ES2213580T3 - Nuevo ensayo para determinar la atpasa. - Google Patents

Nuevo ensayo para determinar la atpasa.

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ES2213580T3 ES00938421T ES00938421T ES2213580T3 ES 2213580 T3 ES2213580 T3 ES 2213580T3 ES 00938421 T ES00938421 T ES 00938421T ES 00938421 T ES00938421 T ES 00938421T ES 2213580 T3 ES2213580 T3 ES 2213580T3
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Abstract

Un método para detectar y medir el ortofosfato (PI) marcado radiológicamente en una mezcla acuosa de reacción, que comprende las etapas de: a. añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción en condiciones ácidas para formar un complejo de fosfomolidabto; y b. poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación; con lo que la fijación de fosfomolibdato a dicha superficie proporciona una proximidad suficiente para que el fosfato marcado radiológicamente induzca una escintilación medible del agente de escintilación, que se correlaciona con la cantidad de dicho ortofosfato.

Description

Nuevo ensayo para determinar la ATPasa.
Campo del invento
El presente invento se refiere a un nuevo ensayo para determinar la ATPasa. Este invento se refiere particularmente a un nuevo método para la detección y la medición de la cantidad de ortofosfato que se libera por hidrólisis de ATP (adenina-trifosfato) o de cualquier otra molécula que contenga radicales de fosfato. Más particularmente, este invento se refiere a un método para la medición de la actividad como ATPasa de la enzima helicasa de E1 procedente de los virus del papiloma humano (HPV).
Antecedentes del invento Enfermedad asociada con los HPV
Los papilomavirus humanos (HPV's) son pequeños virus de ADN que infectan a células de la epidermis cutánea y mucosal. Se han caracterizado más de 80 diferentes genotipos de HPV. Algunos tipos, tales como los HPV-1,
-2, -3, -4 y -10, causan lesiones cutáneas conocidas como verrugas o papilomas. Estas acrescencias son benignas y autolimitadoras, y se encuentran en las manos y los pies de un 7-10% de la población general. Presentan una mayor preocupación médica los tipos de HPV que infectan al tracto anogenital. Estos genotipos se designan ya sea como de "bajo riesgo" o como de "alto riesgo" basándose en su correlación con una progresión maligna.
Los denominados HPV's de bajo riesgo están asociados con verrugas genitales, tambien conocidas como condilomas acuminados. Por ejemplo, los tipos 6 y 11 de HPV se encuentran en más de un 90% de las lesiones genitales benignas, y se asocian muy raramente con una transformación maligna. Sin embargo, éstos representan no obstante un grave problema para la salud pública. Aproximadamente un 1% de los adultos activos sexualmente que habitan en los EE.UU. tienen verrugas genitales visibles, pero en muchos más casos la infección es sub-clínica. De hecho, más del 15% estimado de la población con 15-49 años presenta evidencia molecular de una infección causada por los HPV, en la forma de un ADN vírico detectable por un ensayo de reacción en cadena de polimerasa (PCR, de Polymerase Chain Reaction). Desde luego, un HPV se clasifica como el agente vírico transmititido sexualmente, más corriente en los EE.UU y en el Reino Unido (R.U.), y su incidencia está aumentando constantemente.
Una infección con los tipos de HPV's de alto riesgo, tales como los 16, 18, 31 y 33, ha sido vinculada en gran manera con el desarrollo de maligninades anogenitales, del modo más notable de un cáncer cervical. De hecho, los tipos 16 y 18 de HPV, mientras que raramente se encuentran en lesiones genitales benignas, son detectables en aproximadamente un 70% de los carcinomas invasivos del cuello uterino. La vinculación entre los HPV y un cáncer anogenital está bien demostrada documentalmente - recientes estudios han encontrado que casi un 90% de los carcinomas cervicales contienen ADN de HPV.
Terapias actuales y la necesidad de un tratamiento específico para los virus
A pesar de la penetrabilidad y difusibilidad de una infección causada por los HPV, y de sus posibles consecuencias amenazadoras de la vida, no se ha descrito todavía hasta ahora ningún agente inhibidor que sea específico para estos virus. El descubrimiento de fármacos antivíricos para los HPV ha probado ser bastante difícil hasta ahora, como resultado de las dificultades encontradas para propagar los virus en el laboratorio.
Todas las terapias actuales para una infección causada por los HPV recurren a la destrucción o eliminación inespecífica de un tejido infectado. Los procesos quirúrgicos aceptados incluyen el uso de hielo seco, nitrógeno líquido, una terapia con láser de CO_{2}, una electrocauterización o una extirpación local. Se utilizan también para destruir un tejido diversos agentes citotóxicos, tales como ácido salicílico, ácido tricloro-acético, podofolina, colquicina, bleomicina y cantaridina.
Mientras que el riesgo de presentación de un cáncer hace que estos procesos sean sumamente prudentes para el tratamiento de los HPV's de alto riesgo, se están buscando tratamientos menos invasivos para manipular los genotipos de bajo riesgo. Se han investigado compuestos que estimulan el sistema inmunitario, con la meta de reproducir la regresión espontánea que frecuentemente se observa con lesiones benignas. El imiquimod, que es uno de tales agentes modificadores de la respuesta inmunitaria, ha pasado recientemente de manera satisfactoria las pruebas clínicas y ha sido aprobado para el tratamiento de verrugas genitales asociadas con los HPV.
Los pacientes con verrugas genitales experimentan frecuentemente altas tasas de recurrencia -usualmente de 30-90%- a continuación de tratamientos inespecíficos tales como una operación quirúrgica. Dicha mala eficiencia es un resultado de la eliminación incompleta de los ADN de HPV, o la presencia de virus en un tejido con aspecto normal adyacentemente al papiloma. Evidentemente, existe una necesidad sustancial de una terapia específica para los virus, que sea eficaz para una infección causada por los HPV, que hasta ahora no se ha satisfecho.
Replicación de ADN vírico y E1
La replicación semi-conservativa de los ADN es un proceso intrincado, mediado por muchas enzimas y proteínas accesorias. Las helicasas son enzimas que funcionan durante una replicación de ADN, catalizando el desenrrollamiento de un ADN duplex delante de la bifurcación de replicación. Estas enzimas son muy corrientes en células procarióticas y eucarióticas, así como en la mayor parte de los virus. El mecanismo exacto por el que las helicasas convierten la fijación y la hidrólisis del ATP en energía mecánica con el fin de impulsar el desenrollamiento de un ADN y su propio movimiento simultáneo a lo largo del sitio del ácido nucleico, no se ha comprendido todavía de un modo completo.
La proteína E1 procedente de HPV con un tamaño de 72 kDa ha sido clasificada como un miembro de la superfamilia III de las helicasas junto con el antígeno T del Virus de Simio 40 (del inglés Simian Virus 40 SV40 TAg), con el que éste es homólogo en los aspectos estructural y funcional. La E1 y el TAg pertenecen a un subgrupo digno de atención de helicasas de ADN víricos, que tienen la capacidad de reconocer y fijar secuencias específicas de ADN junto al origen vírico de replicación (ori). También, aunque la mayor parte de las helicasas de ADN requieren una región de ADN monocatenario para su entrada, estas proteínas pueden iniciar un desenrollamiento a partir de un ADN completamente bicatenario, con la condición de que éste contenga un ori.
Sucesos moleculares que se desarrollan junto al origen de replicación de HPV
Los papilomavirus humanos contienen aproximadamente 8 kb (kilobases) de un ADN circular bicatenario. En las células basales de la epidermis, el genoma es replicado y mantenido extra-cromosomalmente a un nivel de estado estable de aproximadamente 20-100 copias por célula. Una amplificación a alto nivel del genoma solamente se produce una vez que la célula se ha diferenciado terminalmente y ha migrado a las capas superiores del epitelio.
En un sistema de replicación de ADN exento de células, la proteína E1 puede dirigir por si misma una replicación de ADN de un modo específico para el origen, en concentraciones suficientes, cuando es provista con el complemento completo de las proteínas de replicación en hospedantes, inclusive la enzima primasa á de polimerasa de ADN. Sin embargo, la replicación es estimulada en gran manera por la proteína E2 vírica, y en concentrciones límites de E1 la replicación in vitro se vuelve completamente dependiente de la E2. Ésta es una consecuencia de que la E1 tiene una afinidad relativamente baja para su sitio de fijación a un ADN. La E2 ayuda a localizar a la E1 en el origen, al actuar como una proteína accesoria. Los sitios de fijación de las E1 y E2 junto al ori vírico están situados en estrecha proximidad, cayendo dentro de una distancia de aproximadamente 100 pb (pares de bases) una de otra. El extremo terminal de carboxi de la E2 fija a su sitio palindrómico en un ADN, mientras que el extremo terminal de amino fija la E1, llevando de esta manera a la E1 a su sitio de fijación.
E1 como una diana para una terapia antivírica
Recientemente, ciertas compañías farmacéuticas han sido capaces de expandir y acelerar sustancialmente sus programas de escrutinio de compuestos antivíricos, como una consecuencia de los avances en la biología molecular. Los virus se están examinando actualmnente de una manera rutinaria al nivel molecular para encontrar agentes inhibidores específicos de productos génicos codificados por los virus.
Para diversos virus, las enzimas tales como las polimerasas, cinasas y proteasas, han constituido dianas para inhibición. En contraste con ello, de las aproximadamente 8 proteínas distintas que son codificadas por el genoma de los HPV, la helicasa de E1 es la única que tiene actividad enzimática (Fields y colaboradores, 1996, Fields Virology, 3ª edición, Lippincott-Raveri, Filadelfia, Capítulo 65 y referencias allí citadas). La E1 despliega una actividad de fijación a ADN, una actividad de fijación a E2, una actividad como ATPasa y una actividad como helicasa de ADN, que son específicas para ori, todas las cuales se pueden ensayar de manera independiente para descubrir agentes inhibidores potenciales. Además, ésta es la proteína más altamente conservada de todas las proteínas de papilomavirus, por lo que un agente inhibidor de E1 sería probablemente eficaz contra múltiples tipos de HPV.
Se conocen escrutinios de alto rendimiento total, que permiten el descubrimiento de agentes inhibidores de la actividad como helicasa de E1 (documento de solicitud de patente internacional WO 99/57283, del 11 de Noviembre de 1999). Incluso aunque se necesita el ATP para impulsar la actividad como helicasa de la E1, y éste se incluye en la reacción, este ensayo para determinar la helicasa no se puede usar con el fin de identificar agentes inhibidores competitivos de la función de ATPasa que posee la E1. Éste es un resultado directo de una K_{m} muy baja de la ATPasa, por ejemplo de aproximadamente 10 \muM para la E1 de HPV-11, y del hecho de que el ensayo para determinar la helicasa se realiza rutinariamente con 300 \muM - 1 mM de ATP). Debe desarrollarse un ensayo más sensible si el sitio de fijación a ATP de la E1 ha de ser destinado como diana para inhibición.
Ensayos existentes para determinar la ATPasa
La actividad como helicasa está asociada siempre virtualmente con una actividad como trifosfatasas de nucleósidos (Matson y colaboradores, Ann. Rev. Biochem., 1990, 59, 289). Una hidrólisis enzimática del ATP ha sido medida por una diversidad de métodos, inclusive reacciones colorimétricas; en todos los casos, se realizan reacciones enzimáticas de acuerdo con protocolos específicos para ciertas enzimas, en los que las condiciones de reacción no son dependientes del proceso de detección (excepto en lo que se refiere a la inclusión de ATP marcado radiológicamente). El proceso de detección difiere para los diferentes ensayos de las siguientes maneras:
TLC: La inclusión de [\alpha-^{33}P] o [\gamma-^{33}P]ATP en el substrato para una reacción con la ATPasa da como resultado la liberación de fosfato o de ADP (= adenina - difosfato) marcado radiológicamente. A causa de su diferente polaridad, los ATP, ADP y el fosfato, marcados con [^{33}P], se pueden separar también mediante cromatografía de capa fina (de thin layer chromatograpy, abreviadamente TLC) (Bronnikov y colaboradores, Anal. Biochem., 1983, 131, 69) en un disolvente en funcionamiento (p.ej. una mezcla de cloruro de litio y ácido fórmico). Las dos especies químicas migran a diferentes distancias en una placa de TLC, basándose en sus afinidades relativas para la fase móvil polar y para la fase sólida no polar. Los resultados son analizados por recuento de la escintilación o por análisis en un reproductor de imágenes fosforescentes (PhosphorImager).
Aunque el ensayo por TLC para realizar la cuantificación del fosfato puesto en libertad produce datos exactos acerca de la actividad y la inhibición de la ATPasa, éste es inapropiado para el escrutinio a gran escala de agentes inhibidores potenciales. La extensión en motas y el funcionamiento de grandes números de placas de TLC son procesos largos y vinculados con un intenso trabajo. Se necesita un método que se preste al formato de placas de 96 pocillos y a una rápida cuantificación si un ensayo para determinar la ATPasa ha de ser ejecutado en un formato de HTS (de High Throughput Scrutiny = escrutinio de alto rendimiento total).
Carbón vegetal: El ATP se fija a un carbón vegetal, pero el ortofosfato no lo hace (Zimmerman y colaboradores J. Biol. Chem. 1961, 236 (5), 1.480). Por lo tanto, si una reacción serealiza usando ATP marcado con partículas \gamma, y se añade carbón vegetal, el material de partida es adsorbido, pero el producto permanece en solución. Puede realizarse esto en forma de un ensayo en placas de 96 pocillos por filtración de soluciones a través de placas de filtros que contienen carbón vegetal, y por recuento de la circulación a su través. No es probable que esto sea reproducible en alto grado, y no se puede someter a un escrutinio robotizado.
Ensayos con enzimas acopladas: Existe un cierto número de procesos relacionados, en los que otra reacción se lleva a cabo con el producto de fosfato mediante una segunda enzima (Rieger y colaboradores, 1997, Anal. Biochem. 246, 86 y las referencias allí contenidas). Estos ensayos son muy útiles para estudios cinéticos, puesto que se genera continuamente un cambio de absorbencia en el curso del ensayo, por lo que el curso de la reacción se puede vigilar sin sacar partes alícuotas, como es necesario para los otros métodos anteriores (la distinción entre ensayos continuos y de tiempo de detención (stop-time)). Estos métodos, sin embargo, no son significativamente más sensibles que el ensayo con molibdato (reseñado seguidamente), y los resultados de los escrutinios serían complicados adicionalmente por la posibilidad de falsos resultados positivos, que son inhibidores de la enzima en acoplamiento.
Molibdato: El molibdato de amonio forma un complejo solamente con el fosfato para formar el fosfomolibdato. El pirofosfato, los nucleótido-trifosfatos (NTP) u otras moléculas que contienen fosfato, que resultan de la reacción, no interactúan con los óxidos de molibdeno. La mayor parte de las reacciones colorimétricas se basan en la formación de un complejo entre el ion de fosfato y el ion de molibdato en una solución en un ácido, seguida por una reducción o una fijación a colorantes que forman complejos coloreados. Se han introducido muchas variaciones en estas técnicas, con la meta de aumentar la sensibilidad y la estabilidad de los colores, y de disminuir la cantidad de hidrólisis espontánea de ATP que se produce durante la incubación que desarrolla un color (González-Romo y colaboradores, Anal. Biochem. 1992, 200, 235). Por ejemplo, el complejo de fosfomolibdato puede ser reducido por el ácido ascórbico para generar un cromógeno con molibdeno de color azul, con una absorbencia máxima a 700 nm (Hergenrother y colaboradores, Anal. Biochem. 1997, 251, 45). Otro método está basado en la formación de un complejo de color verde brillante con verde de malaquita en un medio ácido, que tiene una absorbencia máxima a 650 nm (Moslen y colaboradores, Anal. Biochem. 1983, 131, 69).
De hecho, el ensayo con verde de malaquita fue evaluado con anterioridad como un sistema de ensayo potencial para determinar la actividad como ATPasa de la E1, pero se encontró que era inapropiado,puesto que no podría detectar con exactitud concentraciones de fosfato menores que 25 \muM. Esto planteaba un problema, puesto que la detección de agentes inhibidores competitivos es óptima con unas concentraciones del substrato por debajo de la K_{m} de una enzima. Como se ha mencionado con anterioridad, se ha mostrado que la K_{m}(ATP) de la ATPasa de E1 procedente de HPV-11 es de aproximadamente 10 \mum, de manera tal que la reacción con ATPasa de la E1 se lleva a cabo de una manera rutinaria a alrededor de 1-10 \muM de ATP. Además, el consumo de substrato en un experimento de inhibición es mantenido por debajo de un 30%, por lo que la concentración del substrato permanece esencialmente constante a lo largo del período de tiempo de la reacción. El resultado es que la de 3 \muM es la concentración máxima de fosfato que se pone en libertad - que está situada bien por debajo del límite de detección de 25 \muM del ensayo con verde de malaquita.
Todos estos ensayos colorimétricos para determinar la ATPasa requieren una concentración mínima de ATP de varios cientos de micromoles. Por ser de aproximadamente 10 \muM el valor de la K_{m}(ATP) para la E1 procedente de HPV-11 (medida en la ausencia de ADN), por lo tanto, para escrutar de una manera efectiva los agentes inhibidores competitivos de la actividad como ATPasa de la E1, deberían realizarse ensayos que usen una concetración de ATP = [ATP] \leq 10 \muM.
Adsorción de fosfomolibdato sobre un soporte sólido: El fosfomolibdato es un heteropolimolibdato grande, con una estequiometria de [PMo_{12}O_{40}]^{3-}. A causa de su carga relativamente baja, éste puede ser extraído a partir de una solución acuosa en disolventes orgánicos o puede ser adsorbido sobre una superficie hidrófoba tal como la de perlas de Sephadex o filtros de nitrocelulosa. Ohnishi y colaboradores (en J. Solid-Phase Biochem. 1976, 1(4), 287 y Ohnishi (en Anal. Biochem.1978, 86, 201) describen un método para aislar el complejo de fosfomolibdato a partir de una solución por cromatografía de afinidad en una columna con polivinil-polipirrolidona (PVPP). La PVPP actúa como un catalizador para la reacción de formación de complejo entre el PO_{4} y el molibdeno, y de este modo adsorbe selectivamente el complejo sobre otras moléculas que contienen fosfato. El fosfato puede ser marcado radiactivamente y eluido a partir de la columna para el recuento de la radiactividad. Este método está limitado por hecho de que el fosfato marcado necesita ser separado con respecto de la mezcla de reacción antes del recuento. Subsiste una necesidad de un método robusto para la determinación del fosfato, que sea sometible a un formato de alto rendimiento total.
Yoshimura y colaboradores (en Anal. Biochem. 1986, 58, 591) describen una micro-determinación colorimétrica del azul de molibdeno por adsorción del complejo sobre una fase de gel con Sephadex. Este proceso requiere una reducción del complejo antes de la adsorción y mide la concentración de fosfato por absorciometria (medicición de la absorción) directa del heteropoli-ácido concentrado en la fase de gel. Este proceso requiere una separación de las perlas de gel a partir del material sobrenadante, antes de efectuar una medición por colorimetría. Aunque este método colorimétrico permite una detección de bajas concentraciones de fosfato, sigue siendo inapropiado para una automatización.
Ensayo de proximidad de la escintilación: Hart y colaboradores (en Molec. Immunol. 1979, 16, 265) y Hart y colaboradores (en J. Nucl. Med. 1979, 20, 1062) describen un nuevo método para realizar ensayos inmunológicos, al que se denomina "ensayo de proximidad de la escintilación" [de scintillation proximity assay, abreviadamente SPA] . Esta tecnología usaba partículas de látex escintilantes (centelleantes) revestidas con un ligando que fija específicamente a un reaccionante orgánico que se está investigando. Todas las aplicaciones adicionales de esta tecnología con perlas hidrófobas han recurrido a proporcionar un ligando específico aplicado como revestimiento sobre las perlas para fijarlas específicamente a una molécula.
La patente de los EE.UU 4.568.649 describe dichas perlas revestidas con un ligando específico y especifica que los restantes sitios activos existentes en las perlas deben ser bloqueados antes del ensayo, con el fin de impedir que el reaccionante que interesa, u otros, se fije(n) directamente a las perlas en vez de al ligando. Esta divulgación se aparta del presente invento.
A pesar de las amplias aplicaciones de esta tecnología desde su comienzo, no ha habido ni la más ligera sugerencia de que esta misma tecnología se pudiera utilizar ventajosamente para detectar el fosfato marcado radiológicamente por medio de una interacción hidrófoba con un complejo de fosfomolibdato. El uso por parte de la solicitante del concepto de SPA en la detección de una actividad como ATPasa está fundamentado en la observación de que el complejo de fosfomolibdato hidrófobo se fija a superficies hidrófobas, particularmente a la superficie de perlas para SPA con poli-(vinil-tolueno), mientras que la molécula de ATP cargado no lo hace. La solicitante ha usado esta propiedad para separar el ortofosfato con respecto del ATP o ADP y se aprovecha de la ventaja de las perlas revestidas con un agente de escintilación para la medición de un ortofosfato radiactivo. La solicitante proporciona por lo tanto un método robusto para detectar y medir el ortofosfato. Este ensayo es sometible a una escala grande y proporciona resultados reproducibles para la detección de Pi en el intervalo de bajas concentraciones nanomolares. Este método es apropiado también para un análisis cinético, no realizado con facilidad por los ensayos de la técnica anterior.
Sumario del invento
El presente invento usa el principio consistente en que el fosfomolibdato se fija a superficies hidrófobas para aislar el complejo de fosfomolibdato con respecto de otras moléculas que contienen fosfato, y usa además el concepto del SPA para llevar a un complejo de fosfomolibdato marcado radiológicamente a íntimo contacto con un agente de escintilación para realizar una medición por recuento de la escintilación.
En una primera forma de realización, el presente invento proporciona un método para detectar y medir el ortofosfato (Pi) marcado radiológicamente en una mezcla acuosa de reacción, que comprende las etapas de:
a.
añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción en condiciones ácidas para formar un complejo de fosfomolibdato; y
b.
poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación;
con lo que la fijación de fosfomolibdato a la superficie proporciona una proximidad suficiente para que el fosfato marcado radiológicamente induzca una escintilación medible del agente de escintilación, que se correlaciona con la cantidad de ortofosfato.
En una segunda forma de realización, el presente invento consiste en un método para determinar una actividad como ATPasa, que comprende las etapas de:
a.
mezclar [\gamma-^{33}P]ATP marcado radiológicamente con una enzima que hidroliza al ATP;
b.
incubar la mezcla de reacción durante un período de tiempo suficiente para dar lugar a que el ortofosfato sea liberado a partir de una hidrólisis;
c.
añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción para formar un complejo de fosfomolibdato;
d.
poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación; y
e.
medir la escintilación de dicho agente de escintilación como un medio para calcular la cantidad de dicho ortofosfato.
Opcionalmente, el método comprende también: la etapa f) de añadir una solución de CsCl a dicha mezcla de reacción antes del recuento. Opcionalmente además, el método comprende la etapa g) de añadir una solución de ácido cítrico a dicha mezcla que contiene CsCl antes del recuento.
En una tercera forma de realización, el presente invento consiste en un ensayo para escrutar agentes inhibidores de la actividad de una enzima que hidroliza al fosfato, que comprende las etapas de:
llevar a cabo las etapas a hasta e (y opcionalmente las etapas f y g) de acuerdo con el método anterior, en presencia y en ausencia de un agente inhibidor candidato; y comparar la cantidad de fosfato en cada caso para calcular los niveles de inhibición.
Las perlas para SPA comercialmente disponibles son perlas de tamaño microscópico que están impregnadas con un agente de escintilación, y están disponibles con una diversidad de moléculas fijadas a su superficie (p.ej., estreptavidina, glutatión, proteína A). Las perlas para SPA con poli(vinil-tolueno) (PVT) tienen superficies relativamente hidrófobas. y son capaces de adsorber selectivamente el fosfomolibdato a partir de mezclas de reacción en la presencia de ATP en exceso. Aunque las perlas para SPA son tratadas para convertirlas en menos hidrófobas, la interacción hidrófoba se puede intensificar por altas concentraciones del cloruro de cesio, corrientemente utilizado para hacer flotar perlas en protocolos de SPA. En un medio acuoso, los agentes emisores débiles de partículas \beta tales como [^{33}P] necesitan estar en estrecha proximidad física con respecto a moléculas de un agente de escintilación para dar lugar a que éstas emitan luz - puesto que en caso contrario su energía se disipa y se pierde en el disolvente. Por lo tanto, el fosfato marcado con [^{33}P], convertido en un complejo con un molibdato y fijado a la superficie de la perla, causa una activación del agente de escintilación, mientras que el ATP libre marcado con [^{33}P] en forma de una solución no lo hace. La luz emitida por una muestra es medida por un contador de la escintilación de partículas \beta y es proporcional a la cantidad de fosfato que está presente. Las perlas para SPA están disponibles comercialmente y actualmente son tratadas por la compañía solicitante con una película polihidroxílica para que sean menos hidrófobas. Sin embargo, está considerado por la solicitante que las perlas para SPA no tratadas puedan ser particularmente apropiadas para este ensayo particular.
El método y los ensayos del presente invento son útiles, no solamente para la helicasa de E1 procedente de HPV, sino también para cualquier ATPasa, NTPasa, o cualquier enzima que genere ortofosfato como un producto, especialmente si la K_{m} del substrato está situada en el intervalo de concentraciones desde el de un nanomol hasta unos pocos micromoles.
Particularmente, el ensayo del presente invento es útil para determinar la actividad como ATPasa de diversas enzimas que hidrolizan a la ATP, cuando es deseable llevar a cabo el ensayo en unas concentraciones desde 1 nM hasta unos pocos \muM del substrato. Dichas enzimas incluyen (sin quedar restringidas a ellas): helicasas (p.ej. procedentes de otros virus, tales como los HPV, HSV, CMV, HCV), otros agentes infecciosos (p.ej. bacterias), o helicasas celulares; otras ATPasas transductoras de energía (tales como por ejemplo miosinas, dineinas, cinesinas), ATPasas, transportadoras de iones) o chaperoninas; otras enzimas que hidrolizan a fosfatos de nucleótidos (p.ej. proteínas G), fosfatasas de proteínas o de pequeñas moléculas; o pirofosfatasas inorgánicas.
En una cuarta forma de realización, el presente invento comprende un estuche para medir el ortofosfato marcado radiológicamente en una solución acuosa, comprendiendo dicho estuche:
una solución de molibdato; y
una superficie hidrófoba de un agente de escintilación;
en el que dicha solución de molibdato es añadida a dicha solución acuosa para formar un complejo de fosfomolibdato, siendo capturado dicho complejo por dicha superficie hidrófoba para inducir una escintilación medible en ella.
Otros objetos, ventajas y características adicionales del presente invento se harán más evidentes después de haber leído la siguiente descripción no restrictiva de las formas de realización preferidas, con referencia a los dibujos adjuntos, que son ilustrativos y no deberán ser interpretados como limitativos del alcance del invento.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: El efecto que tiene sobre una señal de SPA el hecho de usar diversos tipos de perlas. (a) cpm para reacciones con E1 y ensayos en vacío. (b) relación de testigo a vacío.
Figura 2: El efecto que tiene sobre una señal de SPA el hecho de hacer variar la concentración de AmMo. Las concentraciones dadas son % de AmMo (en p/v = peso/volumen) cuando éste se disuelve en HCl antes de su adición a las mezclas de reacción. (a) cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en vacío (rombos). (b) relación de testigo a vacío.
Figura 3: El efecto que tiene sobre una señal de SPA el hecho de hacer variar la concentración de HCl en la solución de AmMo. (a) cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en vacío (rombos). (b) relación de testigo a vacío.
Figura 4: El efecto que tiene sobre una señal de SPA el hecho de hacer variar la concentración de CsCl.
Las concentraciones se dan para la solución original que se había añadido a mezclas de reacción como se describe en el Ejemplo 3. (a) cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en vacío (rombos). (b) relación de testigo a vacío.
Figura 5: El efecto que tiene sobre una señal de SPA el hecho de hacer variar el período de tiempo durante el que la mezcla de reacción se incuba con AmMo antes de realizar las adiciones de una suspensión de perlas para SPA y de CsCl. (a) cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en vacío (rombos). (b) relación de testigo a vacío.
Figura 6: El efecto que tiene sobre una señal de SPA el hecho de hacer variar el período de tiempo durante el que la mezcla de reacción completa es incubada después de la adición de CsCl y antes del recuento. (a) cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en vacío (rombos). (b) relación de testigo a vacío.
Figura 7: El efecto que tienen el volumen de CsCl y la adición de ácido cítrico a la mezcla de reacción sobre la relación de reacción de E1:vacío. Los resultados mostrados son para la adición de 30 ó 90 \mul de CsCl con o sin ácido cítrico 0,2 M. La placa de ensayo se leyó en unos momentos que fluctuaban entre 1 y 74 horas después de la adición de CsCl.
Figura 8: El efecto que tienen el HCl, el AmMo y las concentraciones de citrato sobre la relación de testigo a vacío. Los resultados se muestran para tres diferentes momentos de lectura después de la adición de CsCl. Los resultados marcados son para las concentraciones preferidas del reactivo. Esta combinación marcada se repite tres veces para facilitar las comparaciones dentro de cada serie de concentraciones. Como se describe en el Ejemplo 3, los primeros dos conjuntos de resultados representan la ausencia de Igepal-CA630 desde las mezclas de reacción y la adición de Tween-20 a la solución de AmMo, respectivamente.
Figura 9: El curso en el tiempo tiempo de reacción, como se describe al final del Ejemplo 3. Se muestran las cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en vacío (rombos).
Figura 10: La curva de IC_{50} (concentración inhibidora del 50%) para la inhibición por ATP-\gamma-S de la actividad de la ATPasa procedente del HPV-6a.
La regresión no lineal dio un valor de la IC_{50} de 8,0 \pm 1,6 \muM.
Figura 11: Linealidad y exactitud de la detección de fosfato. Las líneas mostradas son correspondientes a: la referencia teórica (en que el valor observado = el valor esperado, rombos); el resultado de un SPA usando 1,2 M de HCl, 2% de AmMo y 0,2 M de citrato, como se describe en el Ejemplo 5 (cuadrados); el resultado de un SPA usando 1,8 M de HCl, 0,5% de AmMo y 0,1 M de citrato (triángulos); el resultado de un SPA usando 1,8 M de HCl, 1% de AmMo y 0,1 M de citrato (cruces); el resultado de un SPA usando 2,4 M de HCl, 1% de AmMo y 0,1 M de citrato (asteriscos); y el resultado de una TLC (círculos).
Figura 12: Señal obtenida para reacciones con E1 (cuadrados) y para ensayos en vacío (rombos), que se realizan en tres placas por separado. El eje de las x es el número de pocillos, una escala arbitraria para diseminar los datos para su visión.
Figura 13: Señal de SPA obtenida para 0,2 hasta 200 \muM de fosfato. Los resultados se muestran para cuatro diferentes concentraciones de perlas para SPA (a) a escala lineal, (b) a escala logarítmica.
La línea teórica mostrada en (b) (asteriscos) es simplemente una línea recta para referencia.
Figura 14: Señal de SPA obtenida para 0,5 hasta 10 \muM de fosfato o ATP. Los resultados se muestran para fosfato en la presencia de AmMo (rombos); para fosfato en la ausencia de AmMo (triangulos); para ATP en la presencia de AmMo (cuadrados) y para ATP en la ausencia de AmMo (cruces). (a) a escala lineal (b) a escala logarítmica.
Figura 15: Estimación del valor de K_{m}(ATP) para E1 procedente de HPV-11, determinado mediante detección por SPA. Los valores determinados experimentalmente se representan en forma de círculos, la línea representa el ajuste óptimo teórico calculado para la ecuación de Michaelis-Menten.
Figura 16: Estimación del valor de K_{m}(ATP) para E1 procedente de HPV-11, determinado mediante detección por TLC. Los valores determinados experimentalmente se representan en forma de círculos, la línea representa el ajuste óptimo teórico calculado para la ecuación de Michaelis-Menten.
Figura 17: Representaciones gráficas (dobles recíprocas) de Lineweaver-Burke, que comparan los datos experimentales de inhibición con los resultados teóricos basados en parámetros obtenidos por regresión no lineal. (A) en el modelo de inhibición competitiva. (B) en el modelo de inhibición no competitiva (igual fijación a E y a ES). Para ambos gráficos, los valores experimentales se dan como puntos con concentraciones del agente inhibidor de 24 \muM (rombos); 12 \muM (asteriscos); 6 \muM (cuadrados); 3 \muM (triángulos); y 0 (círculos). Las líneas están basadas en los parámetros de ajuste óptimo para cada modelo de inhibición.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones
La expresión "superficie hidrófoba de agente de escintilación", como se usa en el presente contexto, significa una superficie hidrófoba que está impregnada, integrada, revestida o contiene de otro modo un agente de escintilación.
La expresión "agente de escintilación", como se usa en el presente contexto, significa una molécula fluorescente (también denominada fluorescedora) que, cuando se coloca en última proximidad con una energía de radiación emitida a partir de un reaccionante marcado radiológicamente para ella, es activada con el fin de emitir energía luminosa detectable y medible por un contador de escintilación.
Realizaciones preferidas
De acuerdo con una primera forma de realización del presente invento, se proporciona un método para detectar y medir el ortofosfato inorgánico (Pi) marcado radiológicamente en una mezcla acuosa de reacción, que comprende las etapas de:
a.
añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción en condiciones ácidas para formar un complejo de fosfomolibdato;
b.
poner en contacto dicho complejo de fosfomolidato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación;
con lo que la fijación de fosfomolibdato a dicha superficie proporciona una proximidad suficiente para que el fosfato marcado radiológicamente induzca una escintilación medible del agente de escintilación, que se correlaciona con la cantidad de dicho ortofosfato.
De acuerdo con una segunda forma de realización del invento, se proporciona un método para determinar la actividad de una enzima que hidroliza a fosfatos, que comprende las etapas de:
a.
mezclar [\gamma-^{33}P]ATP marcado radiológicamente con una de dichas enzimas
b.
incubar la mezcla de reacción durante un período de tiempo suficiente para dar lugar a que el ortofosfato sea puesto en libertad a partir de una hidrólisis;
c.
añadir una solución de molbdato a dicha mezcla de reacción con el fin de formar un complejo de fosfomolibdato;
d.
poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación; y
e.
medir la escintilación de dicho agente de escintilación como un medio para calcular la cantidad de dicho ortofosfato.
Opcionalmente, el método comprende también: la etapa f) de añadir una solución de CsCl a dicha mezcla de reacción antes del recuento. Opcionalmente además, el método comprende la etapa g) de añadir una solución de ácido cítrico a dicha mezcla que contiene CsCl antes del recuento.
De acuerdo con una tercera forma de realización del presente invento, se proporciona un ensayo para escrutar agentes inhibidores de una actividad de una enzima que hidroliza al fosfato, que comprende las etapas de: llevar a cabo las etapas a hasta e (y opcionalmente las etapas f y g) de acuerdo con el método antes descrito, en la presencia y en la ausencia de un agente inhibidor candidato; y comparar los niveles de inhibición.
De acuerdo con una cuarta forma de realización del presente invento, se proporciona un estuche para medir el ortofosfato marcado radiológicamente en una solución acuosa, comprendiendo dicho estuche:
a) una solución de molibdato; y
b) una superficie hidrófoba de un agente de escintilación;
en el que dicha solución de molibdato es añadida a dicha solución acuosa para formar un complejo de fosfomolibdato, siendo capturado dicho complejo por dicha superficie hidrófoba para inducir una escintilación medible en ella.
Preferiblemente, de acuerdo con la anteriores formas de realización de este invento, la solución de molibdato y la superficie hidrófoba se pueden añadir de una manera simultánea a la mezcla de reacción.
Preferiblemente, las formas de realización de este invento comprenden además la etapa de:
añadir una solución de CsCl a la mezcla de reacción antes del recuento.
Más preferiblemente, el invento comprende además una etapa de:
añadir una solución de ácido cítrico a dicha mezcla que contiene CsCl antes del recuento.
De modo sumamente preferible, el CsCl y el ácido cítrico se añaden simultáneamente a la mezcla de reacción.
Preferiblemente, la mezcla de reacción que contiene CsCl y ácido cítrico se incuba durante más de una hora antes del recuento de la escintilación.
Preferiblemente, el molibdato de amonio está en una concentración final de 0,05% a 0,3%, más preferiblemente de 0,1% a 0,2% p/v. De modo sumamente preferible, el molibdato de amonio está en una concentración final de aproximadamente 0,17% p/v.
Preferiblemente, la superficie hidrófoba se selecciona entre el conjunto que consta de:
poli(vinil-tolueno) (PVT), Sephadex, látex, poliestireno, poli(acrilamida), acrilamida, agarosa, polipropileno, policarbonato y Sepharose. Más preferiblemente, la superficie hidrófoba es la de perlas de poili(vinil-tolueno) tales como perlas para SPA.
Preferiblemente el CsCl está en una concentración final más alta que 1 M. Más preferiblemente, el CsCl está en una concentración final que fluctúa entre 2 M y 4 M. De modo sumamente preferible, el CsCl está en una concentración final de aproximadamente 3,5 M.
Preferiblemente, el ácido cítrico está en una concentración final que fluctúa entre 0,05 y 0,2 M. Más preferiblemente, el ácido cítrrico está en una concentración final de aproximadamente 0,1 M.
Preferiblemente, la enzima que hidroliza a fosfatos se selecciona entre el conjunto que consta de: una helicasa, una ATPasa y una fosfatasa. más preferiblemente, la enzima es una ATPasa. De modo sumamente preferible, la ATPasa es la helicasa de E1 procedente de papilomavirus humanos.
Ejemplos
Las abreviaturas usadas en los ejemplos incluyen:
AmMo molibdato de amonio
ATP-\gamma-S adenosina-5'-O-(3-tio-trifosfato)
cpm cómputos por minuto
DMSO dimetil-sulfóxido
DTT ditiotreitol
EDTA ácido etilen-diamina-tetraacético
HEPES N-[2-hidroxi-etil]piperazina-N'-[ácido 2-etano-sulfónico]
MES ácido 2-[N-morfolino]-etano-sulfónico
MgOAc acetato de magnesio
PEI poli(etilenimina)
Pi ortofosfato inorgánico
PVPP polivinil-polipirrolidona
PVT poli(vinil-tolueno)
SPA ensayo de proximidad de la escintilación
TLC cromatografía de capa fina
Materiales y métodos
La E1 procedente de HPV-11. marcada con polihistidina. se expresó en células de insectos infectados por baculovirus y se purificó por cromatografía de afinidad con Ni como se describe en el documento WO 99/57283
Ejemplo 1 Protocolo para un ensayo de proximidad de la escintilación (SPA) de ATPasa usando la E1 procedente de HPV
Un [\gamma-^{33}P]ATP marcado radiológicamente (NEN) se preparó en el momento de su recepción diluyéndolo a 100 veces en el tampón de reacción y almacenándolo a -80ºC. Un material almacenado de esta manera era bueno durante más de un mes. Las reacciones de ATPasa con E1 se realizaron en un tampón que constaba de 20 mM de HEPES, de pH 7,5, 0,05 mM de EDTA y 1 mM de DTT, y 0,05% de Igepal CA-630 (equivalente a Nonidet P40). Los volúmenes y las concentraciones dadas seguidamente son de carácter típico, pero se pueden hacer variar de algún modo con un efecto mínimo sobre los resultados, como se muestra en posteriores ejemplos. Se mezclaron 1 \muM de ATP (de Amersham Pharmacia) y 500 \muM de MgOAc con [\gamma-^{33}]ATP, en una dilución de 100 veces, a partir del material almacenado (dilución a 10.000 a partir del material original), o aproximadamente 1 nCi/\mul cuando estaba en estado reciente. La concentración real de ATP con la que contribuía el [\gamma-^{33}]ATP era de aproximadamente 1 mM; esta cantidad se podría reducir aún más si fuese necesario. Se añadió suficiente cantidad de enzima para dar el nivel deseado de conversión. Por ejemplo, 4 nM de E1 procedente de HPV-6a convertían aproximadamente a un 30% del substrato en ADP y fosfato en 2 horas. Un volumen típico de reacción era el de 40 \mul; las reacciones se llevaron a cabo a la temperatura ambiente en placas de 96 pocillos, típicamente en Optiplates (de Packard).
En el momento deseado, las reacciones de 40 \mul se detuvieron añadiendo 20 \mul de una mezcla de perlas para SPA y AmMo. Esta mezcla constaba de una parte de AmMo al 2% (p/v) en 2,4 M de HCl por dos partes de perlas para SPA de PVT con estreptavidina (Pharmacia Amersham #RPNQ0007), suspendidas a razón de 30 mg/ml en 50 mM de Hepes más 0,02% de aziduro de sodio. La solución de molibdato de amonio se preparaba usualmente de manera reciente cada día mientras que la suspensión de perlas para SPA era estable durante más de un mes. La mezcla se puede preparar varias horas de antemano, y se puede usar incluso durante varios días cuando se almacena a 4ºC. Inmediatamente después de haber añadido la mezcla de molibdato de amonio y perlas, se añadieron 80 \mul de cloruro de cesio 7 M más ácido cítrico 0,2 M. Las placas se agitaron brevemente y luego se dejaron sedimentar durante más de una hora. La extensión de la producción de fosfato se determinó luego por recuento de la escintilación usando el TopCount (de Packard). Si se desea, las cpm se pueden convertir en una concentración de fosfato por comparación de los resultados del SPA con los determinados por TLC (véase seguidamente) para reacciones idénticas. Alternativamente, los resultados se pueden comparar con un "testigo de 100%", una reacción con un gran exceso de enzima confirmada previamente por TLC para dar la conversión completa de ATP en fosfato y ADP. Muestras en vacío que no contienen ninguna enzima, pero por lo demás son iguales, se trataron en paralelo y se restaron.
Ejemplo 2 Ensayo por TLC para determinar la ATPasa de E1
Las reacciones con ATPasa se llevaron a cabo justamente como en el formato de SPA. Al final del período de tiempo de reacción planificado, las reacciones se detuvieron añadiendo medio volumen de EDTA 500 mM enfriado por hielo, de pH 8,0. Unas muestras de reacción de uno a dos microlitros (\mul) se extendieron en forma de motas sobre las placas de TLC a base de celulosa revestida con poli(etilenimina) (de Sigma) y se eluyeron en una solución de 1 M de LiCl y 1 M de ácido fórmico. El [\gamma-^{33}P] fosfato y el ATP se determinan usando el sistema de reproducción en imágenes fosforescentes Storm 860 (de Molecular Dynamics). Para cada muestra, inclusive las muestras en vacío, se cuantificaron las intensidades de las motas de fosfato y ATP y el % de fosfato se calculó como:
100 X \frac{(intensidad \ de \ fosfato)}{(intensidad \ de \ fosfato + intensidad \ de \ ATP)}
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores en vacío estaban en el mismo intervalo que para el SPA, aproximadamente en 2-5%, y fueron restados de los valores para cada reacción con el fin de dar el valor del % de fosfato producido por la reacción enzimática.
Ejemplo 3 El efecto de hacer variar las condiciones de detección sobre la señal y la muestra en vacío
Muchas de las reacciones realizadas en esta sección se realizaron con condiciones ligeramente diferentes, usando un tampón de reacción a base de 20 mM de MES, de pH 7,0, 10% de glicerol y 0,05 mM de EDTA. Las reacciones se realizaron con 10 \muM de ATP (aproximadamente 1 mM de [\gamma-^{33}P]ATP), 500 \muM de MgOAc y suficiente cantidad de E1 para dar una conversión de aproximadamente 20% del substrato en el transcurso de 90 minutos a la temperatura ambiente. Igual que para los Ejemplos 1 y 2, las reacciones se realizaron en Optiplates de Packard. En estos experimentos, la detección se llevó a cabo típicamente mezclando 20 \mul de una mezcla de reacción de ATPAsa con 20 \mul de AmMo al 2% en HCl 1,2 M que contenía 0,05% de Tween-20. Después de 10 minutos, se añadieron 20 \mul de una suspensión de perlas para SPA con estreptavidina (10 mg/ml en 50 mM de HEPES, de pH 7,5 + 0,02% de NaN_{3}), después de una breve mezcladura, esto fue seguido por 20 \mul de CsCl 7,0 M. Después de haber mezclado, se dejó que las placas reposasen durante una hora antes de recontar en el TopCount, como se describe en el Ejemplo 1.
Tipo de perlas para SPA: Las perlas para SPA de PVT están disponibles con una diversidad de moléculas unidas a su superficie. Los tipos que estaban disponibles para su evaluación en el ensayo incluían estreptavidina, aglutinina de germen de trigo, proteína A, IgG anti-ratón y glutatión. Aunque son las propiedades hidrófobas de las perlas de PVT las que tienen afinidad para el fosfomolibdato, se ensayaron una diversidad de revestimientos para observar si el tipo de la molécula situada sobre la superficie tenía algún efecto sobre la señal de SPA. Los datos de cpm se muestran en la Figura 1A. Las relaciones de señal del testigo y de señal de vacío, o "relaciones de señal a fondo" se muestran en la Figura 1B. No hay ningún efecto significativo del tipo de revestimiento. Se han obtenido también resultados similares con perlas de cobre (fijación a una marca con His), y de hecho, las perlas de PVT sin revestir, proporcionadas por Amersham-Pharmacia, proporcionan también una señal equivalente. Las perlas para SPA con silicato de itrio no funcionan en este ensayo, como se esperaba, puesto que ellas carecen de una superficie hidrófoba.
Concentración de molibdato de amonio: La función del molibdato de amonio en la solución de detención es la de convertir en un complejo al fosfato liberado en la reacción con ATPasa. Las concentraciones ensayadas de molibdato de amonio en la solución de detención fluctuaban entre 1 y 4%. Los efectos sobre los cpm se muestran en la Figura 2A, y las relaciones de señal a fondo se muestran en la Figura 2B. [Obsérvese: que la muestra en vacío está relativamente sin afectar por concentraciones crecientes de AmMo. Por lo tanto, en estas condiciones, no parece que el fondo resulte de contaminar el ortofosfato presente en la solución de ATP, sino que más bien puede ser debido a una adherencia inespecífica de ATP a las perlas o a la captura de alguna radiación de partículas \beta, emitida por el [\gamma-^{33}P]ATP en solución]:
Concentración de HCl: La función del HCl en la solución de detención es la de proporcionar un medio de carácter ácido en el que se pueda formar el complejo de fosfomolibdato. Los efectos sobre los cpm de unas concentraciones de HCl que fluctúan entre 0 y 2,4 M en la solución de detención se muestran en la Figura 3A, y las relaciones de señal a fondo se muestran en la Figura 3B. En estas condiciones se determinaron que eran óptimos los valores mayores que 1 M.
Concentración de CsCl: Se añade CsCl antes del recuento de la escintilación, con dos finalidades. La primera es la de producir un medio con un alto contenido de sal (= alto en sal) que aumenta el efecto hidrófobo, intensifica la fijación del complejo de fosfomolibdato a las perlas para SPA; la segunda es la de aumentar la densidad del fluido en el pocillo. Las perlas para SPA de PVT tienen una densidad específica de aproximadamente 1,05 g/ml, y tienden a permanecer dispersas en una solución acuosa, sedimentándose sólo con lentitud sobre el fondo en el transcurso de varías horas. La adición de CsCl de alta molaridad aumenta la densidad del líquido, dando lugar a que las perlas de SPA formen una delgada capa que flota en la superficie, aumentando con ello la señal detectable. El CsCl 7,0 M es esencialmente una solución saturada. El efecto sobre los cpm de añadir 20 \mul de CsCl en diferentes concentraciones se muestra en la Figura 4A, y el efecto sobre las señales de señal a fondo se muestra en la Figura 4B. Se obtuvo una relación óptima de señal a fondo usando una solución 7,0 M.
Período de tiempo de incubación en molibdato de amonio antes de la adición de CsCl: El efecto sobre los cpm de hacer variar la duración del tiempo que transcurre entre la adición de AmMo y la adición de CsCl se muestra en la Figura 5A, y el efecto sobre las relaciones de señal a fondo se muestra en la Figura 5B. Se pone de manifiesto que la señal de reacción es aproximadamente constante, pero que la señal de vacío aumenta con el tiempo; por lo tanto, la relación de señal a fondo disminuye con unos tiempos de incubación en aumento.
Período de tiempo que transcurre entre la adición de CsCl y el recuento de la escintilación: En el procedimiento patrón, las placas se recuentan una hora después de la adición de una solución de CsCl. Los cpm y las relaciones de señal a ruido, obtenidas recontando la misma placa en diversos momentos durante un período de tiempo de 48 horas, se muestran en las Figuras 6A y 6B.
Estabilidad de la señal: Los experimentos representados en las Figuras 5 y 6 indican que la señal del ensayo es inestable. La señal de vacío aumenta constantemente con el tiempo. Se mostró mediante detección por TLC que el hecho de mezclar ATP y HCl en las concentraciones anteriores da como resultado una lenta degradación de ATP a fosfato, y esto responde casi con certidumbre del aumento observado en la señal. El mismo problema se presenta en otros ensayos, que recurren a la formación de fosfomolibdato para detectar el fosfato, por ejemplo mediante un cambio en el color o la formación de un precipitado. Se ha mostrado que el ácido cítrico, añadido inmediatamente después que el AmMo, se fijará apretadamente a cualquier molibdato libre, impidiendo la incorporación del fosfato subsiguientemente liberado en aniones de fosfomolibdato. El intercambio es extremadamente lento, por lo que la adición de citrato no disminuye la concentración de fosfomolibdato previamente formado, ni siquiera después de varios días.
El efecto de añadir ácido cítrico 0,2 M a la solución de CsCl 7 M se muestra en la Figura 7. En este experimento, se realizaron reacciones con 30 \mul de ATPasa de E1, tal como se describe al comienzo del Ejemplo 3. Después de esto, se añadieron 30 \mul de AmMo al 2% en HCl 1 M, seguido inmediatamente por 30 \mul de perlas para SPA de 10 mg/ml y luego por 30 ó 90 \mul de CsCl 7 M \pm ácido cítrico 0,2 M. La señal es intensificada aproximadamente al doble después de una incubación durante una hora, y es estabilizada de una manera significativa por la adición de ácido cítrico, de modo que se observa poco cambio incluso después de tres días.
Un experimento adicional, que muestra el efecto de las concentraciones de AmMo, CsCl, HCl y ácido cítrico sobre la señal y sobre la estabilidad de la señal, se muestra en la Figura 8. Las reacciones se realizaron tal como se describe al comienzo de este ejemplo, excepto que el detergente Igepal-CA630 (de Sigma, equivalente a Nonidet-P40) estaba presente en una concentración de 0,005% en todas las reacciones, excepto en un conjunto de ellas, y se incluyó ácido cítrico en la solución de CsCl en concentraciones de 0,1 M, 0,2 M o 0,4 M. Se incluyó 0,05% de Tween-20 en la solución de molibdato de amonio en uno de los casos. Se conoce que el Tween-20 estabiliza al complejo de fosfomolibdato y verde de malaquita en el ensayo de Itaya y Ui (Clin. Chim Acta, 1966), pero no tiene ningún efecto beneficioso en este ensayo. La placa de ensayo se leyó a las 1,5, 6,5 y 20 horas después de la adición de la mezcla de CsCl y ácido cítrico. La señal aumentó sólo ligeramente después de 1,5 horas y era estable hasta durante al menos 20 horas.
El inhibidor testigo ATP-\gamma-S se añadió a algunos pocillos en una concentración de 10 \muM (datos no mostrados, pero véase el Ejemplo 4), para verificar la robustez de los datos obtenidos en diferentes puntos de tiempo (momentos). A lo largo de todas las condiciones y puntos de tiempo ensayados, el nivel de inhibición varió solamente de 63,9 a 70,0%. Por lo tanto, las variaciones en cuanto a la detección en las diferentes condiciones del ensayo pueden tener un cierto efecto sobre los cpm observados, pero no afectan a las señales relativas entre reacciones de enzimas, reacciones inhibidas y ensayos en vacío, y por lo tanto no afectan a la exactitud fundamental del ensayo.
Un ejemplo de un experimento de curso en el tiempo tiempo, usando la E1 procedente de HPV-11, se muestra en la Figura 9. Este experimento se realizó en las condiciones antes descritas para la Figura 8, excepto en lo que se refiere a la presencia de detergente al 0,005% como antes se describe. Los datos mostrados son los valores medios para cuatro reacciones de 180 \mul. En cada punto de tiempo, se retiraron 30 \mul y se mezclaron con 30 \mul de una solución de una mezcla de AmMo y perlas para SPA, seguidos por 90 \mul de una mezcla de CsCl 7,0 M y ácido cítrico 0,2 M antes del recuento de la escintilación.
Ejemplo 4 Inhibición por ATP-\gamma-S
Las siguientes soluciones se usaron para realizar reacciones de 45 \mul para determinar curvas de IC_{50}:
- ATP (15 \mul por reacción) que constaba de 3,0 \muM de ATP, 1,5 mM de acetato de Mg y 0,06 \muCi de [\gamma-^{33}P]ATP;
- E1 (15 \mul por reacción), que constaba de 18 nM de E1 procedente de HPV-6;
- Solución de agente inhibidor (15 \mul por pocillo) que constaba de \gamma-S-ATP, disuelto en un tampón más 18% de DMSO.
Todas las soluciones se prepararon en el tampón de ensayo descrito en el Ejemplo 3, excepto que el tampón de ensayo contenía también 0,005% de Igepal CA-630. Todos los componentes son diluidos en 3 veces al mezclar las mezclas de reacción. Los reaccionantes se añadieron en el siguiente orden: a) el agente inhibidor; b) la E1 procedente de HPV-6, c) el ATP. El intervalo de concentraciones para el inhibidor en las mezclas de reacción era de 0,2 a 100 \muM. Después de 75 minutos, las mezclas de reacción se sofocaron añadiendo 45 \mul de una mezcla que constaba de 2 partes de perlas para SPA con estreptavidina (15 mg/ml de suspensión) en un tampón para resuspensión (Ejemplo 2) y una parte de HCl 2,4 M que contenía 2% de molibdato de amonio. Luego se añadieron 90 \mul de CsCl 7 M que contenía 0,1 M de ácido cítrico. Después de haber mezclado brevemente, las placas se dejaron durante 90 minutos y luego se recontaron en un TopCount. Los datos de inhibición (véase la Figura 10) se ajustaron a un sistema lógico que usaba un SAS (Statistical Software System = Sistema de programa lógico estadístico; SAS Institute, Inc. Cary, N.C.) con testigos positivos que daban un promedio de 16.000 cpm y muestras en vacío que daban un promedio de 1.300 cpm. Se han obtenido también resultados similares en los casos en los que la detección se realizó mediante una TLC.
Ejemplo 5 Linealidad y exactitud de la detección de fosfato
En este experimento, una reacción de ATPasa grande se llevó a cabo con suficiente cantidad de E1 para dar el 100% de la hidrólisis del ATP. La E1 se desactivó seguidamente por calor, y la mezcla de reacción se mezcló en diversas proporciones con una muestra en vacío de reacción que no contenía E1. El tampón de reacción y las condiciones de incubación eran tal como se han descrito en el Ejemplo 1, excepto que el tampón de reacción era tal como se ha descrito en el Ejemplo 3, aunque estaba presente 0,005% de Igepal CA630. Las mezclas de reacción y en vacío se hicieron a razón de 2:3, 1:5, 1:10 y 1:20 para simular un intervalo de hidrólisis de 40% a 5%. Igual que para algunos de los experimentos anteriores, la detección por SPA se realizó usando molibdato de amonio, HCl y ácido cítrico a varias concentraciones diferentes. Los resultados para algunas condiciones, juntamente con los obtenidos por la TLC, se muestran en la Figura 11. En todos los casos, las señales detectadas (expresadas como una proporción de 100% para el SPA y como la concentración observada de fosfato para la TLC) son muy similares. Aunque la señal absoluta (de cpm) varía con las condiciones, la señal relativa, y por lo tanto la exactitud del ensayo, es constante. En particular, una conversión de 20% simula una extensión típica de reacción en condiciones de escrutinio y una conversión de 10% representa la señal que se observaría para compuestos de ensayo que dan una inhibición de 50%.
Ejemplo 6 Variación para testigos de ensayo usando condiciones de escrutinio
Con el fin de verificar la variabilidad de este método de un pocillo a otro, las reacciones se realizaron, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, en 80 pocillos de tres placas de 96 pocillos dispuestas por separado. Las muestras en vacío de reacción sin enzima se realizaron en los otros 16 pocillos. Los resultados se muestran en la Figura 12. La variabilidad de un pocillo a otro se puede medir usando la estadística de z', que toma en cuenta las desviaciones típicas de las señales y la separación entre la señal procedente de reacciones enzimáticas y la procedente de muestras en vacío (J-H Zhang, y colaboradores, J. Biomol. Screening, 1999, 4, 67-73). Los valores pueden fluctuar desde menos de 0 a 1,0, estimándose que los valores mayores que 0,5 son muy aceptables para un ensayo de escrutinio. El valor de z' para este experimento fue de 0,63 ó 0,75 cuando se retiraron del análisis dos manifiestas muestras situadas fuera de la norma.
Ejemplo 7 Linealidad de la detección de fosfato a mayores concentraciones de fosfato
Los anteriores Ejemplos demuestran que la detección de fosfato por SPA se realiza bien para bajas concentraciones de fosfato, de 0,1-1 \muM. Sin embargo, con el fin de llevar a cabo un trabajo mecanístico (= determinado mecánicamente), es necesario hacer variar más ampliamente la concentración de ATP. Los autores hemos observado que el proceso bosquejado en el Ejemplo 1 no captura cuantitativamente la totalidad del ortofosfato, puesto que se observó una señal aumentada en el caso de que se hubieron añadido mayores cantidades de perlas para SPA. Basándose en estos resultados iniciales, un experimento de valoración de perlas para SPA se llevó a cabo tal como se describe seguidamente.
Similarmente al Ejemplo 5, para este experimento se realizó una reacción mayor usando una alta concentración de E1. En este caso, la concentración de ATP era de 200 \muM. La reacción se llevó a cabo durante cuatro horas a la temperatura ambiente y a continuación durante dos horas a 37ºC, para asegurar una conversión completa. Una muestra se analizó por TLC con el fin de verificar la conversión cuantitativa. La mezcla de reacción se diluyó luego en serie con el tampón de reacción más magnesio para un intervalo de concentraciones de fosfato de 200 \muM a 0,2 \muM. Las muestras se analizaron combinando 45 \mul de una mezcla de reacción diluida con 15 \mul de molibdato de amonio (al 2% en HCl 2,4 M) y con 30 \mul de una suspensión de perlas para SPA a unas concentraciones de 7,5, 15, 30 ó 60 mg/ml. Finalmente, se añadieron a todos los pocillos 90 \mul de CsCl 7 M más ácido cítrico 0,2 M.
Los resultados se muestran en la Figura 13A y como una representación gráfica de log-log en la Figura 13B. Como se observa con la máxima claridad en la Figura 13B, para cada concentración de perlas para SPA la señal era directamente proporcional a la concentración de fosfato hasta llegar a aproximadamente 100 \muM. Sin embargo, la señal absoluta depende de la concentración de perlas. De modo interesante, las líneas en la Figura 13B son paralelas, es decir que el aumento proporcional en la señal, obtenido aumentando la concentración de perlas para SPA es el mismo con todas las concentraciones de fosfato hasta llegar a aproximadamente 100 \muM.
Ejemplo 8 Valoración de ATP y fosfato en la presencia y en la ausencia de AmMo con el fin de determinar la fuente de señal en la ausencia de una enzima
En este experimento, una reacción grande similar a la anterior se llevó a cabo para convertir completamente 10 \muM de ATP en fosfato y ADP; se verificó la conversión completa mediante una TLC (Ejemplo 2). En paralelo, se produjo una mezcla idéntica que carecía de enzima. Cada una de estas mezclas se diluyó en un tampón como anteriormente para dar soluciones con unas concentraciones de fosfato o ATP que fluctuaban entre 10 \muM y 0,5 \muM. Muestras duplicadas de 45 \mul de cada una de las mezclas se mezclaron o bien con 40 \mul de una mezcla de AmMo y perlas para SPA, como se describe en el Ejemplo 1, o con una mezcla similar que carecía de AmMo (pero que todavía contenía HCl), seguida por 80 \mul de una mezcla de CsCl y ácido cítrico. Los resultados se representan gráficamente en la Figura 14A o como una representación gráfica de log-log en la Figura 14B. Como se espera, basándose en el Ejemplo 7, la señal es dependiente linealmente de la concentración de radiactividad en todos los casos. En la presencia de AmMo, la muestra en vacío de reacción (solución de ATP) da una señal igual a aproximadamente 5% de la solución de fosfato producida por una conversión total. A diferencia del experimento representado en el Ejemplo 3 (Figura 2), la mayor parte de la señal en vacío es dependiente de AmMo y por lo tanto, en estas condiciones, la señal en vacío es debida principalmente al ortofosfato contaminador ya presente en la solución de ATP comercial.
Ejemplo 9 Valor de K_{m}(ATP) para HPV-11 como se determina por los métodos de SPA y TLC
Los cursos de ATPasa en el tiempo se realizaron a diferentes concentraciones de ATP con el fin de determinar el parámetro cinético K_{m}(ATP) para la E1 procedente de HPV-11. Las reacciones se realizaron en condiciones similares en ambos experimentos, usando los procesos presentados en los Ejemplos 1 y 2, excepto que la concentración de Igepal-CA630 era de 0,01% en vez de 0,005% y con cambios específicos para los experimentos que se señalan seguidamente. La concentración de E1 era de 2 nM y las concentraciones de ATP fluctuaban entre 3 y 75 \muM (para TLC) o entre 2 y 50 \muM (para SPA), siendo la concentración de MgOAc igual a la concentración de ATP más 0,5 mM. Soluciones originales de ATP en cada concentración se obtuvieron diluyendo la solución de concentración más alta con un tampón que contenía 0,5 mM de MgOAc; por lo tanto, se usó para todas las reacciones una relación constante de ATP marcado radiológicamente a ATP no marcado. Los regímenes de reacción se midieron tomando puntos de tiempo para 10 ó 20 hasta 120 minutos. Con el fin de asegurar unas condiciones de velocidad inicial, no se usaron para el análisis los puntos de tiempo que daban una conversión mayor que 20%.
Detección y tratamiento de los datos para el experimento de K_{m} con SPA: Los volúmenes totales de reacción fueron de 150 \mul. Para cada punto de tiempo se retiraron 20 \mul de la mezcla de reacción y se combinaron con 40 \mul de una mezcla de molibdato de amonio y perlas para SPA, seguidos por 80 \mul de una mezcla de CsCl y ácido cítrico. Todas las reacciones se realizaron en triplicado. Las placas se sometieron a recuento después de incubación durante una noche. En el ultimo punto de tiempo, se retiró una parte alícuota adicional de 20 \mul y se combinó con 10 \mul de EDTA 0,5 M. En este caso, la conversión de ATP en fosfato se cuantificó por TLC, y la concentración de fosfato determinada por TLC se comparó con los cpm para el proceso por SPA después de haber restado los valores en vacío en ambos casos. La relación entre la concentración de fosfato y los cpm es lineal, y la pendiente de la línea se usó para convertir los valores de cpm procedentes de la detección con SPA en una concentración de fosfato producido. Los regímenes de producción de fosfato con cada una de las concentraciones de ATP se ajustaron por regresión no lineal para la ecuación de Michaelis-Menten usando el programa GraFit (V 3.01, R. Leatherbarrow). Los resultados se muestran en la Figura 15.
La detección y el tratamiento de los datos para el experimento de K_{n} por TLC: Igual que para el experimento por SPA anterior, se realizaron reacciones con 150 \mul, en duplicado. En cada punto de tiempo, se retiraron 20 \mul y se combinaron con 10 \mul de EDTA 0,5 M enfriado por hielo. Al completarse el curso en el tiempo, las muestras de reacción se diluyeron de tal manera que la concentración total de radiactividad para cada punto era aproximadamente igual. Por lo tanto, las muestras de reacción con 75 \muM de ATP fueron diluidas en 25 veces, mientras que las muestras de reacción con ATP 3 \muM no fueron diluidas. El tampón para dilución constaba de dos partes de un tampón para reacción que contenía 500 \muM de acetato de magnesio y una parte de EDTA 0,5 M. Un microlitro (\mul) de cada muestra de reacción diluida se extendió en motas para la detección por TLC. Los valores para el grado de conversión porcentual de ATP en fosfato se determinaron tal como se ha descrito en el Ejemplo 2 y éstos se usaron para determinar los regímenes de reacción en cada concentración de ATP. Estos regímenes se ajustaron luego a la ecuación de Michaelis-Menten tal como antes se describe, para dar una estimación para el valor de K_{m}(ATP) (Figura 16).
La comparación de las Figuras 15 y 16 muestra con claridad que las dos técnicas proporcionan resultados similares, pero también que la calidad de los datos es superior para el método de SPA. Además, el método de SPA requiere significativamente menos manipulación y un tiempo más corto de tratamiento de los datos. Los resultados mostrados son ejemplos típicos, cada uno de ellos han sido reproducidos múltiples veces.
Ejemplo 10 Valor de K_{1}(ATP-\gamma-S) para HPV-11 como se determina por los métodos de SPA
El compuesto análogo a ATP con \gamma-tio-fosfato inhibe a muchas ATPasas por un mecanismo competitivo. La determinación experimental del mecanismo de la acción del agente inhibidor requiere medir las velocidades iniciales para un cierto número de concentraciones del substrato y del inhibidor. El número de puntos de datos necesarios (varios cientos) y la precisión requerida para este experimento significan que la realización del experimento mediante detección por TLC es mucho más difícil y tediosa. El proceso de SPA funciona bien, sin embargo. Para este experimento, se usaron unas concentraciones de ATP de 5, 10, 20 y 40 \muM, juntamente con unas concentraciones de agente inhibidor de 0, 3, 6, 12 y 24 \muM. Las reacciones se realizaron tal como se ha descrito para el Ejemplo 9 (detección por SPA). Los datos fueron tratados como anteriormente y ajustados por regresión no lineal a una ecuación para la inhibición competitiva usando el programa GraFit. Los autores hemos obtenido unos valores para K_{i}(ATP-\gamma-S) de 3,8 \pm 0,4 \muM y para K_{m}(ATP) de 6,7 \pm 0,7 \muM.
Una representación gráfica de Lineweaver-Burke, que ilustra el grado de ajuste, se muestra en la Figura 17A. La representación gráfica se generó en Excel usando los parámetros ajustados para las líneas y los valores experimentales para los puntos. Como comparación, los datos se ajustaron también a una ecuación para una inhibición no competitiva (igual fijación de agente inhibidor a enzimas y a complejos de enzimas y substratos). Los valores obtenidos fueron de 16 \pm 2 \muM para K_{i}(ATP-\gamma-S) y de 12 \pm 2 mM para K_{m}(ATP). La correspondiente representación gráfica recíproca doble se muestra en la Figura 17B.
A causa de la calidad de los datos obtenidos, es posible observar una desviación sistemática entre los valores experimentales y los valores ajustados para este segundo mecanismo, especialmente a unas concentraciones más altas del agente inhibidor. Se puede obtener una conclusión similar a partir del valor de chi cuadrado reducido, que es significativamente menor para el ajuste competitivo en comparación con el ajuste no competitivo (62 y 347 respectivamente). Por lo tanto, tal como se espera, el modelo competitivo es más apropiado para este inhibidor.
Discusión
El proceso presentado anteriormente es un método sensible, exacto y robusto para la detección del ortofosfato producido por la disociación de compuestos que contienen fosfato marcado radiológicamente. Éste es adecuado en alto grado para la tarea de medir la actividad de enzimas para las que el ortofosfato es un producto de reacción, y para medir la inhibición de tales actividades. Existen muchas de dichas enzimas; ejemplos corrientes de ellas son helicasas, ATPasas y fosfatasas. Este proceso es particularmente apropiado para casos en los que se producen solamente bajas concentraciones de ortofosfato (del orden de nM o bajos \muM). Casos importantes serán aquellas enzimas, tales como la helicasa de E1 procedente de HPV, que se fija apretadamente al substrato de fosfo. Este proceso permite que se realicen ensayos en unas concentraciones de substrato situadas por debajo del valor de K_{m} para una máxima sensibilidad a agentes inhibidores competitivos. El método es simple y suficientemente robusto para un escrutinio de agentes inhibidores a gran escala. En particular, el método no es sensible a muchas aberraciones corrientes, por ejemplo la inhibición aparente causada por compuestos coloreados o fluorescentes, y la señal producida es estable, reproducible y relativamente insensible a pequeñas fluctuaciones en las concentraciones o los volúmenes de componentes del ensayo. El método es también lo suficientemente exacto como para ser aplicado a estudios enzimológicos cuantitativos.
Otros métodos para detectar el ortofosfato han sido debatidos en la bibliografía. Dos métodos ampliamente informados usan un ATP marcado radiológicamente para medir la actividad como ATPasa. Ambos métodos implican la separación física de productos (p.ej. ADP y Pi) con respecto del material de partida, usando o bien una TLC en PEI - celulosa o una adsorción selectiva de ATP sobre carbón orgánico. Aunque son suficientemente sensibles para detectar muy bajas concentraciones de ortofosfato, éstos son métodos clásicos que no se pueden adaptar con facilidad a las modernas aplicaciones de escrutinio. Otros métodos de ensayo recurren al acoplamiento de enzimas que usan el ortofosfato (u otro producto de reacción) como substrato en una segunda reacción, produciendo un cambio en la absorbencia o en la fluorescencia. Estos pueden resultar bastante exactos, pero son menos sensibles que los ensayos basados en la radiactividad. Además, la adición de una enzima en acoplamiento complica la interpretación de los resultados, puesto que los ensayos de enzimas acopladas están sujetos a aberraciones adicionales. Otros diversos procesos implican la formación de fosfomolibdato, seguida por una reducción o una absorción de colorantes para producir un cambio de color, que puede ser correlacionado con la concentración de fosfato. Algunos ensayos con enzimas basados en estos procesos son lo suficientemente exactos y robustos como para ser usados en esfuerzos para el escrutinio de compuestos o en estudios enzimológicos, pero no resulta práctico usar estos métodos para detectar concentraciones del orden de bajos \muM o de nM de ortofosfato. En algunas aplicaciones, es posible aumentar la sensibilidad de estos métodos concentrando grandes volúmenes de fosfomolibdato reducido sobre Sephadex o resinas afines. Sin embargo, no se ha probado que esto sea aplicable a aplicaciones de escrutinio, puesto que se usan normalmente solamente muy pequeños volúmenes en cada reacción de ensayo. Se ha mostrado que se puede adsorber selectivamente un fosfato marcado radiológicamente sobre la superficie de una polivinil-polipirrolidona (PVPP). Entonces, se pueden eliminar por lavado un ATP marcado radiológicamente u otros contaminantes y el fosfato remanente se puede detectar por elución a un pH elevado. Este proceso específico no resulta muy práctico para estudios enzimáticos, puesto que requiere la separación física de los reaccionantes y los productos, y la reproducibilidad, que es dependiente de la elución de múltiples muestras a partir de columnas con PVP, resultaría relativamente mala. Los autores sugieren que un componente importante de la selectividad de su proceso es la capacidad de la polivinil-polipirrolidona para catalizar la formación de fosfomolibdato, implicando con ello que otras superficies hidrófobas serían menos idóneas para su método, apartándolas con ello del presente invento.

Claims (39)

1. Un método para detectar y medir el ortofosfato (PI) marcado radiológicamente en una mezcla acuosa de reacción, que comprende las etapas de:
a.
añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción en condiciones ácidas para formar un complejo de fosfomolidabto; y
b.
poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación;
con lo que la fijación de fosfomolibdato a dicha superficie proporciona una proximidad suficiente para que el fosfato marcado radiológicamente induzca una escintilación medible del agente de escintilación, que se correlaciona con la cantidad de dicho ortofosfato.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha solución de molibdato y dicha superifice hidrófoba se añaden simultáneamente a dicha mezcla de reacción.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la etapa de:
c.
añadir una solución de CsCl a dicha mezcla de reacción antes del recuento.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además la etapa de:
d.
añadir una solución de ácido cítrico a dicha mezcla que contiene CsCl, antes del recuento.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho CsCl y dicho ácido cítrico se añaden simultáneamente a la mezcla de reacción.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho molibdato es molibdato de amonio en una concentración final de desde 0,05% hasta 0,3% en peso/volumen (p/v).
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho molibdato de amonio está en una concentración final de desde 0,1% hasta 0,2% p/v.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho molibdato de amonio está en una concentración final de aproximadamente 0,17% p/v.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha superficie hidrófoba se selecciona entre el conjunto que consta de:
poli(vinil-tolueno) (PVT), Sephadex, látex, poliestireno, poli(acrilamida), acrilamida, agarosa, polipropileno, policarbonato y Sepharose.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha superficie es la de perlas de poli(vinil-tolueno).
11. El método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho CsCl está en una concentración final mayor que 1 M.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho CsCl está en una concentración final que fluctúa entre 2 M y 4 M.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho CsCl está en una concentración final de aproximadamente 3,5 M.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho ácido cítrico está en una concentración final que fluctúa entre 0,05 y 0,2 M.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho ácido cítrico está en una concentración final de aproximadamente 0,1 M.
16. Un método para determinar la actividad como ATPasa, que comprende las etapas de
a.
mezclar [\gamma-^{33}P]ATP marcado radiológicamente con una enzima que hidroliza al ATP;
b.
incubar la mezcla de reacción durante un período de tiempo suficiente para dar lugar a que el ortofosfato se libere a partir de la hidrólisis;
c.
añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción para formar un complejo de fosfomolibdato;
d.
poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación; y
e.
medir la escintilación de dicho agente de escintilación como un medio para calcular la cantidad de dicho ortofosfato.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicha enzima que hidroliza al ATP es la proteína helicasa de E1 procedente de papilomavirus humanos.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicha solución de molibdato y dicha superficie hidrófoba se añaden simultáneamente a dicha mezcla de reacción.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende además la etapa de:
f.
añadir una solución de CsCl a dicha mezcla de reacción antes del recuento.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende además la etapa de:
g.
añadir una solución de ácido cítrico a dicha mezcla que contiene CsCl antes del recuento.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho CsCl y dicho ácido cítrico se añaden simultáneamente a la mezcla de reacción.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho molibdato es molibdato de amonio en una concentración final de desde 0,05% hasta 0,3% p/v.
23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho molibdato de amonio está en una concentración final de desde 0,1% hasta 0,2% p/v.
24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicho molibdato de amonio está en una concentración final de aproximadamente 0,17% p/v.
25. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicha superficie hidrófoba se selecciona entre el conjunto que consta de:
poli(vinil-tolueno) (PVT), Sephadex, látex, poliestireno, poli(acrilamida), acrilamida, agarosa, polipropileno, policarbonato y Sheparose.
26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que dicha superficie es la de perlas de poli(vinil-tolueno).
27. El método de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, en el que dicho CsCl está en una concentración final más alta que 1 M.
28. El método de acuerdo con la reivindicación 27, en el que dicho CsCl está en una concentración final que fluctúa entre 2 M y 4 M.
29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en el que dicho CsCl está en una concentración final de aproximadamente 3,5 M.
30. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho ácido cítrico está en una concentración final que fluctúa entre 0,05 M y 0,2 M.
31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en el que dicho ácido cítrico está en una concentración final de aproximadamente 0,1 M.
32. Un ensayo para el escrutinio de agentes inhibidores de una actividad de una enzima que hidroliza a fosfatos, que comprende las etapas de:
llevar a cabo las etapas a hasta e de acuerdo con el método de la reivindicación 16, en la presencia y en la ausencia de un agente inhibidor candidato; y comparar la cantidad de fosfato en cada caso para calcular el nivel de inhibición.
33. Un ensayo para el escrutinio de agentes inhibidores de una actividad de una enzima que hidroliza a fosfatos, que comprende las etapas de:
llevar a cabo las etapas a hasta g de acuerdo con el método de la reivindicación 20, en la presencia y en la ausencia de un agente inhibidor candidato; y comparar la cantidad de fosfato en cada caso para calcular el nivel de inhibición.
34. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 33, en el que dicha enzima que hidroliza a fosfatos se selecciona entre el conjunto que consta de: una helicasa, una ATPasa y una fosfatasa.
35. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 33, en el que dicha enzima es una ATPasa.
36. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 33, en el que dicha ATPasa es la helicasa de E1 procedente de papilomavirus humanos.
37. Un estuche para medir el ortofosfato marcado radiológicamente en una solución acuosa, comprendiendo dicho estuche:
a.
una solución de molibdato; y
b.
una superficie hidrófoba de un agente de escintilación,
en el que dicha solución de molibdato es añadida a dicha solución acuosa para formar un complejo de fosfomolibdato, siendo capturado dicho complejo por dicha superficie hidrófoba para inducir una escintilación medible en ella.
38. Un estuche de acuerdo con la reivindicación 37, que comprende además una solución de CsCl para aumentar la flotación de las perlas antes del recuento de la escintilación.
39. Un estuche de acuerdo con la reivindicación 38, que comprende además una solución de ácido cítrico para estabilizar la señal de escintilación.
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