ES2230861T3 - Inmunogeno de nicotina. - Google Patents
Inmunogeno de nicotina.Info
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Abstract
Una 5- o 6- nicotinil-enlazador-proteína portadora que tiene la fórmula en la que X es ¿C=C- o ¿C=C-; Y es ¿(CH2)k- o ¿(CH2)m-C6H10-(CH2)n- o ¿(CH2)m-C6H4- (CH2)n- en la que k = 0-20, m = 0-6 y n = 0-6 y Z es ¿NH- o ¿CO-; o X es ¿CH2-, Y es ¿(CH2)mC6H10-(CH2)n- o ¿(CH2)m-C6H4-(CH2)n- en la que m = 0-6 y n = 0-6, y Z es ¿NH-o ¿CO-.
Description
Inmunógeno de nicotina.
La presente invención se refiere a un inmunógeno
de nicotina, a saber una 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora y a su utilización como medicamento y a una composición
farmacéutica que comprende la 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora. La 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora es útil en el tratamiento inmunológico profiláctico y/o
terapéutico de la dependencia de nicotina procedente de los
productos del tabaco para conseguir la reducción del daño.
Debido al extenso número de
consumidores/fumadores de tabaco en el mundo que necesitan librarse
de su dependencia, existe un gran mercado de productos para
ayudarles a alcanzar su objetivo o al menos producir una reducción
del daño.
Un enfoque consiste en desarrollar una
vacuna/inmunógeno que pueda producir anticuerpos en un individuo,
que se unan fuertemente a la nicotina administrada/inhalada y
bloqueen su efecto antes de que alcance el sistema nervioso central.
La idea es que si el individuo no experimenta el efecto estimulante
esperado de la administración/fumado de nicotina, cesará
(extinción/prevención) el interés en administrar un producto de
tabaco, tal como rapé húmedo o en encender un cigarrillo.
Un enfoque complementario consiste en desarrollar
un inmunógeno que pueda producir en un individuo anticuerpos que se
unan de forma moderada o débil a la nicotina administrada/inhalada y
aumenten/prolonguen su efecto en su sistema nervioso central. La
idea es que si el individuo experimenta el efecto estimulante
esperado de la administración/fumado de la nicotina durante un
periodo prolongado de tiempo, el interés en una administración
renovada de un producto de tabaco, como por ejemplo rapé húmedo o en
el encendido de un cigarrillo será postpuesto y se reducirán las
consecuencias médicas del consumo del producto de tabaco.
Ambos enfoques mencionados anteriormente utilizan
inmunógenos que en un individuo producen una respuesta inmunológica
que conduce a una reducción del daño.
En la técnica anterior existen documentos que
describen inmunoanálisis que utilizan anticuerpos dirigidos contra
la nicotina, pero dichos anticuerpos no han sido sugeridos para
ninguna utilización médica (véase p. ej. Castro A. y Monji N.
Res. Comm. Chem. Path. Pharmacol. 1986, 51,
393-404).
La idea de tratar la dependencia de nicotina con
una vacuna no es nueva, ya que está comprendida en las descripciones
generales iniciales de la preparación de vacunas contra los fármacos
que pueden producir una dependencia (véase p. ej. el documento
EP-BI-0 496 839, ejemplificado por
la morfina; y el documento WO 96/30049, ejemplificado por la
cocaína).
Recientemente se publicó un documento que da a
conocer la inmunización activa para otra distribución de nicotina
(Hieda Y. et al., J. Pharmacol y Exp. Therap.
1997, 283, 1076-1081). El inmunógeno
utilizado en los experimentos fue
(\pm)-6-(carboximetil-ureído)-nicotina
ligado a la hemocianina de la lapa californiana.
Recientemente (09.04.98), se publicó la solicitud
de patente internacional WO 98/14216. Esta solicitud reivindica un
gran número de conjugados de portador de hapteno basados en la
molécula de nicotina y una característica estructural común de los
compuestos parece que es que todas las moléculas de hapteno
contienen un grupo de ácido carboxílico terminal que se conjuga a
continuación con el portador. No se ha dado a conocer ningún ensayo
in vivo para el tratamiento de la presunta toxicomanía.
La presente invención se dirige a una 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora que tiene la fórmula
en la
que
X es -C=C- o -C\equivC-;
Y es -(CH_{2})_{k}- o
-(CH_{2})_{m}-C_{6}H_{10}-(CH_{2})_{n}-
o
-(CH_{2})_{m}-C_{6}H_{4}-(CH_{2})_{n}-
en la que k = 0-20, m =
0-6 y n = 0-6 y
Z es -NH- o -CO-;
o
X es -CH_{2}-,
Y es
-(CH_{2})_{m}C_{6}H_{10}-(CH_{2})_{n}- o
-(CH_{2})_{m}-C_{6}H_{4}-(CH_{2})_{n}-
en la que m = 0-6 y n =
0-6, y
Z es -CO- o -NH-;
En una realización preferida de la invención las
proteínas portadoras del enlace al 5-o
6-nicotinilo se seleccionan de los compuestos en los
que k=1-8, m=0-3 y
n=0-3.
Otras denominaciones para la 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora son proteína portadora del enlace al
5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-
o 3-piridinil y proteína portadora del enlace al
5-(N-metil-2-pirrolidinil)-2-
o 3-piridinil.
La proteína portadora de la 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora de la invención se puede seleccionar a partir de las
proteínas farmacéuticamente aceptables que acopladas a un hapteno
son adecuadas para producir anticuerpos en el hombre y se
seleccionan por ejemplo del grupo constituido por hemocianina de la
lapa californiana (KLH), vacuna contra el tétanos, vacuna contra la
difteria, vacuna contra la difteria mutante no tóxica CRM_{197},
complejo de la proteína de la membrana externa (OMPC) de
Neisseria miningitidis, la subunidad B de Escherichia
coli inestable al calor y la exoproteína A recombinante de
Pseudomonas aeruginosa (EPAr).
Además, la invención se refiere a las nuevas
proteínas portadoras del enlace al 5- o 6-nicotinilo
según la invención para su utilización como medicamento, como por
ejemplo el componente inmunizante en una vacuna.
La invención se refiere además a una composición
farmacéutica que comprende una proteína portadora del enlace a 5- o
6-nicotinilo según la invención y a un vehículo
farmacéuticamente activo.
El vehículo en la composición farmacéutica
necesario para la administración del compuesto inmunógeno de la
invención se puede seleccionar de conocidos vehículos
farmacéuticamente aceptables, tal como la solución salina
fisiológica u otros vehículos adecuados, p. ej. dados a conocer en
la European o US Pharmacopoeia.
La composición farmacéutica según la invención
puede comprender además un adyuvante, que naturalmente debe ser
farmacéuticamente aceptable para uso humano, tal como el fosfato de
aluminio y el hidróxido de aluminio.
En un método de tratamiento inmunológico
profiláctico y/o terapéutico de dependencia de la nicotina de los
productos del tabaco para conseguir la reducción del daño en un
individuo una 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora individual según la invención se puede administrar a dicho
individuo en cantidades productoras de anticuerpos para producir
anticuerpos que se unan a moléculas de nicotina.
Para un individuo específico la cantidad
productora de anticuerpos se hallará experimentalmente por
experiencia subjetiva del efecto estimulante en ensayos de prueba y
error o será sugerida por el fabricante o el médico.
La administración se repite a intervalos para
aumentar el título de los anticuerpos que se unen a las moléculas de
nicotina en dicho individuo. El individuo preferentemente es un ser
humano aún cuando la utilización de la invención debería funcionar
si se tratase a otro mamífero. Este podría ser el caso, desde luego,
si se utilizaran animales de laboratorio con fines de ensayo.
La presente invención se ilustra además con
referencia a la siguiente descripción de los dibujos, a la síntesis
de compuestos inmunógenos y a los experimentos que describen las
realizaciones específicas de la invención. Sin embargo, estos no
deben considerarse como limitaciones al alcance de la invención
definida en las reivindicaciones.
Figura 1. Mediciones de títulos por Elisa del
suero en ratas inmunizadas. El título de los anticuerpos específicos
de ratas GK60-KLH inmunizadas es 1:4000. La
inmunización utilizando otros inmunógenos dio resultados
similares.
Figura 2. Elisa competitivo. El inmunógeno
GK84-KLH inmunizado utilizando el protocolo 1 dio
lugar a anticuerpos que eran aproximadamente 100 veces más
específicos para la nicotina y la nornicotina que otros competidores
utilizados.
Figura 3a. La inmunización activa utilizando
inmunógeno GK84-KLH suprime esencialmente por
completo la liberación de dopamina inducida por nicotina en núcleos
en concha accumbens comparada con las referencias.
Figura 3b. La inmunización activa utilizando
inmunógeno GK80-KLH produce un aumento marcado del
exceso de dopamina en el núcleo de la concha de accumbens tras la
administración de nicotina comparada con las referencias.
Se prepararon inmunógenos de nicotina según los
Esquemas 1 a 6; y los detalles experimentales se bosquejan a
continuación.
Trans-(4-prop-2-inilciclohexil)metanol
(GK91). Se puso en suspensión el complejo acetilida de litio
etilendiamina (7,4 g, 72,5 mmol) en 40 ml de DMSO anhidro y se
añadió a 5ºC una solución de
tolueno-4-sulfonato de
trans-4-(hidrometil)ciclohexilmetilo (8,0 g, 26,8
mmol) en DMSO (30 ml). Se agitó la mezcla durante 2 h a temperatura
ambiente, se enfrió con H_{2}O fría (200 ml) y se filtró a través
de una almohadilla de Celite. Se extrajo la solución resultante con
éter (4 \times 50 ml). Se lavaron las capas orgánicas combinadas
con agua y salmuera, se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se
concentraron al vacío dando 3,5 g (86%) de GK91 que se utilizó en la
etapa siguiente sin purificación posterior; ^{1}H RMN (CDCl_{3},
270 MHz) \delta 3,44 (d, J = 6 Hz, 2H), 2,10 (dd, J
= 6,5, 2,5 Hz, 2H), 1,97 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 1,66 (m, 4H),
1,72 (br s, 1H), 1,43 (m, 2H), 1,01 (m, 4H); ^{13}C RMN
(CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 83,3, 69,0, 68,4, 40,1, 37,1, 31,8,
29,1, 26,0. Una parte de este material se transformó en
3,5-dinitrobenzoato. Punto de fusión
106-108ºC (de iso-hexano); ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 9,23 (t, J = 2 Hz, 1H), 9,15
(d, J = 2 Hz, 2H), 4,29 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,15 (dd,
J = 6,5, 2,5 Hz, 2H), 1,98 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 1,92
(m, 4H), 1,85 (m, 1H), 1,52 (m, 1H), 1,14 (m, 4H), ^{13}C RMN
(CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 162,5, 148,7, 134,1, 129,3, 122,3,
82,9, 71,7, 69,3, 36,9, 36,8, 31,4, 29,2, 25,9;
ácido
trans-4-prop-2-inilciclohexanocarboxílico.
(GK68). Se mantuvo a 0ºC una solución de trióxido de cromo (1,18 g,
11,8 mmol) en H_{2}SO_{4} 2 M (10 ml, 20 mmol) mientras se
añadía 0,9 g (\sim5,9 mmol) de GK91 en acetona (20 ml). Se agitó
la mezcla de reacción durante 1 h a 0ºC y durante 2 h a temperatura
ambiente. Se destruyó el exceso de agente oxidante con
Na_{2}SO_{3} sólido (0,8 g, 8,3 mmol). Se añadió éter (\sim100
ml) y se extrajo la mezcla con salmuera (3 \times 50 ml). Se secó
la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se concentró. Se
cristalizó el residuo en iso-hexano para dar 0,74 g (75%) de
GK68 como cristales incoloros. Punto de fusión
84-86ºC (iso-hexano); ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 10,4 (brs, 1H), 2,27 (app tt, 1H),
2,12 (dd, J = 6,5, 2,5 Hz, 2H), 1,98 (l, J = 2,5 Hz,
1H), 2,15-1,87 (m, 4H), 1,6-1,35 (m,
3H), 1,09 (m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 182,4,
82,8, 69,4, 42,8, 36,2, 31,3, 28,4, 25,8;
éster metílico del ácido
trans-4-prop-2-inilciclohexanocarboxílico.
(GK70). Se disolvió GK68 (0,7 g, 4,2 mmol) en una mezcla de MeOH (5
mL) y ortoformato de trimetilo (1 mL). Se añadió Dowex 50W X2 (0,2
g) y se agitó la mezcla de reacción toda la noche a temperatura
ambiente. Se filtró la resina y se evaporaron los disolventes al
vacío. Se purificó el residuo por destilación bulbo a bulbo (175ºC,
13 mm) para dar 0,71 g (93%) de GK70 como aceite; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 3,66 (s, 3H), 2,24 (app tt, 1H), 2,11
(dd, J = 6,5, 2,5 Hz, 2H), 2,07-1,85 (m, 4H),
1,97 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 1,6-1,35 (m, 3H),
1,06 (m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 178,3,
82,8, 69,3, 51,5, 43,0, 36,2, 31,4, 28,7, 25,8;
toluen-4-sulfonato
de
trans-(4-prop-2-inilciclohexil)metilo
(GK87). Se enfrió a 0ºC una solución de GK91 (3,04 g, 20 mmol)
en piridina (30 ml) y cloruro de p-toluensulfonilo (4 g, 21
mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante 2 h a 0ºC y toda la
noche a temperatura ambiente. Se evaporó la piridina al vacío y se
disolvió el residuo en éter, se lavó con HCl 1M, H_{2}O,
NaHCO_{3} y salmuera, se secó sobre MgSO_{4}, se filtró y se
evaporó. Se recristalizó el residuo sólido en iso-hexano para
dar 5,57 g (91%) de GK87; punto de fusión 59-60ºC;
^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 7,78 (m, 2H), 7,34 (m,
2H), 3,82 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,07 (dd,
J = 6,5, 2,5 Hz, 2H), 1,95 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 1,80
(m, 4H), 1,60 (m, 1H), 1,41 (m, 1H), 0,97 (m, 4H); ^{13}C RMN
(CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 144,6, 133,1, 129,8, 127,8, 82,9,
75,1, 69,2, 37,0, 36,7, 31,3, 28,7, 25,8, 21,6;
trans-(4-prop-2-inilciclohexil)metilamina
(GK88). Se saturó con NH_{3} a -15ºC una solución de GK97
(1,53 g, 5 mmol) en MeOH (50 ml) en un recipiente sellado a 100ºC
durante 3 h. Se evaporó el MeOH al vacío. Se disolvió el residuo en
HCl 1 M (50 ml) y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 20 ml)
para eliminar el hidrocloruro de
bis(trans-(4-prop-2-inilciclohexilmetil)amina.
Se alcalinizó la fase acuosa con NaOH sólido a pH 12 y se extrajo
con éter (3 \times 20 ml). Se secaron los extractos orgánicos
combinados sobre KOH, se filtraron y se concentraron al vacío para
dar 0,4 g (53%) de GK88; ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz) \delta
2,51 (br d, 2H), 2,07 (m, 2H), 1,94 (m, 1H), 1,83 (m, 4H), 1,42 (m,
1H), 1,3-0,8 (m, 7H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68
MHz) \delta 83,3, 68,9, 48,6, 41,0, 37,2, 32,0, 30,3, 26,0;
bromuro de
6-bromohexilamonio^{4} (SG20). Se agitó a 95ºC
durante 11 h una mezcla de
6-amino-1-hexanal
(4,3 g, 37,0 mmol) en HBr al 48% (105 ml). Se concentró la solución
al vacío para dar 8,5 g (89%) de SG20 como polvo hidroscópico
parduzco (punto de fusión de SG20 en bruto:
128-132ºC); ^{1}H RMN (270 MHz,
CD_{3}COCD_{3}) \delta 8,30 (br s, 2H), 3,53 (t, J = 7
Hz, 1H), 3,52 (t, J = 7 Hz, 1H), 3,13-3,06
(m, 2H), 1,91-1,87 (m, 4H),
1,54-1,46 (m, 4H); ^{13}C RMN (68 MHz,
CD_{3}COCD_{3}) \delta 40,5, 34,8, 33,4, 28,3, 27,7, 26,4;
^{4}Dumont, J.L.; Chodkiewicz, W.; Cadiot, P.
Bull. Soc. Chim. Fr. 1967, 2,
558-596.
7-octinamina^{5} (SG26).
Se añadió gota a gota una solución de SG20 (3,0 g, 11,5 mmol) en
DMSO anhidro (2 ml) durante un periodo de 45 minutos a una
suspensión agitada de complejo de acetilida de litio, etilendiamina
(7,0 g, 76,0 mmol) en DMSO anhidro (36 ml) a 8ºC. Después de 3 h a
8ºC se vertió lentamente la suspensión en una solución enfriada de
salmuera (aprox. 300 ml). Se extrajo la solución con hexano (3
\times 150 ml) y se secaron las fases orgánicas combinadas sobre
Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron al vacío a
temperatura ambiente para dar 1,0 g (69%) de SG26 como un aceite
amarillo claro; IR (película) v_{max} 2114, 3296 cm^{-1};
^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 2,63 (l; J = 7
Hz, 2H), 2,14 (dt, J = 7, 2,5 Hz, 2H), 1,88 (t; J =
2,5 Hz, 1H), 1,39-1,31 (m, 10H); ^{13}C RMN (68
MHz, CDCl_{3}) \delta 84,6, 68,3, 42,2, 33,7, 28,6, 28,5, 26,4,
18,4;
^{5}Novis Smith, W. y Beumel, O.F.
Synthesis, 1974, 441-442.
Se desoxigenó con N_{2} una mezcla de
6-bromonicotina^{8} (o
5-bromonicotina^{7}) (0,24 g, 1 mmol), dicloruro
de bis(trifenil-fosfina)paladio (0,014
g, 0,02 mmol) y CuI (0,004 g, 0,02 mmol) en 5 ml de Et_{3} N. Se
añadió el compuesto acetilénico (1,1 mmol) y se calentó la mezcla de
reacción a 120ºC durante 40 min (4 h para
5-bromonicotina) en un recipiente sellado. Se
evaporó al vacío el Et_{3}N y se disolvió el residuo en EtOAc, se
lavó con NaHCO_{3} acuoso saturado y se extrajo con 20 ml de HCl
2N. Se extrajo la fase acuosa ácida con EtOAc (4 \times 20 ml). Se
saturó la capa acuosa con NaHCO_{3} sólido y se extrajo con EtOAc
(3 \times 30 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera, se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se concentró al vacío. Se purificó el
residuo por cromatografía en columna.
^{6}M. Oukal, W. Fiedler, D. Dumas, I. Damaj,
B.R. Martin, J.A. Rosecrans, J.R. James, R.A. Glennon. Eur. J.
Med. Chem. 1996, 31, 875-888,
^{7}L.S. Bleicher, N.D.P. Oxford, A. Herbaut, J.S. McCallum y I.A.
McDonald. J. Org. Chem. 1998, 63,
1109-1118.
4-[(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)etinil]benzoato
de metilo (GK47). Se preparó el 4-etinilbenzoato
de metilo según la ref. 8. Purificación: cromatografía en columna
[sílice, acetona/iso-hexano (1:2)]; rendimiento 78%; punto de
fusión 102-104ºC (iso-hexano); ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,56 (br s, 1H), 8,03 (dd, J =
8,5, 1,5 Hz, 2H), 7,72 (app dt, 1H), 7,63 (dd, J = 8,5, 1,5
Hz, 2H), 7,52 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,25 (m, 1H),
3,13 (t, J = 8 Hz, 1H), 2,4-2,1 (m, 5H),
2,1-1,6 (m, 3H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz)
\delta 166,3, 149,9, 141,6, 138,9, 135,1, 131,8, 130,0, 129,4,
127,2, 127,0, 91,3, 87,7, 68,6, 56,9, 52,2, 40,3, 35,3, 22,6;
^{8}S.J. Havens y P.M. Hergenrother. J. Org.
Chem. 1985, 50, 1763-1765.
7-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)hept-6-inoato
de metilo (GK79). Se preparó 6-heptiaoato de
metilo según la ref. 9. Purificación: cromatografía en columna
[sílice, acetona/iso-hexano (1:2)]; rendimiento 73%; ^{1}H
RMN (CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,45 (d, J = 2 Hz, 1H),
7,63 (dd, J = 8,2 Hz, 1H), 7,33 (d, J = 8 Hz, 1H),
3,67 (s, 3H), 3,29 (m, 1H), 3,08 (app t, 1H), 2,47 (t, J = 7
Hz, 2H), 2,37 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,31 (m, 1H), 2,18 (m, 1H),
2,16 (s, 3H), 2,05-1,6 (m, 7H); ^{13}C RMN
(CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 173,7, 149,5, 142,5, 137 ,7,
134,9,126,6, 89,6, 80,7, 68,6, 56,9, 51,4, 40,3, 35,1, 33,5, 27,7,
24,1, 22,5, 19,0;
^{9}E.C. Taylor et al. J. Org.
Chem. 1991, 56, 1807-1812.
7-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)hept-6-inoato
de metilo (GK77). Se preparó 6-heptinoato de
metilo según la ref. 9. Purificación: cromatografía en columna
[sílice, acetona/iso-hexano (1:2)]; rendimiento 60%; ^{1}H
RMN (CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,51 (br s, 1H), 8,42 (br s, 1H),
7,71 (br s, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,24 (m, 1H), 3,08 (app l, 1H), 2,46
(t, J = 7 Hz, 2H), 2,38 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,31 (m,
1H), 2,20 (m, 1H), 2,17 (s, 3H), 2,1-1,55 (m, 7H;
^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 173,8, 151,0, 147,8,
138,2, 137,3, 120,8, 92,9, 77,9, 68,5, 56,9, 51,5, 40,3, 35,1, 33,5,
27,9, 24,1, 22,6, 19,1;
éster metílico del ácido
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)
prop-2-inil]
ciclohexancarboxílico (GK78). Purificación: cromatografía
en columna [sílice, acetona/iso-hexano (1:2)]; rendimiento
87%; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,46 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,63 (dd, J = 8,2 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,24 (m, 1H), 3,08 (app l, 1H), 2,4-2,1 (m, 8H), 2,1-1,3 (m, 10H), 1,15 (m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 176,3, 149,5, 142,6, 137,7, 134,9, 126,7, 88,7, 81,5, 68,6, 56,9, 51,5, 43,0, 40,3, 36,4, 35,1, 31,6, 28,7, 26,8, 22,6;
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,46 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,63 (dd, J = 8,2 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,24 (m, 1H), 3,08 (app l, 1H), 2,4-2,1 (m, 8H), 2,1-1,3 (m, 10H), 1,15 (m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 176,3, 149,5, 142,6, 137,7, 134,9, 126,7, 88,7, 81,5, 68,6, 56,9, 51,5, 43,0, 40,3, 36,4, 35,1, 31,6, 28,7, 26,8, 22,6;
éster metílico del ácido
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)
prop-2-inil]
ciclohexancarboxílico (GK75). Purificación: cromatografía
en columna [sílice, acetona/iso-hexano (1:2)]; rendimiento
58%; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,50 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,41 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 2 Hz, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,25 (m, 1H), 3,08 (app t, 1H), 2,4-2,1 (m, 8H), 2,1-1,3 (m, 10H), 1,14 (m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 176,3, 151,1, 147,8, 138,1, 137,2, 120,8, 91,9, 78,6, 68,5, 56,9, 51,5, 43,0, 40,3, 36,5, 35,1, 31,6, 28,7, 26,9, 22,6;
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,50 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,41 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 2 Hz, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,25 (m, 1H), 3,08 (app t, 1H), 2,4-2,1 (m, 8H), 2,1-1,3 (m, 10H), 1,14 (m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 176,3, 151,1, 147,8, 138,1, 137,2, 120,8, 91,9, 78,6, 68,5, 56,9, 51,5, 43,0, 40,3, 36,5, 35,1, 31,6, 28,7, 26,9, 22,6;
2-(3-hidroxi-3-metilbut-1-inil)-5-(1-metil-2-pirrolidinil)piridina
(GK55). Purificación: cromatografía en columna [sílice,
acetona/iso-hexano (1:1)]; rendimiento 90%; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,47 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,67
(dd, J = 8,2 Hz, 1H), 7,37 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,50 (br
s, 1H), 3,23 (m, 1H), 3,08 (app t, 1H), 2,30 (m, 1H), 2,19 (m, 1H),
2,15 (s, 3H), 2,05-1,55 (m, 3H), 1,64 (s, 6H);
^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 149,4, 141,7, 138,3,
135,1, 127,0, 94,0, 81,2, 68,6, 65,0, 56,9, 40,3, 35,1, 31,2,
22,6;
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)prop-2-inil]ciclohexilmetilamina
(GK89). Purificación: cromatografía en columna [sílice,
CHCl_{3}: MeOH saturado con NH_{3} (15:1)]; rendimiento 90%;
^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,50 (d, J = 2 Hz,
1H), 8,40 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,70 (t, J = 2 Hz, 1H),
3,24 (m, 1H), 3,07 (app t, 1H), 2,55 (d, J = 6,5 Hz, 2H),
2,33 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,17 (s, 3H),
2,4-2,1 (m, 2H), 2,1-1,4 (m, 10H),
1,26 (m, 1H), 1,2.0,85 (m, 4H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz)
\delta 151,0, 147,7, 138,2, 137,2, 120,9, 92,4, 78,4, 68,4, 56,9,
48,5, 40,9, 40,3, 37,4, 35,1, 32,2, 30,3, 27,0, 22,6;
8-[5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil]
oct-7-inamina (SG29). Se calentó
la mezcla de reacción durante 6 h. Purificación: cromatografía en
columna [SiO_{2}, CHCl_{3}/MeOH/NH_{4}OH, (5:1:0,1)];
rendimiento 0,36 g (86%) (referido a la
5-bromonicotina recuperada); IR (película) v_{max}
2232 cm^{-1}; ^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,47 (d,
J = 2 Hz, 1H), 8,38 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,68 (dd,
J = 2,2 Hz, 1H), 3,21 (ddd, J = 9,5, 9,5, 2 Hz, 1H),
3,08-3,01 (m, 1H), 2,71-2,65 (m,
2H), 2,40 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,34-2,11 (m,
5H), 1,98-1,31 (m, 13H); ^{13}C RMN (68 MHz,
CDCl_{3}) \delta 147,2, 143,9, 134,5, 133,5, 117,1, 89,7, 64,7,
53,1, 37,8, 36,6, 31,3, 28,7, 24,8, 24,6, 22,5, 18,8,
15,5;
15,5;
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)-prop-2-inil]ciclohexilmetilamina
(GK90). Se desoxigenó con N_{2} una mezcla de
6-bromonicotina (0,47 g, 2 mmol),
tris(dibencilidenacetona)-dipaladio
[(dba)_{3}Pd_{2}] (0,018 g, 0,02 mmol),
1,3-bis(difenilfosfino)propano (dppp)
(0,032 g, 0,08 mmol) y CuI (0,008 g, 0,04 mmol) en 15 ml de
Et_{3}N y a continuación se añadió GK88 (0,326 g, 2,16 mmol). Se
calentó la mezcla de reacción a 120ºC durante 6 h en un recipiente
sellado. Se evaporó el Et_{3}N al vacío. Se disolvió el residuo en
EtOAc, se lavó con solución de NaOH diluida y se extrajo con 40 ml
de HCl 2 N. Se extrajo la fase acuosa ácida con EtOAc (4 \times 20
ml). Se alcalinizó la capa acuosa con NaOH a pH 12 y se extrajo con
EtOAc (5 \times 30 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas
con salmuera, se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se
concentraron al vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en
columna [sílice, CHCl_{3}/MeOH saturado con NH_{3},(15:1)];
rendimiento 0,43 g (71%) de GK90; ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz)
\delta 8,46 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,62 (dd, J = 8,2 Hz,
1H), 7,34 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,23 (m, 1H), 3,07 (app t, 1H),
2,53 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,34 (d, J = 6,5 Hz, 2H),
2,30 (app q, 1H), 2,18 (m, 1H), 2,15 (s, 3H),
2,05-1,45 (m, 8H), 1,35-0,65 (m,
7H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 149,5, 142,7, 137,6,
134,8, 126,7, 89,3, 81,3, 68,6, 56,9, 48,7, 41,0, 40,3, 37,4, 35,1,
32,3, 30,3, 26,9, 22,6;
éster metílico del ácido
trans-3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)acrílico
(GK59). Se desoxigenó con nitrógeno una mezcla de
5-bromonicotina (0,241 g, 1 mmol),
Pd(OAc)_{2} (0,011 g, 0,05 mmol),
tri-o-tolilfosfina (0,060 g, 0,2 mmol) y Et_{3}N (0,17 ml,
1,25 mmol) en 5 ml de MeCN y se añadió acrilato de metilo (0,112 ml,
1,25 mmol). Se calentó la mezcla de reacción en un recipiente
sellado a 110ºC toda la noche. Se evaporó al vacío el MeCN y se
disolvió el residuo en EtOAc, se lavó con solución saturada de
NaHCO_{3} y se extrajo con 20 ml de HCl 2 N. Se extrajo la fase
acuosa ácida con EtOAc (4 \times 20 ml). Se saturó la capa acuosa
con NaHCO_{3} sólido y se extrajo con EtOAc (3 \times 30 ml). Se
lavó la fase orgánica con salmuera, se secó (MgSO_{4}) se filtró y
se concentró al vacío. Se purificó el residuo por cromatografía en
columna [sílice, CHCl_{3}/MeOH,(40:1)]; rendimiento 0,2 g (80%);
punto de fusión 42-44ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3},
270 MHz) \delta 8,62 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,53 (d, J =
2 Hz, 1H), 7,87 (t, J = 2 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 16,0
Hz, 1H), 6,55 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,26 (m,
1H), 3,15 (app t, 1H), 2,34 (app q, 1H), 2,22 (m, 1H), 2,18 (s, 3H),
2,1-1,5 (m, 3H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz)
\delta 166,7, 150,9, 148,6, 141,2, 139,3, 132,8, 130,1, 119,9,
68,4, 56,9, 51,8, 40,4, 35,3, 22,6;
4-[(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)etinil]benzoato
de metilo (YH19). Se agitó a temperatura ambiente durante 30 min
una mezcla de 5-bromonicotina (0,44 g, 1,82 mmol),
Pd(OAc)_{2} (60 mg, 0,34 mmol), Ph_{3}P (0,19 g,
0,72 mmol), CuI (30 mg) y Et_{3}N (30 mL). Se añadió
4-etinilbenzoato de metilo^{9} (0,32 g, 2 mmol) y
se calentó a reflujo la mezcla toda la noche. Se dejó que la mezcla
de reacción alcanzase la temperatura ambiente, se diluyó con
CH_{2}Cl_{2} (120 mL) y se lavó con H_{2}O. Se secó
(MgSO_{4}) la fase orgánica, se filtró y se concentró. Se
cromatografió el residuo [SiO_{2}, CHCl_{3}/MeOH (50:1)] para
dar 0,37 g (64%) de YH19. Se recristalizó una muestra analítica en
EtOH/iso-hexano; punto de fusión: 97-98ºC;
^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,65 (br s, 1H), 8,49 (br
s, 1H), 8,03-7,97 (m, 2H), 7,85 (br s, 1H),
7,59-7,53 (m, 2H), 3,89 (s, 3H),
3,27-3,19 (m, 1H), 3,10 (t, J = 8,5 Hz, 1H),
2,36-2,13 (m, 2H), 2,17 (s, 3H),
2,04-1,62 (m, 3H); ^{13}C RMN (270 MHz,
CDCl_{3}) \delta 166,3, 150,9, 148,8, 138,6, 137,4, 131,5,
129,8, 129,5, 127,2, 119,7, 91,5, 89,0, 68,3, 56,9, 52,2, 40,3,
35,2, 22,7;
Ácido
4-[(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)etinil]benzoico
(GK49). Se calentó a reflujo durante 30 min una mezcla de GK47
(0,185 g, 0,58 mmol) y KOH (0,097 g, 1,73 mmol) en MeOH acuoso al
50% (10 ml). Se acidificó la mezcla de reacción con HOAc a pH 8 y se
evaporaron los disolventes al vacío. Se purificó el producto en
bruto por cromatografía en columna (gel de sílice, CHCl_{3}/MeOH,
gradiente de MeOH 10% a 50%). Se evaporaron los disolventes al
vacío. Se disolvió el residuo en CH_{2}Cl_{2}/EtOH, (95:5), se
filtró y se evaporó al vacío para dar 0,17 g (96%) de GK49; ^{1}H
RMN (CD_{3}OD, 270 MHz) \delta 8,54 (br s, 1H), 8,04 (d,
J = 8,5 Hz, 2H), 7,91 (dd, J = 8,2 Hz, 2H), 7,64 (d,
J = 8 Hz, 1H), 7,60 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 3,46 (app t,
1H), 3,36 (m, 1H), 2,55 (app q, 1H), 2,40-2,20 (m,
4H), 2,10-1,80 (m, 3H); ^{13}C RMN (CD_{3}OD, 68
MHz) \delta 174,1, 150,8, 143,5, 138,4, 138,2, 137,9, 132,6,
130,8, 128,9, 125,6, 90,7, 90,2, 70,1, 57,9, 40,5, 35,2, 23,4;
ácido
7-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)hept-6-inoico
(GK81). Se purificó el compuesto por TLC de preparación [sílice,
CHCl_{3}/MeOH, (5:1)]; rendimiento 93%; ^{1}H RMN (CDCl_{3},
270 MHz) \delta 11,49 (br s, 1H), 8,40 (br s, 1H), 8,68 (dd,
J = 8,2 Hz, 1H), 7,31 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,32 (m, 1H),
3,22 (app t, 1H), 2,5-2,1 (m, 9H),
2,1-1,5 (m, 7H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz)
\delta 177,1, 149,3, 142,8, 135,6, 135,3, 126,9, 91,1, 80,0, 68,7,
56,3, 39,6, 34,2, 33,9, 27,6, 24,4, 22,1, 19,1;
ácido
7-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)hept-6-inoico
(GK80). Se purificó el compuesto por TLC de preparación [sílice,
CHCl_{3}/MeOH, (5:1)]; rendimiento 79%; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 12,5 (br s, 1H), 8,47 (br s, 1H),
8,35 (br s, 1H), 7,75 (s, 1H), 3,30(m, 1H), 3,18(app
t, 1H), 2,5-2,1 (m, 9H), 2,1-1,5 (m,
7H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 176,8, 150,7, 147,1,
138,2, 136,5, 121,3, 93,9, 77,3, 68,5, 56,3, 39,7, 34,1 (2 C's),
28,0, 24,4, 22,2, 19,2;
ácido
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)prop-2-inil]ciclohexano-carboxílico
(GK83). Se purificó el compuesto por TLC de preparación [sílice,
CHCl_{3}/MeOH, (10:1)]; rendimiento 80%; ^{1}H RMN (CDCl_{3},
270 MHz) \delta 10,2 (br s, 1H), 8,59 (s, 1H), 7,81 (d, J =
8 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 8 Hz, 1H), 3,33 (m, 1H), 3,23 (m,
1H), 2,5-1,2 (m, 20H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68
MHz) \delta 179,4, 148,7, 141,9, 136,9 (br), 136,0, 127,0, 90,6,
80,6, 68,6, 56,7, 43,1, 40,0, 36,2, 34,6, 31,1, 29,1, 26,7,
22,5;
ácido
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)prop-2-inil]ciclohexano-carboxílico
(GK82). Se purificó el compuesto por TLC de preparación [sílice,
CHCl_{3}/MeOH, (10:1)]; rendimiento 85%; ^{1}H RMN (CD_{3}OD,
270 MHz) \delta 8,48 (br s, 1H), 8,44 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 3,50
(app t, 1H), 3,40 (m, 1H), 2,60 (app q, 1H), 2,4-1,8
(m, 14H), 1,65-1,35 (m, 3H), 1,18 (m, 2H); ^{13}C
RMN (CD_{3}OD, 68 MHz) \delta 181,1, 152,2, 148,7, 139,7, 137,7,
123,2, 94,5, 79,0, 70,1, 57,8, 45,3, 40,3, 38,3, 35,0, 33,1, 30,5,
27,7, 23,3;
ácido
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)propil]ciclohexanocarboxílico
(GK95). Se purificó el compuesto por TLC de preparación [sílice,
CHCl_{3}/MeOH, (10:1)]; rendimiento 93%; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}+C_{8}D_{8}, 270 MHz) \delta 11,89 (br s, 1H), 8,34
(d, J = 2 Hz, 1H), 8,92 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,63 (app
t, 1H), 3,28 (m, 1H), 2,97 (m, 1H), 2,44 (t, J-8 Hz, 2H),
2,35-1,35 (m, 14H), 2,05 (s, 3H), 1,15 (m, 3H), 0,85
(m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}+C_{8}D_{8}, 68 MHz) \delta
179,3, 148,5, 146,5, 138,3, 136,6, 135,0, 68,6, 56,2, 43,9, 39,5,
37,0, 36,8, 34,1, 33,2, 32,4, 32,3, 29,2, 28,3, 22,0;
ácido
trans-3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)-acrílico
(GK62). Se purificó el compuesto por cromatografía en columna
[sílice, CHCl_{3}/EtOH, (1:1)]; rendimiento 82%; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 13,48 (br s, 1H), 8,73 (s, 1H), 8,47
(s, 1H), 8,40 (s, 1H), 7,64 (d, J = 16 Hz, 1H), 6,76 (d,
J = 16 Hz, 1H), 3,83 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 2,62 (m, 1H),
2,5-2,0 (m, 7H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz)
\delta 169,9, 149,8, 148,8, 138,1, 134,4, 134,0, 131,7, 125,3,
69,0, 55,6, 38,9, 33,4, 21,9;
ácido
4-[(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)etinil]benzoico
(YH20). Se añadió KOH (168 mg, 3 mmol) a YH19 (0,32 g, 1 mmol)
en MeOH (5 mL). Se calentó a reflujo la mezcla agitada durante 2 h y
a continuación se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió HOAc a pH
8 y se evaporaron los volátiles. Se cromatografió el residuo
[SiO_{2}, CHCl_{3}/MeOH (5:1)] para dar 0,19 g (62%) de YH20;
^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 11,00 (br s,
0H), 8,75 (br s, 1H), 8,44 (m, 2H), 8,10 (d, J = 8 Hz, 2H),
7,42 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 3,94-3,84 (m, 1H),
3,63-3,52 (m, 1H), 2,69-2,58 (m,
1H), 2,42 (s, 3H), 2,42-1,98 (m, 4H); ^{13}C RMN
(270 MHz, CDCl_{3}) \delta 169,5, 151,6, 148,9, 139,0, 133,8,
132,9, 131,5, 129,6, 125,3, 120,8, 93,0, 87,4, 69,0, 55,5, 38,8,
33,2, 21,7;
ácido
4-(3-(N-metilpirrolidin-2-il)piridin-5-iletil)benzoico
(YH24). Se añadió KOH (130 mg, 2,32 mmol) a una solución de YH22
(0,12 g, 0,37 mmol), H_{2}O (3 mL) y 1,4-dioxano
(3 mL). Después de calentar a reflujo durante 2 h se ajustó el pH de
la mezcla a 8 mediante adición de HOAc. Se evaporaron los volátiles
y se cromatografió el residuo [SiO_{2}, CHCl_{3}/MeOH (2:1)]
para dar 70 mg (61%) de YH24; ^{1}H RMN (400 MHz, CDCl_{3})
\delta 8,44 (br s, 2H), 7,92 (s, 1H), 7,88 (d, J = 8 Hz,
2H), 7,12 (d, J = 8 Hz, 2H), 3,98-3,91 (m,
1H), 3,75-3,66 (m, 1H), 2,99-2,85
(m, 5H), 2,50 (s, 3H), 2,43-2,31 (m, 1H),
2,27-2,06 (m, 3H); ^{13}C RMN (400 MHz,
CDCl_{3}) \delta 172,9, 151,0, 148,4, 145,9, 139,6, 137,9,
134,1, 130,6 (2 C's), 129,5 (3 C's), 70,6, 57,2, 39,5, 38,2, 35,4,
33,7, 22,9;
Ácido
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)
propil] ciclohexano-carboxílico (GK84). Se
hidrogenó
GK83 (0,153 g, 0,47 mmol) en 40 ml de EtOH a temperatura ambiente y a presión atmosférica sobre 0,1 g de paladio al 10% sobre carbono durante 1 h. Se filtró el catalizador y se lavó con EtOH. Se evaporó el disolvente al vacío y se purificó el residuo por TLC de preparación [sílice, CHCl_{3}/MeOH, (10:1)] para dar 0,07 g (45%) de GK84; ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 270 MHz) \delta 8,55 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,96 (dd, J = 8,2 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,14 (m, 1H), 3,69 (m, 1H), 3,08 (m, 1H), 2,81 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,61 (s, 3H), 2,47 (m, 1H), 2,21 (m, 4H), 2,0-1,5(m, 6H), 1,5-1,1 (m, 5H), 0,96 (m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 180,0, 163,3, 148,8, 136,8, 128,6, 123,7, 69,5, 55,8, 43,6, 38,4, 37,6, 32,3, 32,2, 29,1, 27,0, 21,5;
GK83 (0,153 g, 0,47 mmol) en 40 ml de EtOH a temperatura ambiente y a presión atmosférica sobre 0,1 g de paladio al 10% sobre carbono durante 1 h. Se filtró el catalizador y se lavó con EtOH. Se evaporó el disolvente al vacío y se purificó el residuo por TLC de preparación [sílice, CHCl_{3}/MeOH, (10:1)] para dar 0,07 g (45%) de GK84; ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 270 MHz) \delta 8,55 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,96 (dd, J = 8,2 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 8 Hz, 1H), 4,14 (m, 1H), 3,69 (m, 1H), 3,08 (m, 1H), 2,81 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,61 (s, 3H), 2,47 (m, 1H), 2,21 (m, 4H), 2,0-1,5(m, 6H), 1,5-1,1 (m, 5H), 0,96 (m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 180,0, 163,3, 148,8, 136,8, 128,6, 123,7, 69,5, 55,8, 43,6, 38,4, 37,6, 32,3, 32,2, 29,1, 27,0, 21,5;
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)propil]ciclohexilmetilamina
(GK93). Purificación: cromatografía en columna [alúmina,
CHCl_{3}/MeOH, gradiente de metanol 10 a 50%]; rendimiento 78%;
^{1}H RMN (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,34 (d, J = 2 Hz,
1H), 8,32 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,50 (t, J = 2 Hz, 1H),
3,25 (m, 1H), 3,08 (app t, 1H), 2,58 (t, J = 7,5 Hz, 2H),
2,51 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,30 (app q, 1H), 2,19 (m, 1H),
2,17 (s, 3H), 2,05-1,55 (m, 9H), 1,32 (br s, 2H),
1,22 (m, 4H), 0,88 (m, 4H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz)
\delta 148,8, 147,0, 138,0, 137,8, 134,3, 68,8, 56,9, 48,6, 41,3,
40,3, 37,6, 36,9, 35,1, 33,2, 32,7, 30,6, 28,5, 22,5;
éster metílico del ácido
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinil)propil]ciclo-hexanocarboxílico
(GK94). Purificación: cromatografía en columna [sílice,
acetona/iso-hexano (1:2)]; rendimiento 79%; ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,34 (d, J = 2 Hz, 1H), 8,31
(d, J = 2 Hz, 1H), 7,50 (d, J = 2 Hz, 1H), 3,65 (s,
3H), 3,25 (m, 1H), 3,06 (app t, 1H), 2,58 (t, J = 8 Hz, 2H),
2,4-2,1 (m, 3H), 2,17 (s, 3H),
2,05-1,55 (m, 9H), 1,40 (m, 2H), 1,24 (m, 3H), 0,91
(m, 2H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 176,5, 148,8,
147,1, 138,1, 137,7, 134,3, 68,8, 57,0, 51,4, 43,3, 40,4, 36,7,
35,1, 33,2, 32,2, 28,9, 28,4, 22,5;
trans-4-[3-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)propil]ciclohexilmetilamina
(GK96). Purificación: TLC de preparación [sílice,
CHCl_{3}/MeOH saturado con NH_{3} (15:1)]; rendimiento 31%;
^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,41 (d, J = 2 Hz,
1H), 7,60 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,11 (d, J = 2 Hz, 1H),
3,23 (m, 1H), 3,04 (app t, 1H), 2,74 (t, J = 8 Hz, 2H), 2,51
(d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,29 (app q, 1H), 2,19 (m, 1H), 2,16 (s,
3H), 2,05-1,65 (m, 9H), 1,49 (br s, 2H),
1,35-1,10 (m, 4H), 0,88 (m, 4H); ^{13}C RMN
(CDCl_{3}, 68 MHz) \delta 161,4, 148,8, 135,5, 135,1,
122,5, 68,6, 57,0, 48,8, 41,4, 40,3, 36,4, 37,6, 37,1, 35,0, 32,8,
30,6, 27,4, 22,5;
ácido
4-[2-(5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinil)etil]benzoico
(GK54). Se hidrogenó GK49 (0,09 g, 0,29 mmol) en 20 ml de MeOH a
temperatura ambiente y a presión atmosférica sobre 0,03 g de paladio
al 10% sobre carbono durante 6 horas. Se filtró el catalizador y se
lavó con MeOH. Se evaporó el disolvente al vacío y se purificó el
residuo por cromatografía en gel de sílice [CHCl_{3}/MeOH, (5:1)]
para dar 0,052 g (57%) de GK54; ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 270 MHz)
\delta 8,52 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,88 (dd, J = 8,5 Hz,
2H), 7,83 (dd, J = 8,2 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 8 Hz,
1H), 7,19 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 3,74 (m, 1H), 3,51 (m, 1H),
3,08 (m, 4H), 2,76 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,36 (m, 1H), 2,07 (m,
3H); ^{13}C RMN (CD_{3}OD, 68 MHz) \delta 174,2, 162,7, 150,0,
146,1, 138,2, 134,5, 133,1, 130,8, 129,3, 125,1, 70,4, 57,5, 40,2,
39,8, 37,0, 33,9, 23,0;
4-(3-(N-metilpirrolidin-2-il)piridin-5-iletil)benzoato
de metilo (YH22). Se hidrogenó una mezcla de YH19 (0,15 g, 0,468
mmol) y Pd(C) (10%, 20 mg) en MeOH (10 mL) a presión
atmosférica y a temperatura ambiente durante un día. Se eliminó el
catalizador por filtración a través de Celite y se concentró el
filtrado. Se cromatografió el residuo [SiO_{2}, CHCl_{3}/MeOH
(60:1)] para dar 0,15 g (95%) de YH22; ^{1}H RMN (400 MHz,
CDCl_{3}) \delta 8,38 (br s, 2H), 7,91-7,80 (m,
2H), 7,40 (s, 1H), 7,16-7,14 (m, 2H), 3,85 (s, 3H),
3,23-3,16 (m, 1H), 3,05-2,87 (m,
5H), 2,30-2,22 (m, 1H), 2,18-2,08
(m, 1H), 2,09 (s, 3H), 1,92-1,84 (m, 1H),
1,81-1,72 (m, 1H), 1,67-1,57 (m,
1H); ^{13}C RMN (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 166,9, 148,6,
147,3, 146,2, 138,3, 136,5, 134,5, 129,7, 128,0, 68,6, 56,9, 51,9,
40,2, 37,4, 35,0, 34,4, 22,4;
2-etinil-5-(1-metil-2-pirrolidinil)piridina
(GK58). Se disolvió GK55 (0,3 g, 1,23 mmol) y NaH como
dispersión al 60%, en tolueno anhidro (50 ml). Se destiló lentamente
la solución agitada hasta que el punto de ebullición del destilado
alcanzó 110ºC (se recogió aprox. 25 ml de destilado). El resto del
tolueno se evaporó al vacío. Se cromatografió el residuo [SiO_{2},
CHCl_{3}/MeOH, (10:1)] para dar 0,2 g, (87%) de GK58 como un
aceite marrón; ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz) \delta 8,51 (d,
J = 2 Hz, 1H), 7,68 (dd, J = 8,2 Hz, 1H), 7,45 (d,
J = 8 Hz, 1H), 3,24 (m, 1H), 3,14 (s, 1H), 3,11 (app t, 1H),
2,32 (app q, 1H), 2,20 (m, 1H), 2,16 (s, 3H),
2,05-1,62 (m, 3H); ^{13}C RMN (CDCl_{3}, 68 MHz)
\delta 149,7, 141,0, 139,1, 135,0, 127,3, 82,6, 76,6, 68,5, 56,9,
40,3, 35,2, 22,6;
ácido
5-(1-metil-2-pirrolidinil)-2-piridinilpropiólico
(GK60). Se enfrió a -78ºC una solución de GK58(0,175 g,
0,94 mmol) en THF (20 ml) y se añadió BuLi (solución 1,6 M en
hexano, 0,62 ml, 0,99 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante
0,5 h a -78ºC y a continuación se añadió gas CO_{2}. Después de 1
h más a -78ºC se dejó calentar a temperatura ambiente la mezcla de
reacción. Se evaporó el THF al vacío y se purificó el residuo por
TLC de preparación [gel de sílice, CHCl_{3}/MeOH, (1:1)];
rendimiento 0,20 g, (90%); ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 270 MHz)
\delta 8,49 (dd, J = 2, 0,5 Hz, 1H), 7,85 (dd, J =
8,2 Hz, 1H), 7,59 (dd, J = 8, 0,5 Hz, 1H),
3,34-3,21 (m, 2H), 2,42 (app q, 1H), 2,29 (m, 1H),
2,20 (s, 3H), 2,05-1,70 (m, 3H); ^{13}C RMN
(CD_{3}OD, 68 MHz) \delta 160,4, 150,6, 142,5, 139,8, 137,7,
129,2, 87,4, 78,0, 70,0, 58,0, 40,7, 35,7, 23,5;
ácido
5-(1-metil-2-pirrolidinil)-3-piridinilpropiólico
(GK56). Se sintetizó el compuesto a partir de la
3-etinil-5-(1-metil-2-pirrolidinil)piridina^{7}
siguiendo el método descrito para la síntesis de GK60 para dar GK56
con un rendimiento del 80% después de la purificación por TLC de
preparación [gel de sílice, CHCl_{3}/MeOH, (1:1)]; ^{1}H RMN
(CD_{3}OD, 270 MHz) \delta 8,56 (br s, 1H), 8,50 (br s, 1H),
7,93 (t, J = 2 Hz, 1H), 3,22 (m, 2H), 2,38(app q, 1H),
2,26 (m, 1H), 2,18 (s, 3H), 2,10-1,6 (m, 3H);
^{13}C RMN (CD_{3}OD, 68 MHz) \delta 160,7, 152,1, 149,7,
140,4, 140,2, 121,2, 91,0, 75,9, 69,7, 58,0, 40,7, 35,0, 23,6;
Se añadió una solución de hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDC) (9 equiv) y H_{2}O destilada (500 \muL) a una mezcla del
ácido (1 equiv) en H_{2}O destilada (500 \muL) a 0ºC. Después de
10 min se añadió una mezcla de KLH (la misma cantidad (mg) que de
ácido) en H_{2}O destilada (1 mL). Se mantuvo la mezcla de
reacción a 0ºC durante 10 min y a continuación a temperatura
ambiente toda la noche. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo
entre 4,5 y 6 durante la reacción. Se purificó el conjugado de
proteína por cromatografía en columna [Sephadex
G-25M, (columna PD-10), se eluyó con
H_{2}O destilada] y a continuación se liofilizó.
Se añadió una mezcla de KLH (la misma cantidad
(mg) que de amina) y H_{2}O (1 mL) a la mezcla de la amina (10 mg)
en H_{2}O (500 \muL) a 0ºC. Se añadió una solución de EDC (9
equiv.) en H_{2}O (500 \muL) a la mezcla de reacción y se
mantuvo la mezcla a 0ºC durante 10 min y a temperatura ambiente toda
la noche. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo entre 4,5 y 6
durante la reacción. Se purificó el conjugado de proteína por
cromatografía en columna [Sephadex G-25M, (columna
PD-10), se eluyó con H_{2}O destilada] y a
continuación se liofilizó.
Esquema
1
Síntesis de algunos
enlaces
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
3
Hidrólisis de
ésteres
Esquema
4
Hidrogenación del triple
enlace
\newpage
Esquema
5
Síntesis de GK56 y
GK60
Esquema
6
Síntesis de derivados de KLH de
enlace a la nicotina (inmunógenos de
nicotina)
Se enjaularon ratas Wistar macho en grupos de 2 a
3 en condiciones de laboratorio habituales y se mantuvieron bajo un
ciclo de luz y oscuridad de 12 h (luces encendidas a las 06:00 h)
con acceso ilimitado al pienso y al agua.
Se utilizaron dos protocolos de inmunización:
- 1.
- Se inmunizaron los animales utilizando 100 \mug de antígeno (conjugado KLH de enlace a la nicotina) y adyuvante completo de Freund en una inyección intravenosa rápida y a continuación se administró una inyección de refuerzo el día 11 ó 14, conteniendo 100 \mug de antígeno (conjugado KLH de enlace a la nicotina) y adyuvante incompleto de Freund; estas inyecciones se administraron por vía intraperitoneal en 0,4 ml. Se inyectaron referencias con 100 \mug de KLH en adyuvante completo de Freund o adyuvante completo de Freund solo. En las inyecciones de refuerzo se utilizó adyuvante incompleto de Freund en lugar de adyuvante completo de Freund.
- 2.
- Se inmunizaron los animales a los que se les había administrado nicotina utilizando 100 \mug de antígeno (conjugado KLH de enlace a la nicotina) y adyuvante completo de Freund en una inyección intravenosa rápida y a continuación se les administró una inyección de refuerzo el día 7 u 8, conteniendo 100 \mug de antígeno (conjugado KLH de enlace a la nicotina) y adyuvante incompleto de Freund; estas inyecciones se administraron por vía intraperitoneal en 0,4 ml.
Se recubrieron placas para Elisa (Sigma o
Labsystems) con un conjugado de BSA del enlace a la nicotina. A
medida que se necesitaban las placas se bloqueaban utilizando una
solución de BSA al 3% en PBS. Después de lavado prolongado, se
añadió suero en varias diluciones (1:1 a 1:390625) y se incubaron
las placas a 37ºC. Se lavaron las placas de nuevo y después de
añadir el anticuerpo secundario, IgG anti-rata de
cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma), se volvieron a
incubaron a 37ºC. El sustrato de la enzima fosfato de
p-nitrofenilo (p-NPP) (Sigma) produce un producto
coloreado que se puede leer por espectrofotometría a 405 nm.
Se realizó el Elisa competitivo como el Elisa
ordinario con la excepción de que únicamente se utilizó una sola
dilución (1:3125) de suero. Se utilizaron nicotina, cotinina,
nomicotina, nicotina-N-óxido y niacina
respectivamente como competidores.
Se realizaron mediciones voltamétricas de
dopamina en ratas pretratadas con pargilina y se mantuvieron bajo
anestesia de hidrato de cloral. La parte activa del electrodo de
fibra de carbono era de 12 \mum de espesor y 500 \mum de
longitud. Se prepararon los electrodos y se trataron según describe
Gonon (1988). Se colocaron los electrodos en las coordenadas: AP =
+1,6 y ML = \pm0,8 para la NAC_{concha} (Paxinos y Watson,
1986). La punta del electrodo se colocó a 6,5-7,0 mm
bajo la superficie cortical y se utilizó voltametría diferencial de
impulso normal para registrar voltamogramos cada min con los
parámetros descritos anteriormente (Gonon et al, 1984 y
Gonon, 1988). Al observar una referencia estable se inyectó al
animal solución salina por vía intravenosa y a continuación nicotina
a dosis crecientes (6, 12, 24 y 48 \mug/kg) administradas en
intervalos de 10 min.
Hasta la fecha, se ha analizado la
inmunogenicidad de 16 inmunógenos diferentes de nicotina utilizando
métodos tanto in vitro como in vivo.
Se extrajo suero de animales experimentales y se
midieron los títulos de anticuerpo específico por la técnica de
Elisa. El protocolo de inmunización 1, que incluía un adyuvante,
produjo un título elevado de anticuerpos específicos, normalmente
1:3.000 a 1:15.000, véase la figura 1. Todos los inmunógenos de
nicotina analizados, p. ej. GK60-KLH,
GK84-KLH y GK80-KLH, se inmunizaron
utilizando el protocolo 1. Los títulos eran estables al menos
durante un mes.
Se realizó el Elisa competitivo en muestras de
suero de ratas inmunizadas. Se utilizaron como competidores
nicotina, los metabolitos cotinina, nornicotina,
nicotina-N-óxido y niacina (no metabolito). La
concentración de competidor variaba de 6\times10^{-10}a
6\times10^{-6}M. Tras la inmunización utilizando el protocolo 1
los inmunógenos dieron lugar a anticuerpos que eran más específicos
para nicotina que para cotinina, nicotinina-N-óxido
y niacina, véase la figura 2. En la mayoría de los casos la
especificidad para la nicotina y la nornicotina fueron similares. La
cotinina es el principal metabolito nicotínico (80%) (Benowitz et
al., 1994) por tanto es importante que los anticuerpos
nicotínicos tengan una especificidad mayor hacia la nicotina que la
cotinina, por otra parte únicamente el 0,4% de la nicotina se
metaboliza en nornicotina (Benowitz et al., 1994) mientras
que la similitud en la especificidad hacia la nicotina y la
nornicotina no debería desempeñar una función significativa.
La administración de nicotina de las referencias
da lugar a un aumento, dependiente de la dosis, del rendimiento de
DA en el núcleo de la concha accumbens. En cambio la inmunización
activa altera el efecto nicotínico en exceso de DA, véase las
figuras 3a y b. Dependiendo de las propiedades del inmunógeno, es
decir del hapteno nicotínico, se puede suprimir el efecto de la
nicotina sobre la producción de dopamina para los niveles de
referencia (figura 3a) o en lugar de aumentar incluso de forma
paradójica (figura 3b). En los estudios en los que la inmunización
tuvo lugar ya 3 semanas antes del experimento actual con nicotina,
los animales todavía presentaban una notable reducción en el efecto
central de la nicotina a altas dosis en el sistema mesolímbico de
dopamina, es decir, el conducto remunerador primario en el cerebro,
que ha demostrado ser crítico para la autoadministración de la
nicotina y su predisposición a la dependencia.
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Claims (5)
1. Una 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora que tiene la fórmula
en la
que
X es -C=C- o -C\equivC-;
Y es -(CH_{2})_{k}- o
-(CH_{2})_{m}-C_{6}H_{10}-(CH_{2})_{n}-
o
-(CH_{2})_{m}-C_{6}H_{4}-(CH_{2})_{n}-
en la que k = 0-20, m =
0-6 y n = 0-6 y
Z es -NH- o -CO-;
o
X es -CH_{2}-,
Y es
-(CH_{2})_{m}C_{6}H_{10}-(CH_{2})_{n}- o
-(CH_{2})_{m}-C_{6}H_{4}-(CH_{2})_{n}-
en la que m = 0-6 y n =
0-6, y
Z es -NH-o -CO-.
2. Una 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora según la reivindicación 1, en la que la proteína portadora
se selecciona de las proteínas del grupo constituido por la
hemocianina de la lapa californiana (KLH), la vacuna contra el
tétanos, la vacuna contra la difteria, vacuna contra la difteria
mutante no tóxica CRM_{197}, complejo de la proteína de la
membrana externa (OMPC) de Neisseria miningitidis, subunidad
B de Escherichia coli inestable al calor y la exoproteína A
recombinante de Pseudomonas aeruginosa (EPAr).
3. Una 5- o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su
utilización como medicamento.
4. Composición farmacéutica que comprende una 5-
o
6-nicotinil-enlazador-proteína
portadora según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. Composición farmacéutica según la
reivindicación 4, que comprende además un adyuvante.
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