ES2223287A1 - Compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes y autoinmunes. - Google Patents
Compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes y autoinmunes.Info
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Abstract
Compuestos para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes y autoinmunes. La presente invención se relaciona con el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes y autoinmunes, muy en especial con el tratamiento de la esclerosis múltiple. El tratamiento consiste en la administración de sustancias antagonistas de los receptores purinérgicos P2X lo que produce una remisión de los síntomas propios de este tipo de enfermedades. Esto se demostró tanto en modelos celulares in vitro, como en modelos animales.
Description
Compuestos para el tratamiento de enfermedades
desmielinizantes y autoinmunes.
La presente invención se relaciona con el campo
de las enfermedades desmielinizantes y autoinmunes, preferentemente
con el de la esclerosis múltiple, así como con el empleo de
sustancias antagonistas de los receptores P2X, presentes en
oligodendrocitos, para el tratamiento de dichas enfermedades, y con
composiciones que contengan dichos antagonistas.
La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad
desmielinizante del sistema nervioso central más frecuente. Afecta a
un millón y medio de personas en el mundo, y sus síntomas aparecen
en general en adultos jóvenes, por lo que sus consecuencias a nivel
personal y socioeconómico son muy graves.
Se piensa que la susceptibilidad a la EM se debe
a factores genéticos y ambientales desconocidos. La prevalencia de
la enfermedad se sitúa entre 50 a 100 personas por cada 100.000
habitantes en las regiones de alto riesgo, que se localizan
principalmente en las zonas septentrionales del hemisferio norte,
en Europa y América. El riesgo a padecer EM aumenta
10-20 veces en parientes de primer grado de
enfermos, y la concordancia entre gemelos monocigóticos (idénticos
genéticamente) se eleva hasta el 30-35%, mientras
que gemelos dicigóticos sólo alcanza el 2-5%. La
susceptibilidad genética no está caracterizada. Hasta el momento se
tienen evidencias de que puede residir en algún polimorfismo de los
genes que codifican antígenos leucocitarios humanos (HLA),
glicoproteína oligodendrocítica de la mielina (MOG) y otros genes de
los cromosomas 10 y 15.
Existe un consenso entre los investigadores de la
EM según el cual la enfermedad tiene dos fases una inicial
inflamatoria, de naturaleza autoinmune, y otra secundaria
neurodegenerativa progresiva. En la primera, las células T activadas
atraviesan la barrera hematoencefálica, y una vez dentro del
Sistema Nervioso Central liberan citoquinas proinflamatorias que
desencadenan una cascada inmunológica que termina en la destrucción
de la mielina y muerte de los oligodendrocitos. El conocimiento con
un cierto detalle del proceso autoinmune ha servido para desarrollar
agentes de naturaleza inmunomoduladora cuya eficacia terapéutica es
muy modesta. Sin embargo, no se ha generado ningún medicamento que
retrase o detenga el avance de la fase neurodegenerativa de la
enfermedad que cursa con deterioro neurológico progresivo e
invalidez, y que se caracteriza por la aparición de lesiones
desmielinizantes graves en la sustancia blanca con pérdida masiva
de oligodendrocitos, atrofia y daño axonal severo. Hasta ahora se
han descrito diversas dianas para la intervención durante la fase
inflamatoria de la esclerosis múltiple (Zamvil y Steinman, 2003,
Neuron 38, 685-688). Entre ellas se encuentran las
que se dirigen a reducir la inflamación del sistema nervioso
iniciada por la activación de células T específicas de mielina, que
promueven la autoinmunidad en particular contra componentes de la
mielina, penetran en el tejido nervioso central y liberan en él
citoquinas proinflamatorias como el
interferon-\gamma y el factor de la necrosis
tumoral-\alpha. El inmunomodulador
interferón-\beta, aprobado para el tratamiento de
la esclerosis múltiple remitente-recurrente,
previene también las interaciones celulares que llevan a la
penetración de las células T activadas a través del endotelio
vascular. Otros tratamientos en fase de ensayo clínico están
dirigidos a neutralizar la actividad de las citoquinas
proinflamatorias y/o a potenciar las antiinflamatiorias. Un estudio
reciente (Youssef et al., 2002, Nature 420, 78-84)
ha puesto de manifiesto que el medicamento atorvastatin empleado en
el tratamiento de la hipercolesterolemia, es también un potente
inmunomodulador que puede prevenir o revertir la EAE crónica
mediante la potenciación de la secreción de citoquinas
antiinflamatorias y la inhibición de la producción de citoquinas
proinflamatorias.
Los receptores purinérgicos son un tipo de
receptores de membrana activados por purinas extracelulares copio
ADP y ATP y que median diversos efectos biológicos como la
modulación de la actividad neuronal, la liberación de
neurotransmisores, la glucogenolisis, la contractilidad de la pared
vascular o ciertos procesos inmunológicos etc. Los receptores
purinérgicos se clasifican en dos grandes grupos denominados P1,
cuya activación esta mediada por adenosina, y P2 cuyos ligandos
endógenos son las purinas ATP y ADP y las pirimidinas UTP y UDP.
Los receptores P1 transducen la señal al interior de la célula a
través de proteínas G y de acuerdo con sus propiedades moleculares,
bioquímicas y farmacológicas se subdividen en cuatro grupos: A1,
A2A, A2B y A3. Por su parte, los P2 se dividen en ionotrópicos
(P2X) y metabotrópicos (P2Y) (Bamard y cols., 1997; Ralevic y
Burnstock, 1998).
En los últimos años se ha puesto de manifiesto
que los receptores purinérgicos además de participar en señales
propias de la neurotransmisión, también median efectos sobre las
células gliales (Rathbone y cols., 1999). De hecho, la expresión de
receptores purinérgicos en el sistema nervioso central no está
limitada solamente a neuronas, sino que afecta también a la glía
(Dunn y cols., 2001; Franke y cols., 2001a; Stevens y cols., 2002).
En particular, la señalización purinérgica en los astrocitos y la
microglía sirve como un medio de comunicación
glía-glía y glía-neurona (Fields y
Stevens, 2000). Además, algunos estudios muy recientes señalan la
presencia de receptores funcionales en oligodendrocitos in
vitro (Stevens y cols., 2002), que apuntan a una participación
relevante en las funciones propias de este tipo celular. En
particular, Stevens y cols (2002) muestran que la adenosina
liberada desde los axones como consecuencia de la actividad
eléctrica, inhibe la proliferación de los precursores
oligodendrogliales, estimula su diferenciación y promueve la
formación de mielina.
La señalización a través de receptores
purinérgicos tiene también importancia en la viabilidad celular en
respuesta a procesos patológicos cerebrales (revisado en Abbracchio
y Burnstock, 1998). Así, están implicados en la respuesta gliótica
al daño nervioso (Franke y cols., 2001b; James y Butt, 2001), y en
la respuesta reparadora del sistema nervioso central mediante la
producción de factores tróficos en astrocitos (Ciccarelli y cols.,
2001). A su vez, la presencia de ectonucleotidasas que degradan el
ATP hasta adenosina constituye un elemento neuroprotector en la
isquemia (Braun y cols., 1998), mientras que el ATP produce muerte
de células gliales (Honda y Kohsaka, 2001).
El conocimiento sobre la implicación del sistema
purinérgico en la esclerosis múltiple es muy escaso. Esa
información indica que hay alteraciones en la actividad de la
5'-nucleotidasa, el enzima que
degrada ATP hasta adenosina. Dicha actividad está más elevada en
monocitos sanguíneos de pacientes de esclerosis múltiple cultivados
durante varios días (Armstrong y cols., 1988). Por su parte, las
regiones del sistema nervioso central en las que se producen
lesiones propias de la esclerosis múltiple tienen una actividad
nucleotidasa más baja (Ansari y cols., 1978), lo que puede producir
concentraciones más elevadas de ATP extracelular y mayor activación
de los receptores purinérgicos P2.
Lo sorprendente de la presente invención se basa
en el descubrimiento por parte de los inventores de que la
administración de una determinada cantidad de algún antagonista de
receptores P2X, ya sean de amplio espectro o específico como el ATP
oxidado (o-ATP a partir
de ahora), selectivo de los receptores P2X7, produce una remisión de
los síntomas de la enfermedad.
El problema a resolver por la presente invención
es proporcionar una serie de compuestos para el tratamiento de las
enfermedades desmielinizantes y autoinmunes, preferentemente de la
esclerosis múltiple.
La solución presentada en este documento se basa
en la capacidad que poseen los antagonistas de los receptores
purinérgicos P2X de frenar el desarrollo de dichas enfermedades
tanto en ensayos in vitro como in vivo.
La invención se ilustra en el ejemplo en el que
se describen los ensayos llevados a cabo por los inventores en los
que, por un lado, se pone de manifiesto que los oligodendrocitos en
cultivo expresan los receptores P2X en su superficie y, por otro,
que la activación de los mismos con ATP produce un aumento del
calcio citosólico y, si el estímulo es prolongado, produce
finalmente la muerte de las células. Asimismo, se describen los
ensayos en los que se demuestra en modelos in vivo e in
vitro de esclerosis múltiple, que el tratamiento con
antagonistas de receptores purinérgicos P2X frena el desarrollo de
la enfermedad.
Así pues, un aspecto de la invención se refiere
al uso de antagonistas de receptores P2X ya sean de amplio espectro
o selectivos de un determinado subgrupo de receptores (como por
ejemplo el o-ATP como antagonista selectivo de los
receptores P2X7) para el tratamiento de la esclerosis múltiple y en
un sentido más amplio de las enfermedades desmielinizantes y
autoinmunes.
El segundo aspecto de la invención se refiere a
una composición farmacéutica que comprenda al menos uno de los
mencionados antagonistas de los receptores P2X junto con al menos
algún excipiente farmacéuticamente aceptable.
La figura 1 muestra las propiedades
electrofisiológicas de los receptores P2X en oligodendrocitos en
cultivo. La activación de dichos receptores produce una corriente
de entrada que se puede potenciar en ausencia de iones divalentes.
Las curvas dosis-repuesta
del agonista natural endógeno, ATP, y de análogos del mismo, como el
BzATP, indican que las propiedades de las respuestas se asemejan a
las de los receptores P2X7 recombinantes expresados en sistemas
heterólogos.
La figura 2 pone de manifiesto que, tanto el ATP
como el BzATP producen un elevado incremento en la concentración de
calcio intracelular que se evita en presencia de PPADS, un
antagonista P2X y P2Y de amplio espectro, y también eliminando el
calcio del medio extracelular. Además, se observa que las
respuestas se potencian con propofol y se inhiben con
o-ATP, un antagonista selectivo de los receptores
P2X7.
La figura 3 demuestra que la aplicación durante
15 minutos de ATP o BzATP causa muerte de los oligodendrocitos en
cultivo. La muerte es dependiente de calcio, pues su eliminación
del medio de cultivo hace que no se produzca. El antagonista de
amplio espectro PPADS es capaz de prevenirla si se coaplica a la
vez que los agonistas.
La figura 4 demuestra que la muerte
oligodendroglial por ATP se puede prevenir mediante el antagonista
selectivo de los P2X7, el o-ATP.
La figura 5 muestra la expresión in situ
de receptores P2X en oligodendrocitos del nervio óptico mediante
técnicas inmunohistoquímicas utilizando anticuerpos específicos. Se
observa que los receptores P2X2, P2X4 y P2X7 (verde) son muy
abundantes en oligodendrocitos (rojo) de nervio óptico. El color
amarillo indica el solapamiento de ambos colores, por lo que los
mencionados receptores se expresan abundantemente en
oligodendrocitos. Del mismo modo, queda claro que estos no se
expresan demasiado en astrocitos.
La figura 6 muestra como la infusión lenta de (1
\mul/hora) de BzATP (100 mM) produce lesiones en el nervio
óptico, en las que se aprecia daño tisular con astrogliosis y
microgliosis, así como desaparición de la mielina en el área dañada
y rotura de los axones.
La figura 7 pone de manifiesto que las ratas a
las cuales se induce EAE tienen graves síntomas neurológicos que
incluyen parálisis de las extremidades e incluso muerte. Sin
embargo, el tratamiento previo a la aparición de los síntomas con
o-ATP produce la desaparición virtual de los
síntomas.
La figura 8 demuestra como, después de doce días
tras la inducción de la EAE, la administración de
o-ATP hace desaparecer los síntomas neurológicos
causados por la enfermedad.
La figura 9 pone de manifiesto que en la EAE los
niveles de receptores P2X2 no se alteran significativamente, sin
embargo, los de P2X7 bajan de forma drástica. Esto indica que hay
una pérdida de células que lo expresan, principalmente
oligodendrocitos.
El primer aspecto de la invención se refiere al
uso de los antagonistas de los receptores purinérgicos P2X para el
tratamiento de las enfermedades desmielinizantes y autoinmunes. La
autoinmunidad requiere la activación de una cascada precisa de
procesos en células del sistema inmune. Una parte de esas células,
los macrófagos y los linfocitos, expresa receptores P2X1, P2X2,
P2X5 y P2X7, y la activación de este último produce la liberación
de citoquinas proinflamatorias como el factor de la necrosis
tumoral \alpha(TNF-\alpha) e
IL-1\beta, así como apoptosis por mecanismos que
todavía no están caracterizados (Burnstock, 2002, Arteriorscler
Thromb Vasc Biol. 22, 364-373). Sin embargo, las
funciones precisas que median los receptores P2Xs en el sistema
inmune todavía no están bien caracterizadas. Es esta expresión de
receptores P2X en células del sistema inmune la que hace adecuado
el uso de los antagonistas de receptores P2X para el tratamiento de
las enfermedades autoinmunes. Una realización preferida de la
invención contempla como enfermedad a tratar la esclerosis
múltiple.
Entre los antagonistas de los receptores P2X
existen unos que son llamados de amplio espectro debido a que
tienen la capacidad de unirse a varios de los receptores de la
familia P2X, aunque con diferente afinidad a cada uno de ellos; y
otros que son selectivos de un determinado grupo de receptores de
la familia P2X.
Las siguientes fórmulas representan algunos de
estos antagonistas de amplio espectro de los receptores P2X:
Las siguientes fórmulas representan los
antagonistas selectivos de los receptores P2X:
Los compuestos anteriormente representados por
sus fórmulas estructurales son:
- \sqbullet
- El PPADS (sal tetrasódica del ácido piridoxalfosfato-6-azofenil-2',4'-disulfonico) (I)
- \sqbullet
- El iso-PPADS (sal tetrasódica del ácido piridoxalfosfato-6-azofenil-1',4'-disulfonico) (II)
- \sqbullet
- El Suramin (sal hexasódica del ácido 8,8'-[Carbonilbis [imino-3,1-fenilencarbonilimino(4-metil-3,1-fenilen)carbonilimino]] bis-1,3,5-naftalentrisulfonico) (III)
- \sqbullet
- El Evans Blue (sal tetrasódica del ácido 6,6-[(3,3'-Dimetil[1,1'-bifenil]-4, 4'-diil)bis(azo)bis[4-amino- 5-hidroxi-1,3-naftalendisulfonico]) (IV)
- \sqbullet
- El NF023 (sal hexasódica del ácido 8,8-[carbonilbis (imino-3,1-fenilencarbonilimino)]bis-1,3,5-naftalen-trisulfonico) (V)
- \sqbullet
- El NF279 (sal hexasódica del ácido 8,8-[carbonilbis (imino-4,1-fenilencarbonilirnino-4,1-fenilencarbonilimino)]bis-1,3, 5-naftalentrisulfonico) (VI)
- \sqbullet
- El BBG (brillant blue coomasie G) (VII)
- \sqbullet
- El NF449 (sal octasódica del ácido 4,4',4'',4'''-[Carbonilbis (imino-5,1,3-benzentriil-bis(carbonilimino))]tetra- kis-1,3-benzendisulfónico) (VIII)
- \sqbullet
- El o-ATP (sal sódica de Adenosina 5-trifosfato, oxidada con periodato) (IX)
- \sqbullet
- El KN-62 (ester del ácido 4-[(2S)-2-[(5-isoquinolinilsulfonil) metilamino]-3-oxo-3-(4-fenil-1-piperazinil)propil] fenil isoquinolinsulfonico) (X)
- \sqbullet
- El PPNDS (sal tetrasódica de piridoxal-5-fosfato-6-(2'-naftilazo-6'-nitro-4', 8'-disulfonato) (XI)
- \sqbullet
- El RB2 (ácido 1-amino-4-{[4-[[4-cloro-6-[[3 (ó 4)-sulfofenil]amino]-1,3, 5-triazin-2-il]amino]-3-sulfofenil]amino}-9,10-dihidro-9,10-dioxo-2-antracensulfonico) (XII)
Además de los anteriormente citados existen otros
antagonistas de amplio espectro como son el MRS2220
(piridoxina-\alpha4,5-monofosfato-6-fenilazo-2',5'-disulfonato
ciclico), el Ip51 (sal pentapotásica de
P^{1},P^{5}-Diinosina-5-pentafosfato)
o el TNP-ATP (sal monolitio
trisódica de
2',3'-O-2,4,6-trinitrofeniladenosina
5'-trifosfato), así como selectivos como por ejemplo
el HMA (5-(N,N hexametilen) amilorida).
En la tabla 1 aparecen representados los
IC_{50} de algunos de los compuestos anteriores en relación con
los diferentes subgrupos de receptores P2X.
En una realización preferida, uno de dichos
antagonistas es un antagonista selectivo de los receptores P2X7, el
o-ATP. En los ensayos llevados a cabo por los
inventores (ver ejemplo más adelante) este compuesto se ha mostrado
especialmente adecuado para tratar la esclerosis múltiple debido a
la importancia relativa de la presencia de receptores P2X7 en
oligodendrocitos con respecto al resto de receptores P2X.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende al menos un antagonista de
un receptor purinérgico P2X, ya sea de amplio espectro o selectivo
de un subgrupo de receptores, junto con al menos un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables
serán aquellos excipientes de la técnica que permitan la
formulación adecuada de la composición farmacéutica de la invención.
Dicha composición puede formularse para su administración oral,
intravenosa, tópica, rectal, subdérmica, etc. Es decir, puede
presentarse en forma de soluciones, comprimidos, cápsulas,
implantes, etc. Asimismo, dicha formulación puede ser de liberación
inmediata o de liberación controlada.
Los receptores de amplio espectro pueden ser
seleccionados de entre los compuestos anteriormente mencionados.
Una realización preferida contempla una composición farmacéutica
que contenga como antagonista al menos al o-ATP,
selectivo de los receptores P2X7.
En el siguiente ejemplo se detallan los ensayos
llevados a cabo por lo inventores que ilustran el fundamento de la
invención.
Los cultivos celulares se realizaron a partir de
nervio óptico de rata perinatal (P12) siguiendo protocolos
establecidos, que se adaptaron e introdujeron en el laboratorio
según descripción reciente (Matute y cols, 1997, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 94, 8830-8835).
Los registros electrofisiológicos se realizaron
en cultivos de 2 a 5 días, y siguiendo las pautas indicadas en
trabajos previos (Patneau y cols, 1994, Neuron12:
357-371). Las células se registraron en una cámara
que permite variar la composición del medio extracelular a través
de un flujo constante (0,5-1 mL/min). Los electrodos
de registro fueron capilares de vidrio que contenían soluciones
específicas compatibles con las concentraciones fónicas
citoplasmáticas. El estudio de las respuestas mediadas por los
receptores purinérgicos se realizó mediante la técnica de control de
voltaje de la célula entera ("whole-cell
patch-clamp"), midiendo las corrientes generadas
por la aplicación externa de agonistas y antagonistas selectivos de
dichos receptores.
La concentración de calcio citosólico se
determinó mediante el método de Grynkiewikcz y cols. (1985; J.
Biol. Chem. 260, 3440-3450). Los oligodendrocitos se
cargaron con 5 mM de Fura-2/AM, y a continuación se
lavaron y se estudiaron en un microscopio invertido Zeiss equipado
con un monocromador, objetivo 40x de inmersión, una cámara digital
de alta resolución Orca, y un software AquaCosmos (Hamamatsu
Photonics). En estas condiciones se ensayaron los cambios en los
niveles de calcio citosólico en respuesta a agonistas y
antagonistas, en presencia y ausencia de calcio extracelular. La
calibración se realizó al final de los ensayos mediante la
aplicación sucesiva de ionomicina y EGTA, y la concentración de
calcio se estimó mediante la medida del ratio 340/380 nm.
Los nervios se aislaron de ratas adultas jóvenes,
y se perfundieron durante 30 min en líquido cefalorraquídeo
artificial (LCRa) saturado en oxígeno mediante burbujeo de 95% de
oxígeno y 5% de CO2, en condiciones comparables a las descritas para
oligodendrocitos en cultivo (Fern y Möller, 2000, J. Neurosci. 20:
34-42). A continuación se incubaron con agonistas y
antagonistas purinérgicos durante diversos tiempos. Posteriormente,
los nervios se perfundieron durante 1 a 24 horas con LCRa normal
saturado de oxígeno. Transcurrido ese tiempo el daño se evaluó
histológicamente tal y como hemos descrito in vivo (Matute,
1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10229-10234),
y se analizaron los cambios bioquímicos que subyacen a dicho
daño.
Se emplearon anticuerpos comerciales para el
estudio de la presencia de marcadores del linaje oligodendroglial,
componentes de la mielina, astrocitos y microglía. Las técnicas
incluyeron la inmunocitoquímica, inmunohistoquímica e inmunoblotting
(Western blot), todas ellas descritas en detalle (ver por ejemplo,
Domercq y cols., 1999, Eur. J. Neurosci. 11,
2226-2236)
Los experimentos en nervio óptico se realizaron
en conejos (New Zealand White) que, por su tamaño, permiten una
mejor manipulación quirúrgica experimental. El procedimiento
empleado será el descrito previamente (Matute, 1998, Proc. Natl.
Acad. Sci. 95, 10229-10234). Los agonistas
purinérgicos se aplicaron mediante el empleo de microbombas
osmóticas que liberan cantidades pequeñas de soluto durante un
tiempo determinado. Posteriormente, se evaluó el efecto de dicha
aplicación sobre el nervio con un panel de marcadores de
oligodendrocitos y sus progenitores, mielina, integridad axonal,
astrogliosis y microgliosis.
Se emplearon ratas Lewis que se inmunizaron
subcutáneamente con proteína básica de la mielina inyectada en las
patas traseras (100 microgramos/animal en 100 microlitros) y
adyuvante de Freund con 5.5 mg/ml de Micobacterium
tuberculosis H37Ra. La médula espinal de los animales se
extrajo cuando los animales tenían los síntomas de la enfermedad
(12-14 post-inmunización) y se
analizó la expresión de receptores purinérgicos mediante técnicas
inmunoquímicas (inmunoblot e inmunohistoquimica).
El ATP (1 mM) induce una corriente de entrada que
no desensibiliza en la mayoría de oligodendrocitos examinados (77,3
\pm 7,9%; n= 47; Fig. 1a). El análogo del ATP,
2',3'-O-(4-benzoil-4-benzoil)
(BzATP, 100 \muM), que es un agonista P2X de amplio espectro pero
con una afinidad más alta para el receptor P2X7 (Ralevic &
Burnstock, 1998), indujo también respuestas similares (Fig. 1a).
Por el contrario,
\alpha,\beta-metilen-ATP
(\alpha,\beta-Me-ATP, 100
\muM), un agonista selectivo de receptores P2X1, P2X3 y
heterómeros P2X2/3, no generó corrientes en oligodendrocitos. Se
observó que la amplitud de las corrientes generadas por ATP y BzATP
depende de la concentración del agonista correspondiente (Fig. 1a)
(EC_{50}= 8,77 mM y 0,52 mM respectivamente). Asimismo, se pudo
constatar que la ausencia de Mg^{2+} y Ca^{2+}, que incrementa
la concentración de ATP^{4-} la forma activa de los receptores
P2X, potencia 4-10 las respuestas (Fig. 1a).
El antagonista de amplio espectro PPADS (100
\muM), por su parte, bloquea completamente las corrientes
inducidas por ATP (Fig. 1). A su vez, el ATP oxidado
(o-ATP), un antagonista preferentemente de
los receptores P2X7, bloquea parcialmente las corrientes de ATP. A
su vez, el Cu^{2+} (1 mM) que es un inhibidor selectivo de los
P2X7 (Virginio et al., 1997), reduce las corrientes de ATP,
mientras que el propofol (60 \muM), un potenciador de los
receptores P2X4, no altera dichas corrientes. Estos resultados
indican que los receptores P2X presentes en oligodendrocitos tienen
propiedades electrofisológicas compatibles con un predominio de la
subunidad P2X7.
Se monitorizó [Ca^{2+}]_{i}; tras
aplicar ATP y BzATP con objeto de caracterizar los efectos de la
activación de los receptores P2X en oligodendrocitos. Estas células
responden a ATP (10 \muM) con un incremento rápido en
[Ca^{2+}]_{i} citosólico basal (250 \pm 65 nM) a 1200
\pm 468 nM (Fig. 2a). Estas respuestas son reprimidas en presencia
de PPADS (50 \muM) y en ausencia de
Ca^{2+} en la solución de incubación. Estos resultados indican que
la [Ca^{2+}]_{i} aumenta a consecuencia de la entrada de
Ca^{2+} a través de la membrana plasmática y no por la liberación
del mismo desde los depósitos intracelulares.
El Bz-ATP (0,01-1
mM) también activa la entrada de Ca^{2+} en oligodendrocitos de
forma dosis dependiente (Fig. 2b, d). Este efecto desaparece en
ausencia de Ca^{2+} extracelular y se bloquea con PPADS (Fig. 2b,
d). Estos resultados sugieren que los receptores P2X que contienen
la subunidad P2X7 son los principales medidores de la respuesta a
ATP.
De acuerdo con esta idea, el antagonista
selectivo de P2X7 o-ATP (1 mM) (Fernández et al.,
2001), reduce un 63 \pm 8 el incremento de la
[Ca^{2+}]_{i} inducido por Bz-ATP (Fig.
2d, e). Por su parte, el propofol (60 \muM), que potencia las
respuestas mediadas por P2X4 (Tomioka et al., 2000), potencia el
incremento de la [Ca^{2+}]_{i} generado por 0.1 and 1 mM
ATP en un 60 \pm 22 and 77 \pm 34% respectivamente (Fig. 2c, d).
Por tanto, los receptores nativos P2X que contienen P2X4 también
contribuyen a la entrada de Ca^{2+} inducida por ATP en
oligodendrocitos.
A todas las concentraciones de ATP
(0,01-1 mM) ensayadas se produjo la muerte de un
15-27% de oligodendrocitos que se inhibe en
presencia de 50 \muM PPADS y tras quitar el Ca^{2+} del medio
de cultivo (Fig. 3a). De la misma forma el agonista
Bz-ATP causó una toxicidad similar al ATP (Fig.
3b). Otros agonistas purinérgicos como el
ATP-\gamma-S, que es un análogo
más estable que el ATP, y el \alpha,\beta,-meATP son también
tóxicos para los oligodendrocitos, lo que excluye la posibilidad de
que los metabolitos del ATP sean los causantes de la toxicidad tras
activar receptores distintos a los P2X. En su conjunto, los ensayos
de toxicidad muestran que los oligodendrocitos son vulnerables a la
activación de los receptores P2X por ATP y sus análogos.
El análisis de la expresión de receptores P2X
mediante inmunohistoquímica con anticuerpos específicos en cultivos
de oligodendrocitos diferenciados (GalC^{+}/MBP^{+}) puso de
manifiesto que estas células tienen principalmente las subunidades
P2X2, P2X4 y P2X7 (ver Tabla 2).
| Subunidad | P2x_{1} | P2x_{2} | P2x_{3} | P2x_{4} | P2x_{5} | P2x_{6} | P2x_{7} |
| Expresión | +/- | ++ | --- | ++ | +/- | +/- | ++ |
Este perfil de expresión es consistente con las
propiedades electrofisiológicas y las características de la
toxicidad observada en estos cultivos. Además, el patrón de
subunidades observado in vitro también se corresponde con el
observado in situ en nervio óptico (Tabla 3) mediante doble
marcado de subunidades y anticuerpos específicos del linaje
oligodendroglial y astroglial (Fig.5).
| Subunidad | P2X1 | P2X2 | P2X3 | P2X4 | P2X5 | P2X6 | P2X7 |
| Distribución | – | +++ | – | +++ | + | – | +++ |
Estos resultados inmunohistoquímicos se
confirmaron mediante Western blot (inmunotransferencia).
Para determinar si el ATP es tóxico, a los
oligodendrocitos en una preparación de tejido nervioso sin disociar
se prefundieron nervios ópticos enteros aislados de ratas adultas
con líquido cefalorraquídeo artificial con ATP
\hbox{(100
\mu M)} durante 3 h. En estas condiciones se produjo un
incremento de > 3 veces del número de células que mostraban
condensación del núcleo en comparación con los nervios controles
perfundidos sin ATP (Fig. 5). Las células dañadas se orientan en el
eje longitudinal del nervio y forman parte de hileras de
oligodendrocitos interfasciculares. La estimulación con ATP en
presencia de PPADS (10 \muM) previene de la muerte de los
oligodendrocitos.
A continuación, se infundieron los agonistas
ATP-\gamma-S y BzATP sobre el
nervio óptico in vivo mediante bombas osmóticas que liberan
cantidades de soluto muy pequeñas a lo largo de 3 días. El examen
histológico de los nervios a 7 días de inicias la aplicación mostró
daño tisular en un área restringida a la proximidad de la cánula
(Fig. 6).
Además, dicha zona presentaba una gliosis
intensa, falta de mielina y daño axonal (Fig. 6). En su conjunto
esto resultados indican que la activación de los P2X mata
oligodendrocitos in situ y que las lesiones in vivo
comparten propiedades propias de las placas de esclerosis
múltiple.
Se investigaron los efectos del antagonista de
amplio espectro PPADS y del más selectivo o-ATP en
el desencadenamiento y curso de la EAE inducida por inmunización de
ratas Lewis con proteína básica de la mielina. Las ratas inmunizadas
mostraron signos de déficits motores alrededor de los 10 días
postinyección, y alcanzaron un máximo a los 14 días (Fig. 7). El
tratamiento con PPADS (30 mg/kg, dos veces al día) desde los 7 a
los 14 días postinyección no mejoró los síntomas y el curso de la
enfermedad. En cambio la aplicación de o-ATP (1 y 5
mg/kg, cada 12 h) durante el mismo periodo atenuó o previno la
aparición de los síntomas propios de la EAE (Fig. 7).
Posteriormente se evaluó la eficacia del
o-ATP en mejorar los síntomas de la EAE en un
modelo remitente-recurrente-crónico.
Para ello, se inmunizaron ratas DA con médula espinal singénica
observándose la aparición de déficits neurológicos severos a los
7-9 días postinyección, y que alcanzaban su primer
pico entorno a los 11 días. El tratamiento con
o-ATP (2,5 mg/kg, cada 12 h) una vez instaurados la
intensidad máxima de los síntomas los redujo los síntomas y también
eliminó aquellos propios de la fase crónica (Fig. 8).
Con objeto de conocer el mecanismo de acción por
el que el o-ATP mejora el pronóstico de la EAE, se
evaluaron mediante Western blot los niveles del receptor P2X7 sobre
el que actúa de forma preferente este fármaco en la médula espinal
lumbosacra, la región más afectada en esta enfermedad experimental.
Encontramos que los niveles de esta subunidad se reducían a la
mitad en los animales sometidos a EAE, y que dichos niveles
retornaban a los de los controles en aquellos animales con EAE
tratada con o-ATP (Fig. 9). Estos resultados indican
que el tratamiento con o-ATP protege de la muerte a
las células que expresan P2X7, y por ende a los oligodendrocitos
que son el principal tipo celular que expresa dicha subunidad en la
médula espinal.
Los resultados mostrados anteriormente ponen de
manifiesto por primera vez que los oligodendrocitos tienen
receptores P2X. Asimismo, se detallan las propiedades
electrofisiológicas, farmacológicas y moleculares de estos
receptores, así como su elevada permeabilidad a calcio. Esta última
propiedad hace que los oligodendrocitos sean vulnerables a los
estímulos intensos y/o prolongados mediados por estos receptores,
al igual que se ha demostrado con los receptores glutamatérgicos en
esta población celular (Matute et al., 2001, Trends Neurosci 24,
224-230). La vulnerabilidad de los oligodendrocitos
a las señales mediadas por los receptores P2X es una de las causas
del daño en el tejido nervioso que subyace a la enfermedad
experimental EAE, un modelo de esclerosis múltiple. Finalmente, el
bloqueo de los receptores P2X hasta del desencadenamiento de la
enfermedad reduce drásticamente los síntomas neurológicos en la EAE
aguda, y mejora la evolución y pronóstico en la EAE crónica una vez
instaurada la sintomatología.
La invención aquí descrita constituye una vía
para el tratamiento de la esclerosis múltiple, una enfermedad que
carece de tratamientos eficaces que ralenticen o frenen su
progresión. Las vías de intervención que han resultado en el
desarrollo de fármacos en fase de ensayos clínicos o de uso como
medicamentos en el tratamiento de la esclerosis múltiple tienen
mecanismos de acción que regulan el funcionamiento del sistema
inmune. El hecho de que el bloqueo de los P2X prevenga los síntomas
de la EAE aguda, un modelo de EM que mimetiza la fase
inflamatoria/autoinmune de la enfermedad, indica que estos fármacos
pueden ser de hecho potentes agentes inmunomoduladores que eviten
la autoinmunidad que desencadena la EM y otras enfermedades.
Finalmente, los antagonistas de los receptores P2X al ser agentes
protectores de la muerte de los oligodendrocitos, la población
celular que sufre mayor daño en la EM, tienen un gran potencial
terapéutico en la fase neurodegenerativa de esta enfermedad, fase
que se prolonga durante decenios y en la que los pacientes sufren
un deterioro progresivo que cursa con trastornos motores y
sensitivos que produce invalidez.
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Claims (11)
1. Antagonista de un receptor purinérgico P2X
para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes y autoinmunes,
preferiblemente de la esclerosis múltiple, en mamíferos incluido el
hombre.
2. Antagonista de un receptor purinérgico P2X
para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes y autoinmunes
de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque el
receptor purinérgico es preferentemente un receptor P2X7.
3. Antagonista de un receptor purinérgico P2X
para el tratamiento de las enfermedades desmielinizantes y
autoinmunes de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado
porque el antagonista es un antagonista de amplio espectro para
receptores P2X o un antagonista selectivo de un receptor P2X7, como
el o-ATP.
4. Antagonista de un receptor purinérgico P2X
para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes y autoinmunes
de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado
porque dicho antagonista se puede seleccionar de entre el PPADS,
iso-PPADS, Suranim, Evans Blue, NF023, NF279, BBG,
NF449, o-ATP, KN62, PPNDS, RB2, MRS2220, Ip51,
TNP-ATP o HMA.
5. Empleo de un antagonista de los receptores
purinérgicos P2X en la elaboración de un medicamento para el
tratamiento de enfermedades desmielinizantes y autoinmunes,
preferiblemente de la esclerosis múltiple, en mamíferos incluido el
hombre.
6. Empleo de un antagonista de los receptores
purinérgicos P2X de acuerdo con la reivindicación 5
caracterizado porque dichos receptores purinérgicos son
preferentemente receptores P2X7.
7. Empleo de un antagonista de los receptores
purinérgicos P2X de acuerdo con la reivindicación 5
caracterizado porque dicho antagonista es un antagonista de
amplio espectro para receptores P2X o un antagonista selectivo de un
receptor P2X7, como el o-ATP.
8. Empleo de un antagonista de los receptores
purinérgicos P2X de acuerdo con la reivindicación 5 a 7
caracterizado porque dicho antagonistas se puede seleccionar
de entre el PPADS, iso-PPADS, Suranim, Evans Blue,
NF023, NF279, BBG, NF449, o-ATP, KN62, PPNDS, RB2,
MRS2220, Ip51, TNP-ATP o HMA.
9. Composición farmacéutica que comprende al
menos un antagonista de un receptor purinérgico P2X y al menos un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 9 caracterizada porque el antagonista es un
antagonista de amplio espectro para receptores P2X o un antagonista
selectivo de un receptor P2X7, como el o-ATP.
11. Composición farmacéutica de acuerdo con las
reivindicaciones 9 a 10 caracterizada porque dicho
antagonista se selecciona de entre el PPADS,
iso-PPADS, Suranim, Evans Blue, NF023, NF279, BBG,
NF449, o-ATP, KN62, PPNDS, RB2, MRS2220, Ip51,
TNP-ATP o HMA.
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