ES2209915T3 - Esponjas de destoxificacion op de actuacion diferencial. - Google Patents

Abstract

Una esponja o espuma polimérica para la eliminación, descontaminación, desintoxicación y/o neutralización de una serie de compuestos de organofósforo y/o organoazufre que comprende una pluralidad de enzimas o un complejo de enzimas reticuladas inmovilizado en un soporte polimérico poroso, comprendiendo dicha pluralidad de enzimas o dicho complejo de enzimas reticuladas múltiples enzimas seleccionadas entre acetilcolinesterasa (AChE), butirilcolinesterasa (BchE), triesterasa, pseudocolinesterasa, colina oxidasa, peroxidasa, organofosfato hidrolasa (OPH), fosfotriesterasa, paraoxonasa y enzimas de hidrolización de OP y un indicador para medir la capacidad de la esponja para un uso posterior.

Description

Esponjas de destoxificación OP de actuación diferencial.

Campo técnico

La invención se refiere a materiales, composiciones, kits y métodos para neutralizar, destoxificar o descontaminar equipamiento y/o personal expuestos a compuestos de organofósforo y organoazufre.

Antecedentes de la invención

En la técnica se conocen métodos para la descontaminación, neutralización y eliminación de productos químicos, tales como compuestos de organofósforo y organoazufre, herbicidas e insecticidas. Sin embargo, las composiciones y dispositivos utilizados en los métodos de la técnica anterior tienen propiedades no deseables, tales como corrosividad, inflamabilidad, toxicidad, dificultad en la fabricación y el almacenamiento y caducidad limitada.

Por ejemplo, DS2, un agente de descontaminación convencional, comprende 80% de dietilenotriamina, 28% de éter monometílico de etilenglicol y 2% de NaOH en peso. Aunque el DS2 es eficaz, es corrosivo al exponerse al aire. DS2 y cualquier producto que se obtenga a partir de su uso se clasifican y regulan como material peligroso. Después de una aplicación, el DS2 debe permanecer durante 30 minutos antes de aclarar el área tratada con agua. Adicionalmente, DS2 comprende un teratógeno.

Algunos métodos de descontaminación emplean formulaciones de hipoclorito que son corrosivas y tóxicas y perjudiciales para los seres humanos y tejidos sensibles tales como los ojos. Otros métodos comprenden incinerar el material contaminado y utilizar filtros de carbono para absorber los productos químicos residuales. Otros métodos utilizan perlas poliméricas o microemulsiones que absorben el producto químico y que deben aclararse. Estos métodos son intrínsecamente peligrosos, caros y generan residuos peligrosos. Además, como muchas de estas composiciones y compuestos utilizados se degradan con la exposición al agua y al dióxido de carbono, estas composiciones y compuestos deben usarse el mismo día en que se fabrican.

Algunos métodos in vivo emplean colinesterasas en presencia de oximas nucleófilas para destoxificar compuestos OP. Este enfoque biolimpiador enzimático es eficaz contra varios compuestos OP en roedores y primates no humanos. Por ejemplo, el pretratamiento de monos rhesus con acetilcolinesterasa de suero bovino fetal (FBS-AchE) o butilrilcolinesterasa de suero de caballo (Eq-BchE) confiere una protección contra hasta 5 LD_{50} de soman, un agente nervioso OP altamente tóxico. Aunque el uso de una enzima como único fármaco de pretratamiento para la toxicidad de OP es suficiente para proporcionar protección completa a un sujeto, se requiere una cantidad relativamente grande (estequiométrica) de la enzima para neutralizar el compuesto OP in vivo. Por lo tanto, la estequiometría OP/enzima se aumenta combinando el pretratamiento enzimático con la reactivación de oxima de forma que la actividad catalítica de FBS-AChE inhibida por OP se restaura rápida y continuamente, y el compuesto OP se destoxifica.

Es evidente que existe una necesidad de mejores métodos y dispositivos para neutralizar, destoxificar, descontaminar y limpiar materiales, equipo y personal expuestos a compuestos OP.

De esta forma, se han desarrollado compuestos de destoxificación de OP, dispositivos y métodos de los mismos, que permiten una destoxificación segura, eficaz y conveniente y una determinación cuantitativa y cualitativa de compuestos altamente tóxicos que no es posible con la técnica anterior. Estos compuestos, dispositivos y métodos aptos para el medio ambiente se describen más adelante en este documento.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona materiales, composiciones, kits y métodos para neutralizar, destoxificar o descontaminar equipamiento y/o personal expuesto a compuestos de OP.

El indicador puede ser fluorescente, quimioluminiscente, un cromógeno visible o un electrodo. La esponja o espuma puede comprender adicionalmente un compuesto, material o dispositivo de reactivación empotrado o integrado sobre o en o unido al soporte poroso. El compuesto, material o dispositivo de reactivación puede comprender clorhidrato de HI-6 (1-(2-hidroxiiminometil-1-piridinio)-1-(4-carboxiaminopiridinio-)dimetiléter, TMB4 (dibromuro de N,N'-trimetileno bis(piridinio-4-aldoxima) u oximas mono-biscuaternarias.

La esponja o espuma polimérica puede estar codificada por colores.

La invención también se refiere a un método para fabricar una esponja o espuma polimérica de la invención que comprende inmovilizar una pluralidad de enzimas o enzimas reticuladas en un soporte polimérico poroso, comprendiendo dicha pluralidad de enzimas o enzimas reticuladas que comprende múltiples enzimas seleccionadas entre acetilcolinesterasa (AChE), butirilcolinesterasa (BchE), triesterasa, pseudocolinesterasa, colina oxidasa, peroxidasa, organofosfato hidrolasa (OPH), fosfotriesterasa, paraoxonasa y enzimas de hidrolización de OP.

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La etapa de inmovilización puede comprender mezcla la diversidad de enzimas o el complejo de enzimas reticuladas con un prepolímero de poliuretano. El prepolímero de poliuretano puede comprender un diisiocianato: el diisocianato puede ser diisocianato de tolilo. Preferiblemente, se mezclan simultáneamente partes iguales de la pluralidad de enzimas o del complejo de enzimas reticuladas y el prepolímero de poliuretano.

La invención también proporciona un método para reactivar un esponja o espuma polimérica de acuerdo con la invención, comprendiendo el método poner en contacto la esponja o espuma polimérica con al menos un compuestos seleccionado entre HI-6, TMB4 y oximas mono-biscuaternarias.

La invención también se refiere a un kit para la eliminación, descontaminación, destoxificación y/o neutralización de una serie de productos químicos peligrosos que comprende una esponja polimérica de acuerdo con la invención. El kit puede comprender adicionalmente una compuesto o compuestos para la reactivación de las enzimas en una cantidad suficiente para desplazar los compuestos de organofósforo unidos covalentemente a partir de la posición activa de la enzima por ataque nucleófilo.

La invención también proporciona un método para descontaminar una superficie donde pueden estar presentes uno o más productos químicos peligrosos que comprenden poner en contacto la superficie con una esponja o espuma polimérica de acuerdo con la invención. El método puede comprender adicionalmente medir la capacidad de la esponja para un uso posterior.

En una realización, la invención se refiere a un material que comprende una mezcla de enzimas y sustratos para la eliminación, descontaminación y neutralización de compuestos OP incluyendo los dirigidos contra seres humanos. La mezcla de enzimas utilizada comprende colinesterasas (ChEs) y/o OP hidrolasas y reactivadores, tales como compuestos de reacción con OP tales como ciertas oximas como HI-6 y oximas mono-biscuaternarias tales como 2-PAM.

El material puede comprender un soporte poroso flexible o rígido. El soporte poroso puede ser una matriz de poliuretano o equivalente.

Por ejemplo, el soporte poroso puede ser una sustancia flexible tipo esponja o material similar, donde las enzimas están aseguradas por inmovilización. Dependiendo del prepolímero de poliuretano o sustrato utilizado, se pueden obtener soportes porosos con distintos grados de flexibilidad y porosidad. El soporte poroso puede formarse de diversas formas, tamaños y densidades dependiendo de la necesidad y de la forma del molde. Por ejemplo, el material poroso puede formarse una esponja o toallita típica para uso doméstico. Las dimensiones preferidas de la esponja son (2,5 x 5,1 x 20,3 cm) a (5,1 x 10,2 x 20,3 cm). Las dimensiones preferidas para la toallita son (10,2 x 10,2 x 0,6 cm) a (35,6 x 35,6 x 0,2 cm). Sin embargo, durante la síntesis a gran escala, las dimensiones del producto enzimático inicial inmovilizado deben ser grandes. Por ejemplo, se podrían producir rollos de 4 pies por 8 pies (1,2 x 2,4 m) y darles un tamaño apropiado como se ha descrito anteriormente.

El soporte de tipo esponja será preferible para uso en superficies, incluyendo superficies naturales, sintéticas y biológicas tales como equipamiento, material de laboratorio, dispositivos, piel y otras membranas delicadas, donde se desea una descontaminación de un superficie irregular o desigual o donde los materiales de descontaminación de la técnica anterior son incompatibles con el tejido humano. Por ejemplo, los materiales se pueden usar para limpiar y descontaminar heridas ya que no son tóxicos y las enzimas inmovilizadas no se filtrarán en la herida. Por lo tanto, las esponjas se podrían usar para descontaminar civiles contaminados por un ataque terrorista en un acto público.

Si el objeto y/o área a neutralizar o descontaminar comprende grietas, rajas, superficies irregulares o porosas, es adecuado un soporte de tipo espuma. La aplicación de pequeñas cantidades se puede realizar con un frasco de nebulización o un bote de nebulización con una boquilla adecuada. Además, la espuma se puede seleccionar de forma que se pueda dispensar en la entrada en un equipo sensible o en un orificio de un sujeto, por ejemplo, el canal auditivo. Si se contamina una gran área, puede utilizarse un aparato que dispense grandes cantidades de espuma.

El soporte de tipo espuma se puede disipar después de un período de tiempo como la espuma de afeitar, o puede secarse en un soporte de tipo esponja estable y flexible. La espuma que se disipa se puede aplicar a sujetos vivos. La espuma, que se seca, se puede aplicar alrededor de una objeto y contener la contaminación dentro de la espuma. Una vez que la espuma se seca, el objeto se puede manipular y mover sin exposición adicional al producto químico peligroso.

Cuando sea necesario, el material también puede comprender un soporte rígido y poroso. El material rígido puede triturarse en un polvo y añadirse a lociones, jabones y otros líquidos para aplicación. Asimismo, el material
flexible, supra, puede tratarse apropiadamente para hacer que sea adecuado para uso en lociones, jabones y otros líquidos.

El material también puede estar en forma de filtro para neutralizar, destoxificar o descontaminar gases tales como el aire. Adicionalmente, el material puede estar en una forma adecuada para uso como ropa o tejidos de ropa.
Además, el material se puede usar para descontaminar agua introduciendo el material en agua y después retirándolo del agua.

En otra realización, el material puede estar codificado por colores de acuerdo con la sustancia específica que puede neutralizar, destoxificar o descontaminar. El color o esquema de colores puede seleccionarse para indicar la concentración enzimática, la actividad y/o la vida útil restante o el alcance de la misma.

Los materiales de la invención se pueden introducir en recipientes para completar la descontaminación de los compuestos OP en los materiales.

Otras realizaciones incluyen los métodos para usar materiales inmediatos para la determinación cuantitativa o cualitativa de compuestos peligrosos tales como compuestos OP.

Como se ha descrito en este documento, el especialista en la técnica apreciará los diversos materiales y sus usos contemplados por los inventores. Todas estas formas pueden combinarse apropiadamente con carbono para la absorción adicional de compuestos OP. El carbono puede integrarse o incorporarse en el soporte poroso del material o el carbono puede ser una capa, filtro u otro a usar junto con el material. Adicionalmente, en el soporte poroso del material se puede integrar o incorporar un forma de liberación lenta, tal como una cápsula seca, sedimento, liposoma u otro, de un compuesto de reactivación tal como HI-6.

Una realización preferida de la invención comprende un material donde AChE y/o BChE se inmovilizan de forma simultánea con hidrolasas OP sobre o en el soporte poroso durante la síntesis del material. Preferiblemente, las enzimas se inmovilizan a través de engarces covalentes. Las enzimas pueden ser de origen procariótico o eucariótico. Estas enzimas pueden ser recombinantes. El enzimas pueden estar contenidas dentro de la célula o sin célula. Pueden emplearse otras enzimas capaces de hidrolizar productos químicos peligrosos tales como compuestos de OP. Asimismo, pueden usarse enzimas tales como triesterasa para la descontaminación de pesticidas de una forma similar a la descrita en este documento. Las enzimas preferidas son aquéllas que pueden ser compuestos OP reactivados o directamente hidrolizados.

En otra realización, la invención se refiere al proceso de fabricar un material, para la eliminación, descontaminación o neutralización de productos químicos peligrosos tales como compuestos OP, que comprenden una mezcla de enzimas inmovilizadas en un soporte poroso. En esta realización, una mezcla de enzimas y prepolímero se mezclan suave y uniformemente junto con una degradación mínima del componente biotipo de forma que la enzima inmovilizada resultante pueda descontaminar, neutralizar o destoxificar eficazmente una cantidad de compuesto OP. El dispositivo utilizado envuelve los componentes en otro. Este es un proceso de bajo cizallamiento. Durante la síntesis del material por los métodos de la técnica anterior, por ejemplo una perforadora de mezcla, las enzimas utilizadas se someten a fuerzas de fluido o a tensión de cizallamiento. El uso de un dispositivo que envuelve levemente los componentes en otros reduce en gran medida las fuerzas de fluido o tensión de cizallamiento, y es el dispositivo preferido para las enzimas, específicamente enzimas sensibles a altas fuerzas de cizallamiento del dispositivo de la perforadora de mezcla. Adicionalmente, el uso de aditivos tales como polímeros que actuación en la superficie, por ejemplo P-65, o bajas concentraciones de glicerol, protege contra la desnaturalización enzimática inducida por fuerzas de cizallamiento. Los polímeros de actuación en la superficie también proporcionan consistencia y absorbencia apropiadas del soporte sólido.

En un proceso preferido para la fabricación del material, se utiliza un aparato de dos cámaras. Una cámara contiene una mezcla de enzimas y la otra cámara contiene el prepolímero. La mezcla de enzimas y el prepolímero se extruyen simultáneamente en una relación 1:1 y se mezclan. Preferiblemente, las mezcla de enzimas y el prepolímero se extruyen rápida y uniformemente mediante un estator estático de mezcla que mezcla suave y uniformemente las enzimas y el prepolímero. Un dispositivo de bajo cizallamiento preferido es una jeringa de doble cámara y un estator estático de mezcla que se usa típicamente para mezclar poliuretanos viscosos o pegamentos epoxi. El tamaño del aparato puede variar dependiendo de la necesidad. Puede ser de bolsillo para que lo usen los soldados en el campo. Como alternativa, el aparato puede ser adecuado para la producción a gran escala y/o descontaminación de grandes objetos o áreas. El dispositivo de mezcla de bajo cizallamiento produce más del doble de la actividad enzimática inmovilizada de AChE o BChE resultante en comparación con una mezcla idéntica preparada con un dispositivo de alto cizallamiento.

La invención se refiere adicionalmente a varios materiales, métodos y dispositivos para reactivar la actividad enzimática del material. Estos materiales, métodos y dispositivos permitirán a una persona usar el material de descontaminación de la invención para diversos usos separados y/o para uso único o continuo, lo que requeriría normalmente diversos materiales de descontaminación pero para la reactivación de la actividad enzimática de las enzimas inmovilizadas. Adicionalmente, estos materiales, métodos y dispositivos permiten la completa descontaminación y/o neutralización de compuestos OP en exceso absorbidos por el soporte poroso pero que no reaccionaron con las enzimas inmovilizadas. Estos métodos y materiales de reactivación emplean sustratos y/o oximas, para reactivar la actividad catalítica de las enzimas inhibidas e inmovilizadas por OP.

La invención se refiere además a diversos materiales y aditivos que se añaden a la realización para ayudar en la eliminación y descontaminación de organofosfatos a partir de superficies tales como grietas, rajas, superficies porosas o irregulares tales como ropas y superficies biológicas que absorben fácilmente los organofosfatos y pesticidas tales como la piel. Los aditivos se usan junto con el material de esponja y pueden incorporarse en el soporte poroso del material. Los aditivos pueden esta en forma seca o líquida, y pueden ser compuestos que solubilizan organofosfatos tales como triacetina o tetraglima, u oximas, que ayudan en la descontaminación y en la reactivación de enzimas.

Otra realización de la invención se refiere a varios kits. Estos kits contienen la esponja que contiene una pluralidad de enzimas necesarias para la descontaminación de compuestos de organofósforo y/o azufre. También se pueden incluir materiales que faciliten o que se consideren necesarios para el proceso de descontaminación. Los kits también pueden incluir materiales poliméricos y enzimas si la espuma es de naturaleza transitoria, por ejemplo, el prepolímero, una mezcla enzimática estable y un aparato de bajo cizallamiento para fabricar una espuma de descontaminación de organofósforo y/o organoazufre. Estos kits también pueden incluir indicadores tanto para la detección cualitativa como para la detección cuantitativa de compuestos OP y medios para transmitir resultados a un punto de recogida central, por ejemplo, un ordenador, enlaces por satélite, estaciones de radio, dispositivos de medida manuales que funcionan con baterías, etc. Por ejemplo, se pueden analizar cuantitativamente los compuestos OP usando dispositivos de medida manuales que funcionan con baterías y conectándolo con un ordenador para calcular la velocidades de reacción que pueden mandarse a un punto de recogida central. Los kits pueden contener elementos para facilitar el uso del dispositivo, por ejemplo instrucciones, recipientes, tubos de ensayo, etc.

Descripción de los dibujos

Esta invención se ilustra adicionalmente con referencia a los dibujos en los que:

La Figura 1A ilustra las superficies modeladas de la Acetilcolinesterasa, butirilcolinesterasa y fosfotriesterasa. La Figura 1B ilustra las superficies modeladas de la casa.

La Figura 2 muestra un material seco.

La Figura 3 ilustra esquemáticamente la reacción específica de las enzimas con prepolímero.

La Figura 4 muestra la correlación lineal entre la cantidad de BChE añadida durante la síntesis del material y la cantidad de BChE en el material final.

La Figura 5 muestra el aumento de las cantidades de BSA añadidas durante la síntesis a una cantidad constante de AChE y polímero TDI.

La Figura 6 ilustra que los materiales mantenían estabilidad enzimática durante más de 3 años a 4ºC y más de 12 meses a 25ºC y 45ºC.

La Figura 7 demuestra que el material mantenía actividad enzimática después de lavados consecutivos.

La Figura 8 muestra una curva dependiente de la concentración de sustrato para AChE acoplada acoplada a poliuretano y soluble.

La Figura 9 ilustra el intervalo de pH de AChE soluble e inmovilizada.

La Figura 10 muestra las actividades relativas de ChEs co-inmovilizadas y OPH.

Las Figuras 11A y B muestra una versión de un cañón de mezcla manual y un estator de mezcla desechable.

La Figura 12 ilustra esquemáticamente esquemas alternativos para detectar actividad de ChE.

La Figura 13 es un modelo de electrodo de carbono con ChE inmovilizada.

La Figura 14 ilustra cómo F invierte la reacción entre un compuesto OP y ChE.

La Figura 15 ilustra cómo las oximas pueden reactivar ChE alquilfosforilada.

La Figura 16A ilustra la actividad de FBS-AChE inmovilizada. La Figura 16B ilustra la actividad enzimática de Eq-BChE inmovilizada.

La Figura 17 representa la inhibición de FBS-AChE inmovilizada en espuma por DFP y la reactivación mediante HI-6.

La Figura 18 representa la inhibición de Eq-BChE inmovilizada en espuma por DFP y reactivación mediante TMB4.

La Figura 19A muestra un aumento de aproximadamente 10 veces en K_{m} debido a que también se observa un cambio a la derecha en la forma (de esponja) inmovilizada cuando se determina usando paraoxon como sustrato. Por otro lado, la Figura 19B muestra poco cambio en la K_{m} para el sustrato paraoxon, con OPAA (derivado de Alteromonas).

La Figura 20A muestra el perfil de pH de colina oxidasa soluble e inmovilizada. La Figura 20B muestra la curva dependiente de la concentración de sustrato para colina oxidasa soluble y acoplada a poliuretano.

La Figura 21A muestra el perfil de temperatura de AChE inmovilizada y soluble. La Figura 21B muestra el perfil de temperatura de BChE inmovilizada y soluble.

La Figura 22 muestra que sólo en relaciones muy altas de organofosfato (exceso 1000 veces molar) el proceso de unión, reactivación y desintoxicación no se completa. Sin embargo, HI-6 puede recupera la mayor parte de la actividad original una vez más.

La Figura 23 muestra la inhibición del detector AChE mediante el organofosfato MEPQ, que no se invierte mediante el lavado en agua o en solución tampón.

La Figura 24A muestra la protección proporcionada por la esponja con un aditivo tetraglima. La Figura 24B muestra la protección proporcionada por la esponja con un aditivo HI-6. La Figura 24C muestra la protección producida por la esponja con un aditivo 2-PAM.

La Figura 25 ilustra la capacidad de la esponja de carbono resultante para unirse a azul de metileno (un indicador colorimétrico del carbono activado).

La Figura 26A muestra las actividades del detector AChE después de incubación continua a 25ºC a diferentes pH. La Figura 26B muestra las actividades del detector BChE después de incubación continua a 25ºC a diferentes pH. La Figura 26C muestra la actividad del detector AChE después de exposición continua a agua de Chesapeake Bay (salobre) a 25ºC. La Figura 26D muestra la actividad del detector AChE después de exposición continua a agua de Allegheny River (fresca) a 25ºC. La Figura 26E muestra la sensibilidad del rótulo M272 a condiciones acuosas (tampón fosfato 50 mM, pH 8,0).

La Figura 27A muestra la inhibición dependiente de la dosis del detector de AChE inmovilizado y AChE soluble al diclorofos de pesticida. La Figura 27B muestra la inhibición dependiente de la dosis de AChE inmovilizada (detector) y AChE soluble al organofosfato soman (GD).

Descripción detallada de la invención

Se han incorporado enzimas en espumas de uretano basadas en hipo durante la síntesis del polímero. Véase la Patente de Estados Unidos Nº 4.342.834. El hipoprepolímero se sintetiza con una reacción de poliol de poliéter (o poliéster) con isocianatos en presencia de agentes de reticulación. Véase Havens, P.L., et al., Ind Eng Chem Res (1993) 32:2254-2258; Patente de Estados Unidos Nº 4.137.200; LeJeune, K.E., et al., Biotechnology and Bioengineering (1999) 20;62(6):659-665. La síntesis se inicia poniendo en contacto moléculas de agua con grupos isocianato presentes en el prepolímero de poliuretano.

A partir de este punto tiene lugar un procedimiento de dos etapas. Los isocianatos reaccionan con agua para formar un ácido carbónico inestable, que a su vez se degrada a amina produciendo CO_{2} que sube el soporte poroso y le permite que crezca. Las aminas reaccionan fácilmente con grupos isocianato, conduciendo a la producción de enlaces de tipo urea. Como la enzima contiene múltiples grupos funcionales, tales como aminas e hidroxilos que pueden reaccionar con los isocianatos, la enzima se convierte en un parte integral del soporte poroso durante la síntesis. Se pueden unir cantidades significativas de enzima al soporte poroso sin impedir el progreso de la síntesis del polímero. A continuación se muestra la reacción que tiene lugar durante la síntesis del polímero.

1. Desprendimiento de CO_{2}:

1

2. Enlace Urea:

2

3. Inmovilización de la Enzima del Grupo Amina.

3

4. Inmovilización de la Enzima del Grupo Hidroxilo.

4

La siguiente lista de enzimas y productos químicos son ejemplos adecuados para usar en la presente invención:

Acetilcolinesterasa (AChE);

Butirilcolinesterasa (BChE);

Pseudocolinesterasa;

Organofosfato hidrolasas (OPH);

Organofosfato ácido anhidrasa (OPAA);

Fosfotriesterasa;

OPH bacteriana de Pseudomonas diminuta (paraoxonasa);

Lacasa;

Cloruro de pralidoxima (2-PAM);

Yoduro de 8-(metoxifosfiniloxi)-1-metilquinolio (MEPQ);

Fluorofosfato de diisopropilo (DFP);

Yoduro de acetiltiocolina (ATC);

Yoduro de S-butiriltiocolina (BTC);

5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB);

Dibromuro de N,N'-trimetileno bis(piridinio-4-aldoxima) (TMB4); y

Clorhidrato de éter dimetílico de 1-(2-hidroxiiminometil-1-piridinio)-1-(4- carboxiaminopiridinio) (HI-6).

Usando colinesterasas de mamíferos tales como FBS-AChE o Eq-BChE en lugar de la colinesterasa Eel, tal y como se encuentra en el impreso M272 (que se usa en la actualidad para detectar compuestos de organofosfato), la enzima inmovilizada mostrará la misma sensibilidad a los OP a los que los seres humanos son susceptibles, o a cualquier nuevo OP que se pueda producir en el futuro contra el ser humano. Se pueden emplear otras enzimas capaces de hidrolizar productos químicos peligrosos tales como compuestos OP, por ejemplo lacasa. Adicionalmente, otras enzimas de hidrólisis de OP asegurarían la rápida y completa destrucción de cualquier intermedio tóxico (por ejemplo, fosforiloximas) que se puedan generar durante el proceso de descontaminación.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invención.

Ejemplo 1 Determinación de posible interferencia de enzimas

Como el prepolímero de poliéter derivado del diisocianato de tolilo (TDI) reacciona de forma más favorable con aminas alifáticas libres tales como lisina y arginina presente en la superficie de la ChEs (o cualquier proteína) para transformarse en una parte permanente reticulada del material, se realizó un modelado molecular por ordenador de las enzimas para marcar los grupos amino disponibles en la superficie de cada enzima, y para determinar si el acoplamiento de estos grupos a un soporte poroso interferiría con la función enzimática. Esto se puede realizar para todas las enzimas de las cuales se conoce su estructura cristalina, o enzimas que pueden modelarse por homología.

La Figura 1A ilustra las superficies modeladas de la acetilcolinesterasa, butirilcolinesterasa y fosfotriesterasa y muestra los restos lisina y arginina en la superficie de la ChE que están disponibles para el acoplamiento al prepolímero. Esto se generó con Insight II, un software de modelado molecular de Biosym Technologies. Basándose en el modelo molecular, hay al menos un resto lisina y 29 restos arginina accesibles al agua en la superficie de la FBS-AChe para acoplar al soporte poroso, mientras que en la BChE equina se modelaron 26 restos lisina y 26 restos arginina. La mayoría de los restos lisina y arginina se encontraron en la parte trasera de la ChE, y solo se encontraron unos pocos en el lado de la enzima donde está situada la posición catalítica. El borde y la abertura del desfiladero de la posición catalítica de la AChE y BChE parecían no tener lisina ni arginina. Por lo tanto, acoplar estas enzimas al soporte poroso debería tener un efecto mínimo en la entrada del sustrato, inhibidores tales como OP, o reactivadores tales como oximas, que incluyen oximas mono- biscuaternarias, liberación de productos de la catálisis hacia y desde la posición activa, y los parámetros cinéticos de las enzimas. De forma similar, se muestra un modelo de la superficie de la lacasa (Figura 1B) con los restos disponibles para unirse covalentemente al prepolímero.

Ejemplo 2 Síntesis de un material de poliuretano unido a enzima

Una síntesis típica del material comprende mezclar enzimas en un tampón fosfato que contiene un 1% (concentración final) de tensioactivo con prepolímero. Se utilizó prepolímero de poliéter derivado de diisocianato de tolilo (TDI), prepolímero Hipool TDI 3000 (Hampshire Chemical, Lexington, MA) y tensioactivo Pluronic P-65 (BASF Specialty Chemicals, Parsippany, NJ). El sistema de 2 fases se mezcla y se introduce en un molde adecuado y se deja curar. La Figura 2 muestra un material curado que comprende un soporte de tipo esponja.

La Figura 3 ilustra esquemáticamente la reacción específica de las enzimas con el prepolímero. La síntesis comienza cuando las moléculas de H_{2}O reaccionan con los grupos isocianato presentes en el prepolímero de poliuretano. El isocianato reacciona con el agua para forma un ácido carbónico inestable, que se degrada en amina dando CO_{2}. El CO_{2} hace que el polímero crezca y se haga poroso, y de forma simultánea, las aminas reaccionan fácilmente con los grupos isocianato conduciendo a enlaces urea.

Como el ChE contiene aminas que están en la superficie y disponibles para reaccionar con los grupos isocianato, pueden llegar a ser parte integral del soporte de poliuretano durante la síntesis. No hay un atrapamiento de la enzima en el material como el que se encuentra en las ciclodextrinas, o un adsorción física de las enzimas, como se observa en el carbono activado. La inclusión de un tensioactivo tal como Pluronic P-65 a una concentración final de aproximadamente un 1% controla la estructura final y el potencial de absorción del material.

Para crear un material que comprende un soporte de poliuretano poroso, se introdujeron aproximadamente 30 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 8,0, que contenían tampón tensioactivo P-65 en un vaso de precipitados de plástico de 600 ml. Se añadieron de 3 a 5 ml de FBS-AChE purificado (7.500 unidades) o Eq-BChE purificado (5.000 unidades), seguido de aproximadamente 40 g de prepolímero Hipoo 3000 (diisocianato de tolilo). El sistema de dos fases se mezcló y el material se dejó expandir durante 10 minutos y se extruyó del recipiente. El material se lavó minuciosamente con tampón fosfato 50 mM, pH 8,0, se secó y se almacenó en una bolsa con cierre de tipo cremallera a 4ºC para su uso posterior.

Ejemplo 3 Características del material sintetizado

Aproximadamente el 20-90% de las enzimas estaban unidas covalentemente al soporte poroso a través de grupos amino o hidroxilo libres. Esto se determinó por la presencia de enzima en el primer y segundo lavado del material.

Como las enzimas pueden estar unidas en múltiples puntos, se convierten en parte del soporte de polímero reticulado. El soporte de polímero reticulado imparte una estabilidad considerable a las enzimas unidas. Se puede incorporar una gran cantidad de enzima en un pequeño soporte de poliuretano, haciendo por tanto al soporte de polímero reticulado un material altamente eficaz para la descontaminación.

A. Actividad enzimática

Se suspendieron cinco muestras de materiales que contenían FBS-AChE y cinco muestras de materiales que contenían Eq-BChE, con un peso en el intervalo de 1 a 40 mg, en 2,8 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 8,0 y se analizaron usando el método de Ellman. Véase Ellman, G.L., et al., (1961) Biochem Pharmacol 7:88-95. Se encontró una correlación lineal entre el peso de la esponja y la actividad enzimática de las inmovilizaciones de FBS-AChE y Eq-BChE. Véanse las Figuras 16A y B. La correlación lineal entre el peso del material y la actividad enzimática indica una inmovilización uniforme de AChE o BChE en el material.

El material se lavó con tampón fosfato 50 mM, agua destilada o bicarbonato amónico 10 mM sin afectar a la hidrólisis del sustrato. Por lo tanto, la mezcla de prepolímero, tensioactivo y enzima in situ a 22ºC produce un material útil y eficaz que retiene aproximadamente el 50% de la actividad original de la ChE soluble.

B. Capacidad de carga de proteína

El material tiene una capacidad de carga significativamente mayor para ChEs tales como BChE o AChE. La actividad final de la BChE inmovilizada en el material se podría incrementar añadiendo mayores cantidades de enzima durante la síntesis. Véase la Figura 4. Al añadir proteína no específica (albúmina de suero bovino, BSA) a una cantidad constante de AChE purificada, no se produjo ninguna reducción en la actividad ChE. Véase la Figura 5. De esta forma, se pueden sintetizar materiales de más potencia con proteínas adicionales, enzimas y otras ChE. Adicionalmente, se pueden sintetizar fácilmente materiales eficaces frente a una serie de compuestos OP con combinaciones de múltiples enzimas o una diversidad de enzimas.

C. Estabilidad enzimática

Como se ilustra en la Figura 6, la ChE y la OP hidrolasa mantuvieron la estabilidad enzimática durante más de 3 años a 4ºC, y durante más de 12 meses a 25ºC y 45ºC, respectivamente. Si el material se congela en nitrógeno líquido, la mayor parte de la actividad original permanece. El TDI imparte una estabilidad destacable a la ChE inmovilizada; aproximadamente el 50% de la actividad original de AChE inmovilizada y el 20% de la actividad de la BChE inmovilizada permanecían después de 16 horas a 80ºC, condiciones en las que las enzimas solubles no mostrarían actividad. Los materiales ChE pueden secarse exhaustivamente al vacío a 22ºC y después rehidratarse sin pérdida de actividad enzimática. Cuando los materiales AChE y BChE se lavan exhaustivamente y se analiza su actividad, el lavado y el ciclo de ensayo se repiten más de veinte veces en tres días y no se produce ninguna pérdida de actividad. Véase la Figura 7. Esto indica que el material se puede usar repetidamente.

Estos resultados también demuestran que los ChEs se reticulan covalentemente en el soporte poroso y que los ChE no lixivian a la piel, agua o equipamiento. Por lo tanto, una vez que las enzimas inmovilizadas se unen a un compuesto OP, el OP se elimina de la superficie que requiere descontaminación.

D. Constantes cinéticas TABLA 1

Inhibición dependiente del tiempo de CHE con MEPQ
		Constante de velocidad bimolecular
ChE	Forma de la Enzima	(M^{-1} min^{-1}) \pm SD
FBS-AChE	soluble	1,59 \pm 0,52 x 10^{8}
	acoplada a esponja	1,00 \pm 0,28 x 10^{8}
BChE-equina	soluble	4,15 \pm 0,78 x 10^{7}
	acoplada a esponja	4,21 \pm 2,00 x 10^{7}

El número de posiciones activas de la ChE inmovilizada o soluble se determinó por valoración con el compuesto de organofósforo MEPQ, yoduro de 7-(metiletoxifosfiniloxi)-1-metilquilonolinio. Las constantes de velocidad bimolecular de la inhibición de material AChE y material BChE y las respectivas enzimas solubles con MEPQ a 25ºC mostraron que no había una diferencia significativa entre las enzimas solubles y las unidas covalentemente. Véase la Tabla 1.

Estos resultados demuestran que las formas inmovilizada y soluble de ChE interactúan con los compuestos OP de forma similar. Por lo tanto, se pueden usar los ensayos de actividad enzimática que están disponibles en el mercado y conocidos en la técnica.

Se usó un método de velocidades iniciales usando un ensayo de Ellman modificado para determinar los parámetros K_{m}, k_{cat} y k_{cat}/K_{m} de las AChE y BChE inmovilizada y soluble. El número de posiciones activas de las ChE acopladas o solubles se determinó por valoración con MEPQ. Como se muestra en la Tabla 2 y en la Figura 8 para la AChE, los valores K_{m} de las ChEs inmovilizadas eran aproximadamente 10 veces mayores que en las enzimas solubles correspondientes, y los valores k_{cat} se vieron afectados en menor medida. Los efectos combinados en la afinidad por el sustrato y k_{cat} tuvieron como resultado una reducción de aproximadamente 20 a 50 veces en la acilación (k_{cat}/K_{m}). Sorprendentemente, mientras que la BChE soluble carecía de inhibición del sustrato, la BChE inmovilizada producía inhibición del sustrato. Estos resultados sugieren que la unión covalente de restos de superficie de las ChE al soporte poroso cambió algunas propiedades de la región de la posición activa de las enzimas acopladas de forma directa o indirecta.

TABLA 2

Parámetros cinéticos de ChEs solubles y acopladas a poliuretano
Enzima	Forma	Inhibición	K_{m} (mM)	K_{ss} (mM)	B	K_{cat} (min^{-1})	K_{cat}/K_{m} (M^{-1}min^{-1})
		del sustrato
FBS-AChE	Soluble	si	0,119	18	-	2,8 x 10^{5}	2,5 x 10^{9}
	Inmovilizada	si	1,090	22	-	5,9 x 10^{4}	5,4 x 10^{7}
BChE-Equina	Soluble	no	0,127	1,5	1,8	3,1 x 10^{4}	2,4 x 10^{8}
	Inmovilizada	si	1,200	16	-	1,8 x 10^{4}	1,5 x 10^{7}
Determinado en fosfato 50 mM, pH 8 a 25ºC usando un método de velocidades iniciales.
Calculado a partir de la V_{max} y la concentración de la posición activa de ChE que se determinó por valoración con
MEPQ.
Los valores se calcularon^{2} usando ecuaciones de Haldane modificadas, y el caso especial fue b=0. El mejor ajuste
entre los dos se determinó usando una prueba F, en la que el significado se definió como p<0,05

Generalmente, las colinesterasas inmovilizadas o enzimas de hidrólisis de OP muestran entre las mismas valores de K_{m} 10 veces mayores que las correspondientes enzimas solubles. Además de las colinesterasas, la OPH (derivada de Pseudomonas diminuta, Figura 19A) muestra una aumento aproximadamente 10 veces mayor en la K_{m} debido a que también se observa un cambio a la derecha en la forma (esponja) inmovilizada cuando se determina usando el sustrato paraoxon. Por otro lado, la OPAA (derivada de Alteromonas, Figura 19B) muestra poco cambio en la K_{m} con el sustrato paraoxon.

Determinación de K_{m} en colina oxidasa inmovilizada y soluble

Se observó que la K_{m} de las formas (esponja) de colina oxidasa soluble e inmovilizada eran similares, ya que hay poco cambio en la curva del sustrato, como se muestra en la Figura 20B, indicando que esta enzima no sólo es muy adecuada para la inmovilización, sino también para la coinmovilización con las colinesterasas. Las K_{m} observadas para la forma soluble y de esponja son de 2,5 y 6,7 mM, respectivamente.

E. pH de enzimas solubles e inmovilizadas

Los perfiles de pH de AChE soluble e inmovilizada son idénticos y las enzimas muestran actividad en todo el amplio intervalo de pH de 7-8,5. Véase la Figura 9. Como los perfiles de pH de las colinesterasas solubles, OP hidrolasas y colina oxidadas tienen actividades óptimas en este mismo intervalo de pH, los materiales se pueden optimizar y diversificar empleando una diversidad de estas múltiples enzimas inmovilizadas en o dentro de un soporte poroso.

Figura 20A: El perfil de pH de colina oxidasa soluble e inmovilizada. Comparar con la Figura 9, el perfil de pH de acetilcolinesterasa soluble e inmovilizada.

Actividad dependiente de la temperatura de colinesterasas solubles y colinesterasas detector (inmovilizadas)

Los detectores que contenían AChE o BChE inmovilizada mostraron una actividad dependiente de la temperatura casi idéntica en comparación con sus homólogos solubles (Figuras 21A y B). Sin embargo, como se muestra en la Figura 6, las enzimas inmovilizadas son más resistentes a las condiciones desnaturalizantes de altas temperaturas durante periodos prolongados, mientras que las enzimas solubles no lo son. Las enzimas inmovilizadas son también resistentes a congelación en nitrógeno líquido. Estos perfiles indican que a bajas temperaturas, los detectores se podrían calentar mediante el calor corporal o con una fuente de calor externa para aumentar la velocidad de reacción.

Ejemplo 4 Inmovilización de una diversidad de enzimas

Se co-inmovilizaron ChE con OP hidrolasa bacteriana (OPH_{B}) y/o OP hidrolasa de suero de conejo (OPH_{R}). No hubo ninguna reducción en las actividades enzimáticas de AChE o BChE co-inmovilizadas con OPH en comparación con las actividades enzimáticas de cada una de estas enzimas inmovilizadas individualmente. Véase la Figura 10. Además, no hubo reducción en la actividad enzimática de OPH co-inmovilizada. Por lo tanto, se puede seleccionar y utilizar una diversidad de enzimas, cada una de las cuales reacciona de forma diferente con distintos compuestos OP, en un material para crear un material de descontaminación eficaz contra un amplio intervalo de compuestos OP.

Ejemplo 5 Síntesis rápida de mezcla

Utilizando un método de síntesis modificado de la industria de adhesivos (CPA, Greenville, RI 02828), se reducen las fuerzas de cizallamiento que reducen la actividad enzimática. Véanse las Figuras 11A y B. En este método, la enzima no está en un tampón orgánico como se requiere en algunas técnicas de inmovilización. Esto tiene como resultado un menor cizallamiento inducido por aire, manteniendo por tanto la actividad enzimática. Este método es además simple de realizar, rápido y reproducible. El dispositivo de mezcla de bajo cizallamiento obtiene más del doble de actividad enzimática resultante con AChE y/o BChE inmovilizada en comparación con una mezcla idéntica preparada con un dispositivo de alto cizallamiento tal como una perforadora de mezcla. Véase la Tabla 3.

TABLA 3

Técnica	Actividad AChE U/mg
Perforadora de mezcla de alto cizallamiento	0,100
Dispositivo de 2 cámaras de bajo cizallamiento	0,270

Ejemplo 6 Inhibición de FBS-BChE inmovilizada con DFP y reactivación con HI-6

Se incubaron muestras de 100 mg de FBS-AChE inmovilizada con distintas concentraciones de DFP en 2 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 8,0, durante 1 hora a 25ºC. En experimentos paralelos, se añadió HI-6 1mM a la misma cantidad de material y DFP. El DFP residual en las muestras se midió añadiendo una porción de 0,5 ml de la mezcla de reacción a 0,5 ml de una solución reciente de 1 U/ml de FBA-AchE, incubando durante una hora y analizando porciones de 10 \mul usando el procedimiento de Ellman. Los resultados se muestran en la Figura 17.

La inhibición de la actividad FBS-AChE con DFP fue proporcional a la cantidad estequiométrica de DFP añadida a la espuma suspendida en la solución tampón. La presencia de HI-6 1 mM evitó casi completamente la inhibición de la enzima con el DFP. Esto indica que la FBS-AChE inmovilizada se puede usarse repetidamente después de reactivar la enzima con una solución de oxima tal como HI-6. La Figura 15 ilustra como las oximas pueden reactivar la actividad de la ChE alquilfosforilada.

Ejemplo 7 Inhibición de Eq-BChE inmovilizada con DFP y reactivación con TMB4

Se incubaron muestras de 50 mg de FBS-BChE inmovilizada con distintas concentraciones de DFP en 2 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 8,0, durante 18 horas a 25ºC. En experimentos paralelos, se añadió TMB4 1mM a la misma cantidad de material y DFP. El DFP residual en las muestras se midió añadiendo una porción de 0,5 ml de la mezcla de reacción a 0,5 ml de una solución reciente de 1 U/ml de FBA-BchE, incubando durante una hora y analizando porciones de 10 \mul usando el procedimiento de Ellman. Los resultados se muestran en la Figura 17.

Se usó TMB4 como reactivador en lugar de HI-6 porque el TMB4 es un reactivador más eficaz de Eq-BChE inhibida que HI-6- Estos resultados se muestran en la Figura 18. Como en el Ejemplo 6, la Eq-BChE unida a la espuma se puede usar repetidamente después de reactivar la enzima con una solución de oxima tal como TMB4. La Figura 15 ilustra como las oximas pueden reactivar la actividad ChE alquilfosforilada.

Ejemplo 8 Determinación de la actividad enzimática

La Figura 12 ilustra una diversidad de métodos para determinar la presencia de AChE y/o BChE y/o la eficacia de una material. En los siguientes ejemplos, el material se expone primero a compuestos OP y después se realizan análisis cualitativos y/o cuantitativos. Los análisis cualitativos se pueden realizar visualmente utilizando cromógenos visibles y/o cromógenos quimioluminiscentes. Los análisis cuantitativos se pueden realizar usando dispositivos manuales que miden cantidades de fluorescencia, quimioluminiscencia o cromógenos visibles. Alternativamente, la cantidad de H_{2}O_{2} generada se puede usar para determinar la eficacia del material.

Para evaluar la presencia de AChE y/o BChE inmovilizada en un material, se puede utilizar un método de Ellman modificado en un entorno acuoso con una solución tampón fosfato que contiene acetiltiocolina para AChE o butiriltiocolina para BChE como sustratos. Si hay AChE y/o BChE presente, se obtendrá como resultado de la reacción un intenso color amarillo que se puede observar espectrofotométricamente a 412 nm. Para determinar la presencia de OP hidrolasas inmovilizadas en un material, se puede usar p-nitrofenilfosfato de dietilo como sustrato y las reacciones se pueden observar a 500 nm. Los ensayos de Ellman y OP hidrolasa producen un cromógeno amarillo si la enzima está presente, y ningún color si la enzima está ausente. Alternativamente, si se usa acetato de 2,6-dicloroindofenilo como sustrato, quedará un color rojo si la enzima está ausente y se volverá azul (2,6-dicloindolfenilato) si la enzima está presente.

Para la determinación fluorescente de la presencia de una enzima inmovilizada, el sustrato puede ser yoduro de 1-metil-7-acetoxiquinolinio. En presencia de una enzima, se obtendrá como resultado un compuestos altamente fluorescente, yoduro de 1-metil-7-hidroxiquinolinio, es decir 405 nm/em 505 nm. Alternativamente, la maleimida fluorogénica N-(4-(7-dietilamino-4-metil-coumarin-3-il)fenil)-maleimida que se condensa con el tiol formado en la hidrólisis con acetil- o butiril-tiocolina de ChEs, puede indicar la presencia de una enzima inmovilizada, es decir 390 nm/em 473 nm.

Para el análisis de quimioluminiscencia, se utiliza un sustrato ChE y o benzoilcolina, colina oxidasa, peroxidasa y luminol.

Se pueden usar electrodos para detectar la presencia y eficacia de una diversidad de enzimas inmovilizadas en un material con el uso de una diversidad de sustratos tales como ChE, colina oxidasa y peroxidasa.

Ejemplo 8 Inhibición de AChE inmovilizada con el organofosfato MEPQ y desintoxicación del MEPQ y reactivación de la enzima inmovilizada en presencia de HI-6

Se incubaron muestras de 50 mg de acetilcolinesterasa inmovilizada con distintas concentraciones de MEPQ en 2 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 8,0 a 25ºC durante 1 hora. En ausencia de oxima HI-6, la esponja absorbe el MEPQ y se inactiva. La adición de HI-6 reactiva la actividad de la esponja, y el MEPQ se desintoxica, y la mayor parte de la actividad original de la esponja se recupera. Solo en relaciones muy altas de organofosfato (exceso molar de 1.000 veces) el proceso de unión, reactivación y desintoxicación no se completa. Sin embargo, el HI-6 reciente puede recuperar la mayor parte de la actividad original una vez más. Véase la Figura 22.

Ejemplo 9

Se incubaron muestras de 50 mg de FBS-AChE inmovilizada con el doble de la relación estequiométrica del organofosfato MEPQ en 2 ml de tampón fosfato 50 mM, pH 8,0 durante 10 minutos o 30 minutos a 25ºC. En el periodo de tiempo más corto medido, el detector indica inhibición. Además, el detector se puede lavar en agua o solución tampón sin invertir la inhibición del organofosfato. Véase la Figura 23.

Ejemplo 9 Material diversificado que comprende múltiples enzimas inmovilizadas

Los materiales que comprenden colinesterasas, OP hidrolasas y enzimas que hidrolizan otros OP se pueden inmovilizar covalentemente en, dentro de, o encapsularse en un soporte poroso para formar un material para neutralizar, desintoxicar o descontaminar equipamiento y/o personal expuesto a una serie de compuestos OP. Por ejemplo, como la OP hidrolasa del suero de conejo muestra una alta actividad con el sarín, pero no con soman, la OPH de conejo y la OPH de otra fuente se pueden co-inmovilizar dentro de un soporte poroso para formar un material útil para neutralizar, desintoxicar o descontaminar sarín y soman.

Adicionalmente, como las enzimas de varias especies de bacterias halófilas y Alteromonas tienen una variación considerable en la actividad enzimática en compuestos de organofósforo, se pueden inmovilizar una diversidad de estas enzimas en, o dentro del soporte poroso. Por ejemplo, como la OPH de A. undi muestra una mayor actividad enzimática contra soman que con respecto a sarín o tabun, se puede usar la OPH de A. undi y la OPH de otra fuente con mayor actividad contra el sarín y tabun. Además, se puede usar una diversidad de OP hidrolasas, ChE, lacasas y/o mediadores de lacasas y mutaciones de los mismos para fabricar un material eficaz contra un amplio intervalo de compuestos OP.

Las Tablas 4 y 5 describen algunas enzimas que se pueden usar contra los compuestos OP dados.

TABLA 4

Actividad relativa de la enzima
Oxígeno	AChE o BChE	OPH de conejo	Alteromonas undi	Lacasa
Sarín	Inhibida	++	+	-
Soman	Inhibida	-	+++	-
Tabun	Inhibida	-	+	-
VX	Inhibida	-	-	++
- no ensayado o no hidrolizado

Enzimas múltiples inmovilizadas potenciales
Tipo de enzima y origen	Características distinguibles	Referencias
AChE, BChE	Inhibida por OP	1,2
Lacasa	Hidroliza VX preferiblemente con un mediador	21
OPH suero humano	Hidroliza tabun, VX mal	13
OPH suero de conejo	Hidroliza sarín preferiblemente	32
OPH Pseudomonas	HIdroliza agentes G	33
OPH Alteromonas undi	Hidroliza soman preferiblemente	17
OPH Calamar	Hidroliza tabun, VX mal	34

Ejemplo 10 Aditivos de la esponja para mejorar la descontaminación de piel contaminada con soman (GD) en cobayas.

Se usaron esponjas de 1 ½ x 2 ½ x 1/4'' (HxLxD) que contenían 9,0 ml de aditivo y una segunda esponja que contenía 4,5 ml de aditivo. Cada cobaya se lavó con la primera esponja y después con la segunda esponja después de la exposición al soman (GD). La supervivencia de los cobayas se determinó después de 24 horas, y se calculó la relación de protección. La relación de protección es la relación del LD_{50} de la esponja que contiene un aditivo con el LD_{50} del soman en ausencia de esponja. De esta forma, cuanto mas grande sea el LD_{50}, mayor es la relación de protección y más eficaz es la combinación de esponja para la descontaminación de la piel del cobaya y la protección del animal con respecto al organofosfato. La esponja se comparó con el kit M291, el kit de descontaminación usado en la actualidad por el Ejército de Estados Unidos. Como se muestra en la tabla, las esponjas proporcionaron una protección de 4 a 5 veces mejor que el kit M291.

La Figura 24A muestra la protección producida con tetraglima; La Figura 24B la protección producida con HI-6, y la Figura 24C la protección producida con 2-PAM. El número en la parte superior de cada barra muestra el número de cobayas evaluados en la dosis indicada de soman (GD). Como referencia, el LD_{50} del soman en cobayas sin descontaminar se muestra con la etiqueta "GP", mientras que la protección ofrecida por el kit M219 se muestra como "M291". Otros aditivos a la esponja, tales como triacetina también produjeron alguna protección adicional en comparación con el kit M291.

\newpage

Aditivo en la esponja	LD_{50}	Relación de Protección
HI-6 (oxima, 50 mM)	79	8,0
2-PAM (oxima, 50 mM)	76	7,7
Tetraglima (30%)	88	8,9
Valores de referencia
Kit de descont. M291	17,7	1,8
Sólo soman	9,9	--

Ejemplo 11 Análisis cuantitativo y cualitativo remoto del compuesto OP

Una enzima inhibida con un OP no se invierte fácilmente y la enzima se inmoviliza, el material se puede transportar del lugar de ensayo al lugar en el que se analiza la presencia de compuestos OP dados. Adicionalmente, el material se puede dejar en un lugar para el control de compuestos OP durante un periodo de tiempo. Como la enzima inhibida con un OP no se invierte fácilmente, los compuestos y composiciones que interfieren se pueden eliminar del material en el lugar de ensayo o en otro distinto. Además, el análisis no se tiene que realizar inmediatamente o en un periodo corto después de la toma de muestras.

A. Liberación inducida con fluoruro de OP

Las altas concentraciones de F^{-} provocan la liberación del compuesto OP en forma de complejo a la ChE inmovilizada en el material. Véase la Figura 14. Como resultado de esto se obtiene un fosfofluoridato soluble, que es específico del compuesto OP presente. El fosfofluoridato se puede identificar y cuantificar por cromatografía de gas y verificarse posteriormente por una espectrometría de masas para determinar el compuesto OP original. Específicamente, un material que contiene la ChE inhibida y del cual se han retirado los compuestos que puedan interferir, se acidifica a pH 4 y se incuba con fluoruro de potasio 2 M. Después, la solución se extrae con una SepPak C_{18} (Waters Associate, Milford, Mass.). El compuesto OP se eluye e identifica por cromatografía de gas y espectrometría de masas. La mayor parte de los agentes OP de interés se pueden identificar y distinguir de pesticidas OP. En este ejemplo, las muestras no tienen que estar congeladas para que se analicen posteriormente para detectar compuestos OP ya que el material es extremadamente resistente a condiciones mecánicas extremas, condiciones químicas extremas y temperaturas extremas y cambiantes.

B. Digestión enzimática

Como procedimiento alternativo, puede usarse digestión enzimática para la identificación post-exposición de compuestos OP. Los compuestos OP se pueden liberar de las enzimas inmovilizadas en o dentro del soporte poroso y se pueden digerir con tampón Tris 1 mM, pH 19 y fosfatasa alcalina. Después, los productos de alto peso molecular se pueden concentrar y disolverse en una solución de piridina y agentes de trimetilsililación. Después, las muestras se pueden analizar por cromatografía de gas y espectrometría de masas.

Ejemplo 12 Esponja que contiene carbono activado

Se añadieron 0,5-1 gramos de carbono activado a aproximadamente 4 ml del prepolímero antes de mezclarlo con acetilcolinesterasa (5 ml de Electric eel, en solución tampón 50 mM pH 8,0 con Pluronic P-65 al 1%) para producir una esponja de carbono con acetilcolinesterasa inmovilizada. La adición de carbono no interfirió con la inmovilización de la enzima, como se muestra en la tabla. La capacidad de la esponja de carbono resultante para unirse al azul de metileno (un indicador colorimétrico del carbono activado) se ilustra en la Figura 25. Por lo tanto, la comparación de la esponja con carbono activado con la esponja que carece de carbono activado demuestra que puede unir aproximadamente dos veces más azul de metileno a concentraciones menores que las de saturación.

\newpage

Actividades de esponjas y carbono activado
Tipo de Esponja	Actividad Relativa (% de control	Actividad Relativa para
	en ausencia de carbono)	absorber azul metileno
Esponja AchE Electric eel	100%	1X
Esponja AchE Electric eel con carbono activado	108%	2X
Carbono Activado que no está en la esponja	--	13X

Ejemplo 13 Determinación cualitativa y cuantitativa in situ de compuestos OP

Se puede realizar una determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos OP in situ utilizando una diversidad de indicadores encapsulados e integrados en o dentro del soporte poroso. Los indicadores se pueden encapsular en una estructura que se rompe fácilmente con una presión leve, tal como un liposoma o un pequeño paquete aplastable. De esta forma, se puede usar el material para descontaminar o desintoxicar un área y después extraer el material para liberar el indicador del pequeño paquete aplastable o del liposoma. El cambio en el color indicará la cantidad o tipo de compuesto OP en el material descontaminado o desintoxicado.

Ejemplo 14 Múltiples usos del material de actuación diferencial

Se puede sintetizar una esponja del tamaño deseado con enzimas inmovilizadas, por ejemplo ChE, colina oxidasa y peroxidasa, con electrodos integrados. Véase la Figura 13. Los electrodos estarían inmersos en la esponja que contiene las enzimas, y reflejaría la actividad de la enzima en el área circundante. El electrodo de carbono se puede conectar a un detector electroquímico manual que funciona con baterías. Cuando se añade el sustrato, por ejemplo acetiltiocolina o acetilcolina, el electrodo generará una respuesta si la esponja no se ha agotado y puede descontaminar más compuestos OP. De esta forma, la esponja actuará como esponja de desintoxicación y como biodetector en un modo alternativo.

Adicionalmente, los electrodos de carbono se pueden insertar en distintas áreas de una espuma curada. En el caso de un ataque terrorista, y en presencia de sustrato, los electrodos de carbono podrían transmitir información sobre el compuesto OP presente en el entorno a un punto central de recogida.

Alternativamente, la espuma se podría rociar con sustrato, que puede ser colorimétrico, quimioluminiscente o fluorescente, de forma que un cambio en el color de la espuma, es decir, quimioluminiscente o fluorescente, indicaría que la espuma está activa y que no hay escape de compuesto OP o pesticida. La falta de cambio en el color indicaría circunstancias tales como indicador defectuoso, que no se administró suficiente cantidad de enzima, que la espuma no contenía suficiente compuesto OP, que se utilizó una enzima defectuosa o que la oxima se ha consumido. Por lo tanto, en el caso en el que el color está ausente, indicaría la necesidad de rociar más espuma u otra espuma distinta. Se puede usar un control positivo, es decir, un biodetector, para determinar si el indicador está defectuoso o no.

La esponja que contiene la enzima inmovilizada se podría usar para empapar el OP o pesticida e introducirse en una bolsa de plástico para completar la descontaminación de la toxina química. Después de un periodo de tiempo, el sustrato en viales o paquetes aplastables incluidos en la bolsa de plástico se podría liberar aplastando manualmente. Una fuerte aparición de color indicaría una desintoxicación eficaz. Se pueden incluir varios viales o paquetes aplastables de forma que se pudiese comprobar varias veces la finalización de la descontaminación. La suficiencia de la descontaminación se podría volver a comprobar posteriormente simplemente aplastando otro vial. Como se incluyeron originalmente varios viales en la bolsa, no es necesario volver a abrir la bolsa y por lo tanto se evita una exposición adicional al compuesto OP o insecticida. Además, si el sustrato fuese quimioluminiscente, la descontaminación se podría evaluar en la oscuridad sin una fuente de luz.

El material que contiene múltiples enzimas se puede sintetizar de una forma adecuada para permitir que fluya agua a través o alrededor de el, tal como en una columna o en una cámara para que se una a todos los OP. Una parte del material se podría retirar e introducirse con un paquete aplastable para liberar el sustrato. La aparición de color indicaría agua desintoxicada. El material se podría usar otra vez. Probablemente, no contendría oxima de reactivación ya que la oxima se lixiviaría en el agua potable.

Una vez más, la falta de cambio de color indicaría circunstancias tales como indicador defectuoso, que no se administró suficiente cantidad de enzima, que se utilizó una enzima defectuosa o que la oxima se ha consumido. Por lo tanto, la falta de cambio de color indicaría la necesidad de utilizar más espuma u otra espuma distinta. Se puede usar un control positivo, es decir, un biodetector, para determinar si el indicador está defectuoso o no. Adicionalmente, si el indicador no está defectuoso y la esponja no cambió de color, se podría reactivar con oxima para otros propósitos de desintoxicación.

Ejemplo 15 Detección a largo plazo de organofosfatos en entornos acuosos

Una ventaja significativa de las enzimas inmovilizadas es que están inmovilizadas de forma covalente permanentemente dentro de la matriz de poliuretano. Esto proporciona a los detectores las siguientes propiedades que están ausentes en el estado soluble de las enzimas o cuando las enzimas no están unidas covalentemente a papeles, tiras de papel u otras tiras indicadoras.

A. Capacidad para retener actividad después de incubación continua a 25ºC a distintos valores de pH.

La actividad de las enzimas inmovilizadas AChE y BChE después de dos meses a 25ºC en soluciones tampón a pH de 4,0 a 10,5 se muestran en la Figura 26A y 26B, respectivamente. Incluso después de más de un mes en solución sin esterilización, ambos detectores ChE retenían la mayor parte de su actividad original a pH entre 6-8, y sólo se perdió una cantidad de actividad significativa en los extremos de pH 4 y 10,5. La pérdida de actividad a pH extremo no es inesperada ya que se sabe que estas condiciones causan una desnaturalización irreversible de las enzimas solubles. Sin embargo, debe apreciarse que para periodos cortos menores de unos pocos días, permanecía el 50% o más de la actividad original, aunque la enzima soluble se hubiese desnaturalizado completamente. Estos resultados demuestras que las ChE son adecuadas para la detección a largo plazo (de unos días a muchas semanas) de compuestos OP. Por ejemplo, el detector se puede dejar en un lugar alejado y recuperarse posteriormente.

B. Capacidad para retener actividad después de incubación continua en fuentes naturales de agua a temperatura ambiente (25ºC).

En la Figura 26C (Exposición a Agua Salobre, obtenida de Chesapeake Bay, Aberdeen, MD) se observan pruebas adicionales de que el detector AChE retiene actividad durante periodos de tiempo prolongados en el entorno y en la Figura 26D (Exposición a Agua Fresca, obtenida de Allegheny River, PA). La mayor parte de la actividad original del detector permanece incluso cuando se expone a agua durante más de un mes. La enzima inmovilizada también era resistente a flora y fauna natural microbiológica que podría degradar la enzima ya que el agua sometida a autoclave no era más estable que el agua no tratada. En conjunto, estos resultados demuestran el potencial de detección a largo plazo de estas enzimas inmovilizadas.

C. Comparación de la tira de papel M272 con los ejemplos A y B anteriores.

La tira de papel M272 (Disponible en Truetech, Inc.) es la tira de papel usada actualmente para detectar organofosfatos en soluciones acuosas. La tira de papel contiene Eel colinesterasa unida no covalentemente. En contraste con los 1-2 meses que los detectores de AChE y BChE inmovilizada pueden retener actividad incluso después de una exposición continua a fuentes naturales de agua, distintos valores de pH, temperatura (hasta años), etc, la tira de papel M272 pierde más del 80% de su actividad después de la exposición a agua de Chesapeake Bay (Figura 26E) o a un tampón (tampón fosfato 50 mM, pH 8,0) (Figura 26F) después de sólo 5 minutos de exposición. Por lo tanto, mientras que las enzimas inmovilizadas son adecuadas para la detección a largo plazo en el entorno, incluyendo entorno acuoso, por el contrario, la tira de papel M272 no es adecuada ni siquiera para la detección a corto plazo de compuestos de organofósforo en fuentes acuosas.

Ejemplo 16 Acoplamiento de enzima antes de la formación del material

Las enzimas se pueden acoplar antes de la formación del material por métodos conocidos en la técnica para formar un complejo de enzimas reticuladas. Véase, por ejemplo, Hashida, S., Imagawa, M., Inoue, S., Ruan, J.-h, e Ishikawa, E. (1984) J. Applied Biochem. 6, 56-63 y Samaoszuk, M.K., Petersen, A., Lo-Hsueh, M., y Rietveld, C. (1989). (A peroxide-generating immuinoconjugate directed to eosinophil peroxidase is cytotoxic to Hodgkin's disease cells in vitro.), Antibody Immunocon. Radiopharm. 2(1), 37-46.

Por ejemplo, la AChE puede conjugarse con colina oxidasa con uno de los diversos agentes de reticulación y métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, la AchE y la colina oxidasa estarían próximas, de forma que el producto de la hidrólisis de AChE, colina, caería cerca de la colina oxidasa para producir H_{2}O_{2}. Este tipo de cascada enzimática proporcionaría un acoplamiento más eficaz y una respuesta más rápida y más sensible. Además, debido a la proximidad de la colina oxidasa, es decir, de la colina oxidasa a AChe, la relación de colina oxidasa con AChE se puede reducir. Se pueden utilizar más de dos enzimas diferentes.

El agente de reticulación utilizado puede ser una agente de reticulación multifuncional. Existe una amplia diversidad de agentes de reticulación disponibles de distribuidores comerciales, por ejemplo, Pierce (Rockford, IL). Estos agentes de reticulación multifuncionales pueden comprender distintas longitudes de ramas espaciadoras para asegurar que la unión entre las enzimas unidas tiene una longitud apropiada para mantener una estructura, función y actividad enzimática independiente. Normalmente, esta sería una longitud de aproximadamente 4-8 ángstrom. Sin embargo, la longitud puede ser de hasta 16 ángstrom. Algunas posiciones de reticulación deben estar disponibles para el acoplamiento de enzimas conjugadas al prepolímero. La reticulación se puede realizar en el mismo tampón usado para la reacción del prepolímero, como se ha explicado en el Ejemplo 2. Después, el conjugado de enzimas se mezcla con un prepolímero, como en el Ejemplo 2, para formar un material polimérico.

Ejemplo 17 Sensibilidad de ache de mamífero soluble e inmovilizada al pesticida (diclorofos) y organofosfato (soman, GD)

Se expusieron el detector AChE y AChE soluble a diluciones de diclorofos en 2,5 ml de tampón fosfato 50 mM durante 5 minutos, y después se determinó la actividad de las enzimas en forma soluble y del detector inmovilizado. Como se muestra en la Figura 27A, la sensibilidad del detector inmovilizado y de la enzima soluble mostraron valores EC_{50} muy similares, sin embargo la pendiente de la esponja fue aproximadamente un 20% menor que la de la enzima soluble. Estos resultados indican que la esponja AChE fue ligeramente menos sensible a la inhibición con el pesticida que la enzima soluble de mamífero.

Se observaron resultados similares para la inhibición del detector AChE (enzima inmovilizada) y la acetilcolinesterasa soluble. La Figura 27B demuestra que cuando las enzimas se exponen a soman durante 5 minutos y después se determina la inhibición de la enzima, las curvas que indican pérdida de actividad enzimática no son significativamente diferentes. De esta forma, en ausencia de soman, se produce un cambio de color y actividad enzimática (a un nivel del 100%) mientras que con 30 pg de soman, se produce poco cambio de color y la actividad es menor del 20% del nivel de control.

Referencias citadas en la tabla 5

(17) DeFrank, J.J, Beaudry, W.T., Chen, T-C., Harvey, S.P., Stroup, A.N., y Szafraniec, L.L. Screening of halophilic bacteria and Alteromonas species for organophosphorus hydrolizing enzyme activity. Chem. Biol. Interactions 87:141-148 (1993).

(33) Donarski W.J., Dumas D.P., Heitmeyer D.P., Lewis V.E., Raushel, F.M., Structure-activity relationships in the hydrolisis of substrates by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Biochemistry 28:4650-5 (1989).

(32) Furlong, C.E., RIchter, R.J., Chapline, C. and Crabb, J.W. Purification of rabbit and human serum paraoxonase. Biochemistry, 30:19133-10140 (1991).

(13) Gan, K.N., Smolen, A., Eckerson, H.W., La Du, B.N., Purification of human serum paraoxonase/arylesterase. Evidence for one esterase catalyzing both activities. Drug. Metab. Disp. 19:100-106 (1991).

(34) Hoskin, F.C, Roush, A.H. Hydrolysis of nerve gas by squid-type diisopropyl phosphpfluoridate hydrolizing enzyme on agarose resin. Science 215:1255-7 (1982).

(2) Maxwell, D.M., C.A. Castro, D.M. De la Hoz, M.K. Gentry, M.B. Gold, R.P. Solana, A.D. Wolfe, B.P. Doctor. Protection of rhesus monkeys against soman and prevention of performance decrement by treatment with acetylcolinesterase, Toxicol. Appl. Pharmacol. 115 44-49 (1992).

(21) Personal Communication, Dr. Gabriel Amitai, Israel Institute for Biological Research, Ness Ziona, Israel.

(1) Taylor, P., Anticholinesterase agents, in: A.G. Gilman, T.W. Rall, A.S. Nies, P. Taylor (Eds.), The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon, New York, pág. 131-149 (1990).

Claims (20)

1. Una esponja o espuma polimérica para la eliminación, descontaminación, desintoxicación y/o neutralización de una serie de compuestos de organofósforo y/o organoazufre que comprende una pluralidad de enzimas o un complejo de enzimas reticuladas inmovilizado en un soporte polimérico poroso, comprendiendo dicha pluralidad de enzimas o dicho complejo de enzimas reticuladas múltiples enzimas seleccionadas entre acetilcolinesterasa (AChE), butirilcolinesterasa (BchE), triesterasa, pseudocolinesterasa, colina oxidasa, peroxidasa, organofosfato hidrolasa (OPH), fosfotriesterasa, paraoxonasa y enzimas de hidrolización de OP y un indicador para medir la capacidad de la esponja para un uso posterior.

2. Una esponja o espuma de acuerdo con la reivindicación 1, donde el soporte poroso comprende poliuretano.

3. Una esponja o espuma de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 que comprende adicionalmente carbono incorporado o integrado en el soporte poroso.

4. Una esponja o espuma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el indicador es fluorescente, quimioluminiscente, un cromógeno visible o un electrodo.

5. Una esponja o espuma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende un compuesto, material o dispositivo de reactivación incorporado o integrado en o unido al soporte poroso.

6. Una esponja o espuma de acuerdo con la reivindicación 5, donde el compuesto, material o dispositivo de reactivación comprende HI-6 (clorhidrato de 1(2-hidroxiiminometil-1-piridinio)-1-(4-carboxiaminopiridinio)-dimetiléter), TMB4 (dibromuro de N,N'-trimetileno bis(piridinio-4-aldoxima)) u oximas mono-biscuaternarias.

7. Una esponja o espuma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la esponja o espuma polimérica está codificada por colores.

8. Un método para fabricar una esponja o espuma polimérica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende inmovilizar una pluralidad de enzimas o un complejo de enzimas reticuladas en un soporte polimérico, comprendiendo dicha pluralidad de enzimas o dicho complejo de enzimas reticuladas múltiples enzimas seleccionadas entre acetilcolinesterasa (AChE), butirilcolinesterasa (BchE), triesterasa, pseudocolinesterasa, colina oxidasa, peroxidasa, organofosfato hidrolasa (OPH), fosfotriesterasa, paraoxonasa y enzimas de hidrolización de OP.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, donde la etapa de inmovilización comprende mezclar la pluralidad de enzimas o el complejo de enzimas reticuladas con un prepolímero de poliuretano.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, donde el prepolímero de poliuretano comprende un diisocianato.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, donde el diisocianato es diisocianato de tolilo.

12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde se mezclan simultáneamente partes iguales de la pluralidad de enzimas o del complejo de enzimas reticuladas y del prepolímero de poliuretano.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, donde la etapa de mezclado se realiza con un aparato que tiene una primera cámara y una segunda cámara.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde la primera cámara contiene la pluralidad de enzimas o el complejo de enzimas reticuladas y la segunda cámara contiene un prepolímero de poliuretano.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, donde la mezcla comprende extruir partes iguales de la pluralidad de enzimas o del complejo de enzimas reticuladas y del prepolímero de poliuretano rápida y uniformemente mediante un estator de mezcla estático.

16. Un método para reactivar una esponja o espuma polimérica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende poner en contacto la esponja o espuma polimérica con al menos un compuesto seleccionado entre HI-6, TMB4 y oximas mono-biscuaternarias.

17. Un kit para la eliminación, descontaminación, desintoxicación y/o neutralización de una seria de productos químicos peligrosos, que comprende una esponja o espuma polimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

18. Un kit de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende adicionalmente un compuesto o compuestos para la reactivación de enzimas en una cantidad suficiente para desplazar compuestos de organofósforo unidos covalentemente de la posición activa de la enzima por ataque nucleófilo.

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19. Un método para descontaminar una superficie en la que pueden estar presentes uno o más productos químicos peligrosos, que comprende poner en contacto la superficie con una esponja o espuma polimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19 que comprende adicionalmente medir la capacidad de la esponja para un uso posterior.