ES2138965T5 - Modificacion de la produccion de almidon. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONA UN PROCESO POR MEDIO DEL CUAL SE ALTERA LA CONSTITUCION DEL ALMIDON PRODUCIDO EN UNA PLANTA SIN QUE HAYA UN CAMBIO SUBSTANCIAL EN LA CANTIDAD TOTAL DEL ALMIDON QUE SE PRODUCE. EN EL PROCESO, SE TRANSFORMA UNA CELULA DE PLANTA UTILIZANDO UN GEN QUIMERICO QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE CODIFICACION ANTISENTIDO DESDE LA POSICION CEROSA DE UN GENOMA DE PLANTA O UNA SECUENCIA DE CODIFICACION SIMILAR ANTISENTIDO A PARTIR DE UN GENOMA QUE NO PROVIENE DE UNA PLANTA.

Description

Modificación de la producción de almidón.

La presente invención se refiere al procedimiento de producción de almidón en plantas.

Un objeto de la invención es llevar a cabo un cambio en la naturaleza del almidón producido en una planta sin reducir, o sin reducir sustancialmente, la cantidad de almidón que la planta produce. El almidón se utiliza en las industrias alimentaria, química, papelera y textil. En estas industrias, la naturaleza de un almidón afecta su idoneidad para ser utilizado en un procedimiento concreto.

Se ha descrito que plantas de patata han sido transformadas para producir RNA antisentido a partir de una construcción génica que contenía DNA de almidón-sintasa en orientación inversa, y que esto produjo tubérculos que contenían almidón exento de amilosa. Véase "Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs", R.G.F. Visser et al., Mol. Gen. Genet. (1991), 225:289-296.

En la forma mutante del maíz conocida como maíz céreo, se suprime el proceso para producir amilosa, y por tanto la cantidad total de almidón que se produce es menor que en el caso del maíz que contiene el gen céreo.

La presente invención suministra un procedimiento según la reivindicación 1.

Por "secuencia codificante procedente del locus céreo" se quiere dar a entender una secuencia no mutada, no una secuencia del gen céreo mutante o procedente de éste. La secuencia puede ser la secuencia completa o una parte o partes operables de la misma.

Como resultado de llevar a cabo la presente invención se reduce la actividad enzimática de la almidón-sintasa. En este caso, podría esperarse que la cantidad total de almidón se vería reducida. Sorprendentemente, no existe una reducción aparente en la cantidad total de almidón cuando la invención se lleva a cabo.

El promotor debe ser tal que provoque que la reducción en la actividad de la almidón-sintasa se lleve a cabo en la principal localización de almidón de la planta, siendo ésta por ejemplo en los tubérculos para la patata, y en las semillas para el trigo o el arroz.

La secuencia codificante cérea se obtuvo a partir de una genética de DNAc de RNA de endospermo de trigo. La secuencia, en orientación con sentido, está descrita por Clark et al. (Plant Molecular Biology, 16, 1099-1101, 1991). La secuencia codificante cérea se rellena y se liga en el plásmido pFW4101 en lugar de la secuencia codificante GUS (\beta-glucuronidasa), para producir el gen quimérico antisentido (véase la única figura anexa) en el plásmido pFW4082. El pFW4101 se construyó con un promotor de patatina preparado a partir de dos clones genómicos PS3 y PS27, según describen Blundy et al. (Plant Molecular Biology, 16, 153-160, 1991). Los fragmentos de patatina PS3 y PS27 se derivaron de los clones genómicos descritos por Mignery et al. (Gene, 62, 27-44, 1988). Los fragmentos consistían en -3,5 kb a -1 kb de PS3, y de -1 kb a + 3 de PS27, numerados en relación al comienzo de la traducción. También se suministró el pFW4101 con una secuencia de terminación Nos.

Se depositó E. coli que contenía pFW4101 y Agrobacterium tumefaciens que contenía pFW4082 bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Procedimiento de Patentes, en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Reino Unido, el 5 de julio de 1990 con el número de registro NCIMB 40306, y el 6 de junio de 1991 con el número de registro NCIMB 40422, respectivamente.

El vector pFW4082 fue transferido en las cepas LBA 4404 y C58 nº3 de Agrobacterium tumefaciens mediante apareamiento triparental. Las cepas de Agrobacterium se utilizaron para transformar el cultivar de patata Desirée. Se produjo una gran familia de más de 60 plantas transgénicas, y se produjeron microtubérculos a partir de éstas in vitro.

Se ensayó la almidón-sintasa preparando extractos de los microtubérculos y midiendo la incorporación de [^{14}C] procedente de [^{14}C] ADPglucosa en el almidón (material insoluble en metanol) por estos extractos. Este ensayo reveló que la actividad de la almidón-sintasa se había reducido en aproximadamente 50%, cuando se compara con plantas no transformadas.

Para evaluar el contenido en almidón de los microtubérculos, en primer lugar se extrajo almidón de los microtubérculos con ácido perclórico. El almidón extraído fue convertido luego enzimáticamente en glucosa, que con posterioridad fue ensayada de forma espectrofotométrica. Para evaluar la precisión de estas medidas, se llevaron a cabo experimentos de control tomando muestras exactas de los extractos, a las cuales se añadieron cantidades conocidas de almidón antes de comenzar el procedimiento de ensayo.

Los resultados demostraron que cuando la actividad de almidón-sintasa se reducía en 50%, el contenido en almidón de los microtubérculos permanecía constante.

Con el fin de medir el contenido en amilosa del almidón en las plantas transformadas, se determinó la proporción de glucano de cadena lineal en almidón mediante la digestión del almidón con exo-amilasa. El glucano liberado se ensayó de forma espectrofotométrica, y con ello se determinó que la proporción de glucano se había reducido desde 60% hasta 30%, y por tanto que la relación de amilosa a amilopectina era menor en las plantas transformadas que en el caso de las plantas no transformadas.

Como apreciarán los expertos en la técnica, mientras que en el procedimiento anteriormente descrito para la transformación de la patata se utilizó A. tumefaciens, cuando se aplique el proceso de la presente invención con respecto a otras plantas, por ejemplo maíz, arroz, trigo o cebada, pueden utilizarse otros modos de transformación. Así, por ejemplo, puede emplearse la transformación directa o la electroporación.

Claims (1)

1. Un procedimiento para alterar la producción de almidón en una planta de arroz, trigo, cebada, maíz o patata, comprendiendo dicho procedimiento transformar una célula de arroz, trigo, cebada, maíz o patata con un gen quimérico que comprende un promotor y una secuencia codificante antisentido procedente del locus céreo de un genoma de maíz, y regenerar una planta a partir de la célula transformada, con lo cual la planta regenerada muestra el efecto técnico de una relación disminuida de amilosa a amilopectina, sin que haya una reducción en la cantidad total de almidón.