ES2228457T3 - Derivados de resorufina como sustratos para cypea4. - Google Patents
Derivados de resorufina como sustratos para cypea4.Info
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Abstract
Un ensayo para analizar inhibidores de la enzima CYP3A4 que comprende poner en contacto la enzima y un compuesto de la fórmula (I): con un compuesto de ensayo y medir la inhibición de la O-desalquilación del compuesto de la fórmula (I) por la enzima.
Description
Derivados de resorufina como sustratos para
CYP3A4.
La presente invención se refiere a compuestos, a
procedimientos para su elaboración y su uso como sustratos de
enzimas.
La mayoría de las interacciones de fármacos
basadas en el metabolismo son un resultado de la inhibición de
enzimas citocromo P450. Las interacciones de fármacos que implican
enzimas P450 individuales se pueden predecir usando procedimientos
in vitro. Ensayos típicos in vitro de la enzima P450
incluyen incubación de un sustrato apropiado con una fuente de
enzima. Tradicionalmente, se han usado procedimientos
cromatográficos de larga duración para detectar metabolitos en
estas incubaciones. Recientemente la disponibilidad de lectores de
placas fluorométricos ha facilitado una mayor capacidad de los
ensayos de enzimas en general. La adaptación de ensayos P450 a la
tecnología de lectores de placas fluorométricos requiere la
identificación de los sustratos con los productos fluorescentes
apropiados para las enzimas individuales. Entre el citocromo P450
de metabolización xenobiótica, el CYP3A4 es uno de las comúnmente
responsables de la metabolización de fármacos.
El éter bencílico de resorufina se ha descrito
para realizar una selección de inhibición de CYP3A4 de alta
capacidad (Crespi et al. Anal. Biochem., 1997, 248,
188-190). Sin embargo, la velocidad de
metabolización de éter bencílico de resorufina por el CYP3A4 es
baja, por lo tanto se requiere un sustrato más apropiado de CYP3A4
para permitir una selección de inhibición de mayor capacidad.
Ahora se ha identificado un compuesto que es un
sustrato mejorado para el CYP3A4 y que se usa para la configuración
de ensayos con una alta pantalla de inhibición de la producción.
Según la presente invención se proporciona un
ensayo para analizar inhibidores de la enzima CYP3A4 que comprende
poner en contacto la enzima y un compuesto de la fórmula (I):
con un compuesto de ensayo y medir
la inhibición de la O-desalquilación del compuesto
de la fórmula (I) por la
enzima.
Generalmente se conocerá la velocidad de
O-desalquilación del compuesto de la fórmula (I) en
ausencia del compuesto a analizar, al igual que el grado de
O-desalquilación en determinados momentos. El ensayo
puede analizar la inhibición de O-desalquilación de
forma continua o en determinados intervalos de tiempo.
La O-desalquilación del compuesto
de la fórmula (I) tras la incubación con CYP3A4 da un producto
fluorescente de fórmula (II) fácilmente cuantificable:
que se puede explorar con adecuadas
longitudes de onda de excitación y emisión, por ejemplo una
longitud de onda de excitación de 530 nm y una longitud de onda de
emisión de 590
nm.
El ensayo se puede llevar a cabo en una solución
o usando un soporte sólido. Los solventes adecuados cuando se lleva
a cabo el ensayo en una solución incluyen metanol, acetonitrilo y
DMSO.
El compuesto de ensayo puede ser preincubado con
una enzima antes de ser añadido el sustrato, o de forma alternativa
el sustrato puede ser añadido simultáneamente. Las concentraciones
finales de la enzima y del sustrato se calculan para lograr una
velocidad adecuada de procesamiento para llevar a cabo el ensayo. Si
se desea, se puede parar la reacción, por ejemplo añadiendo ácido o
disolvente. El producto fluorescente de la fórmula (II) se puede
analizar usando cualquier sistema convencional de detección de
fluorescencia, por ejemplo un lector de placas multifuente / placas
fluorescente.
El compuesto de la fórmula (I) es nuevo y como
tal también forma parte de la presente invención.
El compuesto de la fórmula (I) se puede preparar
mediante procedimientos convencionales, por ejemplo tal y como se
muestra en el esquema 1:
Esquema
1
\vskip1.000000\baselineskip
Así según otro aspecto de la presente invención
se proporciona un procedimiento para la producción de un compuesto
de fórmula (I) que comprende la reacción entre un compuesto de la
fórmula (III):
en la que L es un grupo saliente,
por ejemplo Br, con 1-fenilpiperacina. Es preferible
llevar a cabo la reacción en presencia de
dimetilformamida.
Los materiales de partida resorufina,
\alpha,\alpha'-dibromo-m-xileno y
1-fenil piperacina están comercialmente
disponibles.
Puesto que la inhibición de enzimas citocromo
P450 es generalmente el mecanismo usado para las interacciones
fármaco / fármaco, el ensayo conforme a la presente invención es
particularmente útil para la identificación de compuestos que puedan
dar lugar a interacciones adversas fármaco / fármaco. Por lo tanto,
el ensayo se puede usar en combinación con modificaciones químicas
de los compuestos de análisis para aumentar el potencial de un
compuesto de ensayo para su uso farmacéutico.
Según otros aspectos de la presente invención se
proporciona un procedimiento para reducir la actividad de inhibición
de la enzima CYP3A4 de un compuesto, que comprende las etapas de
identificar el compuesto como un inhibidor de CYP3A4 en el ensayo
descrito antes; y después producir una versión química modificada
del compuesto de ensayo en el que la funcionalidad que se sospecha
es responsable de la inhibición de CYP3A4 es eliminada o cambiada; y
según este procedimiento se producen compuestos nuevos.
La modificación química de los compuestos a
analizar según este procedimiento se puede realizar usando técnicas
que conocen bien los expertos en la técnica.
Los nuevos compuestos producidos conforme a este
procedimiento pueden encontrar aplicación como fármacos. Un producto
producido conforme a este procedimiento se podrá identificar
fácilmente como nuevo consultando la bibliografía de rutina y bases
de datos. La actividad farmacéutica de tales compuestos se puede
determinar fácilmente usando procedimientos convencionales de
selección biológica conocidos por los expertos en la técnica.
Se describe la presente invención en los
siguientes ejemplos.
Una mezcla de resorufina (3,2 g),
\alpha,\alpha'-dibromo-m-xileno
(11,9 g), carbonato de potasio (4,15 g) y dimetilformamida (90 ml)
se removió a temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se
evaporó y el residuo se repartió entre diclorometano y agua. Se
añadió gel de sílice a la fase orgánica y se evaporó el disolvente.
La cromatografía sobre gel de sílice (eluyente metanol al 2% en
diclorometano) dio el compuesto subtitulado (3,0 g).
\delta_{H}(CDCl_{3}) 4,52 (s, 2H),
5,17 (s, 2H), 6,32 (d, J=2,0 Hz, 1H), 6,84 (dd,
J=7,8, 2,0 Hz, 1H), 6,88 (d, J=2,7 Hz, 1H), 7,02 (dd,
J=8,8, 2,7 Hz, 1H), 7,38-7,48 (m, 5H), 7,73
(d, J=8,9 Hz, 1H);
espectro de masas m/z 398,396
(MH^{+})
Una mezcla de éter
3-bromometilbencílico de resorufina (1,0 g),
1-fenilpiperacina (1,54 ml) y dimetilformamida (50
ml) se removió a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente
se evaporó y el residuo se repartió entre diclorometano y una
solución acuosa de bicarbonato de sodio. Se lavo con agua la fase
orgánica y después se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. Se purificó el
residuo mediante cromatografía sobre gel de sílice (eluyente
metanol al 2% en diclorometano) para dar el compuesto del título
(0,72 g).
\delta_{H}(CDCl_{3})
2,60-2,63 (m, 4H), 3,18-3,20 (m,
4H), 3,60 (s, 2H), 5,18 (s, 2H), 6,32 (d, J=2,0 Hz, 1H),
6,82-7,03 (m, 6H), 7,23-7,28 (m,
2H), 7,33-7,44 (m, 5H), 7,71 (d, J=8,9 Hz,
1H);
espectro de masas m/z 500 (MNa^{+}), 478
(MH^{+})
éter
3-(4-fenilpiperacina-1-il)metilbencílico
de resorufina 0,5 mM, (es decir 0,239 mg/ml en DMSO)- almacenado a
aproximadamente -20ºC en la oscuridad
NaHCO_{3} al 2% (p/v) - almacenado a
aproximadamente 4ºC
fosfato de potasio 50 mM tampón, pH 7,4
Solución de cofactor recién preparada: -
aproximadamente lo siguiente por ml de NaHCO_{3} al 2% (p/v)
\hskip0,5cm 1,7 mg de NADP, sal de
monosodio
\hskip0,5cm 7,8 mg de
glucosa-6-fosfato, sal de
monosodio
6 unidades de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
tipo VII de levadura de panadería
- 1)
- Se precalienta el horno del lector de placas a 37ºC y se precalienta la lámpara durante al menos 10 minutos.
- 2)
- Se mezclan 1\mul de éter 3-(4-fenilpiperacina-I-il)metilbencílico de resorufina 0,5 mM, 5\mul (50 \mug) de proteína CYP3A4 microsomal y 214 \mul de tampón por incubado (se obtiene éter 3-(4-fenilpiperacina-1-il)metilbencílico de resorufina 2\muM y 200 \mug/ml de proteína de concentración final).
- 3)
- Se añade a cada pocillo de una placa de 96 pocillos 220 \mul de mezcla de incubación y 5 \mul de un compuesto ( o 5 \mul de un disolvente apropiado para el control de pocillos - se puede utilizar metanol, acetonitrilo o DMSO).
- 4)
- Se preincuba la placa multipocillos en el lector de placas a 37ºC durante 5 minutos. Se precalienta la solución cofactor a 37ºC durante 5 minutos.
- 5)
- Se añaden 25 \mul de solución cofactor a cada pocillo y se exploran con una longitud de onda de excitación de 530 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm con una ganancia de 80. Se explora durante 10 ciclos a intervalos de 1 minuto.
Se confirma que se obtiene el éter
3-(4-fenilpiperacina-1-il)metilbencílico
de resorufina como un sustrato de CYP3A4 usando ketoconazol, un
inhibidor de diagnóstico de CYP3A4 (Baldwin et al,
Xenobiotica, 1995, 25, 261-270). Con
ketoconazol, se inhibió éter
3-(4-fenilpiperacina-1-il)metilbencílico
de resorufina con una IC_{50} de 32 nM (Figura I), un valor de
inhibición típico de otros sustratos CYP3A4 bien
caracterizados.
Claims (7)
1. Un ensayo para analizar inhibidores de la
enzima CYP3A4 que comprende poner en contacto la enzima y un
compuesto de la fórmula (I):
con un compuesto de ensayo y medir
la inhibición de la O-desalquilación del compuesto
de la fórmula (I) por la
enzima.
2. El ensayo según la reivindicación 1, en el que
la inhibición de la O-desalquilación del compuesto
de la fórmula (I) por la enzima se mide mediante la cuantificación
del compuesto de la fórmula (II):
3. El ensayo según la reivindicación 2, en el que
el compuesto de la fórmula (II) se cuantifica por detección
fluorescente.
4. El ensayo según la reivindicación la
reivindicación 3, en el que el compuesto de la fórmula (II) se
cuantifica mediante exploración a una longitud de onda de excitación
de 530 nm y una de longitud de onda de emisión de 590 nm.
5. Un compuesto de fórmula (I) según la
reivindicación la reivindicación 1.
6. Un procedimiento de producción del compuesto
de fórmula (I) según la reivindicación 1 que comprende una reacción
del compuesto de fórmula (III):
en la que L es un grupo saliente,
con
1-fenilpiperacina.
7. Un procedimiento para reducir la actividad
inhibidora de la enzima CYP3A4 en un compuesto, que comprende las
etapas de identificar un compuesto como inhibidor de CYP3A4 en un
ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y a
continuación producir una versión químicamente modificada del
compuesto de ensayo en el cual se elimina o se cambia la
funcionalidad que se sospecha responsable de la inhibición de
CYP3A4.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GBGB9902068.7A GB9902068D0 (en) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | Compounds |
| GB9902068 | 1999-01-29 |
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