ES2208121A1 - Antibodies and antigens immobilised on magnetic silica particles used as biosensors - Google Patents
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Abstract
Description
Anticuerpos y antígenos inmovilizados sobre partículas magnéticas de sílice como biosensores.Antibodies and antigens immobilized on magnetic particles of silica as biosensors.
La presente invención se refiere al campo de los biosensores, concretamente a anticuerpos adecuadamente orientados y antígenos inmovilizados sobre partículas magnéticas. En particular, la invención se refiere a la preparación de dichas partículas magnéticas y de dichos biosensores, así como al uso de dichos biosensores para la identificación y cuantificación de analitos.The present invention relates to the field of biosensors, specifically to properly oriented antibodies and antigens immobilized on magnetic particles. In particular, the invention relates to the preparation of said particles magnetic and of said biosensors, as well as the use of said biosensors for the identification and quantification of analytes
El uso de anticuerpos y antígenos inmovilizados tiene un gran interés en el campo de la clínica y la química analítica. La gran especificidad de los anticuerpos les permite distinguir entre dos moléculas muy similares dentro de mezclas muy complejas, mientras que la inmovilización de antígenos tendrá un gran interés en clínica, por ejemplo para detectar trazas de anticuerpos frente a un antígeno dado.The use of immobilized antibodies and antigens He has a great interest in the field of clinic and chemistry analytics. The high specificity of the antibodies allows them distinguish between two very similar molecules within mixtures very complex, while antigen immobilization will have a great interest in clinic, for example to detect traces of antibodies against a given antigen.
La técnica más habitual de utilización de anticuerpos y antígenos como biosensores supone su previa inmovilización, por ejemplo en placas multipocillo. Tras añadir a estas placas la muestra, y lavar, se usa un segundo anticuerpo específico para otra zona del antígeno. Este segundo anticuerpo (o de lectura) suele estar marcado con una enzima u otro tipo de señal que permite cuantificar la cantidad de antígeno presente en la muestra. El ejemplo más representativo de este tipo de ensayos son los famosos inmunoensayos enzimáticos ELISA. En estos ensayos, hay varios factores que determinan la señal conseguida como son la cantidad de anticuerpo y antígeno inmovilizada, la cantidad de anticuerpo correctamente orientado, la posibilidad de tener una "colección" de antígenos con diferentes orientaciones sobre el soporte, o el grado de distorsión de la molécula de antígeno o anticuerpo (figura 1).The most common technique of using antibodies and antigens as biosensors supposes its prior immobilization, for example in multiwell plates. After adding to these plates the sample, and wash, a second antibody is used specific for another zone of the antigen. This second antibody (or reading) is usually marked with an enzyme or other type of signal which allows quantifying the amount of antigen present in the sample. The most representative example of this type of essays are the famous ELISA enzyme immunoassays. In these trials, there are several factors that determine the signal achieved as are the amount of antibody and immobilized antigen, the amount of Correctly oriented antibody, the possibility of having a "collection" of antigens with different orientations on the support, or the degree of distortion of the antigen molecule or antibody (figure 1).
El principal problema de la metodología ELISA es el límite de volumen a utilizar, del orden de unos pocos microlitros-mililitros de muestra: si se pretenden detectar trazas muy minoritarias de antígeno (p.e., partes por billón), este tipo de ensayos podría no dar la sensibilidad adecuada.The main problem of the ELISA methodology is the volume limit to be used, of the order of a few microliters-milliliters of sample: if they are intended detect very minor traces of antigen (e.g., parts by billion), such tests may not give sensitivity adequate.
En este contexto, el uso de partículas magnéticas supone un avance significativo (Giaver, US 4,018,886). Unos pocos miligramos de estas partículas magnéticas pueden suspenderse en grandes volúmenes de muestra, y ser recuperadas posteriormente mediante el empleo de un imán, determinándose posteriormente la cantidad de antígeno. Su empleo permite purificar o concentrar trazas muy minoritarias de antígeno contenidas en grandes volúmenes de líquido (litros o incluso metros cúbicos) o mezclas líquido-sólido, de forma que se puede reducir en gran medida el límite de detección. Este tipo de sistemas permite determinar la presencia de antígenos de interés en situaciones donde una detección precoz del antígeno puede ser crítica para evitar efectos muy negativos del mismo: en biomedicina (presencia de trazas muy minoritarias de proteínas relacionadas con procesos tumorales, infecciones, deficiencias genéticas,...), medioambiente (determinación de la presencia de contaminantes, toxinas de origen biológico en aguas de río o marinas,...), alimentación (determinación de la presencia de toxinas o productos peligrosos,...), etc. En todos estos casos, se puede conseguir analizar un volumen de muestra del orden de mililitros o de litros usando apenas unos microgramos de partículas magnéticas, concentrando y purificando de esta forma el antígeno en cuestión entre miles y millones de veces, lo que se podría traducir en un aumento de la sensibilidad de los mismos ordenes de magnitud (figuras 2-4).In this context, the use of magnetic particles It represents a significant advance (Giaver, US 4,018,886). A few milligrams of these magnetic particles can be suspended in large sample volumes, and be retrieved later by using a magnet, subsequently determining the Amount of antigen Its use allows to purify or concentrate very minor traces of antigen contained in large volumes of liquid (liters or even cubic meters) or mixtures liquid-solid, so that it can be reduced by greatly limit the detection limit. This type of systems allows determine the presence of antigens of interest in situations where early detection of the antigen can be critical to avoid very negative effects of it: in biomedicine (presence of very minor traces of process-related proteins tumor, infections, genetic deficiencies, ...), environment (determination of the presence of contaminants, toxins of origin biological in river or marine waters, ...), food (determination of the presence of toxins or products dangerous, ...), etc. In all these cases, you can get analyze a sample volume of the order of milliliters or liters using just a few micrograms of magnetic particles, thus concentrating and purifying the antigen in question between thousands and millions of times, which could translate into a increased sensitivity of the same orders of magnitude (Figures 2-4).
Pero en todos los casos, la orientación del anticuerpo será clave as la hora de conseguir buenas señales.But in all cases, the orientation of the Antibody will be key when it comes to getting good signals.
Los ferrofluidos descubiertos por Elmore hace 50 años (Elmore, W.C. Physical Review, 54, 1092, 1938), son suspensiones estables de partículas ferro o ferrimagnéticas con una estrecha distribución de tamaños de partícula. A principios de la década de los 80 se utilizaban materiales de tipo ferrofluído, que empleaban soluciones acuosas de polímeros o proteínas como surfactantes (Molday R.S, MacKenzie, J.Immunol. Meth. 52, 353, 1982). Estos materiales fueron sintetizados basándose en la adsorción de Fe^{3+} o Fe^{2+} en presencia de un polímero o una proteína, para formar magnetita u otro óxido de hierro menos magnético. Uno de los primeros métodos usados para la preparación de ferrofluídos implicaba la utilización de molinos de bolas, pero requerían tiempos de preparación grandes y la distribución de tamaños de partícula obtenida era amplia.Ferrofluids discovered by Elmore 50 years ago years (Elmore, W.C. Physical Review, 54, 1092, 1938), are stable suspensions of ferro or ferrimagnetic particles with a Narrow distribution of particle sizes. At the beginning of the 80s were used ferrofluid type materials, which they used aqueous solutions of polymers or proteins such as surfactants (Molday R.S., MacKenzie, J. Immunol. Meth. 52, 353, 1982). These materials were synthesized based on the adsorption of Fe 3+ or Fe 2+ in the presence of a polymer or a protein, to form magnetite or another iron oxide less magnetic. One of the first methods used for preparation of ferrofluids involved the use of ball mills, but they required large preparation times and the distribution of particle sizes obtained was wide.
Las partículas que constituyen los ferrofluídos son generalmente "superparamagnéticas", ya que tienen un momento magnético permanente mucho mayor que las paramagnéticas: en ausencia de un campo magnético externo los momentos magnéticos individuales están orientados al azar, mientras que en presencia de un campo magnético, los momentos individuales se orientan paralelos, dando lugar a una fuerte atracción partícula-partícula transmitida a todo el fluido. Si bien es interesante la posibilidad de que las partículas sean concentradas mediante la aplicación de un campo magnético, no es deseable que las interacciones magnéticas entre partículas sean tan fuertes como para promover una orientación colectiva y una posible agregación/coagulación.The particles that constitute ferrofluids they are generally "superparamagnetic", since they have a permanent magnetic moment much greater than paramagnetic: in absence of an external magnetic field the magnetic moments individual are randomly oriented while in the presence of a magnetic field, the individual moments are oriented parallels, leading to a strong attraction particle-particle transmitted to all the fluid. While it is interesting the possibility that the particles are concentrated by applying a magnetic field, it is not desirable that the magnetic interactions between particles be so strong enough to promote a collective orientation and a possible aggregation / coagulation.
Para obtener un ferrofluído estable bajo un campo magnético moderadamente fuerte, es decir, que la fuerza de atracción entre partículas sea menor que la energía térmica asociada a las partículas, estas deben ser muy pequeñas. El limite superior del tamaño de partícula admitido a temperatura ambiente es de \sim3 nm para hierro y \sim10 nm para Fe_{3}O_{4} (magnetita) y su forma oxidada \gamma-Fe_{2}O_{3} (maghemita). Como se ha comentado, si las partículas son demasiado grandes podrían actuar como núcleos de agregación y crecer desestabilizando la suspensión, por lo que es necesario un tamaño pequeño y una distribución estrecha de tamaños de partícula.To obtain a stable ferrofluid under a field moderately strong magnetic, that is, the force of attraction between particles is less than thermal energy associated with the particles, these must be very small. The limit greater than the particle size admitted at room temperature is \3 nm for iron and sim10 nm for Fe3O4 (magnetite) and its oxidized form γ-Fe 2 O 3 (maghemite). How has it commented, if the particles are too big they could act as aggregation nuclei and grow destabilizing the suspension, so a small size and distribution is necessary narrow particle sizes.
Así pues, los ferrofluídos están constituidos por fases estables de materiales que pueden ser desplazados o controlados por gradientes magnéticos. La magnetita de un tamaño adecuado y monodispersa tiene gran aplicabilidad en este campo.Thus, ferrofluids are constituted by stable phases of materials that can be displaced or controlled by magnetic gradients. The magnetite of one size Adequate and monodispersed has great applicability in this field.
El principal método directo de obtención de nanopartículas magnéticas de magnetita con estrecha distribución de tamaños es en disolución a partir de sales de hierro (Massart R.C.R. Acad. Sci. Paris. Ser. C, 291,1,1980). También se pueden sintetizar nanopartículas magnéticas mediante métodos de vapor como el láser pirólisis (Veintemillas S., Morales M.P., Serna C.J., Materials Letters, 35,151,1998), si bien da lugar a partículas muy dispersas y de muy pequeña saturación, o el método de la llama (Urakavwa T., Nakzawa T., Inoue H., Shirat T., Fluk E.J. Mater. Sci. Letters 15,1237,1996) que origina partículas polidispersas. Recientemente, se ha utilizado una red de sílice para obtener nanopartículas magnéticas pero con una distribución de tamaño demasiado amplia (Del Monte F., Morales M. P, Levy. D, Fernández A, Ocaña M, O'Grady K, Sema C.J. Langmuir 13,3627, 1997).The main direct method of obtaining magnetic magnetite nanoparticles with narrow distribution of sizes is in solution from iron salts (Massart R.C.R. Acad. Sci. Paris. Ser. C, 291,1,1980). Can also be synthesize magnetic nanoparticles using steam methods such as the pyrolysis laser (Veintemillas S., Morales M.P., Serna C.J., Materials Letters, 35,151,1998), although it gives rise to very particles scattered and of very small saturation, or the flame method (Urakavwa T., Nakzawa T., Inoue H., Shirat T., Fluk E.J. Mater. Sci. Letters 15,1237,1996) that originates polydisperse particles. Recently, a silica net has been used to obtain magnetic nanoparticles but with a size distribution too wide (Del Monte F., Morales M. P, Levy. D, Fernández A, Ocaña M, O'Grady K, Sema C.J. Langmuir 13,3627, 1997).
En el estado de la técnica se conocen varios métodos de síntesis para obtener nanopartículas esféricas de magnetita en disolución. Según uno de dichos métodos, una suspensión de hidróxido férrico es parcialmente oxidada con diferentes agentes oxidantes. Se han obtenido partículas esféricas de magnetita de una estrecha distribución de tamaños entre 30 y 1100 nm mezclando FeSO_{4} con KOH en presencia de ion nitrato y llevando el gel resultante a 90°C por varias horas (Sugimoto. T, Matijevic E.J. Colloid Interface Sci. 74,227, 1980).In the state of the art several are known synthesis methods to obtain spherical nanoparticles of magnetite in solution. According to one of said methods, a ferric hydroxide suspension is partially oxidized with Different oxidizing agents Spherical particles have been obtained of magnetite of a narrow distribution of sizes between 30 and 1100 nm by mixing FeSO 4 with KOH in the presence of nitrate ion and bringing the resulting gel at 90 ° C for several hours (Sugimoto. T, Matijevic E.J. Colloid Interface Sci. 74,227, 1980).
Otro método es el método de Massart, que consiste en el envejecimiento de una mezcla de disoluciones de hidróxido ferroso y férrico en medio acuoso (Massart R., Cabuil. V.J. Chem Phys, 84, 967,1987). Con una estequiometría de Fe(II)/Fe(III)=0,5 se forman partículas muy homogéneas en tamaño y composición química. Además se ha observado que ajustando el pH y la fuerza iónica del medio de precipitación, es posible controlar el tamaño medio de las partículas, en un orden de magnitud en el rango de nanómetros (desde 12,5 a 1,6 nm) (Jolivet J.P., Massart R., Fruchard J.M., Nouv. J. Chim. 7,325,1983). Por lo tanto, el tamaño de partículas decrece conforme aumenta el pH y la fuerza iónica. Ambos factores determinan el cambio isostático de la superficie de las partículas y en consecuencia la composición química de la superficie. Por ejemplo, las partículas esféricas de magnetita de 14 a 8 nm pueden ser obtenidas variando la naturaleza de la base usada en la precipitación: NH_{4}(OH), Na(OH) o K(OH) (Jolivet J.P., Massart R., Fruchard J.M., Nouv. J. Chim. 7,325,1983), y la temperatura. Para la precipitación de estas partículas, se añadieron 50 ml de una solución acuosa 0,33 M in FeCl_{2} y 0,66 M en FeCl_{3} a 450 ml de solución básica (1M) bajo fuerte agitación. Un flujo de N_{2} gas se pasa previamente a través de la solución básica para asegurar que el precipitado final esta constituido solamente por magnetita. Las partículas más pequeñas se obtienen si añadimos a la mezcla de sales de hierro una disolución de K(OH) 1M con un 1% (p/p) de poli(alcohol vinílico) (PVA) a temperatura ambiente según el proceso descrito por Lee et al (Lee J, Isobe T, Senna M.J., Colloid Interface Sci. 177,490, 1996).Another method is the Massart method, which consists of aging a mixture of ferrous and ferric hydroxide solutions in aqueous medium (Massart R., Cabuil. VJ Chem Phys, 84, 967,1987). With a stoichiometry of Fe (II) / Fe (III) = 0.5, very homogeneous particles are formed in size and chemical composition. It has also been observed that by adjusting the pH and ionic strength of the precipitation medium, it is possible to control the average particle size, in an order of magnitude in the nanometer range (from 12.5 to 1.6 nm) (Jolivet JP, Massart R., Fruchard JM, Nouv. J. Chim. 7,325,1983). Therefore, the particle size decreases as the pH and ionic strength increases. Both factors determine the isostatic change of the surface of the particles and consequently the chemical composition of the surface. For example, spherical particles of magnetite from 14 to 8 nm can be obtained by varying the nature of the base used in the precipitation: NH4 (OH), Na (OH) or K (OH) (Jolivet JP, Massart R ., Fruchard JM, Nouv. J. Chim. 7,325,1983), and temperature. For precipitation of these particles, 50 ml of a 0.33 M aqueous solution in FeCl 2 and 0.66 M in FeCl 3 were added to 450 ml of basic solution (1M) under strong stirring. A flow of N2 gas is previously passed through the basic solution to ensure that the final precipitate is constituted only by magnetite. Smaller particles are obtained if we add to the mixture of iron salts a solution of 1M K (OH) with 1% (w / w) of polyvinyl alcohol (PVA) at room temperature according to the process described by Lee et al (Lee J, Isobe T, Senna MJ, Colloid Interface Sci. 177,490, 1996).
Las partículas magnéticas de tamaño adecuado, sintetizadas por el método anterior tienen un punto isoeléctrico cercano a 7, lo que las hace muy inestables en solución acuosa. Por lo tanto, es necesario recubrirlas de un compuesto que estabilice la suspensión en agua. El recubrimiento puede estar constituido por sustancias orgánicas, como polímeros y dextrano (Hasegawa, U.S. Pat n° 4,101,435) o inorgánicas, principalmente sílice (Ohmori M., Matijevic E.J., Colloid Interface Science. 150, 594, 1992; y Corradi A.R., Ceresa E.M. IEEE Trans Magn. 15,1068, 1979). El recubrimiento con sílice proporciona una gran estabilidad frente a la agregación, reduce considerablemente las interacciones magnéticas (Qingxia L., Zhenghe X., Frinch J.A., Egerton R., Chem Mater. 10, 3936,1998) y, confiere gran resistencia frente a los tratamientos térmicos (Tartaj P., González-Carreño T., Serna C.J. Adv. Mater. 13, 1620, 2001).Magnetic particles of adequate size, synthesized by the previous method have an isoelectric point close to 7, which makes them very unstable in aqueous solution. By therefore, it is necessary to coat them with a stabilizing compound The suspension in water. The coating may consist of organic substances, such as polymers and dextran (Hasegawa, U.S. Pat No. 4,101,435) or inorganic, mainly silica (Ohmori M., Matijevic E.J., Colloid Interface Science. 150, 594, 1992; and Corradi A.R., Ceresa E.M. IEEE Trans Magn. 15,1068, 1979). Coating with silica provides great stability against aggregation, considerably reduces magnetic interactions (Qingxia L., Zhenghe X., Frinch J.A., Egerton R., Chem Mater. 10, 3936,1998) and, confers great resistance against heat treatments (Tartaj P., González-Carreño T., Serna C.J. Adv. Mater. 13, 1620, 2001).
Sin embargo, el recubrimiento con sílice tiene como gran inconveniente la baja resistencia mecánica de la capa de sílice en tanques agitados. Por otro lado, este recubrimiento de sílice podría tener lugar sólo sobre unas pocas partículas magnéticas (agregados de unas 5 partículas) (Philipse A.P., van Bruggen M.P.B, Pathmamanoharan C. Langmuir 10, 92, 1994).However, silica coating has as a major drawback the low mechanical resistance of the layer of silica in agitated tanks. On the other hand, this coating of silica could take place only on a few particles magnetic (aggregates of about 5 particles) (Philipse A.P., van Bruggen M.P.B, Pathmamanoharan C. Langmuir 10, 92, 1994).
Sorprendentemente, los presentes autores han descubierto que al tratar térmicamente nanopartículas de magnetita obtenidas por el método de Massart recubiertas por una capa de sílice, se consigue aumentar la resistencia mecánica de dicha capa de sílice, obteniéndose así suspensiones de nanopartículas magnéticas mejoradas útiles como soporte para biosensores alternativos.Surprisingly, the present authors have discovered that by thermally treating magnetite nanoparticles obtained by the method of Massart coated by a layer of silica, it is possible to increase the mechanical resistance of said layer of silica, thus obtaining nanoparticle suspensions enhanced magnetic useful as a support for biosensors Alternative
El objeto de la presente invención, por tanto, es proporcionar partículas magnéticas mejoradas adecuadas para la preparación de biosensores consistentes en anticuerpos y antígenos inmovilizados sobre dichas partículas magnéticas.The object of the present invention, therefore, is provide enhanced magnetic particles suitable for the preparation of biosensors consisting of antibodies and antigens immobilized on said magnetic particles.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para la preparación de dichas partículas magnéticas mejoradas que supere los inconvenientes del estado de la técnica mencionados.Another object of the present invention is provide a method for the preparation of said particles Improved magnetic that overcomes the inconvenience of the state of the mentioned technique.
Por otro lado, otro objeto de la invención es proporcionar dichos biosensores, así como un método de preparación de los mismos, solucionando fundamentalmente los problemas de orientación de los anticuerpos.On the other hand, another object of the invention is provide said biosensors, as well as a method of preparation of them, fundamentally solving the problems of antibody orientation.
Por último, otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de uso de dichos biosensores para la identificación y cuantificación de analitos.Finally, another object of the present invention is to provide a method of using said biosensors for the Identification and quantification of analytes.
En un aspecto de la invención, se proporcionan partículas magnéticas de óxido de hierro con un tamaño de 5 - 30 nm, cargadas en medio básico, que presentan un recubrimiento de sílice de 30 - 100 nm de espesor, caracterizadas porque dichas partículas han sido sometidas a un tratamiento térmico de 300 a 800°C durante 1 a 24 horas.In one aspect of the invention, they are provided magnetic particles of iron oxide with a size of 5 - 30 nm, loaded in basic medium, which have a coating of 30 - 100 nm thick silica, characterized in that said particles have undergone a heat treatment of 300 to 800 ° C for 1 to 24 hours.
En una realización particular, el óxido de hierro empleado presenta una estructura de espinela (magnetita/maghemita), ya que la magnetita es fácil de sintetizar en tamaños de 5 - 30 nm y tiene propiedades magnéticas apropiadas (Ms = 70 emu/g). Estas partículas se sintetizan por co-precipitación de Fe^{3+} y Fe^{2+} en solución alcalina. Las partículas magnéticas así obtenidas tienen un punto isoeléctrico (i.p.e.) cercano a 7, lo que las hace muy inestables en solución acuosa, además la superficie de las partículas no es fácil de funcionalizar (requisito necesario para que sirvan de soporte en biosensores) y podría ser demasiado reactiva para algunas aplicaciones. Por todo lo anterior es necesario recubrir las partículas con sílice. Dicho recubrimiento da lugar a suspensiones estables en agua (i.e.p \sim3), es resistente químicamente, fácil de funcionalizar y permite recubrir agregados constituidos por 20-50 partículas magnéticas. La gran ventaja de tener recubrimientos de sílice constituidos por 20-50 partículas de magnetita es que son fácilmente atraídos en presencia de un campo magnético. Las partículas así obtenidas se someten a tratamiento térmico entre 300-800°C durante 3 horas con el objeto de "anclar" la capa de sílice sobre las partículas magnéticas, aumentando su dureza y resistencia en sistemas agitados.In a particular embodiment, iron oxide employee presents a spinel structure (magnetite / maghemite), since magnetite is easy to synthesize in sizes of 5 - 30 nm and has appropriate magnetic properties (Ms = 70 emu / g). These particles are synthesized by co-precipitation of Fe 3+ and Fe 2+ in alkaline solution. The particles magnetic so obtained have an isoelectric point (i.p.e.) close to 7, which makes them very unstable in aqueous solution, in addition the surface of the particles is not easy to functionalize (required to serve as support in biosensors) and It could be too reactive for some applications. For all The above is necessary to coat the particles with silica. Saying coating results in water-stable suspensions (i.e.p sim3), it is chemically resistant, easy to functionalize and allows coating aggregates consisting of 20-50 Magnetic particles. The great advantage of having coatings of silica consisting of 20-50 particles of magnetite is that they are easily attracted in the presence of a field magnetic. The particles thus obtained are subjected to treatment. thermal between 300-800 ° C for 3 hours with the object of "anchoring" the silica layer on the particles magnetic, increasing its hardness and resistance in systems agitated
Así, en otro aspecto de la invención, se proporciona un método para la preparación de las partículas magnéticas de la invención que comprende las etapas de:Thus, in another aspect of the invention, provides a method for preparing the particles of the invention comprising the steps of:
- a)to)
- preparación de un polvo de partículas magnéticas de óxido de hierro de 5-30 nm de tamaño,preparation of a iron oxide magnetic particle powder 5-30 nm in size,
- b)b)
- tratamiento del polvo de partículas de tal forma que las partículas queden cargadas en medio básico,treatment of particle dust so that the particles are charged in basic environment,
- c)c)
- recubrimiento de las partículas cargadas en medio básico con sílice con un espesor de 30 - 100 nm, yoverlay particles loaded in basic medium with silica with a thickness from 30-100 nm, and
- d)d)
- tratamiento térmico del producto obtenido en la etapa c) a una temperatura de 300 a 800 °C durante 1 a 24 horas.heat treatment of the product obtained in step c) at a temperature of 300 to 800 ° C for 1 to 24 hours.
En una realización de dicho método, el tratamiento de la etapa b) de se lleva a cabo con hidróxido de tetrametil amonio.In an embodiment of said method, the Treatment of step b) of is carried out with hydroxide of tetramethyl ammonium
En otra realización particular de dicho método, el recubrimiento de las partículas con sílice de la etapa c) se lleva a cabo con ortosilicato de tetraetilo.In another particular embodiment of said method, the coating of the particles with silica from step c) is carried out with tetraethyl orthosilicate.
En otra realización particular, el método para la preparación de las partículas magnéticas de la invención previamente descrito comprende adicionalmente las siguientes etapas:In another particular embodiment, the method for preparation of the magnetic particles of the invention previously described further comprises the following stages:
- a)to)
- tratamiento de las partículas magnéticas de la invención obtenidas mediante el método previamente descrito con un derivado de trietoxisilano, en particular con glicidoxipropil trietoxisilano;treatment of magnetic particles of the invention obtained by the method previously described with a triethoxysilane derivative, in particularly with glycidoxypropyl triethoxysilane;
- b)b)
- tratamiento del producto obtenido en la etapa a) con etilendiamina; o bien, transformación de los grupos epóxido del producto obtenido en la etapa a) en grupos aldehído, seguida de un tratamiento con etilendiamina (para inmovilizar los anticuerpos via la cadena de azucares oxidada) (figura 5);treatment of product obtained in step a) with ethylenediamine; O well, transformation of the epoxide groups of the product obtained in the stage a) in aldehyde groups, followed by treatment with ethylenediamine (to immobilize antibodies via the chain of oxidized sugars) (figure 5);
- c)c)
- tratamiento del producto obtenido en la etapa a) con iminodiacetico y posterior adicción de metales, para inmovilizar los anticuerpos en soportes mixtos epoxido-metalicos por la zona mas rica en His (figura 6).treatment of product obtained in stage a) with iminodiacetic and subsequent metal addiction, to immobilize antibodies on supports mixed epoxide-metallic by the richest area in His (figure 6).
Tratando las partículas magnéticas de la invención con un trietoxisilano se obtienen silanoles de la sílice cuyos enlaces silano permiten la activación de la superficie de dichas partículas para la inmovilización de proteínas. En concreto, el tratamiento de dichos silanoles de la sílice con dietilamina tiene como objetivo introducir grupos aminados, modificación cuya principal ventaja es que produce unos grupos amino primario de pK muy bajo (del orden de 7), lo que les convierte en grupos químicamente muy reactivos en condiciones de reacción suave, y unos grupos amino secundario de pK relativamente elevado (en torno a 10), que les convierte en buenos intercambiadores aniónicos.Treating the magnetic particles of the invention with a triethoxysilane silica silanoles are obtained whose silane bonds allow the activation of the surface of said particles for protein immobilization. Specific, the treatment of said silica silanoles with diethylamine It aims to introduce amino groups, modification whose main advantage is that it produces primary amino groups of pK very low (of the order of 7), which turns them into groups chemically very reactive under mild reaction conditions, and about relatively high secondary amino groups of pK (around 10), which makes them good anion exchangers.
De este modo, la superficie de las partículas magnéticas queda funcionalizada de tal forma que permite inmovilizar de forma orientada las partículas de antígeno o anticuerpo sobre ella, con las consiguientes ventajas de posibilitar la exposición de diferentes epitopos, o de evitar impedimentos estéricos o distorsiones de la molécula de anticuerpo (que se inmovilizará por los azucares oxidados).In this way, the surface of the particles magnetic is functionalized so that it allows immobilize oriented antigen particles or antibody on it, with the consequent advantages of enable the exposure of different epitopes, or avoid steric impediments or distortions of the antibody molecule (which will be immobilized by oxidized sugars).
Las partículas magnéticas así obtenidas son estables en suspensión durante un largo periodo de tiempo y se concentran rápidamente en fracciones adecuadas mediante la aplicación de un campo magnético, redispersándose fácilmente al retirar el campo magnético con una suave agitación. Dicha propiedad permite su utilización como biosensores, de acuerdo con lo expuesto previamente.The magnetic particles thus obtained are stable in suspension for a long period of time and it quickly concentrate on appropriate fractions by application of a magnetic field, easily redispersing at Remove the magnetic field with gentle agitation. Such property allows its use as biosensors, in accordance with the above previously.
Así pues, la presente invención proporciona biosensores que consisten en una partícula magnética como la descrita previamente, la cual presenta al menos un tipo de anticuerpo o al menos un tipo de antígeno inmovilizado en su superficie.Thus, the present invention provides biosensors that consist of a magnetic particle like the described previously, which has at least one type of antibody or at least one type of immobilized antigen in its surface.
En una realización particular, dichos biosensores presentan adicionalmente sobre su superficie una enzima inmovilizada que sea capaz de emitir señales que permitan la cuantificación de las partículas magnéticas capturadas. Preferiblemente, dicha enzima está seleccionada entre el grupo formado por beta galactosidasa, lipasa, penicilina G acilasa y otras hidrolasas.In a particular embodiment, said biosensors they also have an enzyme on their surface immobilized that is capable of emitting signals that allow quantification of the captured magnetic particles. Preferably, said enzyme is selected from the group formed by beta galactosidase, lipase, penicillin G acylase and other hydrolases
La co-inmovilización en las partículas magnéticas de una enzima capaz de reconocer un sustrato que libere el mismo tipo de compuesto fácilmente detectable (por absorción en Vis-UV, por flourescencia) coloreado que la enzima ligada al anticuerpo de lectura pero a partir de un sustrato diferente, aprovechando la especificidad de dicha enzima, permite cuantificar exactamente el número de partículas unidas y la señal específica obtenida con esas partículas. Para dicho fin son especialmente útiles la penicilina G acilasa y las galactosidadas puesto que no reconocen los sustratos de forma cruzada. Como alternativa, se podrían usar marcajes fluorescentes con distintas sondas.Co-immobilization in magnetic particles of an enzyme capable of recognizing a substrate that releases the same type of easily detectable compound (by Vis-UV absorption, by fluorescence) colored that the enzyme bound to the reading antibody but from a different substrate, taking advantage of the specificity of said enzyme, allows to quantify exactly the number of bound particles and the specific signal obtained with those particles. To that end they are Especially useful are penicillin G acylase and galactosidates since they do not recognize the substrates crosswise. As alternatively, fluorescent labels with different probes
En otra realización particular, dichos biosensores presentan un recubrimiento adicional con polímeros heterofuncionales para evitar adsorciones inespecíficas de biomacromoléculas. Preferiblemente, dicho recubrimiento adicional es de dextrano-aspártico-aldehído.In another particular embodiment, said biosensors have an additional coating with polymers heterofunctional to avoid nonspecific adsorption of biomachromolecules Preferably, said additional coating It is dextran-aspartic-aldehyde.
El uso de dichos polímeros dificulta los procesos de adsorción no deseados evitando así la adsorción del anticuerpo de lectura (es decir, la aparición de falsos positivos), o de otras proteínas de la muestra (es decir el enmascaramiento de la adsorción del antígeno). Estos polímeros deberán de ser capaces de unirse selectivamente al soporte sin alterar al anticuerpo único a la partícula magnética.The use of such polymers makes processes difficult of unwanted adsorption thus avoiding adsorption of the antibody reading (i.e. the appearance of false positives), or other sample proteins (i.e. masking the adsorption of the antigen). These polymers should be able to selectively bind to the support without altering the single antibody to the magnetic particle
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona también un método para la preparación de dichos biosensores que comprende la inmovilización de al menos un antígeno o al menos un anticuerpo en la superficie de las partículas magnéticas obtenidas según el método que se ha descrito previamente.In a further aspect of the invention, it also provides a method for preparing said biosensors comprising the immobilization of at least one antigen or at least one antibody on the surface of the particles Magnetic obtained according to the method described previously.
En una realización particular, dicho método para la preparación de los biosensores de la invención comprende adicionalmente la inmovilización de una enzima en la superficie de la partícula que sea capaz de emitir señales que permitan la cuantificación de las partículas magnéticas capturadas. Preferiblemente, dicha enzima está seleccionada del grupo formado por beta galactosidasa, lipasa, penicilina G acilasa y otras hidrolasas.In a particular embodiment, said method for the preparation of the biosensors of the invention comprises additionally the immobilization of an enzyme on the surface of the particle that is capable of emitting signals that allow the quantification of the captured magnetic particles. Preferably, said enzyme is selected from the group formed by beta galactosidase, lipase, penicillin G acylase and others hydrolases
En otra realización particular, dicho método para la preparación de los biosensores de la invención comprende, además, un tratamiento con polímeros heterofuncionales para evitar adsorciones inespecíficas de biomacromoléculas. Dicho polímero heterofuncional es preferiblemente dextrano-aspártico-aldehído.In another particular embodiment, said method for the preparation of the biosensors of the invention comprises, In addition, a treatment with heterofunctional polymers to avoid nonspecific adsorption of biomachromolecules. Said polymer heterofunctional is preferably dextran-aspartic-aldehyde.
En otro aspecto, la presente invención proporciona también el uso de los biosensores de la invención para la identificación y cuantificación de analitos. Para ello, proporciona un método para la identificación y cuantificación de analitos presentes en una muestra líquida, que comprende las siguientes etapas:In another aspect, the present invention also provides the use of the biosensors of the invention for the identification and quantification of analytes. For it, provides a method for the identification and quantification of analytes present in a liquid sample, comprising the following stages:
- a)to)
- puesta en contacto de dicha muestra líquida con los biosensores de la invención de tal manera que los analitos presentes en la muestra líquida interaccionen con dichos biosensores;contacting of said liquid sample with the biosensors of the invention of such so that the analytes present in the liquid sample interact with these biosensors;
- b)b)
- recuperación de los biosensores de la muestra líquida mediante la aplicación de un campo magnético local a dicha muestra líquida, de tal forma que los biosensores se adhieran a la superficie de dicho campo magnético local;recovery of biosensors of the liquid sample by applying a local magnetic field to said liquid sample, such that the biosensors adhere to the surface of said magnetic field local;
- c)c)
- cuantificación de los biosensores que han sido recuperados y de los analitos que han interaccionado con dichos biosensores recuperados en la etapa b).quantification of the biosensors that have been recovered and the analytes that have interacted with said biosensors recovered in the stage b).
Figura 1- Esquema de la reacción que ocurre entre anticuerpos y antígenos en un inmunoensayo enzimático de ELISA.Figure 1- Scheme of the reaction that occurs between antibodies and antigens in an ELISA enzyme immunoassay.
Figura 2- Sistema ideal: anticuerpos correctamente orientados sobre partículas magnéticas inertes y coinmovilización con enzimas marcadoras para cuantificar partículas magnéticas.Figure 2- Ideal system: antibodies correctly oriented on inert magnetic particles and coinmobilization with marker enzymes to quantify particles magnetic
Figura 3- Esquema representando la orientación correcta e incorrecta del anticuerpo sobre partículas magnéticas inertes.Figure 3- Scheme representing the orientation correct and incorrect antibody on magnetic particles inert
Figura 4- Esquema representando el proceso de concentración y purificación de un antígeno en una muestra, utilizando anticuerpos inmovilizados sobre partículas magnéticas.Figure 4- Scheme representing the process of concentration and purification of an antigen in a sample, using antibodies immobilized on particles magnetic
Figura 5- Esquema representando la inmovilización de los anticuerpos a través de sus cadenas glicosiladas sobre soportes aminados y el recubrimiento posterior de la superficie de la partícula con dextranos para hacerla inerte y aumentar la estabilidad de los anticuerpos.Figure 5- Scheme representing the immobilization of the antibodies through their glycosylated chains on laminated supports and the back surface coating of the particle with dextrans to make it inert and increase the antibody stability
Figura 6- Esquema representando la inmovilización de los anticuerpos a través de la zona más rica en His de la cadena pesada mediante el uso de soporte epoxido-quelato y el tratamiento posterior con dextrano para hacer inerte la superficie de las partículas como en la figura 5.Figure 6- Scheme representing the immobilization of antibodies through the richest area in His chain heavy by using epoxy-chelate support and subsequent treatment with dextran to make the inert surface of the particles as in figure 5.
Figura 7- Esquema de fraccionamiento de la suspensión de nanopartículas de magnetita preparada según la invención.Figure 7- Scheme of fractionation of the magnetite nanoparticle suspension prepared according to invention.
Figura 8- Variación de la movilidad fónica frente al pH de las partículas magnéticas de la invención.Figure 8- Variation of phonic mobility versus at the pH of the magnetic particles of the invention.
Figura 9- Estudio de las tres fracciones de la suspensión de nanopartículas de magnetita mediante microscopía ópticaFigure 9- Study of the three fractions of the suspension of magnetite nanoparticles by microscopy optics
Figura 10- Micrografía realizada por microscopía electrónica de transmisión mostrando la microestructura de las partículas de la fracción útil de la suspensión de nanopartículas de magnetita.Figure 10- Micrography performed by microscopy Transmission electronics showing the microstructure of the particles of the useful fraction of the nanoparticle suspension Magnetite
Se prepara una suspensión magnética compuesta por nanopartículas de magnetita (Fe_{3}O_{4}) de tamaño uniforme, recubiertas de una capa de sílice. El recubrimiento de sílice tiene lugar sobre un agregado inicial de partículas magnéticas, resultando en una suspensión magnética con propiedades definidas. Mediante la aplicación de un campo magnético se puede fraccionar la suspensión de partículas Fe_{3}O_{4}/SiO_{2} preparada, de forma que se obtengan fracciones adecuadas para su utilización como biosensores cumpliendo propiedades muy restrictivas: deben ser estables en suspensión durante un largo periodo de tiempo y concentrase rápidamente mediante la aplicación de un campo magnético, redispersándose fácilmente al retirarle el campo magnético con una suave agitación.A magnetic suspension consisting of magnetite (Fe 3 O 4) nanoparticles of uniform size, coated with a layer of silica. The silica coating has place over an initial aggregate of magnetic particles, resulting in a magnetic suspension with defined properties. By applying a magnetic field you can fractionate the Fe 3 O 4 / SiO 2 particle suspension prepared, of so that fractions suitable for use are obtained as biosensors fulfilling very restrictive properties: they must be stable in suspension for a long period of time and quickly concentrate by applying a field magnetic, redispersing easily when the field is removed Magnetic with gentle agitation.
Se toman 40 mg de magnetita (Fe_{3}O_{4}) sintetizada por el método de Massart y se muelen en un mortero de ágata hasta conseguir un polvo muy fino. En este mismo mortero se añaden 1,12 mg de hidróxido de tetrametil amonio (OH(CH_{3})_{4} NH_{4}) gota a gota mezclándose bien con la magnetita inicial. Por otro lado se prepara una disolución de 16 ml de H_{2}O y 2 ml de NH_{4} (OH) (29%), que se incorpora al mortero poco a poco, a la vez que se va retirando la suspensión y añade a un matraz Erlenmeyer de vidrio que contiene 50 ml de alcohol isopropílico. Cuando toda la suspensión haya sido depositada en el matraz se añaden otros 250 ml de alcohol con agitación.40 mg of magnetite (Fe 3 O 4) are taken synthesized by Massart's method and ground in a mortar of Agate until you get a very fine powder. In this same mortar add 1.12 mg tetramethyl ammonium hydroxide (OH (CH 3) 4 NH 4) dropwise by mixing well with The initial magnetite. On the other hand a solution of 16 is prepared ml of H2O and 2 ml of NH4 (OH) (29%), which is incorporated into the mortar little by little, while the suspension is being removed and add to a glass Erlenmeyer flask containing 50 ml of isopropyl alcohol. When the entire suspension has been deposited In the flask another 250 ml of alcohol are added with stirring.
Durante este proceso la reacción que tiene lugar se puede expresar como:During this process the reaction that takes place It can be expressed as:
El matraz Erlenmeyer completamente protegido por una película de parafina se sumerge en un baño ultrasónico durante 30 min asegurándose que transcurrido ese tiempo el baño haya adquirido la temperatura de 40 °C. Después de ese tiempo, se añade a la suspensión 0,8 ml de ortosilicato de tetraetilo (TEOS).The Erlenmeyer flask completely protected by a paraffin film is immersed in an ultrasonic bath during 30 min making sure that after that time the bathroom has acquired the temperature of 40 ° C. After that time, it is added to the 0.8 ml suspension of tetraethyl orthosilicate (TEOS).
La reacción que ha tenido lugar puede expresarse como:The reaction that has taken place can be expressed as:
Mediante esta reacción las partículas de magnetita se recubren de sílice durante una hora, y posteriormente se baja la temperatura hasta condiciones normales. Con objeto de anclar mas fuertemente la sílice sobre las partículas de magnetita la muestra lavada y seca es sometida a temperaturas entre 300-800°C durante 1-24 horas en atmósfera controlada. En la figura 2 se da la variación de la movilidad iónica frente al pH, mostrándose que la parte externa de las partículas está constituida por sílice. Cuando la suspensión se haya enfriado se filtra por succión a través de un filtro de 0,2 micrómetros, se lava con alcohol isopropílico y a continuación con agua.Through this reaction the particles of magnetite are coated with silica for one hour, and then the temperature is lowered to normal conditions. With the object of anchor the silica more strongly on the magnetite particles the washed and dried sample is subjected to temperatures between 300-800 ° C for 1-24 hours at controlled atmosphere. Figure 2 shows the variation of the ionic mobility against pH, showing that the external part of The particles consist of silica. When the suspension is has cooled filtered by suction through a 0.2 filter micrometers, washed with isopropyl alcohol and then with Water.
El residuo sólido obtenido se dispersa en un tubo con 16 ml de agua y la solución se fracciona de acuerdo con el esquema de la figura 7.The solid residue obtained is dispersed in a tube with 16 ml of water and the solution is fractionated according to the scheme of figure 7.
En primer lugar, se hace una separación de la fracción magnética. Para ello, se coloca un imán (1 Tesla) bajo el tubo que contiene la suspensión (1) y se deja reposar hasta que el líquido tenga apariencia blanca. Sin retirar el imán, se decanta el líquido blanco constituido sobre todo por sílice (2). Posteriormente, se repone el líquido decantado con agua. Se coloca el imán en el lateral del tubo, situado mas o menos a la mitad de altura ocupada por el líquido (3), se espera un minuto y sin apartar el imán se decanta el líquido. Esta operación se repite hasta que el líquido que se recoge sea transparente. Esta suspensión recogida constituye la fracción no magnética. (4) Se deja el tubo en reposo durante 10 min, tras lo cual se separan las otras dos fracciones. Se vierte el líquido del tubo en otro tubo acercando en el último momento el imán al fondo del primer tubo para poder retener el sedimento creado durante el reposo. El líquido vertido es la fracción útil (5). El sedimento constituye la fracción gruesa (6). En la figura 9, se muestra un estudio de las tres fracciones mediante microscopía óptica. En la figura 10, se da una micrografía realizada por microscopía electrónica de transmisión mostrando la microestructura de las partículas de la fracción útil.First, a separation of the magnetic fraction is made. To do this, a magnet (1 Tesla) is placed under the tube containing the suspension (1) and allowed to stand until the liquid appears white. Without removing the magnet, the white liquid consisting mostly of silica (2) is decanted. Subsequently, the decanted liquid is replaced with water. The magnet is placed on the side of the tube, located about half the height occupied by the liquid (3), a minute is expected and without removing the magnet the liquid is decanted. This operation is repeated until the liquid that is collected is transparent. This collected suspension constitutes the non-magnetic fraction . (4) The tube is left at rest for 10 min, after which the other two fractions are separated. The liquid from the tube is poured into another tube at the last moment bringing the magnet to the bottom of the first tube to retain the sediment created during rest. The spilled liquid is the useful fraction (5). The sediment constitutes the thick fraction (6). In Figure 9, a study of the three fractions by optical microscopy is shown. In Figure 10, a micrograph is performed by transmission electron microscopy showing the microstructure of the particles of the useful fraction.
-Desecación de las partículas magnéticas: Aproximadamente 10 mg de partículas magnéticas se resuspenden en 5 ml de acetona. Se realizan varios lavados (x3) cuyo objetivo es eliminar el agua de la superficie de la partícula, ya que la silanización se realiza en medio orgánico.- Drying of the magnetic particles : Approximately 10 mg of magnetic particles are resuspended in 5 ml of acetone. Several washes are performed (x3) whose objective is to remove water from the surface of the particle, since silanization is carried out in organic medium.
-Tratamiento con \gamma-aminopropiltrietoxisilano: Este se realiza en tolueno. Se resuspenden las partículas en tolueno en presencia de 10% de \gamma-aminopropiltrietoxisilano. Se mantienen a temperatura ambiente durante 24 horas con agitación suave. Posteriormente se procede realizando varios lavados (con volúmenes iguales) para eliminar los disolventes, el primer lavado es con tolueno (x4), benceno (x4), acetona (x4), realizándose varios lavados con agua.- Treatment with γ-aminopropyltriethoxysilane : This is carried out in toluene. The particles are resuspended in toluene in the presence of 10% γ-aminopropyltriethoxysilane. They are kept at room temperature for 24 hours with gentle agitation. Subsequently, several washes are carried out (with equal volumes) to remove the solvents, the first wash is with toluene (x4), benzene (x4), acetone (x4), several washing with water.
Se resuspenden las partículas magnéticas (concentración 10 mg/ml), ya silanizadas, en tampón fosfato 200 mM, pH 8. Se procede a la activación con glutaraldehído al 10% manteniéndose durante una noche (O/N) a temperatura ambiente con agitación suave. Posteriormente se procede a lavados con agua hasta desaparición total del olor a glutaraldehído. Se procede a la incubación con la PGA (prepurificada previamente por varios intercambiadores aniónicos y catiónicos).The magnetic particles are resuspended (concentration 10 mg / ml), already silanized, in 200 mM phosphate buffer, pH 8. Activation is carried out with 10% glutaraldehyde staying overnight (O / N) at room temperature with gentle agitation Subsequently it is washed with water until total disappearance of the smell of glutaraldehyde. We proceed to the PGA incubation (prepurified previously by several anionic and cationic exchangers).
Se adicionan aproximadamente 25 ml de PGA (purificada) (300 UE/ml) a las partículas resuspendidas en 25 ml de tampón fosfato 25 mM pH 8. Se mantienen con agitación suave a temperatura ambiente durante 24 horas.Approximately 25 ml of PGA are added (purified) (300 EU / ml) to resuspended particles in 25 ml of 25 mM phosphate buffer pH 8. They are maintained with gentle agitation at room temperature for 24 hours.
Transcurrido este tiempo se procede a la reducción con borohidruro sódico. Se adicionan a la suspensión aproximadamente 2 ml de tampón carbonato 500 mM pH 10,5, con esto se sube el pH de la suspensión, se le adiciona 1 mg/ml de borohidruro sódico y se mantiene durante 60 min a +4 °C. Luego se realizan varios lavados con tampón fosfato 100 mM pH 7, y con agua. Después se resuspenden en tampón fosfato 25 mM pH 7.After this time, proceed to the reduction with sodium borohydride. They are added to the suspension approximately 2 ml of 500 mM carbonate buffer pH 10.5, with this the pH of the suspension is raised, 1 mg / ml of sodium borohydride and is maintained for 60 min at +4 ° C. Then I know perform several washes with 100 mM phosphate buffer pH 7, and with water. They are then resuspended in 25 mM phosphate buffer pH 7.
Se consiguen inmovilizar 7000 UI de PGA/g de partícula, lo que sugiere una capacidad de carga muy elevada, derivada del bajo tamaño de las partículas, superior a la capacidad de carga de otras partículas magnéticas comerciales (p.e., 5200 UI en partículas carboxilo-Estapor)They are able to immobilize 7000 IU of PGA / g of particle, which suggests a very high load capacity, derived from the low particle size, exceeding the capacity charge of other commercial magnetic particles (e.g., 5200 IU in carboxyl-Stapor particles)
Se utilizan partículas magnéticas silanizadas según el ejemplo 2 que presentan grupos amino en su superficie. Este grupo amino interaccionará con los grupos carbonilo, generados en la región Fc de la IgG por oxidación con peryodato de los grupos glucídicos presentes en la región Fc del anticuerpo. Se formará una base de Schiff entre el grupo amino y el carbonilo.Silanized magnetic particles are used according to example 2 which have amino groups on their surface. This amino group will interact with the carbonyl groups, generated in the Fc region of IgG by periodate oxidation of the groups glycides present in the Fc region of the antibody. It will form a Schiff base between the amino group and the carbonyl.
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La oxidación de las IgG se realiza en las siguientes condiciones:The oxidation of IgG is carried out in the following conditions:
- 20 mg/ml IgG antiperoxidasa20 mg / ml IgG antiperoxidase
- +10mM IO_{4}^{-}++ 10mM IO_ {4} - +
- +tampón fosfato 5 mM pH 7.+ 5 mM pH phosphate buffer 7.
- en agitación magnética a +4 °C durante 90 min.in magnetic stirring at +4 ° C for 90 min.
Posteriormente se procede a realizar una diálisis frente a agua (en una relación de volumen 1/100) para eliminar el formaldehído generado en la oxidación de los grupos de azúcares de la IgG.Subsequently proceed to perform a dialysis against water (in a 1/100 volume ratio) to eliminate the formaldehyde generated in the oxidation of the sugar groups of IgG
Se procede a la inmovilización de las IgG oxidadas sobre partículas silanizadas con grupos amino en su superficie. Esta se realiza en las siguientes condiciones:IgG immobilization proceeds oxidized on silanized particles with amino groups in their surface. This is done under the following conditions:
- 5 mg de partículas magnéticas-NH_{2} +5 mg of particles magnetic-NH2 +
- +30 mg/ml de anticuerpo oxidado ++30 mg / ml antibody rusty +
- +150 mM Trimetilaminoborano ++150 mM Trimethylaminoborane +
- +Tampón fosfato 100 mM pH 8 ++ 100 mM phosphate buffer pH 8 +
- con agitación suave a temperatura ambiente, O/N.with gentle agitation to room temperature, O / N.
Posteriormente se procede a la reducción de la Base de Schiff generada entre los grupos carbonilo y amino. La reducción se realiza en las siguientes condiciones:Subsequently, the reduction of Schiff base generated between carbonyl and amino groups. The Reduction is done under the following conditions:
- Adición de Tampón Carbonato 500mM pH 10,5 +Carbonate Buffer Addition 500mM pH 10.5 +
- +1 mg/ml de NaBH_{4} ++1 mg / ml NaBH4 +
- durante 60 min a +4°C.for 60 min at + 4 ° C
Transcurrido este tiempo se procede al lavado de las partículas con tampón fosfato 100 mM pH 7, y se resuspenden las partículas en tampón fosfato 25 mM pH 7.After this time, the washing of particles with 100 mM phosphate buffer pH 7, and resuspend particles in 25 mM phosphate buffer pH 7.
Se determina mediante el método de Bradford la cantidad de proteína inmovilizada sobre las partículas magnéticas, siendo el ensayo:The method of Bradford is determined by amount of protein immobilized on the magnetic particles, being the essay:
- 1 ml Líquido Coomassie+1 ml Liquid Coomassie +
- +20 \mul de muestra++20 \ mul of show +
- a 595 nm se determina la absorbanciaat 595 nm the absorbance
La cantidad de proteína inmovilizada sobre las partículas magnéticas (aproximadamente 5 mg) es de 9,3 mg.The amount of protein immobilized on the Magnetic particles (approximately 5 mg) is 9.3 mg.
Una vez inmovilizadas las IgG sobre las partículas magnéticas a través de grupos presentes en la región Fc, se comprueba que estos anticuerpos son biológicamente activos al presentar su capacidad de adsorción del antígeno, demostrando así la inmovilización orientada de IgG sobre las partículas magnéticas. Para ello se determina la presencia de peroxidasa (antígeno) en las partículas magnéticas. Ese ensayo se realiza en fuerza iónica que impida la posibilidad de adsorción iónica de la peroxidasa sobre las partículas aminadas.Once the IgGs are immobilized on the magnetic particles through groups present in the Fc region, it is proven that these antibodies are biologically active at present its antigen adsorption capacity, thus demonstrating oriented immobilization of IgG on magnetic particles. For this, the presence of peroxidase (antigen) in the Magnetic particles. That test is performed on ionic strength that prevent the possibility of ionic adsorption of peroxidase on the aminated particles.
Una vez comprobada la inmovilización de la proteína, se comprueba que la inmunoglobulina inmovilizada es biológicamente activa. Para ello, se realiza una incubación con el antígeno (peroxidasa) correspondiente a las IgG inmovilizadas. Esta incubación se realiza con antígeno en exceso y a una alta fuerza iónica para evitar la adsorción iónica de la peroxidasa (antígeno) sobre la superficie aminada de las partículas magnéticas. Para ello, se ha obtenido una preparación de extracto de peroxidasa de alta carga enzimática, 25 mg/ml en tampón fosfato 100 mM pH 7.Once the immobilization of the protein, the immobilized immunoglobulin is proven to be biologically active For this, an incubation is performed with the antigen (peroxidase) corresponding to immobilized IgGs. This incubation is performed with excess antigen and at high strength ionic to prevent ionic adsorption of peroxidase (antigen) on the aminated surface of the magnetic particles. For in this way, a preparation of peroxidase extract of high enzyme load, 25 mg / ml in 100 mM phosphate buffer pH 7.
Se determina la cantidad de actividad peroxidasa (valorando espectrofotométricamente) con el siguiente ensayo enzimático:The amount of peroxidase activity is determined (spectrophotometrically evaluating) with the following test enzymatic:
- Tampón fosfato 100 mM pH 7,5100 mM pH phosphate buffer 7.5
- + 50 \mug/ ml o-fenilendiamina++ 50 µg / ml o-phenylenediamine +
- + 100 \mul H_{2}O_{2} 125 mM+ 100 µL H 2 O 2 125 mM
- \lambda 420 nm Tª 25°Cλ 420 nm T 25 ° C
Los anticuerpos inmovilizados son capaces de reconocer una molécula de peroxidasa por molécula de anticuerpo, como los anticuerpos libres.Immobilized antibodies are capable of recognize one peroxidase molecule per antibody molecule, as the free antibodies.
Las partículas magnéticas tratadas con \gamma-aminopropiltrietoxisilano poseen en su superficie la presencia de un grupo NH_{2} primario con un pK elevado, lo cual supone que a pH usuales de trabajo se encuentra cargado positivamente. Esto implica que la superficie de las partículas magnéticas es un intercambiador catiónico, por lo que un elevado número de proteínas se adsorberán iónicamente en condiciones normales. El recubrimiento con dextrano-aspártico-aldehído tiene por objetivo hacer inerte la superficie de las partículas. La presencia de grupos carboxilos (cargas negativas) provoca que se absorba iónicamente el dextrano-aspártico-aldehído, así quedan aproximados el grupo amino del soporte y el grupo aldehído del dextrano, forzando de esta forma la generación de una base de Schiff entre estos grupos, evitando así el inconveniente que se produce por el elevado pK del grupo amino en la generación de la base de Schiff.Magnetic particles treated with γ-aminopropyltriethoxysilane possess in its surface the presence of a primary NH2 group with a pK high, which means that at normal working pH is positively charged This implies that the surface of the magnetic particles is a cation exchanger, so a high number of proteins will be adsorbed ionically in normal conditions. Coating with dextran-aspartic-aldehyde has by objective make the surface of the particles inert. The presence of carboxy groups (negative charges) causes ionically absorb the dextran-aspartic-aldehyde as well the amino group of the support and the aldehyde group are approximated of dextran, thus forcing the generation of a base of Schiff between these groups, thus avoiding the inconvenience that produced by the high pK of the amino group in the generation of the Schiff base.
Se preparan polímeros dextrano-aspártico-aldehído de distintos tamaños (6000 Da y 20000 Da) con un porcentaje del 20% de aspártico y el 80% restante de grupos aldehído. La concentración final del dextrano-aspártico-aldehído es aproximadamente de 10 mg/ml.Polymers are prepared dextran-aspartic-aldehyde different sizes (6000 Da and 20,000 Da) with a percentage of 20% of aspartic and the remaining 80% of aldehyde groups. Concentration end of the dextran-aspartic-aldehyde is approximately 10 mg / ml.
Se procede a la inmovilización de dextrano-aspártico-aldehído sobre las partículas magnéticas en las siguientes condiciones:The immobilization of dextran-aspartic-aldehyde on Magnetic particles under the following conditions:
- 1 mg de partículas magnéticas aminadas+1 mg of magnetic particles aminated +
- +19 ml de dextrano-aspártico-aldehído (20000)++19 ml of dextran-aspartic-aldehyde (20,000) +
- +1 ml tampón fosfato 500 mM pH 7 ++1 ml phosphate buffer 500 mM pH 7+
- +150 mM trimetilaminoborano++150 mM trimethylaminoborane +
- + 24 horas a temperatura ambiente+ 24 hours at temperature ambient
Posteriormente se procede a la reducción con 1 mg/ml de NaBH_{4} a pH alcalino. Se realizan varios lavados con H_{2}O y se procede a la incubación con el extracto proteico de E.coli a baja fuerza fónica y pH 7.Subsequently, the reduction is carried out with 1 mg / ml of NaBH4 at alkaline pH. Several washes are carried out with H2O and the incubation is carried out with the E.coli protein extract at low phonic strength and pH 7.
Se incuban las partículas (recubiertas con esta primera capa de dextrano-aspártico-aldehído) y partículas aminadas con extracto de E.coli de concentración 10 mg/ml. Esta se realiza en tampón fosfato 5 mM pH 7. Se determina mediante método de Bradford la cantidad de proteína adsorbida iónicamente sobre las partículas.The particles (coated with this first layer of dextran-aspartic-aldehyde) and aminated particles are incubated with E.coli extract of 10 mg / ml concentration. This is done in 5 mM phosphate buffer pH 7. The amount of ionically adsorbed protein on the particles is determined by Bradford's method.
Los datos de absorbancia demuestran que un 18% de proteínas se han adsorbido sobre las partículas magnéticas recubiertas de dextrano-aspártico-aldehído; mientras que sobre las partículas aminadas (sin recubrir) se adsorbe iónicamente el 81% de las proteínas presentes en el extracto.Absorbance data show that 18% of proteins have been adsorbed on magnetic particles covered with dextran-aspartic-aldehyde; while on the aminated particles (uncoated) it ionically adsorbs 81% of the proteins present in the abstract.
Los resultados anteriores llevan a pensar que sería conveniente un segundo recubrimiento de dextrano-aspártico-aldehído ya que con el primer recubrimiento no se han bloqueado todas las cargas positivas presentes en la superficie de la partícula magnética.The previous results lead us to think that a second coating of dextran-aspartic-aldehyde since with the first coating not all loads have been blocked positives present on the surface of the magnetic particle.
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Se procede a la inmovilización de una segunda capa de dextrano- áspártico-aldehído con las siguientes condiciones:We proceed to the immobilization of a second dextran-aspartic-aldehyde layer with the following conditions:
- 1 mg de partículas magnéticas (1 capa)+1 mg of magnetic particles (1 layer) +
- +19 ml de dextrano-aspártico-aldehído (6000 Da)++19 ml of dextran-aspartic-aldehyde (6000 Da) +
- +150 mM trimetilaminoborano++150 mM trimethylaminoborane +
- +1 ml tampón fosfato 500 mM pH 7++1 ml phosphate buffer 500 mM pH 7+
- + 24 horas a temperatura ambiente.+ 24 hours at temperature ambient.
Posteriormente se procede a la reducción de las bases de Schiff generadas con 1 mg/ml de NaBH_{4} a pH alcalino. Se realizan varios lavados con agua y se procede a la incubación con el extracto de E.coli a baja fuerza iónica (Tampón fosfato 5 mM pH 7).Subsequently, the Schiff bases generated with 1 mg / ml of NaBH4 are reduced to alkaline pH. Several washings are carried out with water and the incubation is carried out with the extract of E.coli at low ionic strength (5 mM phosphate buffer pH 7).
Se incuban las partículas en las mismas condiciones de antes, determinando igualmente por el método de Bradford la cantidad de proteína que se ha adsorbido iónicamente sobre la partícula. En esta ocasión los valores de absorbancia demuestran que la cantidad de proteína adsorbida sobre las partículas magnéticas con un doble recubrimiento de dextrano-aspártico-aldehído es de un 1% en comparación con el 80% que presentan las partículas aminadas en las mismas condiciones.The particles are incubated therein conditions before, also determining by the method of Bradford the amount of protein that has been ionically adsorbed on the particle. This time the absorbance values demonstrate that the amount of protein adsorbed on the magnetic particles with a double coating of dextran-aspartic-aldehyde is from 1% compared to 80% presented by particles aminated under the same conditions.
Claims (18)
- a)to)
- preparación de un polvo de partículas magnéticas de óxido de hierro de 5-30 nm de tamaño,preparation of a iron oxide magnetic particle powder 5-30 nm in size,
- b)b)
- tratamiento del polvo de partículas de tal forma que las partículas queden cargadas en medio básico.treatment of particle dust so that the particles are charged in basic medium.
- c)c)
- recubrimiento de las partículas cargadas en medio básico con sílice con un espesor de 30 - 100 nm, yoverlay particles loaded in basic medium with silica with a thickness from 30-100 nm, and
- d)d)
- tratamiento térmico del producto obtenido en la etapa c) a una temperatura de 300 a 800°C durante 1 a 24 horas.heat treatment of the product obtained in step c) at a temperature of 300 to 800 ° C for 1 to 24 hours.
- a)to)
- tratamiento del producto obtenido en las reivindicaciones 8-9 con un derivado de trietoxisilano, en particular con glicidoxipropil trietoxisilano;treatment of product obtained in claims 8-9 with a triethoxysilane derivative, in particular with glycidoxypropyl triethoxysilane;
- b)b)
- tratamiento del producto obtenido en la etapa a) de esta reivindicación con etilendiamina; o bien, transformación de los grupos epóxido del producto obtenido en la etapa a) en grupos aldehído, seguida del tratamiento con etilendiamina.treatment of product obtained in step a) of this claim with ethylenediamine; or, transformation of the epoxide groups of product obtained in step a) in aldehyde groups, followed by ethylenediamine treatment.
- a)to)
- puesta en contacto de dicha muestra líquida con biosensores según las reivindicaciones 3-7 de tal manera que los analitos presentes en la muestra líquida interaccionen con dichos biosensores;contacting of said liquid sample with biosensors according to the claims 3-7 in such a way that the analytes present in the liquid sample interact with said biosensors;
- b)b)
- recuperación de los biosensores de la muestra líquida mediante la aplicación de un campo magnético local a dicha muestra líquida, de tal forma que los biosensores se adhieran a la superficie de dicho campo magnético local;recovery of biosensors of the liquid sample by applying a local magnetic field to said liquid sample, such that the biosensors adhere to the surface of said magnetic field local;
- c)c)
- cuantificación de los biosensores que han sido recuperados y de los analitos que han interaccionado con dichos biosensores recuperados en la etapa b).quantification of the biosensors that have been recovered and the analytes that have interacted with said biosensors recovered in the stage b).
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010034846A1 (en) | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Biótica, Bioquímica Analítica, S.L. | Rapid procedure for detection of microorganisms with magnetic particles |
| US9157911B2 (en) | 2011-06-15 | 2015-10-13 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | Assay method using magnetic silica particles and reagent for said assay method |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0234083A2 (en) * | 1986-02-25 | 1987-09-02 | Tosoh Corporation | Carrier for a biologically active component for immunoassay or enzymatic reaction |
| US4914023A (en) * | 1986-06-10 | 1990-04-03 | Serono Diagnostics Partners | Method of extending the linear range of an enzyme immunoassay by measuring off-peak absorbance |
| US5256386A (en) * | 1987-06-29 | 1993-10-26 | Eka Nobel Ab | Method for preparation of silica particles |
| US20020098529A1 (en) * | 2000-05-17 | 2002-07-25 | Weihong Tan | Method for identifying cells |
| US20020128234A1 (en) * | 1999-04-28 | 2002-09-12 | Hubbell Jeffrey A. | Multifunctional polymeric surface coatings in analytic and sensor devices |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010028234A1 (en) * | 1999-03-29 | 2001-10-11 | Banhidy Timothy Almondo | Windshield wiper automatic control |
-
2002
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2003
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0234083A2 (en) * | 1986-02-25 | 1987-09-02 | Tosoh Corporation | Carrier for a biologically active component for immunoassay or enzymatic reaction |
| US4914023A (en) * | 1986-06-10 | 1990-04-03 | Serono Diagnostics Partners | Method of extending the linear range of an enzyme immunoassay by measuring off-peak absorbance |
| US5256386A (en) * | 1987-06-29 | 1993-10-26 | Eka Nobel Ab | Method for preparation of silica particles |
| US20020128234A1 (en) * | 1999-04-28 | 2002-09-12 | Hubbell Jeffrey A. | Multifunctional polymeric surface coatings in analytic and sensor devices |
| US20020098529A1 (en) * | 2000-05-17 | 2002-07-25 | Weihong Tan | Method for identifying cells |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| TARTAJ, P.; GONZALEZ-CARREÑO, T.; SERNA, C.J. Single-step nanoengineering of silica coated maghemite hollow spheres with tunable magnetic properties. Advanced Materials. Noviembre 2001, Vol. 13, Nº 21, paginas 1620-1624. * |
| TARTAJ, P.; GONZÁLEZ-CARREÑO, T.; SERNA, C.J. Single-step nanoengineering of silica coated maghemite hollow spheres with tunable magnetic properties. Advanced Materials. Noviembre 2001, Vol. 13, Nº 21, páginas 1620-1624. \\ A 12,17,18 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010034846A1 (en) | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Biótica, Bioquímica Analítica, S.L. | Rapid procedure for detection of microorganisms with magnetic particles |
| US9157911B2 (en) | 2011-06-15 | 2015-10-13 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | Assay method using magnetic silica particles and reagent for said assay method |
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