ES2211568T3 - Prueba genetica para determinar la falta de respuesta al tratamiento farmacologico con estatina. - Google Patents

Prueba genetica para determinar la falta de respuesta al tratamiento farmacologico con estatina.

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ES2211568T3 ES00945124T ES00945124T ES2211568T3 ES 2211568 T3 ES2211568 T3 ES 2211568T3 ES 00945124 T ES00945124 T ES 00945124T ES 00945124 T ES00945124 T ES 00945124T ES 2211568 T3 ES2211568 T3 ES 2211568T3
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Abstract

Método de detección de la predisposición genética en un sujeto humano a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la prevención de la estenosis aterosclerótica, que comprende: a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a partir de una muestra de tejido recogida de un sujeto humano para obtener los productos de amplificación, y b) analizar los productos de amplificación para determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa humano, en el que la homocigosidad para la ausencia de dicho sitio de reconocimiento para HindIII indica una predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la prevención de la estenosis aterosclerótica.

Description

Prueba genética para determinar la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina.
Antecedentes de la invención
En toda esta solicitud se hace referencia a diversas publicaciones entre paréntesis con el fin de describir más detalladamente el estado de la técnica al que concierne la invención.
1. Campo de la invención
Esta invención se refiere a las técnicas médicas. En particular, se refiere al campo de los métodos de pruebas genéticas y equipos de diagnóstico.
2. Discusión de la técnica relacionada
Los fármacos de estatina, los agentes hipolipemiantes más potentes actualmente disponibles, son inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reductasa. Incluyen lovastatina, pravastatina, simvastatina, atorvastatina, fluvastatina y cerivastatina. Todos estos fármacos de estatina comparten un mecanismo de acción común y tienen similares perfiles de toxicidad (E. Von Kreutz y G. Schluter, Preclinical safety evaluation of cerivastatin, a novel HMG-CoA reductase inhibitor, Am. J. Cardiol. 82(B):11J-17J [1998]; A.G. Ollson [1998]).
Los fármacos de estatina son eficaces en la reducción del riesgo primario y secundario de enfermedad de la arteria coronaria y acontecimientos coronarios, tales como ataque al corazón, en hombres y mujeres de mediana edad y mayores (por debajo de los 76 años) tanto en pacientes diabéticos como no diabéticos, y a menudo se prescriben para pacientes con hiperlipidemia. (A.G. Ollson, Addressing the challenge, Eur. Heart J. Suppl. M:M29-35 [1998]; M. Kornitzer, Primary and secondary prevention of coronary artery disease: a follow-up on crinical controlled trials, Curr. Opin. Lipidol. 9(6):557-64 [1998]; M. Farnier y J. Davignon, Current and future treatment of hyperlipidemia: the role of statins, Am. J. Cardiol. 82(4B):3J-10J [1998]). Las estatinas utilizadas en la prevención secundaria de la enfermedad coronaria o cardiaca reducen significativamente el riesgo de accidente cerebrovascular, la morbimortalidad total y los ataques de isquemia miocárdica; el uso de las estatinas también se asocia con las mejoras en las funciones endotelial y fibrinolítica y la disminución de la formación de trombos plaquetarios. (M. Kornitzer [1998]; M. Farnier y J. Davignon, Current and future treatment of hyperlipidemia: the role of statins, Am. J. cardiol. 82(4B):3J-10J [1998]).
El uso de fármacos de estatina ha disminuido recientemente la necesidad de revascularización coronaria quirúrgica, conocida como injerto de derivación de arteria coronaria (CABG). (B.M. Rifkind, Clinical trials of reducing low-density lipoprotein concentrations, Endocrinol. Metab. Clin. North. Am. 27(3):585-95, viii-ix [1998]). Pero la CABG es todavía una intervención quirúrgica común para pacientes que desarrollan oclusión aterosclerótica en las arterias coronarias. Se realizan al año aproximadamente 12.000-14.000 procedimientos de CABG. (G.F. Neitzel et al., Atherosclerosis in Aortocoronary Bypass Grafts, Atherosclerosis 6(6):594-600 [1998]). Se utiliza la propia vena safena de los pacientes o la arteria humeral o mamaria para derivar la arteria coronaria afectada. La mayoría de los pacientes de CABG experimentan buenos resultados a largo plazo, pero el 30-40% requieren una segunda CABG en el plazo de 10-12 años tras la cirugía, y la aterosclerosis continuada en el injerto es un factor importante en el rechazo del injerto tardío. (L. Campeau et al., The effect of aggresive lowering of low-density lipoprotein cholesterol levels and low-dose anticoagulation on obstructive changes in saphenous-vein coronary-artery bypass grafts, N. Eng. J. Med. 336(3):153-62 [1997]).
La aterosclerosis en injertos de derivación se asocia con niveles séricos elevados de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), colesterol de la lipoproteína de baja densidad (LDL-C) y triglicéridos, y niveles bajos del colesterol de la lipoproteína de alta densidad (HDL-C). (J.T. Lie et al., Aortocoronary bypass saphenous vein atherosclerosis: Anatomic study of 99 vein grafts from normal and hyperlipoproteinemic patients up to 75 months postoperatively, Am. J. cardiol. 40:906 [1977]; L. Campeau et al., The relation of risk factors to the development of atherosclerosis in saphenous vein bypass grafts and the progression of disease in the native circulation, N. Engl. J. Med. 311(21):1329-32 [1984]). Es normal que se prescriban fármacos de estatina a los pacientes de CABG para disminuir sus niveles séricos de LDL-C.
Se ha demostrado que el tratamiento con hipolipemiantes retrasa la progresión de la aterosclerosis en las arterias coronarias. (Por ejemplo, G. Brown et al., Regression of coronary artery diseases as a result of intensive lipid lowering therapy in men with high levels of apolipoprotein B, N. Engl. J. Med. 323:1289-98 [1990]; J.P. Kane et al., Regression of coronary atherosclerosis during trestment of familial hypercholesterolemia with combined drug regimens, JAMA 264:3007-12 [1990]; Jukema et al., 1995). Antes del ensayo Post-CABG, había pocos datos disponibles para determinar la eficacia de el tratamiento de disminución de las LDL en el retraso de la obstrucción de los injertos de vena safena. (D.H. Blankenhorn et al., Beneficial effects of combined colestipol-niacin therapy on coronary atherosclerosis and coronary venous bypass grafts, JAMA 257:3233-40 [1987]). Además, también se había observado que la trombosis contribuye a la obstrucción del injerto (G.F. Neitzel et al., Atherosclerosis in aortocoronary bypass grafts: morphologic study and risk factor analysis 6 to 12 years after surgery, Arteriosclerosis 6:594-600 [1986]). El tratamiento anticoagulación a dosis bajas evitó la embolia tras la cirugía mayor (A.G.G. Turpie et al., Randomised comparison of two intensities of oral anticoagulant therapy after tissue heart valve replacement, Lancet 1:1242-45 [1998]; L. Poller et al., Fixed minidose warfarin: a new approach to prophylaxis against venous thrombosis after major surgery, Br. Med. J. 295:1309-12 [1987]), y esto implicaba que el tratamiento anticoagulante a dosis bajas también debería poder retrasar la obstrucción del injerto.
El tratamiento con fármaco de estatina afecta beneficiosamente al resultado a largo plazo para la mayoría de pacientes de CABG. En un gran estudio clínico, el ensayo Post-CABG, los pacientes de CABG recibieron tratamiento farmacológico de estatina para disminuir los niveles séricos de LDL-C; comparando los pacientes que habían recibido un tratamiento intensivo con lovastatina (LDL-C disminuyó hasta 93-97 mg/dl) con los que sólo habían recibido un tratamiento moderado con lovastatina (LDL-C disminuyó hasta 132-136 mg/dl), los porcentajes de pacientes con empeoramiento aterosclerótico de los injertos en un plazo de 4 años fueron del 39% y el 51%, respectivamente. (L. Campeau et al. [1997]). El número de pacientes del grupo de tratamiento intensivo con lovastatina que requirieron un segundo procedimiento de CABG fue un 29% inferior que el número en el grupo de tratamiento moderado.
Además de las concentraciones lipídicas en suero, existen otros factores de riesgo, que pueden tener una base genética, y que pueden afectar independientemente a la enfermedad de la arteria coronaria aterosclerótica y a la oclusión de los injertos de derivación o que pueden interaccionar con el tratamiento de estatina para disminuir los lípidos séricos, que puede afectar a la estenosis aterosclerótica. Varios laboratorios han observado una relación entre alelos variantes del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) y la aparición / progresión de la aterosclerosis. La implicación de la LPL en la enfermedad de la arteria coronaria se sospechaba, puesto que los raros homocigotos con defectos en este gen tienen hiperlipoproteinemina de tipo I (OMIM 238600) y enfermedad prematura de la arteria coronaria (P. Benlian et al., Premature atherosclerosis in patients with familial chylomicronemia caused by mutations in the lipoprotein lipase gene, N. Engl. J. Med. 335:848-54 [1996]).
La lipoproteína lipasa (LPL; E.C. 3.1.1.34), también conocida como triacilglicerol acilhidrolasa, es una enzima de glucoproteína que se puede liberar de heparina, unida a los componentes glucosaminoglicanos de los macrófagos y a la supericie luminal de las células epiteliales capilares en una variedad de tejidos humanos, incluyendo corazón, músculo esquelético, adiposo, pulmón y cerebro. (K.L. Wion et al., Human lipoprotein lipase complementary DNA sequence, Science 235:1638 [1987]; C. Heizmann et al., DNA polymorphism haplotypes of the human lipoprotein lipase gene: possible asociation with high density lipoprotein levels. Hum. Genet. 86:578-84 [1991]). La lipoproteína lipasa es activa como un dímero de subunidades idénticas, cada una de aproximadamente 62,500 D en forma no glicosilada. (M.R. Taskinen et al., Enzymes involved in triglyceride hydrolysis. En: James Shepard (Ed.), Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism, Vol. 1, Nº 3, Bailliere Tindall, Londres, págs. 639-66 [1987]).
La lipoproteína lipasa es una enzima limitante de la velocidad para la hidrólisis y eliminación de lipoproteínas ricas en triglicéridos, tales como los quilomicrones, VLDL y LDL-C procedentes del torrente sanguíneo. (Jukema et al., The Asp_{9}Asn Mutation in the lipoprotein Lipase Gene Is Associated With Increased Progression of Coronary Atherosclerosis, Circulation 94(8):1913-18 [1996]). La acción enzimática de la LPL da como resultado la generación de mono y diglicéridos y ácidos grasos libres que se pueden utilizar como combustible para obtener energía o volverse a esterificar para su almacenamiento en el tejido adiposo periférico.
La secuencia génica de la LPL humana es conocida, incluyendo la región 3' a través del exón 10 y la región 3' sin traducir (3'-UTR). K.L. Wion et al., Human lipoprotein lipase complementary DNA sequence, Science 235:1638-41 [1987]; T.G. Kirchgessner et al., The sequence of cDNA encoding lipoprotein lipase, J. Biol. Chem. 262(18):8463-66 [1987]; K. Oka et al., Structure and polymorphic map of human lipoprotein lipase gene, Biochim. Biophys. Acta 1049:21-26 [1990]; D.A. Nickerson et al., DNA sequence diversity in a 9.7-kb region of the human lipoprotein lipase gene, Nat. Genet. 19:233-40 [1998]). Nickerson et al. secuenciaron la región del gen de la LPL que abarca los exones 4-9 (que contienen la principal porción catalítica de la enzima) de 71 individuos tomados de 3 poblaciones diferentes y se observaron 88 variantes diferentes de ADN o polimorfismos, con 78 de éstos presentes en una frecuencia alélica superior al 1% (D.A. Nickerson et al., [1998]).
Dos polimorfismos de la LPL se sabe que afectan a la actividad de la LPL. La mutación D9N en el exón 2 se ha asociado con el aumento de los niveles de triglicéridos y con la aparición de aterosclerosis coronaria, atenuando la capacidad de la pravastatina para disminuir el LDL-C. (J. Jukema et al., [1996]). La mutación N291S en el exón 6 se ha asociado con niveles reducidos de HDL-C. (P. Reymer et al., A lipoprotein lipase mutation [asn291ser] is associated with reduced HDl cholesterol levels in premature atherosclerosis, Nat. Gen. 10:28-34 [1995]; H.H. Wittrup et al., A common substitution [asn291ser] in lipoprotein lipase is associated with increased risk of ischemic heart disease, J. Clin. Inves. 99:1606-13 [1997]). La mutación N291S también está relacionada con el aumento de la estenosis coronaria (estrechamiento del lumen arterial) observada mediante angiografía en mujeres con enfermedad cardiaca isquémica confirmada comparada con los controles. (H.H. Wittrup et al., [1997]).
Los otros dos polimorfismos de la LPL han demostrado asociación con el desarrollo de aterosclerosis, aunque su importancia funcional es desconocida. El primero es el polimorfismo PvuII en el intrón 6, que está relacionado con los varios vasos sanguíneos coronarios con más del 50% de obstrucción (X. Wang et al., Common DNA polymorphisms at the lipoprotein lipase gene: association with severity of coronary artery disease and diabetes, Circulation 93:1339-45 [1996]). El segundo es el polimorfismo HindIII en el intrón 8, asociado con la gravedad angiográfica de la enfermedad de la arteria coronaria. (R. Mattu et al., DNA variants at the LPL gene locus associate with angiographically defined severity of atherosclerosis and serum lipoprotein levels in a Welsh population, Arterio. Thromb. 14:1090-97 [1994]; R. Peacock et al., Associations between lipoprotein lipase, lipoproteins and lipase activities in young myocardial infarction survivors and age-matched healthy individuals from Sweden, Atherosclerosis 97:171-85 [1992]).
El avance de la farmacogenética ha demostrado que bajo una variación genética humana subyacen diferentes respuestas individuales al tratamiento farmacológico dentro de una población. (Revisado en G. Alvan, Genetic polymorphisms in drug metabolism, J. Int. Med. 231:571-73 [1992]; P.W. Kleyn and E.S. Vesell, Genetic variation as a guide to drug development, Science 281:1820-22 [1998]). Por ejemplo los alelos de los genes NAT1 y NAT2 (N-acetiltransferasas) producen un fenotipo "acetilador lento" en el 40-60% de la raza blanca, dando como resultado un aclaramiento lento y la toxicidad asociada de muchos fármacos, incluyendo isoniazida y procainamida (K.P. Vatsis et al., Diverse point mutations in the human gene for polymorphic N-acetyltransferase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(14):6333-37 [1991]). Un defecto en CYP2D6 un elemento de la familia del citocromo P450) conduce al fenotipo del "metabolizador lento" en el 5-10% de la raza blanca, afectando al metabolismo de muchos fármacos, incluyendo algunos beta-bloqueantes y antiarrítmicos. (Revisado en A.K. Daly et al., Metabolic polymorphisms, Pharmac. Ther. 57:129-60 [1993]). Algunas variaciones genéticas se pueden asociar con la acumulación de productos tóxicos, por ejemplo, el tratamiento de pacientes deficientes en TPMT (tiopurina metiltransferasa) con 6-mercaptopurina o azatioprina puede conducir a toxicidad hematopoyética potencialmente fatal debida a niveles superiores a los normales de nucleótidos de tioguanina. (R. Weinshilboum, Methyltransferase pharmacogenetics, Pharmac. Ther. 43:77-90 [1989]; E.S. Vesell, Therapeutic lessons from pharmacogenetics, Ann. Intern. Med. 126:653-55 [1997]).
La presencia de múltiples factores genéticos y ambientales que pueden producir tales grandes variaciones en cómo funcionan los fármacos en los pacientes aboga porque se requiere la individualización de la elección del fármaco y la dosis para el tratamiento óptimo de la enfermedad, incluyendo enfermedad aterosclerótica de la arteria coronaria. Jukema et al. (1996) notificaron que el inhibidor de la HMG_CoA reductasa, pravastatina, no disminuía el nivel de LDL-colesterol en sujetos con el polimorfismo N9 de la LPL en el mismo grado que en aquellos con polimorfismo D9 de la LPL. Además, J.A. Kuivenhoven et al. (1998) observaron que la pravastatina ralentizaba la progresión de la aterosclerosis en sujetos con el genotipo B1B1 de la CETP, pero no en aquellos con el genotipo B2B2 de la CETP. (J.A. Kuivenhoven et al., The role of a common variant of the cholesterol ester transfer protein gene in the progresión of coronary atherosclerosis, N. Engl. J. Med. 338:86-93 [1998]). Este informe sugiere que existen interacciones entre los fármacos de estatina y algunos determinantes genéticos de la aterosclerosis.
Ha existido una necesidad definitiva de una prueba predictiva fiable para determinar qué pacientes padecen la enfermedad de la arteria coronaria, o qué pacientes de CABG, probablemente no responderán positivamente al tratamiento farmacológico con estatina con respecto a la estenosis de una arteria coronaria o un injerto de derivación. Tal método de pruebas genéticas puede proporcionar información útil de modo que se pueda administrar a los pacientes tratamientos alternativos más adecuados individualmente para evitar el daño adicional.
Este y otros beneficios de la presente invención se describen en el presente documento.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un método de detección de la predisposición genética en un sujeto humano a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina, tal como se define en las reivindicaciones. Este método de pruebas genéticas implica analizar los productos de amplificación de los ácidos nucleicos en una muestra de tejido humano que incluye una región no codificante o no traducida dentro del extremo 3' del gen de la LPL humano. La homocigosidad de la ausencia del sitio de restricción para HindIII en el intrón 8 del gen de la LPL humano indica una predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento con fármacos de la clase de la estatina, tales como lovastatina, pravastatina, simvastatina, atorvastatina, fluvastatina y cerivastatina, que se prescriben normalmente para tratar la aterosclerosis en sujetos con enfermedad de la arteria coronaria, o para evitar el empeoramiento del injerto (estenosis) en pacientes de CABG.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el empeoramiento del injerto en sujetos relacionados con diferentes alelos variantes de la LPL en el gen de la LPL.
La figura 1(a) muestra la localización de algunos alelos variantes en el gen de la LPL. Las barras verticales representan exones. La figura 1(b) muestra el porcentaje de sujetos con empeoramiento del injerto. Cada pareja de barras verticales representa dos grupos de genotipo para cada marcador, tal como se define en la casilla de la base de la barra. El número de sujetos en cada grupo de genotipo (N) se facilita debajo de cada barra. La figura 1(c) representa las razones de probabilidades y los límites de confianza al 95% para el empeoramiento del injerto para cada polimorfismo.
La figura 2 muestra el empeoramiento del injerto en sujetos por el genotipo HindIII y los grupos de tratamiento farmacológico. El número total de sujetos en cada grupo se facilita sobre cada barra vertical.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La presente invención se refiere a un método de detección de la predisposición genética en un sujeto humano a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria coronaria o la tensión arterial elevada. Este método de pruebas genéticas implica analizar los productos de amplificación de los ácidos nucleicos en una muestra de tejido humano para determinar la homocigosidad con respecto a un alelo variante en una región no codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano. La presente invención no se basa en y no se compromete con ningún mecanismo particular mediante el cual un alelo variante o polimorfismo de la LPL en una región no codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano produce un fenotipo de falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina.
El gen de la LPL se localiza en el brazo corto del cromosoma 8 humano, en 8p22. (R.S. Sparkes et al., Human genes involved lipolysis of plasma lipoproteins: Mapping of loci for lipoprotein lipase to 8p22 and hepatic lipase to 15q21, Genomics 1:138-44 [1987]). El gen está próximo al marcador microsatélite D8S1715 y flanqueado por los microsatélites D8S261 y D8S280. Las secuencias de flanqueo más próximas de la LPL humana se definen por los números de acceso de GenBank M94221 y M94222 (S. Wood et al., Support for founder effect for two lipoprotein lipase [LPL] gene mutations in French Canadians by analysis of GT microsatellites flanking the LPL gene, sin publicar [1992]). El gen abarca aproximadamente 30 kb y contiene 10 exones que codifican para una proteína de 475 aminoácidos que incluye un péptido señal secretor de 27 aminoácidos. (S. Deeb y R. Peng, Structure of the human lipoprotein lipase gene, Biochemistry 28(10):4131-35 [1989]; T.G. Kirchgessner et al., Organization of the human lipoprotein lipase gene and evolution of the lipase gene family, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9647-51 [1989]).
El extremo 3' del gen de la lipoproteína lipasa humano, para los fines de la presente invención, incluye las posiciones nucleotídicas 4801 a 9734 de la secuencia de referencia de Nickerson que se extiende desde el intrón 6 hasta el intrón 9 (Nº de acceso de GenBank AF050163). (D.A. Nickerson et al., DNA sequence diversity in a 9.7-kb region of the human lipoprotein lipase gene, Nat. Genet. 19:233-40 [1998]). La secuencia completa de referencia de Nickerson es la siguiente:
1
2
3
4
5
El extremo 3' del gen de la lipoproteína lipasa humano incluye el exón 10 y la región 3' no traducida (3'UTR), al menos parcialmente definida por las posiciones nucleotídicas 1 a 3240 de la secuencia de referencia de Oka et al., (Nº de acceso de GenBank X52978 y X53518; Oka et al., Structure and polymorphic map of human lipoprotein lipase gene, Biochim. Biophys. Acta 1049(1):21-26 [1990], errata: [Biochim. Biophys. Acta 11 de noviembre de 1991; 1090(3):357]. En la secuencia de referencia de Oka et al., la primera y segunda señales de poliadenilación están en los nt 15-20 y 411-416, respectivamente (en negrita), y dos secuencias AGTAAA análogas están en los nt 469-473 y 529-534 (en negrita). El sitio de poli(A)adición está en el nt 439. La siguiente es la secuencia de referencia de Oka et al.:
6
7
El extremo 3' del gen de la lipoproteína lipasa humano incluye la secuencia de nucleótidos intermedios entre el extremo de la secuencia de referencia de Nickerson en el intrón 9 y el principio de la secuencia de referencia de Oka et al.
Una región no codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano incluye cualquier secuencia nucleotídica no transcrita o no traducida dentro del extremo 3', incluyendo todas las secuencias intrónicas. Están incluidas la parte del intrón 6 que se extiende desde la posición del nt 4801 de la secuencia de referencia de Nickerson hasta el nt 6086; el intrón 7 desde el nt 6208 hasta el nt 7729; el intrón 8 desde el nt 7913 hasta el nt 8941; y el intrón 9 desde el nt 9047 hasta el nt 9734. También está incluido el exón 10 y el 3'UTR.
Un alelo variante en una región no codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano es una mutación o polimorfismo con respecto a las secuencias de referencia de Nickerson o de Oka et al., de cualquier clase, tal como, pero sin limitarse a, un polimorfismo de un único nucleótido (SPN). Incluidas entre las fuentes de alelos variantes en una región no codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano se encuentran las mutaciones de deleción, mutaciones de inserción, inversiones, translocaciones, transiciones, transversiones o repeticiones.
Ejemplos de genotipos homocigóticos que indican una predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina incluyen, pero no se limitan a, los genotipos HindIII 2/2 y (TTTA)_{n} 4/4.
El alelo variante HindIII 2 es producido por una transición de T a G en el sitio de reconocimiento para HindIII único mapeado en el intrón 8, es decir, de AAGCTT a AAGCGT, en la posición 8393 de la secuencia de referencia de Nickerson. (K. Oka et al. [1990]; C. Heinzmann et al., RFLP for the human lipoprotein lipase [LPL] gene: HindIII, Nuc. Acids Res. 15:6763 [1987]; D.A. Nickerson et al. [1998]). Para los fines de la presente invención, los ácidos nucleicos que comprenden el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la LPL humana, son secuencias de ácidos nucleicos que solapan con la región de seis pares de bases completa en las posiciones 8389-8394 de la secuencia de referencia de Nickerson, sea o no AAGCTT la secuencia de ácidos nucleicos de un sujeto humano particular en ese locus.
La secuencia de repetición del tetranucleótido (TTTA)_{n} en el intrón 6 del gen de la LPL empieza en la posición 4819 de la secuencia de referencia de Nickerson y se extiende hasta la posición 4864. Existen cinco alelos o polimorfismos de (TTTA)_{n} conocidos. El alelo 4 proporciona un fragmento nucleotídico de 131 pb cuando se realiza la amplificación mediante PCR utilizando un conjunto de cebadores que comprende un cebador inverso GZ-15 5'-CCT GGG TAA CTG AGC GAG ACT GTG TC-3': SEQ. ID. NO.:33) y el cebador directo GZ-14 (5'-ATC TGA CCA AGG ATA GTG GGA TAT A-3'; SEQ. ID. NO.:34).
En los 4 alelos variantes de (TTTA)_{n}, se añaden dos repeticiones TTTA adicionales (mostradas a continuación en el tipo de negrita subrayado) para dar una longitud de los 4 alelos de (TTTA)_{n} de 131 pb. Los números de posición nucleotídica con respecto a la secuencia de referencia de Nickerson estarán fuera de este punto en:
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Un fármaco de estatina es cualquier inhibidor de la 3-hidroxi-3-metilglutarilcoenzima A (HMG-CoA) reductasa, incluyendo, pero sin limitarse a, lovastatina, pravastatina, simvastatina, atorvastatina, fluvastatina y cerivastatina.
Un sujeto humano, particularmente un paciente de CABG, que tenga una predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina, posee una inclinación, susceptibilidad o tendencia hereditaria a desarrollar estenosis aterosclerótica de los vasos sanguíneos coronarios, incluyendo de una arteria coronaria nativa o de cualquier injerto de derivación de arteria coronaria que utilice la vena safena o cualquier otra vena o arteria, de manera que no responda al tratamiento farmacológico con estatina. Esto no significa que en algún momento tal persona desarrollará estenosis de un vaso sanguíneo coronario, o empeoramiento del injerto (estrechamiento del lumen del injerto). Simplemente significa que tiene una probabilidad mayor de desarrollar estenosis, cuando se administra el tratamiento con estatina, esto es en comparación con la población general de individuos que no son homocigóticos para una mutación en el extremo 3' del gen de la LPL, por ejemplo, para los 2 alelos de HindIII o los 4 alelos de (TTTA)_{n}, incluyendo aquellos que tienen enfermedad aterosclerótica de la arteria coronaria, que son pacientes con injerto de derivación de la arteria coronaria.
Un paciente de CABG es un sujeto humano que es candidato a la cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria o uno que se ha sometido al procedimiento de injerto de derivación de la arteria coronaria.
Se pueden tomar y recoger muestras de cualquier tejido humano que contenga ácidos nucleicos con el fin de poner en práctica los métodos de la presente invención. Un tejido más preferido y conveniente del que recoger muestras es la sangre. Recoger una muestra de tejido incluye la recogida in vitro de células humanas cultivadas obtenidas a partir de un tejido del sujeto o cualquier medio de toma de muestras in vivo directamente de un sujeto, por ejemplo, mediante extracción de sangre, punción lumbar, frotis de tejido o biopsia de tejido. Opcionalmente, las muestras de tejido se almacenan antes del análisis mediante medios de almacenamiento bien conocidos que conservarán los ácidos nucleicos de las muestras en un estado analizable, tal como un régimen de congelación rápida o de congelación controlada, en presencia de un crioprotector, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), glicerol o propanodiol-sacarosa. Las muestras de tejido también se pueden reunir antes o después del almacenamiento para fines de amplificarlas para el análisis.
La amplificación de los ácidos nucleicos de una muestra de tejido de un sujeto para obtener productos de amplificación incluye cualquier medio convencional de acumulación de suficiente material de ácido nucleico para el análisis. Más preferiblemente, la amplificación se realiza mediante métodos convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Alternativamente, la amplificación de ácidos nucleicos se realiza con cultivo celular in vitro y recogida de las células cultivadas del sujeto, o mediante la múltiple toma de muestras de los tejidos del sujeto in vivo y reunión de las múltiples muestras de tejido procedentes de un sujeto. Los ácidos nucleicos así amplificados son productos de amplificación si incluyen una secuencia nucleotídica no codificante o no traducida desde el extremo 3' del gen de la LPL, por ejemplo, el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8, o la región de repetición del tetranucleótido (TTTA)_{n} del intrón 6, del gen de la LPL humano.
En una realización preferida del presente método, se utiliza la secuenciación nucleotídica para analizar los productos de amplificación de los ácidos nucleicos de una muestra de tejido, para detectar la homocigosidad para una mutación en el extremo 3' de la LPL humana. Los expertos pueden detectar la mutación mediante cualquier medio de secuenciación nucleotídica, por ejemplo la secuenciación didesoxi convencional o, preferiblemente, utilizando un secuenciador automático disponible comercialmente, comparando luego las secuencias nucleotídicas del sujeto con otras secuencias conocidas de la LPL humana disponibles en las bases de datos de secuencias genómicas, tales como la GenBank.
En una realización más preferida que emplea la secuenciación nucleotídica, la secuenciación de las secuencias del extremo 3' de la LPL se consigue mediante el uso de análisis de polimorfismo conformacional de la cadena sencilla (SSCP) basado en la fluorescencia, un medio fiable y de rutina de identificación de mutaciones puntuales, pequeñas inserciones o deleciones. (J.S. Ellison, Fluorescence-based mutation detection. Single-strand conformation polymorphism analysis [F-SSCP], Mol. Biotechnol. 5(1):17-31 [1996]; H. Iwahana et al., Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis using internal fuorescent labeling of PCR products, Biotechniques 21(3):510-14, 516-19 [1996]; R. Makino et al., F-SSCP: fluorescence-based polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism [PCR-SSCP], PCR Methods Appl. 2(1):10-13 [1992]). Se puede utilizar un sistema automático, tal como un secuenciador de ADN de Applied Biosystems, equipado con GENESCAN 672^{MR}, Genotyper^{MR}, u otro paquete de software analítico apropiado.
Opcionalmente, se puede conseguir el análisis de alto rendimiento mediante técnicas de multiplicación por PCR bien conocidas en la técnica. (Por ejemplo, Z. Lin et al., Multiplex genotype determination at a large number of gene loci, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(6):2582-87 [1996]).
En una realización más preferida, la secuenciación nucloetídica no es necesaria para analizar los productos de amplificación. Por ejemplo, el análisis de heterodúplex en matrices de gel de alta resolución se emplea para detectar incluso polimorfismos de un único nucleótido. (M.T. Hauser et al., Generation of codominant PCR-based markers by duplex analysis on high resolution gels, Plant. J. 16(1):117-25 [1998]). El procedimiento de PCR/OLA se puede utilizar para analizar los productos de amplificación para detectar SNP en el extremo 3' del gen de la LPL humano. (B.R. Glick y J.J. Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., págs. 197-200 [1994]). También se puede emplear la electroforesis en gel sensible a la conformación de los productos de amplificación como un medio de análisis por el experto en la práctica de los métodos de la presente invención. (A. Markoff et al., Comparison of conformation-sensitive gel electrophoresis and single strand conformation polymorphism analysis for detection of mutations in the BRCA1 gene using optimized conformation analysis protocols, Eur. J. Genet. 6(2):145-50 [1998]).
La electroforesis para el análisis de los productos de amplificación se realiza rápidamente y con sensibilidad elevada utilizando cualquiera de diversos métodos de electroforesis en placa o capilar convencional, con la que el profesional puede elegir opcionalmente el empleo de cualquier medio que facilite la detección de los fragmentos de ácidos nucleicos, incluyendo, pero sin limitarse a, radionucleidos, absorbancia UV o fluorescencia inducida por láser. (K. Keparnik et al., Fast detection of a (CA)18 microsatellite repeat in the IgE receptor gene by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection, Electrophoresis 19(2);249-55 [1998]; H. Inoue et al., Enhanced separation of DNA sequencing products by capillary electrophoresis using a stepwise gradient of electric field stength, J. Chromatogr. A. 802(1):179-84 [1998]; N.J. Dovichi, DNA sequencing by capillary electrophoresis, Electrophoresis 18(12-13);2393-99 [1997]; H. Arakawa et al., Analysis of single-strand conformation polymorphisms by capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection, J. Pharm. Biomed. Anal. 15(9-10):1537-44 [1997]; Y. Baba, Analysis of diseases-causing genes and DNA-based drugs by capillary electrophoresis. Towards DNA diagnosis and gene therapy for human diseases, J. Chromatogr B. Biomed. Appl. 687(2):271-302 [1996]; K.C. Chan et al., High-speed electrophoretic separation of DNA fragments using a short capillary, J. Chromatogr B. Biomed. Sci. Appl. 695(1):13-15 [1997]). Cualquiera de los tintes fluorescentes diversos pueden utilizarse opcionalmente para marcar cebadores de la presente invención o productos de amplificación para la facilidad del análisis, incluyendo pero sin limitarse a, SYBR Green I, Y1O-PRO-1, naranja de tiazol, Hex (es decir, 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína), pico green, edans, fluoresceína, FAM (es decir, 6-carboxifluoresceína) o TET (es decir, 4,7,2',7'-tetracloro-6-carboxifluoresceína). Por ejemplo, J. Skeidsvoll y P.M. Ueland, Analysis of double-stranded DNA by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection using the monomeric dye SYBR green I, Anal. Biochem. 231(20):359-65 [1995]; H. Iwahana et al., Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis using internal fuorescent labeling of PCR products, Biotechniques 21(30:510-14, 516-19 [1996]).
El análisis de los productos de amplificación también se puede realizar por medio de la restricción de los productos de amplificación con una o más enzimas de restricción. Cuando los productos de amplificación comprenden el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la LPL humano, la enzima de restricción empleada es preferiblemente HindIII. La restricción de los ácidos nucleicos se sigue mediante la separación de los fragmentos resultantes y el análisis de la longitud de los fragmentos o la migración diferencial de los fragmentos en cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (DHPLC) o electroforesis en gel, como anteriormente, incluyendo la electroforesis capilar-restricción. Por ejemplo, esto se puede lograr mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como PCR-fragmentos de restricción-SSCP, que puede detectar sustituciones, eliminaciones o inserciones de una única base. (M. Tawata et al., A mass screening device of genome by polymerase chain reaction-restriction fragment-single strand conformation polymorphism analysis, Genet. Anal. 12(3-4):125-27 [1996]; Lee et al., Mutational analysis by a combined application of the multiple restriction fragment-single strand conformation polymorphism and the direct linear amplification DNA sequencing protocols, Anal. Biochem. 205(2);289-93 [1992]).
Los cebadores nucleotídicos útiles para amplificar los ácidos nucleicos incluyen cualquiera de una secuencia de 15 a 18 unidades de nucleótidos que se hibridan con un fragmento de ácido nucleico de las secuencias de referencia de Nickerson o de Oka, en condiciones convencionales de astringencia utilizadas para la hibridación en PCR, y en conjunto con otra secuencia cebadora que amplifica una región no codificante o no traducida dentro del extremo 3' del gen de la LPL humano. Un cebador preferido es uno de 20 a 24 unidades.
Es útil para amplificar secuencias no codificantes o no traducidas de ácidos nucleicos desde el intrón 6 (comenzando en la posición 5988 de la secuencia de referencia de Nickerson) al intrón 9, un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que tienen secuencias nucleotídicas que son fragmentos de las secuencias nucleotídicas con los números de acceso de GenBank M76722 (a continuación) y M76723 (hebra opuesta). La secuencia nucleotídica de M76722 es la siguiente:
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Por ejemplo, las secuencias de cebadores oligonucleotídicos que son útiles para amplificar ácidos nucleicos que comprenden el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 de la LPL, incluyen pero no se limitan a, las siguientes secuencias (la designación tras el SEQ.ID.NO. incluye la posición nucleotídica dentro de M76222, por ejemplo, 2701 ó 2397, en el que el 5'-terminal de la primera secuencia empieza si hay un cebador superior ["U", es decir, directo], en cuya posición complementaria a una posición dentro de M76222 termina su extremo 3'-terminal si hay un cebador inferior ["L", es decir inverso]; y la longitud del cebador, por ejemplo, 24 bases):
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Cualquier secuencia de cebador de 15 a 28 unidades que se solape con cualquiera de los SEQ.ID.NO: 1-32 ó 35-79 puede utilizarse también para amplificar ácidos nucleicos que comprenden el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la LPL. La secuencia del cebador puede solapar con la secuencia completa de cualquiera de los SEQ.ID.NO: 1-32 y 35-79 o puede solapar con una o más posiciones nucleotídicas contiguas de cualquiera de los SEQ.ID.NO: 1-32 y 35-79 y nucleótidos adicionales adyacentes a la posición basándose en la secuencia de referencia de Nickerson.
Otras secuencias de cebadores son útiles para amplificar secuencias de ácidos nucleicos que incluyen la región de repetición del tetranucleótido (TTTA)_{n} en el intrón 6. Estos incluyen los SEQ.ID.NOS: 33 y 34, descritos anteriormente y las siguientes secuencias de cebadores (la designación incluye la posición nucleotídica dentro de la secuencia de referencia de Nickerson en el acceso de GenBank AF050163, por ejemplo, 4644 ó 4934, en el que el 5'-terminal de la primera secuencia empieza si hay un cebador superior ["U", es decir, directo]; o la posición complementaria a una posición en AF050163 en la que termina su extremo 3'-terminal si hay un cebador inferior ["L", es decir inverso]; y la longitud del cebador, por ejemplo, 24 bases):
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Cualquier secuencia de cebador de 15 a 28 unidades que solape con cualquiera de los SEQ.ID.NOS: 33 y 34 ó 82-92 puede utilizarse también para amplificar ácidos nucleicos que comprenden la región de repetición del tetranucleótido (TTTA)_{n} en el intrón 6 de la LPL. La secuencia del cebador puede solapar con la secuencia completa de cualquiera de los SEQ.ID.NOS: 33-34 y 82-92 o puede solapar con una o más posiciones nucleotídicas contiguas de cualquiera de los SEQ.ID.NO: 33-34 y 82-92 y nucleótidos adicionales adyacentes a la posición basándose en la secuencia de referencia de Nickerson.
Otras secuencias de cebadores son útiles para amplificar secuencias de ácidos nucleicos en el exón 10 y el 3'-UTR. Éstas incluyen las siguientes secuencias de cebadores (SEQ.ID.NO.:95-106) (la designación incluye la posición nucleotídica dentro de la secuencia de referencia de Oka en el acceso de GenBank X52978 X53518, por ejemplo, 2564, en el que el 5'-terminal de la primera secuencia empieza si hay un cebador superior ["U", es decir, directo]; o la posición complementaria a una posición dentro de X52978 X53518 en la que termina su extremo 3'-terminal si hay un cebador inferior ["L", es decir inverso]; y la longitud del cebador, por ejemplo, 22 bases):
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Cualquier secuencia de cebador de 15 a 28 unidades que solape con cualquiera de las SEQ.ID.NO.: 95-106 con respecto a su posición en la secuencia de referencia de Oka puede utilizarse también para amplificar ácidos nucleicos que comprenden el exón 10 y el 3'-UTR de la LPL. La secuencia del cebador puede solapar con la secuencia completa de cualquiera de las SEQ.ID.NO.: 95-106 o puede solapar con una o más posiciones nucleotídicas contiguas de cualquiera de las SEQ.ID.NO.: 95-106 y nucleótidos adicionales adyacentes a la posición basándose en la secuencia de referencia de Oka.
Las funciones de conjuntos de cebadores útiles pata iniciar la síntesis de los ácidos nucleicos en PCR desde ambos extremos 5' y 3' de una plantilla de ácido nucleico que comprende una región no codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano. El conjunto de cebadores comprende dos cebadores oligonucleotídicos cualesquiera adecuados de la presente invención, tal como se describe en el presente documento, siempre que el conjunto de cebadores incluya tanto un cebador directo (superior o "U") y uno inverso (inferior o "L").
Por ejemplo, un conjunto de cebadores preferido para amplificar ácidos nucleicos que comprenden el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 de la LPL incluye cualquier par de cebadores inferior y superior de entre las SEQ.ID.NO.: 1-32 ó 35-79 (descritas anteriormente), o secuencias de cebadores que solapan con cualquiera de ellas con respecto a la secuencia de referencia de Nickerson. Un conjunto de cebadores más preferido es el cebador inverso (inferior) SEQ.ID.NO.: 1 y el cebador directo (superior) SEQ.ID.NO.: 2.
Conjuntos adicionales de cebadores que son útiles para amplificar la región de la repetición del tetranucleótido (TTTA)_{n} incluyen cualquier par de cebadores inferior y superior de entre las SEQ.ID.NO.: 33-34 y 82-92 (descritas anteriormente), o secuencias de cebadores que solapan con cualquiera de ellas con respecto a la secuencia de referencia de Nickerson. Una realización más preferida de un conjunto de cebadores para la detección de la presencia de los 4 alelos de (TTTA)_{n} incluye cebadores que comprenden las SEQ.ID.NO.: 33 y 34.
Conjuntos adicionales de cebadores que son útiles para amplificar el exón 10 y el 3'UTR incluyen cualquier par de cebadores inferior y superior de entre las SEQ.ID.NO.: 95-106 (descritas anteriormente), o secuencias de cebadores que solapan con cualquiera de ellas con respecto a la secuencia de referencia de Oka.
El equipo de pruebas genéticas útiles es un conjunto preparado de materiales para facilitar la amplificación de los ácidos nucleicos de un sujeto humano que comprende una secuencia nucleotídica de una región no codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano y/o analizar los productos de amplificación de los mismos. Un equipo de pruebas genéticas de la presente invención contiene al menos un cebador oligonucleotídico de la presente invención y, preferiblemente comprende un conjunto de cebadores de la presente invención, tal como se definió anteriormente, junto con instrucciones para la puesta en práctica del presente método. Los materiales o componentes reunidos en el equipo de pruebas genéticas, se facilitan al profesional almacenados de cualquier manera conveniente y adecuada que conserve su operabilidad y utilidad. Por ejemplo, los componentes pueden estar en forma disuelta, deshidratada o liofilizada; pueden facilitarse a temperaturas ambiente, de refrigeración o de congelación.
El equipo de pruebas genéticas puede incorporar una serie de cebadores oligonucleotídicos específicos para los polimorfismos de un único nucleótido en la secuencia nucleotídica humana del extremo 3' de la LPL, particularmente de regiones no codificantes o no traducidas, recopilados previamente en una configuración de "chip de ADN" (o "chip génico") para facilitar la amplificación de los ácidos nucleicos y el análisis de los productos de amplificación. (Por ejemplo, J.G. Hacia et al., Enhanced high density oligonucleotide array-based sequence analysis using modified nucleoside triphosphates, Nucleic Acids Res. 26(2):4975-82 [1998]; R.W. Wallace, DNA on a chip: serving up the genome for diagnostics and research, Mol. Med. Today 3(9):384-89 [1997]; T. Pastinen et al., Minisequencing: a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays, Genome Res. 7(6):606-14 [1997]; M.T. Cronin et al., Cystic fibrosis mutation detection by hybridization to light-generated DNA probes arrays, Hum. Mutat. 7(3):244-55 [1996]; A.C. Pease et al., Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-26 [1994]; E.M. Southern et al., Arrays of complementary oligonucleotides for analyzing the hibridisation behaviour of nucleic acids, Nucleic Acids Res. 22(8):1368-73 [1994]).
El profesional experto apreciará que la homocigosidad para una mutación en una región no codificante o no traducida del extremo 3' del gen de la LPL humano, tal como los genotipos HindIII 2/2 o (TTTA)_{n} 4/4, es un factor de riesgo para la estenosis aterosclerótica en la enfermedad de la arteria coronaria, independiente y aditivo al uso de fármacos de estatina para reducir las LDL. Por ejemplo, el efecto del genotipo HindIII 2/2 de la LPL en el empeoramiento aterosclerótico del injerto es de la misma magnitud que con el uso de un tratamiento farmacológico moderado en lugar de intensivo para disminuir las LDL. Tal genotipo aparentemente no actúa a través de un efecto sobre los niveles lipídicos, ni sobre la cantidad de fármaco que se necesita para conseguir niveles más bajos. Sin embargo, se asocia con un efecto moderado sobre la tensión arterial.
Utilizando los métodos de la presente invención para la detección de una predisposición genética en un ser humano a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria coronaria, el profesional puede identificar pacientes homocigóticos para el alelo variante, el genotipo HindIII 2/2. Estos pacientes están predispuestos a desarrollar la progresión aterosclerótica, a pesar de su cumplimiento del tratamiento intensivo hipolipemiante con lovastatina u otros fármacos de la clase de la estatina.
Un nivel elevado de LDL-C es un factor de riesgo importante en la enfermedad cardiaca y la aterosclerosis, pero no es el único factor de riesgo. La presente invención facilita al profesional una herramienta valiosa para caracterizar mejor los pacientes individuales e identificar aquellos pacientes que es probable que necesiten intervenciones alternativas individualizadas distintas al tratamiento para disminuir el LDL-C con fármacos de la clase de la estatina. Por ejemplo, puede estar indicado el tratamiento directo para disminuir la tensión arterial en pacientes identificados como homocigóticos para un genotipo variante según la presente invención, debido a que tienden a tener tensiones arteriales en el extremo superior del intervalo normal. Tal tratamiento puede incluir, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE) o bloqueantes del canal del Ca^{2+}. Alternativamente, los beta-bloqueantes, diuréticos o una combinación de modalidades pueden ser un tratamiento más adecuado de disminución de la tensión arterial para un paciente dado. La disminución de la tensión arterial en combinación con el tratamiento con aspirina puede evitar la enfermedad cardiaca en algunos pacientes. (Véase, L. Hansson et al., Effects of intensive blood-pressure lowering and low-dose aspirin in patients with hypertension: principle results of the hypertension Optimal Treatment [HOT] randomised trial, Lancet 351(9118):1755-62 [1998]; Thrombosis prevention trial: randomised trial of low-intensity oral anticoagulation with warfarin and low-dose aspirin in the primary prevention of ischemic heart disease in men at increased risk, Lancet 351(9098):233-41 [1998]).
Para los pacientes identificados como homocigóticos para un alelo variante según la presente invención, el profesional puede considerar una variedad de otros factores de riesgo aterogénicos conocidos o sospechados, además de los niveles de LDL-C, que pueden tratarse en un paciente individual. Por ejemplo, pequeños tamaños de partícula de las LDL pueden tratarse con fármacos derivados del ácido fíbrico, por ejemplo, lopid, o niacina a dosis elevadas. (Véase J.R. Guyton et al., Effectiveness of once-nightly dosing of extended-release niacin alone and in combination for hypercholesterolemia, Am. J. Cardiol. 82(6):737-43 [1998]). Los niveles elevados de Lp(a) pueden tratarse con niacina, o estrogenoterapia restitutiva en mujeres o restitución de testosterona en hombres.
Para algunos pacientes identificados como homocigóticos para un alelo variante según la presente invención, el profesional puede centrarse apropiadamente en alterar los factores aterogénicos del estilo de vida tales como la dieta, fumar y el ejercicio. (Por ejemplo, véase J.C. LaRosa, The role of diet and exercise in the statin era, Prog. Cardiovasc. Dis. 41(2):137-50 [1998]).
En vista del coste sustancial de los fármacos de estatina, un segundo beneficio que ha de derivarse de los pacientes que se ha identificado que tienen una predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina, para la enfermedad de la arteria coronaria o la tensión arterial elevada, es el ahorro de costes para los pacientes y los sistemas de asistencia sanitaria, que se puede obtener basándose en tratamientos alternativos más adecuados individualmente en lugar de regímenes de tratamiento con estatina, para aquellos individuos para los que es probable que la estatina sea ineficaz. (Véase D.M. Huse et al., Cost-effectiveness of statins, Am. J. Cardiol. 82(11):1357-63 [1998]; P.N. Durrington, Can we afford to treat hyperlipidaemia as we should? Strategies for rational treatment, Atherosclerosis 139 (Apéndice 1):S1-5[1998]; J.A. Farmer, Economic implications of lipid-lowering trails: current considerations in selecting a statin, Am. J. Cardiol. 82(6A):26M-31M [1998]).
Utilizando los métodos de la presente invención, el profesional puede individualizar mejor el tratamiento y mejorar la atención de los pacientes con enfermedad de la arteria coronaria.
Los ejemplos detallados que siguen describen la asociación genética entre los alelos variantes en regiones no codificantes o no traducidas del extremo 3' del gen de la LPL humano y la estenosis aterosclerótica en la enfermedad de la arteria coronaria que no responde al tratamiento farmacológico con estatina. Se pretende que estos ejemplos sean simplemente para ilustrar y de ninguna manera limitan la presente invención.
Ejemplos Relación genética entre los genotipos de la LPL mutantes y estenosis aterosclerótica fenotípica en la enfermedad de la arteria coronaria que no responde al tratamiento farmacológico con estatina
Los siguientes ejemplos describirán adicionalmente datos y análisis que apoyan una asociación genética entre los genotipos HindIII 2/2 o (TTTA)_{n} 4/4 de la LPL y un fenotipo de estenosis aterosclerótica en la enfermedad de la arteria coronaria que no responde al tratamiento farmacológico con estatina. Sólo las realizaciones referidas al alelo HindIII 2/2 de la LPL ilustran la invención.
Ejemplo 1 Diseño del estudio
Se llevó a cabo un estudio de la asociación genética mediante una comparación dentro del caso auxiliar al Ensayo Tras el Injerto de Derivación de Arteria Coronaria (Post Coronary Artery Bypass Graft Trial. (Investigadores del Ensayo Tras el Injerto de Derivación de Arteria Coronaria). The effect of aggressive lowering of low-density lipoprotein cholesterol levels and low-dose anticoagulation on obstructive changes in saphenus-vein coronary-artery bypass grafts, N. Engl. J. Med. 336:153-62 [1997]). Se siguió un diseño de dos fases. En primer lugar, se establecieron líneas celulares linfoblastoides transformadas mediante EBV (virus de Epstein-Barr) para sujetos de la cohorte de Los Ángeles (L.A.), que proporcionaban una fuente permanente de ADN para probar las hipótesis relacionadas con los genes candidatos a estar relacionados con la aterosclerosis. Entonces, los resultados significativos se probaron en una segunda fase mediante la obtención de los genotipos de todos los sujetos disponibles en el ensayo Post-CABG utilizando ADN aislado de la sangre total enviada a Cedars-Sinai Medical Center desde los demás centros participantes.
Los participantes se asignaron aleatoriamente, siguiendo un diseño de dos por dos, para recibir 1) tratamiento con lovastatina para disminuir el nivel de LDL-colesterol hasta dentro del intervalo de 93-97 mg/dl (grupo de tratamiento intensivo) o 132-136 mg/dl (grupo de tratamiento moderado), y 2) placebo o warfarina a dosis bajas (Post-CABG, 1997). Se compararon los angiogramas coronarios de 1351 sujetos en su inscripción y una media de 4,3 años después utilizando una evaluación cuantitativa de la gravedad de la estenosis del injerto. El empeoramiento del injerto se definió como una disminución del diámetro del lumen de 0,6 mm o más. El porcentaje de sujetos con empeoramiento de uno o más injertos fue del 39% en el grupo de tratamiento intensivo comparado con el 51% en el grupo de tratamiento moderado (p<0,001) y el porcentaje medio de injertos por paciente que mostraban un empeoramiento fue del 27% en el grupo de tratamiento intensivo comparado con el 39% en el grupo de tratamiento moderado (p<0,001).
Estos resultados demuestran la eficacia de la disminución de los niveles de LDL-colesterol con tratamiento farmacológico con estatina en reducir el riesgo de empeoramiento del injerto en la mayoría de los pacientes de CABG. No se observó ningún efecto del tratamiento con warfarina en el empeoramiento del injerto.
Ejemplo 2 Sujetos
Se incluyeron un total de 1351 sujetos procedentes de siete centros clínicos de toda Norteamérica en el ensayo clínico y todos se pudieron elegir como participantes. Se recibió el material genético de 891 sujetos que se incluyeron en el estudio auxiliar. Los criterios de inclusión para el ensayo clínico fueron: cirugía de derivación 1-11 años antes del estudio; un nivel de LDL-colesterol de 130-175 mg/dl; y al menos un injerto de vena del paciente tal como se determinó mediante angiografía. Se excluyeron los sujetos si hubo: (a) la posibilidad de revascularización o muerte dentro del periodo del estudio de 5 años; (b) angina inestable o infarto de miocardio en un plazo de seis meses antes del inicio del ensayo; (c) angina grave; (d) insuficiencia cardiaca; o (e) contraindicaciones a las medicaciones del estudio. Id. Los participantes se asignaron aleatoriamente en un diseño de dos por dos al tratamiento para disminuir el nivel de LDL-colesterol de forma intensiva (LDL objetivo de 93-97 mg/dl) o moderada (LDl objetivo de 132-136 mg/dl) con lovastatina y colestiramina si fuese necesario, y para el tratamiento con placebo o warfarina suficiente para mantener una razón normalizada internacional inferior a 2. Id. El empeoramiento del injerto se determinó comparando el angiograma inicial en la inscripción con un angiograma de seguimiento repetido una media de 4,3 años después. "El empeoramiento" se definió como una reducción del diámetro \geq 0,6 mm de diámetro. "Los sujetos con empeoramiento" se definieron como aquellos sujetos con uno o más injertos que mostraban empeoramiento.
Ejemplo 3 Recogida de datos
Se recogieron los datos de cuestionarios concernientes a datos demográficos, de historia médica y familiar y datos angiográficos y clínicos, como parte del ensayo Post-CABG. Se recogieron datos adicionales de historial familiar en 891 sujetos en el estudio genético auxiliar.
Ejemplo 4 ADN
Durante los años 2-3 del ensayo clínico, se establecieron las líneas celulares de 224 de la cohorte de L.A. mediante la transformación de los linfocitos de la sangre periférica con el virus de Epstein-Barr (EBV). (M.A. Anderson y J.F. Gusella, Use of cyclosporin-A in establishing Epstein-Barr virus transformed human lymphoblastoid cell lines. In Vitro 21:856-58 [1984]; S. Pressman y J.I. Rotter, Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes, prolonged experience with technique, letter to the editor, Am. J. Hum. Genet. 49:467 [1991]). Durante los años 4-5, se recogió la sangre total de 667 sujetos adicionales de los demás centros. Por tanto, el ADN estaba disponible a partir de 891 sujetos. Se aisló el ADN siguiendo protocolos estándar (B.G. Herrman y A. Frischauf, Isolation of Genomic DNA, Methods in Enzymology 152:180-183 [1987]).
Ejemplo 5 Obtención del genotipo
Se utilizaron técnicas convencionales sobre gel de agarosa para obtener el genotipo de la cohorte de LA para el polimorfismo HindIII de la LPL bialélica siguiendo a Heizmann et al. (C.Heizmann et al., RFLP for the human lipoprotein lipase (LPL) gene: HindIII, Nucleic Acids Res. 15:6373 [1987]). Se obtuvo el genotipo de las muestras de ADN de los sujetos restantes para este polimorfismo así como cuatro polimorfismos adicionales de la LPL utilizando la tecnología fluorescente semiautomática. En la figura 1(a), se recopiló la localización de los polimorfismos en el gen de la LPL a partir de la información en GenBank, números de acceso G187209, G34390, M76222 y M76223 y otras fuentes publicadas. (F. Mailly et al., A common variant in the gene for lipoprotein lipase (asp9-asn): functional implications and prevalence in normal and hyperlipidemic subjects, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15:468-78 [1995]; P.W.A. Reymer et al., A lipoprotein lipase mutation (asn291ser) is associated with reduced HDL cholesterol levels in premature atherosclerosis, Nat Genet 1995; 10:28-34 [1995]; C. Heizmann et al., DNA polymorphism haplotypes of the human lipoprotein lipase gene: possible association with high density lipoprotein levels. Hum. Genet. 86:578-84 [1991]; G. Zuliani y H.H. Hobbs, Tetranucleotide repeat polymorphism in the LPL gene, Nucleic Acids Res. 18:4958 [1990]).
Se determinaron los genotipos del marcador utilizando una PCR con los cebadores enumerados a continuación tal como se recomienda por el fabricante de Ampli-Taq Gold (Perkin Elmer, Foster City, CA) en un termociclador Perkin Elmer 9600. (Todas las ejecuciones de PCR comenzaron con 95º durante 10 minutos para activar la polimerasa). Tras la digestión con la enzima de restricción apropiada, se reunieron los productos de la PCR para cada sujeto procedentes de las cinco reacciones de obtención del genotipo y se pasaron juntos sobre geles de Long Ranger al 6% en un secuenciador semiautomático de ADN (Secuenciador de ADN ABI 373, Applied Biosystems, Foster City, CA) con tratamiento de gel utilizando software Genescan y Genotyper.
D9N (exón 2). Se volvió a diseñar el ensayo de Mailley et al. (1995) utilizando la secuencia de GenBank de acceso G187209 de modo que el cebador directo (5'-Hex-ACT CCG GGA ATG AGG T; SEQ.ID.NO.: 107) portaba el tinte de detección y el cebador inverso (CCA GAA AGA AGA GAT TTT GTC; SEQ.ID.NO.: 108) introdujo un sitio de restricción para SalI si el fragmento de PCR portaba el alelo D9N mutado, y daba como resultado un fragmento de 98 pb para el alelo D (1 alelo) y un fragmento de 77 pb para el alelo N (2 alelos) tras la digestión con SalI. Las condiciones de la PCR fueron 35 ciclos de 94ºC 30 segundos, 46ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos.
N291S (exón 6). Se siguió el procedimiento de Reymer et al. (1995) con Hex añadido al cebador directo. Las condiciones de la PCR fueron 35 ciclos de 94ºC 30 segundos, 60ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos. El cebador inverso introduce un sitio para RsaI parcial de modo que el alelo N dio un fragmento de 242 pb (1 alelo) y el alelo S dio un fragmento de 218 pb (2 alelos) tras la digestión con RsaI.
PvuII (intrón 6). Se volvió a diseñar el ensayo de Li et al. (S. Li et al., PvuII RFLP at the human lipoprotein [LPL] gene locus, Nucleic Acids Res. 16:2358 [1998]) utilizando la secuencia del GenBank de número de acceso g34390 de modo que los fragmentos resultantes se desplazaran menos de 350 pb de tamaño en el ABI 373. El cebador directo fue 5'-Tet-CTG CTT TAG ACT CTT GTC CAG GTG (SEQ.ID.NO.: 109) y el cebador inverso fue 5'-GGG TTC AAG GCT CTG TCA GTG TCC (SEQ.ID.NO.: 110). Las condiciones de la PCR fueron 35 ciclos de 94ºC 30 segundos, 55ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos. Se detectó un fragmento de 155 pb si el sitio para PuvII estaba presente (1 alelo) y se detectó un fragmento de 282 pb si el sitio para PuvII estaba ausente (2 alelos).
(TTTA)_{n} (intrón 6). Se siguió el procedimiento de Zuliani y Hobbs (1990) utilizando el cebador GZ-15 marcado con FAM (5'-CCT GGG TAA CTG AGC GAG ACT GTG TC-3'; SEQ.ID.NO.: 33) y el cebador GZ-14 (5'-ATC TGA CCA AGG ATA GTG GGA TAT A-3'; SEQ. ID. NO.: 34). Las condiciones de la PCR fueron 35 ciclos de 94ºC 30 segundos, 68ºC 3 minutos. El alelo 1 se desplazó hasta un tamaño de 119 pb, 2 hasta 123 pb, 3 hasta 127 pb, 3 hasta 127 pb, 4 hasta 131 pb y 5 hasta 135 pb.
HindIII (intrón 8). Se utilizó el ensayo de Heinzmann et al. (1987) para la fase 1 y luego se volvió a diseñar la fase 2 utilizando la secuencia en el GenBank, números de acceso M76722 y M76723. El cebador inverso fue 5'-Fam-GCA TCT GCC TTC AGC TAG ACA TTG (SEQ.ID.NO.: 1) y el cebador directo fue 5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC CAA (SEQ.ID.No.: 2). Las condiciones de la PCR fueron las mismas que las descritas anteriormente para PvuII. Utilizando este conjunto de cebadores de SEQ.ID.NO.: 1 y 2, se detectó un fragmento de 228 pb si el sitio de restricción para HindIII estaba presente (1 alelo) y se detectó un fragmento de 330 pb si estaba ausente (2 alelos).
Ejemplo 6 Métodos estadísticos
Se probaron las diferencias en las características en el nivel inicial entre los grupos de tratamiento y entre los grupos de genotipo mediante un análisis de la varianza de una vía o pruebas de Chi-cuadrado. Se utilizaron los valores de TG y HDH transformados mediante logaritmo para realizar todos los análisis estadísticos con el fin de ajustar sus distribuciones asimétricas, pero están presentes en las tableas como medias sin transformar + DE. Se probó la asociación entre el empeoramiento del injerto y el genotipo de la LPL mediante la prueba de Chi-cuadrado. Se utilizó la estadística de Mantel-Haenszel para probar las interacciones entre genotipos y grupos de tratamiento. La proporción de injertos que mostraban empeoramiento por sujeto se utilizó como la medida cuantitativa del empeoramiento del injerto, y se realizó una regresión múltiple para esta proporción como una función del genotipo y el grupo de tratamiento para identificar factores pronóstico. Las variables ajustadas para esta característica incluyeron la edad, sexo, índice de masa corporal, estado de fumador, número de años desde la CABG, tensión arterial sistólica y diastólica, uso de medicinas actual e historia familiar tal como se enumera en la tabla 1. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con software SAS (versión 6.12, SAS Institute, Cary, NC).
Ejemplo 7 Características en el nivel inicial
La tabla 1(a) compara las características en el nivel inicial de los sujetos en los grupos de tratamiento farmacológico intensivo y moderado. Se observaron diferencias menores en el porcentaje de sujetos con una historia de accidente cerebrovascular, porcentaje que utilizaba tratamientos para la diabetes, tensiones arteriales sistólica y diastólica, y niveles iniciales de LDL. La diferencia sumamente significativa en los niveles en el equilibrio de colesterol total y LDL-colesterol entre estos dos grupos refleja el efecto del tratamiento farmacológico. Tal como se muestra en la tabla 1(b), se observaron diferencias significativas entre los 891 sujetos en el estudio genético y los 460 sujetos que no se incluyeron: frecuencia de infarto de miocardio previo, 46% frente al 55%, p=0,001; fumadores 9% frente al 14%, p=0,005; años medios desde la CABG hasta la inscripción, 4,7 frente a 5,2 años, p<0,001; y uso de aspirina, 79% frente al 69%, p=0,001.
TABLA 1 Características de los sujetos
17
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Ejemplo 8 HindIII de la LPL y empeoramiento del injerto en la cohorte de L.A
La obtención del genotipo de la cohorte de L.A. para el polimorfismo HindIII de la LPL demostró que la proporción de sujetos con empeoramiento del injerto aumentó con el número de 2 alelos HindIII: 42% en los que no tienen ninguno de los 2 alelos HindIII, 54% en los que tienen uno, y 72% en los que tienen los dos (prueba X^{2} 2x3 de asociación, p=0,05). Además, se calculó el porcentaje de injertos que mostraban empeoramiento por sujeto y la media de este porcentaje también aumentó con el número de 2 alelos HindIII de la LPL, con un 22% en los sujetos con HindIII 1/2, 31% en los sujetos con 1/1,y 53% en los sujetos con 2/2 (análisis de la varianza, p=0,001).
Ejemplo 9 HindIII de la LPL y empeoramiento del injerto en todos los sujetos
Con este resultado, se obtuvo el genotipo de los 667 sujetos restantes. En la tabla 2, se muestra una comparación del porcentaje de sujetos con empeoramiento del injerto para los dos genotipos HindIII de la LPL para los 891 sujetos. Se observó una diferencia significativa en el porcentaje de sujetos que mostraba empeoramiento del injerto entre los que tienen el genotipo HindIII 2/2 de la LPL comparado con los que tienen los genotipos HindIII 1/1 y 1/2 de la LPL combinados; el 58% de los que tienen el genotipo HindIII 2/2 de la LPL mostraron empeoramiento comparado con el 42% de los que tienen 1/1 o 1/2 (razón de probabilidades = 1,9, intervalo de confianza al 95% 1,2-3,2, p=0,011). La proporción media de injertos que muestran empeoramiento por sujeto también aumentó de manera significativa para los que tienen el genotipo HindIII 2/2 de la LPL (40% para HindIII 2/2 comparado con 27% para HindIII 1/1 y 1/2 de la LPL; p=0,0066). No hubo diferencias significativas en el empeoramiento del injerto entre sujetos con los genotipos HindIII 1/1 y 1/2 de la LPL.
TABLA 2 Empeoramiento del injerto y genotipo HindIII de la LPL
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Ejemplo 10 Genotipos de la LPL y empeoramiento del injerto
Se probaron cuatro polimorfismos adicionales de la LPL para la asociación con el empeoramiento del injerto en la cohorte completa del estudio genético (figura 1). Los datos de empeoramiento completos estuvieron disponibles para 792 sujetos, los datos de obtención del genotipo completos para cada marcador representado en la figura 1: D9N (exón 2; Mailley et al. [1995], N291S (exón 6; Reymer et al. [1995]), PvuII (intrón 6; "1"=sitio está presente, "2"=sitio está ausente; S. Li et al. [1998]), (TTTA)_{n} (intrón 6; alelo 1 es de 119 pb, 2 es de 123 pb, 3 es de 127 pb, 4 es de 131 pb, 5 es de 135 pb; D.A. Wu et al., Quantitative trait locus mapping of human blood pressure to a genetic region at or near the lipoprotein gene locus on chromosome 8p22, J. Clin. Invest. 97:2111-18 [1996]), HindIII (intrón 8; "1"=sitio está presente, "2"=sitio está ausente; C. Heizmann et al. [1987]). Una designación de "X" es una abreviatura de "otros" genotipos. El porcentaje de sujetos con empeoramiento del injerto es el porcentaje de sujetos con uno o más injertos que muestran una reducción del diámetro \geq 0,6 mm.
Sólo los polimorfismos (TTTA)_{n} y HindIII se asociaron significativamente con empeoramiento del injerto mediante la prueba Chi-cuadrado de asociación. No hubo asociación entre el empeoramiento del injerto y los polimorfismos funcionales D9N y N291S y tampoco asociación con el polimorfismo PvuII. En comparación, el genotipo 4/4 del polimorfismo (TTTA)_{n} se asoció con empeoramiento del injerto: 63% de sujetos con (TTTA)_{n} 4/4 tuvieron empeoramiento de uno o más injertos comparado con el 43% de los sujetos con otros genotipos de (TTTA)_{n} (RP=2,2, IC al 95% 1,1-4,6; p=0,027). Se encontró que el (TTTA)_{n} de 4 alelos estaba en fuerte desequilibrio de segregación con el HindIII de 2 alelos (p<0,001, datos no mostrados). En consecuencia, el genotipo combinado de (TTTA)_{n} 4/4 y HindIII 2/2 también se asoció con empeoramiento del injerto a un nivel de significación similar a los genotipos de (TTTA)_{n} 4/4 o HindIII 2/2 solos.
El empeoramiento del injerto también se asoció significativamente con el genotipo HindIII 2/2 de la LPL y los polimorfismos del tetranucleótido (TTTA)_{n} 4/4, tanto individualmente como juntos. El polimorfismo HindIII 2/2 de la LPL no pareció actuar mediante ninguna variable lipídica, pero se asoció con diferencias significativas en la tensión arterial sistólica y diastólica.
En comparación, no se observaron asociaciones entre los criterios de valoración clínicos y los polimorfismos de la LPL, D9N, N291S o PvuII, lo que indica que la hasta ahora desconocida mutación funcional asociada con el empeoramiento del injerto está en desequilibrio de segregación con los polimorfismos (TTTA)_{n} y HindIII, y por tanto, reside en el extremo 3' del gen de la LPL.
El análisis por regresión múltiple demostró que no hubo diferencias en los valores lipídicos en suero iniciales o de equilibrio, o en la respuesta al tratamiento hipolipemiante entre aquellos sujetos con el genotipo HindIII 2/2 de la LPL y aquellos con los otros genotipos HindIII (es decir, 1/1 ó 1/2). Aunque la presente invención no se compromete con ningún mecanismo particular, esta observación indica que el polimorfismo de la LPL no actúa mediante un efecto sobre el LDL-colesterol. Este resultado es congruente con el de Peacock et al. (1992) que observaron una asociación entre HindIII de 2 alelos de la LPL y la gravedad angiográfica de la aterosclerosis sin observar diferencias concomitantes en los niveles lipídicos en suero medios en ayunas en una comparación de personas jóvenes que sobrevivieron a un infarto de miocardio y controles con edad correspondiente.
Se observaron algunas diferencias significativas en los factores de riesgo importantes para la aterosclerosis entre el grupo de sujetos en el estudio genético descrito en el presente documento, incluyendo: la frecuencia de infartos de miocardio previos, fumadores, uso de aspirina y años medios desde la CABG hasta la inscripción. Pero si se produjo un sesgo de supervivencia, conduciría a una subestimación del efecto del genotipo HindIII 2/2 de la LPL sobre el riesgo de empeoramiento del injerto. Además, en los 891 sujetos para los que estaba disponible el ADN, no hubo diferencias importantes entre los grupos de tratamiento intensivo y moderado con respecto al efecto de HindIII 2/2 sobre la respuesta al tratamiento con estatina, tal como se describió anteriormente.
Ejemplo 11 Características del grupo de genotipo HindIII 2/2
Para investigar los mecanismos potenciales de la asociación entre el genotipo HindIII 2/2 de la LPL y el empeoramiento del injerto, se compararon las características en el nivel inicial y la respuesta de los sujetos a la acción hipolipemiante de la lovastatina entre los sujetos (tabla 3). No se observaron diferencias entre los valores iniciales para el colesterol total, HDL-colesterol y triglicéridos. Sin embargo, se observó una pequeña diferencia en el LDL-colesterol, 159,6+2,1 mg/dl para los sujetos con HindIII 2/2 comparado con 155,0+0,7 para 1/1 y 1/2, p=0,04. No hubo diferencias en ninguno de los valores lipídicos obtenidos como resultado del tratamiento farmacológico durante el ensayo, ni fue significativamente diferente la cantidad de fármaco necesaria para conseguir los valores lipídicos diana entre los dos grupos de genotipo. En comparación con el perfil lipídico esencialmente similar de los grupos de genotipo HindIII de la LPL, los sujetos con HindIII 2/2 variaron conformemente en un conjunto de parámetros fisiológicos. Tuvieron una tensión arterial media superior, tensión sistólica de 138,6+2,1 mmHg frente a 133,7+0,6 para los sujetos con otros genotipos, p=0,03; y tensión diastólica de 82,1+1,0 mmHg frente a 79,4+0,3 para los sujetos con otros genotipos, p=0,02.
El análisis por regresión múltiple mostró que el empeoramiento del injerto o la estenosis se asociaba con una interacción entre el genotipo de la LPL y la tensión arterial. El efecto observado de HindIII de la LPL sobre la tensión arterial probablemente tiene aquí poco efecto en sujetos normales. Sin embargo, en presencia de patología vascular en curso o aterosclerosis clínica, un cambio moderado debido a un factor genético podría ejercer un efecto mayor. Por ejemplo, mientras que un aumento de la tensión arterial dentro del intervalo normal tiene poco efecto en la población general, ligeros aumentos en la tensión arterial son un factor de riesgo significativo para la neuropatía en la diabetes de tipo I, de tal manera que se recomienda la intervención para disminuir la tensión arterial para algunos pacientes normotensos diabéticos de tipo I (J. Barzilay et al., Predisposition to hypertension: risk factor for nephropathy and hypertension in IDDM, Kidney Int. 42:723-30 [1992]; E.J. Lewis et al., The effect of angiotensin-converting enzyme inhibition on diabetic nephropathy, N. Engl. J. Med. 329:1456-62 [1993]). Por tanto, para los pacientes con un genotipo de la LPL desfavorable (por ejemplo, HindIII 2/2) pueden estar indicados otros tratamientos además o en lugar del tratamiento hipolipemiante con estatina para la prevención de la estenosis aterosclerótica.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3 Características de los sujetos con el genotipo HindIII 2/2
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Ejemplo 12 Genotipo HindIII 2/2 y tratamiento farmacológico con estatina
En la figura 2, se muestra el porcentaje de sujetos con empeoramiento del injerto cuando se estratificaron por grupo de tratamiento con lovastatina y genotipo HindIII de la LPL. Los datos completos del genotipo HindIII de la LPL y los datos de empeoramiento estuvieron disponibles para 786 sujetos.
El porcentaje más elevado de sujetos con empeoramiento fue para aquellos con el genotipo HindIII 2/2 asignado al grupo de tratamiento hipolipemiante moderado (65%). El porcentaje más bajo de sujetos con empeoramiento fue para aquellos con el genotipo HindIII 1/1 ó 1/2 asignado al grupo de tratamiento hipolipemiante intensivo (35%). Dentro del grupo de genotipo HindIII 1/1 ó 1/2 de la LPL, el grupo de tratamiento farmacológico moderado tuvo un porcentaje significativamente superior de sujetos con empeoramiento del injerto que el grupo de tratamiento intensivo, 49% comparado con el 35%, razón de probabilidades = 1,8, intervalo de confianza al 95% 1,3 a 2,4, p<0,001. Dentro del grupo de tratamiento intensivo, el grupo de genotipo HindIII 2/2 de la LPL, tuvo un porcentaje significativamente superior de sujetos con empeoramiento del injerto, 54% frente al 35%, RP=2,14, IC al 95% 1,11-4,11, p=0,23. El efecto del genotipo sobre el empeoramiento del injerto, ajustado por tratamiento, fue significativo a p=0,006, RP=2,06, IC al 95% 1,23-3,43, y el efecto del tratamiento sobre el empeoramiento del injerto, ajustado por genotipo, fue significativo a p=0,001, RP=1,78, IC al 95% 1,32-2,4. El efecto combinado de ambos, el genotipo HindIII de la LPL desfavorable con el tratamiento farmacológico moderado dio una razón de probabilidades de 3,5 para el empeoramiento del injerto, IC al 95% 1,4-8,7, p=0,002.
Utilizando la proporción de injertos con empeoramiento por sujeto como variable dependiente, se probaron las interacciones entre los factores utilizando el análisis por regresión múltiple. Tras hacerse ajustes para la edad, sexo, índice de masa corporal (BMI), fumadores, uso de medicación actual, historia médica e historia familiar, el grupo de tratamiento farmacológico (p=0,0001) y la interacción entre el genotipo HindIII 2/2 de la LPL y la tensión arterial sistólica (p=0,0046) permanecieron significativos. No se observó interacción entre la dosis de lovastatina requerida para llevar a cada sujeto a su nivel de LDL-colesterol objetivo y el genotipo HindIII 2/2.
Cuando se estratificaron los sujetos por su genotipo HindIII de la LPL y el grupo de tratamiento farmacológico, cada factor tuvo un efecto similar sobre el empeoramiento del injerto, con razones de probabilidades de 2,1 y 1,8, respectivamente. El efecto combinado de ambos, el genotipo HindIII de la LPL desfavorable con la disminución de lípidos moderada dio una razón de probabilidades para el empeoramiento del injerto de 3,5 (IC al 95% 1,4-8,7, p=0,002). Este análisis demuestra que el genotipo HindIII 2/2 de la LPL es un factor de riesgo independiente y aditivo para el empeoramiento de los injertos con una razón de probabilidades de la misma magnitud que para la disminución de lípidos en el ensayo Post-CABG.
Se presentan las siguientes reivindicaciones, siendo los ejemplos anteriores ilustrativos pero no una descripción exhaustiva de las realizaciones de la presente invención.
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<110> Cedar-Sinai Medical Center (Asignado)
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<120> Prueba genetica para determinar la falta de respuesta al tratamiento farmatologico con estatina
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<130> CEDAR-045110
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<140> No asignado
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<141> 2000-06-30
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<150> US 09/347,114
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<151> 1999-07-02
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<160> 110
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<210> 1
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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gcatctgcct tcagctagac attg 
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24 
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<210> 2
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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tcttccagaa gggtgagatt ccaa 
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24 
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<210> 3
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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ggaaaacata agccctgaat c 
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<210> 4
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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gaaaacataa gccctgaatc g 
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21 
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<210> 5
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 5
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aacataagcc ctgaatcgct c 
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<210> 6
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 6
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cctgaatcgc tcacagttat t 
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<210> 7
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 7
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ctgaatcgct cacagttattc c 
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<210> 8
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatcgctcac agttattcag t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttggcactgt ttcttgtaag t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cactatagtt tgcaaaatcc c 
\hfill
21 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaacctccg agatgctacc tgga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agatgctacc tggataatca aaga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatgctacct ggataatcaa agat 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttccagaag ggtgagattc caag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagaagggt gagattccaa gata 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagaagggtg agattccaag ataa 
\hfill
24 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccacccatg tgtacccata aaat 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210>18
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccacccatgt gtacccataa aatg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccatgtgta cccataaaat gaat 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212>DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtacccataa aatgaattac acag 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccataaaat gaattacaca gaga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgaattaca cagagatcgc tata 
\hfill
24 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acacagagat cgctatagga ttta 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttataacatt tccatcccca agat 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catctgcctt cagctagaca ttgc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgcattaag gaattagggc atct 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agatcaactc tgccatctct tagc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcttatatgtta ctgggctttc acca 
\hfill
24 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcctagagc agtcttatgt tact 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagcctagag cagtcttatg ttac 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acagcctaga gcagtcttat gtta 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agacagccta gagcagtctt atgt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctgggtaac tgagcgagac tgtgtc 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atctgaccaa ggatagtggg atata 
\hfill
25 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctttataaca tttccatccc caagat 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtacccata aaatgaatta cacaga 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acccataaaa tgaattacac agagat 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaatgaatt acacagagat cgctat 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttacacagag atcgctatag gattca 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagcctagag cagtcttatg ttact 
\hfill
25 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acagcctaga gcagtcttat gttac 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacagcctag agcagtctta tgtta 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ataaaatgaa ttacacagag atcgctat 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagattcttt ataacatttc catccc 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattacacag agatcgctat aggattta 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\hfill
26 
\newpage
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\vskip0.333000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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cccacccatg tgtacccat 
\hfill
19 
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\vskip0.333000\baselineskip
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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ccacccatgt gtacccat 
\hfill
18 
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\vskip0.333000\baselineskip
<210> 49
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\hfill
21 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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acccatgtgt acccataaaa 
\hfill
20 
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ggctttcacc aagagatgat aa 
\hfill
22 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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gggctttcac caagagatga ta 
\hfill
22 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
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<212> DNA
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tgaattacac agagatcgct at 
\hfill
22 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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acagagatcg ctataggatt ta 
\hfill
22 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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gttactgggc tttcacc 
\hfill
17 
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\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\hfill
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\vskip0.333000\baselineskip
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<212> DNA
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\hfill
20 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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ccacccatgt gtacccata 
\hfill
19 
\newpage
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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cacccatgtg tacccata 
\hfill
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<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
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\hfill
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\hfill
18 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\hfill
20 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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tcaactctgc catctcttag 
\hfill
20 
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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atcaactctg ccatctctta 
\hfill
20 
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\vskip0.333000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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gaaaacataa gccctgaa 
\hfill
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\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaaacataag ccctgaatc 
\hfill
19 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acataagccc tgaatcg 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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ctgaatcgct cacagtt 
\hfill
17 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaatcgctc acagttatt 
\hfill
19 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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atcgctcaca gttattcag 
\hfill
19 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcgctcacag ttattcagt 
\hfill
19 
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\vskip0.333000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgctcacagt tattcagtg 
\hfill
19 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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aatcccagca catttagtat 
\hfill
20 
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
actatagttt gcaaaatccc 
\hfill
20 
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\vskip0.333000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
tgagagctgg gattagaa 
\hfill
18 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
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<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagagctggg attagaagt 
\hfill
19 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagctggga ttagaagtc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212>DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatcccagca catttagtat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
cccacccatg tgtacccata 
\hfill
20 
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 9734
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
22
23
24
25 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 81
26
27 
\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctggacaaga gtctaaagca gcat 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 83
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\hskip-.1em\dddseqskip
gaatcgcttg aaccggaaag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accatcagtc ttaagagatc tgtg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacagatctc ttaagactga tggt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttttcacct ggacaagagt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtaactga gcgagaccgt 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcacctgga caagagtcta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttgaaccg gaaag 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcacctggac aagagtctaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<212>DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtaactga gcgagaccgt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctccagcctg ggtaact 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acaagagtct aaagcagcat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 668
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 3240
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
29
30 
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgaaaagag catatggtgg tt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggcccaggt atacatatgt aacta 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcccaggta tacatatgta actaa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgaaaagagc atatggtggt tc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaagagca tatggtggtt c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccaggtat acatatgtaa ctaac 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaagagcat atggtggttc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttctctca gctcccagcc aacaa 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agcacaccaa catggcccag gta 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcagctccc agccaacaac cagtc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagcacacca acatggccca ggta 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctcccagc caacaaccag tctcg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actccgggaa tgaggt 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagaaagaa gagattttgt c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgctttaga ctcttgtcca ggtg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggttcaagg ctctgtcagt gtcc 
\hfill
24

Claims (18)

1. Método de detección de la predisposición genética en un sujeto humano a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la prevención de la estenosis aterosclerótica, que comprende:
a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a partir de una muestra de tejido recogida de un sujeto humano para obtener los productos de amplificación, y
b) analizar los productos de amplificación para determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa humano,
en el que la homocigosidad para la ausencia de dicho sitio de reconocimiento para HindIII indica una predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la prevención de la estenosis aterosclerótica.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra de tejido es una muestra de sangre.
3. Método según la reivindicación 1, que comprende además restringir los productos de amplificación con una enzima de restricción antes de analizar los productos de amplificación.
4. Método según la reivindicación 3, en el que la enzima de restricción es HindIII.
5. Método según la reivindicación 1, en el que se utiliza un cebador oligonucleotídico en la amplificación de dichos ácidos nucleicos.
6. Método según la reivindicación 1, en el que se utiliza un oligonucleótido que comprende la secuencia 5'- GCA TCT GCC TTC AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) en la amplificación de dichos ácidos nucleicos.
7. Método según la reivindicación 1, en el que se utiliza un cebador oligonucleotídico que comprende la secuencia 5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2) en la amplificación de dichos ácidos nucleicos.
8. Método según la reivindicación 1, en el que se utiliza un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia 5'- GCA TCT GCC TTC AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) ó 5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2) en la amplificación de dichos ácidos nucleicos.
9. Método según las reivindicaciones 1 y 5-8, en el que se utilizan un cebador oligonucleotídico inverso que tiene la secuencia 5'- GCA TCT GCC TTC AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) y un cebador oligonucleotídico directo que tiene la secuencia 5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2) en la amplificación de dichos ácidos nucleicos.
10. Método según la reivindicación 1, en el que se utiliza un cebador oligonucleotídico en la amplificación de dichos ácidos nucleicos, comprendiendo dicho cebador una secuencia nucleotídica de (SEQ.ID.NO.: 1), (SEQ.ID.NO.: 2), (SEQ.ID.NO.: 3), (SEQ.ID.NO.: 4), (SEQ.ID.NO.: 5), (SEQ.ID.NO.: 6), (SEQ.ID.NO.: 7), (SEQ.ID.NO.: 8), (SEQ.ID.NO.: 9), (SEQ.ID.NO.: 10), (SEQ.ID.NO.: 11), (SEQ.ID.NO.: 12), (SEQ.ID.NO.: 13), (SEQ.ID.NO.: 14), (SEQ.ID.NO.: 15), (SEQ.ID.NO.: 16), (SEQ.ID.NO.: 17), (SEQ.ID.NO.: 18), (SEQ.ID.NO.: 19), (SEQ.ID.NO.: 20), (SEQ.ID.NO.: 21), (SEQ.ID.NO.: 22), (SEQ.ID.NO.: 23), (SEQ.ID.NO.: 24), (SEQ.ID.NO.: 25), (SEQ.ID.NO.: 26), (SEQ.ID.NO.: 27), (SEQ.ID.NO.: 28), (SEQ.ID.NO.: 29), (SEQ.ID.NO.: 30), (SEQ.ID.NO.: 31), (SEQ.ID.NO.: 32), (SEQ.ID.NO.: 35), (SEQ.ID.NO.: 36), (SEQ.ID.NO.: 37), (SEQ.ID.NO.: 38), (SEQ.ID.NO.: 39), (SEQ.ID.NO.: 40), (SEQ.ID.NO.: 41), (SEQ.ID.NO.: 42), (SEQ.ID.NO.: 43), (SEQ.ID.NO.: 44), (SEQ.ID.NO.: 45), (SEQ.ID.NO.: 46), (SEQ.ID.NO.: 47), (SEQ.ID.NO.: 48), (SEQ.ID.NO.: 49), (SEQ.ID.NO.: 50), (SEQ.ID.NO.: 51), (SEQ.ID.NO.: 52), (SEQ.ID.NO.: 53), (SEQ.ID.NO.: 54), (SEQ.ID.NO.: 55), (SEQ.ID.NO.: 56), (SEQ.ID.NO.: 57), (SEQ.ID.NO.: 58), (SEQ.ID.NO.: 59), (SEQ.ID.NO.: 60), (SEQ.ID.NO.: 61), (SEQ.ID.NO.: 62), (SEQ.ID.NO.: 63), (SEQ.ID.NO.: 64), (SEQ.ID.NO.: 65), (SEQ.ID.NO.: 66), (SEQ.ID.NO.: 67), (SEQ.ID.NO.: 68), (SEQ.ID.NO.: 69), (SEQ.ID.NO.: 70), (SEQ.ID.NO.: 71), (SEQ.ID.NO.: 72), (SEQ.ID.NO.: 73), (SEQ.ID.NO.: 74), (SEQ.ID.NO.: 75), (SEQ.ID.NO.: 76), (SEQ.ID.NO.: 77), (SEQ.ID.NO.: 78) o (SEQ.ID.NO.: 79), o que comprende una secuencia que solapa con la secuencia de cualquiera de éstas con respecto a su posición en la SEQ.ID.NO: 80 (secuencia de referencia de Nickerson).
11. Método según la reivindicación 5, en el que dicho cebador oligonucleotídico se marca con un tinte fluorescente.
12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho tinte fluorescente es SYBR Green I, YO-PRO-1, naranja de tiazol, Hex, pico green, edans, fluoresceína, FAM o TET.
13. Método según la reivindicación 1, en el que dicho fármaco de estatina es lovastatina, pravastatina, simvastatina, atorvastatina, fluvastatina o cerivastatina.
\newpage
14. Método según la reivindicación 1, en el que el sujeto humano tiene una enfermedad de la arteria coronaria y la homocigosidad para la ausencia de dicho sitio de reconocimiento para HindIII indica una predisposición genética en dicho sujeto humano a la falta de respuesta al tratamiento con estatina para la enfermedad de la arteria coronaria.
15. Método según la reivindicación 14, en el que el sujeto humano es un paciente con injerto de derivación de la arteria coronaria.
16. Método según la reivindicación 1-2, 5 ó 14-15, más específicamente, método de detección de la predisposición genética en un paciente con injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG) a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria coronaria, que comprende:
a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a partir de una muestra de sangre recogida de un paciente de CABG para obtener los productos de amplificación; y
b) analizar los productos de amplificación para determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa humano,
indicando la homocigosidad para la ausencia de dicho sitio de reconocimiento para HindIII la predisposición genética de dicho paciente de CABG a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria coronaria.
17. Método según las reivindicaciones 1, 9 ó 14-15, más específicamente un método de detección de la predisposición genética en un paciente con injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG) a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria coronaria, que comprende:
a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a partir de una muestra de tejido recogida de un paciente de CABG para obtener los productos de amplificación, utilizando un cebador oligonucleotídico inverso que tiene la secuencia 5'- GCA TCT GCC TTC AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) y un cebador oligonucleotídico directo que tiene la secuencia 5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2); y
b) analizar los productos de amplificación para determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa humano,
indicando la homocigosidad para la ausencia de dicho sitio de reconocimiento para HindIII la predisposición genética de dicho paciente de CABG a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria coronaria.
18. Método según las reivindicaciones 1, 4, 9 ó 14, más específicamente un método de detección de la predisposición genética en un sujeto humano a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria coronaria, que comprende:
a) amplificar ácidos nucleicos que incluyen el locus normal del sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) humano a partir de una muestra de tejido recogida de un sujeto humano para obtener los productos de amplificación, utilizando un cebador oligonucleotídico inverso que tiene la secuencia 5'- GCA TCT GCC TTC AGC TAG ACA TTG-3' (SEQ.ID.NO. 1) y un cebador oligonucleotídico directo que tiene la secuencia 5'-TCT TCC AGA AGG GTG AGA TTC CAA-3' (SEQ.ID.NO. 2);
b) restringir dichos productos de amplificación con HindIII; y
c) analizar los fragmentos de restricción para determinar la ausencia de un sitio de reconocimiento para HindIII en el intrón 8 del gen de la lipoproteína lipasa humano,
en el que la homocigosidad para la ausencia de dicho sitio de reconocimiento para HindIII indica la predisposición genética a la falta de respuesta al tratamiento farmacológico con estatina para la enfermedad de la arteria coronaria.
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