ES2228146T3 - Uso de derivados de acido nicotinico para tratar el daño en el dna de celulas cutaneas. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para un sujeto que necesita una elevación del contenido intracelular de NAD, que comprende un agente pro-NAD y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicho agente pro-NAD está en una concentración suficiente para elevar el contenido intracelular de NAD en dicho sujeto y en la que dicho agente pro-NAD tiene un log PO/W en el intervalo de 5 a 20.

Description

Uso de derivados de ácido nicotínico para tratar el daño en el DNA de células cutáneas.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Con esta solicitud se reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional número de serie 60/110.482, presentada el 1 de Diciembre de 1.998.

Antecedentes 1. Campo del invento

El invento se dirige a métodos y una composición para usar moléculas orgánicas denominadas agentes pro-NAD, capaces de potenciar el contenido de NAD de células cutáneas dérmicas y epidérmicas con una resultante potenciación de la reparación de DNA y otras respuestas protectoras frente al estrés genotóxico de la piel.

2. Descripción de los antecedentes

La presente solicitud se refiere a métodos y composiciones capaces de modular y suprarregular el contenido celular de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD; del inglés, nicotinamide-adenine-dinucleotide) mediante la aplicación tópica de agentes químicos con el fin de potenciar las respuestas protectoras naturales de las células cutáneas frente al daño en el DNA. Los métodos y composiciones son eficaces para la prevención y el tratamiento del deterioro cutáneo que resulta del daño en el DNA de células de la piel. Los síntomas de dicho deterioro cutáneo son muchos e incluyen típicamente la pérdida de humedad, rayas finas, rayas profundas, arrugas y pérdida de elasticidad, así como esclerosis atrófica y otras imperfecciones de la piel. La piel se deteriora con la edad como una consecuencia natural de la exposición prolongada a factores internos y externos. Los factores de deterioro internos incluyen subproductos metabólicos naturales tales como radicales libres, que causan el envejecimiento de todos los tejidos. Los factores de deterioro externos incluyen la radiación ionizante, tal como la luz del sol, y agresiones químicas, tales como la contaminación y el humo de los cigarrillos. En teoría, los métodos y composiciones para el cuidado de la piel deberían inhibir o hacer más lento el proceso de deterioro de la piel al contrarrestar estos factores internos y externos. Desafortunadamente, los métodos y composiciones actuales para el cuidado de la piel son generalmente reactivos en lugar de proactivos. Es decir, los métodos y composiciones actuales reducen o disimulan los signos de envejecimiento pero ejercen un mínimo o nulo efecto sobre los subyacentes procesos bioquímicos progresivos y acumulativos que causan el deterioro de la piel. Por lo tanto, es deseable tener un método y una composición para el cuidado de la piel que no sólo reduzcan los síntomas del deterioro sino que además traten las causas subyacentes del deterioro de la piel de tal modo que el deterioro pueda ser realmente retrasado. Para comprender las limitaciones de los métodos y composiciones actuales, es necesario comprender la función y la estructura de la piel y los mecanismos del deterioro de la piel.

Con 4,5 kg, la piel es el órgano más grande del cuerpo. La Figura 1 muestra un diagrama de la piel que señala la situación de los dos principales tipos celulares presentes en la piel, es decir, fibroblastos situados en la capa dérmica de la piel y queratinocitos situados en la capa epidérmica de la piel. La piel proporciona la primera línea de defensa entre el interior del cuerpo y las dañinas agresiones ambientales mediante mecanismos físicos y bioquímicos bien establecidos. Los mecanismos de protección físicos incluyen la barrera relativamente impermeable que proporciona la piel. En cierto grado, la piel puede rechazar y absorber agresiones tales como las de productos químicos y la luz ultravioleta para que, aunque la piel pueda resultar dañada, el tejido subyacente resulte protegido. Los mecanismos bioquímicos incluyen los sistemas inmunes innato y adquirido. Los microbios patógenos son rechazados por respuestas inmunes a nivel epidérmico en que están implicadas células de Langerhans, queratinocitos, citoquinas, células polinucleares, células endoteliales, mastocitos y linfocitos.

Estructuralmente, la piel comprende tejido epitelial (la epidermis) en la capa externa y, debajo de ella, tejido conectivo (la dermis) y, debajo de éste, el tejido graso (hipodermis). La epidermis no está vascularizada y se regenera cada cuatro a seis semanas. Su función primaria es mantener la integridad de la piel del cuerpo, actuando como una barrera física frente a agentes tóxicos, la suciedad, bacterias, microorganismos y agresiones físicas. La dermis está debajo de la epidermis y actúa proporcionando resistencia, soporte, sangre y oxígeno a la piel. Los principales componentes celulares de la dermis son fibroblastos, aunque también contiene glándulas sudoríparas, glándulas sebáceas, folículos pilosos y pequeñas células grasas. La hipodermis, también conocida como fascia superficial, fija la dermis a las estructuras subyacentes; su función es promover un continuo suministro de sangre a la dermis para su regeneración.

Los mecanismos del deterioro de la piel implican un proceso gradual y progresivo que comienza en el nacimiento. Los factores internos que contribuyen al envejecimiento de la piel incluyen subproductos metabólicos tóxicos, enfermedades autoinmunes y predisposición genética. Las consecuencias del deterioro interno pueden observarse por todo el cuerpo, desde la piel hasta los órganos internos. Aunque los mecanismos del deterioro interno no están completamente entendidos, se ha mostrado que la mutación somática es un factor contribuyente. Bajo la teoría de la mutación somática, las células pierden gradualmente sus características juveniles y su capacidad para dividirse por la acumulación de mutaciones (errores) en su código genético. Estas mutaciones pueden ser causadas por radicales libres o agentes alquilantes generados en el metabolismo, que conducen a un daño no reparado en el DNA. A lo largo del tiempo, las mutaciones se acumulan en el cuerpo hasta que la célula ya no puede dividirse ni producir proteínas funcionales.

Factores externos tales como agentes químicos y físicos del medio ambiente pueden también causar un daño en el DNA que conduzca al deterioro de la piel. Los factores externos incluyen la luz del sol, la contaminación y productos químicos ingeridos procedentes del humo del tabaco o de la comida.

El deterioro de la piel conduce a cambios del grosor y la elasticidad dérmicas a causa de una aumentada reticulación de colágeno. La regeneración epidérmica aumenta en cuanto a actividad mientras el metabolismo, las glándulas sudoríparas y la vascularización disminuyen en cuanto a actividad. El daño por factores internos y externos es progresivo y acumulativo y da lugar a la aparición de deterioro asociado con piel envejecida.

En relación con la teoría de la mutación somática, tanto los factores internos como los externos contribuyen al estrés oxidativo, lo que, a su vez, da lugar a daño en el DNA. En seres humanos, el estrés oxidativo y el daño en el DNA son causados por factores tales como el oxígeno hiperbárico, radiación gamma, radiación ultravioleta, ozono, peróxidos, radicales libres, agentes alquilantes y fármacos ciclantes redox. Aunque el estrés oxidativo total y el daño en el DNA pueden reducirse viviendo en un ambiente con baja contaminación y evitando la luz del sol, no pueden eliminarse. Algunos factores como la radiación ionizante están presentes en todos los ambientes en un bajo nivel y otros factores son subproductos del metabolismo y no pueden ser totalmente eliminados. Además, los ambientes urbanos presentan niveles elevados de contaminación de nivel fundamental procedentes de una diversidad de fuentes que no es probable que se reduzcan en el futuro próximo. Sin embargo, aunque no puede evitarse el daño en el DNA, no todo el daño en el DNA conduce a mutaciones.

El daño en el DNA no conduce necesariamente a mutación porque una célula normal contiene diversos y eficaces sistemas para reparar el DNA dañado. Hay al menos 50, y posiblemente más de 100, genes implicados en la reparación del DNA. La importancia de una buena reparación del DNA en cuanto a retrasar el deterioro de la piel es más evidente en pacientes que padecen defectos en la reparación del DNA, tal como xerodermia pigmentosa (XP). Los pacientes con XP presentan un deterioro de la piel precoz y acelerado, lo que demuestra claramente la importancia de la reparación del DNA para reducir el deterioro de la piel. Además de la reparación del DNA, una célula normal tiene también sistemas que recurren a la "muerte celular programada" mediante un proceso denominado apoptosis. El proceso de la apoptosis "borra" eficazmente las células dañadas más allá del punto de reparación. Estos mecanismos de defensa de la piel naturales han sido ignorados por los métodos actuales para prevenir el deterioro de la piel.

Muchas cremas, lociones, aceites de baño, ungüentos, pastas, productos limpiadores, productos de cubrimiento y polvos reivindican su eficacia para prevenir el deterioro de la piel. Sin embargo, todos los métodos y composiciones actuales presentan diversas desventajas ya que están limitados en cuanto a su capacidad para retrasar el deterioro de la piel. La mayoría de los productos para el cuidado de la piel de venta libre suavizan la piel deteriorada o, si no, reducen los síntomas de la piel deteriorada sin efecto alguno sobre los subyacentes procesos bioquímicos implicados en el deterioro. Muchos productos para el cuidado de la piel y cosméticos existentes actúan proporcionando humedad a la piel, evitando la pérdida de humedad o proporcionando cubrimiento para ocultar los signos visibles de deterioro. Aunque los cosméticos tradicionales pueden ejercer efectos sobre el aspecto, estos efectos son evanescentes y cualquier mejora aparente desaparece tan pronto como se interrumpe el uso del producto. Además, la eficacia de los cosméticos tradicionales disminuye tras la exposición a la humedad y, por ello, los cosméticos han de volverse a aplicar después del ejercicio, la natación o cualquier otra exposición a la humedad. Algunos cosméticos contienen metales (por ejemplo, hierro y cobre) que realmente pueden aumentar los niveles cutáneos de formación de radicales libres y posiblemente activar el deterioro. Puesto que el uso de tales productos no evita el deterioro, con el tiempo se necesita cada vez más producto para ocultar el creciente estado grave de la piel subyacente.

Otro método para tratar el envejecimiento de la piel es el uso de alfa-hidroxiácidos (AHA) tales como ácido láctico, ácido cítrico, ácido glicólico o ácido málico; beta-hidroxiácidos (BHA), tal como el ácido salicílico; y retinoides [por ejemplo, tretinoína (ácido trans-retinoico), retinol y retinal], como agentes exfoliantes. Estos agentes ayudan a eliminar la capa superior de la piel para exponer la piel subyacente, más joven. Sin embargo, existe el peligro de que, al eliminar la capa superior de la piel, los AHA, BHA y retinoides puedan comprometer la importante función de barrera de la piel. Es posible que el uso de estos agentes exfoliantes pueda acelerar el envejecimiento de la piel al eliminar la capa protectora externa de la piel. Los agentes exfoliantes y otros ingredientes pueden aumentar también la sensibilidad de la piel a condiciones ambientales tales como la luz del sol, el viento, la temperatura baja y el aire seco, o a agentes químicos tales como antígenos, o pueden exacerbar la irritación atribuible a una enfermedad cutánea preexistente. Otra desventaja de los AHA, BHA y retinoides es que estos compuestos son posibles agentes irritantes cutáneos que pueden provocar efectos secundarios tales como úlceras y enrojecimiento.

Otro método popular para el tratamiento de la piel es el uso de bloqueadores solares. "Bloqueador solar" (es decir, pantalla solar) se refiere a cualquier producto químico que, cuando se aplica a la piel, reduce la cantidad de luz UV que llega a la piel. Al prevenir absorciones UV que causan mutaciones genómicas, los bloqueadores solares pueden disminuir y retrasar el deterioro de la piel. Los bloqueadores solares fueron originalmente diseñados para prevenir la quemadura solar (también conocida como eritema), una reacción aguda a una sobreexposición al sol. La capacidad de los bloqueadores solares se mide mediante el índice Factor de Protección Solar (índice SPF; del inglés, Sun Protection Factor). Un valor de SPF de, por ejemplo, 15 proporcionará 15 veces más protección frente a las quemaduras solares que la piel desnuda. Sin embargo, ha de advertirse que los valores de SPF, que miden la resistencia a la quemadura solar, no pueden ser extrapolados a la protección frente al fotoenvejecimiento, que es causado por las constantes agresiones ambientales de bajo nivel. Es decir, un bloqueador solar con un factor SPF de 15 no reducirá por 15 el fotoenvejecimiento. Existe además el peligro de que productos químicos de ciertos bloqueadores solares aumenten el daño en el DNA y contribuyan al deterioro de la piel. Finalmente, todas las clases principales de bloqueadores solares han sido relacionadas con alergias cutáneas.

Finalmente, hay agentes que son combinaciones físicas de agentes existentes. Una combinación física es una mezcla de dos o más productos químicos. Las combinaciones físicas pueden ser polvos mixtos, disoluciones mixtas, emulsiones mixtas, disoluciones coloidales mixtas, partículas en disoluciones, y similares. Un ejemplo de una combinación física puede ser un cosmético de cubrimiento o coloración mezclado con un bloqueador solar (dióxido de titanio) y un hidroxiácido.

En resumen, los métodos actuales para tratamiento de la piel son muy reactivos ya que tratan los síntomas del deterioro una vez que el daño está hecho. Los métodos actuales para tratamiento de la piel no invierten el daño producido al tejido dérmico. Existe la necesidad de productos tópicos para el cuidado de la piel que sean proactivos en vez de reactivos. Un producto proactivo es uno que ayuda a la piel a resistir al daño en el DNA previniendo el daño o ayudando a reparar cualquier daño.

Sumario del invento

El presente invento supera muchas de las limitaciones, problemas y desventajas asociadas con las estrategias y diseños actuales para prevenir el deterioro de la piel y proporciona métodos y una composición para el tratamiento del deterioro de la piel.

Un objeto del invento se dirige a un método y una composición para tratar la piel con objeto de prevenir y hacer más lento el proceso de deterioro.

Otro objetivo del invento es proporcionar un método para retrasar el deterioro de la piel, al potenciar el mecanismo natural de la piel para reparar DNA.

Otro objeto del invento es proporcionar un método para la liberación continua de agentes pro-NAD a células de la piel.

Otro objeto del invento se dirige a una composición para aplicación tópica, que comprende uno o más agentes pro-NAD que activan la reparación celular de DNA.

Una realización del invento se dirige a una composición farmacéutica para un sujeto que necesita una elevación del contenido intracelular de NAD. La composición farmacéutica comprende un agente pro-NAD y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El agente pro-NAD está presente en la composición farmacéutica en una concentración suficiente para elevar el contenido intracelular de NAD en el sujeto. La composición farmacéutica puede adaptarse para administración tópica a la piel. La adaptación puede incluir la inclusión de un vehículo farmacéuticamente aceptable que sea adecuado para uso en aplicaciones tópicas.

Los agentes pro-NAD del invento pueden comprender uno o más compuestos con la fórmula siguiente:

1

en la que R_{1} es cualquier grupo químico que pueda ser enzimática o químicamente eliminado para generar ácido nicotínico después de la administración a dicho sujeto, con la condición de que el log P_{O/W} esté entre 5 y 20. Un grupo químico es cualquier molécula química, tal como, por ejemplo, cualquier grupo alcano, alqueno o alquino ramificado o no ramificado (lineal). En una realización preferida, el grupo químico es un grupo tal como un éster, que puede ser eliminado por una esterasa después de la administración de la composición farmacéutica al sujeto.

Preferiblemente, la esterasa es una esterasa intracelular para que el grupo químico no sea eliminado hasta que el agente pro-NAD esté dentro de una célula.

En una realización preferida, R_{1} es un alcano, alqueno o alquino de cadena ramificada o no ramificada con, por ejemplo, entre 14 y 22 carbonos. R_{1} puede contener también uno o más grupos funcionales. Un grupo funcional es un átomo o grupo de átomos que actúa como una unidad, que ha sustituido a un átomo de hidrógeno de una molécula hidrocarbonada y cuya presencia imparte propiedades características a una molécula. Los ejemplos de grupos funcionales que pueden ser usados incluyen tiol, alcohol, amina, ácido carboxílico, onio, anhídrido carboxílico, éster carboxílico, haluro de acilo, amida, nitrilo, aldehído, cetona, iminas, éteres, sulfuro, haluro, nitro, nitroso, azidas, diazo y una combinación de estos grupos.

R_{1} puede ser un grupo químico que cambie el log P_{O/W} de dicho agente pro-NAD a entre 5 y 20.

Más preferiblemente, el agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15.

Por ejemplo, el agente pro-NAD puede ser nicotinato de tetradecilo, nicotinato de octadecilo o una combinación de estos compuestos químicos.

Alternativamente, el agente pro-NAD puede comprender uno o más compuestos con la fórmula siguiente:

2

en la que R_{2} es un grupo químico que puede ser enzimática o químicamente eliminado para generar nicotinamida después de que sea administrada la composición farmacéutica, con la condición de que el log P_{O/W} esté entre 5 y 20.

Por ejemplo, R_{2} puede ser un ácido carboxílico que contenga un alcano, alqueno o alquino. Preferiblemente, R_{2} es un ácido carboxílico que contiene un grupo alcano R con entre 14 y 22 carbonos. Además, R_{2} también contiene uno o más grupos funcionales. El grupo funcional puede ser, por ejemplo, tiol, alcohol, amina, ácido carboxílico, onio, anhídrido carboxílico, éster carboxílico, haluro de acilo, amida, nitrilo, aldehído, cetona, iminas, éteres, sulfuro, haluro, nitro, nitroso, azidas o diazo. Los grupos funcionales preferidos incluyen los grupos tiol, alcohol, amina y ácido carboxílico. R_{2} puede tener también más de un grupo funcional. Además, R_{2} puede ser cualquier grupo químico que cambie el log P_{O/W} de dicho agente pro-NAD a entre 5 y 20. Más preferiblemente, el agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15.

La composición farmacéutica del invento puede tener una concentración de agente pro-NAD que esté entre 0,001% y 10% en peso. Preferiblemente, la concentración de agente pro-NAD está entre 0,01% y 3% en peso. La composición farmacéutica puede comprender además un agente opcional tal como, por ejemplo, antioxidantes, pantallas solares, vitaminas, un agente estabilizador del pH o una combinación de estos agentes.

Se entiende que la composición farmacéutica del invento puede ser usada para tratar a un sujeto. El sujeto es un animal. El animal puede ser un animal unicelular o multicelular, tal como, por ejemplo, un mamífero, Además, el mamífero puede ser un ser humano. El sujeto puede ser también una población de células en cultivo, una línea de células en cultivo, un huevo, esperma o un zigoto.

Otra realización del invento se dirige a un método para tratar o hacer más lento el deterioro de la piel. En el método, puede administrarse una composición farmacéutica del invento a un sujeto para tratar, hacer más lento o invertir el deterioro de la piel en el sujeto. Preferiblemente, mediante el método se aumentará la concentración intracelular de NAD de las células cutáneas en al menos 50% con respecto a la de un sujeto no tratado. Más preferiblemente, mediante el método se aumentará la concentración intracelular de NAD en una cantidad aún mayor, tal como, por ejemplo, 100%, con respecto a la de un sujeto no tratado. Se entiende que la célula cutánea de esta aplicación se refiere a fibroblastos y/o queratinocitos. La administración puede ser realizada tópica, intradérmica o subcutáneamente. La administración tópica puede ser por medio de un parche dérmico o un mecanismo de liberación lenta aplicado a la capa de piel del mamífero. Además, la administración puede ser oral o parenteral.

Otra realización del invento se dirige a un procedimiento para llevar a cabo la distribución transdérmica de un agente pro-NAD.

Otra realización del invento se dirige al uso de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica del invento para la preparación de un medicamento para reducir los efectos citotóxicos del daño en el DNA de la piel de un mamífero, potenciando o elevando una o más proteínas intracelulares de células cutáneas. Las células cutáneas son los fibroblastos y/o queratinocitos de la piel. El procedimiento comprende aplicar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica del invento a una capa de piel del mamífero. La proteína intracelular puede ser p53. Alternativamente, la proteína intracelular puede ser PARP-1, PARP-2, PARP-3, tankirasa, V-PARP y telomerasa.

Otra realización del invento se dirige a un método para tratar la piel con objeto de inhibir el deterioro de la piel debido a la exposición a radiación UV. En el método, se aplica una composición farmacéutica del invento a la piel en un momento suficientemente próximo al momento de la exposición a la radiación UV, para inhibir el daño provocado por la radiación UV a la piel. La composición farmacéutica puede ser aplicada antes de la exposición a la radiación UV. Alternativamente, la composición farmacéutica puede ser aplicada después de la exposición a la radiación UV. El momento de la aplicación puede ser, por ejemplo, menos de 1 hora, menos de 2 horas, menos de 6 horas, menos de 12 horas o menos de 1 día, antes de la exposición a la radiación UV. Alternativamente, el momento de la aplicación puede ser, por ejemplo, menos de 5 minutos, menos de 10 minutos, menos de 20 minutos, menos de 1 hora, menos de 2 horas, menos de 6 horas, menos de 12 horas, menos de 1 día, menos de 2 días o menos de 5 días, después de la exposición a la radiación UV.

Otras realizaciones y ventajas del invento se exponen, en parte, en la descripción que viene a continuación y, en parte, serán obvias a partir de esta descripción y entendidas por el técnico experto que lleve este invento a la práctica.

Descripción de los dibujos

Figura 1 Representa un diagrama de la piel que señala la situación de los dos principales tipos celulares presentes en la piel; es decir, fibroblastos situados en la capa dérmica de la piel y queratinocitos situados en la capa epidérmica de la piel.

Figura 2 Representa la reacción catalizada por PARPs y la hidrólisis de polímeros de ADPR hasta ADPR libre por poli(ADP-ribosa) glucohidrolasa (PARG).

Figura 3 Representa un resumen de la implicación de PARPs y PARG en respuestas celulares protectoras frente al estrés genotóxico.

Figura 4 Representa el contenido disminuido de NAD celular, tanto en fibroblastos como en queratinocitos humanos, que resulta de un estado de niacina disminuido.

Figura 5 Representa una distribución de valores de índice de niacina en una población de 705 sujetos de Malmö, Suecia.

Figura 6 Representa el contenido de NAD de piel no enferma de individuos con piel gravemente deteriorada (carcinoma de células escamosas) y piel ligeramente deteriorada (queratosis actínica).

Figura 7 Representa la recuperación de fibroblastos de piel humana y queratinocitos de piel humana con un contenido reducido de NAD, después de la exposición a radiación solar proporcionada por un simulador solar.

Figura 8 Representa la integridad del DNA, según se mide mediante el ensayo "cometa", de células humanas en función del contenido de NAD tanto en ausencia como después de un estrés genotóxico.

Figura 9 La Sección A representa el contenido celular de p53 en función del contenido celular de NAD. La Sección B representa el contenido relativo de p53 después de estrés genotóxico en células con un contenido bajo o normal de NAD.

Figura 10 Representa tres posibles rutas biosintéticas para la síntesis del NAD, presentes en células humanas.

Figura 11 Representa resultados experimentales que muestran que la nicotinamida, el ácido nicotínico y 4 diferentes ésteres del ácido nicotínico pueden ser bioconvertidos en NAD por fibroblastos cutáneos.

Figura 12 En la Sección A se compara la integridad del DNA de células cultivadas en niveles normales (50 micromolar) o niveles elevados (500 micromolar) de nicotinamida después de un estrés genotóxico. La Sección B representa los efectos de niveles elevados de nicotinamida o niveles elevados de ácido nicotínico sobre la ruta de señalización de p53.

Figura 13 Representa una serie de agentes pro-NAD.

Figura 14 Representa un gráfico de valores de log P_{O/W} frente a la longitud de cadena del éster para una serie de agentes pro-NAD.

Figura 15 Representa los resultados de estudios experimentales llevados a cabo para elevar los niveles de NAD en piel de ratón por aplicación tópica de un agente pro-NAD.

Figura 16 Representa los resultados de estudios experimentales que muestran la elevación del contenido de NAD de piel de ratón en función del número de aplicaciones diarias de un agente pro-NAD.

Descripción del invento

El NAD, como sustrato para la síntesis de polímeros de ADP-ribosa (ADPR) por la acción de poli(ADP-ribosa) polimerasas (PARPs), tiene una implicación directa y central en los mecanismos que mantienen la integridad genómica [M. K. Jacobson y E. L. Jacobson (1.999), Trends Biochem. Sci. 24, 415-417]. En la Figura 2 se muestran la reacción catalizada por PARPs y la hidrólisis de polímeros de ADPR hasta ADPR libre por poli(ADP-ribosa) glucohidrolasa (PARG). En la Figura 3 se resume la implicación de PARPs y PARG en respuestas celulares protectoras frente al estrés genotóxico. El NAD es usado por PARPs de concierto con otras proteínas de respuesta al daño en el DNA, tales como p53 y DNA proteína quinasa, para iniciar las rutas de señalización de respuesta al daño en el DNA que conducen a la reparación del DNA y la recuperación celular de la función normal de la célula. Además de la función del NAD en cuanto a la reparación de DNA, en los casos en que se produce más daño en el DNA, como podrían experimentar las células cutáneas después de una quemadura solar grave, las proteínas de respuesta al daño en el DNA, incluyendo PARPs, pueden iniciar rutas de respuesta que conduzcan a la muerte celular programada, un proceso denominado apoptosis. Puesto que esto se refiere a la piel, la respuesta de apoptosis tiene el efecto de "borrar" las células muy dañadas con el probable beneficio de la eliminación de células que podrían progresar hasta cáncer. Finalmente, dosis masivas de daño en el DNA conducen a muerte por necrosis porque la hiperactivación de PARPs da lugar al agotamiento del NAD celular con la subsiguiente pérdida de todas las funciones celulares dependientes de energía. No es probable que el grado de daño en el DNA que daría lugar a necrosis se produzca en la piel normal, pero puede producirse en piel enferma o, más probablemente, en tejido cardiaco o cerebral después de un ataque cardiaco o un accidente cerebrovascular.

Muchas enzimas que confieren una respuesta celular protectora frente al daño en el DNA utilizan NAD. De estas enzimas, la mejor conocida es PARP-1. La presencia de roturas en las cadenas de DNA activa intensamente PARP-1, y muchos estudios [revisados por A. A. Pieper et al. (1.999), Trends Pharmacol. Sci. 4, 171-178] han porporcionado evidencia de que PARP-1, de concierto con otras proteínas sensibles a roturas del DNA, tales como p53 y DNA proteína quinasa, participa en la modulación de las rutas de respuesta representadas en la Figura 3.

Recientemente se ha descubierto otra proteína, denominada PARP-2, que usa NAD en respuesta al daño en el DNA [H. Berghammer et al. (1.999), FEBS Lett. 449, 259-263; M. Johansson (1.999), Genomics 57, 442-445; J. C. Amé et al. (1.999), J. Biol. Chem. 274, 17.860-17.866]. La situación nuclear y la activación de PARP-2 por roturas del DNA sugieren que también está implicada en las rutas de señalización de respuesta al DNA representadas en la Figura 3. La presencia de una proteína adicional con una elevada homología de secuencia con respecto a PARP-2 [M. Johansson (1.999), Genomics 57, 442-445] puede representar aún otra enzima que utiliza NAD, implicada en respuestas celulares protectoras.

Recientemente se han descubierto otras dos proteínas con actividad PARP [S. Smith et al. (1.998), Science 282, 1.484-1.487; V. A. Kickhoefer et al. (1.999), J. Cell Biol. 146: 917-928]. Una de estas PARPs, denominada tankirasa, es un componente de extremos cromosómicos denominados telómeros [S. Smith et al. (1.998), Science 282, 1.484-1.487]. Los telómeros son las regiones terminales de cromosomas, que contienen secuencias de DNA repetitivas únicas y porciones sobresalientes de cadena sencilla ricas en G. En la mayoría de las células humanas, los telómeros se acortan con cada ciclo de división celular porque las enzimas de la replicación del DNA son incapaces de replicar completamente los extremos cromosómicos. Este proceso, denominado "erosión de telómeros", limita el potencial de proliferación de las células normales porque la erosión de los telómeros alcanza finalmente un punto en que las células ya no pueden dividirse, y esto explica el envejecimiento celular. Por lo tanto, unos niveles óptimos de NAD en la célula también facilitan el mantenimiento de los telómeros y, en consecuencia, retrasan el envejecimiento celular. Se ha identificado recientemente otra PARP (Vault-PARP) como una de las tres proteínas presentes en "vaults", grandes complejos ribonucleoproteínicos de función desconocida situados esencialmente en el compartimento citoplásmico [V. A. Kickhoefer et al. (1.999), J. Cell Biol. 146: 917-928]. También se encuentra Vault-PARP en el huso mitótico de los cromosomas. De este modo, el NAD puede actuar en el mantenimiento de la integridad genómica al servir como sustrato para Vault-PARP.

La implicación de PARP-1, PARP-2 y PARP-3 en las respuestas celulares protectoras frente al estrés genotóxico demuestra la necesidad de NAD en las respuestas protectoras que reparan o borran el daño según sea apropiado. Aunque el NAD es un componente esencial de muchas rutas celulares y de reparación de DNA, no estaba claro en la técnica anterior cómo se controlan estas rutas de reparación de DNA.

Como se muestra en la sección Ejemplos, se ha hallado sorprendentemente que NAD es un factor limitante en la respuesta celular al daño genómico. El invento aquí descrito se refiere a (1) el descubrimiento de que las respuestas celulares protectoras en que está implicado NAD son acusadamente dependientes del contenido de NAD de la célula en el momento del estrés genotóxico; (2) que el contenido de NAD de las células cutáneas puede ser elevado mediante la aplicación tópica de moléculas bioactivas específicas; y (3) que la elevación de los niveles intracelulares de NAD potencia el mecanismo celular de reparación de DNA. Estos hallazgos se discuten en la sección Ejemplos.

Una realización del invento se dirige a una composición farmacéutica para un mamífero que necesita una elevación del contenido intracelular de NAD. La composición farmacéutica comprende un agente pro-NAD en una concentración suficiente para elevar el contenido intracelular de NAD, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica se refiere a una composición adecuada para uso farmacéutico en un animal o una línea celular animal. El animal puede ser un mamífero, tal como un ser humano. Una composición farmacéutica del invento comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente pro-NAD, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente que es eficaz para producir el pretendido efecto de reducir, prevenir y/o invertir el deterioro de la piel. El deterioro de la piel puede ser causado por diversos factores ambientales enumerados en la sección Antecedentes. Dichos factores incluyen fuentes de radiación ultravioleta tal como la luz solar, productos químicos y contaminación. Otros factores que causan deterioro de la piel incluyen especies oxigenadas reactivas que son generadas por agresiones ambientales y/o el metabolismo.

La expresión "agente pro-NAD" se refiere a compuestos que son precursores de NAD que, tras la administración a un sujeto y la subsiguiente absorción, son convertidos in vivo en una especie activa por medio de algún proceso, tal como un proceso metabólico. Otros productos del proceso de conversión son fácilmente desechados por el organismo. Los agentes pro-NAD más preferidos producen, mediante el proceso de conversión, productos que son generalmente reconocidos como seguros.

El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier vehículo conocido en este campo técnico como adecuado para una aplicación farmacéutica (es decir, tópica, oral o parenteral). En, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences [edición 19ª, compilado por Genarro (1.995), Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, EE.UU.] se describen vehículos y formulaciones farmacéuticos adecuados. Los vehículos farmacéuticos preferidos dependen del previsto modo de administración del agente activo. Los modos de administración típicos incluyen el entérico (es decir, oral), el parenteral (es decir, inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal) y el tópico (administración transdérmica o transmucosa).

El vehículo farmacéuticamente aceptable puede incluir, por ejemplo, agentes emolientes, agentes humectantes, agentes espesativos, siliconas y agua. En Remington's Pharmaceutical Sciences [edición 19ª, compilado por Genarro (1.995), Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, EE.UU.] pueden hallarse formulaciones adecuadas que incluyen excipientes farmacéuticamente aceptables para introducir agentes pro-NAD en la corriente sanguínea por vías distintas a la inyección. Los ejemplos específicos de vehículos incluyen aceites y ceras hidrocarbonados tales como aceite mineral, vaselina, parafina, ceresina, ozoquerita, cera microcristalina, polietileno y perhidroescualeno; triglicéridos tales como aceite vegetal, grasas animales, aceite de ricino, manteca de cacao, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de hígado de bacalao, aceite de almendra, aceite de aguacate, aceite de palma, aceite de sésamo, escualeno y aceite de soja modificado con anhídrido maleico; acetoglicéridos, tales como monoglicéridos acetilados; glicéridos etoxilados, tales como monoestearato de glicerilo etoxilado; ésteres alquílicos de ácidos grasos, tales como laurato de metilo, isopropilo, butilo y hexilo, laurato de isohexilo, palmitato de isohexilo, palmitato de isopropilo, oleato de decilo, oleato de isodecilo, estearato de hexadecilo, estearato de decilo, isoestearato de isopropilo, adipato de diisopropilo, adipato de diisohexilo, adipato de dihexildecilo, sebacato de diisopropilo, lactato de laurilo, lactato de miristilo, y ésteres de lactato de cetilo con ácido graso; ésteres alquenílicos de ácidos grasos, tales como miristato de oleilo, estearato de oleilo y oleato de oleilo; ácido grasos tales como los ácidos pelargónico, láurico, mirísitico, palmítico, esteárico, isoesteárico, hidroxiesteárico, oleico, linoleico, ricinoleico, araquídico, behénico y erúcico; alcoholes grasos tales como los alcoholes laurílico, miristílico, cetílico, hexadecílico, estearílico, isoestearílico, hidroxiestearílico, oleílico, ricinoleílico, behenílico, erucílico y 2-octildodecanílico; éteres de alcoholes grasos, tales como los alcoholes laurílico, cetílico, estearílico, isoestearílico y oleílico y colesterol que tienen fijados de 1 a 50 grupos óxido de etileno o de 1 a 50 grupos óxido de propileno; éter-ésteres tales como ésteres de ácidos grasos con alcoholes grasos etoxilados; lanolina y derivados tales como aceite de lanolina, cera de lanolina, alcoholes de lanolina, ácidos grasos de lanolina, lanolato de isopropilo, lanolina etoxilada, alcoholes de lanolina etoxilados, colesterol etoxilado, alcoholes de lanolina propoxilados alcoholes de lanolina acetilados, linoleato de alcoholes de lanolina, ricinoleato de alcoholes de lanolina, acetato de ricinoleato de alcoholes de lanolina, acetato de alcoholes etoxilados-ésteres, hidrogenolisis de lanolina, lanolina hidrogenada y etoxilada, lanolina-sorbitol etoxilado, y bases de absorción de lanolina líquidas y semisólidas; ésteres de alcoholes polihidroxilados, tales como mono- y di-ésteres de ácidos grasos con etilenglicol, mono- y di-ésteres de ácidos grasos con dietilenglicol, mono- y di-ésteres de ácidos grasos con polietilenglicol (200-6.000), mono- y di-ésteres de ácidos grasos con propilenglicol, monooleato de polipropilenglicol 2.000, monoestearato de polipropilenglicol 2.000, monoestearato de propilenglicol etoxilado, mono- y di-ésteres glicerílicos de ácidos grasos, poliésteres grasos de poliglicerol, monoestearato de glicerilo etoxilado, monoestearato de 1,3-butilenglicol, diestearato de 1,3-butilenglicol, ésteres de ácidos grasos con polioxietileno-poliol, ésteres de ácidos grasos con sorbitán, y ésteres de ácidos grasos con polioxietileno-sorbitán, que son ésteres de alcoholes polihidroxilados satisfactorios; ceras tales como cera de abejas, espermaceti, miristato de miristilo, estearato de estearilo, cera de abejas-polioxietileno-sorbitol, y ceras de carnauba y de candelilla; fosfolípidos tales como lecitina y derivados; esteroles tales como colesterol y ésteres de ácidos grasos con colesterol; y amidas tales como amidas de ácidos grasos, amidas de ácidos grasos etoxilados, y alcanolamidas de ácidos grasos
sólidas.

Además, el agente pro-NAD y el vehículo farmacéuticamente aceptable pueden ser encerrados en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimidos en forma de tabletas o incorporados directamente a la dieta del individuo. Específicamente, el agente pro-NAD puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, sellos, y similares. Cuando el agente pro-NAD es administrado oralmente, puede ser mezclado con otras formas alimentarias y con agentes potenciadores del sabor farmacéuticamente aceptables. Cuando el agente pro-NAD es administrado entéricamente, puede ser introducido en forma sólida, semisólida, de suspensión o de emulsión y puede ser combinado con cualquier número de aditivos farmacéuticamente aceptables bien conocidos. Los sistemas de distribución oral con liberación continua y/o los revestimientos entéricos para formas de dosificación oralmente administradas son conocidos en la técnica y también se consideran.

La composición farmacéutica puede ser administrada oral, tópica o parenteralmente. La administración oral se refiere a la administración de la formulación por ingestión a través de la boca, o a través de cualquier otra parte del sistema gastrointestinal incluyendo el esófago, o mediante la administración de supositorios. La administración parenteral se refiere a la distribución de una composición, tal como una composición que comprenda un agente pro-NAD, a través de una vía distinta del tracto gastrointestinal (por ejemplo, distribución oral). En particular, la administración parenteral puede ser por inyección intravenosa, subcutánea, intramuscular o intramedular (es decir, intratecal). La administración tópica se refiere a la aplicación de un agente farmacéutico a la superficie externa de la piel o a las membranas mucosas (incluyendo las membranas superficiales de la nariz, los pulmones y la boca), para que el agente atraviese la superficie externa de la piel o la membrana mucosa y pase a los tejidos subyacentes. La administración tópica de un agente farmacéutico puede dar lugar a una distribución limitada del agente en la piel y los tejidos circundantes o, cuando el agente es retirado de la zona de tratamiento por la corriente sanguínea, puede dar lugar a una distribución sistémica del agente. En una forma preferida de administración tópica, el agente farmacéutico se distribuye por distribución transdérmica. La distribución transdérmica se refiere a la difusión de un agente a través de la barrera de la piel. La piel (estrato córneo y epidermis) actúa como una barrera y pocos agentes farmacéuticos son capaces de penetrar en la piel intacta. Por contraste, la dermis es permeable a muchos solutos y, por lo tanto, la absorción de fármacos se produce más fácilmente a través de piel que está erosionada o, si no, desprovista de la epidermis para dejar expuesta la dermis. La absorción a través de piel intacta puede ser potenciada al disponer el agente activo en un vehículo oleoso antes de la aplicación a la piel (un proceso conocido como unción). La administración tópica pasiva puede consistir en aplicar directamente el agente activo al sitio de tratamiento en combinación con emolientes o agentes potenciadores de la penetración.

Se apreciará que no es necesario que el contenido unitario del ingrediente o ingredientes activos contenidos en una dosis individual de cada forma de dosificación constituya en sí una cantidad eficaz ya que la cantidad eficaz necesaria puede alcanzarse mediante la administración de una pluralidad de unidades de dosificación (tales como cápsulas o tabletas, o combinaciones de las mismas). Es decir, no es necesario que la dosis individual de agentes pro-NAD orales proporcione una elevación suficiente del contenido de NAD intracelular. Sin embargo, la dosificación continuada del agente pro-NAD oral a lo largo de un periodo de tiempo dará lugar a un nivel elevado de NAD intracelular. Similarmente, puede que una aplicación tópica individual del agente pro-NAD no eleve el contenido intracelular de NAD de la célula cutánea hasta el nivel deseado. Sin embargo, la aplicación repetida del agente pro-NAD a lo largo de un periodo de tiempo dará lugar a células cutáneas con un contenido elevado de NAD.

En una realización preferida, el agente pro-NAD contiene uno o más agentes pro-NAD con la fórmula siguiente:

3

en la que R_{1} puede ser cualquier grupo que pueda ser enzimática o químicamente eliminado para generar ácido nicotínico después de la administración, con la condición de que el log P_{O/W} esté entre 5 y 20. Por ejemplo, R_{1} puede ser un alcano, alqueno o alquino de cadena ramificada o no ramificada (es decir, lineal), con una longitud de hasta 30 átomos de carbono. Por ejemplo, si R_{1} fuera un alcano no ramificado, tendría la fórmula -(CH_{2})_{n}-CH_{3} en que n podría ser cualquier número entero de 0 a 29. R_{1} puede contener otros grupos funcionales, tales como, por ejemplo, grupos OH, grupos SH, grupos COOH, NH_{2} y similares. Los ejemplos específicos de agentes pro-NAD preferidos incluyen nicotinato de tetradecilo y nicotinato de octadecilo. El agente pro-NAD tiene un coeficiente de reparto en octanol/agua cuyo log (P_{O/W}) está entre 5 y 20, más preferiblemente entre 10 y 15. De este modo, son muy preferidos los R_{1} que comprenden un alcano de cadena lineal de 14 a 22 carbonos (es decir, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ó 22 carbonos) con valores de log P_{O/W} entre 10 y 15.

En otra realización preferida, el agente pro-NAD contiene uno o más agentes pro-NAD con la fórmula siguiente:

4

en la que R_{2} puede ser cualquier grupo que pueda ser enzimática o químicamente eliminado para generar nicotinamida después de la administración, con la condición de que el log P_{O/W} esté entre 5 y 20. Por ejemplo, R_{2} puede ser un compuesto ácido carboxílico de fórmula R_{1}-COOH en que R_{1} es como se describió anteriormente, y en el que dicho R_{2} está enlazado en un enlace amida como se muestra a continuación:

5

En una realización preferida, esta clase de agentes pro-NAD tiene un coeficiente de reparto en octanol/agua (P_{O/W}) cuyo log (P_{O/W}) varía entre 5 y 20, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15.

Se entiende que el agente pro-NAD puede comprender cualquier combinación de los anteriormente enumerados agentes pro-NAD preferidos. De esta manera, por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender nicotinato de tetradecilo, nicotinato de octadecilo o una combinación de ambos compuestos químicos. Como otro ejemplo, la composición farmacéutica puede contener uno o más derivados del ácido nicotínico con uno o más compuestos seleccionados entre nicotinamida y derivados de nicotinamida. Como otro ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes pro-NAD de acuerdo con el invento. También se entiende que el agente pro-NAD puede ser una sal de los agentes enumerados en esta solicitud. La sal es preferiblemente administrada en forma
soluble.

Dosificación eficaz

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en el presente invento incluyen composiciones en que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para alcanzar su pretendido fin. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para elevar óptimamente el contenido de NAD de las células cutáneas para prevenir el desarrollo, o aliviar los síntomas existentes, de deterioro de la piel. Se entiende que, en ciertos niveles de dosificación, puede que una cantidad eficaz no muestre efecto mensurable alguno hasta después de una semana, un mes, tres meses o seis meses de uso. Además, se entiende que una cantidad eficaz puede reducir la velocidad del deterioro natural que acompaña a la edad pero no invertir el deterioro que ya ha tenido lugar. La determinación de las cantidades eficaces está bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la detallada descripción aquí proporcionada.

Sin embargo, se entiende que el nivel de dosis específico para un usuario concreto dependerá de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del agente pro-NAD específico empleado, la edad, el nivel de actividad física, el estado general de salud y la gravedad del problema cutáneo. Por ejemplo, una persona activa que transpira puede requerir una formulación más oleosa o impermeable. Una persona con piel seca requerirá una formulación más oleosa, mientras que una persona con piel grasa puede preferir una suspensión menos oleosa.

Para cualquier agente pro-NAD usado en el método del invento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos con cultivos celulares o a partir de pruebas con animales. Por ejemplo, una dosis puede ser formulada en un modelo de ensayo en piel animal para aumentar el nivel de NAD celular, por ejemplo, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 100%, aproximadamente un 150%, aproximadamente un 200%, aproximadamente un 300% o aproximadamente un 500% con respecto al nivel normal de NAD. Dicha información puede ser usada para determinar más exactamente la dosis útil en un ser humano.

Una dosis terapéuticamente eficaz también se refiere a la cantidad del agente (o agentes) pro-NAD que da lugar a una elevación del contenido de NAD de las células cutáneas con una mejoría de los síntomas, sin efectos secundarios indeseados ni intolerables. La toxicidad y la eficacia terapéutica del agente pro-NAD pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales. Usando métodos estándares, puede determinarse la dosificación que muestra eficacia en aproximadamente el 50% de la población de ensayo, la dosis eficaz mediana (ED_{50}). La eficacia puede ser cualquier señal de que los síntomas de deterioro de la piel (pérdida de humedad, rayas finas, rayas profundas, arrugas y pérdida de elasticidad así como esclerosis atrófica y otras imperfecciones de la piel) se desarrollan más lentamente, se reducen o se invierten. Similarmente, puede determinarse la dosificación que produce un efecto secundario indeseable en aproximadamente el 50% de la población, la SD_{50}. Los efectos secundarios indeseables incluyen muerte, quemaduras, heridas, erupciones cutáneas, enrojecimiento anormal y similares. La relación de dosis entre efectos secundarios y efectos terapéuticos puede expresarse como el "índice terapéutico", que puede expresarse como la relación entre SD_{50} y ED_{50} (es decir, índice terapéutico = SD_{50}/ED_{50}). Se prefieren agentes pro-NAD con índices terapéuticos elevados. Es decir, se prefieren agentes pro-NAD que sean eficaces en una baja dosificación y no ejerzan efectos secundarios indeseables hasta dosis muy elevadas. Un índice terapéutico preferido es superior a aproximadamente 3; más preferiblemente, el índice terapéutico es superior a 10; muy preferiblemente, el índice terapéutico es superior a 25, tal como, por ejemplo, superior a 50. Además, son más preferidos los agentes pro-NAD que no producen efectos secundarios en ningún nivel de dosificación. Finalmente, son muy preferidos los agentes pro-NAD que son eficaces en bajas dosificaciones y no ejercen efectos secundarios en ningún nivel de dosificación. La formulación, vía de administración y dosificación exactas pueden ser escogidas dependiendo del efecto deseado y pueden ser preparadas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una crema cutánea para el mantenimiento de una piel de aspecto juvenil puede tener una dosificación menor que una crema cutánea para la reparación de la piel dañada por el sol o la
edad.

Los intervalos de dosificación pueden ser determinados mediante pruebas experimentales. Los agentes pro-NAD deberían ser administrados usando un régimen que mantuviera niveles celulares dérmicos 50% por encima de los normales, 100% por encima de los normales, preferiblemente aproximadamente 200% por encima de los normales, más preferiblemente aproximadamente 300% por encima de los normales, y muy preferiblemente aproximadamente 500% por encima de los normales, relativos a muestras de células cutáneas no expuestas a agentes pro-NAD. La cantidad de elevación de NAD dependerá, por supuesto, del sujeto que es tratado, la exposición del sujeto al medio ambiente, la gravedad del daño producido a la piel, y la forma y composición de la composición. Por ejemplo, un sujeto de piel clara, un sujeto de más edad o un sujeto con alto grado de exposición solar en el trabajo puede requerir más elevación de NAD.

En una realización preferida, la composición farmacéutica del invento puede comprender un agente pro-NAD en una concentración de entre 0,001% y 10%, preferiblemente entre 0,01% y 3%, tal como, por ejemplo, aproximadamente 1% en peso.

Agentes opcionales

La composición del invento puede comprender opcionalmente otros agentes conocidos por ejercer un efecto cosmético o beneficioso sobre la piel. Dichos agentes incluyen, por ejemplo, antioxidantes, pantallas solares, un agente amortiguador del pH y una combinación de los mismos. Aunque puede usarse cualquier antioxidante que sea químicamente compatible, los antioxidantes preferidos incluyen aminoácidos tales como glicocola, histidina, tirosina y triptófano; imidazoles tales como ácido urocánico; péptidos tales como D,L-carnosina, D-carnosina, L-carnosina y anserina; carotenoides; carotenos tales como alfa-caroteno, beta-caroteno y licopeno; ácido lipoico, tal como ácido dihidrolipoico; tioles tales como aurotioglucosa, propiltiouracilo, tiorredoxina, glutatión, cisteína, cistina y cistamina; tiodipropionato de dilaurilo; tiodipropionato de diestearilo; ácido tiodipropiónico; compuestos de sulfoximina tales como butionina-sulfoximinas, homocisteína-sulfoximina, butionina-sulfonas, y penta-, hexa- y heptationina-sulfoximina; agentes quelantes de metales, tales como alfa-hidroxiácidos grasos, ácido palmítico, ácido fítico, lactoferrina, EDTA y EGTA; alfa-hidroxiácidos tales como ácido cítrico, ácido láctico y ácido málico; ácidos grasos insaturados tales como ácido gamma-linolénico, ácido linoleico y ácido oleico; ácido fólico; ubiquinona y ubiquinol; vitamina C y derivados tales como palmitato de ascorbilo, fosfato de Mg-ascorbilo y acetato de ascorbilo; tocoferoles y derivados tales como acetato de vitamina E; vitamina A y derivados tales como palmitato de vitamina A; benzoato de coniferilo, de resina de benzoína; ácido rútico; alfa-glicosilrutina; ácido ferúlico; furfurilidenglucitol; carnosina, butilhidroxitolueno; butilhidroxianisol; nordihidroácido de resina de Guaiacum; ácido nordihidroguayarético; trihidroxibutirofenona; ácido úrico; manosa; compuestos de zinc tales como ZnO y ZnSO_{4}; selenio; y estilbenos. Además, el antioxidante puede incluir derivados tales como sales, ésteres, éteres, péptidos, lípidos, nucleótidos y nucleósidos de dichos antioxidantes. Los derivados pueden incluir, por ejemplo, derivados de ésteres de glicosilo, N-acetilo, metilo, etilo, propilo, amilo, butilo, laurilo, palmitoilo, oleilo, \gamma-linoleilo, colesterilo y glicerilo. Además, los antioxidantes pueden ser una combinación, una mezcla física, de sales de uno o más
antioxidantes.

La cantidad de los antioxidantes anteriormente mencionados (uno o más compuestos) en las formulaciones es preferiblemente de 0,001 a 30% en peso, particularmente es preferiblemente 0,05-20% en peso, en particular 1-10% en peso, con respecto al peso total de la formulación.

Otro agente opcional es un bloqueador solar. Los bloqueadores solares son productos químicos que pueden reducir la absorción de luz ultravioleta por la piel. El bloqueador solar puede dispersar, absorber o reflejar radiación ultravioleta. La adición de un bloqueador solar permite la operación cooperativa y sinérgica del agente pro-NAD y proporciona al consumidor una ventaja añadida.

El tipo específico de bloqueador solar se limita a los que no interfieren en la función activadora de NAD de los agentes pro-NAD. Los expertos en la técnica conocen bloqueadores solares, y productos químicos que absorben, reflejan y dispersan luz ultravioleta. En consecuencia, aunque a continuación se enumeran diversos bloqueadores solares, los métodos y composiciones del invento no se limitan a estos bloqueadores solares. Los productos químicos que son útiles como bloqueadores solares comprenden dioxibenzona, 4-[bis(hidroxipropil)]aminobenzoato de etilo, aminobenzoato de glicerilo, homosalato, antranilato de mentilo, octocrileno, metoxicinamato de octilo, salicilato de octilo, oxibenzona, padimato O, vaselina roja, dióxido de titanio, 4-mentilbenciliden-alcanfor, benzofenona-1, benzofenona-2, benzofenona-6, benzofenona-12, isopropil-dibenzoil-metano, butil-metoxidibenzoilmetano, zotocrileno, óxido de zinc, ácido para-aminobenzoico (PABA), cinamato, y derivados, compuestos análogos y compuestos análogos funcionales de dichos productos químicos. Los bloqueadores solares pueden ser también mezclas físicas o combinaciones químicas de uno o más productos químicos individuales.

Los agentes amortiguadores del pH (estabilizadores del pH) opcionales incluyen conocidos productos químicos adecuados para mantener el pH en una composición farmacéutica. Dichos productos químicos son conocidos y enumerados, por ejemplo, en libros de texto de química estándares [por ejemplo, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, EE.UU. (1.988); véase, por ejemplo, la página 243].

En otra realización, la composición puede comprender opcionalmente un fármaco tópicamente activo, tal como compuestos antifúngicos, compuestos antibacterianos, compuestos antiinflamatorios, anestésicos tópicos, medicamentos para dermatitis y enfermedades cutáneas, compuestos que reducen la irritación y la comezón, analgésicos, antibióticos, antisépticos y antiparasitarios. Además, la composición puede comprender un fármaco dermatológico tal como preparaciones anti-acné; agentes antiinflamatorios; agentes despigmentantes tales como monobenzona; agentes para aliviar la dermatitis, tales como el esteroide activo amcinonida, diacetato de diflorasona, hidrocortisona, y similares; agentes para aliviar los sarpullidos de las nalgas de los bebés, tales como cloruro de metilbenzetonio y similares; emolientes y agentes humectantes, tales como aceite mineral, dilaurato de PEG-4, aceite de lanolina, vaselina, cera mineral y similares; fungicidas, tales como nitrato de butoconazol, haloprogina, clotrimazol y similares; fármacos para el tratamiento del hérpes, tales como O-[(2-hi-droxietoxi)-metil]guanina; medicamentos antipruríticos, tales como dipropionato de alclometasona, valerato de betametasona, miristato de isopropilo MSD y similares; agentes para la psoriasis, seborrea y sarna, tales como antralina, methoxsalen, alquitrán de hulla y similares; y esteroides, tales como 2-(acetiloxi)-9-fluoro-1',2',3',4'-tetrahidro-11-hidroxipregna-1,4-dieno[16,17-b]naftalen-3,20-diona y 21-cloro-9-fluoro-1',-2',3',4'-tetrahidro-11b-hidroxipregna-1,4-dieno[16z,17-b]naftalen-3,20-diona. Cualquier otro medicamento que sea compatible con agentes pro-NAD y que sea eficaz cuando se administra tópicamente puede ser incorporado al método y la composición del presente invento.

Aunque un método que comprenda aplicar regularmente a la piel una disolución simple de uno o más agentes pro-NAD en agua sea eficaz para activar la reparación del DNA y prevenir el deterioro de la piel, pueden mezclarse ingredientes adicionales con los ingredientes activos para un efecto cosmético o una eficacia de aplicación mejoradas o como un agente diluyente para los ingredientes activos.

Por ejemplo, puede añadirse alcohol estearílico en una concentración de hasta aproximadamente 15 por ciento en peso para proporcionar un efecto de lubricación. Puede añadirse alcohol cetílico como agente emulsivo y espesativo, en una concentración de hasta aproximadamente 6 por ciento en peso. Puede añadirse glicerol como agente emoliente y humectante, en una concentración de hasta 18 por ciento en peso. Una mezcla de cera de ésteres cetílicos, alcohol estearílico, alcohol cetílico y glicerol puede formar una base humectante para cremas, un agente diluyente y un vehículo para los ingredientes activos. Además del ingrediente activo primario, uno o más agentes pro-NAD, puede haber ingredientes activos opcionales que pueden comprender, por ejemplo, pantallas solares, medicamentos, antioxidantes y similares.

Además, pueden añadirse conservantes y tampones para prevenir la corrupción y mantener el pH. Los conservantes pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno y Quaternium-15. Además, puede añadirse laurilsulfato sódico como agente humectante y emulsivo. Finalmente, puede usarse agua desionizada como diluyente, vehículo y agente humectante.

Envasado

Si se desea, la composición puede presentarse en un sistema de dispositivo dispensador que puede contener una o más unidades de dosificación. El sistema puede ser, por ejemplo, un recipiente con una bomba dispensadora que produzca una dosificación medida de la composición con cada bombeo. Como otro ejemplo, la composición puede ser individualmente envuelta con papel metálico o plástico, en forma de envases de una sola dosis. Los ingredientes fotosensibles pueden ser protegidos mediante envases opacos, y los ingredientes térmicamente sensibles pueden ser refrigerados del modo conocido en la técnica.

En otra realización, el invento se dirige a un método para tratar o hacer más lento el deterioro de la piel. En el método, una composición farmacéutica que comprende un agente pro-NAD del invento es administrada a un sujeto que necesita una elevación del contenido intracelular de NAD. Mediante el método se puede aumentar la concentración intracelular de NAD en al menos 50%, preferiblemente al menos 100%, más preferiblemente al menos aproximadamente 200% o aproximadamente 300%, tal como, por ejemplo, aproximadamente 500%, con respecto a los niveles de NAD de la piel no tratada antes del tratamiento.

La composición farmacéutica del invento puede ser administrada oral, tópica o parenteralmente. Por ejemplo, la administración puede ser intradérmica, subcutánea, o por medio de un parche dérmico o un mecanismo de liberación lenta aplicado a la capa de piel del mamífero.

Otra realización del invento se dirige a una composición farmacéutica que contiene uno o más agentes pro-NAD del invento, incluyendo agentes con la fórmula siguiente:

6

en la que R_{1} puede ser cualquier grupo que pueda ser enzimática o químicamente eliminado para generar ácido nicotínico después de la administración, con la condición de que el log P_{O/W} esté entre 5 y 20. Por ejemplo, R_{1} puede ser un alcano, alqueno o alquino de cadena lineal o ramificada, con una longitud de hasta 30 átomos de carbono.

En otra realización preferida, el agente pro-NAD puede contener uno o más agentes pro-NAD con la fórmula siguiente:

7

en la que R_{2} puede ser cualquier grupo que pueda ser enzimática o químicamente eliminado para generar nicotinamida después de la administración, con la condición de que el log P_{O/W} esté entre 5 y 20. Por ejemplo, R_{2} puede ser un compuesto ácido carboxílico de fórmula R_{1}-COOH en que R_{1} es como se describió anteriormente, y en el que dicho R_{2} está enlazado en un enlace amida como se muestra a continuación:

8

En una realización preferida, esta clase de agentes pro-NAD tiene un coeficiente de reparto en octanol/agua (P_{O/W}) cuyo log (P_{O/W}) varía entre 5 y 20, más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15.

Otra realización del invento se dirige al uso de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica del invento para la preparación de un medicamento para reducir los efectos citotóxicos del daño en el DNA de la piel de un mamífero al potenciar una o más enzimas, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La enzima que va a ser potenciada por el agente pro-NAD puede ser, por ejemplo, P53, PARP-1, PARP-2, PARP-3, tankirasa y V-PARP.

Los métodos, composiciones farmacéuticas y agentes pro-NAD de este invento pueden usarse para tratar a cualquier sujeto biológico. El término "sujeto" se refiere a un animal o a una o más células procedentes de un animal. Preferiblemente, el animal es un mamífero, muy preferiblemente un ser humano. Las células pueden estar en cualquier forma, incluyendo, pero sin limitarse a, células retenidas en tejido, agregados celulares, células inmortalizadas, células transfectadas o transformadas, y células procedentes de un animal que ha sido física o fenotípicamente alterado. En una realización, los métodos y agentes pro-NAD pueden usarse para tratar células en cultivo tisular, tales como, por ejemplo, células pluripotenciales embrionarias o linfocitos, para prevenir daño en el DNA. Esto puede usarse, por ejemplo, para prevenir que células de médula ósea muten en un trasplante de médula ósea. Los agentes pro-NAD pueden ser también usados, por ejemplo, para evitar que esperma, huevos y zigotos muten durante procesos de fertilización in vitro.

Otras realizaciones y ventajas del invento se exponen, en parte, en los ejemplos que vienen a continuación y, en parte, serán obvias a partir de esta descripción y podrán ser entendidas a partir de la práctica del invento.

Ejemplo 1 Resultados del estado subóptimo de niacina en células cutáneas con contenido reducido de NAD

Se examinó el efecto de medios de cultivo que contenían precursores subóptimos de NAD sobre el contenido de NAD de fibroblastos y queratinocitos humanos normales. En resumen, se cultivaron fibroblastos humanos normales con CO_{2} al 5% en medio complementado con nicotinamida o medio deficiente en nicotinamida. El medio deficiente en nicotinamida usado fue medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; del inglés, Dulbecco's modified Eagle medium) preparado sin nicotinamida y complementado con suero bovino al 5%; puede prepararse en el laboratorio y puede también disponerse de él solicitándolo a proveedores comerciales tales como Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland, EE.UU.) y Sigma (St. Louis, Missouri, EE.UU.). El medio complementado con nicotinamida es medio deficiente en nicotinamida complementado con nicotinamida hasta 33 \muM. Tras el cultivo de las células durante varios días, se extrajeron las células y se analizó su contenido de NAD. En la Figura 4 se muestran los resultados de un experimento típico, que muestra que un estado subóptimo de niacina da lugar a un contenido disminuido de NAD celular tanto en fibroblastos como en queratinocitos humanos.

El estado general de niacina varía ampliamente en la población humana. Se ha usado un ensayo bioquímico del estado de niacina [E. L. Jacobson y M. K. Jacobson (1.997), Methods in Enzymology, volumen 280, Academic Press, New York, EE.UU., 221-230] para evaluar el estado de niacina de una población humana de Malmö, Suecia. En este ensayo, el estado de niacina de los individuos se determina por la relación de NAD a NADP en los glóbulos rojos. A esta relación multiplicada por un factor de cien se hace referencia como "índice de niacina". E. L. Jacobson y M. K. Jacobson (Meth. Enzymol. 280, 221-230, 1.997) y E. L. Jacobson et al. (J. Cell Physiol. 99, 417-426, 1.979), incorporados aquí por referencia, describen métodos para medir el contenido de niacina (estado de niacina). La Figura 5 muestra una distribución de valores de índice de niacina en una población de 705 sujetos de Malmö, Suecia. También se muestran los valores de un grupo testigo. Las barras de la Figura 5 representan el rango de 95,5% del grupo testigo. Los resultados muestran que el estado general de niacina varía ampliamente en una población humana y que el 15% de esos individuos tienen valores de índice de niacina que les clasifican como gravemente deficientes en niacina.

Ejemplo 2 Un contenido aumentado de NAD en la piel se correlaciona con un deterioro menos grave de la piel

Puesto que el contenido de NAD de los glóbulos rojos varía ampliamente en la población humana, se examinó la posibilidad de que el contenido de NAD de las células de la piel variase ampliamente en experimentos que planteaban dos cuestiones relacionadas con el contenido de NAD de las células cutáneas. La primera cuestión planteaba si el contenido de NAD de la piel humana muestra una variación significativa. Se tomaron zonas de piel no enfermas procedentes de voluntarios humanos normales y se analizaron en cuanto al contenido de NAD. Los datos de la Figura 6 muestran que el contenido de NAD de la piel tomada de zonas no enfermas de voluntarios humanos normales varía más del cuádruplo.

El siguiente experimento fue diseñado para plantear la cuestión de si existe una correlación entre contenido de NAD de las células cutáneas y susceptibilidad al deterioro de la piel. En este experimento, se comparó el contenido de NAD de zonas no enfermas de piel de individuos con menor deterioro, con el de zonas no enfermas de piel de individuos con mayor deterioro. Los resultados, mostrados en la Figura 6, demuestran que el contenido de NAD de la piel no enferma de individuos con deterioro más grave de la piel (carcinoma de células escamosas) era significativamente menor que el de la piel no enferma de individuos con deterioro menos grave de la piel (queratosis actínica).

Ejemplo 3 Determinación de la correlación entre capacidad para reparar DNA y contenido de NAD

Puesto que el contenido de NAD de las células cutáneas humanas varía ampliamente, se llevó a cabo una serie de experimentos para examinar la capacidad de la piel para reparar DNA y responder al daño en el DNA, en función del contenido de NAD. La capacidad de las células para recuperarse de los efectos celularmente mortíferos del estrés genotóxico depende de su capacidad para reparar el daño en el DNA y activar múltiples rutas de respuesta al daño en el DNA en respuesta a estreses genotóxicos. En resumen, se cultivaron queratinocitos cutáneos humanos y fibroblastos cutáneos humanos normales en medio testigo o subóptimo de niacina (es decir, los medios deficientes en nicotinamida del Ejemplo 1) del modo descrito para el Ejemplo 1 anterior. Esto da lugar a células con un contenido normal o agotado de NAD. Se expusieron luego las células a luz solar simulada y se determinó la capacidad de las células para recuperarse de las diferentes dosis de luz solar midiendo el crecimiento de las células 5 días después de la exposición a la luz solar.

La Figura 7 muestra que fibroblastos cutáneos humanos y queratinocitos cutáneos humanos con un contenido reducido de NAD presentan una capacidad disminuida para recuperarse de una exposición a radiación solar proporcionada por un simulador solar. El restablecimiento del contenido normal de NAD mediante la adición de agentes pro-NAD al medio de cultivo de las células con un contenido reducido de NAD dio lugar al restablecimiento de un perfil normal de recuperación. La capacidad de reparación de DNA en función del contenido de NAD ha sido también evaluada mediante una técnica denominada "ensayo cometa". En un ensayo cometa [O. Ostling y K. J. Johanson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 123: 291 (1.984); P. L. Olive y J. P. Banath, Exp. Cell Res. 221: 19 (1.995)], las células son sembradas tras ser embebidas en agarosa líquida sobre un soporte y son lisadas in situ después de la formación de un gel de agarosa. El DNA de las células individuales es luego separado in situ mediante un campo eléctrico. El DNA dañado que contiene roturas de cadenas migra del núcleo celular a causa de su menor tamaño, y esta migración da lugar a una imagen en que el núcleo aparece como la cabeza del cometa y el DNA roto aparece como la cola del cometa. Cuanto más degradado está el DNA genómico, mayor es la cantidad de DNA capaz de migración y mayor es la "cola del cometa".

La Figura 8 muestra el análisis de la integridad del DNA de células humanas en función del contenido de NAD, tanto en ausencia como después de un estrés genotóxico. Los resultados muestran el porcentaje de cometas de "tipo 3" y "tipo 4" que corresponden a las células con los mayores niveles de daño no reparado. En primer lugar, el experimento muestra que células con un contenido subóptimo de NAD tienen una cantidad significativa de daño no reparado aun sin estrés genotóxico. En segundo lugar, células con un contenido bajo de NAD muestran niveles mucho mayores de daño no reparado después de un estrés genotóxico.

Ejemplo 4 Células humanas con un contenido disminuido de NAD también presentan otras rutas de señalización-respuesta al daño en el DNA alteradas

Como se muestra en la Figura 3, las rutas de señalización de daño en el DNA en las que está implicado el NAD interaccionan con otras rutas de señalización de daño en el DNA. En una de las rutas principales está implicada la proteína p53. El contenido celular de p53 es normalmente bajo en ausencia de estrés genotóxico pero aumenta rápidamente después de la aparición de roturas de cadenas de DNA. En resumen, se cultivaron células en medios testigo y subóptimo de niacina del modo descrito en el anterior Ejemplo 1, lo que dio lugar a células con contenido normal o bajo de NAD. Luego se extrajo la proteína de las células, se sometieron porciones del extracto a separación por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico y se determinó el contenido de proteína p53 por inmunotransferencia (transferencia Western). La Figura 9A muestra el contenido celular de p53 en células que tienen un contenido normal o bajo de NAD, según se determina por inmunotransferencia para la proteína p53. Las células con un contenido bajo de NAD tienen un contenido mucho mayor de p53, lo que demuestra que un contenido bajo de NAD da lugar a una alteración de la ruta de señalización de p53. En la Figura 9B se compara el contenido relativo de p53 después del estrés genotóxico causado por el agente alquilante MNNG en células con un contenido normal o bajo de NAD. 6 horas después del daño en el DNA, el contenido de p53 está elevado con respecto al de células con un contenido normal de NAD, mientras que, 24 horas después del daño, el contenido de p53 está muy reducido con respecto al de células con un contenido normal de NAD.

Ejemplo 5 Determinación del agente pro-NAD óptimo

Dos diferentes rutas biosintéticas pueden elevar el contenido de NAD de las células cutáneas humanas. Se llevó a cabo una serie de experimentos para determinar las posibles clases de agentes pro-NAD que pueden usarse para la elevación del contenido de NAD de las células cutáneas mediante aplicación tópica. A cualquier compuesto que pueda ser convertido en NAD se hace aquí referencia como agente "pro-NAD". La ruta para la conversión de triptófano en NAD sólo actúa en el hígado, y, por lo tanto, se evaluaron las dos restantes rutas en células cutáneas humanas. Una de estas rutas implica la conversión de nicotinamida en mononucleótido de nicotinamida y luego en NAD por la acción de la nicotinamida fosforribosiltransferasa y la mononucleótido de nicotinamida adeniltransferasa, respectivamente. La segunda ruta implica la conversión de ácido nicotínico en mononucleótido de ácido nicotínico con la subsiguiente conversión en dinucleótido de ácido nicotínico y adenina y en NAD por la acción de la ácido nicotínico fosforribosiltransferasa, la mononucleótido de ácido nicotínico adeniltransferasa y la NAD sintetasa, respectivamente.

Basándose en el modelo anteriormente mencionado, se han agrupado ahora los agentes pro-NAD en cuatro clases: (1) nicotinamida, (2) cualquier derivado de nicotinamida que pueda ser química o enzimáticamente convertido en nicotinamida, (3) ácido nicotínico y (4) cualquier derivado de ácido nicotínico que pueda ser química o enzimáticamente convertido en ácido nicotínico. Se han llevado a cabo experimentos con tres de las cuatro clases anteriormente descritas, usando fibroblastos cutáneos humanos en cultivo, y en la Figura 11 se muestran los resultados de un experimento típico. Los resultados demuestran que los fibroblastos cutáneos pueden bioconvertir la nicotinamida, el ácido nicotínico y cuatro diferentes ésteres del ácido nicotínico en NAD. Se espera que, basándose en los resultados aquí descritos para la nicotinamida, derivados de nicotinamida que pueden ser bioconvertidos en nicotinamida sirvan como agentes pro-NAD.

Ejemplo 6 Se prefiere la ruta del ácido nicotínico para la elevación del contenido de NAD de las células cutáneas

Los experimentos de la sección previa demostraron que dos diferentes rutas biosintéticas pueden elevar el contenido de NAD de las células cutáneas. Al considerar la calidad relativa de las dos rutas, se alcanzó la conclusión provisional de que la ruta del ácido nicotínico puede ser una ruta preferida. Aunque sin pretender el respaldo de teoría alguna, se expone a continuación el pertinente razonamiento. Esta conclusión se basó en la comprensión de que la nicotinamida en niveles elevados puede inhibir la reparación del DNA porque es un inhibidor de PARPs celulares, mientras que el ácido nicotínico no afecta a la actividad de las PARPs. La conclusión de que se prefería la elevación del contenido de NAD por la ruta del ácido nicotínico fue confirmada mediante experimentos en que se examinaban los efectos de altos niveles de ácido nicotínico o nicotinamida (Nam) sobre la reparación del DNA y otras rutas de señalización de daño en el DNA. En la Figura 12a se compara la integridad del DNA de células cultivadas en niveles normales (50 micromolar) o niveles altos (500 micromolar) de nicotinamida después del estrés genotóxico provocado por el agente alquilante MNNG. Puede verse que la presencia de niveles altos de nicotinamida da lugar a una integridad disminuida del DNA como resultado de la inhibición de las rutas de reparación del DNA y de respuesta al daño en el DNA. En la Figura 12B se muestran los efectos de altos niveles de nicotinamida o altos niveles de ácido nicotínico sobre la ruta de señalización de p53. La presencia de altos niveles de nicotinamida produjo niveles anormalmente altos de p53 tanto en ausencia como después del estrés genotóxico, mientras que la respuesta en presencia de altos niveles de ácido nicotínico fue sorprendentemente similar a la respuesta vista con niveles normales de nicotinamida. Estos experimentos muestran que la ruta del ácido nicotínico es una ruta preferida para la elevación del contenido de NAD de células cutáneas.

Ejemplo 7 La distribución tópica es una vía preferida para la elevación del contenido de NAD de las células cutáneas

El descubrimiento de que la ruta del ácido nicotínico es una ruta preferida para la elevación del contenido de NAD de células cutáneas condujo a una serie de experimentos para determinar si la vía de distribución tópica, mejor que una vía de distribución sistémica, es una vía preferida para la distribución de nutrientes pro-NAD a células cutáneas. La piel está en el extremo distal del sistema de distribución sistémica, la ingestión de nutrientes pro-NAD está sometida al metabolismo hepático de primera pasada, y las capas superiores de la piel están escasamente vascularizadas. Cada uno de estos factores indica que se requerirían grandísimas dosis orales de pro-nutrientes para alcanzar un suministro sistémico eficaz de agentes pro-NAD a las células cutáneas.

Se llevaron a cabo experimentos para determinar un método preferido para la elevación del contenido de NAD de las células cutáneas mediante distribución tópica. Un objetivo del experimento era desarrollar métodos para distribución continua de nicotinato a células cutáneas con mínima (y preferiblemente ninguna) distribución sistémica. Con este fin, el diseño de un agente pro-NAD preferido seguía los criterios siguientes: (1) el agente pro-NAD debe ser suficientemente lipófilo para repartirse eficazmente en, y a través de, el estrato córneo; y (2) el agente pro-NAD debe ser lentamente convertido en nicotinato por esterasas cutáneas para que el nicotinato sea eficazmente convertido en NAD por queratinocitos y fibroblastos.

El primer asunto considerado fue las propiedades físico-químicas de los agentes pro-NAD más deseables para aplicación tópica. La molécula de ácido nicotínico no puede ser óptima porque puede ser demasiado polar para que sea eficazmente suministrada tópicamente a células cutáneas. Las moléculas que son demasiado polares no pueden repartirse eficazmente en la apolar capa de estrato córneo de la piel, y habría de esperar que, después del paso a través del estrato córneo, entraran rápidamente en la circulación sistémica. Se caracterizó la serie de agentes pro-NAD mostrada en la Figura 13. Para valorar el potencial de esos agentes pro-NAD para repartirse en el estrato córneo, se determinaron experimentalmente los coeficientes de reparto de los ésteres nicotinato de metilo, etilo, butilo, hexilo y octilo en octanol/agua.

El coeficiente de reparto en octanol/agua fue determinado disolviendo una cantidad conocida de agente pro-NAD en agua y luego mezclando el compuesto acuoso con un volumen conocido de octanol. Tras mezclamiento durante un periodo de 1 a 18 horas, se analizó la cantidad de agente pro-NAD restante en partes alícuotas de la fase acuosa mediante cromatografía líquida de alta eficacia. El coeficiente de reparto (P) fue calculado mediante la ecuación siguiente:

P_{O/W} = (C_{0}-C)V_{W}/CV_{O}

log \ P_{O/W} = log_{10} \ [(C_{0}-C)V_{W}/CV_{O}]

en la que C_{0} es la concentración inicial en agua y C es la concentración después del reparto. V_{W} y V_{O} representan los volúmenes de las fases acuosa y octanólica, respectivamente. La Figura 14 muestra un gráfico de valores de log P_{O/W} frente a la longitud de cadena del éster. La Figura 14 también muestra que los valores de P_{O/W} para los ésteres tetradecílico y octadecílico del ácido nicotínico pueden ser deducidos por extrapolación de los resultados obtenidos mediante la determinación experimental de los valores de P_{O/W} para los ésteres más cortos. Los ésteres nicotinato de tetradecilo y octadecilo presentan propiedades favorables para reparto en el estrato córneo, y estos experimentos muestran que los agentes pro-NAD con valores de log P_{O/W} en el intervalo de 10 a 15 son óptimos para un reparto eficaz en la capa de estrato córneo de la piel.

El siguiente asunto considerado fue la velocidad de hidrólisis de agentes pro-NAD tópicamente aplicados hasta ácido nicotínico de modo que la conversión en NAD pueda ser completada por la ruta mostrada en la Figura 11. La velocidad de hidrólisis de un agente pro-NAD después de aplicación tópica puede ser estimada por evaluación de la vasodilatación local que sigue a la aplicación tópica de un agente pro-NAD. Los ésteres nicotinato no causan vasodilatación y, por ello, las velocidades de hidrólisis que dan lugar a niveles tisulares de nicotinato que sobrepasan el umbral para vasodilatación pueden ser detectadas después de la aplicación tópica. Diversos experimentos han permitido comparar la ausencia o presencia de vasodilatación (y el curso temporal de la vasodilatación, cuando está presente) para algunos de los agentes pro-NAD mostrados en la Figura 13. Por ejemplo, la aplicación de una crema que contiene nicotinato de hexilo al 0,05% da lugar a una vasodilatación que se inicia aproximadamente a los 10 minutos y dura aproximadamente 90 minutos. Una aplicación similar de nicotinato de octilo da lugar a una vasodilatación que se inicia aproximadamente a los 15 minutos y dura 360 minutos. Una aplicación similar de nicotinato de tetradecilo no da lugar a vasodilatación. Estos experimentos indican que el nicotinato de tetradecilo se libera muy lentamente después de la aplicación. Es probable que dos factores estén implicados en la velocidad de hidrólisis de agentes pro-NAD tópicamente aplicados: la velocidad de salida del estrato córneo y la velocidad de hidrólisis por esterasas presentes en las capas epidérmica y dérmica de la piel. Estos experimentos indicaron que los ésteres de ácido nicotínico de cadena más larga son un método preferido para la elevación del contenido de NAD de las células cutáneas.

Ejemplo 8 El contenido de NAD de la piel puede ser elevado mediante la aplicación tópica de agentes pro-NAD

Basándose en la evaluación de agentes pro-NAD, se llevaron a cabo experimentos, que demostraran la eficacia de estos, para la elevación del contenido de NAD de las células cutáneas por distribución tópica usando un modelo de ratón sin pelo. En resumen, se usó nicotinato de tetradecilo para los estudios iniciales. En el estudio, se realizaron tres aplicaciones tópicas diarias de una crema de nicotinato de tetradecilo al 1% al lomo de los animales y no se aplicó crema al abdomen. Inmediatamente después de la tercera aplicación, se analizó el contenido de NAD de la piel del lomo y el abdomen. Las muestras de ensayo de piel fueron congeladas en nitrógeno líquido y pulverizadas por medios mecánicos El contenido de NAD fue evaluado del modo previamente descrito (E. L. Jacobson y M. K. Jacobson, Meth. Enzymol. 280, 221-230, 1.997; E. L. Jacobson et al. (J. Cell Physiol. 99, 417-426, 1.979). El ensayo de NAD se basa en el principio de la ciclación enzimática entre estados oxidados y reducidos, en que el NAD es el factor limitante de la velocidad para una serie de reacciones de multiplicación. La proteína total fue analizada mediante el ensayo de Bradford. Los resultados, mostrados en la Figura 15, indican que tres aplicaciones tópicas diarias de una crema que contiene nicotinato de tetradecilo al 1% al lomo del animal de ensayo daba lugar a un contenido cutáneo de NAD que era el 143% del contenido de un animal testigo, tratado sólo con una crema básica. La Figura 15 también muestra que no aumentaba el contenido de NAD de la piel retirada del abdomen del animal tratado, lo que proporciona una prueba de que el contenido aumentado de NAD era debido a la distribución tópica.

En otro experimento, se examinó el efecto del número de aplicaciones diarias de la crema de nicotinato de tetradecilo al 1%. De nuevo, la aplicación se realizó en el lomo del animal, y el abdomen de cada animal sirvió como testigo. Los resultados, representados en la Figura 16, muestran que el contenido de NAD de la piel retirada del lomo aumentaba en función del número de aplicaciones diarias. Por contraste, el contenido de NAD del abdomen no aumentaba, lo que proporciona evidencia adicional de que el contenido aumentado de NAD era debido a la distribución tópica del agente pro-NAD.

Ha de advertirse que, en los experimentos mostrados en las Figuras 15 y 16, en ningún caso hubo señales de toxicidad observadas como resultado de la aplicación tópica de la crema de nicotinato de tetradecilo.

Otros agentes pro-NAD pueden ser identificados al exponer células en cultivo a presuntos agentes pro-NAD o al exponer la piel de un sujeto de ensayo, tal como un ratón, al presunto agente pro-NAD. Una vez que se ha determinado una dosificación segura y eficaz, los presuntos agentes pro-NAD pueden ser probados en voluntarios humanos y analizados mediante muestras de biopsias de piel. La eficacia de los agentes pro-NAD puede ser determinada (a) analizando bioquímicamente lisados celulares para evaluar el contenido celular de NAD o (b) calificando cambios fenotípicos o funcionales en las células tratadas con respecto a los de células testigo que no han sido expuestas al presunto agente pro-NAD.

Cuando se van a identificar o evaluar compuestos análogos y derivados de un agente pro-NAD conocido, las células son expuestas al agente pro-NAD del invento y son comparadas con testigos positivos que han sido sólo expuestos al agente pro-NAD conocido y con testigos negativos que no han sido expuestos al presunto agente pro-NAD ni al agente pro-NAD conocido.

Con objeto de determinar si el agente pro-NAD administrado de acuerdo con el método del invento es absorbido por tejidos corporales, y, si así fuera, en qué tejido tiene lugar la absorción, puede llevarse a cabo lo siguiente. Se analizan muestras de diversos tejidos corporales de un sujeto, tal como un ratón de laboratorio, en cuanto al contenido de NAD a horas crecientes después de la administración oral de un agente pro-NAD. Los resultados de las mediciones se comparan con los de sujetos testigo para determinar el porcentaje de aumento del contenido de NAD. Pueden desarrollarse una curva de dosis-respuesta y un índice terapéutico para determinar la dosificación oral óptima.

Otras realizaciones y usos del invento resultarán evidentes a los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica del invento aquí descrito.

Claims (41)

1. Una composición farmacéutica para un sujeto que necesita una elevación del contenido intracelular de NAD, que comprende un agente pro-NAD y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicho agente pro-NAD está en una concentración suficiente para elevar el contenido intracelular de NAD en dicho sujeto y en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 5 a 20.

2. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1, que está adaptada para administración tópica a la piel mediante la inclusión de un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicho agente pro-NAD comprende uno o más compuestos con la fórmula siguiente:

9

en la que R_{1} es un grupo químico que puede ser enzimática o químicamente eliminado para generar ácido nicotínico después de la administración a dicho sujeto, en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 5 a 20.

4. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 3, en la que R_{1} es un grupo químico que puede ser eliminado por una esterasa después de la administración a dicho sujeto.

5. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 3, en la que R_{1} es un alcano, alqueno o alquino de cadena no ramificada o ramificada, de hasta 30 átomos de carbono, en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 5 a 20.

6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 3, en la que R_{1} es un alcano con entre 14 y 22 carbonos.

7. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 3, en la que R_{1} también contiene uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en tiol, alcohol, amina, ácido carboxílico, onio, anhídrido carboxílico, éster carboxílico, haluro de acilo, amida, nitrilo, aldehído, cetona, imina, éter, sulfuro, haluro, nitro, nitroso, azida, diazo y una combinación de los mismos.

8. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 3, en la que R_{1} es un grupo químico que cambia el log P_{O/W} de dicho agente pro-NAD a entre 5 y 20.

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 3, en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 10 a 15.

10. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 3, en la que dicho agente pro-NAD es seleccionado del grupo que consiste en nicotinato de tetradecilo, nicotinato de octadecilo y una combinación de los mismos.

11. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicho agente pro-NAD comprende uno o más compuestos con la fórmula siguiente:

10

en la que R_{2} es un grupo químico que puede ser enzimática o químicamente eliminado para generar nicotinamida después de la administración a dicho sujeto, en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 5 a 20.

12. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 11, en la que R_{2} es un ácido carboxílico que contiene un grupo alcano, alqueno o alquino de hasta 30 átomos de carbono que cambia el log P_{O/W} de dicho agente pro-NAD a entre 5 y 20, en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 5 a 20.

13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 11, en la que R_{2} es un ácido carboxílico que contiene un grupo alcano R con entre 14 y 22 carbonos.

14. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 11, en la que R_{2} también contiene uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en tiol, alcohol, amina, ácido carboxílico, onio, anhídrido carboxílico, éster carboxílico, haluro de acilo, amida, nitrilo, aldehído, cetona, imina, éter, sulfuro, haluro, nitro, nitroso, azida, diazo y una combinación de los mismos.

15. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 11, en la que R_{2} es un grupo químico que cambia el log P_{O/W} de dicho agente pro-NAD a entre 5 y 20.

16. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 11, en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 10 a 15.

17. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que la concentración de dicho agente pro-NAD es entre 0,001% y 10% en peso.

18. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que la concentración de dicho agente pro-NAD es entre 0,01% y 3% en peso.

19. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1, que comprende además un compuesto seleccionado del grupo que consiste en antioxidantes, pantallas solares, vitaminas, un agente estabilizador del pH y una combinación de los mismos.

20. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicho sujeto es un mamífero.

21. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1, en la que dicho sujeto es seleccionado del grupo que consiste en una población de células en cultivo, una línea de células en cultivo, un huevo, esperma o un zigoto.

22. Uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1 en una cantidad eficaz para la preparación de un medicamento para tratar o hacer más lento el deterioro de la piel.

23. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 22, en el que dicha cantidad es suficiente para aumentar la concentración intracelular de NAD de células cutáneas de dicho sujeto en al menos un 50%.

24. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 22, en el que dicha cantidad es suficiente para aumentar la concentración intracelular de NAD de células cutáneas de dicho sujeto en al menos un 100%.

25. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 22, en el que dicha célula cutánea es un fibroblasto o un queratinocito.

26. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 22, en el que una cantidad eficaz de la composición farmacéuticamente aceptable es administrada tópica, intradérmica o subcutáneamente, o por medio de un parche dérmico o un mecanismo de liberación lenta aplicado a una capa de piel de dicho sujeto.

27. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 22, en el que la administración es oral o parenteral.

28. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 1, formulada para uso transdérmico.

29. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 28, en la que dicho agente pro-NAD comprende uno o más compuestos de la fórmula siguiente:

11

en la que R_{1} es un grupo químico que puede ser enzimática o químicamente eliminado para generar ácido nicotínico después de la administración, en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 5 a 20.

30. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 29, en la que R_{1} es un grupo químico que puede ser eliminado por una esterasa después de la administración a dicho sujeto.

31. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 29, en la que R_{1} es un alcano, alqueno o alquino de cadena lineal o ramificada, con una longitud de hasta 30 átomos de carbono, en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 5 a 20.

32. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 29, en la que R_{1} también contiene uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en tiol, alcohol, amina, ácido carboxílico, onio, anhídrido carboxílico, éster carboxílico, haluro de acilo, amida, nitrilo, aldehído, cetona, imina, éter, sulfuro, haluro, nitro, nitroso, azida, diazo y una combinación de los mismos.

33. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 29, en la que dichos uno o más compuestos son seleccionados del grupo que consiste en nicotinato de tetradecilo y nicotinato de octadecilo.

34. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 28, en la que dicho agente pro-NAD comprende uno o más compuestos de la fórmula siguiente:

12

en la que R_{2} es un grupo que puede ser enzimática o químicamente eliminado para generar nicotinamida después de la administración, en la que dicho agente pro-NAD tiene un log P_{O/W} en el intervalo de 5 a 20.

35. Una composición de acuerdo con la Reivindicación 34, en la que R_{2} también contiene uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en tiol, alcohol, amina, ácido carboxílico, onio, anhídrido carboxílico, éster carboxílico, haluro de acilo, amida, nitrilo, aldehído, cetona, imina, éter, sulfuro, haluro, nitro, nitroso, azida, diazo y una combinación de los mismos.

36. Uso de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para reducir los efectos citotóxicos del daño en el DNA de la piel de un mamífero al potenciar o elevar el contenido de una o más proteínas intracelulares de las células cutáneas.

37. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 36, en el que dicha proteína es p53.

38. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 36, en el que dicha proteína es seleccionada del grupo que consiste en PARP-1, PARP-2, PARP-3, tankirasa, V-PARP y telomerasa.

39. Uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 1, para la preparación de un medicamento para tratar la piel en un momento suficientemente próximo al momento de una exposición a radiación UV, para inhibir el deterioro de la piel debido a la exposición a radiación UV.

40. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 39, que comprende aplicar la composición farmacéutica a la piel antes de la exposición a radiación UV.

41. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 39, que comprende aplicar la composición farmacéutica a la piel después de la exposición a radiación UV.