ES2214865T3 - Columna analitica multicapas. - Google Patents
Columna analitica multicapas.Info
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Abstract
La invención se refiere a una columna de análisis multicapa que comprende una cámara que tiene un eje longitudinal y un primer extremo provisto con una primera abertura. Una pluralidad de capas de membrana están apiladas verticalmente en el interior de la cámara y comprenden al menos una pluralidad de sustrato en fase sólida, llevando cada uno de estos un anti-analito diferente. Una muestra puede disponerse en la cámara para que unos analitos específicos de la muestra se fijen a los anti-analitos. Se utiliza entonces un detector para recibir una señal procedente de los sustratos y generar una señal eléctrica correspondiente.
Description
Columna analítica multicapas.
La presente invención está dirigida a una columna
analítica, y más en particular a una columna analítica multicapas
que es capaz de identificar y cuantificar una serie de analitos de
una muestra de fluido en un solo análisis.
Comúnmente son usados análisis para analizar
muestras de fluido tales como muestras de sangre a fin de determinar
la presencia y/o cantidad de un analito en la muestra de fluido.
Para analizar una muestra de sangre para determinar la existencia de
un analito, como p. ej. un antígeno, un anticuerpo, un ligando o un
receptor de ligando, en los actuales sistemas de análisis se utiliza
la tecnología de la microtitulación o de las placas de
microtitulación, en la que es llevado a cabo un solo análisis de una
muestra de fluido en cada uno de numerosos sitios separados. Un
dispositivo que es usado a menudo en el análisis con placas de
microtitulación es la llamada placa de microtitulación de noventa y
seis cavidades, que es un aparato que tiene noventa y seis entrantes
o cavidades dentro de cada uno(a) de los (las) cuales se pone
y queda unida a la cavidad una cantidad de un determinado
antianalito, como p. ej. un anticuerpo o un antígeno o algo similar.
Entonces se pone en cada cavidad una cantidad de muestra. Los
analitos específicos que puedan estar presentes en la muestra (como
p. ej. anticuerpos, antígenos, ligandos y receptores) se fijan al
antianalito en cada cavidad, revelando la existencia del analito
cuando es añadido a la cavidad un reactivo conjugado con una marca
detectable. El rendimiento de fijación de la muestra al antianalito
en un dispositivo de este tipo puede ser relativamente bajo, y el
funcionamiento de estos dispositivos resulta costoso. Un análisis de
este tipo está basado en un procedimiento de análisis "uno a
uno", es decir que se requiere un análisis para la detección de
cada analito específico. La plataforma de análisis uno a uno es
también muy usada para analizar la actividad biológica de
compuestos, p. ej. en la búsqueda de nuevas drogas potenciales.
Puesto que hay cientos de miles de compuestos químicos que deben ser
pasados por las pruebas de selección, la realización de análisis uno
a uno para el descubrimiento de drogas requiere un tiempo
tremendamente largo.
La EP-A-0139373
se refiere a una sonda microanalítica que está adaptada para ser
usada para la selección de fluido biológico y otros gases o fluidos
de muestra para determinar la presencia de sustancias que son
capaces de experimentar específicas reacciones de fijación.
La EP-A-0312394
se refiere a inmunoanálisis en los que se utiliza como soporte una
membrana y se emplea una jeringa reutilizable o un colector de vacío
para pasar muestras por medio de un gradiente de presión a través de
una membrana que contiene una afinidad para un analito.
La US-A-5057438
se refiere a la determinación de una pluralidad de especies de
anticuerpos o antígenos que se logra mediante un método que
comprende los pasos de formar una pluralidad de distintas clases de
membranas de reacción que tienen cada una una distinta especie de
anticuerpo o antígeno sobre un soporte electroforético, y superponer
estas membranas de reacción.
Es un objetivo de la presente invención aportar
una columna analítica multicapas que reduzca o supere plenamente
algunas de las susodichas dificultades que son inherentes a los
anteriores dispositivos conocidos o todas ellas. A la luz de la
siguiente descripción de la invención y de la siguiente descripción
detallada de determinadas realizaciones preferidas, los particulares
objetos y ventajas de la invención resultarán obvios para los
expertos en la materia, es decir para aquéllos que estén versados o
experimentados en este campo de la tecnología.
Los principios de la invención pueden ser
aprovechados para lograr una columna analítica multicapas que
permita que sean llevados a cabo de manera prácticamente simultánea
múltiples análisis de una única muestra de fluido, proporcionando un
rendimiento mejorado y unos costes reducidos.
Según un primer aspecto de la presente invención,
se aporta una columna multicapas que comprende, en combinación:
una cámara que tiene un eje geométrico
longitudinal con un primer extremo que tiene una primera abertura;
y
una pluralidad de capas realizadas en forma de
membranas microporosas tipo filtro prácticamente planares apiladas
verticalmente que están apiladas dentro de la cámara e incluyen al
menos una pluralidad de sustratos en fase sólida que llevan cada uno
un distinto antianalito, teniendo cada capa realizada en forma de
membrana una pluralidad de poros que permite al fluido de muestra
fluir a través de cada capa realizada en forma de membrana y permite
al fluido de muestra fluir a través de la pluralidad de capas
realizadas en forma de membranas apiladas verticalmente, siendo el
plano de cada una de las capas realizadas en forma de membranas
prácticamente perpendicular al eje geométrico longitudinal de la
cámara.
Según un segundo aspecto de la presente
invención, se aporta un aparato de análisis de fluidos que
comprende, en combinación:
una caja;
medios de montaje dentro de la caja para admitir
una cámara alargada;
una cámara alargada que queda montada en los
medios de montaje y tiene una primera abertura en un primer extremo
de la misma y una pluralidad de capas realizadas en forma de
membranas microporosas tipo filtro prácticamente planares apiladas
verticalmente que están apiladas dentro de la cámara e incluyen al
menos una pluralidad de sustratos en fase sólida que llevan cada uno
un distinto antianalito, teniendo cada capa realizada en forma de
membrana una pluralidad de poros que permite al fluido de muestra
fluir a través de cada capa realizada en forma de membrana y permite
al fluido de muestra fluir a través de la pluralidad de capas
realizadas en forma de membranas apiladas verticalmente, siendo el
plano de cada una de las capas realizadas en forma de membranas
prácticamente perpendicular al eje geométrico longitudinal de la
cámara;
un depósito de reactivo y medios de suministro de
fluido dentro de la caja para suministrar reactivo del depósito de
reactivo a la primera abertura de la cámara alargada;
un depósito de tampón de lavado y segundos medios
de suministro de fluido dentro de la caja para suministrar tampón de
lavado del depósito de tampón de lavado a la primera abertura de la
cámara alargada; y
un sensor dentro de la caja para recibir una
señal procedente de la cámara alargada y generar una correspondiente
señal eléctrica.
A la luz de la anterior descripción, será
totalmente obvio para los expertos en la materia, es decir para
aquéllos que estén versados o experimentados en este campo de la
tecnología, que la presente invención aporta un importante avance
tecnológico. Realizaciones preferidas de la columna analítica
multicapas de la presente invención pueden proporcionar un mejorado
rendimiento de fijación, una incrementada área superficial para la
captura de los analitos de una muestra, y unos costes reducidos.
Estas características y ventajas adicionales de la invención que
aquí se describe se comprenderán mejor a la luz de la siguiente
descripción detallada de determinadas realizaciones preferidas.
Se describen detalladamente a continuación
determinadas realizaciones preferidas haciendo referencia a los
dibujos adjuntos, en los cuales:
La Fig. 1 es una vista esquemática en perspectiva
de un aparato de análisis multicapas según la presente
invención;
la Fig. 2 es una vista esquemática en alzado y
parcialmente en sección de una columna multicapas según la presente
invención;
la Fig. 3 es una vista esquemática en perspectiva
de una columna de capas realizadas en forma de membranas que está
destinada a ser introducida en la cámara filtradora multicapas de la
Fig. 2 y está formada a base de una pluralidad de hojas de sustrato
recubierto apiladas;
la Fig. 4 es una vista esquemática en sección de
una parte de la columna de capas realizadas en forma de membranas de
la Fig. 3;
la Fig. 5 es una representación esquemática del
aparato de análisis multicapas de la Fig. 1;
la Fig. 6 es una vista esquemática en perspectiva
de la caja de la columna multicapas de la Fig. 2, mostrándose en la
ilustración dicha caja de la columna multicapas introducida en un
depósito de desecho;
la Fig. 7 es una vista esquemática en
perspectiva, dibujada en parte con líneas de trazos, de una
realización alternativa de la caja y las capas realizadas en forma
de membranas de la columna multicapas de la Fig. 2, no siendo dicha
realización alternativa parte de la presente invención;
la Fig. 8 es una vista esquemática dibujada
parcialmente en sección de otra realización alternativa de la caja y
las capas realizadas en forma de membranas de la columna multicapas
de la Fig. 2;
la Fig. 9 es una vista esquemática en sección de
una realización alternativa de capas realizadas en forma de
membranas de la columna multicapas de la Fig. 2; y
la Fig. 10 es una vista esquemática en alzado de
un transportador que lleva columnas multicapas al aparato de
análisis multicapas de la Fig. 5.
Las figuras a las que se ha aludido anteriormente
no están necesariamente dibujadas a escala, y debe entenderse que
las mismas constituyen una representación de la invención que sirve
para ilustrar los principios de los que aquí se trata. Algunos
elementos característicos del aparato de análisis multicapas que se
ilustran en los dibujos han sido ampliados o deformados con respecto
a otros para facilitar la explicación y la comprensión. En los
dibujos se usan los mismos números de referencia para los
componentes y elementos característicos similares o idénticos que
son ilustrados en las distintas realizaciones alternativas. Los
aparatos de análisis multicapas que aquí se describen tendrán
configuraciones y componentes que vendrán determinados en parte por
la aplicación prevista y por el entorno en el que deban ser
usados.
Haciendo referencia a la Fig. 1, está ilustrada e
indicada en general en la misma con el número de referencia 1 una
máquina de análisis según la presente invención. La máquina de
análisis 1 comprende una caja 3 que tiene unos medios de montaje y
unos medios de transporte tales como una rueda giratoria de carga 5
que tiene entrantes 7 para admitir columnas alargadas 2 (de las que
se ve una en la Fig. 2 y que serán descritas más detalladamente más
adelante). La rueda de carga 5 permite que las de una pluralidad de
columnas 2 sean cargadas en la máquina de análisis 2 y sean
transportadas a las estaciones que se encuentran dentro de la
máquina de análisis 1 para el análisis de una muestra de fluido.
Otros adecuados medios de montaje y medios de transporte pueden
incluir, por ejemplo, una vía o correa transportadora o un brazo
asidor móvil que pueda trasladar una columna alargada entre las
estaciones en la máquina de análisis 1. A la luz de esta descripción
resultarán totalmente obvios para los expertos en la materia otros
adecuados medios de montaje y transporte. Las columnas alargadas
pueden ser, por ejemplo, dispositivos con forma de tubos de ensayo
que contengan en su interior membranas multicapas como las descritas
más adelante. La máquina de análisis 1 tiene un panel de control 9
para recibir información tal como información leída en etiquetas de
código de barras o datos introducidos por teclado, y un monitor 15
para visualizar información del funcionamiento de la máquina tal
como los resultados de análisis.
Está contenida dentro de la caja 3 una columna
analítica multicapas 2 como la que se ve en la Fig. 2. La columna
analítica 2 comprende una cámara cilíndrica alargada o caja 4 que
tiene un eje geométrico longitudinal L y contiene una pluralidad de
capas 6 realizadas en forma de membranas. Un receptáculo 8 está
situado encima de las capas 6 realizadas en forma de membranas. En
el extremo superior de la caja 4 está formada una abertura 10. En el
extremo inferior de la caja 4 está formada una abertura 12. Está
unido al extremo superior de la caja 4 un adaptador 11 para
pipetas.
Como se ve en la Fig. 3, las capas 6 realizadas
en forma de membranas son preferiblemente formadas a base de apilar
una pluralidad de hojas de membrana microporosa tipo filtro o
membranas de matriz de fibras. En el sentido en el que se la utiliza
en la presente, la expresión "membranas apiladas" se refiere a
una pluralidad de membranas superpuestas. Hay que tener en cuenta
que las membranas pueden estar desplazadas unas con respecto a
otras, y que las capas realizadas en forma de membranas pueden estar
distanciadas unas de otras por ejemplo por medio de capas
distanciadoras. En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "membrana microporosa tipo filtro" se
refiere a una membrana que proporciona un soporte sólido para un
antianalito y tiene una pluralidad de poros que permiten al fluido
de muestra fluir a través de la membrana y proporcionan una
incrementada área superficial para la unión del antianalito, así
como un incrementado número de sitios para la fijación del analito
al antianalito. En el sentido en el que se la utiliza en la
presente, la expresión "membrana de matriz de fibras" se
refiere a una membrana que está formada a base de una maraña de
fibras y es preferiblemente un género que proporciona un soporte
sólido para un antianalito y tiene una pluralidad de poros que
permiten al fluido de muestra fluir a través de la membrana y
proporcionan una incrementada área superficial para la unión del
antianalito, así como un incrementado número de sitios para la
fijación del analito al antianalito. Las capas realizadas en forma
de membranas son preferiblemente transparentes a la luz y en general
deberán ser apilables en una cámara. Los materiales adecuados para
la capa 6 realizada en forma de membrana incluyen la celulosa, la
nitrocelulosa, el copolímero acrílico, la polietersulfona, el
polietileno, el fluoruro de polivinilideno, el polímero, el nilón,
el plástico y el vidrio.
En el sentido en el que se le usa en la presente,
el vocablo "analito" se refiere a una sustancia que está
presente en una muestra de fluido, y a veces se alude al analito en
la presente llamándolo "analito objetivo" o "material
objetivo". Según determinadas realizaciones preferidas, los
ejemplos de analitos incluyen anticuerpos, antígenos, ligandos,
receptores de ligandos, otras proteínas y ácidos nucleicos. A la luz
de esta descripción resultarán totalmente obvios para los expertos
en la materia otros analitos adecuados. En el sentido en el que se
le utiliza en la presente, el vocablo "antianalito" se refiere
a una sustancia que reacciona específicamente con un analito que
está presente en una muestra de fluido o a la cual se fija un
analito que está presente en una muestra de fluido. Los ejemplos de
antianalitos incluyen anticuerpos, antígenos, ligandos, receptores
de ligandos, aptámeros, ácidos nucleicos capaces de hibridarse con
un ácido nucleico analito, analito inmunosorbente ligado a enzimas,
proteínas o fragmentos de proteínas que sean capaces de formar un
complejo con una proteína o un fragmento de proteína analito, y
compuestos químicos que sean capaces de tener actividad biológica
con un analito objetivo. A la luz de esta descripción, serán
totalmente obvios para los expertos en la materia otros adecuados
antianalitos. Las correspondientes parejas de analito y antianalito
incluyen, por ejemplo:
anticuerpo para el cual un típico antianalito
fuese un antígeno que se fije específicamente al anticuerpo
objetivo;
otras proteínas u otros fragmentos de proteínas
que sean capaces de formar un complejo con una proteína objetivo o
un fragmento de proteína objetivo;
ácido nucleico que sea capaz de hibridarse con un
ácido nucleico objetivo;
compuestos químicos que puedan ser potencialmente
capaces de actuar en un objetivo biológico ligado a una determinada
enfermedad; e
indicadores para constituyentes de la muestra o
condiciones de la muestra tales como el pH.
Los expertos en la materia comprenderán que los
anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos pueden fijarse a un
antígeno o a un fragmento de un antígeno, como p. ej. una proteína
objetivo, un lípido objetivo, un aminoácido objetivo, un grupo
fosfato objetivo, un carbohidrato objetivo, etc. Se entenderá
adicionalmente que típicamente un ácido nucleico objetivo de una
célula de la sangre, por ejemplo, sería primeramente extraído de la
célula de la sangre mediante cualquiera de varias técnicas
conocidas. Es posible, por ejemplo, sonicar una muestra o someterla
a extracción con detergente o a extracción orgánica. El lisado
resultante sería entonces inyectado al interior de una columna
analítica multicapas. Tal lisado puede o puede no contener aún
material de la pared celular y otros residuos celulares. Como se
expone más adelante, realizaciones preferidas de la columna
analítica multicapas de la invención emplean capas filtrantes para
separar por filtración tales residuos de la muestra de fluido que ha
sido inyectada o aportada de otra manera al interior de la columna
analítica multicapas.
Al menos algunas hojas están recubiertas con un
antianalito para servir de sustrato en fase sólida. La unión del
antianalito al sustrato puede ser efectuada por cualquier
procedimiento convencional, tal como por ejemplo el de absorción o
el de enlace covalente. Una superficie de membrana puede ser tratada
químicamente, y determinados antianalitos pueden ser ligados
químicamente al sustrato. Pueden ser sintetizados directamente sobre
una membrana compuestos químicos. Estos procedimientos son
perfectamente conocidos en la técnica, y no se considera que sean
necesarios adicionales detalles relativos a estas cuestiones para
una completa comprensión de la invención. En determinadas
realizaciones preferidas, el antianalito es biológicamente
activo.
El antianalito se une a la capa 6 realizada en
forma de membrana y proporciona sitios a los cuales se fija el
analito de una muestra de fluido. El antianalito que recubre las
capas 6 realizadas en forma de membranas proporciona preferiblemente
sitios de fijación específica. En el sentido en el que se la utiliza
en la presente, la expresión "sitios de fijación específica" se
refiere a sitios a los cuales se fija un analito específico o una
clase de analitos específica. La capa 6 realizada en forma de
membrana es entonces tratada con una sustancia o un reactivo
bloqueante para bloquear prácticamente los sitios de fijación
inespecífica en la capa realizada en forma de membrana. Así, el
antianalito sigue estando disponible para fijarse a un analito
objetivo, pero los sitios de fijación inespecífica están
prácticamente bloqueados. El reactivo bloqueante puede ser, p. ej.,
albúmina sérica bovina (BSA).
La pila de capas 6 realizadas en forma de
membranas es entonces cortada siendo así convertida en una
pluralidad de columnas 13 dimensionadas adecuadamente para encajar
dentro de la caja 4. En determinadas realizaciones preferidas, como
se ve en la Fig. 4, cada capa 6 realizada en forma de membrana
comprende preferiblemente una pluralidad de subcapas, que son
específicamente una capa apantalladora formada a base de una capa de
fotoabsorción 14 y una primera capa fotorreflectora 16 debajo de la
capa de absorción 14; una capa de captura 18 a la cual se une el
antianalito aplicado como recubrimiento; y una segunda capa
apantalladora formada a base de una segunda capa reflectora 20
debajo de la capa de captura 18 y una segunda capa de absorción 21
debajo de la segunda capa reflectora 20. En determinadas
realizaciones preferidas, cada capa apantalladora puede actuar como
una capa apantalladora para capas de captura situadas tanto encima
como debajo de la capa apantalladora. La capa de captura 18 es
prácticamente transparente a al menos determinadas longitudes de
onda de luz. La luz que es emitida por la capa de captura 18 (como
se describe más detalladamente más adelante) es prácticamente
reflejada al exterior de la capa 6 realizada en forma de membrana
por las capas reflectoras 16, 20 como se indica mediante las flechas
A. La capa de absorción 14 absorbe la luz emitida por la capa de
captura 18. Así, las capas reflectoras 16, 20 y la capa de absorción
14 impiden prácticamente que la luz que es emitida por la capa de
captura 18 entre en las capas de captura 18 de las capas 6
realizadas en forma de membranas adyacentes. Las capas 6 realizadas
en forma de membranas que son la más superior y la más inferior en
la caja 4 son preferiblemente capas filtrantes que impiden
prácticamente el paso de las partículas de gran tamaño, como son p.
ej. las células de la sangre, a otras capas 6 realizadas en forma de
membranas en la caja 4. Dichas capas no filtran o bloquean sin
embargo el flujo de otros analitos de menor tamaño de la muestra,
como son p. ej. los anticuerpos, etc., que son pasados a las capas
inferiores realizadas en forma de membranas para la fijación.
Determinadas capas 6 realizadas en forma de
membranas pueden estar tratadas solamente con un reactivo o
sustancia bloqueante para bloquear prácticamente los sitios de
fijación inespecífica y servir de capas de control negativo. En
condiciones de funcionamiento normales, las capas de control
negativo prácticamente no producen luz emitida. Si es emitida
bastante luz por una capa de control negativo, ello constituye una
indicación de que hay un problema dentro de la columna 2. Otras
capas 6 realizadas en forma de membranas pueden estar recubiertas
específicamente para actuar como capas de control positivo. En
condiciones de funcionamiento normales, una capa de control positivo
produce una luz emitida. Así, si las condiciones son distintas de
las normales, prácticamente no habrá luz emitida por la capa de
control positivo, lo cual indica que hay un problema dentro de la
columna 2. Las capas de control pueden ser usadas, por ejemplo, como
referencia para cuantificar la cantidad del analito en la muestra a
base de comparar la magnitud de la luz o señal generada por la capa
de control con la magnitud de la luz o señal generada por la capa de
captura. Esta relación funciona cuando la magnitud de la señal está
establecida para una cantidad de analito conocida. Las capas de
control pueden ser también usadas para identificar una marca
incorrecta y/o un reactivo incorrecto para indicar la contaminación
de la columna 2, o bien pueden servir como marcadores posicionales
entre las capas 6 realizadas en forma de membranas. Por ejemplo, en
una columna 2 que tenga cientos de capas 6 realizadas en forma de
membranas apiladas, podría estar situada una capa de control entre
cada diez capas 6 realizadas en forma de membranas, siendo con ello
reducida la probabilidad de error acumulado que podría producirse al
identificar incorrectamente una determinada capa realizada en forma
de membrana dentro de una larga serie de capas realizadas en forma
de membranas adyacentes.
La caja 4 es preferiblemente llenada con una
solución tampón para estabilizar las capas realizadas en forma de
membranas recubiertas. Típicamente, la solución tampón es retirada
de la caja 4 antes del uso. Las soluciones tampón adecuadas
incluyen, p. ej., tampones de fosfato suplementados con BSA.
Pasando ahora a la Fig. 5, puede apreciarse que
están ilustrados en la misma los componentes que están alojados
dentro de la caja 3 de la máquina de análisis 1. Un depósito de
muestra 25 está conectado mediante la válvula de control 23 y la
tubería 28 con el interior de la columna 2. En determinadas
realizaciones preferidas, el depósito de muestra 25 puede ser un
contenedor de muestras de fluido tal como un tubo de ensayo de los
que son típicamente usados para recoger una muestra de fluido, como
p. ej. la sangre de un paciente. Tal contenedor de muestra de fluido
o tubo de ensayo puede ser alojado en unos medios de montaje tales
como los entrantes 7 de la rueda de carga 5 anteriormente descrita.
La muestra de fluido puede ser retirada de un tubo de ensayo e
introducida en una columna multicapas 2 por medios de suministro de
fluido conocidos. Los ejemplos de los medios de suministro de fluido
incluyen, por ejemplo, una aguja de muestreo o punta de pipeta de
vacío que es conectada a un adaptador para pipetas e introducida en
un tubo de ensayo para aspirar fluido del tubo de ensayo; un brazo
móvil para trasladar la aguja a una columna multicapas 2; y una
fuente de presión para hacer que la muestra de fluido pase de la
aguja al interior de la primera abertura 10 de la caja 4 de la
columna multicapas 2. A la luz de esta descripción, resultarán
totalmente obvios para los expertos en la materia otros adecuados
medios de suministro de fluido.
En determinadas realizaciones preferidas, puede
estar prevista una rueda de carga 5 para manipular las columnas
multicapas 2, y puede estar prevista una rueda de carga 5 aparte
para manipular los tubos de ensayo o los otros contenedores de
muestras de fluido. Así, puede ser usada una sola rueda de carga, o
bien pueden ser usadas múltiples ruedas de carga 5 para transportar
una combinación de columnas multicapas 2 y contenedores de muestras
de fluido entre las distintas estaciones dentro de la máquina de
análisis 1. Los ejemplos de las estaciones que están dispuestas
dentro de la máquina de análisis 1 incluyen una estación de
manipulación de fluido donde la muestra de fluido es retirada de un
contenedor de muestra de fluido y transferida a una columna
multicapas, una estación de reactivo donde es añadido un reactivo a
la columna multicapas, una estación de lavado donde es añadido
tampón de lavado a la columna multicapas para retirar el analito no
fijado y/u otras partículas, y una estación detectora donde es
recibida la luz u otra señal procedente de la columna multicapas 2.
En otras realizaciones preferidas pueden ser llevados a cabo en una
sola estación múltiples pasos de procesamiento.
Un depósito de aire 24 está conectado a la
columna 2 por medio de la válvula de control 26 y de la tubería 28.
El depósito de tampón de lavado 30 está conectado a la columna 2 por
medio de la válvula de control 32 y de la tubería 28. El depósito de
reactivo 34 está conectado a la columna 2 por medio de la válvula de
control 36 y de la tubería 28. Es usado un sensor para recibir una
señal de la columna 2 y generar una correspondiente señal eléctrica.
En la realización ilustrada, el sensor comprende una fuente luminosa
38 y un sensor de luz 40. En determinadas realizaciones preferidas
está prevista una fuente de energía de excitación para dirigir
energía de excitación hacia la columna 2 para generar una señal de
la columna 2. En la realización ilustrada, la fuente de energía es
la fuente luminosa 38. En determinadas realizaciones preferidas, la
fuente de energía de excitación puede aplicar una diferencia de
voltaje a través de la columna alargada por medio de un par de
electrodos, no ilustrados. A la luz de esta descripción, resultarán
totalmente obvias para los expertos en la materia otras adecuadas
fuentes de energía de excitación.
La fuente luminosa 38 está situada junto a la
columna 2, estando el sensor de luz 40 situado junto a la columna 2
frente a la fuente luminosa 38. El sensor de luz 40 está conectado
mediante el cable 42 al ordenador 44 que está situado en la caja 3.
Los depósitos 25, 24, 30, 34 sirven para contener un adecuado
volumen de muestra, aire, tampón de lavado o reactivo. En
determinadas realizaciones preferidas, los depósitos contienen una
cantidad de muestra, aire, tampón de lavado o reactivo suficiente
para un solo análisis, y más preferiblemente dichos depósitos están
dimensionados para contener cantidades suficientes para múltiples
análisis. Los depósitos proporcionan un suministro de al menos una
parte de sus contenidos que puede ser suministrada a la columna 2 a
través de una tubería, lo cual es opcionalmente regulado mediante
una válvula de control. A la luz de esta descripción, resultarán
totalmente obvios para los expertos en la materia los depósitos
adecuados.
El depósito o recipiente de desecho 46 está
situado debajo de la columna 2 para recibir el flujo que sale por la
abertura 12. En determinadas realizaciones preferidas, como se ve en
la Fig. 6, el recipiente de desecho 46 es conectado directamente al
extremo inferior de la caja 4 con el collar 48. En el collar 48
están formadas acanaladuras 50 para permitir el paso de aire al
interior de la columna 2 y desde la misma al exterior.
Se describe a continuación con respecto a la Fig.
5 el funcionamiento de la máquina de análisis 1. Como se ha señalado
anteriormente, desde el depósito de muestra 25 es introducida en el
interior de la columna 2 una muestra, como por ejemplo una muestra
de sangre. Desde el depósito de aire 24 y a través de la tubería 28
es introducido aire al interior de la columna 2. La bomba 52 está
conectada al depósito de aire 24 por medio de la tubería 54 para
variar la presión de aire en el depósito 24. La presión de aire en
la columna 2 es variada alternativamente pasando de un valor
positivo a un vacío, haciendo que la muestra fluya hacia arriba y
hacia abajo a través de las capas 6 realizadas en forma de
membranas. Cada capa de captura 18 de las capas 6 realizadas en
forma de membranas que tiene aplicado a la misma como recubrimiento
un antianalito fija un específico analito, como p. ej. un específico
antígeno, anticuerpo, ligando o receptor, etc., que esté presente en
la muestra. El caudal de la muestra a través de la columna 2 es
regulado a fin de mejorar su rendimiento de fijación. La fijación es
también incrementada debido al hecho de que la probabilidad de que
los analitos que están presentes en la muestra se encuentren con los
sitios de fijación que están presentes en la capa de captura 18 se
ve incrementada con las múltiples pasadas de la muestra a través de
la columna 2.
Entonces puede ser introducido en el interior de
la columna 2 tampón de lavado del depósito 30 para retirar o lavar
los analitos no fijados evacuándolos así de la columna 2 a través de
la abertura 12 y al interior del recipiente de desecho 46. Entonces
es introducido en el interior de la columna 2 reactivo del depósito
34. El reactivo (como p. ej. un segundo anticuerpo) está conjugado
con una marca detectable que proporciona una identificación del
específico analito que está presente en la muestra. Las marcas
adecuadas incluyen, por ejemplo, marcas enzimáticas y marcas
luminiscentes tales como marcas quimioluminiscentes o marcas
fluorescentes. El reactivo marcado es fijado a los analitos
capturados a base de pasar el reactivo marcado a través de la
columna 2 de manera similar a lo descrito anteriormente con respecto
a la muestra. El flujo de reactivo a través de la cámara es por
consiguiente también regulado para mejorar su rendimiento de
fijación. Puede ser introducido de nuevo tampón de lavado para
evacuar por lavado todo el reactivo marcado que no se haya
fijado.
En determinadas realizaciones preferidas, el
reactivo tiene una marca radiactiva. En una realización de este tipo
se emplea un sensor para detectar la radiación que emana de
determinadas capas 6 realizadas en forma de membranas. Es evidente
que todo sensor de este tipo deberá ser lo suficientemente sensible
como para distinguir entre la radiación que emana de las distintas
capas 6 realizadas en forma de membranas. En otras realizaciones
preferidas, el reactivo tiene una marca fluorescente, en cuyo caso
se requiere otra fuente luminosa para que el reactivo marcado emita
luz. En ese caso, la fuente luminosa 38 es usada para proyectar luz,
como p. ej. una luz láser de una específica longitud de onda, al
interior de la columna 2 para excitar al reactivo marcado fijado
para producir una luz emitida. En cualquier caso, la capa de captura
18 emite luz que tiene una específica longitud de onda. El sensor de
luz 40 explora cada capa 6 realizada en forma de membrana en la
columna 2, detectando la ubicación de cada uno de los analitos
capturados sobre la base de la longitud de onda de su luz emitida, a
la manera de un lector de códigos de barras. Entonces es transmitida
al ordenador 44 para su análisis una señal desde el sensor de luz 40
a través del cable 42. Con el reactivo marcado fijado al analito
capturado, el sensor de luz 40 y el ordenador 44 son capaces de
detectar la presencia y la cantidad de los distintos analitos
capturados en las distintas capas 6 realizadas en forma de
membranas.
En otras realizaciones preferidas, el reactivo
puede tener una marca electroquimioluminiscente, en cuyo caso es
aplicado un voltaje a la columna 2, lo cual redunda en una luz
emitida de una específica longitud de onda que emana del reactivo
marcado fijado que está presente en las capas de captura 18 de las
capas 6 realizadas en forma de membrana.
En otras realizaciones preferidas, la marca puede
constar de dos partes, siendo la primera parte unida al antianalito
que está presente en la capa de captura 18, y siendo la segunda
parte conjugada con el reactivo. La marca emitirá luz solamente
cuando estén suficientemente cerca una de otra las partes primera y
segunda. Un ejemplo de una primera parte adecuada es el criptato de
europio. Un ejemplo de una segunda parte adecuada es la
aloficocianina. Si un analito presente en la muestra se ha fijado a
la capa de captura 18 y si el reactivo se ha fijado a su vez al
analito de la muestra, las partes primera y segunda serán lo
suficientemente cercanas como para crear luz emitida de una
específica longitud de onda. Como se ha descrito anteriormente, la
luz puede ser emitida directamente, o bien puede requerirse otra
fuente luminosa o un voltaje aplicado a fin de crear la luz emitida.
En consecuencia, la presencia del analito será identificada por la
luz emitida.
En determinadas realizaciones preferidas, el
tampón de lavado y el reactivo pueden ser añadidos a la columna 2
manualmente en lugar de desde depósitos controlados por válvulas y/o
por un ordenador u otro controlador adecuado. Análogamente, la
muestra puede ser añadida a la columna 2 de manera manual, o bien
bajo el control de un ordenador u otro controlador adecuado.
Un aparato de análisis multicapas según la
presente invención puede ser usado, por ejemplo, para analizar
muestras de sangre y para seleccionar compuestos químicos en busca
de actividad biológica para descubrir drogas. Los análisis que
pueden ser efectuados en una muestra de sangre usando la presente
invención incluyen, por ejemplo, análisis para determinar la
presencia de virus, antígenos, anticuerpos, proteínas, enzimas, etc.
en la sangre, tales como los análisis para determinar la presencia
del Antígeno de Superficie de la Hepatitis B (HbsAg), del Anticuerpo
de la Hepatitis C (HCV) y del HIV (HIV = virus de la
inmunodeficiencia humana). Los compuestos químicos pueden ser
sintetizados directamente sobre una membrana. Entonces pueden ser
formadas columnas multicapas, y las mismas pueden ser usadas para
detectar la actividad biológica de los compuestos con una proteína
objetivo que esté vinculada a una enfermedad y esté presente en una
muestra de fluido a analizar. Gracias al hecho de que se dispone de
múltiples capas distintas, pueden ser efectuados simultáneamente
múltiples análisis en una sola muestra de fluido, con lo cual son
incrementados la productividad y el rendimiento total y son
reducidos los costes. El número de capas de membrana 6 puede ser de
decenas, centenas, miles o más.
El uso de un capa realizada en forma de membrana
microporosa proporciona un área superficial mayor que la de una
placa de microtitulación, y por consiguiente la sensibilidad de los
análisis se ve enormemente incrementada puesto que la sensibilidad
es proporcional a la superficie de captura. La sensibilidad puede
ser también incrementada mediante el uso de marcas tales como marcas
quimioluminiscentes.
La presente invención es adecuada para ser usada
en procesos de pasos múltiples, como p. ej. en procesos de dos
pasos. Un ejemplo de un proceso de dos pasos es un inmunoanálisis
ligado a enzimas (ELISA). En un proceso de este tipo, un antianalito
es unido a una capa de captura de una columna multicapas tal como se
ha descrito anteriormente en conexión con las Figs. 3, 4. La columna
es entonces expuesta a una muestra, como p. ej. la sangre de un
paciente, de tal manera que el analito que está presente en la
muestra puede fijarse al antianalito. La columna es entonces lavada
con un tampón para retirar el analito no fijado, usando, p. ej. en
la realización anteriormente descrita, solución tampón del depósito
de tampón de lavado 30. La columna es entonces expuesta a un
reactivo, p. ej. del depósito de reactivo 34, que lleva el mismo
antianalito como el aplicado como recubrimiento a la capa de captura
o un antianalito distinto, que se fija específicamente al analito.
En una realización preferida, el reactivo está marcado con una mitad
detectable. Las mitades detectables incluyen, por ejemplo marcas
enzimáticas, marcas radiactivas, marcas fluorescentes y marcas
quimioluminiscentes que son fijadas al reactivo. Opcionalmente, la
columna puede ser lavada de nuevo usando, por ejemplo, una solución
tampón tal como tampón de lavado del depósito de tampón de lavado
30. Entonces es usado un sensor para detectar la presencia y/o
cantidad de analito en la muestra como se ha descrito
anteriormente.
En determinadas realizaciones preferidas puede
usarse para controlar automáticamente la máquina de análisis 1 y sus
componentes un sistema de control programable, como p. ej. un
ordenador universal con un adecuado soporte lógico informático de
control o un módulo que constituya un ordenador dedicado dentro de
la caja 3. Por ejemplo, el ordenador 44 puede ser usado para
controlar el funcionamiento de las válvulas 23, 26, 32 y 36 a través
de los cables 55, 56, 58 y 60, respectivamente. El ordenador 44
puede ser también usado para controlar el funcionamiento de la
fuente luminosa 38 a través del cable 62. Los expertos en la materia
serán perfectamente capaces de prever el soporte lógico informático
de control y el soporte físico adecuados para controlar la máquina
de análisis 1.
En determinadas realizaciones preferidas, puede
estar incluido dentro de la caja 3 un dispositivo centrífugo para
proporcionar la fuerza necesaria para generar el flujo de muestra a
través de las membranas multicapas de una columna multicapas.
En determinadas realizaciones preferidas, la
máquina de análisis 1 tiene un dispositivo regulador de la
temperatura. Unos medios reguladores de la temperatura calientan y/o
enfrían una columna multicapas. Debe entenderse que la temperatura
de la columna multicapas puede ser regulada directamente, tal como
con un sensor de temperatura que detecta la temperatura de la
columna multicapas y mantiene una temperatura correspondiente al
valor establecido. Como alternativa, la temperatura de la columna
multicapas podría ser regulada indirectamente a base de detectar y
regular la temperatura de una zona en la que esté alojada la columna
multicapas. Los medios reguladores de la temperatura pueden incluir
un elemento calefactor, y pueden también incluir un dispositivo
refrigerador. A la luz de esta descripción serán totalmente obvios
para los expertos en la materia otros adecuados medios reguladores
de la temperatura.
Opcionalmente, como se ve en la Fig. 10, las de
una serie de columnas 2 o los de una serie de contenedores de
muestras de fluido pueden ser transportadas o transportados por una
vía o correa transportadora 90 (que está aquí representada
esquemáticamente) o por medios similares entre las distintas
estaciones dentro de la máquina de análisis 1 para analizar
distintas muestras de los mismos fluidos o de fluidos distintos.
Otros medios para transportar las columnas multicapas 2 y los
contenedores de muestras de fluido incluyen, por ejemplo, brazos
móviles que pueden asir y sujetar las columnas 2 y los contenedores
de muestras de fluido.
Está ilustrada en la Fig. 7 otra realización que
no es parte de la presente invención. Sobre un solo sustrato planar
68 son formadas capas 66 realizadas en forma de membranas a base de
recubrir distintos segmentos del sustrato planar 68 con distintos
antianalitos de manera conocida. El sustrato planar 68 es puesto en
la caja 70 de forma tal que el plano del sustrato 68 es
prácticamente paralelo a un eje geométrico longitudinal L de la caja
70. La caja 70 es usada en un aparato de análisis como se ha
descrito anteriormente. Las capas 66 realizadas en forma de
membranas pueden ser marcadas con un colorante para diferenciar una
capa 66 realizada en forma de membrana de otra. En otra realización
preferida, los específicos antígenos o anticuerpos de las capas
realizadas en forma de membranas pueden ser puestos directamente
sobre la superficie interior de la caja 70, la cual sirve entonces
de sustrato.
Está ilustrada en la Fig. 8 otra realización
preferida en la que las capas 76 realizadas en forma de membranas
son formadas sobre un sustrato 78. El sustrato 78 es plegado a la
manera de un acordeón dentro de la caja 80. Cada capa 76 realizada
en forma de membrana queda por consiguiente a un ángulo oblicuo con
respecto al eje geométrico longitudinal Y de la caja 80. El aparato
de análisis multicapas de la Fig. 8 es usado en un aparato de
análisis como se ha descrito anteriormente. Debe entenderse que en
determinadas realizaciones preferidas las capas 76 realizadas en
forma de membranas que están situadas en las partes superior e
inferior del sustrato 78 pueden actuar como capas filtrantes como se
ha descrito anteriormente.
Está ilustrada en la Fig. 9 otra realización
preferida en la que ha sido eliminada por corte una parte 86 de cada
capa 88 realizada en forma de membrana, estando cada parte 86 al
menos parcialmente superpuesta a las partes 86 adyacentes de forma
tal que queda formado un conducto que pasa por las capas 88
realizadas en forma de membranas, a través de cuyo conducto puede
fluir directamente la muestra de fluido.
Claims (23)
1. Columna multicapas que comprende, en
combinación:
una cámara que tiene un eje geométrico
longitudinal con un primer extremo que tiene una primera abertura;
y
una pluralidad de capas realizadas en forma de
membranas microporosas tipo filtro prácticamente planares apiladas
verticalmente que están apiladas dentro de la cámara e incluyen al
menos una pluralidad de sustratos en fase sólida que llevan cada uno
un distinto antianalito, teniendo cada capa realizada en forma de
membrana una pluralidad de poros que permite al fluido de muestra
fluir a través de cada capa realizada en forma de membrana y permite
al fluido de muestra fluir a través de la pluralidad de capas
realizadas en forma de membranas apiladas verticalmente, siendo el
plano de cada una de las capas realizadas en forma de membranas
prácticamente perpendicular al eje geométrico longitudinal de la
cámara.
2. Columna multicapas según la reivindicación 1,
en la que cada una de las capas realizadas en forma de membranas
comprende una membrana de matriz de fibra.
3. Columna multicapas según la reivindicación 1,
en la que las capas realizadas en forma de membranas son
prácticamente transparentes a luz de al menos una longitud de onda
seleccionada.
4. Columna multicapas según la reivindicación 1,
en la que cada una de las de una pluralidad de capas realizadas en
forma de membranas comprende una capa de captura que lleva
antianalito y al menos una capa fotoapantalladora que es
prácticamente coplanar con la capa de captura.
5. Columna multicapas según la reivindicación 4,
en la que al menos una de las capas fotoapantalladoras incluye una
subcapa de fotoabsorción.
6. Columna multicapas según la reivindicación 4,
en la que al menos una de las capas fotoapantalladoras incluye una
subcapa fotorreflectora.
7. Columna multicapas según la reivindicación 1,
en la que al menos los de una pluralidad de los sustratos en fase
sólida llevan una sustancia bloqueante.
8. Columna multicapas según la reivindicación 1,
en la que prácticamente todas las superficies dentro de la cámara
llevan una sustancia bloqueante.
9. Columna multicapas según la reivindicación 1,
en la que las capas realizadas en forma de membranas que son las más
extremas de las de la pluralidad de capas realizadas en forma de
membranas son capas filtrantes que tienen poros dimensionados para
impedir prácticamente el flujo de partículas de un tamaño
preseleccionado a las capas realizadas en forma de membranas
centrales de la pluralidad de capas realizadas en forma de
membranas.
10. Columna multicapas según la reivindicación 1,
en la que las capas realizadas en forma de membranas están
distanciadas axialmente unas de otras a lo largo del eje geométrico
longitudinal.
11. Columna multicapas según la reivindicación 1,
que comprende además una solución tampón contenida dentro de la
cámara.
12. Columna multicapas según la reivindicación 1,
en la que la cámara tiene una segunda abertura en un segundo extremo
de la misma.
13. Columna multicapas según la reivindicación
12, que comprende además un depósito de desecho que está en
comunicación fluídica con la segunda abertura de la cámara.
14. Columna multicapas según la reivindicación 1,
que comprende además una abertura para el flujo de fluido para
proporcionar una vía para el flujo de salida de fluido desde el
interior de la cámara.
15. Columna multicapas según la reivindicación 1,
en la que cada uno de los antianalitos es seleccionado de entre los
miembros del grupo que consta de anticuerpos, antígenos, ligandos,
receptores de ligandos, ácidos nucleicos capaces de hibridarse con
un ácido nucleico analito, analito inmunosorbente ligado a enzimas,
proteínas o fragmentos de proteínas capaces de formar un complejo
con una proteína analito o un fragmento de proteína analito, y
compuestos químicos capaces de tener actividad biológica con un
analito objetivo.
16. Aparato de análisis de fluidos que comprende,
en combinación:
una caja;
medios de montaje dentro de la caja para admitir
una cámara alargada;
una cámara alargada que queda montada en los
medios de montaje y tiene una primera abertura en un primer extremo
de la misma y una pluralidad de capas realizadas en forma de
membranas microporosas tipo filtro prácticamente planares apiladas
verticalmente que están apiladas dentro de la cámara e incluyen al
menos una pluralidad de sustratos en fase sólida que llevan cada uno
un distinto antianalito, teniendo cada capa realizada en forma de
membrana una pluralidad de poros que permite al fluido de muestra
fluir a través de cada capa realizada en forma de membrana y permite
al fluido de muestra fluir a través de la pluralidad de capas
realizadas en forma de membranas apiladas verticalmente, siendo el
plano de cada una de las capas realizadas en forma de membranas
prácticamente perpendicular al eje geométrico longitudinal de la
cámara;
un depósito de reactivo y medios de suministro de
fluido dentro de la caja para suministrar reactivo del depósito de
reactivo a la primera abertura de la cámara alargada;
un depósito de tampón de lavado y segundos medios
de suministro de fluido dentro de la caja para suministrar tampón de
lavado del depósito de tampón de lavado a la primera abertura de la
cámara alargada; y
un sensor dentro de la caja para recibir una
señal procedente de la cámara alargada y generar una correspondiente
señal eléctrica.
17. Aparato de análisis de fluidos según la
reivindicación 16, que comprende además un ordenador que actúa en
respuesta a la señal eléctrica generada por el sensor.
18. Aparato de análisis de fluidos según la
reivindicación 16, que comprende además un sistema de manipulación
de fluido que comprende unos medios de montaje de contenedores de
muestras para montar al menos un contenedor de muestra de fluido, y
medios de suministro de muestra de fluido para suministrar muestra
de fluido del contenedor de muestra de fluido a una cámara alargada
montada en los medios de montaje.
19. Aparato de análisis de fluidos según la
reivindicación 18, en el que los medios de montaje de contenedores
de muestras de fluidos contienen simultáneamente una pluralidad de
contenedores de muestra de fluido, y los medios de suministro de
muestra de fluido están adaptados para suministrar secuencialmente
muestra de fluido de cada uno de los contenedores de muestra de
fluido a una correspondiente cámara alargada.
20. Aparato de análisis de fluidos según la
reivindicación 16, que comprende además una fuente de energía de
excitación dentro de la caja para dirigir energía de excitación
hacia la cámara alargada.
21. Aparato de análisis de fluidos según la
reivindicación 20, en el que la fuente de energía de excitación
comprende una fuente luminosa que está orientada para iluminar al
menos una de las capas realizadas en forma de membranas en la
columna alargada con luz de una longitud de onda preseleccionada,
respondiendo al menos una de las capas realizadas en forma de
membrana en la cámara alargada a la longitud de onda
preseleccionada.
22. Aparato de análisis de fluidos según la
reivindicación 20, en el que la fuente de energía de excitación
aplica una diferencia de voltaje a través de la cámara alargada.
23. Aparato de análisis de fluidos según la
reivindicación 16, que comprende además una fuente de presión
variable que está conectada funcionalmente a la primera
abertura.
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