ES2213052T3 - Extractos de aceite de vetiver como agente repelente y toxico contra las termitas. - Google Patents

Abstract

Un método para proteger un material de la infestación de termitas, que comprende tratar el material con una composición que comprende una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en nootkatona, zizanol y biciclovetivenol, en el que dicha composición está libre de aceite de vetiver y en el que el material tratado repele o mata termitas sustancialmente más que lo hace otro material idéntico que no se ha tratado con la composición.

Description

Extractos de aceite de vetiver como agente repelente y tóxico contra las termitas.

El desarrollo de este invento se patrocinó parcialmente por el Gobierno bajo la subvención núm.: USDA/ARS 58-6435-8-084 del Departamento de Agricultura. El Gobierno tiene ciertos derechos en este invento.

Campo técnico

Este invento se refiere a un método para repeler termitas subterráneas usando ciertos extractos de aceite de vetiver, por ejemplo nootkatona, \alpha-cedreno, y una combinación de zizanol, y biciclovetivenol.

Fundamentos de la técnica

La termita subterránea de Formosa, Coptotermes formosanus Shiraki, es un insecto nocivo mundial principal que ataca tanto a árboles vivos como a madera estructural. A diferencia de otras termitas subterráneas, la termita de Formosa puede establecer una colonia que no toca el suelo.

La Coptotermes formosanus es nativa del sudeste de Asia, pero también se encuentra ahora en Hawai, a lo largo de la costa atlántica suroriental de los Estados Unidos y en el Golfo Sur de los Estados Unidos. Descubierta por primera vez en los Estados Unidos por operadores de control de insectos nocivos en 1965, la C. formusanus ha expandido gradualmente su campo geográfico. El mayor lugar individual de C. formosanus en los Estados Unidos está en el sur de Louisiana, con fuertes infestaciones en el Lago Charles y Nueva Orleáns. La C. formosanus puede en algunos casos desplazar a la Reticulitermes spp nativa.

Se han usado tres métodos principales en el pasado para controlar las Coptotermes: (1) barreras químicas y físicas para evitar que las termitas ataquen la madera, (2) conservantes y termicidas de madera usados para proteger la madera infestada o susceptible, y (3) destrucción de una colonia de termitas mediante excavación del nido. Véase, por ejemplo, las Patentes EE.UU. núms. 4.921.696; 5.303.523; 5.609.879; 5.802.779 y 5.874.097. El uso extensivo de barreras químicas y termicidas han generado una preocupación pública por la seguridad medioambiental.

La búsqueda de un nuevo repelente o termicida es difícil porque estudios han mostrado que las termitas muestran una sensibilidad inesperada a los productos químicos, sensibilidad que se diferencia de la de otros insectos. Por ejemplo, se ha mostrado que el fenoxietanol es una sustancia rastreadora; y el naftaleno, un veneno para la mayoría de los insectos, se encontró que podían usarse como un fumigante de termitas para sus nidos a concentraciones que matarían hormigas rojas. Véase la Patente EE.UU. núm. 5.874.097; J. Chen et al., "Isolation and identification of 2-phenoxyethanol from a ballpoint pen as a trail-following substance of Coptotermes formosanus Shiraki and Reticulitermes sp.", J. Entomol. Sci., volumen 33, pp. 97-105 (1998); y J. Chen et al., "Termites fumigate their nests with naphthalene", Nature, volumen 392, pp. 558 (1998).

También se han descrito repelentes químicos naturales de termitas. Se ha encontrado que las hojas maduras de Cinnamomun osmophloeum Kaneh. y C. zeylanicum B1 proporcionan resistencia a las termitas. Los componentes principales de aceite extraído de estas dos especies fueron aldehído cinnámico y eugenol, respectivamente, exhibiendo el eugenol la mayor actividad de resistencia a las termitas. Véase Tien-shu Lin et al., "The effects of Cinnamomum spp. oils on the control of the termite Coptotermes formosanus Shiraki", Taiwan For. Res. Inst. New Series, volumen 10, pp. 459-464 (1995). Adicionalmente, se encontró que las maderas de Cedro de Alaska, secuoya, y teca eran resistentes a las termitas subterráneas de Formosa. Aunque las termitas se alimentaron en las maderas, fue solo en una extensión muy limitada. Véase J.K. Grace, "Natural resistance of Alaska-cedar, redwood, and teak to Formosan subterranean termites", "Forest Products Journal", volumen 44, pp. 41-45 (1994); y R. P. Adams, "Cedar Wood Oil - Analyses and Properties", en Modern Methods of Plant Analysis - Oils and Waxes, H.F. Linskens y J.F. Jackon, eds., Springer Verlag, pp. 159-173 (1991).

El documento JP 06 016517 A describe un repelente de termitas que contiene aceites esenciales de plantas, particularmente aceites esenciales de vetiver y/o pachulí, encerrados en microcápsulas.

T. Kinyanjui et al, Chemosphere, volumen 41, núm. 7.2000, páginas 1071-1074, describe los componentes del Juniperus procera como compuestos antitermitas potenciales.

Yatagai et al, Mokuzia Gakkaishi (1991), 37(4), 345-51, investiga las actividades termicidas de los aceites esenciales y compuestos extractivos procedentes de la madera pantanosa de yakusugi, una variedad de Cryptomeria japonica.

El pasto vetiver (Vetiveria zizanioides), una planta de rápido crecimiento nativa de India, pertenece al mismo grupo de la familia de pasto que incluye maíz, sorgo, caña de azúcar y hierba limón. El vetiver se usa para prevenir la erosión del suelo porque las raíces crecen extremadamente rápido. Véase Vetiver Grass: A Thin Green Line Against Erosion, Board on Science and Technology for International Development, National Research Council, National Academy Press, Washington, D.C., 171 pp. (1993). En India, las raíces de vetiver se tejen en esteras, cestas, abanicos, sacos y adornos. Las esteras tejidas se cree que proporcionan protección de los insectos nocivos, además de su agradable fragancia. Aunque las raíces secas se han usado para repeler polillas, piojos y chinches, las termitas se supone que comen pasto vetiver. La caña de azúcar, un miembro de la misma familia de pasto, se conoce incluso por ser un alimento preferido de la termita subterránea de Formosa. Véase Vetiver Grass: A Thin Green Line Against Erosion, p. 63 y 81 (1993); y J. Chen et al., "Determination of feeding preference of Formosan subterranean termite (Coptotermes formosanus Shiraki) for some amino acid additives", J. Chem. Ecol., volumen 23, pp. 2359-2369 (1996). A pesar de este conocimiento de la alimentación de la termita, se ha especulado con sólidas bandas de pasto vetiver para bloquear potencialmente a las termitas, hormigas rojas, u otros insectos subterráneos insidiosos, porque se conocen otros insectos que evitan el aceite de vetiver y las raíces de vetiver. Véase Vetiver Grass: A Thin Green Line Against Erosion, pp. 24, 28, 80 y 92 (1993).

El aceite extraído de las raíces se usa en la industria del jabón y perfume por su agradable y persistente fragancia. Véase la Patente EE.UU. núm. 4.937.073. El aceite de vetiver se conoce por ser una mezcla compleja de más de 300 compuestos, más de 150 de los cuales son compuestos sesquiterpenoides. Véase P. Weyerstahl et al., "New sesquiterpene ethers from vetiver oil", Liebigs Ann., pp. 1195-1199 (1996); N.H. Andersen, "The structures of zizanol and vetiselinenol", Tetrahedron Letters, volumen 21, pp. 1755-58 (1970); R.M. Coates et al., "The crystal structure of khusimol \rho-bromobenzoate", Chemical Communications, pp. 999 1000 (1969). El aceite de vetiver se conoce por repeler moscas y cucarachas. Los ingredientes en el aceite de vetiverpresentados para repeler insectos son las cetonas - \alpha-vetivona, \beta-vetivona, cusimona; y los aldehídos - zizanal y epizizanal. Véase Vetiver Grass: A Thin Green Line Against Erosion, p. 80 y 92 (1993); y Jain et al., "Insect Repellents from Vetiver Oil: I. Zizanal and Epizizanal", Tetrahedron Letters, volumen 23, pp. 4639-4642 (1982). Otros componentes del aceite de vetiver son zizanol (o cusimol), biciclovetivenol y \alpha-cedreno. Véase N. Andersen, "Biogenetic implications of the antipodal sesquiterpenes of vetiver oil", Phytochemistry, volumen 9, pp. 145-151 (1970); R.M. Coates et al., "The crystal structure of khusimol \rho-bromobenzoate", Chemical Communications, Com. 1099, pp. 999-1000 (1969); y R. Kaiser et al., "Biogenetically significant components in vetiver oil", Tetrahedron Letters, volumen 20, pp. 2009-2012 (1972).

La nootkatona, o 4,4a,5,6,7,8-hexahidro-6-isopropenil-4,4a-dimetil-2(3H)-naftalenona, es una cetona de sesquiterpeno ligeramente acre encontrada en el aceite del cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis) y en un gran número de aceites cítricos, especialmente aceite de pomelo (Citrus pavadisi). La nootkatona se usa ampliamente en las industrias de perfumería y aromas, siendo esencialmente no tóxica para los seres humanos. Véase las Patentes EE.UU. núms. 3.835.192 y 5.847.226; H. Erdtman et al., "The Chemistry of the Natural Order Cupressales XVIII: Nootkatone, a new sesquiterpene type hydrocarbon from the heartwood of Chamaecyparis nootkatensis (Lamb.) Spach.", Acta Chem. Scand., volumen 11, pp. 1157 (1957); y H. Erdtman et al., "The Chemistry of the Natural Order Cupressales 46. The structure of nootkatone", Acta Chem. Scand., volumen 16, pp. 1311 (1962). La nootkatona también se ha identificado como un componente minoritario del aceite de vetiver. Véase la Patente EE.UU. núm. 4.937.073; y N.H. Andersen et al., "Prezizaene and the biogenesis of zizaene", Chemistry and Industry, pp. 62-63 (1971); N. Andersen et al., "Biogenetic implications of the antipodal sesquiterpenes of vetiver oil", Phytochemistry, volumen 9, pp. 145-151 (1970); y R. Kaiser et al., "Biogenetically significant components in vetiver oil", Tetrahedron Letters, volumen 20, pp. 2009-2012 (1972). La estructura de la nootkatona se muestra debajo:

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Descripción del invento

Se ha descubierto que ciertos extractos de aceite de vetiver son repelentes y venenos significativos de termitas. Se han probado la nootkatona, el \alpha-cedreno, el zizanol y el biciclovetivenol. Se ha mostrado que la nootkatona disminuye significativamente el consumo de alimento, disminuye el comportamiento tunelador, y aumenta la mortalidad en las termitas. La nootkatona es un repelente y veneno eficaz de termitas, o bien por si mismo o como un añadido a otros sustratos, incluyendo abonos hechos de raíces de pasto vetiver o productos de madera. La nootkatona puede usarse también para proteger la madera de construcción del ataque de las termitas subterráneas de Formosa. La nootkatona como un repelente no es tóxico para los seres humanos y otros mamíferos y es medioambientalmente seguro. Además, se encontró que el \alpha-cedreno es un repelente débil de termitas; y se encontró que la combinación de zizanol y biciclovetivenol es tanto un repelente como un veneno de termitas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el consumo medio de papel de filtro por las termitas a medida que se aumenta la concentración de nootkatona en el sustrato.

La Figura 2 ilustra la mortalidad media de termitas trabajadoras y soldados a medida que se aumenta la concentración de nootkatona en el sustrato.

La Figura 3 ilustra la longitud media del túnel cavado por las termitas a medida que se aumenta la concentración de nootkatona en el sustrato.

Modos para llevar a cabo el invento

Se ha descubierto que ciertos extractos de aceite de vetiver son repelentes y venenos eficaces de termitas. Mientras se probaba la repulsión de las termitas a las raíces de pasto vetiver y al aceite de vetiver aislado de las raíces, se desarrolló un bioensayo usando cámaras con arena tratada. Se probaron extractos de aceite de vetiver que se habían separado usando una columna de gel de sílice eluyendo con hexano y concentraciones en aumento de cloruro de metileno. Cuatro de los cinco extractos mostraron tener actividad repelente de termitas. Sobre análisis adicionales de estos extractos usando cromatografía de gases/espectrometría de masas, se encontró que la nootkatona era un componente de uno de los extractos repelentes de termitas del aceite de vetiver. Se usó la nootkatona disponible comercialmente para probar la repulsión contra las termitas. Se descubrió que la nootkatona es un repelente y un veneno eficaz de termitas a concentraciones tan bajas como 10 \mug/g. La nootkatona redujo la actividad alimentaria y tuneladora, y provocó un aumento de la mortalidad en las termitas subterráneas de Formosa. Además, se encontró que las termitas eran repelidas por \alpha-cedreno disponible comercialmente, un componente del aceite de vetiver. También se aisló y probó para la bioactividad extractos de aceite de vetiver que contenían ante todo zizanol y biciclovetivenol; los extractos mostraron ser repelentes y venenos eficaces de termitas.

Ejemplo 1 Extracción de aceite de vetiver a partir de raíces

Las raíces de vetiver procedentes de Vetiveria zizanioides crecida en Louisiana (Donald O. Heumann Greenhouse and Laboratory; Poydras, Louisiana) se lavaron, se secaron al aire, y se molieron en un mezclador. Las raíces molidas se almacenaron a -20ºC durante 3 a 6 meses. Después de descongelarse, se añadieron 5 g de raíz de vetiver molida a 300 ml de alcohol etílico, y la mezcla se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. Aproximadamente 250 ml de extracto de alcohol se filtraron a través de papel de filtro de 15 cm y se concentraron mediante un rotavapor de aproximadamente 3 ml. El extracto concentrado se mezcló con 3 g de gel de sílice (poro de 60 Ángstrom) y se secó en una campana. Se empaquetó una columna de sílice (2 x 30 cm) con el gel de sílice que contenía el extracto de vetiver empaquetado en el fondo de la columna. Los compuestos del extracto se separaron mediante marcha ascendente de cloroformo durante la noche en una cámara sellada. El gel de sílice se recogió después en 2,54 cm cada vez durante siete fracciones en total. Cada una de las siete fracciones se extrajo con 50 ml de alcohol etílico. Cada una de las siete fracciones se centrifugó para eliminar el gel de sílice y luego se concentró a 3 ml.

Cada extracto se separó adicionalmente mediante cromatografía de capa fina ("TLC"). Dos microlitros de cada fracción se echaron en el fondo de una placa de sílice (Gel de Sílice GF, Analtech, Newark, Nueva Jersey). Se usó cloroformo como un disolvente para la cromatografía. Antes que el disolvente alcanzara la parte superior, la placa se eliminó y se secó al aire. Las bandas en la placa TLC se visualizaron carbonizando a 150ºC después de pulverizar con ácido sulfúrico al 50%. Al menos de 1 a 5 bandas podían verse en cada una de las siete fracciones. (No se muestran datos).

Ejemplo 2 Bioensayo en termitas de los extractos de aceite de vetiver

Se usaron cuarenta y ocho envases de plástico claro de tres cámaras para probar los siete extractos del Ejemplo 1. Cada cámara rectangular (17,5 x 8 x 4 cm; Pioneer Packaging Co., North Dixon, Kentucky) se dividió en tres compartimentos con dos paredes internas. Se fundió un pequeño agujero (0,5 cm de diámetro) al fondo de cada una de las paredes internas para permitir el acceso de la termita a todas las cámaras. La cámara más a la izquierda se designó el "compartimento natal" y se llenó con 115 g de arena fina de voladura nº 4 (Easy Crete, Inc., Greenwell Springs, Louisiana) a la que se añadió 10 ml de agua destilada desionizada ("ddH_{2}O"). Como fuente de alimentación, se pesó un círculo de papel de filtro Whatman nº 2 de 55 mm (Whatman International, Maidstone, Inglaterra) y se colocó en el compartimento más a la derecha. El compartimento del centro se llenó con arena que se había tratado con uno de los extractos de alcohol del Ejemplo 1 o sólo con alcohol (el control). Cada uno de los siete extractos se mezcló con alcohol etílico a un volumen total de 25 ml y luego se añadió a 115 g de arena de voladura nº 4 en una cazuela poco profunda. La cazuela se agitó para evaporar el alcohol antes de añadir 575 g de arena adicionales y mezclarlos. La arena (ahora 690 g) se dejó descubierta toda la noche y se mezcló de nuevo a la mañana siguiente. Después de mezclar, se colocaron 115 g de arena tratada y 10 ml de ddH_{2}O en el compartimento del centro. Se prepararon seis cámaras usando extracto de cada una de las siete fracciones durante un total de 42 cámaras experimentales. Seis cámaras adicionales para controles recibieron arena tratada sólo con 25 ml de alcohol etílico.

Cincuenta y cinco termitas de Formosa (Coptotermes formosanus) (50 trabajadoras y 5 soldados) de una colonia recogida dos meses antes en Nueva Orleáns, Louisiana, se añadieron al compartimento natal de cada uno de los cuarenta y ocho envases. Los envases se cubrieron entonces y se colocaron en una incubadora oscura a 25ºC. Los envases se examinaron diariamente en busca de termitas vivas. Cada dos o tres días se añadieron 200 \mul de ddH_{2}O a los círculos de papel de filtro. Después de dos semanas, se escaneó e imprimió a color el fondo de cada envase al tamaño real usando un Equipo de Escaneo 4c y un Desk Jet 890C de Hewlett Packard. El papel de filtro se eliminó, se cepillo hasta su limpieza y se secó al aire antes de pesar.

Usando las imágenes impresas, se midió la longitud total del túnel en cada compartimento con arena. Un envase con extracto 7 se excluyó de las comparaciones de longitud del túnel porque el envase se cayó inadvertidamente antes de escanear el fondo, lo que rompió los túneles de las termitas.

Las diferencias entre tratamientos en el peso del papel de filtro y la longitud del túnel en los compartimentos natales o del centro se compararon por análisis de varianza (ANOVA) y la Prueba de Intervalo Studentizado de Tukey. Los resultados se presentan en las Tablas 1, 2 y 3.

Como se midió por el consumo de papel de filtro, ninguno de los tratamientos difirió significativamente del control (extracto 8). (Tabla 1) La única diferencia significativa vista entre los extractos en el consumo de papel de filtro fue que el tratamiento con extracto 7 mostró significativamente menos consumo de papel de filtro que los tratamientos con extractos 2, 3 ó 4.

TABLA 1 Consumo de Papel de Filtro (g)

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Como se muestra en la Tabla 2, no hubo una diferencia significativa entre los tratamientos en la longitud de los túneles en los compartimentos natales.

TABLA 2 Longitud del túnel en el compartimento natal (cm)

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Como se muestra en la Tabla 3, hubo una fuerte diferencia entre los tratamientos en la longitud del túnel en el compartimento del centro o tratado. La longitud del túnel fue significativamente menor en los compartimentos del centro tratados con o bien el extracto 6 o el extracto 7. Estos resultados indican que las termitas fueron inhibidas del tunelado por los compuestos encontrados en los extractos 6 y 7. Así, las raíces de vetiver contienen al menos un compuesto que inhibe la tunelación de las termitas. En las técnicas de separación descritas en el Experimento 1, este(os) compuesto(s) se separó(aron) con los extractos de 6 ó 7.

TABLA 3 Longitud del túnel en el compartimento de centro (cm)

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Así, en los extractos de aceite de vetiver, el extracto 7 disminuyó significativamente tanto el consumo del papel de filtro como el tunelado de las termitas. El extracto 6 disminuyó significativamente el tunelado de las termitas. Los resultados de todos los demás extractos no fueron significativamente diferentes del control.

Ejemplo 3 Aislamiento de nootkatona procedente del aceite de vetiver crecido en Louisiana a. Extracción del aceite de vetiver

Las raíces de vetiver procedentes de Vetiveria zizanioides crecida en Louisiana se limpiaron, se secaron al aire, se molieron en un mezclador y se almacenaron a -20ºC. Se añadió un litro de éter de petróleo a 20 g de raíces secas de vetiver y se agitaron durante 24 horas a temperatura ambiente. El extracto se filtró a través de papel de filtro y se concentró mediante un rotavapor. El extracto de aceite se redisolvió después en 5 ml de hexano.

b. Aislamiento de los componentes del aceite de vetiver

Los componentes del extracto de aceite se separaron usando una columna de gel de sílice de 2,5 x 20 cm, usando una extracción más eficaz que en el Ejemplo 1. Se disolvieron cinco gramos de aceite de vetiver en 50 ml de hexano y se colocaron en una columna de sílice que se había lavado con 200 ml de hexano. El extracto se eluyó con hexano y una concentración en aumento de cloruro de metileno. Se aislaron cinco fracciones: la fracción 1 eluida con una relación de 20:80 CH_{2}Cl_{2}:hexano; la fracción 2, con una relación de 30:70; la fracción 3, con una relación de 40:60; la fracción 4, con una relación de 60:40; y la fracción 5, con una relación de 80:20. Se visualizaron muestras de las fracciones 1 a 5 para su autofluorescencia bajo una luz UV para indicar la presencia de cetonas de sesquiterpeno. Las fracciones que indicaron autofluorescencia se separaron después adicionalmente por TLC usando el método descrito anteriormente en el Ejemplo 1, junto con nootkatona disponible comercialmente.

Usando el bioensayo como se describe en el Ejemplo 2, se probaron las fracciones 1 a 5 para la actividad repelente de termitas. Para cada fracción se añadieron 100 \mug/g de extracto a la arena y se establecieron cuatro cámaras replicadas. Después de una incubación de dos semanas, cada cámara se analizó para la actividad tuneladora. La fracción 1 no mostró bioactividad en termitas, mientras que las fracciones 2 a 5 mostraron fuerte actividad repelente de termitas (baja actividad tuneladora). (No se muestran datos).

Las bandas TLC 1 y 2 de la Fracción 4 se caracterizaron además mediante Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (GC-MS), usando un HP5890 GC/HP 5791 MSD (Hewlett Packard Co., Palo Alto, California). Las separaciones del cromatógrafo de gases se realizaron en una columna capilar DB-5MS (30 m x 0,25 mm di x 0,25 \mum, J & W, Folsom, California), usando helio (0,8 ml/min) como un gas de transporte. La temperatura del puerto de inyección fue de 250ºC en un modo dividido con una inyección de 1 \mul. La temperatura inicial del GC se mantuvo a 60ºC durante 1 minuto, se aumento a 150ºC a 2,5ºC/min durante 15 minutos y 260ºC a 5ºC/min, donde se mantuvo durante 10 minutos. El detector espectral de masas (MSD) se puso en modo de escaneo total (M/Z 41 a 400). Se encontró que la nootkatona era un constituyente principal de la banda 2 comparando el espectro de masas con el de un patrón de nootkatona sintética (cristalina, 97%) comprado a Lancaster Shyntesis Inc. (Windham, New Hampshire), y comparando el espectro de masas con un espectro de masas conocido disponible a partir de una base de datos (Wiley Database, Versión 7; Thermoquest-Finnigan, Austin, Texas).

Ejemplo 4 Bioactividad en termitas de la nootkatona

La cantidad de nootkatona aislada del aceite de vetiver fue insuficiente para probar la actividad repelente en termitas. La nootkatona se compró por lo tanto de una fuente comercial (Lancaster Shyntesis Inc., Windham, New Hampshire). Se usó un envase de plástico de tres cámaras como se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Se fundió un pequeño agujero al fondo de cada una de las dos paredes internas para conectar las cámaras. Se usaron cuatro cámaras replicadas para cada concentración de nootkatona (\mug/g de arena) probada: 0, 10 \mug/g, 20 \mug/g, 100 \mug/g, y 200 \mug/g. Para cada concentración, se mezcló la nootkatona en 25 ml de alcohol etílico con 500 g de arena de voladura nº 4 como se describe en el Ejemplo 2. La arena se secó toda la noche. Al día siguiente se añadieron 115 g de arena tratada a la cámara intermedia; se añadieron 115 g de arena no tratada a una cámara de un extremo, y se colocó un papel de filtro pesado (Whatman nº 1, 55 mm) en la cámara del extremo contrario. El papel de filtro se había secado a 70ºC durante 3 horas y se enfrió a temperatura ambiente antes de pesar. Luego se añadieron 10 ml de ddH_{2}O a cada cámara con arena y se añadieron 200 \mul de ddH_{2}O al papel de filtro. Cuatro envases sin nootkatona sirvieron como controles negativos. Cincuenta termitas trabajadoras y 5 soldados de una sola colonia recogida en Algiers, Louisiana, se colocaron en cada cámara de arena no tratada. Las cámaras se cubrieron y dejaron en una incubadora oscura a 29ºC.

En el día 16, el número de termitas vivas se contó, y el fondo de cada envase se escaneó para determinar la longitud de tunelado como se describe en el Ejemplo 2. El papel de filtro de cada envase se eliminó, se limpió, se seco a 70ºC durante 3 horas, se enfrió, y finalmente se pesó.

Se compararon las diferencias entre tratamientos en el peso de papel de filtro, mortalidad, y longitud del túnel en los compartimentos tratados mediante análisis de varianza (ANOVA) y la Prueba de Intervalo Studentizado de Tukey. Los resultados se presentan en las Tablas 4, 5 y 6 y en las Figuras 1 a 3.

El consumo se calculó como la diferencia entre el peso del papel de filtro antes y después de la incubación. La Figura 1 y la Tabla 4 muestran que el consumo medio de papel de filtro disminuyó significativamente con la concentración de nootkatona. En los experimentos de control, las termitas tunelaron a través del compartimento del medio al papel de filtro en el compartimento del final. Incluso a la menor concentración, la nootkatona disminuyó significativamente la alimentación como se midió por la pérdida de peso de papel de filtro del control. Casi no se vio consumo de papel de filtro a concentraciones mayores que 20 \mug/g. Como se muestra debajo, esta disminución en la alimentación se debió tanto a la disminución en la tunelación a través de la cámara del medio como a un aumento en la mortalidad de las termitas.

TABLA 4 Consumo de papel de filtro (g)

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La Figura 2 y la Tabla 5 muestran la mortalidad sólo de las trabajadoras. Por el bajo número de soldados añadidos a los envases, el dato de soldados se excluyó. La mortalidad entre los tratamientos y el control fue significativamente diferente. El noventa por ciento de la mortalidad o más se vio en todas las cámaras donde la concentración de nootkatona fue \geq 100 \mug/g de arena.

TABLA 5 Mortalidad de obreras

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La Figura 3 y la Tabla 6 muestran la longitud de todos los túneles vistos en la cámara del medio o tratada al final del día 16. La presencia de nootkatona disminuyó sustancialmente la actividad tuneladora a la menor concentración de 10 \mug/g. A mayores concentraciones de nootkatona, no fue visible la tunelación en la cámara del medio.

TABLA 6 Longitud del túnel en el compartimento tratado (cm)

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Estos resultados muestran que la nootkatona a concentraciones tan bajas como 10 \mug/g, disminuye la tunelación y alimentación de las termitas y aumenta la mortalidad. Así, se muestra que la nootkatona es un potente repelente y veneno de termitas. Se cree que concentraciones entre 10 \mug/g y 1000 \mug/g, más preferiblemente entre 10 \mug/g y 200 \mug/g, serán útiles repeliendo y matando termitas.

Ejemplo 5 Bioactividad en termitas del \alpha-cedreno

La bioactividad en termitas del \alpha-cedreno, un componente del aceite de vetiver, se probó usando un producto disponible comercialmente (Fluka, una división de Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Missouri). Se desarrolló un nuevo método para investigar compuestos para la bioactividad en termitas que era más rápido que el bioensayo descrito en el Ejemplo 2. Se usaron placas petri de cinco cm de diámetro con tapas. Se extendieron dos ml de disolución caliente de agar (1,5 g/100 ml ddH_{2}O) de modo uniforme en el fondo de cada placa y se dejó enfriar. La disolución de agar proporcionó humedad a las termitas y dejó la arena en el sitio. La arena se puso en un autoclave durante 30 minutos, se añadió el alcohol con la muestra, y se secó en un horno. Para tres placas, se cubrió una mitad del fondo de cada placa con 1,5 g de arena tratada mezclada con un total de 100 \mug de \alpha-cedreno por placa, disuelto en 250 \mul de etanol, y la otra mitad con 1,5 g de arena no tratada (sólo etanol). La arena cubrió completamente el agar, pero no era lo suficiente gruesa para ocultar la tunelación de las termitas. Se prepararon tres placas como un control sólo con arena no tratada en cada lado. Finalmente, se añadieron diez termitas a cada placa, y las placas se cubrieron para eliminar la luz.

La distribución de termitas en cada placa, medida contando el número de termitas en la mitad no tratada de la placa, se examinó cada hora durante hasta 8 horas. Una prueba Chi-cuadrado indicó que cuando 23 o más de las 30 termitas (valor medio de todas las réplicas) o al menos el 76,7% se observaron en la arena no tratada, había una diferencia significativa de la distribución de termitas entre el grupo tratado y el grupo de control (X^{2} = 4,59, df = 1; p = 0,032; Instituto SAS, 1998). Por lo tanto, el extracto se consideró un repelente. El extracto se consideró tóxico si algunas o todas las termitas que se comportaron de manera perezosa, estuvieron moribundas o muertas.

Los resultados para el \alpha-cedreno se muestran debajo en la Tabla 7. El \alpha-cedreno era un repelente débil para las termitas a una concentración de 100 \mug/placa, al menos en el marco de tiempo de 2-3 h. Ninguna de las termitas murió en ninguna de las placas.

TABLA 7 Actividad del \alpha-cedreno (100 \mug/placa): Porcentaje de termitas en el lado no tratado (suma de las tres réplicas)

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Ejemplo 6 Bioactividad en termitas de extractos de aceite de vetiver que comprenden zizanol y biciclovetivenol

Se prepararon extractos de aceite de vetiver crecido en Louisiana como se describe en el Ejemplo 3, usando una columna de gel de sílice y TLC. Se analizaron fracciones con alta bioactividad con GC-MS. Las fracciones con alta bioactividad se analizaron con GC-MS y se encontró que tenían altas concentraciones de zizanol y biciclovetivenol como se describe en el Ejemplo 3. Las fracciones que tienen altas concentraciones de zizanol y biciclovetivenol se identificaron comparando el espectro de masas con una gráfica conocida disponible a partir de una base de datos. De esta información, se prepararon extractos con mayores concentraciones de zizanol y biciclovetivenol y se analizaron para la bioactividad en termitas usando el rápido método de placa petri como se describe en el Ejemplo 5.

En un experimento se compararon dos diferentes extracciones con un control usando cuatro réplicas de cada proceso experimental. En el Extracto A se encontró que el pico de biciclovetivenol por GC-MS era dos veces la altura del pico de zizanol. En el Extracto B fue correcto lo contrario. Cada extracto se probó a dos concentraciones, 100 \mug/placa y 500 \mug/placa. A estas dos concentraciones, ambos extractos mostraron actividad en termitas como repelentes y venenos suaves como se muestra en la Tabla 8. No hubo diferencia entre la eficacia de los dos extractos anotados en este experimento, incluso aunque las cantidades relativas de zizanol y biciclovetivenol eran inversas entre los dos extractos. Esto es una evidencia de que el zizanol y el biciclovetivenol tienen bioactividad en termitas individualmente.

TABLA 8 Bioactividad de los extractos de aceite de vetiver que comprenden ante todo zizanol y biciclovetivenol; (un porcentaje promedio de termitas en el lado no tratado para cuatro réplicas)

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Otro experimento se llevó a cabo para probar una mayor concentración. El Extracto C era similar al Extracto B, con el pico de zizanol aproximadamente dos veces el tamaño del pico de biciclovetivenol en el GS. Se hicieron seis réplicas para tanto los controles como las muestras tratadas (0,86 mg de extracto/placa). Los resultados se muestran en la Tabla 9. Las termitas estuvieron moribundas a las 24 horas, y empezaron a morir a las 48 horas. A los 7 días, el 80% de las termitas en las placas tratadas habían muerto, mientras sólo dos termitas de control habían muerto.

TABLA 9 Bioactividad de extractos de aceite de vetiver que comprenden ante todo zizanol y biciclovetivenol; un porcentaje promedio de termitas en el lado no tratado para seis réplicas o [porcentaje de mortalidad]

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Este experimento indicó que a una mayor concentración, los extractos de aceite de vetiver que comprenden ante todo zizanol y biciclovetivenol eran tanto repelentes como venenos de termitas.

Ejemplo 7 Toxicidad de la nootkatona

Para determinar adicionalmente el nivel de toxicidad de la nootkatona en las termitas subterráneas de Formosa, se llevará a cabo un experimento de toxicidad. Las termitas se colocarán en envases sellados que contienen un sustrato de arena. En tres conjuntos de envases la arena se tratará con nootkatona a niveles de 10 \mug/g, 100 \mug/g y 200 \mug/g de arena, respectivamente. El cuarto envase será un control sin nootkatona. Se harán conteos diarios de termitas muertas en un periodo de una semana para determinar la mortalidad para cada tratamiento. Las termitas generalmente viven siete días sin comida. Se espera que la mortalidad aumente cuando la concentración de nootkatona aumente.

Ejemplo 8 Repulsión y toxicidad de la madera tratada con nootkatona

Para demostrar la eficacia de la nootkatona en la repulsión de las termitas subterráneas de Formosa de la madera de construcción, se llevó a cabo un experimento de alimentación y tunelación de termitas para comparar la madera tratada con nootkatona, aceite de vetiver y octaborato disódico tetrahidratado (TIM-BOR®, U.S. Borax, Inc., Valencia, California). Una balsa de madera (5 cm x 5 cm x 0,5 mm) se empapó durante 1 hora en una disolución de etanol al 1% de o bien aceite de vetiver, nootkatona, TIM-BOR®, o un control de etanol. La madera tratada se secó entonces y se dejó al aire hasta su uso en los experimentos. Los experimentos se hicieron a uno, tres, y seis meses después de que la madera fuera tratada. El procedimiento experimental de alimentación y tunelado fue como se describe en el Ejemplo 2, excepto que en lugar del papel de filtro como alimento para las termitas, se colocó la balsa de madera tratada en cada compartimento final; y arena no tratada se colocó en las tres cámaras. En la cámara del centro se añadieron 225 trabajadoras y 25 soldados recogidas de dos grandes colonias de termitas de Formosa en Nueva Orleáns, Louisiana. Se monitorizaron tres envases réplica para cada una de las dos colonias y para cada tratamiento de madera de balsa durante 8 días. La actividad tuneladora se comprobó periódicamente en los días 3, 5 y 7, escaneando los fondos de los envases. En el día 8, la madera de balsa se eliminó y pesó para determinar el consumo de madera. En los tres periodos, las termitas en los tres grupos experimentales consumieron menos madera que el grupo de control, teniendo con la nootkatona el mayor efecto en la disminución de consumo de madera en el intervalo de los meses 1 a 3. Incluso a los seis meses, la nootkatona y el aceite de vetiver fueron tan eficaces como la disolución de borato en la reducción del consumo de madera. (No se muestran datos). La actividad tuneladora de las termitas se redujo sustancialmente con el aceite de vetiver y especialmente con la nootkatona, incluso después de tres meses. El TIM-BOR® no mostró efecto en el comportamiento tunelador. (No se muestran datos). Tanto la nootkatona como el aceite de vetiver mantuvieron sus eficacias como un repelente de termitas seis meses después del tratamiento inicial de la muestra de madera. (No se muestran datos).

Estos compuestos, es decir, nootkatona, \alpha-cedreno, zizanol y biciclovetivenol, que son eficaces como repelentes o venenos de termitas podrían añadirse a cualquier sustrato o material para proteger el material de la infestación o daño de termitas, incluyendo, pero no limitado a, cualquier material que contiene celulosa, tierra, tierras de diatomeas, e incluso incorporados en plásticos.

En la memoria descriptiva y las reivindicaciones, una "cantidad eficaz" de un compuesto, por ejemplo, nootkatona, \alpha-cedreno, zizanol y biciclovetivenol, es una cantidad que, cuando se aplica a un sustrato u otro material, provoca una repulsión o toxicidad significativa, o que disminuye la actividad o viabilidad de las termitas en comparación con otro medioambiente idéntico sin el extracto añadido.

Los siguientes documentos se citan como referencia: B. Zhu et al., "Nootkatone is a repellent for Formosan subterranean termites (Coptotermes formosanus)"; aceptado y sometido de nuevo al Journal of Chemical Ecology en Octubre de 2000; L. Maistrello et al., "Effects of nootkatone and a borate compound on Formosan subterranean termite and its symbiont protozoa", sometido al Journal of Entomological Science en Mayo de 2000; y B. Zhu et al., "Evaluation of vetiver oil and seven insect-active essential oils against Formosan Subterranean Termites", sometido al Journal of Chemical Ecology en Septiembre de 2000; L. Maistrello et al., "Effects of vetiver oil and its constitutents on Coptotermes formosanus and its symbiotic fauna", presentación en póster en el XXI International Congress of Entomology, Cataratas de Iguazú, Brasil, 20-26 de Agosto de 2000; y el texto completo de la Serie de Solicitudes provisionales de Estados Unidos núm. 60.160.251, presentada el 19 de Octubre de 1999.

Claims (27)

1. Un método para proteger un material de la infestación de termitas, que comprende tratar el material con una composición que comprende una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en nootkatona, zizanol y biciclovetivenol, en el que dicha composición está libre de aceite de vetiver y en el que el material tratado repele o mata termitas sustancialmente más que lo hace otro material idéntico que no se ha tratado con la composición.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el material tratado repele termitas.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que el material tratado mata termitas.

4. Un método según la reivindicación 1, en el que el material a tratar se selecciona a partir de una lista que comprende tierra, sustrato, plásticos, tierra de diatomeas, y cualquier material que contiene celulosa.

5. Un método según la reivindicación 1, en el que el compuesto es nootkatona.

6. Un método según la reivindicación 1, en el que el compuesto es zizanol.

7. Un método según la reivindicación 1, en el que el compuesto es biciclovetivenol.

8. Un método según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente tratar el material con uno o más compuestos diferentes seleccionados a partir del grupo que comprende nootkatona, \alpha-cedreno, zizanol y biciclovetivenol.

9. Una composición para una barrera protectora contra la infestación de termitas, comprendiendo la composición de dicha barrera una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en nootkatona, zizanol y biciclovetivenol, y un material sustrato, en la que dicha composición está libre de aceite de vetiver y en la que dicha barrera tratada repele o mata termitas sustancialmente más que lo hace otra barrera idéntica que no se ha tratado con el compuesto.

10. Una composición según la reivindicación 9, en la que el material sustrato es un abono.

11. Una composición según la reivindicación 10, en la que el abono es pasto vetiver seco.

12. Una composición según la reivindicación 10, en la que el abono es otro material que contiene celulosa.

13. Una composición según la reivindicación 9, en la que el material sustrato es tierra.

14. Una composición según la reivindicación 9, en la que el material sustrato es tierra de diatomeas.

15. Una composición según la reivindicación 9, en la que el compuesto es nootkatona.

16. Una composición según la reivindicación 15, en la que la concentración de nootkatona en dicha barrera está entre 10 \mug/g y 1000 \mug/g.

17. Una composición según la reivindicación 15, en la que la concentración de nootkatona en dicha barrera está entre 10 \mug/g y 200 \mug/g.

18. Una composición según la reivindicación 9, en la que el compuesto es zizanol.

19. Una composición según la reivindicación 9, en la que el compuesto es biciclovetivenol.

20. Una composición según la reivindicación 9, que comprende adicionalmente tratar el material con uno o más compuestos diferentes seleccionados a partir del grupo que comprende nootkatona, \alpha-cedreno, zizanol y biciclovetivenol.

21. Una composición para una barrera protectora contra la infestación de termitas, comprendiendo la composición de dicha barrera una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en nootkatona, zizanol y biciclovetivenol, y un material de construcción de madera, en la que dicha composición está libre de aceite de vetiver y en la que el material de construcción tratado repele o mata termitas sustancialmente más que lo hace otro material idéntico que no se ha tratado con el compuesto.

22. Una composición según la reivindicación 21, en la que el compuesto es nootkatona.

23. Una composición según la reivindicación 22, en la que la concentración de nootkatona en dicha barrera está entre 10 \mug/g y 1000 \mug/g.

24. Una composición según la reivindicación 22, en la que la concentración de nootkatona en dicha barrera está entre 10 \mug/g y 200 \mug/g.

25. Una composición según la reivindicación 21, en la que el compuesto es zizanol.

26. Una composición según la reivindicación 21, en la que el compuesto es biciclovetivenol.

27. Una composición según la reivindicación 21, que comprende adicionalmente tratar el material con uno o más compuestos diferentes seleccionados a partir del grupo que comprende nootkatona, \alpha-cedreno, zizanol y biciclovetivenol.