ES2205982B1 - Enzima con actividad beta-(1,6)-endoglucanasa. - Google Patents
Enzima con actividad beta-(1,6)-endoglucanasa.Info
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Abstract
Enzima con actividad beta(1,6)endoglucanasa. Esta invención se refiere a una enzima con actividad beta (1,6) endoglucanasa, a construcciones de ADN que codifican para dicha enzima, a métodos para la producción de dicha enzima, a preparaciones enzimáticas que contienen dicha enzima y al empleo de dichas enzima y preparaciones enzimáticas para la degradación o modificación de materiales que contienen beta-(1,6)-glucano.
Description
Enzima con actividad
\beta-(1,6)-endoglucanasa.
Esta invención se refiere a una enzima con
actividad \beta-(1,6)-endoglucanasa, a
construcciones de ADN que codifican para dicha enzima, a métodos
para la producción de dicha enzima, a preparaciones enzimáticas que
contienen dicha enzima y al empleo de dichas enzima y preparaciones
enzimáticas para la degradación o modificación de materiales que
contienen \beta-(1,6)-glucano.
Existen organismos con la capacidad de actuar
como agentes de control biológico. Entre estos organismos se
encuentran algunas especies de hongos, por ejemplo, del género
Trichoderma, útiles como agentes de control biológico frente
a diversos fitopatógenos fúngicos. La degradación y posterior
asimilación de los hongos fitopatógenos, proceso conocido como
micoparasitismo, se ha propuesto como el mecanismo principal para
explicar la actividad antagonista de tales hongos frente a
patógenos fúngicos. El micoparasitismo es un proceso complejo que
comprende varias etapas, entre las que se encuentra la penetración
del micoparásito en el micelio del hongo fitopatógeno, lo cual
parece que va acompañado de una degradación, al menos parcial, de
la pared celular del hongo fitopatógeno.
El estudio de los modelos de expresión de las
enzimas que degradan la pared celular de hongos en distintas
fuentes nutrientes, y la caracterización bioquímica de estas
enzimas son requisitos previos para comprender las bases
moleculares de la acción antagonista de los agentes de control
biológico frente a hongos fitopatógenos. En base a esto, se ha
analizado la producción de quitinasas,
\beta-1,6-glucanasas,
\beta-1,3-glucanasas y proteasas
extracelulares por distintos organismos potencialmente útiles como
agentes de control biológico cuando se cultivan en condiciones que
asemejan dicho antagonismo, tales como la presencia de polisacáridos
abundantes en las paredes celulares de los hongos (por ejemplo,
quitina), paredes celulares fúngicas purificadas o micelios
esterilizados en autoclave como fuentes de nutrientes. Algunas de
estas hidrolasas han sido purificadas y se las considera enzimas
clave durante las primeras etapas del antagonismo.
Debido a la complejidad de las paredes celulares
de los hongos, también son interesantes las actividades
hidrolíticas con capacidad para degradar otros polisacáridos no
abundantes en la pared celular. Recientes estudios han puesto de
manifiesto que el
\beta-1,6-glucano es un polímero
clave en la estructura de la pared celular de los hongos ya que
está implicado en la unión de los componentes mayoritarios que
incluyen \beta-1,3-glucanos,
quitina y manoproteínas. Por tanto, las enzimas que hidrolizan
\beta-1,6-glucanos fúngicos bajo
las condiciones previamente mencionadas deberían contribuir, junto
con quitinasas y \beta-1,3- glucanasas, a una
ruptura eficaz de las paredes celulares de los hongos
(fitopatógenos, patógenos de animales, contaminantes de alimentos,
etc.) durante el antagonismo.
Los hongos del género Trichoderma han sido
estudiados desde hace mucho tiempo tanto por su actividad
celulolítica como por sus propiedades antagonistas de los patógenos
fúngicos de las plantas. El mecanismo antifúngico de
Trichoderma implica el empleo de enzimas que degradan la
pared celular del hongo, entre las que se encuentran quitinasas,
\beta-1,3- y
\beta-1,6-glucanasas y proteasas.
Debido a que la quitina y el
\beta-1,3-glucano son los
principales componentes estructurales de las paredes celulares
fúngicas (excepto de los Oomycetes), se ha propuesto que las
quitinasas y las
\beta-1,3-glucanasas sean las
enzimas clave en la lisis de las paredes celulares de los hongos
fitopatógenos durante la acción antagonista de Trichoderma.
Sin embargo, parece que otras enzimas que degradan las paredes
celulares, incluyendo aquéllas que hidrolizan los polímeros
minoritarios (\beta-1,6-glucanos,
\alpha-1,3-glucanos, etc.) también
pueden estar implicadas en la degradación eficaz y completa de las
paredes del micelio y de los conidios de hongos fitopatógenos por
Trichoderma.
Las \beta-(1,6)-endoglucanasas
(1,6-\beta-D-glucan
glucano- hidrolasas, EC 3.2.1.75) son enzimas que catalizan la
ruptura de los enlaces \beta-(1,6)-glucosídicos
presentes en el \beta-glucano, uno de los
componentes de las paredes celulares de numerosos organismos, por
ejemplo, hongos y levaduras. Estas enzimas también se denominan
pustulanasas debido a su capacidad para degradar el pustulano.
La presencia de una actividad
\beta-(1,6)-glucanasa ha sido detectada en
diversos organismos.
Martin et al. [Applied and Environental
Microbiology, 1980, 40(6), 1136-1138]
describen algunas especies de Bacillus que secretan
\beta-(1,6)-glucanasas.
Schep et al. [Biochem J., 1984, 223,
707-714] describen la purificación y propiedades de
una \beta-(1,6)-glucanasa de Penicillium
brefeldianum.
Dubourdieu et al. [Carbohydrate Research, 144,
277-287 (1985)] han descrito una preparación
enzimática industrial [NOVOZYM SP-116, de Novo
Industri A/S] derivada de una cepa de T. harzianum que,
entre otras glucanasas, comprende una \beta-(1,6)-
exoglucanasa.
Pitson et al. [Enzyme Microbiol. Technol., 1993,
15, 178- 192] describen que algunos hongos filamentosos tales como
Penicillium brefeldianum o Trichoderma harzianum y
levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae producen
enzimas que exhiben actividad
\beta-(1,6)-endoglucanasa.
Mullenga et al. [Microbios, 1994, 80(234),
143-154] describen el aislamiento y caracterización
de una \beta-(1,6)- glucanasa en una cepa de Saccharomycopsis
fibuligera.
Se ha descrito una actividad
\beta-1,6-glucanasa extracelular
a partir de una cepa de Trichoderma harzianum, descrita como
un eficaz agente de control biológico, que crece sobre quitina como
única fuente de carbono [de la Cruz et al., 1993, Arch.
Microbiol., 159, 316-322]. Dicha actividad es debida
a la presencia de, al menos, dos
\beta-1,6-glucanasas, denominadas
BGN16.1 y BGN16.2 [De la Cruz et al., 1995, J. Bacteriol., 177,
1864-1871]. La enzima BGN16.2 y el gen
bgn16.2 ya han sido analizados [De la Cruz et al., 1995, J.
Bacteriol., 177, 1864- 1871; Lora et al., 1995, Mol. Gen. Genet.,
247, 639-645]. Sin embargo, la enzima BGN16.1 no ha
sido purificada ni caracterizada previamente ni el gen que codifica
para dicha enzima, por lo que se desconoce tanto la estructura de
dicha enzima como sus relaciones con otras enzimas o las
inferencias evolutivas.
La patente norteamericana US 5.770.406 describe
una enzima con actividad
\beta-1,6-endoglucanasa derivada
de Trichoderma harzianum que se caracteriza porque tiene un
peso molecular aparente de 50 kDa determinado por electroforesis en
condiciones desnaturalizantes, un pH óptimo de 5, una temperatura
óptima comprendida entre 30°C y 40°C, una Km de 0,3%
aproximadamente sobre pustulano, un pI aparente de 5, 6, una
actividad específica de alrededor de 100 U/mg de enzima y un modo
de acción endo.
Aunque se han descrito diversas enzimas con
actividad \beta-(1,6)-glucanasa en diferentes
organismos (bacterias, hongos, levaduras), la enorme variedad
existente en cuanto a los mecanismos de acción, afinidad a
sustrato, especificidad, capacidad lítica, etc., hace que siga
siendo necesario incrementar el arsenal de enzimas con capacidad
para degradar o modificar la pared celular de organismos
perjudiciales, por ejemplo, hongos fitopatógenos y saprofíticos,
con el fin de poder evitar de forma eficaz las pérdidas causadas
por tales hongos.
La invención proporciona una solución a la
necesidad existente que comprende la purificación y caracterización
de una enzima con actividad
\beta-1,6-glucanasa de
Trichoderma harzianum, el aislamiento y caracterización de
la secuencia de ADN que codifica para dicha enzima y la clonación
de dicha secuencia de ADN.
La invención también proporciona un método para
la producción de dicha enzima, preparaciones enzimáticas que
contienen dicha enzima y el empleo de dichas enzima y preparaciones
enzimáticas para la degradación o modificación de materiales que
contienen \beta-(1,6)-glucano.
La Figura 1 muestra una imagen de microscopio
óptico (200X de amplificación) en el que se aprecia el efecto
antifúngico, determinado por la reducción del tamaño de las hifas
del hongo fitopatógeno Penicillium digitatum, producido por
la enzima BGN16.3 [Figura 1A] y el efecto de un control negativo
[Figura 1B].
La invención proporciona una enzima con actividad
\beta-(1,6)- glucanasa, en adelante enzima de la invención, que
tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
- a)
- la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1, y
- b)
- una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga y funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente homóloga" significa que las
secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad,
a nivel de aminoácidos, de, al menos, un 70%, preferentemente de,
al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%.
Asimismo, en el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "funcionalmente equivalente"
significa que la proteína en cuestión tiene, al menos, actividad
\beta-(1,6)-glucanasa.
La enzima cuya secuencia de aminoácidos se
muestra en la SEC. ID. N°: 1 ha sido denominada BGN16.3 en esta
descripción y no ha sido descrita previamente. Dicha enzima BGN16.3
presenta las características que se resumen en la Tabla 1.
Parámetro | BGN16.3 |
Peso molecular (SDS) | 47,5 kDa |
pI (IEE) | 4,5 |
pI (CE) | 4,1 |
Tª inactivación | 50°C |
Glicosilación | No |
Tª óptima | 50°C |
Km (pustulano) | 0,11% |
Actividad específica | 185 U/mg |
- [SDS: dodecilsulfato sódico; pI: punto isoléctrico; IEE: isoelectroenfoque; CE: cromatoenfoque]
En los Ejemplos que acompañan a esta descripción
se describen detalladamente los métodos utilizados para la
determinación de dichas propiedades.
La enzima de la invención puede obtenerse a
partir de un organismo productor de la misma, tal como un hongo del
género Trichoderma, mediante un procedimiento que comprende
el cultivo del organismo productor bajo condiciones apropiadas para
la expresión de dicha enzima y, posteriormente, recuperar dicha
enzima. En una realización particular de esta invención, el hongo
utilizado pertenece a la especie Trichoderma harzianum,
concretamente a la cepa depositada en la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso CECT 2413.
El cultivo del organismo productor puede hacerse
en dos etapas, tal como se menciona en el Ejemplo 1. En una primera
etapa se inoculan esporas del hongo en un medio de cultivo
suplementado con glucosa como fuente de carbono y, a continuación,
se recoge el micelio, se lava y se cultiva en medio Czapek como
medio de preinducción, sin necesidad de añadir quitina al medio de
inducción ya que la enzima BGN16.3 no es inducida (o al menos en
cantidades detectables) por quitina sino que es inducida por
paredes celulares de hongos, por ejemplo, de Botrytis, o en
ausencia de fuente de carbono.
La actividad
\beta-(1,6)-glucanasa se puede ensayar mediante
el protocolo descrito en el Ejemplo 2.
El aislamiento y la purificación de la enzima de
la invención se puede llevar a cabo mediante un procedimiento que
comprende la precipitación de la enzima con sulfato amónico, la
adsorción-digestión a pustulano, el cromatoenfoque
de la solución dializada procedente de la
adsorción-digestión a pustulano y la filtración en
gel de las fracciones concentradas que presentaron mayor actividad
\beta-(1-6)-glucanasa [véase el
Ejemplo 3].
Con la enzima de la invención aislada y
purificada se realizaron los ensayos
físico-químicos y cinéticos que se mencionan en los
Ejemplos 4-10 y cuyos resultados se recogen en la
Tabla 1 previamente mostrada. La actividad antifúngica de la enzima
de la invención se muestra en el Ejemplo 11.
A partir de la enzima de la invención se puede
identificar y aislar la secuencia de ADN que codifica para dicha
enzima mediante un procedimiento que comprende:
- la creación de genotecas de ADN genómico (ADNg)
o de ADN copia (ADNc) de organismos productores de la enzima de la
invención;
- la secuenciación del extremo amino de la enzima
de la invención y de fragmentos trípticos de la misma;
- el diseño de oligonucleótidos adecuados para
amplificar, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
una región del clon genómico de los organismos productores de la
enzima de la invención que sirva para obtener sondas destinadas a
escrutar dichas genotecas; y
- el análisis y selección de los clones
positivos.
Todas estas etapas se describen con más detalle
en el Ejemplo 12 donde se ilustra la obtención de la secuencia de
ADN que codifica para la enzima BGN16.3 de T. harzianum.
La extracción del ADNg se puede llevar a cabo
mediante un protocolo estándar [Kaiser et al., 1994, Methods in
yeast genetics. A Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring
Harbour, New York] con algunas modificaciones, por ejemplo, la
adición de un paso de purificación con fenol [véase el Ejemplo
12.1].
Para la creación de la genoteca de ADNc se extrae
el ARN total del organismo productor de la enzima de la invención
siguiendo un protocolo estándar [Chomczynski y Sacchi, 1987,
Single-step method of RNA isolation by acid
guanidinium
thiocyanate-phenol-chlorofom
extraction. Anal. Biochem. 162:156- 159] con ligeras modificaciones.
En una realización particular, el organismo productor de la enzima
de la invención es T. harzianum CECT 2413 el cual se cultiva
en un medio mínimo con paredes de organismos de la especie
Botrytis como única fuente de carbono, aislándose el ARN
mensajero (ARNm) mediante cromatografía de afinidad a
oligo(dT)celulosa. Posteriormente, se sintetiza el
ADNc, por ejemplo, utilizando un kit comercial, se le unen unos
adaptadores apropiados, se liga a un vector adecuado y se empaqueta
en un hospedador apropiado, por ejemplo, el fago \lambda [véase
el Ejemplo 12.2 y 12.3].
La secuenciación del extremo amino de la enzima
de la invención y de fragmentos trípticos de la misma se puede
realizar mediante cualquier procedimiento convencional, por
ejemplo, mediante el método de Edmans Matsudaira [A practical guide
to protein and peptide purification for microsequencing. Academic
press, Inc. New York, Edmans Matsudaira (eds.) 1989] [véase el
Ejemplo 12.4].
A partir de la información obtenida de la
secuencia del extremo amino y de los fragmentos trípticos de la
enzima de la invención se procedió a diseñar un conjunto de
oligonucleótidos destinados a amplificar una secuencia específica
correspondiente a la secuencia de ADN que codifica para la enzima
de la invención. En una realización particular, el oligonucleótido
directo se diseñó a partir de la secuencia del extremo amino de la
enzima BGN16.3 mientras que el oligonucleótido inverso
(antisentido) se diseñó a partir de la secuencia de los fragmentos
trípticos de la enzima BGN16.3. En el Ejemplo 12.4 se describen las
secuencias del extremo amino y del fragmento tríptico de la enzima
BGN16.3 que sirvió para diseñar los oligonucleótidos utilizados
para la realización de la PCR [véase el Ejemplo 12.5].
Los fragmentos adecuados resultantes de la
amplificación mediante PCR se pueden marcar y utilizar como sondas
para escrutar una genoteca (de ADNg o de ADNc) con el fin de aislar
los clones de interés mediante hibridación in situ [véase el
Ejemplo 12.6].
Por tanto, la invención proporciona una
construcción de ADN que codifica para la enzima de la invención que
comprende:
- a)
- la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. N°: 2; o
- b)
- una secuencia de ADN análoga a la secuencia definida en a) que
- i)
- es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN definida en a); y/o
- ii)
- codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la secuencia de ADN definida en a).
La SEC. ID. N°: 2 corresponde a la secuencia de
nucleótidos que codifica para la BGN16.3.
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análogo/a" pretende incluir a cualquier secuencia de
ADN que codifica para una enzima con actividad
\beta-1,6-endoglucanasa que tiene
las propiedades i)-ii) arriba mencionadas.
Típicamente, la secuencia de ADN análoga:
- se puede aislar de otro organismo que produce
la enzima con actividad \beta-(1,6)-glucanasa en
base a la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID. N°: 2, o
- se construye en base a la secuencia de ADN
mostrada en la SEC. ID. N°: 2, por ejemplo, mediante la introducción
de sustituciones de nucleótidos conservativas, es decir, que no dan
lugar a otra secuencia de aminoácidos de la
\beta-(1,6)-glucanasa codificada por dicha
secuencia de ADN mostrada en SEC. ID. N°: 2, pero que corresponde
al empleo de codones del organismo hospedador destinado a la
producción de la enzima, o bien mediante la introducción de
sustituciones de nucleótidos que dan lugar a una secuencia de
aminoácidos diferente y, por tanto, posiblemente, a una estructura
proteica diferente que pudiera dar lugar a una
\beta-(1,6)-glucanasa mutante con propiedades
diferentes a las de la enzima nativa. Otros ejemplos de posibles
modificaciones incluyen la inserción de uno o más nucleótidos en la
secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los
extremos de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en
cualquier extremo o en el interior de la secuencia. Por ejemplo, la
secuencia de ADN análogo puede ser una subsecuencia de la secuencia
de ADN mostrada en la secuencia mostrada en SEC. ID. N°: 2.
En general, la secuencia de ADN análoga es
sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN que codifica para
una enzima B- (1,6)-glucanasa de la invención, por
ejemplo SEC. ID. N°: 2, es decir, presenta una homología a nivel de
nucleótidos de, al menos, un 70%, preferentemente, al menos un 85%,
o más preferentemente, al menos, un 95% respecto a la secuencia
mencionada previamente.
La secuencia de ADN que codifica para la enzima
de la invención puede proceder no solo de T. harzianum CECT
2413 sino de cualquier otra cepa de Trichoderma o de un
organismo hospedador transformado con dicha secuencia de ADN.
Alternativamente, la secuencia de ADN que
codifica para la enzima de la invención, puede ser aislada,
mediante técnicas convencionales, a partir del ADN de cualquier
organismo mediante el empleo de sondas o de oligonucleótidos
preparados a partir de la información sobre la secuencia de ADN
proporcionada en esta descripción, o mediante iniciadores (por
PCR).
La secuencia de ADN que codifica para la enzima
de la invención, o la construcción que la contiene, puede ser
insertada en un vector apropiado. Por tanto, la invención también
se refiere a un vector, tal como un vector de expresión, que
comprende dicha secuencia de ADN, o una construcción que la
contiene. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora
en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el
vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un
plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula
hospedadora, se integra en el genoma de dicha células y se replica
junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (en los que) se ha
integrado.
En el vector proporcionado por esta invención, la
secuencia de ADN que codifica para la enzima de la invención debe
estar conectada operativamente a un promotor y a una secuencia
terminadora. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que
muestra una actividad transcripcional en la célula hospedadora
elegida y puede derivar bien de genes que codifican para proteínas
homólogas o heterólogas de la célula hospedadora. Los
procedimientos utilizados para ligar la secuencia de ADN que
codifica para la enzima de la invención al promotor y a la
secuencia terminadora, respectivamente, y para insertar dicha
construcción en un vector son bien conocidos por los técnicos en la
materia y han sido descritos, por ejemplo, por Sambrook et al.
[Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY,
1989].
La invención también proporciona una célula que
comprende una secuencia de ADN que codifica para la enzima de la
invención, o una construcción de ADN que contiene a dicha secuencia
o dicho vector mencionado más arriba. Las células hospedadoras que
se pueden transformar con la secuencia de ADN que codifica para la
enzima de la invención pueden ser células procarióticas o,
preferentemente, células eucarióticas, tales como células de
tejidos vegetales o células fúngicas, por ejemplo, células de
levadura o de hongos filamentosos. La transformación de estas
células puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales, por
ejemplo, mediante técnicas que implican la formación de
protoplastos y la transformación de los mismos seguido de la
regeneración de la pared celular. La transformación de células de
tejidos vegetales puede ser muy interesante desde diversos puntos
de vista, por ejemplo, para aumentar la resistencia a hongos
fitopatógenos.
La invención también proporciona un método para
la producción de una enzima de la invención, que comprende cultivar
una célula hospedadora adecuada que contiene la secuencia de ADN
que codifica para la enzima de la invención bajo condiciones que
permiten la producción de la enzima y recuperar la enzima del medio
de cultivo.
El medio utilizado para cultivar las células
hospedadoras transformadas puede ser cualquier medio adecuado para
cultivar las células hospedadoras en cuestión. La
\beta-(1,6)-glucanasa expresada puede ser,
ventajosamente, secretada al medio de cultivo y puede ser
recuperada mediante un procedimiento como el descrito en el
Ejemplo 3 o por cualquier otro procedimiento convencional de
aislamiento de proteínas que comprende la separación de las células
del medio de cultivo, la precipitación de las proteínas y la
separación por métodos cromatográficos.
La invención también proporciona una preparación
enzimática útil para la degradación o modificación de materiales
que contienen \beta-(1,6)-glucano, por ejemplo,
el material de la pared celular microbiana, que comprende, al
menos, una enzima con actividad
\beta-(1,6)-glucanasa de la invención. Dicha
preparación enzimática puede contener entre 0,01% y 100% en peso de
dicha enzima con actividad \beta-(1,6)-glucanasa
de la invención.
En una realización particular, la preparación
enzimática proporcionada por esta invención es una preparación
enzimática de componente único y contiene mayoritariamente una o
más de las enzimas con actividad
\beta-(1,6)-glucanasa de la invención.
En otra realización particular, la preparación
enzimática proporcionada por esta invención comprende múltiples
actividades enzimáticas, por ejemplo, diferentes actividades
enzimáticas requeridas para la modificación o degradación de
paredes celulares microbianas. A modo de ejemplo, dicha preparación
enzimática puede incluir enzimas líticas, en particular de origen
microbiano (fúngico o bacteriano), por ejemplo, derivadas de
diversas especies de los géneros Trichoderma, Oerskovia,
Arthrobacter, Rhizotocnia, Staphylococcus o Streptomyces.
También puede contener una o más enzimas capaces de modificar o
degradar paredes celulares, por ejemplo, enzimas con actividad
celulolítica, mananolítica, quitinolítica o proteolítica, tales
como celulasas, otras \beta-(1,6)-glucanasas,
\beta-(1,3-glucanasas, mananasas, endo- o exo-
quitinasas, quitosanasas, proteasas, \alpha- o
\beta-manosidasas, mutanasas, etc. Estas enzimas
pueden proceder de cualquier organismo productor de las mismas,
tales como diversas especies del género Aspergillus o los
mencionados más arriba en relación con las enzimas líticas.
La preparación enzimática de la invención puede
prepararse por métodos convencionales y puede presentarse en forma
líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un granulado. La
preparación enzimática puede contener aditivos, por ejemplo,
estabilizantes que prolonguen la estabilidad de la misma.
La invención proporciona, además, una composición
antifúngica que comprende, al menos, una enzima de la invención
junto con, al menos, un fungicida químico. Como fungicida químico
puede utilizarse cualquiera de los usados habitualmente,
preferentemente, un fungicida químico seleccionado del grupo
formado por los fungicidas químicos que afectan a la membrana, los
fungicidas químicos que afectan a la síntesis de la pared celular y
sus mezclas. Opcionalmente, la composición antifúngica de la
invención puede contener, además, al menos, una proteína con
actividad enzimática degradadora de la pared celular microbiana.
Cualquier enzima con actividad degradadora de la pared celular
microbiana puede utilizarse, si se desea, en la composición
antifúngica de la invención.
La composición antifúngica de la invención, que
puede contener entre 0,01% y 99,99% en peso de la enzima de la
invención, puede prepararse por métodos convencionales y puede
presentarse en forma líquida o sólida, por ejemplo, en forma de un
granulado. La composición antifúngica de la invención también puede
contener aditivos, por ejemplo, estabilizantes con el fin de
prolongar la estabilidad de la misma.
La enzima de la invención puede ser utilizada
para degradar o modificar materiales que contienen
\beta-(1,6)-glucano, por ejemplo, las paredes
celulares microbianas. En una realización particular preferida, la
enzima de la invención puede ser utilizada como biofungicida frente
a diversos organismos perniciosos, por ejemplo, frente a hongos
fitopatógenos, hongos que causen daños en cultivos, hongos
patógenos de animales, incluido el hombre, por ejemplo
Candida spp., responsable de candidiasis en humanos y
animales, hongos contaminantes de alimentos, etc.
La enzima de la invención también puede
utilizarse para romper o lisar las paredes celulares de diversos
microorganismos para recuperar productos de interés producidos por
dichos microorganismos. En este sentido, cabe destacar que la
BGN16.1 es aproximadamente unas 10 veces más efectiva en la ruptura
o lisis de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae que
la enzima descrita en la patente norteamericana US 5.770.406.
La preparación enzimática de la invención puede
diseñarse a voluntad con una composición específicamente adaptada
para la pared celular a romper o lisar. Por ejemplo, si la pared
celular a romper contiene un complejo
proteína-manano y un glucano, la preparación
enzimática podría contener, ventajosamente, una mezcla de
actividades proteasa, mananasa, quitinasa y \beta- glucanasa, con
el fin de romper de forma eficiente dicha pared celular.
Otras aplicaciones de la enzima de la invención
incluyen, a modo ilustrativo, no limitativo, la extracción de
manoproteínas de la capa externa de las paredes celulares de
levadura; la producción de protoplastos a partir de levaduras u
hongos; la preparación de extractos de levaduras y hongos; la
mejora de las operaciones de filtración en procesos para la
producción de vinos, mostos y zumos; la elaboración de vinos con
propiedades organolépticas alteradas mediante la sobreexpresión del
gen en las levaduras vínicas; la elaboración de composiciones para
la limpieza de dientes y dentaduras; la elaboración de
composiciones para la limpieza de lentes de contacto; la
eliminación de hongos sobre recubrimientos; el tratamiento de
tejidos, por ejemplo, la retirada del exceso de colorante en los
tejidos; la elaboración de composiciones para retirar la placa
dental; la elaboración de composiciones para retirar películas
biológicas (biofilms) depositadas en superficies, por ejemplo en la
superficie de una lente de contacto.
La enzima o la preparación enzimática
proporcionadas por esta invención pueden utilizarse en el control
de organismos perniciosos, por ejemplo, hongos, patógenos de
plantas, animales, incluido el hombre, o contaminantes de cosechas
y alimentos. En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "controlar" incluye la reducción o paralización del
crecimiento y/o de la germinación que puede resultar en la
eliminación de dichos organismos perniciosos o en la disminución de
los daños causados por éstos.
La composición antifúngica de la invención puede
ser usada para controlar todo tipo de hongos perniciosos, por
ejemplo, patógenos de plantas, animales, incluido el hombre, o
contaminantes de cosechas y alimentos, mediante el mecanismo de
lucha conocido como control integrado.
La dosificación de la preparación enzimática y de
la composición antifúngica proporcionadas por esta invención y sus
condiciones de uso pueden ser determinados en base a los métodos
conocidos en la técnica.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
presente invención y no deben ser considerados como limitativos del
alcance de la misma.
T. harzianum CECT 2413 se obtuvo de la
Colección Española de Cultivos Tipo, CECT (Valencia, España) y se
mantuvo en un medio de cultivo PPG (puré de patata + glucosa, ambos
al 2%), suplementado con agar al 2%.
Para la producción y purificación de la enzima
BGN16.3, así como para la producción de la genoteca de ADNc, se
cultivó T. harzianum en dos etapas siguiendo protocolos ya
descritos por De la Cruz et al. [J. Bacteriol., 1995, Vol. 177, No.
7, 1864- 1871].
Brevemente, para la producción de BGN16.3, en una
primera etapa se inoculan esporas de T. harzianum a una
concentración final de 10^{8} esporas/ml en medio Czapek
[MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g/l; FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,01
g/l; KCl 0,425 g/l; MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,115 g/l;
NH_{4}Cl, 2,1 g/l; NaH_{2}PO_{4}, 0,92 g/l] como medio de
preinducción y sin añadir quitina al medio de inducción ya que la
BGN16.3 tiene la peculiaridad de que no es inducida por quitina (o
al menos en cantidades detectables) sino por paredes celulares de
hongos o en ausencia de fuente de carbono. En este medio de
preinducción se cultiva T. harzianum durante 48 horas a 28°C
y con agitación orbital a 200 rpm. Posteriormente, se recoge el
micelio, se lava y se transfiere a un medio de inducción bien en
presencia de paredes celulares de hongos o bien en ausencia de
fuente de carbono.
La actividad
\beta-(1,6)-glucanasa se determina mediante un
ensayo que consiste en preparar una mezcla de ensayo conteniendo
0,8 ml de solución de pustulano
[\beta-(1,6)-glucano] al 0,5% (p/v) en tampón
acetato potásico 50 mM, pH 5,5, y 0,2 ml de la solución enzimática
apropiadamente diluida en el mismo tampón. La mezcla de reacción se
incuba a 37°C durante un periodo de tiempo comprendido entre 30
minutos y 1 hora, deteniendo la reacción calentándola a 100°C
durante 7 minutos. Posteriormente se determina el incremento de
azúcares reductores en 0,15 ml de mezcla de reacción por el método
de Somogyi [J. Biol. Chem., 1952, 195, 19-23] y
Nelson [Methods Enzymol., 1957, 3, 85-86], usando
como patrón glucosa a concentraciones comprendidas entre 0 y 1
mg/ml. Se incluyen blancos de enzima y de sustrato.
Se define 1 unidad de actividad
\beta-(1,6)-glucanasa como la cantidad de enzima
que libera 1 \mumol de equivalentes de azúcares reductores,
expresados como glucosa, por minuto, bajo las condiciones
ensayadas.
La concentración de proteína se determina
mediante el método de Bradford [Anal. Biochem., 1976, 72,
248-254].
Para la purificación de la enzima BGN16.3 se
siguió un procedimiento constituido por las siguientes etapas:
Esta etapa, al igual que todas las demás (salvo
que se indique lo contrario) se realizó a 4°C. Cultivos de T.
harzianum incubados durante 48 horas en medio Czapek
suplementado con paredes celulares de Botrytis al 0,1% se
filtraron a través de papel Whatman n° 1 y se centrifugaron a 6.000
g durante 10, minutos. A continuación, el sobrenadante (unos 200
ml) se precipitó con sulfato amónico al 80% de saturación. Tras una
noche de incubación, el precipitado se recuperó centrifugando a
12.000 g durante 20 minutos, se resuspendió en el menor volumen
posible de agua destilada y se dializó frente a tampón acetato
potásico 50 mM, pH 5,5.
Para la adsorción a pustulano (Umbilicaria
papullosa, Calbiochem) se incuban alícuotas de 3 ml de
sobrenadante dializado con 0,6 ml de pustulano particulado con
etanol siguiendo el procedimiento descrito por De la Cruz et al. [J.
Bacteriol., 1995, Vol. 177, No. 7, 1864-1871]. La
incubación se realiza durante 20 minutos con agitación magnética y
posteriormente se centrifuga a 12.000 g durante 10 minutos. El
sobrenadante (la fracción no adsorbida a pustulano) se vuelve a
incubar con pustulano (este proceso se repite dos veces más). Los
precipitados obtenidos tras las sucesivas adsorciones se lavan tres
veces con 3 ml de una solución de NaCl 1 M en tampón
fosfato-KOH 70 mM, pH 6,0 y, finalmente, se
resuspende en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5 con fluoruro de
fenilmetil- sulfonilo 1 mM y azida sódica 1 mM. Estas muestras se
incuban durante toda la noche a 37°C. La fracción clarificada fruto
de la degradación del pustulano se centrifuga a 12.000 g durante
10 minutos. El sobrenadante (5-10 ml) se dializa
nuevamente frente a tampón imidazol-HCl 25 mM, pH
7,4.
La solución dializada procedente de la etapa b)
se somete a cromatoenfoque. Para ello se utiliza una columna de
vidrio calibrada, modelo C10/20 (1 cm de diámetro y 20 cm de
altura) de Pharmacia (Suecia), que contiene un lecho de 18 ml de
Polybuffer Exchanger 94 de la misma marca, limitado en su parte
superior por 1 ml de Sephadex G-25 (Pharmacia) y un
émbolo AC 10 y se empaqueta siguiendo el procedimiento descrito por
el fabricante. La cromatografía se desarrolla a 4°C. La columna se
equilibra con 20 volúmenes de tampón imidazol-HCl.
Como eluyente se usó Polybuffer 74 (Pharmacia) diluido en agua en
una proporción 1:8. La solución se desgasificó previamente y el pH
se ajustó a 4,0. Se aplicó un flujo de 9 ml/h por medio de una
bomba peristáltica LKB 10200 conectada a la salida de la columna y
se recogieron fracciones de aproximadamente 1,5 ml mediante un
colector automático Pharmacia modelo Frac-100.
Después de medir el pH de las distintas fracciones, se ensayó la
actividad \beta-1,6-glucanasa.
Las fracciones que presentaron mayor actividad se concentraron
hasta 0,5 ml aproximadamente con un concentrador Centricon 10
(Amicon, Beverley, Mass.).
La purificación de la BGN16.3 se realizó por
filtración en gel en un FPLC con una columna Protein Pack 125
(Waters). Después de introducir la muestra se aplicó una solución
de KCl 0,1 M en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5, a un flujo
de 0,2 ml/min. Se recogieron fracciones cada 60 segundos (0,2
ml/fracción). La aparición de la proteína se monitorizó mediante un
detector de absorbancia ajustado a 280 nm.
El peso molecular de la enzima BGN16.3 se
determinó por electroforesis analítica en condiciones
desnaturalizantes. La electroforesis de la enzima BGN16.3 en
condiciones desnaturalizantes [electroforesis en gel de
poliacrilamida tratado con dodecilsulfato sódico,
SDS-PAGE] se realizó según el procedimiento
descrito por Weber y Osborn (1975) [The Proteins (Vol. 1), págs.
179-221, Neurath y Hill (eds.), Academic Press,
Inc., New York], usando geles al 12% de
acrilamida-bisacrilamida y un aparato
Mini-Protean II de Bio-Rad (EEUU) y
siguiendo las instrucciones del fabricante. El peso molecular
aparente de la enzima BGN16.3, en las condiciones ensayadas, es de
47,5 kDa.
Para determinar el punto isoeléctrico (pI) de la
enzima BGN16.3 se han empleado técnicas de isoelectroenfoque (IEE)
y de cromatoenfoque (CE).
El isoelectroenfoque se realizó siguiendo el
procedimiento descrito por Robertson et al. [Anal. Biochem., 1987,
167, 290-294]. Las proteínas se visualizaron
mediante tinción con azul de Coomassie. El valor del pi aparente
para la enzima BGN16.3 se calculó por referencia a proteínas
marcadoras convencionales con valores de pI comprendidos entre 3,5
y 9,3 (Amersham- Pharmacia). El valor de pi aparente calculado
mediante isoelectroenfoque fue de 4,5 para la BGN16.3.
Mediante cromatoenfoque ácido se calculó un pI de
4,1 para la BGN16.3.
Para conocer la estabilidad de la enzima BGN16.3
purificada frente a la temperatura se incubó dicha enzima
purificada durante 30 minutos a temperaturas comprendidas entre
20°C y 80°C en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5, y, a
continuación, se midió la actividad remanente a 37°C añadiendo
pustulano (5 mg/ml) como sustrato de ensayo. La temperatura de
inactivación, que se define como la temperatura en la que la
actividad específica se reduce un 50% en las condiciones descritas,
es de 50°C para la BNG16.3.
La temperatura óptima de la enzima BGN16.3 se
determinó mediante ensayos convencionales en los que se valoró la
actividad enzimática en un intervalo de temperaturas comprendido
entre 20°C y 80°C. La temperatura óptima obtenida fue de 50°C, a pH
5,5.
Para estudiar la especificidad para diferentes
sustratos de la enzima BGN16.3 purificada se ha ensayado su
actividad enzimática frente a diversos sustratos que tenían enlaces
\alpha- o \beta-glicosídicos a una
concentración de 5 mg/ml. Cuando se utilizaron glucanos, los
productos de reacción se determinaron mediante los ensayos
convencionales descritos previamente. Las actividades quitinasa y
quitosanasa se determinaron mediante el procedimiento descrito por
De la Cruz [Eur. J. Biochem., 1992, 206,
856-867].
La hidrólisis de los sustratos mediante la enzima
BGN16.3 purificada se realizó incubando 4 mg de pustulano o 2 mg de
gentibiosa (un
\beta-1,6-disacárido) con 2 \mug
de proteína purificada en 1 ml de agua destilada a diferentes
tiempos a 37°C. Se incluyeron blancos de sustrato en paralelo.
Después de la hidrólisis, las reacciones se pararon calentándolas a
100°C durante 5 minutos y los oligómeros de pustulano se analizaron
mediante cromatografía líquida de alta presión [HPLC] utilizando
una columna HPX 42-A mantenida a 60°C. Se utilizó
agua como eluyente a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min. Los
productos se detectaron en base a su absorbancia a 195 nm y se
identificaron por comparación con patrones de glucosa, gentibiosa
y oligosacáridos de celulosa (velocidad de oligomerización de 2 a
5).
La Tabla 2 recoge los distintos sustratos
ensayados y muestra los resultados obtenidos en porcentaje respecto
al máximo de actividad alcanzado en cada caso.
Sustratos | Enlace principal | BGN16.3 |
Laminarina | \beta-1,3:\beta-1,6(Glc) | 8 |
Paquiman | \beta-1,3(Glc) | 0 |
Pustulano | \beta-1,6(Glc) | 100 |
Glucano (S. cerevisiae) | \beta-1,3:\beta-1,6(Glc) | 18 |
Carboximetilcelulosa | \beta-1,4(Glc) | 0 |
Quitina coloidal | \beta-1,4(GlcNAc) | 0 |
Glicol-quitosano | \beta-1,4(GlcN) | NR |
Nigeran | \alpha-1,3:\alpha-1,4(Glc) | 0 |
Almidón soluble | \alpha-1,4:\alpha-1,6(Glc) | 0 |
Dextrano | \alpha-1,6(Glc) | NR |
[NR: No realizado] |
El pustulano (de Umbilicaria papullosa) y
el paquiman (de Porfia cocos) eran de Calbiochem (La Jolla,
CA). La carboximetil-celulosa, la quitina (de
conchas de cangrejo), el dextrano (de Leuconostoc
mesenteroides), el glicol-quitosano, la
laminarina (de Laminarla digitata), el nigeran (de Aspergillus
nidulans) y el almidón soluble fueron adquiridos a Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO). El glucano de levadura se prepara a
partir de levadura de panadería según la metodología descrita por
Rombouts y Phaff [Eur. J. Biochem., 1976, 63,
109-120].
Como puede apreciarse, la actividad de la enzima
BGN16.3 es específica de su sustrato (pustulano)
[\beta-1,6-glucano], actúa en
mucha menor medida sobre el glucano de levadura
[\beta-1,3:\beta-1,6 glucano
(4:1)] y muestra una actividad muy reducida frente a la laminarina,
un polisacárido formado fundamentalmente por \beta-
(1,3)-glucano que posee un 15% aproximadamente de
enlaces tipo \beta-(1,6)-glucosídicos que serían
los que se hidrolizarían. No se detectó actividad con los otros
sustratos ensayados.
Para estudiar la afinidad de la enzima BGN16.3
para sus sustratos, se realizaron ensayos usando diferentes
concentraciones de pustulano. La constante de
Michaelis-Menten (Km) se determinó según la
representación de Lineweaver-Burk a partir de los
datos obtenidos midiendo la velocidad inicial de la hidrólisis de
pustulano y utilizando un intervalo de concentraciones de pustulano
de 20 a 0,5 mg/ml. Las velocidades iniciales de hidrólisis de
pustulano se calcularon midiendo la actividad bajo las condiciones
de ensayo descritas antes a diferentes tiempos de 0 a 30
minutos.
Los resultados obtenidos fueron:
- -
- Km: 1,1 mg de pustulano/ml
- -
- Vmax: 391 \mumol de producto/minuto\cdotmg de BGN16.3
Se ha estudiado la capacidad que posee la enzima
BGN16.3 purificada para degradar paredes celulares de distintos
hongos. Para ello, se incubó la enzima purificada (0,5 U) con 4 mg
de paredes celulares liofilizadas de diferentes hongos en 1 ml de
ensayo en tampón acetato potásico 50 mM, pH 5,5.
Los hongos ensayados fueron Botrytis
cinerea CECT 2100, Giberella fujikuroi IMI 58289,
Phytophthora syringae CECT 2351 y Saccharomyces
cerevisae (levadura de panadería La Cinta Roja®, España). Las
mezclas se incubaron a 37°C durante 16 horas con agitación
ocasional. Las reacciones se pararon mediante centrifugación
(10.000 x g, 10 minutos) y la cantidad de azúcares reductores
liberados en los sobrenadantes se determinó mediante el método
descrito por Somogyi [J. Biol. Chem., 1952, 195,
19-23] y Nelson [Methods Enzymol., 1957, 3,
85-86]. Se incluyen blancos de enzima y de
sustrato. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3 y
ponen de manifiesto que la enzima BGN16.3 no ejerce actividad
enzimática sobre ninguna de las paredes celulares ensayadas.
Paredes celulares | BGN16.3 (%) |
B. cinerea CECT 2100 | 0 |
G. fujikuroi IMI 58289 | 0 |
P. syringae CECT 2351 | 0 |
S. cerevisae | 0 |
Para determinar la actividad antifúngica de la
enzima BGN16.3 se realizó el siguiente ensayo. En un pocillo de una
microplaca se crecen 3.000 esporas de Penicillium digitatum
en PDA (Patata Dextrosa Agar, Difco) diluido tres veces respecto a
la concentración recomendada por el fabricante, junto con la enzima
cuyo efecto antifúngico quiere observarse. Se mantiene 18 horas a
25°C y posteriormente se observa al microscopio. Como control
negativo se realiza un ensayo sólo con PDB y esporas. Se analiza
tanto la inhibición de la germinación de las esporas como la
disminución del tamaño de las hifas de Penicillium
digitatum.
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que
la enzima BGN16.3, a una concentración de 70 \mug/ml, produce una
reducción del tamaño de las hifas del 50% respecto del control, no
observándose efecto de inhibición de la germinación de las
esporas.
En la Figura 1A se muestra el efecto antifúngico
producido por la enzima BGN16.3, a una concentración de 70
\mug/ml (70 ppm), sobre 3.000 esporas de Penicillium
digitatum tras 18 horas de incubación. En la Figura 1B se
muestra el resultado de un control negativo que contenía únicamente
PDA y esporas. La Figura 1 pone de manifiesto claramente la
reducción del tamaño de las hifas de Penicillium digitatum
debido a la acción antifúngica de la enzima BGN16.3.
Para obtener el clon completo de cDNA de la
enzima BGN16.3 se siguió una estrategia que comprendía el empleo de
PCR. Para ello, se diseñaron oligonucleótidos degenerados a partir
de la microsecuenciación del extremo amino y de péptidos trípticos
de la enzima BGN16.3.
Para el diseño del oligonucleótido directo se
utilizó la secuencia del extremo amino de la enzima BGN16.3
mientras que para el diseño del oligonucleótido inverso se utilizó
la secuencia del péptido interno (fragmento tríptico).
Con dichos oligonucleótidos y bajo las
condiciones experimentales que se describen más adelante [véase el
Ejemplo 12.5] se obtuvo una banda específica de la secuencia
codificante para la enzima BGN16.3 que se subclonó en un vector
pGEM-T. La secuenciación de la banda amplificada
confirmó que se trataba de un fragmento del clon buscado. A
continuación, los fragmentos obtenidos por PCR se marcaron
radiactivamente y se utilizaron como sonda para escrutar una
genoteca de ADNc de T. harzianum CECT 2413. Del total de
clones escrutados se obtuvieron unos clones positivos, cuyos
análisis pusieron de manifiesto que portaban unos insertos que
englobaban completamente la ORF y algo de las secuencias
flanqueantes de las regiones promotora y terminadora.
El ADNg de Trichoderma harzianum CECT 2413
se obtuvo según el protocolo descrito por Kaiser et al. (1994)
[Methods in yeast genetics. A Cold Spring Harbour Laboratory Press,
Cold Spring Harbour, New York], con algunas modificaciones,
incluyendo la adición de un paso de purificación con fenol.
Brevemente, 0,3- 0,5 g de micelio liofilizado se resuspende en
Tris-HCl 50 mM y EDTA 20 mM, se homogeniza y se
añaden 200 ml de dodecilsulfato sódico (SDS) al 10%. A
continuación, se incuba a 65°C durante 30 minutos, se añade acetato
sódico y se incuba otros 30 minutos a 4°C. Finalmente se centrifuga
y el sobrenadante se trata con fenol y se precipita con etanol.
El ARN total de T. harzianum CECT 2413 se
extrajo utilizando el método del fenol ácido descrito por
Chomczynski y Sacchi (1987) [Single-step method of
RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform
extraction. Anal. Biochem. 162:156] con ligeras modificaciones.
A partir del ARN total de T. harzianum
CECT 2413, obtenido tras cultivar dicho hongo en MM con paredes
celulares de Botrytis al 0,5% como fuente de carbono durante
9 horas, se aisló el ARNm. Para ello se utilizó una cromatografía
de afinidad a oligo(dT)celulosa (Stratagene, La
Jolla, CA). A continuación, se sintetizó el ADNc empleando el kit
comercial "ZAP-cDNA synthesis kit"
(Stratagene). Al ADNc así obtenido se le unieron los adaptadores
Eco RI y Xho I y se ligó al vector Uni-Zap XR
(Stratagene). Finalmente, para empaquetar el ADNc ligado al fago
\lambda se empleó el kit de empaquetamiento "Gigapack III gold
packaging extract" (Stratagene), siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Para determinar el extremo amino de la enzima
BGN16.3, así como para obtener fragmentos internos que permitieran
la clonación del gen correspondiente, se realizó la
microsecuenciación siguiendo el método de Edmans Matsudaira [A
practical guide to protein and peptide purification for
microsequencing. Academic Press, Inc., New York, Edmans Matsudaira
(eds.) 1989].
Los resultados obtenidos fueron los
siguientes:
Extremo amino: AAGAQAYASNQAGN [SEC. ID. N°:
3]
Péptido interno: GLNSNLQIFGSPW [SEC. ID. N°:
4]
Para los experimentos de PCR se diseñaron
oligonucleótidos degenerados a partir de las secuencias parciales
de la enzima BGN16.3. En este caso, los oligonucleótidos directo e
inverso fueron los siguientes:
directo:
5'-GCTGGNGCNCARGCNTAYGC-3' [SEC. ID.
N°: 5]
inverso:
5'-CCANGGNCTNCCRAANATYTG-3' [SEC.
ID. N°: 6]
donde
N es inosina;
Y es T o C;
R es G o A; y
D es A o G o T
Para la realización de la PCR se emplearon las
siguientes condiciones:
- -
- 1 ciclo de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto, seguido de
- -
- 35 ciclos de síntesis compuestos por:
- -
- una fase de hibridación a 50°C durante 1 minuto,
- -
- una fase de elongación a 72°C durante 1 minuto, y
- -
- una fase de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto; y finalmente
- -
- 1 ciclo de elongación adicional de 7 minutos a 72°C para completar los productos inacabados.
La PCR se realizó utilizando ADNg como molde y
empleando 100 pmoles de cada oligonucleótido, para un volumen total
de PCR de 25 \mul.
El escrutinio de la genoteca de ADNc se realizó
siguiendo procedimientos convencionales descritos por Sambrook et
al. [Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
NY, 1989], empleando sondas marcadas radiactivamente con
\alpha^{32}P-dCTP siguiendo el método de
cebadores al azar descrito por Feingerg y Vogelstein (1983) en
Anal. Biochem., 132:6. Para ello, se utilizó el kit comercial
"Oligolabelling kit" [Pharmacia, Suecia] y se siguieron las
instrucciones del fabricante.
Para el diseño del oligonucleótido directo se
utilizó la secuencia del extremo amino de la BGN16.3 [SEC. ID. N°:
3] y para el diseño del oligonucleótido inverso se utilizó la
secuencia de un péptido interno [SEC. ID. N°: 4].
Con dichos oligonucleótidos y bajo las
condiciones experimentales previamente descritas [véase el Ejemplo
12.5] se obtuvo una banda específica de 450 nucleótidos que se
subclonó en el vector comercial pGEM-T (Promega,
WI). Posteriormente, la secuenciación de esta banda confirmó que se
trataba de un fragmento del clon buscado. A continuación, el
fragmento obtenido por PCR se marcó radiactivamente y se utilizó
como sonda para escrutar una genoteca de \lambda Zap construida a
partir de ARN extraído de T. harzianum CECT 2413 tras 48
horas de inducción en MM con paredes de Botrytis. De unos
400.000 clones escrutados se obtuvieron 2 clones positivos,
identificados como ZBgn3.I y ZBgn3.II. Para el análisis de tales
clones, en primer lugar se escindió el fago siguiendo las
instrucciones del fabricante, y el fagémido así obtenido se
secuenció por ambas cadenas. En los dos casos los vectores eran
portadores de un inserto de 1,7 kpb que englobaba completamente la
ORF y algo de la secuencia flanqueante de la región promotora y
terminadora.
<110> Newbiotechnic, S.A.
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Universidad de Salamanca
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Universidad de Sevilla
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Enzima con actividad
\beta-(1,6)-endoglucanasa
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 490
\vskip0.400000\baselineskip
<212> aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220> proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<240>
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1.696
\vskip0.400000\baselineskip
<212> nucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220> AND genómico
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220> péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<240> fragmento
N-terminal
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Gly Ala Gln Ala Tyr Ala Ser Asn Gln
Ala Gly Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> aminoácidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220> péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<240> fragmento interno
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Asn Ser Asn Leu Gln Ile Phe Gly Ser
Pro Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> nucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGGNGCNC ARGCNTAYGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
[N = Inosina]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> nucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCANGGNCTN CCRAANATYT G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
[N = Inosina]
Claims (31)
1. Una enzima con actividad
\beta-(1,6)-endoglucanasa caracterizada
porque tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
- a)
- la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1, y
- b)
- una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga y funcionalmente equivalente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC. ID. N°: 1.
2. Enzima según la reivindicación 1,
caracterizada porque tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC. ID. N°: 1.
3. Enzima según la reivindicación 2,
caracterizada porque tiene un peso molecular aparente
determinado en condiciones desnaturalizantes de 46 kDa
aproximadamente.
4. Enzima según la reivindicación 2,
caracterizada porque tiene un punto isoeléctrico aparente de
4,1, determinado por isoelectroenfoque.
5. Una secuencia de ADN aislado que comprende una
secuencia de ADN que codifica para una enzima según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, o para un fragmento funcionalmente
equivalente de dicha enzima.
6. Secuencia de ADN según la reivindicación 5,
caracterizada porque tiene una secuencia de nucleótidos
seleccionada entre:
- a)
- la SEC. ID. N°: 2, y
- b)
- una secuencia de ADN análoga a la secuencia definida en a) que
- (i)
- es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN definida en a); y/o
- (ii)
- codifica para un polipéptido que es sustancialmente homólogo a la proteína codificada por la secuencia de ADN definida en a).
7. Un vector recombinante caracterizado
porque contiene una secuencia de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6.
8. Una célula caracterizada porque
contiene una secuencia de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6, o un vector según la reivindicación 7.
9. Un método para la producción de una enzima
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende
cultivar una célula según la reivindicación 8 bajo condiciones que
permiten la producción de la enzima y recuperar la enzima del medio
de cultivo.
10. Una preparación enzimática útil para la
degradación o modificación de materiales que contienen
\beta-(1,6)-glucano, que comprende, al menos, una
enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
11. Preparación enzimática según la
reivindicación 10, que comprende entre 0,01% y 100% en peso de una
enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
12. Preparación enzimática según la
reivindicación 10, que contiene como único componente una enzima
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
13. Preparación enzimática según la
reivindicación 10, que contiene más de una enzima según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4.
14. Preparación enzimática según la
reivindicación 10, que comprende, además, al menos una enzima
seleccionada del grupo formado por celulasas, glucanasas, mananasas,
quitinasas, proteasas y/o quitosanasas.
15. Una composición antifúngica que comprende, al
menos, una enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4
junto con, al menos, un fungicida químico.
16. Composición según la reivindicación 15, en la
que dicho fungicida químico se selecciona del grupo formado por un
fungicida químico que afecta a la membrana, un fungicida químico
que afecta a la síntesis de la pared celular y sus mezclas.
\newpage
17. Composición según la reivindicación 15, que
comprende, además, al menos, una proteína con actividad enzimática
degradadora de la pared celular microbiana.
18. Empleo de una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, o de una preparación enzimática según
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, o de una composición
antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, para
degradar o modificar ex vivo materiales que contienen
\beta-(1,6)-glucano.
19. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicho material que contiene \beta-(1,6)-glucano
es una pared celular microbiana.
20. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza para la preparación de protoplastos.
21. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza para la preparación de extractos de levaduras.
22. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza en la extracción de manoproteínas.
23. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza en la producción de vinos, mostos y zumos.
24. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza en la elaboración de composiciones para retirar la placa
dental.
25. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza en la elaboración de composiciones para la limpieza de
dientes y dentaduras.
26. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza en la elaboración de composiciones para retirar películas
biológicas (biofilms) depositadas en superficies.
27. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza en la elaboración de composiciones para la limpieza de
lentes de contacto.
28. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza en la eliminación de hongos sobre recubrimientos.
29. Empleo según la reivindicación 18, en el que
dicha enzima, preparación enzimática o composición antifúngica se
utiliza para tratar tejidos.
30. Método para controlar hongos perniciosos
seleccionados entre hongos patógenos de plantas, hongos
contaminantes de cosechas y hongos contaminantes de alimentos, que
comprende poner en contacto dichos hongos con una enzima según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o con una preparación
enzimática según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, o con
una composición antifúngica según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17.
31. Empleo de una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, o de una preparación enzimática según
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, o de una composición
antifúngica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en la
elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de
enfermedades causadas por hongos patógenos de animales, incluido el
hombre.
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Non-Patent Citations (3)
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DE LA CRUZ, J. et al. "Purification and characterization of an endo-beta-1,6-glucanase from Trichoderma harzianum that is related to its mycoparasitism", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 1995, Vol. 177, nº 7, páginas 1864-1871. Todo el documento. * |
LORA, I.M. et al. "Molecular characterization and heterologous expression of an endo-beta-1,6-glucanase gene from the mycoparasitic fungus Trichoderma harzianum", MOL. GEN. GENET., 1995, Vol. 247, páginas 639-645. Todo el documento. * |
SOLER, A. et al. "Detection of 1,6-glucanase isozymes from Trichoderma strains in Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectrofocusing gels", JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS, 1999, Vol. 35, páginas 245-251. Todo el documento. * |
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