transgénicas que expresen el factor de transcripción de levadura Gal4, bajo el control de cualquier promotor endógeno de Drosophila melanogaster, preferentemente en el ojo de dicha mosca.
- b)
- Generar una segunda línea de moscas en la cual el transgén de las reivindicaciones 1 a 3 se encuentra integrado de forma estable y fusionado con la secuencia UAS.
- c)
- Cruzar ambas líneas de moscas.
- d)
- Seleccionar la progenie con el fenotipo deseado.
5. Método según la reivindicación 4
caracterizado porque la integración estable del transgén,
específica o al azar, en al menos una célula de la mosca,
preferentemente en estado de embrión, se hace a través de un vector
adecuado, preferentemente un plásmido, según cualquiera de las
tecnologías conocidas en el sector, entre otras la electroporación
y la microinyección.
6. Método según la reivindicación 5
caracterizado porque cuando la integración del transgén es
al azar y la célula en cuyo genoma se integra tiene una fuente
endógena de transposasa, el vector que contiene el transgén posee
además las repeticiones invertidas terminales de 31 pares de bases
del elemento transponible P de Drosophila melanogaster.
7. Método según la reivindicación 5
caracterizado porque cuando la integración del transgén es
al azar y la célula en cuyo genoma se integra no posee una fuente
endógena de transposasa, el vector que contiene el transgén se
inyecta conjuntamente con una secuencia codificante para la
transposasa de Drosophila.
8. Método según la reivindicación 7
caracterizado porque el vector que contiene el transgén es
preferentemente el plásmido pTURBO.
9. Moscas Drosophila melanogaster
transgénicas obtenibles según el método de cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 8 caracterizadas por poseer un genoma
que contiene el transgén de las reivindicaciones 1 a 3 que se
expresa en diferentes tejidos y en diferentes momentos del
desarrollo de las moscas utilizando el sistema de expresión
Gal4/UAS, resultando en un fenotipo reconocible.
10. Un modelo animal para la identificación, de
manera individual o simultánea, de compuestos candidatos útiles
para el tratamiento de cualquier enfermedad en cuyo estado
patológico sea relevante la presencia de expansiones de
microsatélites basados en la secuencia CTG, caracterizado
porque comprende:
- a)
- Administrar dicho compuesto candidato a las moscas transgénicas Drosophila melanogaster de la reivindicación 9.
- b)
- Medir el efecto de dicho compuesto candidato sobre el fenotipo generado en moscas transgénicas que expresan los transgenes de las reivindicaciones 1 a 3 en un tejido dado.
- c)
- Comparar el fenotipo de las moscas transgénicas que expresan dichos transgenes en un tejido dado con el fenotipo de moscas transgénicas que expresan los mismos transgenes en idénticas condiciones pero que no recibieron el producto candidato.
- d)
- Identificar, como compuestos potencialmente terapéuticos, aquellos que son capaces de provocar un incremento o disminución del fenotipo, lo que es indicativo de una actividad potenciadora o reductora, respectivamente, de la capacidad patogénica del transgén.
11. Un modelo para el ensayo y/o validación de
compuestos candidatos útiles para el tratamiento de cualquier
enfermedad en cuyo estado patológico sea relevante la presencia de
expansiones de microsatélites basados en la secuencia CTG,
identificados in vivo o in vitro, mediante cualquier
sistema bioquímico o biológico, incluyendo el modelo de la
reivindicación 10, que comprende:
- a)
- Administrar dicho compuesto candidato a las moscas transgénicas Drosophila melanogaster de la reivindicación 9.
- b)
- Medir el efecto de dicho compuesto candidato sobre el fenotipo generado en moscas transgénicas que expresan el transgén de las reivindicaciones 1 a 3 en un tejido dado.
- c)
- Comparar cuantitativamente el incremento, reducción o alteración del fenotipo de las moscas transgénicas que expresan el transgén de las reivindicaciones 1 a 3 en un tejido dado con el fenotipo de moscas transgénicas que expresan dicho transgén en condiciones idénticas pero no recibieron el producto candidato.
- d)
- Identificar, como compuestos potencialmente terapéuticos, aquéllos que son capaces de provocar un incremento o disminución del fenotipo, lo que es indicativo de una actividad potenciadora o reductora, respectivamente, de la capacidad patogénica in vivo del transgén de las reivindicaciones 1 a 3.
- e)
- Comparar cualitativamente el fenotipo de las moscas transgénicas que expresan el transgén de las reivindicaciones 1 a 3 en un tejido dado con el fenotipo de moscas transgénicas que expresan dicho transgén en condiciones idénticas pero no recibieron el producto candidato de forma que la aparición de un fenotipo no relacionado con el fenotipo provocado por expresión del transgén de las reivindicaciones 1 a 3 es indicativo de un efecto secundario del compuesto ensayado.
12. Un modelo según cualquiera de las
reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque el compuesto
candidato es administrado a las moscas transgénicas Drosophila
melanogaster en un medio nutritivo.
13. Un modelo según cualquiera de las
reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque el compuesto
candidato es administrado a las moscas transgénicas Drosophila
melanogaster por vía respiratoria.
14. Un modelo según cualquiera de las
reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque el compuesto
candidato es administrado a las moscas transgénicas Drosophila
melanogaster por inyección en la cavidad corporal.
15. Un modelo según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque la enfermedad
se selecciona entre la distrofia miotónica de tipo 1 y 2, la ataxia
espinocerebelar 8 o la enfermedad HDL2.
16. Un modelo animal para identificar genes que
potencialmente modulen la actividad de los transgenes descritos en
las reivindicaciones 1 a 3 que comprende:
- a)
- Producir o introducir, mediante cruces genéticos, una mutación en el genoma de la mosca transgénica de la reivindicación 9.
- b)
- Determinar si dicha mutación tiene un efecto de incremento, reducción o alteración, sobre el fenotipo generado por la expresión del transgén de las reivindicaciones 1 a 3.
- c)
- Identificar el gen mutado que se introdujo en la etapa (a) o en el que se produjo la mutación.
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|---|---|---|---|
| ES200302591A ES2231039B1 (es) | 2003-10-27 | 2003-10-27 | Modelos animales transgenicos en drosophila para enfermedades geneticas humanas provocadas por expansiones de microsatelites que contienen el trinucleotido ctg. |
| PCT/ES2004/070085 WO2005039282A1 (es) | 2003-10-27 | 2004-10-20 | Modelos animales transgénicos en drosophila para enfermedades genéticas humanas provocadas por expansiones de microsatélites que contienen el trinucleótido ctg |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200302591A ES2231039B1 (es) | 2003-10-27 | 2003-10-27 | Modelos animales transgenicos en drosophila para enfermedades geneticas humanas provocadas por expansiones de microsatelites que contienen el trinucleotido ctg. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2231039A1 ES2231039A1 (es) | 2005-05-01 |
| ES2231039B1 true ES2231039B1 (es) | 2007-03-01 |
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|---|---|---|---|
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| WO (1) | WO2005039282A1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001012238A1 (en) * | 1999-08-12 | 2001-02-22 | California Institute Of Technology | An animal model of polyglutamine toxicity, methods of use, and modulators of polyglutamine toxicity |
| JP2004517634A (ja) * | 2000-10-27 | 2004-06-17 | ベイラー カレッジ オブ メディシン | 神経変性疾患の同定と治療のための方法及び組成物 |
-
2003
- 2003-10-27 ES ES200302591A patent/ES2231039B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-10-20 WO PCT/ES2004/070085 patent/WO2005039282A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BRAND A.H. et al. "Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes". Development, 1993, 118, páginas 401-415. * |
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| TAYLOR J.P. "Aberrant histone acetylation, altered transcription, and retinal degeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease are rescued by CREB-binding protein". Genes and Development, (2003), 17 (12), páginas 1463-1468. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2231039A1 (es) | 2005-05-01 |
| WO2005039282A1 (es) | 2005-05-06 |
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