ES2213580T3 - Nuevo ensayo para determinar la atpasa. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar y medir el ortofosfato (PI) marcado radiológicamente en una mezcla acuosa de reacción, que comprende las etapas de: a. añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción en condiciones ácidas para formar un complejo de fosfomolidabto; y b. poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación; con lo que la fijación de fosfomolibdato a dicha superficie proporciona una proximidad suficiente para que el fosfato marcado radiológicamente induzca una escintilación medible del agente de escintilación, que se correlaciona con la cantidad de dicho ortofosfato.
Description
Nuevo ensayo para determinar la ATPasa.
El presente invento se refiere a un nuevo ensayo
para determinar la ATPasa. Este invento se refiere particularmente a
un nuevo método para la detección y la medición de la cantidad de
ortofosfato que se libera por hidrólisis de ATP
(adenina-trifosfato) o de cualquier otra molécula
que contenga radicales de fosfato. Más particularmente, este invento
se refiere a un método para la medición de la actividad como ATPasa
de la enzima helicasa de E1 procedente de los virus del papiloma
humano (HPV).
Los papilomavirus humanos (HPV's) son pequeños
virus de ADN que infectan a células de la epidermis cutánea y
mucosal. Se han caracterizado más de 80 diferentes genotipos de HPV.
Algunos tipos, tales como los HPV-1,
-2, -3, -4 y -10, causan lesiones cutáneas conocidas como verrugas o papilomas. Estas acrescencias son benignas y autolimitadoras, y se encuentran en las manos y los pies de un 7-10% de la población general. Presentan una mayor preocupación médica los tipos de HPV que infectan al tracto anogenital. Estos genotipos se designan ya sea como de "bajo riesgo" o como de "alto riesgo" basándose en su correlación con una progresión maligna.
-2, -3, -4 y -10, causan lesiones cutáneas conocidas como verrugas o papilomas. Estas acrescencias son benignas y autolimitadoras, y se encuentran en las manos y los pies de un 7-10% de la población general. Presentan una mayor preocupación médica los tipos de HPV que infectan al tracto anogenital. Estos genotipos se designan ya sea como de "bajo riesgo" o como de "alto riesgo" basándose en su correlación con una progresión maligna.
Los denominados HPV's de bajo riesgo están
asociados con verrugas genitales, tambien conocidas como condilomas
acuminados. Por ejemplo, los tipos 6 y 11 de HPV se encuentran en
más de un 90% de las lesiones genitales benignas, y se asocian muy
raramente con una transformación maligna. Sin embargo, éstos
representan no obstante un grave problema para la salud pública.
Aproximadamente un 1% de los adultos activos sexualmente que habitan
en los EE.UU. tienen verrugas genitales visibles, pero en muchos más
casos la infección es sub-clínica. De hecho, más del
15% estimado de la población con 15-49 años presenta
evidencia molecular de una infección causada por los HPV, en la
forma de un ADN vírico detectable por un ensayo de reacción en
cadena de polimerasa (PCR, de Polymerase Chain Reaction). Desde
luego, un HPV se clasifica como el agente vírico transmititido
sexualmente, más corriente en los EE.UU y en el Reino Unido (R.U.),
y su incidencia está aumentando constantemente.
Una infección con los tipos de HPV's de alto
riesgo, tales como los 16, 18, 31 y 33, ha sido vinculada en gran
manera con el desarrollo de maligninades anogenitales, del modo más
notable de un cáncer cervical. De hecho, los tipos 16 y 18 de HPV,
mientras que raramente se encuentran en lesiones genitales benignas,
son detectables en aproximadamente un 70% de los carcinomas
invasivos del cuello uterino. La vinculación entre los HPV y un
cáncer anogenital está bien demostrada documentalmente - recientes
estudios han encontrado que casi un 90% de los carcinomas cervicales
contienen ADN de HPV.
A pesar de la penetrabilidad y difusibilidad de
una infección causada por los HPV, y de sus posibles consecuencias
amenazadoras de la vida, no se ha descrito todavía hasta ahora
ningún agente inhibidor que sea específico para estos virus. El
descubrimiento de fármacos antivíricos para los HPV ha probado ser
bastante difícil hasta ahora, como resultado de las dificultades
encontradas para propagar los virus en el laboratorio.
Todas las terapias actuales para una infección
causada por los HPV recurren a la destrucción o eliminación
inespecífica de un tejido infectado. Los procesos quirúrgicos
aceptados incluyen el uso de hielo seco, nitrógeno líquido, una
terapia con láser de CO_{2}, una electrocauterización o una
extirpación local. Se utilizan también para destruir un tejido
diversos agentes citotóxicos, tales como ácido salicílico, ácido
tricloro-acético, podofolina, colquicina, bleomicina
y cantaridina.
Mientras que el riesgo de presentación de un
cáncer hace que estos procesos sean sumamente prudentes para el
tratamiento de los HPV's de alto riesgo, se están buscando
tratamientos menos invasivos para manipular los genotipos de bajo
riesgo. Se han investigado compuestos que estimulan el sistema
inmunitario, con la meta de reproducir la regresión espontánea que
frecuentemente se observa con lesiones benignas. El imiquimod, que
es uno de tales agentes modificadores de la respuesta inmunitaria,
ha pasado recientemente de manera satisfactoria las pruebas clínicas
y ha sido aprobado para el tratamiento de verrugas genitales
asociadas con los HPV.
Los pacientes con verrugas genitales experimentan
frecuentemente altas tasas de recurrencia -usualmente de
30-90%- a continuación de tratamientos inespecíficos
tales como una operación quirúrgica. Dicha mala eficiencia es un
resultado de la eliminación incompleta de los ADN de HPV, o la
presencia de virus en un tejido con aspecto normal adyacentemente al
papiloma. Evidentemente, existe una necesidad sustancial de una
terapia específica para los virus, que sea eficaz para una infección
causada por los HPV, que hasta ahora no se ha satisfecho.
La replicación semi-conservativa
de los ADN es un proceso intrincado, mediado por muchas enzimas y
proteínas accesorias. Las helicasas son enzimas que funcionan
durante una replicación de ADN, catalizando el desenrrollamiento de
un ADN duplex delante de la bifurcación de replicación. Estas
enzimas son muy corrientes en células procarióticas y eucarióticas,
así como en la mayor parte de los virus. El mecanismo exacto por el
que las helicasas convierten la fijación y la hidrólisis del ATP en
energía mecánica con el fin de impulsar el desenrollamiento de un
ADN y su propio movimiento simultáneo a lo largo del sitio del ácido
nucleico, no se ha comprendido todavía de un modo completo.
La proteína E1 procedente de HPV con un tamaño de
72 kDa ha sido clasificada como un miembro de la superfamilia III de
las helicasas junto con el antígeno T del Virus de Simio 40 (del
inglés Simian Virus 40 SV40 TAg), con el que éste es homólogo en los
aspectos estructural y funcional. La E1 y el TAg pertenecen a un
subgrupo digno de atención de helicasas de ADN víricos, que tienen
la capacidad de reconocer y fijar secuencias específicas de ADN
junto al origen vírico de replicación (ori). También, aunque
la mayor parte de las helicasas de ADN requieren una región de ADN
monocatenario para su entrada, estas proteínas pueden iniciar un
desenrollamiento a partir de un ADN completamente bicatenario, con
la condición de que éste contenga un ori.
Los papilomavirus humanos contienen
aproximadamente 8 kb (kilobases) de un ADN circular bicatenario. En
las células basales de la epidermis, el genoma es replicado y
mantenido extra-cromosomalmente a un nivel de estado
estable de aproximadamente 20-100 copias por célula.
Una amplificación a alto nivel del genoma solamente se produce una
vez que la célula se ha diferenciado terminalmente y ha migrado a
las capas superiores del epitelio.
En un sistema de replicación de ADN exento de
células, la proteína E1 puede dirigir por si misma una replicación
de ADN de un modo específico para el origen, en concentraciones
suficientes, cuando es provista con el complemento completo de las
proteínas de replicación en hospedantes, inclusive la enzima primasa
á de polimerasa de ADN. Sin embargo, la replicación es estimulada en
gran manera por la proteína E2 vírica, y en concentrciones límites
de E1 la replicación in vitro se vuelve completamente
dependiente de la E2. Ésta es una consecuencia de que la E1 tiene
una afinidad relativamente baja para su sitio de fijación a un ADN.
La E2 ayuda a localizar a la E1 en el origen, al actuar como una
proteína accesoria. Los sitios de fijación de las E1 y E2 junto al
ori vírico están situados en estrecha proximidad, cayendo
dentro de una distancia de aproximadamente 100 pb (pares de bases)
una de otra. El extremo terminal de carboxi de la E2 fija a su sitio
palindrómico en un ADN, mientras que el extremo terminal de amino
fija la E1, llevando de esta manera a la E1 a su sitio de
fijación.
Recientemente, ciertas compañías farmacéuticas
han sido capaces de expandir y acelerar sustancialmente sus
programas de escrutinio de compuestos antivíricos, como una
consecuencia de los avances en la biología molecular. Los virus se
están examinando actualmnente de una manera rutinaria al nivel
molecular para encontrar agentes inhibidores específicos de
productos génicos codificados por los virus.
Para diversos virus, las enzimas tales como las
polimerasas, cinasas y proteasas, han constituido dianas para
inhibición. En contraste con ello, de las aproximadamente 8
proteínas distintas que son codificadas por el genoma de los HPV, la
helicasa de E1 es la única que tiene actividad enzimática (Fields y
colaboradores, 1996, Fields Virology, 3ª edición,
Lippincott-Raveri, Filadelfia, Capítulo 65 y
referencias allí citadas). La E1 despliega una actividad de fijación
a ADN, una actividad de fijación a E2, una actividad como ATPasa y
una actividad como helicasa de ADN, que son específicas para
ori, todas las cuales se pueden ensayar de manera
independiente para descubrir agentes inhibidores potenciales.
Además, ésta es la proteína más altamente conservada de todas las
proteínas de papilomavirus, por lo que un agente inhibidor de E1
sería probablemente eficaz contra múltiples tipos de HPV.
Se conocen escrutinios de alto rendimiento total,
que permiten el descubrimiento de agentes inhibidores de la
actividad como helicasa de E1 (documento de solicitud de patente
internacional WO 99/57283, del 11 de Noviembre de 1999). Incluso
aunque se necesita el ATP para impulsar la actividad como helicasa
de la E1, y éste se incluye en la reacción, este ensayo para
determinar la helicasa no se puede usar con el fin de identificar
agentes inhibidores competitivos de la función de ATPasa que posee
la E1. Éste es un resultado directo de una K_{m} muy baja de la
ATPasa, por ejemplo de aproximadamente 10 \muM para la E1 de
HPV-11, y del hecho de que el ensayo para determinar
la helicasa se realiza rutinariamente con 300 \muM - 1 mM de ATP).
Debe desarrollarse un ensayo más sensible si el sitio de fijación a
ATP de la E1 ha de ser destinado como diana para inhibición.
La actividad como helicasa está asociada siempre
virtualmente con una actividad como trifosfatasas de nucleósidos
(Matson y colaboradores, Ann. Rev. Biochem., 1990, 59,
289). Una hidrólisis enzimática del ATP ha sido medida por una
diversidad de métodos, inclusive reacciones colorimétricas; en todos
los casos, se realizan reacciones enzimáticas de acuerdo con
protocolos específicos para ciertas enzimas, en los que las
condiciones de reacción no son dependientes del proceso de detección
(excepto en lo que se refiere a la inclusión de ATP marcado
radiológicamente). El proceso de detección difiere para los
diferentes ensayos de las siguientes maneras:
TLC: La inclusión de
[\alpha-^{33}P] o
[\gamma-^{33}P]ATP en el substrato para
una reacción con la ATPasa da como resultado la liberación de
fosfato o de ADP (= adenina - difosfato) marcado radiológicamente. A
causa de su diferente polaridad, los ATP, ADP y el fosfato, marcados
con [^{33}P], se pueden separar también mediante cromatografía de
capa fina (de thin layer chromatograpy, abreviadamente TLC)
(Bronnikov y colaboradores, Anal. Biochem., 1983, 131,
69) en un disolvente en funcionamiento (p.ej. una mezcla de cloruro
de litio y ácido fórmico). Las dos especies químicas migran a
diferentes distancias en una placa de TLC, basándose en sus
afinidades relativas para la fase móvil polar y para la fase sólida
no polar. Los resultados son analizados por recuento de la
escintilación o por análisis en un reproductor de imágenes
fosforescentes (PhosphorImager).
Aunque el ensayo por TLC para realizar la
cuantificación del fosfato puesto en libertad produce datos exactos
acerca de la actividad y la inhibición de la ATPasa, éste es
inapropiado para el escrutinio a gran escala de agentes inhibidores
potenciales. La extensión en motas y el funcionamiento de grandes
números de placas de TLC son procesos largos y vinculados con un
intenso trabajo. Se necesita un método que se preste al formato de
placas de 96 pocillos y a una rápida cuantificación si un ensayo
para determinar la ATPasa ha de ser ejecutado en un formato de HTS
(de High Throughput Scrutiny = escrutinio de alto rendimiento
total).
Carbón vegetal: El ATP se fija a un carbón
vegetal, pero el ortofosfato no lo hace (Zimmerman y colaboradores
J. Biol. Chem. 1961, 236 (5), 1.480). Por lo tanto, si
una reacción serealiza usando ATP marcado con partículas \gamma, y
se añade carbón vegetal, el material de partida es adsorbido, pero
el producto permanece en solución. Puede realizarse esto en forma de
un ensayo en placas de 96 pocillos por filtración de soluciones a
través de placas de filtros que contienen carbón vegetal, y por
recuento de la circulación a su través. No es probable que esto sea
reproducible en alto grado, y no se puede someter a un escrutinio
robotizado.
Ensayos con enzimas acopladas: Existe un
cierto número de procesos relacionados, en los que otra reacción se
lleva a cabo con el producto de fosfato mediante una segunda enzima
(Rieger y colaboradores, 1997, Anal. Biochem. 246, 86
y las referencias allí contenidas). Estos ensayos son muy útiles
para estudios cinéticos, puesto que se genera continuamente un
cambio de absorbencia en el curso del ensayo, por lo que el curso de
la reacción se puede vigilar sin sacar partes alícuotas, como es
necesario para los otros métodos anteriores (la distinción entre
ensayos continuos y de tiempo de detención
(stop-time)). Estos métodos, sin embargo, no son
significativamente más sensibles que el ensayo con molibdato
(reseñado seguidamente), y los resultados de los escrutinios serían
complicados adicionalmente por la posibilidad de falsos resultados
positivos, que son inhibidores de la enzima en acoplamiento.
Molibdato: El molibdato de amonio forma un
complejo solamente con el fosfato para formar el fosfomolibdato. El
pirofosfato, los nucleótido-trifosfatos (NTP) u
otras moléculas que contienen fosfato, que resultan de la reacción,
no interactúan con los óxidos de molibdeno. La mayor parte de las
reacciones colorimétricas se basan en la formación de un complejo
entre el ion de fosfato y el ion de molibdato en una solución en un
ácido, seguida por una reducción o una fijación a colorantes que
forman complejos coloreados. Se han introducido muchas variaciones
en estas técnicas, con la meta de aumentar la sensibilidad y la
estabilidad de los colores, y de disminuir la cantidad de hidrólisis
espontánea de ATP que se produce durante la incubación que
desarrolla un color (González-Romo y colaboradores,
Anal. Biochem. 1992, 200, 235). Por ejemplo, el
complejo de fosfomolibdato puede ser reducido por el ácido ascórbico
para generar un cromógeno con molibdeno de color azul, con una
absorbencia máxima a 700 nm (Hergenrother y colaboradores, Anal.
Biochem. 1997, 251, 45). Otro método está basado en la
formación de un complejo de color verde brillante con verde de
malaquita en un medio ácido, que tiene una absorbencia máxima a 650
nm (Moslen y colaboradores, Anal. Biochem. 1983, 131,
69).
De hecho, el ensayo con verde de malaquita fue
evaluado con anterioridad como un sistema de ensayo potencial para
determinar la actividad como ATPasa de la E1, pero se encontró que
era inapropiado,puesto que no podría detectar con exactitud
concentraciones de fosfato menores que 25 \muM. Esto planteaba un
problema, puesto que la detección de agentes inhibidores
competitivos es óptima con unas concentraciones del substrato por
debajo de la K_{m} de una enzima. Como se ha mencionado con
anterioridad, se ha mostrado que la K_{m}(ATP) de la ATPasa
de E1 procedente de HPV-11 es de aproximadamente 10
\mum, de manera tal que la reacción con ATPasa de la E1 se lleva a
cabo de una manera rutinaria a alrededor de 1-10
\muM de ATP. Además, el consumo de substrato en un experimento de
inhibición es mantenido por debajo de un 30%, por lo que la
concentración del substrato permanece esencialmente constante a lo
largo del período de tiempo de la reacción. El resultado es que la
de 3 \muM es la concentración máxima de fosfato que se pone en
libertad - que está situada bien por debajo del límite de detección
de 25 \muM del ensayo con verde de malaquita.
Todos estos ensayos colorimétricos para
determinar la ATPasa requieren una concentración mínima de ATP de
varios cientos de micromoles. Por ser de aproximadamente 10 \muM
el valor de la K_{m}(ATP) para la E1 procedente de
HPV-11 (medida en la ausencia de ADN), por lo tanto,
para escrutar de una manera efectiva los agentes inhibidores
competitivos de la actividad como ATPasa de la E1, deberían
realizarse ensayos que usen una concetración de ATP = [ATP] \leq
10 \muM.
Adsorción de fosfomolibdato sobre un soporte
sólido: El fosfomolibdato es un heteropolimolibdato grande, con
una estequiometria de [PMo_{12}O_{40}]^{3-}. A causa de
su carga relativamente baja, éste puede ser extraído a partir de una
solución acuosa en disolventes orgánicos o puede ser adsorbido sobre
una superficie hidrófoba tal como la de perlas de Sephadex o filtros
de nitrocelulosa. Ohnishi y colaboradores (en J.
Solid-Phase Biochem. 1976,
1(4), 287 y Ohnishi (en Anal. Biochem.1978,
86, 201) describen un método para aislar el complejo de
fosfomolibdato a partir de una solución por cromatografía de
afinidad en una columna con
polivinil-polipirrolidona (PVPP). La PVPP actúa como
un catalizador para la reacción de formación de complejo entre el
PO_{4} y el molibdeno, y de este modo adsorbe selectivamente el
complejo sobre otras moléculas que contienen fosfato. El fosfato
puede ser marcado radiactivamente y eluido a partir de la columna
para el recuento de la radiactividad. Este método está limitado por
hecho de que el fosfato marcado necesita ser separado con respecto
de la mezcla de reacción antes del recuento. Subsiste una necesidad
de un método robusto para la determinación del fosfato, que sea
sometible a un formato de alto rendimiento total.
Yoshimura y colaboradores (en Anal. Biochem.
1986, 58, 591) describen una
micro-determinación colorimétrica del azul de
molibdeno por adsorción del complejo sobre una fase de gel con
Sephadex. Este proceso requiere una reducción del complejo antes de
la adsorción y mide la concentración de fosfato por absorciometria
(medicición de la absorción) directa del heteropoli-ácido
concentrado en la fase de gel. Este proceso requiere una separación
de las perlas de gel a partir del material sobrenadante, antes de
efectuar una medición por colorimetría. Aunque este método
colorimétrico permite una detección de bajas concentraciones de
fosfato, sigue siendo inapropiado para una automatización.
Ensayo de proximidad de la escintilación:
Hart y colaboradores (en Molec. Immunol. 1979, 16,
265) y Hart y colaboradores (en J. Nucl. Med. 1979,
20, 1062) describen un nuevo método para realizar ensayos
inmunológicos, al que se denomina "ensayo de proximidad de la
escintilación" [de scintillation proximity assay,
abreviadamente SPA] . Esta tecnología usaba partículas de látex
escintilantes (centelleantes) revestidas con un ligando que fija
específicamente a un reaccionante orgánico que se está investigando.
Todas las aplicaciones adicionales de esta tecnología con perlas
hidrófobas han recurrido a proporcionar un ligando específico
aplicado como revestimiento sobre las perlas para fijarlas
específicamente a una molécula.
La patente de los EE.UU 4.568.649 describe dichas
perlas revestidas con un ligando específico y especifica que los
restantes sitios activos existentes en las perlas deben ser
bloqueados antes del ensayo, con el fin de impedir que el
reaccionante que interesa, u otros, se fije(n) directamente a
las perlas en vez de al ligando. Esta divulgación se aparta del
presente invento.
A pesar de las amplias aplicaciones de esta
tecnología desde su comienzo, no ha habido ni la más ligera
sugerencia de que esta misma tecnología se pudiera utilizar
ventajosamente para detectar el fosfato marcado radiológicamente por
medio de una interacción hidrófoba con un complejo de
fosfomolibdato. El uso por parte de la solicitante del concepto de
SPA en la detección de una actividad como ATPasa está fundamentado
en la observación de que el complejo de fosfomolibdato hidrófobo se
fija a superficies hidrófobas, particularmente a la superficie de
perlas para SPA con poli-(vinil-tolueno), mientras
que la molécula de ATP cargado no lo hace. La solicitante ha usado
esta propiedad para separar el ortofosfato con respecto del ATP o
ADP y se aprovecha de la ventaja de las perlas revestidas con un
agente de escintilación para la medición de un ortofosfato
radiactivo. La solicitante proporciona por lo tanto un método
robusto para detectar y medir el ortofosfato. Este ensayo es
sometible a una escala grande y proporciona resultados reproducibles
para la detección de Pi en el intervalo de bajas concentraciones
nanomolares. Este método es apropiado también para un análisis
cinético, no realizado con facilidad por los ensayos de la técnica
anterior.
El presente invento usa el principio consistente
en que el fosfomolibdato se fija a superficies hidrófobas para
aislar el complejo de fosfomolibdato con respecto de otras moléculas
que contienen fosfato, y usa además el concepto del SPA para llevar
a un complejo de fosfomolibdato marcado radiológicamente a íntimo
contacto con un agente de escintilación para realizar una medición
por recuento de la escintilación.
En una primera forma de realización, el presente
invento proporciona un método para detectar y medir el ortofosfato
(Pi) marcado radiológicamente en una mezcla acuosa de reacción, que
comprende las etapas de:
- a.
- añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción en condiciones ácidas para formar un complejo de fosfomolibdato; y
- b.
- poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación;
con lo que la fijación de fosfomolibdato a la
superficie proporciona una proximidad suficiente para que el fosfato
marcado radiológicamente induzca una escintilación medible del
agente de escintilación, que se correlaciona con la cantidad de
ortofosfato.
En una segunda forma de realización, el presente
invento consiste en un método para determinar una actividad como
ATPasa, que comprende las etapas de:
- a.
- mezclar [\gamma-^{33}P]ATP marcado radiológicamente con una enzima que hidroliza al ATP;
- b.
- incubar la mezcla de reacción durante un período de tiempo suficiente para dar lugar a que el ortofosfato sea liberado a partir de una hidrólisis;
- c.
- añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción para formar un complejo de fosfomolibdato;
- d.
- poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación; y
- e.
- medir la escintilación de dicho agente de escintilación como un medio para calcular la cantidad de dicho ortofosfato.
Opcionalmente, el método comprende también: la
etapa f) de añadir una solución de CsCl a dicha mezcla de reacción
antes del recuento. Opcionalmente además, el método comprende la
etapa g) de añadir una solución de ácido cítrico a dicha mezcla que
contiene CsCl antes del recuento.
En una tercera forma de realización, el presente
invento consiste en un ensayo para escrutar agentes inhibidores de
la actividad de una enzima que hidroliza al fosfato, que comprende
las etapas de:
llevar a cabo las etapas a hasta e (y
opcionalmente las etapas f y g) de acuerdo con el método anterior,
en presencia y en ausencia de un agente inhibidor candidato; y
comparar la cantidad de fosfato en cada caso para calcular los
niveles de inhibición.
Las perlas para SPA comercialmente disponibles
son perlas de tamaño microscópico que están impregnadas con un
agente de escintilación, y están disponibles con una diversidad de
moléculas fijadas a su superficie (p.ej., estreptavidina, glutatión,
proteína A). Las perlas para SPA con
poli(vinil-tolueno) (PVT) tienen superficies
relativamente hidrófobas. y son capaces de adsorber selectivamente
el fosfomolibdato a partir de mezclas de reacción en la presencia de
ATP en exceso. Aunque las perlas para SPA son tratadas para
convertirlas en menos hidrófobas, la interacción hidrófoba se puede
intensificar por altas concentraciones del cloruro de cesio,
corrientemente utilizado para hacer flotar perlas en protocolos de
SPA. En un medio acuoso, los agentes emisores débiles de partículas
\beta tales como [^{33}P] necesitan estar en estrecha proximidad
física con respecto a moléculas de un agente de escintilación para
dar lugar a que éstas emitan luz - puesto que en caso contrario su
energía se disipa y se pierde en el disolvente. Por lo tanto, el
fosfato marcado con [^{33}P], convertido en un complejo con un
molibdato y fijado a la superficie de la perla, causa una activación
del agente de escintilación, mientras que el ATP libre marcado con
[^{33}P] en forma de una solución no lo hace. La luz emitida por
una muestra es medida por un contador de la escintilación de
partículas \beta y es proporcional a la cantidad de fosfato que
está presente. Las perlas para SPA están disponibles comercialmente
y actualmente son tratadas por la compañía solicitante con una
película polihidroxílica para que sean menos hidrófobas. Sin
embargo, está considerado por la solicitante que las perlas para SPA
no tratadas puedan ser particularmente apropiadas para este ensayo
particular.
El método y los ensayos del presente invento son
útiles, no solamente para la helicasa de E1 procedente de HPV, sino
también para cualquier ATPasa, NTPasa, o cualquier enzima que genere
ortofosfato como un producto, especialmente si la K_{m} del
substrato está situada en el intervalo de concentraciones desde el
de un nanomol hasta unos pocos micromoles.
Particularmente, el ensayo del presente invento
es útil para determinar la actividad como ATPasa de diversas enzimas
que hidrolizan a la ATP, cuando es deseable llevar a cabo el ensayo
en unas concentraciones desde 1 nM hasta unos pocos \muM del
substrato. Dichas enzimas incluyen (sin quedar restringidas a
ellas): helicasas (p.ej. procedentes de otros virus, tales como los
HPV, HSV, CMV, HCV), otros agentes infecciosos (p.ej. bacterias), o
helicasas celulares; otras ATPasas transductoras de energía (tales
como por ejemplo miosinas, dineinas, cinesinas), ATPasas,
transportadoras de iones) o chaperoninas; otras enzimas que
hidrolizan a fosfatos de nucleótidos (p.ej. proteínas G), fosfatasas
de proteínas o de pequeñas moléculas; o pirofosfatasas
inorgánicas.
En una cuarta forma de realización, el presente
invento comprende un estuche para medir el ortofosfato marcado
radiológicamente en una solución acuosa, comprendiendo dicho
estuche:
una solución de molibdato; y
una superficie hidrófoba de un agente de
escintilación;
en el que dicha solución de molibdato es añadida
a dicha solución acuosa para formar un complejo de fosfomolibdato,
siendo capturado dicho complejo por dicha superficie hidrófoba para
inducir una escintilación medible en ella.
Otros objetos, ventajas y características
adicionales del presente invento se harán más evidentes después de
haber leído la siguiente descripción no restrictiva de las formas de
realización preferidas, con referencia a los dibujos adjuntos, que
son ilustrativos y no deberán ser interpretados como limitativos del
alcance del invento.
Figura 1: El efecto que tiene sobre una señal de
SPA el hecho de usar diversos tipos de perlas. (a) cpm para
reacciones con E1 y ensayos en vacío. (b) relación de testigo a
vacío.
Figura 2: El efecto que tiene sobre una señal de
SPA el hecho de hacer variar la concentración de AmMo. Las
concentraciones dadas son % de AmMo (en p/v = peso/volumen) cuando
éste se disuelve en HCl antes de su adición a las mezclas de
reacción. (a) cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en
vacío (rombos). (b) relación de testigo a vacío.
Figura 3: El efecto que tiene sobre una señal de
SPA el hecho de hacer variar la concentración de HCl en la solución
de AmMo. (a) cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en
vacío (rombos). (b) relación de testigo a vacío.
Figura 4: El efecto que tiene sobre una señal de
SPA el hecho de hacer variar la concentración de CsCl.
Las concentraciones se dan para la solución
original que se había añadido a mezclas de reacción como se describe
en el Ejemplo 3. (a) cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y
ensayos en vacío (rombos). (b) relación de testigo a vacío.
Figura 5: El efecto que tiene sobre una señal de
SPA el hecho de hacer variar el período de tiempo durante el que la
mezcla de reacción se incuba con AmMo antes de realizar las
adiciones de una suspensión de perlas para SPA y de CsCl. (a) cpm
para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en vacío (rombos). (b)
relación de testigo a vacío.
Figura 6: El efecto que tiene sobre una señal de
SPA el hecho de hacer variar el período de tiempo durante el que la
mezcla de reacción completa es incubada después de la adición de
CsCl y antes del recuento. (a) cpm para reacciones con E1
(cuadrados) y ensayos en vacío (rombos). (b) relación de testigo a
vacío.
Figura 7: El efecto que tienen el volumen de CsCl
y la adición de ácido cítrico a la mezcla de reacción sobre la
relación de reacción de E1:vacío. Los resultados mostrados son para
la adición de 30 ó 90 \mul de CsCl con o sin ácido cítrico 0,2 M.
La placa de ensayo se leyó en unos momentos que fluctuaban entre 1
y 74 horas después de la adición de CsCl.
Figura 8: El efecto que tienen el HCl, el AmMo y
las concentraciones de citrato sobre la relación de testigo a vacío.
Los resultados se muestran para tres diferentes momentos de lectura
después de la adición de CsCl. Los resultados marcados son para las
concentraciones preferidas del reactivo. Esta combinación marcada se
repite tres veces para facilitar las comparaciones dentro de cada
serie de concentraciones. Como se describe en el Ejemplo 3, los
primeros dos conjuntos de resultados representan la ausencia de
Igepal-CA630 desde las mezclas de reacción y la
adición de Tween-20 a la solución de AmMo,
respectivamente.
Figura 9: El curso en el tiempo tiempo de
reacción, como se describe al final del Ejemplo 3. Se muestran las
cpm para reacciones con E1 (cuadrados) y ensayos en vacío
(rombos).
Figura 10: La curva de IC_{50} (concentración
inhibidora del 50%) para la inhibición por
ATP-\gamma-S de la actividad de la
ATPasa procedente del HPV-6a.
La regresión no lineal dio un valor de la
IC_{50} de 8,0 \pm 1,6 \muM.
Figura 11: Linealidad y exactitud de la detección
de fosfato. Las líneas mostradas son correspondientes a: la
referencia teórica (en que el valor observado = el valor esperado,
rombos); el resultado de un SPA usando 1,2 M de HCl, 2% de AmMo y
0,2 M de citrato, como se describe en el Ejemplo 5 (cuadrados); el
resultado de un SPA usando 1,8 M de HCl, 0,5% de AmMo y 0,1 M de
citrato (triángulos); el resultado de un SPA usando 1,8 M de HCl, 1%
de AmMo y 0,1 M de citrato (cruces); el resultado de un SPA usando
2,4 M de HCl, 1% de AmMo y 0,1 M de citrato (asteriscos); y el
resultado de una TLC (círculos).
Figura 12: Señal obtenida para reacciones con E1
(cuadrados) y para ensayos en vacío (rombos), que se realizan en
tres placas por separado. El eje de las x es el número de pocillos,
una escala arbitraria para diseminar los datos para su visión.
Figura 13: Señal de SPA obtenida para 0,2 hasta
200 \muM de fosfato. Los resultados se muestran para cuatro
diferentes concentraciones de perlas para SPA (a) a escala lineal,
(b) a escala logarítmica.
La línea teórica mostrada en (b) (asteriscos) es
simplemente una línea recta para referencia.
Figura 14: Señal de SPA obtenida para 0,5 hasta
10 \muM de fosfato o ATP. Los resultados se muestran para fosfato
en la presencia de AmMo (rombos); para fosfato en la ausencia de
AmMo (triangulos); para ATP en la presencia de AmMo (cuadrados) y
para ATP en la ausencia de AmMo (cruces). (a) a escala lineal (b) a
escala logarítmica.
Figura 15: Estimación del valor de
K_{m}(ATP) para E1 procedente de HPV-11,
determinado mediante detección por SPA. Los valores determinados
experimentalmente se representan en forma de círculos, la línea
representa el ajuste óptimo teórico calculado para la ecuación de
Michaelis-Menten.
Figura 16: Estimación del valor de
K_{m}(ATP) para E1 procedente de HPV-11,
determinado mediante detección por TLC. Los valores determinados
experimentalmente se representan en forma de círculos, la línea
representa el ajuste óptimo teórico calculado para la ecuación de
Michaelis-Menten.
Figura 17: Representaciones gráficas (dobles
recíprocas) de Lineweaver-Burke, que comparan los
datos experimentales de inhibición con los resultados teóricos
basados en parámetros obtenidos por regresión no lineal. (A) en el
modelo de inhibición competitiva. (B) en el modelo de inhibición no
competitiva (igual fijación a E y a ES). Para ambos gráficos, los
valores experimentales se dan como puntos con concentraciones del
agente inhibidor de 24 \muM (rombos); 12 \muM (asteriscos); 6
\muM (cuadrados); 3 \muM (triángulos); y 0 (círculos). Las
líneas están basadas en los parámetros de ajuste óptimo para cada
modelo de inhibición.
La expresión "superficie hidrófoba de agente de
escintilación", como se usa en el presente contexto, significa
una superficie hidrófoba que está impregnada, integrada,
revestida o contiene de otro modo un agente de
escintilación.
La expresión "agente de escintilación", como
se usa en el presente contexto, significa una molécula fluorescente
(también denominada fluorescedora) que, cuando se coloca en última
proximidad con una energía de radiación emitida a partir de un
reaccionante marcado radiológicamente para ella, es activada con el
fin de emitir energía luminosa detectable y medible por un contador
de escintilación.
De acuerdo con una primera forma de realización
del presente invento, se proporciona un método para detectar y medir
el ortofosfato inorgánico (Pi) marcado radiológicamente en una
mezcla acuosa de reacción, que comprende las etapas de:
- a.
- añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción en condiciones ácidas para formar un complejo de fosfomolibdato;
- b.
- poner en contacto dicho complejo de fosfomolidato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación;
con lo que la fijación de fosfomolibdato a dicha
superficie proporciona una proximidad suficiente para que el fosfato
marcado radiológicamente induzca una escintilación medible del
agente de escintilación, que se correlaciona con la cantidad de
dicho
ortofosfato.
De acuerdo con una segunda forma de realización
del invento, se proporciona un método para determinar la actividad
de una enzima que hidroliza a fosfatos, que comprende las etapas
de:
- a.
- mezclar [\gamma-^{33}P]ATP marcado radiológicamente con una de dichas enzimas
- b.
- incubar la mezcla de reacción durante un período de tiempo suficiente para dar lugar a que el ortofosfato sea puesto en libertad a partir de una hidrólisis;
- c.
- añadir una solución de molbdato a dicha mezcla de reacción con el fin de formar un complejo de fosfomolibdato;
- d.
- poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación; y
- e.
- medir la escintilación de dicho agente de escintilación como un medio para calcular la cantidad de dicho ortofosfato.
Opcionalmente, el método comprende también: la
etapa f) de añadir una solución de CsCl a dicha mezcla de reacción
antes del recuento. Opcionalmente además, el método comprende la
etapa g) de añadir una solución de ácido cítrico a dicha mezcla que
contiene CsCl antes del recuento.
De acuerdo con una tercera forma de realización
del presente invento, se proporciona un ensayo para escrutar agentes
inhibidores de una actividad de una enzima que hidroliza al fosfato,
que comprende las etapas de: llevar a cabo las etapas a hasta e (y
opcionalmente las etapas f y g) de acuerdo con el método antes
descrito, en la presencia y en la ausencia de un agente inhibidor
candidato; y comparar los niveles de inhibición.
De acuerdo con una cuarta forma de realización
del presente invento, se proporciona un estuche para medir el
ortofosfato marcado radiológicamente en una solución acuosa,
comprendiendo dicho estuche:
a) una solución de molibdato; y
b) una superficie hidrófoba de un agente de
escintilación;
en el que dicha solución de molibdato es añadida
a dicha solución acuosa para formar un complejo de fosfomolibdato,
siendo capturado dicho complejo por dicha superficie hidrófoba para
inducir una escintilación medible en
ella.
Preferiblemente, de acuerdo con la anteriores
formas de realización de este invento, la solución de molibdato y la
superficie hidrófoba se pueden añadir de una manera simultánea a la
mezcla de reacción.
Preferiblemente, las formas de realización de
este invento comprenden además la etapa de:
añadir una solución de CsCl a la mezcla de
reacción antes del recuento.
Más preferiblemente, el invento comprende además
una etapa de:
añadir una solución de ácido cítrico a dicha
mezcla que contiene CsCl antes del recuento.
De modo sumamente preferible, el CsCl y el ácido
cítrico se añaden simultáneamente a la mezcla de reacción.
Preferiblemente, la mezcla de reacción que
contiene CsCl y ácido cítrico se incuba durante más de una hora
antes del recuento de la escintilación.
Preferiblemente, el molibdato de amonio está en
una concentración final de 0,05% a 0,3%, más preferiblemente de 0,1%
a 0,2% p/v. De modo sumamente preferible, el molibdato de amonio
está en una concentración final de aproximadamente 0,17% p/v.
Preferiblemente, la superficie hidrófoba se
selecciona entre el conjunto que consta de:
poli(vinil-tolueno) (PVT),
Sephadex, látex, poliestireno, poli(acrilamida), acrilamida,
agarosa, polipropileno, policarbonato y Sepharose. Más
preferiblemente, la superficie hidrófoba es la de perlas de
poili(vinil-tolueno) tales como perlas para
SPA.
Preferiblemente el CsCl está en una concentración
final más alta que 1 M. Más preferiblemente, el CsCl está en una
concentración final que fluctúa entre 2 M y 4 M. De modo sumamente
preferible, el CsCl está en una concentración final de
aproximadamente 3,5 M.
Preferiblemente, el ácido cítrico está en una
concentración final que fluctúa entre 0,05 y 0,2 M. Más
preferiblemente, el ácido cítrrico está en una concentración final
de aproximadamente 0,1 M.
Preferiblemente, la enzima que hidroliza a
fosfatos se selecciona entre el conjunto que consta de: una
helicasa, una ATPasa y una fosfatasa. más preferiblemente, la enzima
es una ATPasa. De modo sumamente preferible, la ATPasa es la
helicasa de E1 procedente de papilomavirus humanos.
Las abreviaturas usadas en los ejemplos
incluyen:
AmMo | molibdato de amonio |
ATP-\gamma-S | adenosina-5'-O-(3-tio-trifosfato) |
cpm | cómputos por minuto |
DMSO | dimetil-sulfóxido |
DTT | ditiotreitol |
EDTA | ácido etilen-diamina-tetraacético |
HEPES | N-[2-hidroxi-etil]piperazina-N'-[ácido 2-etano-sulfónico] |
MES | ácido 2-[N-morfolino]-etano-sulfónico |
MgOAc | acetato de magnesio |
PEI | poli(etilenimina) |
Pi | ortofosfato inorgánico |
PVPP | polivinil-polipirrolidona |
PVT | poli(vinil-tolueno) |
SPA | ensayo de proximidad de la escintilación |
TLC | cromatografía de capa fina |
La E1 procedente de HPV-11.
marcada con polihistidina. se expresó en células de insectos
infectados por baculovirus y se purificó por cromatografía de
afinidad con Ni como se describe en el documento WO 99/57283
Un [\gamma-^{33}P]ATP
marcado radiológicamente (NEN) se preparó en el momento de su
recepción diluyéndolo a 100 veces en el tampón de reacción y
almacenándolo a -80ºC. Un material almacenado de esta manera era
bueno durante más de un mes. Las reacciones de ATPasa con E1 se
realizaron en un tampón que constaba de 20 mM de HEPES, de pH 7,5,
0,05 mM de EDTA y 1 mM de DTT, y 0,05% de Igepal
CA-630 (equivalente a Nonidet P40). Los volúmenes y
las concentraciones dadas seguidamente son de carácter típico, pero
se pueden hacer variar de algún modo con un efecto mínimo sobre los
resultados, como se muestra en posteriores ejemplos. Se mezclaron 1
\muM de ATP (de Amersham Pharmacia) y 500 \muM de MgOAc con
[\gamma-^{33}]ATP, en una dilución de 100
veces, a partir del material almacenado (dilución a 10.000 a partir
del material original), o aproximadamente 1 nCi/\mul cuando estaba
en estado reciente. La concentración real de ATP con la que
contribuía el [\gamma-^{33}]ATP era de
aproximadamente 1 mM; esta cantidad se podría reducir aún más si
fuese necesario. Se añadió suficiente cantidad de enzima para dar el
nivel deseado de conversión. Por ejemplo, 4 nM de E1 procedente de
HPV-6a convertían aproximadamente a un 30% del
substrato en ADP y fosfato en 2 horas. Un volumen típico de reacción
era el de 40 \mul; las reacciones se llevaron a cabo a la
temperatura ambiente en placas de 96 pocillos, típicamente en
Optiplates (de Packard).
En el momento deseado, las reacciones de 40
\mul se detuvieron añadiendo 20 \mul de una mezcla de perlas
para SPA y AmMo. Esta mezcla constaba de una parte de AmMo al 2%
(p/v) en 2,4 M de HCl por dos partes de perlas para SPA de PVT con
estreptavidina (Pharmacia Amersham #RPNQ0007), suspendidas a razón
de 30 mg/ml en 50 mM de Hepes más 0,02% de aziduro de sodio. La
solución de molibdato de amonio se preparaba usualmente de manera
reciente cada día mientras que la suspensión de perlas para SPA era
estable durante más de un mes. La mezcla se puede preparar varias
horas de antemano, y se puede usar incluso durante varios días
cuando se almacena a 4ºC. Inmediatamente después de haber añadido la
mezcla de molibdato de amonio y perlas, se añadieron 80 \mul de
cloruro de cesio 7 M más ácido cítrico 0,2 M. Las placas se agitaron
brevemente y luego se dejaron sedimentar durante más de una hora. La
extensión de la producción de fosfato se determinó luego por
recuento de la escintilación usando el TopCount (de Packard). Si se
desea, las cpm se pueden convertir en una concentración de fosfato
por comparación de los resultados del SPA con los determinados por
TLC (véase seguidamente) para reacciones idénticas.
Alternativamente, los resultados se pueden comparar con un
"testigo de 100%", una reacción con un gran exceso de enzima
confirmada previamente por TLC para dar la conversión completa de
ATP en fosfato y ADP. Muestras en vacío que no contienen ninguna
enzima, pero por lo demás son iguales, se trataron en paralelo y se
restaron.
Las reacciones con ATPasa se llevaron a cabo
justamente como en el formato de SPA. Al final del período de tiempo
de reacción planificado, las reacciones se detuvieron añadiendo
medio volumen de EDTA 500 mM enfriado por hielo, de pH 8,0. Unas
muestras de reacción de uno a dos microlitros (\mul) se
extendieron en forma de motas sobre las placas de TLC a base de
celulosa revestida con poli(etilenimina) (de Sigma) y se
eluyeron en una solución de 1 M de LiCl y 1 M de ácido fórmico. El
[\gamma-^{33}P] fosfato y el ATP se determinan
usando el sistema de reproducción en imágenes fosforescentes Storm
860 (de Molecular Dynamics). Para cada muestra, inclusive las
muestras en vacío, se cuantificaron las intensidades de las motas de
fosfato y ATP y el % de fosfato se calculó como:
100 X \frac{(intensidad \ de
\ fosfato)}{(intensidad \ de \ fosfato + intensidad \ de \
ATP)}
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores en vacío estaban en el mismo
intervalo que para el SPA, aproximadamente en 2-5%,
y fueron restados de los valores para cada reacción con el fin de
dar el valor del % de fosfato producido por la reacción
enzimática.
Muchas de las reacciones realizadas en esta
sección se realizaron con condiciones ligeramente diferentes, usando
un tampón de reacción a base de 20 mM de MES, de pH 7,0, 10% de
glicerol y 0,05 mM de EDTA. Las reacciones se realizaron con 10
\muM de ATP (aproximadamente 1 mM de
[\gamma-^{33}P]ATP), 500 \muM de MgOAc
y suficiente cantidad de E1 para dar una conversión de
aproximadamente 20% del substrato en el transcurso de 90 minutos a
la temperatura ambiente. Igual que para los Ejemplos 1 y 2, las
reacciones se realizaron en Optiplates de Packard. En estos
experimentos, la detección se llevó a cabo típicamente mezclando 20
\mul de una mezcla de reacción de ATPAsa con 20 \mul de AmMo al
2% en HCl 1,2 M que contenía 0,05% de Tween-20.
Después de 10 minutos, se añadieron 20 \mul de una suspensión de
perlas para SPA con estreptavidina (10 mg/ml en 50 mM de HEPES, de
pH 7,5 + 0,02% de NaN_{3}), después de una breve mezcladura, esto
fue seguido por 20 \mul de CsCl 7,0 M. Después de haber mezclado,
se dejó que las placas reposasen durante una hora antes de recontar
en el TopCount, como se describe en el Ejemplo 1.
Tipo de perlas para SPA: Las perlas para
SPA de PVT están disponibles con una diversidad de moléculas unidas
a su superficie. Los tipos que estaban disponibles para su
evaluación en el ensayo incluían estreptavidina, aglutinina de
germen de trigo, proteína A, IgG anti-ratón y
glutatión. Aunque son las propiedades hidrófobas de las perlas de
PVT las que tienen afinidad para el fosfomolibdato, se ensayaron una
diversidad de revestimientos para observar si el tipo de la molécula
situada sobre la superficie tenía algún efecto sobre la señal de
SPA. Los datos de cpm se muestran en la Figura 1A. Las relaciones de
señal del testigo y de señal de vacío, o "relaciones de señal a
fondo" se muestran en la Figura 1B. No hay ningún efecto
significativo del tipo de revestimiento. Se han obtenido también
resultados similares con perlas de cobre (fijación a una marca con
His), y de hecho, las perlas de PVT sin revestir, proporcionadas por
Amersham-Pharmacia, proporcionan también una señal
equivalente. Las perlas para SPA con silicato de itrio no funcionan
en este ensayo, como se esperaba, puesto que ellas carecen de una
superficie hidrófoba.
Concentración de molibdato de amonio: La
función del molibdato de amonio en la solución de detención es la de
convertir en un complejo al fosfato liberado en la reacción con
ATPasa. Las concentraciones ensayadas de molibdato de amonio en la
solución de detención fluctuaban entre 1 y 4%. Los efectos sobre los
cpm se muestran en la Figura 2A, y las relaciones de señal a fondo
se muestran en la Figura 2B. [Obsérvese: que la muestra en vacío
está relativamente sin afectar por concentraciones crecientes de
AmMo. Por lo tanto, en estas condiciones, no parece que el fondo
resulte de contaminar el ortofosfato presente en la solución de ATP,
sino que más bien puede ser debido a una adherencia inespecífica de
ATP a las perlas o a la captura de alguna radiación de partículas
\beta, emitida por el
[\gamma-^{33}P]ATP en solución]:
Concentración de HCl: La función del HCl
en la solución de detención es la de proporcionar un medio de
carácter ácido en el que se pueda formar el complejo de
fosfomolibdato. Los efectos sobre los cpm de unas concentraciones de
HCl que fluctúan entre 0 y 2,4 M en la solución de detención se
muestran en la Figura 3A, y las relaciones de señal a fondo se
muestran en la Figura 3B. En estas condiciones se determinaron que
eran óptimos los valores mayores que 1 M.
Concentración de CsCl: Se añade CsCl antes
del recuento de la escintilación, con dos finalidades. La primera es
la de producir un medio con un alto contenido de sal (= alto en sal)
que aumenta el efecto hidrófobo, intensifica la fijación del
complejo de fosfomolibdato a las perlas para SPA; la segunda es la
de aumentar la densidad del fluido en el pocillo. Las perlas para
SPA de PVT tienen una densidad específica de aproximadamente 1,05
g/ml, y tienden a permanecer dispersas en una solución acuosa,
sedimentándose sólo con lentitud sobre el fondo en el transcurso de
varías horas. La adición de CsCl de alta molaridad aumenta la
densidad del líquido, dando lugar a que las perlas de SPA formen una
delgada capa que flota en la superficie, aumentando con ello la
señal detectable. El CsCl 7,0 M es esencialmente una solución
saturada. El efecto sobre los cpm de añadir 20 \mul de CsCl en
diferentes concentraciones se muestra en la Figura 4A, y el efecto
sobre las señales de señal a fondo se muestra en la Figura 4B. Se
obtuvo una relación óptima de señal a fondo usando una solución 7,0
M.
Período de tiempo de incubación en molibdato
de amonio antes de la adición de CsCl: El efecto sobre los cpm
de hacer variar la duración del tiempo que transcurre entre la
adición de AmMo y la adición de CsCl se muestra en la Figura 5A, y
el efecto sobre las relaciones de señal a fondo se muestra en la
Figura 5B. Se pone de manifiesto que la señal de reacción es
aproximadamente constante, pero que la señal de vacío aumenta con el
tiempo; por lo tanto, la relación de señal a fondo disminuye con
unos tiempos de incubación en aumento.
Período de tiempo que transcurre entre la
adición de CsCl y el recuento de la escintilación: En el
procedimiento patrón, las placas se recuentan una hora después de la
adición de una solución de CsCl. Los cpm y las relaciones de señal a
ruido, obtenidas recontando la misma placa en diversos momentos
durante un período de tiempo de 48 horas, se muestran en las Figuras
6A y 6B.
Estabilidad de la señal: Los experimentos
representados en las Figuras 5 y 6 indican que la señal del ensayo
es inestable. La señal de vacío aumenta constantemente con el
tiempo. Se mostró mediante detección por TLC que el hecho de mezclar
ATP y HCl en las concentraciones anteriores da como resultado una
lenta degradación de ATP a fosfato, y esto responde casi con
certidumbre del aumento observado en la señal. El mismo problema se
presenta en otros ensayos, que recurren a la formación de
fosfomolibdato para detectar el fosfato, por ejemplo mediante un
cambio en el color o la formación de un precipitado. Se ha mostrado
que el ácido cítrico, añadido inmediatamente después que el AmMo, se
fijará apretadamente a cualquier molibdato libre, impidiendo la
incorporación del fosfato subsiguientemente liberado en aniones de
fosfomolibdato. El intercambio es extremadamente lento, por lo que
la adición de citrato no disminuye la concentración de
fosfomolibdato previamente formado, ni siquiera después de varios
días.
El efecto de añadir ácido cítrico 0,2 M a la
solución de CsCl 7 M se muestra en la Figura 7. En este experimento,
se realizaron reacciones con 30 \mul de ATPasa de E1, tal como se
describe al comienzo del Ejemplo 3. Después de esto, se añadieron 30
\mul de AmMo al 2% en HCl 1 M, seguido inmediatamente por 30
\mul de perlas para SPA de 10 mg/ml y luego por 30 ó 90 \mul de
CsCl 7 M \pm ácido cítrico 0,2 M. La señal es intensificada
aproximadamente al doble después de una incubación durante una hora,
y es estabilizada de una manera significativa por la adición de
ácido cítrico, de modo que se observa poco cambio incluso después de
tres días.
Un experimento adicional, que muestra el efecto
de las concentraciones de AmMo, CsCl, HCl y ácido cítrico sobre la
señal y sobre la estabilidad de la señal, se muestra en la Figura 8.
Las reacciones se realizaron tal como se describe al comienzo de
este ejemplo, excepto que el detergente Igepal-CA630
(de Sigma, equivalente a Nonidet-P40) estaba
presente en una concentración de 0,005% en todas las reacciones,
excepto en un conjunto de ellas, y se incluyó ácido cítrico en la
solución de CsCl en concentraciones de 0,1 M, 0,2 M o 0,4 M. Se
incluyó 0,05% de Tween-20 en la solución de
molibdato de amonio en uno de los casos. Se conoce que el
Tween-20 estabiliza al complejo de fosfomolibdato y
verde de malaquita en el ensayo de Itaya y Ui (Clin. Chim Acta,
1966), pero no tiene ningún efecto beneficioso en este ensayo. La
placa de ensayo se leyó a las 1,5, 6,5 y 20 horas después de la
adición de la mezcla de CsCl y ácido cítrico. La señal aumentó sólo
ligeramente después de 1,5 horas y era estable hasta durante al
menos 20 horas.
El inhibidor testigo
ATP-\gamma-S se añadió a algunos
pocillos en una concentración de 10 \muM (datos no mostrados, pero
véase el Ejemplo 4), para verificar la robustez de los datos
obtenidos en diferentes puntos de tiempo (momentos). A lo largo de
todas las condiciones y puntos de tiempo ensayados, el nivel de
inhibición varió solamente de 63,9 a 70,0%. Por lo tanto, las
variaciones en cuanto a la detección en las diferentes condiciones
del ensayo pueden tener un cierto efecto sobre los cpm observados,
pero no afectan a las señales relativas entre reacciones de enzimas,
reacciones inhibidas y ensayos en vacío, y por lo tanto no afectan a
la exactitud fundamental del ensayo.
Un ejemplo de un experimento de curso en el
tiempo tiempo, usando la E1 procedente de HPV-11, se
muestra en la Figura 9. Este experimento se realizó en las
condiciones antes descritas para la Figura 8, excepto en lo que se
refiere a la presencia de detergente al 0,005% como antes se
describe. Los datos mostrados son los valores medios para cuatro
reacciones de 180 \mul. En cada punto de tiempo, se retiraron 30
\mul y se mezclaron con 30 \mul de una solución de una mezcla de
AmMo y perlas para SPA, seguidos por 90 \mul de una mezcla de CsCl
7,0 M y ácido cítrico 0,2 M antes del recuento de la
escintilación.
Las siguientes soluciones se usaron para realizar
reacciones de 45 \mul para determinar curvas de IC_{50}:
- ATP (15 \mul por reacción) que constaba de
3,0 \muM de ATP, 1,5 mM de acetato de Mg y 0,06 \muCi de
[\gamma-^{33}P]ATP;
- E1 (15 \mul por reacción), que constaba de 18
nM de E1 procedente de HPV-6;
- Solución de agente inhibidor (15 \mul por
pocillo) que constaba de
\gamma-S-ATP, disuelto en un
tampón más 18% de DMSO.
Todas las soluciones se prepararon en el tampón
de ensayo descrito en el Ejemplo 3, excepto que el tampón de ensayo
contenía también 0,005% de Igepal CA-630. Todos los
componentes son diluidos en 3 veces al mezclar las mezclas de
reacción. Los reaccionantes se añadieron en el siguiente orden: a)
el agente inhibidor; b) la E1 procedente de HPV-6,
c) el ATP. El intervalo de concentraciones para el inhibidor en las
mezclas de reacción era de 0,2 a 100 \muM. Después de 75 minutos,
las mezclas de reacción se sofocaron añadiendo 45 \mul de una
mezcla que constaba de 2 partes de perlas para SPA con
estreptavidina (15 mg/ml de suspensión) en un tampón para
resuspensión (Ejemplo 2) y una parte de HCl 2,4 M que contenía 2% de
molibdato de amonio. Luego se añadieron 90 \mul de CsCl 7 M que
contenía 0,1 M de ácido cítrico. Después de haber mezclado
brevemente, las placas se dejaron durante 90 minutos y luego se
recontaron en un TopCount. Los datos de inhibición (véase la Figura
10) se ajustaron a un sistema lógico que usaba un SAS (Statistical
Software System = Sistema de programa lógico estadístico; SAS
Institute, Inc. Cary, N.C.) con testigos positivos que daban un
promedio de 16.000 cpm y muestras en vacío que daban un promedio de
1.300 cpm. Se han obtenido también resultados similares en los casos
en los que la detección se realizó mediante una TLC.
En este experimento, una reacción de ATPasa
grande se llevó a cabo con suficiente cantidad de E1 para dar el
100% de la hidrólisis del ATP. La E1 se desactivó seguidamente por
calor, y la mezcla de reacción se mezcló en diversas proporciones
con una muestra en vacío de reacción que no contenía E1. El tampón
de reacción y las condiciones de incubación eran tal como se han
descrito en el Ejemplo 1, excepto que el tampón de reacción era tal
como se ha descrito en el Ejemplo 3, aunque estaba presente 0,005%
de Igepal CA630. Las mezclas de reacción y en vacío se hicieron a
razón de 2:3, 1:5, 1:10 y 1:20 para simular un intervalo de
hidrólisis de 40% a 5%. Igual que para algunos de los experimentos
anteriores, la detección por SPA se realizó usando molibdato de
amonio, HCl y ácido cítrico a varias concentraciones diferentes. Los
resultados para algunas condiciones, juntamente con los obtenidos
por la TLC, se muestran en la Figura 11. En todos los casos, las
señales detectadas (expresadas como una proporción de 100% para el
SPA y como la concentración observada de fosfato para la TLC) son
muy similares. Aunque la señal absoluta (de cpm) varía con las
condiciones, la señal relativa, y por lo tanto la exactitud del
ensayo, es constante. En particular, una conversión de 20% simula
una extensión típica de reacción en condiciones de escrutinio y una
conversión de 10% representa la señal que se observaría para
compuestos de ensayo que dan una inhibición de 50%.
Con el fin de verificar la variabilidad de este
método de un pocillo a otro, las reacciones se realizaron, tal como
se ha descrito en el Ejemplo 1, en 80 pocillos de tres placas de 96
pocillos dispuestas por separado. Las muestras en vacío de reacción
sin enzima se realizaron en los otros 16 pocillos. Los resultados se
muestran en la Figura 12. La variabilidad de un pocillo a otro se
puede medir usando la estadística de z', que toma en cuenta las
desviaciones típicas de las señales y la separación entre la señal
procedente de reacciones enzimáticas y la procedente de muestras en
vacío (J-H Zhang, y colaboradores, J. Biomol.
Screening, 1999, 4, 67-73). Los
valores pueden fluctuar desde menos de 0 a 1,0, estimándose que los
valores mayores que 0,5 son muy aceptables para un ensayo de
escrutinio. El valor de z' para este experimento fue de 0,63 ó 0,75
cuando se retiraron del análisis dos manifiestas muestras situadas
fuera de la norma.
Los anteriores Ejemplos demuestran que la
detección de fosfato por SPA se realiza bien para bajas
concentraciones de fosfato, de 0,1-1 \muM. Sin
embargo, con el fin de llevar a cabo un trabajo mecanístico (=
determinado mecánicamente), es necesario hacer variar más
ampliamente la concentración de ATP. Los autores hemos observado que
el proceso bosquejado en el Ejemplo 1 no captura cuantitativamente
la totalidad del ortofosfato, puesto que se observó una señal
aumentada en el caso de que se hubieron añadido mayores cantidades
de perlas para SPA. Basándose en estos resultados iniciales, un
experimento de valoración de perlas para SPA se llevó a cabo tal
como se describe seguidamente.
Similarmente al Ejemplo 5, para este experimento
se realizó una reacción mayor usando una alta concentración de E1.
En este caso, la concentración de ATP era de 200 \muM. La reacción
se llevó a cabo durante cuatro horas a la temperatura ambiente y a
continuación durante dos horas a 37ºC, para asegurar una conversión
completa. Una muestra se analizó por TLC con el fin de verificar la
conversión cuantitativa. La mezcla de reacción se diluyó luego en
serie con el tampón de reacción más magnesio para un intervalo de
concentraciones de fosfato de 200 \muM a 0,2 \muM. Las muestras
se analizaron combinando 45 \mul de una mezcla de reacción diluida
con 15 \mul de molibdato de amonio (al 2% en HCl 2,4 M) y con 30
\mul de una suspensión de perlas para SPA a unas concentraciones
de 7,5, 15, 30 ó 60 mg/ml. Finalmente, se añadieron a todos los
pocillos 90 \mul de CsCl 7 M más ácido cítrico 0,2 M.
Los resultados se muestran en la Figura 13A y
como una representación gráfica de log-log en la
Figura 13B. Como se observa con la máxima claridad en la Figura 13B,
para cada concentración de perlas para SPA la señal era directamente
proporcional a la concentración de fosfato hasta llegar a
aproximadamente 100 \muM. Sin embargo, la señal absoluta depende
de la concentración de perlas. De modo interesante, las líneas en la
Figura 13B son paralelas, es decir que el aumento proporcional en la
señal, obtenido aumentando la concentración de perlas para SPA es el
mismo con todas las concentraciones de fosfato hasta llegar a
aproximadamente 100 \muM.
En este experimento, una reacción grande similar
a la anterior se llevó a cabo para convertir completamente 10 \muM
de ATP en fosfato y ADP; se verificó la conversión completa mediante
una TLC (Ejemplo 2). En paralelo, se produjo una mezcla idéntica que
carecía de enzima. Cada una de estas mezclas se diluyó en un tampón
como anteriormente para dar soluciones con unas concentraciones de
fosfato o ATP que fluctuaban entre 10 \muM y 0,5 \muM. Muestras
duplicadas de 45 \mul de cada una de las mezclas se mezclaron o
bien con 40 \mul de una mezcla de AmMo y perlas para SPA, como se
describe en el Ejemplo 1, o con una mezcla similar que carecía de
AmMo (pero que todavía contenía HCl), seguida por 80 \mul de una
mezcla de CsCl y ácido cítrico. Los resultados se representan
gráficamente en la Figura 14A o como una representación gráfica de
log-log en la Figura 14B. Como se espera, basándose
en el Ejemplo 7, la señal es dependiente linealmente de la
concentración de radiactividad en todos los casos. En la presencia
de AmMo, la muestra en vacío de reacción (solución de ATP) da una
señal igual a aproximadamente 5% de la solución de fosfato producida
por una conversión total. A diferencia del experimento representado
en el Ejemplo 3 (Figura 2), la mayor parte de la señal en vacío es
dependiente de AmMo y por lo tanto, en estas condiciones, la señal
en vacío es debida principalmente al ortofosfato contaminador ya
presente en la solución de ATP comercial.
Los cursos de ATPasa en el tiempo se realizaron a
diferentes concentraciones de ATP con el fin de determinar el
parámetro cinético K_{m}(ATP) para la E1 procedente de
HPV-11. Las reacciones se realizaron en condiciones
similares en ambos experimentos, usando los procesos presentados en
los Ejemplos 1 y 2, excepto que la concentración de
Igepal-CA630 era de 0,01% en vez de 0,005% y con
cambios específicos para los experimentos que se señalan
seguidamente. La concentración de E1 era de 2 nM y las
concentraciones de ATP fluctuaban entre 3 y 75 \muM (para TLC) o
entre 2 y 50 \muM (para SPA), siendo la concentración de MgOAc
igual a la concentración de ATP más 0,5 mM. Soluciones originales
de ATP en cada concentración se obtuvieron diluyendo la solución de
concentración más alta con un tampón que contenía 0,5 mM de MgOAc;
por lo tanto, se usó para todas las reacciones una relación
constante de ATP marcado radiológicamente a ATP no marcado. Los
regímenes de reacción se midieron tomando puntos de tiempo para 10 ó
20 hasta 120 minutos. Con el fin de asegurar unas condiciones de
velocidad inicial, no se usaron para el análisis los puntos de
tiempo que daban una conversión mayor que 20%.
Detección y tratamiento de los datos para el
experimento de K_{m} con SPA: Los volúmenes totales de reacción
fueron de 150 \mul. Para cada punto de tiempo se retiraron 20
\mul de la mezcla de reacción y se combinaron con 40 \mul de una
mezcla de molibdato de amonio y perlas para SPA, seguidos por 80
\mul de una mezcla de CsCl y ácido cítrico. Todas las reacciones
se realizaron en triplicado. Las placas se sometieron a recuento
después de incubación durante una noche. En el ultimo punto de
tiempo, se retiró una parte alícuota adicional de 20 \mul y se
combinó con 10 \mul de EDTA 0,5 M. En este caso, la conversión de
ATP en fosfato se cuantificó por TLC, y la concentración de fosfato
determinada por TLC se comparó con los cpm para el proceso por SPA
después de haber restado los valores en vacío en ambos casos. La
relación entre la concentración de fosfato y los cpm es lineal, y la
pendiente de la línea se usó para convertir los valores de cpm
procedentes de la detección con SPA en una concentración de fosfato
producido. Los regímenes de producción de fosfato con cada una de
las concentraciones de ATP se ajustaron por regresión no lineal para
la ecuación de Michaelis-Menten usando el programa
GraFit (V 3.01, R. Leatherbarrow). Los resultados se muestran en la
Figura 15.
La detección y el tratamiento de los datos para
el experimento de K_{n} por TLC: Igual que para el experimento por
SPA anterior, se realizaron reacciones con 150 \mul, en duplicado.
En cada punto de tiempo, se retiraron 20 \mul y se combinaron con
10 \mul de EDTA 0,5 M enfriado por hielo. Al completarse el curso
en el tiempo, las muestras de reacción se diluyeron de tal manera
que la concentración total de radiactividad para cada punto era
aproximadamente igual. Por lo tanto, las muestras de reacción con
75 \muM de ATP fueron diluidas en 25 veces, mientras que las
muestras de reacción con ATP 3 \muM no fueron diluidas. El tampón
para dilución constaba de dos partes de un tampón para reacción que
contenía 500 \muM de acetato de magnesio y una parte de EDTA 0,5
M. Un microlitro (\mul) de cada muestra de reacción diluida se
extendió en motas para la detección por TLC. Los valores para el
grado de conversión porcentual de ATP en fosfato se determinaron tal
como se ha descrito en el Ejemplo 2 y éstos se usaron para
determinar los regímenes de reacción en cada concentración de ATP.
Estos regímenes se ajustaron luego a la ecuación de
Michaelis-Menten tal como antes se describe, para
dar una estimación para el valor de K_{m}(ATP) (Figura
16).
La comparación de las Figuras 15 y 16 muestra con
claridad que las dos técnicas proporcionan resultados similares,
pero también que la calidad de los datos es superior para el método
de SPA. Además, el método de SPA requiere significativamente menos
manipulación y un tiempo más corto de tratamiento de los datos. Los
resultados mostrados son ejemplos típicos, cada uno de ellos han
sido reproducidos múltiples veces.
El compuesto análogo a ATP con
\gamma-tio-fosfato inhibe a muchas
ATPasas por un mecanismo competitivo. La determinación experimental
del mecanismo de la acción del agente inhibidor requiere medir las
velocidades iniciales para un cierto número de concentraciones del
substrato y del inhibidor. El número de puntos de datos necesarios
(varios cientos) y la precisión requerida para este experimento
significan que la realización del experimento mediante detección por
TLC es mucho más difícil y tediosa. El proceso de SPA funciona bien,
sin embargo. Para este experimento, se usaron unas concentraciones
de ATP de 5, 10, 20 y 40 \muM, juntamente con unas concentraciones
de agente inhibidor de 0, 3, 6, 12 y 24 \muM. Las reacciones se
realizaron tal como se ha descrito para el Ejemplo 9 (detección por
SPA). Los datos fueron tratados como anteriormente y ajustados por
regresión no lineal a una ecuación para la inhibición competitiva
usando el programa GraFit. Los autores hemos obtenido unos valores
para K_{i}(ATP-\gamma-S)
de 3,8 \pm 0,4 \muM y para K_{m}(ATP) de 6,7 \pm 0,7
\muM.
Una representación gráfica de
Lineweaver-Burke, que ilustra el grado de ajuste, se
muestra en la Figura 17A. La representación gráfica se generó en
Excel usando los parámetros ajustados para las líneas y los valores
experimentales para los puntos. Como comparación, los datos se
ajustaron también a una ecuación para una inhibición no competitiva
(igual fijación de agente inhibidor a enzimas y a complejos de
enzimas y substratos). Los valores obtenidos fueron de 16 \pm 2
\muM para
K_{i}(ATP-\gamma-S) y de
12 \pm 2 mM para K_{m}(ATP). La correspondiente
representación gráfica recíproca doble se muestra en la Figura
17B.
A causa de la calidad de los datos obtenidos, es
posible observar una desviación sistemática entre los valores
experimentales y los valores ajustados para este segundo mecanismo,
especialmente a unas concentraciones más altas del agente inhibidor.
Se puede obtener una conclusión similar a partir del valor de chi
cuadrado reducido, que es significativamente menor para el ajuste
competitivo en comparación con el ajuste no competitivo (62 y 347
respectivamente). Por lo tanto, tal como se espera, el modelo
competitivo es más apropiado para este inhibidor.
El proceso presentado anteriormente es un método
sensible, exacto y robusto para la detección del ortofosfato
producido por la disociación de compuestos que contienen fosfato
marcado radiológicamente. Éste es adecuado en alto grado para la
tarea de medir la actividad de enzimas para las que el ortofosfato
es un producto de reacción, y para medir la inhibición de tales
actividades. Existen muchas de dichas enzimas; ejemplos corrientes
de ellas son helicasas, ATPasas y fosfatasas. Este proceso es
particularmente apropiado para casos en los que se producen
solamente bajas concentraciones de ortofosfato (del orden de nM o
bajos \muM). Casos importantes serán aquellas enzimas, tales como
la helicasa de E1 procedente de HPV, que se fija apretadamente al
substrato de fosfo. Este proceso permite que se realicen ensayos en
unas concentraciones de substrato situadas por debajo del valor de
K_{m} para una máxima sensibilidad a agentes inhibidores
competitivos. El método es simple y suficientemente robusto para un
escrutinio de agentes inhibidores a gran escala. En particular, el
método no es sensible a muchas aberraciones corrientes, por ejemplo
la inhibición aparente causada por compuestos coloreados o
fluorescentes, y la señal producida es estable, reproducible y
relativamente insensible a pequeñas fluctuaciones en las
concentraciones o los volúmenes de componentes del ensayo. El método
es también lo suficientemente exacto como para ser aplicado a
estudios enzimológicos cuantitativos.
Otros métodos para detectar el ortofosfato han
sido debatidos en la bibliografía. Dos métodos ampliamente
informados usan un ATP marcado radiológicamente para medir la
actividad como ATPasa. Ambos métodos implican la separación física
de productos (p.ej. ADP y Pi) con respecto del material de partida,
usando o bien una TLC en PEI - celulosa o una adsorción selectiva de
ATP sobre carbón orgánico. Aunque son suficientemente sensibles para
detectar muy bajas concentraciones de ortofosfato, éstos son métodos
clásicos que no se pueden adaptar con facilidad a las modernas
aplicaciones de escrutinio. Otros métodos de ensayo recurren al
acoplamiento de enzimas que usan el ortofosfato (u otro producto de
reacción) como substrato en una segunda reacción, produciendo un
cambio en la absorbencia o en la fluorescencia. Estos pueden
resultar bastante exactos, pero son menos sensibles que los ensayos
basados en la radiactividad. Además, la adición de una enzima en
acoplamiento complica la interpretación de los resultados, puesto
que los ensayos de enzimas acopladas están sujetos a aberraciones
adicionales. Otros diversos procesos implican la formación de
fosfomolibdato, seguida por una reducción o una absorción de
colorantes para producir un cambio de color, que puede ser
correlacionado con la concentración de fosfato. Algunos ensayos con
enzimas basados en estos procesos son lo suficientemente exactos y
robustos como para ser usados en esfuerzos para el escrutinio de
compuestos o en estudios enzimológicos, pero no resulta práctico
usar estos métodos para detectar concentraciones del orden de bajos
\muM o de nM de ortofosfato. En algunas aplicaciones, es posible
aumentar la sensibilidad de estos métodos concentrando grandes
volúmenes de fosfomolibdato reducido sobre Sephadex o resinas
afines. Sin embargo, no se ha probado que esto sea aplicable a
aplicaciones de escrutinio, puesto que se usan normalmente solamente
muy pequeños volúmenes en cada reacción de ensayo. Se ha mostrado
que se puede adsorber selectivamente un fosfato marcado
radiológicamente sobre la superficie de una
polivinil-polipirrolidona (PVPP). Entonces, se
pueden eliminar por lavado un ATP marcado radiológicamente u otros
contaminantes y el fosfato remanente se puede detectar por elución a
un pH elevado. Este proceso específico no resulta muy práctico para
estudios enzimáticos, puesto que requiere la separación física de
los reaccionantes y los productos, y la reproducibilidad, que es
dependiente de la elución de múltiples muestras a partir de columnas
con PVP, resultaría relativamente mala. Los autores sugieren que un
componente importante de la selectividad de su proceso es la
capacidad de la polivinil-polipirrolidona para
catalizar la formación de fosfomolibdato, implicando con ello que
otras superficies hidrófobas serían menos idóneas para su método,
apartándolas con ello del presente invento.
Claims (39)
1. Un método para detectar y medir el
ortofosfato (PI) marcado radiológicamente en una mezcla acuosa de
reacción, que comprende las etapas de:
- a.
- añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción en condiciones ácidas para formar un complejo de fosfomolidabto; y
- b.
- poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación;
con lo que la fijación de fosfomolibdato a dicha
superficie proporciona una proximidad suficiente para que el fosfato
marcado radiológicamente induzca una escintilación medible del
agente de escintilación, que se correlaciona con la cantidad de
dicho ortofosfato.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha solución de molibdato y dicha superifice hidrófoba
se añaden simultáneamente a dicha mezcla de reacción.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende además la etapa de:
- c.
- añadir una solución de CsCl a dicha mezcla de reacción antes del recuento.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
que comprende además la etapa de:
- d.
- añadir una solución de ácido cítrico a dicha mezcla que contiene CsCl, antes del recuento.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que dicho CsCl y dicho ácido cítrico se añaden simultáneamente
a la mezcla de reacción.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicho molibdato es molibdato de amonio en una
concentración final de desde 0,05% hasta 0,3% en peso/volumen
(p/v).
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que dicho molibdato de amonio está en una concentración final
de desde 0,1% hasta 0,2% p/v.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho molibdato de amonio está en una concentración final
de aproximadamente 0,17% p/v.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha superficie hidrófoba se selecciona entre el conjunto
que consta de:
poli(vinil-tolueno) (PVT),
Sephadex, látex, poliestireno, poli(acrilamida), acrilamida,
agarosa, polipropileno, policarbonato y Sepharose.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
9, en el que dicha superficie es la de perlas de
poli(vinil-tolueno).
11. El método de acuerdo con la reivindicación 3
ó 4, en el que dicho CsCl está en una concentración final mayor que
1 M.
12. El método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que dicho CsCl está en una concentración final que fluctúa
entre 2 M y 4 M.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que dicho CsCl está en una concentración final de
aproximadamente 3,5 M.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
4, en el que dicho ácido cítrico está en una concentración final que
fluctúa entre 0,05 y 0,2 M.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
14, en el que dicho ácido cítrico está en una concentración final de
aproximadamente 0,1 M.
16. Un método para determinar la actividad como
ATPasa, que comprende las etapas de
- a.
- mezclar [\gamma-^{33}P]ATP marcado radiológicamente con una enzima que hidroliza al ATP;
- b.
- incubar la mezcla de reacción durante un período de tiempo suficiente para dar lugar a que el ortofosfato se libere a partir de la hidrólisis;
- c.
- añadir una solución de molibdato a dicha mezcla de reacción para formar un complejo de fosfomolibdato;
- d.
- poner en contacto dicho complejo de fosfomolibdato con una superficie hidrófoba de un agente de escintilación; y
- e.
- medir la escintilación de dicho agente de escintilación como un medio para calcular la cantidad de dicho ortofosfato.
17. El método de acuerdo con la reivindicación
16, en el que dicha enzima que hidroliza al ATP es la proteína
helicasa de E1 procedente de papilomavirus humanos.
18. El método de acuerdo con la reivindicación
16, en el que dicha solución de molibdato y dicha superficie
hidrófoba se añaden simultáneamente a dicha mezcla de reacción.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
16, que comprende además la etapa de:
- f.
- añadir una solución de CsCl a dicha mezcla de reacción antes del recuento.
20. El método de acuerdo con la reivindicación
19, que comprende además la etapa de:
- g.
- añadir una solución de ácido cítrico a dicha mezcla que contiene CsCl antes del recuento.
21. El método de acuerdo con la reivindicación
20, en el que dicho CsCl y dicho ácido cítrico se añaden
simultáneamente a la mezcla de reacción.
22. El método de acuerdo con la reivindicación
16, en el que dicho molibdato es molibdato de amonio en una
concentración final de desde 0,05% hasta 0,3% p/v.
23. El método de acuerdo con la reivindicación
22, en el que dicho molibdato de amonio está en una concentración
final de desde 0,1% hasta 0,2% p/v.
24. El método de acuerdo con la reivindicación
23, en el que dicho molibdato de amonio está en una concentración
final de aproximadamente 0,17% p/v.
25. El método de acuerdo con la reivindicación
16, en el que dicha superficie hidrófoba se selecciona entre el
conjunto que consta de:
poli(vinil-tolueno) (PVT),
Sephadex, látex, poliestireno, poli(acrilamida), acrilamida,
agarosa, polipropileno, policarbonato y Sheparose.
26. El método de acuerdo con la reivindicación
25, en el que dicha superficie es la de perlas de
poli(vinil-tolueno).
27. El método de acuerdo con la reivindicación
19 ó 20, en el que dicho CsCl está en una concentración final más
alta que 1 M.
28. El método de acuerdo con la reivindicación
27, en el que dicho CsCl está en una concentración final que fluctúa
entre 2 M y 4 M.
29. El método de acuerdo con la reivindicación
28, en el que dicho CsCl está en una concentración final de
aproximadamente 3,5 M.
30. El método de acuerdo con la reivindicación
20, en el que dicho ácido cítrico está en una concentración final
que fluctúa entre 0,05 M y 0,2 M.
31. El método de acuerdo con la reivindicación
30, en el que dicho ácido cítrico está en una concentración final de
aproximadamente 0,1 M.
32. Un ensayo para el escrutinio de agentes
inhibidores de una actividad de una enzima que hidroliza a fosfatos,
que comprende las etapas de:
llevar a cabo las etapas a hasta e de acuerdo con
el método de la reivindicación 16, en la presencia y en la ausencia
de un agente inhibidor candidato; y comparar la cantidad de fosfato
en cada caso para calcular el nivel de inhibición.
33. Un ensayo para el escrutinio de agentes
inhibidores de una actividad de una enzima que hidroliza a fosfatos,
que comprende las etapas de:
llevar a cabo las etapas a hasta g de acuerdo con
el método de la reivindicación 20, en la presencia y en la ausencia
de un agente inhibidor candidato; y comparar la cantidad de fosfato
en cada caso para calcular el nivel de inhibición.
34. El ensayo de acuerdo con la reivindicación
33, en el que dicha enzima que hidroliza a fosfatos se selecciona
entre el conjunto que consta de: una helicasa, una ATPasa y una
fosfatasa.
35. El ensayo de acuerdo con la reivindicación
33, en el que dicha enzima es una ATPasa.
36. El ensayo de acuerdo con la reivindicación
33, en el que dicha ATPasa es la helicasa de E1 procedente de
papilomavirus humanos.
37. Un estuche para medir el ortofosfato marcado
radiológicamente en una solución acuosa, comprendiendo dicho
estuche:
- a.
- una solución de molibdato; y
- b.
- una superficie hidrófoba de un agente de escintilación,
en el que dicha solución de molibdato es añadida
a dicha solución acuosa para formar un complejo de fosfomolibdato,
siendo capturado dicho complejo por dicha superficie hidrófoba para
inducir una escintilación medible en ella.
38. Un estuche de acuerdo con la reivindicación
37, que comprende además una solución de CsCl para aumentar la
flotación de las perlas antes del recuento de la escintilación.
39. Un estuche de acuerdo con la reivindicación
38, que comprende además una solución de ácido cítrico para
estabilizar la señal de escintilación.
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