EP4762084A1 - Nukleinsäuresequenz, vektor, screening-verfahren und verfahren zur herstellung von rekombinanten antikörpern - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz mit einer erhöhten Expressionsrate aufweisend zumindest eine Expressionskassette zur Expression eines Proteins, wobei die Expressionskassette wenigstens ein Promotorelement, und wenigstens eine erste Transkriptionseinheit, die für wenigstens ein Peptid codiert, aufweist, wobei das Promotorelement aus der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder einer Nukleinsäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 % zur SEQ ID NO: 1 besteht. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor oder eine isolierte Nukleinsäure, umfassend wenigstens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz in einfacher oder repetitiver Form. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Aminosäuresequenz, umfassend SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 %, zur SEQ ID NO: 2, sowie eine Zelle umfassend einen erfindungsgemäßen Vektor oder eine erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäure, oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, oder eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, wobei die Zelle eine photosynthetisch aktive Zelle, insbesondere eine einzellige Pflanze oder Viridiplantae, bevorzugt eine Kieselalge ist. Die Erfindung betrifft ferner ein Screening-Verfahren zur Auswahl von Zellen mit einer erhöhten Expressionsrate einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, sowie ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors oder einer erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäure und/oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz.

Description

NUKLEINSÄURESEQUENZ, VEKTOR, SCREENING-VERFAHREN UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEN ANTIKÖRPERN

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz mit einer erhöhten Expressionsrate zur Produktion von rekombinanten Proteinen, sowie einen Vektor oder eine isolierte Nukleinsäure zur heterologen Expression von Proteinen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine entsprechende Aminosäuresequenz, eine Zelle, sowie ein Screening-Verfahren zur Auswahl von Zellen mit einer erhöhten Expressionsrate und ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern.

STAND DER TECHNIK

Ein Problem gängiger Immunoassays, die sich der Verwendung von Antikörpern bedienen, besteht darin, dass die Antikörper tierischen Ursprungs sind. So erfolgt die Produktion von Antikörpern entweder in Tieren oder in tierischen Zellkulturen. Dabei kommen vor allem CHO- (Eileiterzellen des chinesischen Hamsters) und HEK-293T-Zellen

(menschliche embryonale Nierenzellen) zum Einsatz. Diese Zellkultur-basierte Produktion ist sehr kostenintensiv, daher werden vorhandene Kapazitäten vor allem bei der Produktion hochpreisiger, therapeutischer Antikörper eingesetzt. Im Bereich der Diagnostik eingesetzte Antikörper weisen viel niedrigere Margen auf und werden daher immer noch häufig in Tieren hergestellt. Solche in Tieren produzierten Antikörper besitzen neben dem damit verbundenen Tierleid auch die geringe Zuverlässigkeit der Bindungseigenschaften, die limitierte Verfügbarkeit sowie die Gefahr der Kontamination mit Humanpathogenen.

Die Alternativen für die Herstellung von Antikörpern ebenso wie von anderen komplexen Proteinen sind recht eingeschränkt. Bakterien wie Escherichia coli können die notwendigen posttranslationalen Modifikationen an den Antikörpern nicht durchzuführen, außerdem sind die Produktionsraten extrem niedrig. Ähnliches gilt auch für Hefe- bzw. P/c/7/a-basierte Produktionssysteme. Auch hier können die Antikörper durch die Wirtszellen selten korrekt gefaltet werden und die Produktionsraten sind ähnlich niedrig wie in Bakterien. Transgene Pflanzen werden seit vielen Jahren als alternative Produzenten diskutiert, aber auch hier erlauben die sehr niedrigen Produktionsraten keine wirtschaftliche Verwertung. Auch die Produktion von Antikörpern in Phaeodactylum tricomutum, einer Mikroalge, wurde bereits beschrieben. So offenbart bspw. die EP 2 671 950 A1 die Expression und Sekretion von rekombinanten, vollständig assemblierten Proteinkomplexen durch Mikroalgen. Aus der EP 2 660 323 A1 ist die Produktion von sekretierten therapeutischen Antikörpern in der Mikroalge Phaeodactylum tricornutum bekannt. Auch unter Einsatz dieser Expressionssysteme konnten keine Produktionsraten erzielt werden, die eine wirtschaftliche Produktion erlauben.

Um eine Überexpression eines bestimmten Proteins in Phaeodactylum tricornutum herbeizuführen und damit die Produktivität eines rekombinanten Proteins signifikant zu erhöhen, wird in der WO 2021/002630 A1 die Verwendung des Promotors HASP1 beschrieben. Weiterhin offenbart werden ein Signalpeptid HASP1-SP, ein Expressionsvektor, der HASP1 und HASP1-SP umfasst, eine Transformante, in die der Expressionsvektor in eine Wirtszelle eingeführt wurde, sowie Verfahren zur Herstellung, Expression und Erhöhung des Expressionsniveaus eines Proteins von Interesse in einer Wirtszelle. Auch hinsichtlich dieses Verfahrens lässt sich die Produktionsrate noch weiter steigern.

AUFGABE

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die technische Aufgabe zugrunde, eine Nukleinsäuresequenz, einen Vektor, eine Aminosäuresequenz, eine Zelle, sowie ein Screening- und ein Herstellungsverfahren zur Verfügung zu stellen, die es erlauben, das Expressionsniveau und damit die Produktionsrate rekombinanter Proteine gegenüber den im Stand der Technik bekannten Verfahren und genetischen Komponenten weiter zu erhöhen.

LÖSUNG

Die Aufgabe wird durch eine Nukleinsäuresequenz mit den Merkmalen des Anspruchs 1 , sowie einen Vektor oder eine isolierte Nukleinsäure, eine Aminosäuresequenz, eine Zelle, ein Screening-Verfahren und ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern mit den Merkmalen der nebengeordneten Ansprüche erfüllt. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen sind den Unteransprüchen, der Beschreibung und den Ausführungsbeispielen zu entnehmen. Die Aufgabe wird insbesondere durch eine Nukleinsäuresequenz mit einer erhöhten Expressionsrate zur Produktion von rekombinanten Proteinen, aufweisend zumindest eine Expressionskassette zur Expression eines oder mehrerer Peptide, gelöst. Dabei weist die Expressionskassette erfindungsgemäß wenigstens ein Promotorelement und wenigstens eine erste Transkriptionseinheit, die für ein Protein codiert, auf, wobei das Promotorelement aus der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder einer Nukleinsäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 %, bevorzugt zumindest 80 %, besonders bevorzugt zumindest 90 %, ganz besonders bevorzugt zumindest 95 %, weiter bevorzugt zumindest 99 % zur SEQ ID NO: 1 besteht.

Der Begriff „Homologie“ bezeichnet im Sinne der Erfindung die Ähnlichkeit zwischen Nukleotid-Sequenzen der DNA bzw. RNA und/oder zwischen Aminosäuresequenzen von Proteinen.

Vorteilhafterweise stellt die SEQ ID NO:1 einen im Folgenden als HASP1^mod bezeichneten Promotor dar, der sich als besonders geeignet für die regulierte Proteinproduktion herausgestellt hat. Dabei ist der HASP1 ^mod-Prornotor ein von dem natürlichen HASP1- Promotor abgeleitetes Promotorelement, wobei eine Teilsequenz des natürlichen HASP1- Promotors verdoppelt wurden ist.

Die SEQ ID NO:1 lautet wie folgt, wobei der unterstrichene Anteil die Dopplung darstellt:

5'-

CATACAGTGAATGTAACTTTCGAATTGACAGTATTAGTAGTCGTATTGACAGTGAGGCAC GCCCCTCAATGTGCGAGGTGGAAAATATACCAGCATGACAATGAATCTTGGAGATTCTT TTGCTGTCATCAAGATTCACCGCCAAATCTTCAGGAACCTATCACGTCCACAGGCGATG TTAATTCTTGAGTCGTCAAAACAAAGTCCTGTCCTACCTGTAGAAGTTGACAGCGAGCAA TTGTATGCAAACTTCTGACTTTGTTATAATAACATTAAAGGTAATTAAGTATCTTCAATTAG GCATTTTGTCACTGTCAGTCCGTTCCGACAATATAGGTAGATTTGGAATGAATCTTTTCT ATGCTCATACAGTGAATGTAACTTTCGAATTGACAGTATTAGTAGTCGTATTGACAGTGA GGCACGCCCCTCAATGTGCGAGGTGGAAAATATACCAGCATGACAATGAATCTTGGAGA TTCTTTTG CTGTCATCAAG ATTCACCG CCAAATCTTCAG G AACCTATCACG TCCACAG GC GATGTTAATTCTTGAGTCGTCAAAACAAAGTCCTGTCCTACCTGTAGAAGTTGACAGCGA GCAATTGTATGCAAACTTCTGACTTTGTTATAATAACATTAAAGGTAATTAAGTATCTTCA ATTAGGCATTTTGTCACTGTCAGTCCGTTCCGACAATATAGGTAGATTTGGAATGAATCT TTTCTATGCTGCTGCGAATCTTGTACACCTTTGAGGCCGTAGATTCTGTCCGACGAAGC GATAATTATTGCAAAATACATGGACTCATTATTTTGATTCGATTTCTTTTTGGTATCCGAC TCGAAAAGATCCATCACGGCGAGC-3' Von der Erfindung umfasst sind dabei auch Nukleinsäuresequenzen, deren Promotorelement einzelne HASP1 -Sequenzabschnitte repetitiv aufweist, beispielsweise bezogen auf das Startcodon ATG zwischen -100 und -1 , zwischen -200 bis -101 , zwischen -300 bis -201 , zwischen -400 bis -301 und/oder zwischen -500 bis -400. Dabei können diese Abschnitte in beliebiger Konstellation und Kopienzahl kombiniert werden. So ergibt sich eine neue Sequenz, die weniger als 85 % Homologie zum nativen und HASP1 Promotor ergibt.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung umfasst wenigstens eine Transkriptionseinheit ein Polynukleotid, welches für eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 %, bevorzugt zumindest 80 %, besonders bevorzugt zumindest 90 %, ganz besonders bevorzugt zumindest 95 %, weiter bevorzugt zumindest 99 % zur SEQ ID NO:2 codiert.

Die SEQ ID NO:2 stellt dabei eine Aminosäuresequenz der hinge-Region eines Antikörpers dar, welche aus equinen Immunglobulin-Sequenzen abgeleitet wurde und sich als besonders Protease-resistent herausgestellt hat. Die Verwendung dieser Protease-resistenten Hinge- Region reduziert maßgeblich die Proteolyse der hergestellten Antikörper verschiedener Formate und aus verschiedenen Spezies, sowohl in vivo als auch in vitro.

Die SEQ ID NO:2 lautet wie folgt:

VIKEPCCCPKCP

Die Aufgabe wird weiterhin durch eine Aminosäure umfassend SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 %, bevorzugt zumindest 80 %, besonders bevorzugt zumindest 90 %, ganz besonders bevorzugt zumindest 95 %, weiter bevorzugt zumindest 99 % zur SEQ ID NO: 2.

Ferner wird die Aufgabe durch einen Vektor oder eine isolierte Nukleinsäure, welche/r eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einfacher oder repetitiver Form umfasst, sowie durch eine Zelle umfassend einen erfindungsgemäßen Vektor oder eine erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäure oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz gelöst.

Erfindungsgemäß ist die Zelle dabei eine photosynthetisch aktive Zelle, insbesondere eine Viridiplantae oder eine einzellige Pflanze, bevorzugt eine Kieselalge. Die Aufgabe wird weiterhin durch ein Screening-Verfahren zur Auswahl von Zellen mit einer erhöhten Expressionsrate einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz gelöst. Das Screening-Verfahren umfasst dabei die Schritte a) Bereitstellen von Zellen, welche mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder einer erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäure und/oder mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz transformiert wurden, b) Vereinzelung und Überführung der Zellen in ein Kulturmedium, c) Anreichern des Kulturmediums mit einer Phosphatkonzentration im Bereich von 0,1 pM bis 200 pM, bevorzugt 0,5 pM bis 200 pM, besonders bevorzugt 1 pM bis 200 pM, ganz besonders bevorzugt 1 pM bis 35 pM, und d) Untersuchung der Zellen auf eine gewünschte Expressionsrate.

Vorteilhafterweise ermöglicht es das erfindungsgemäße Screening-Verfahren nicht nur, produzierende Zelllinien zu finden, sondern zu einem möglichst frühen Zeitpunkt des Verfahrens die Zelllinien zu identifizieren, welche die höchsten Proteinausbeuten erbringen.

Weiterhin wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors oder einer erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäure oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz gelöst, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Bereitstellen von Zellen mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, bevorzugt ermittelt durch ein erfindungsgemäßes Screening-Verfahren, b) Kultivieren der transformierten Zellen in einem Kulturmedium, wobei das Kultivieren zunächst in einer Vorkultur und anschließend in einer Hauptkultur erfolgt und wobei ein Anpassen der Kulturbedingungen dahingehend erfolgt, dass eine Maximierung der Ausbeute heterolog produzierter Proteine erreicht wird, und c) Extrahieren der heterolog produzierten Proteine.

Es kann zweckdienlich sein, dass das Kulturmedium Phosphat in einer Menge von 20 pM bis 300 pM, bevorzugt von 20 pM bis 400 pM, besonders bevorzugt von 20 pM bis 500 pM aufweist. ALLGEMEINE VORTEILE

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren und dafür notwendige Komponenten, welches erstmalig eine effiziente und vegane Produktion von rekombinanten Proteinen in Kieselalgen, beispielsweise in Phaeodactylum tricornutum, ermöglicht. Unter veganer Produktion wird dabei eine Produktion verstanden, welche sowohl auf den Einsatz von Tieren oder tierischen Zellen als auch von Stoffen, die aus Tieren gewonnen werden, verzichtet. Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ist vor allem auf die heterologe Expression von Antikörpern verschiedener Formate ausgerichtet, kann jedoch auch für andere Proteine, bevorzugt aus Tier und Mensch, genutzt werden. Im Unterschied zu bereits beschriebenen Verfahren erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren erstmals Produktionsmengen von mindestens 50 mg rekombinantem Protein * L^-1 Kultur. Die somit erreichten Mengen liegen damit mindestens 20x höher als die bis zum heutigen Zeitpunkt beschriebenen und wurden bisher von keinem stabil transformierten, pflanzlichen oder Sar-basiertem Produktionssystem erreicht. Darüber hinaus erfüllt das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren die Vorgaben für eine komplett vegane Produktion, solange die DNA-Sequenzen der zu produzierenden Proteine nicht aus Tieren stammen, sondern beispielsweise aus rekombinanten (humanen) Antikörperbanken.

Ein weiterer Vorteil gegenüber der Herstellung von polyklonalen Antiseren liegt in der gleichbleibenden Qualität und der Reproduzierbarkeit der hergestellten Antikörper, da bspw. die antikörperproduzierenden Tiere nach einer gewissen Zeit sterben und Antikörper aus einem anderen Tier andere Eigenschaften aufweisen, d.h., die Qualität der auf dem herkömmlichen Weg erzeugten Antikörper ist stark schwankend. Darüber hinaus handelt es sich bei Antikörpern und Hilfsproteinen, die aus einer Kieselalge, einzelligen Pflanze oder Viridiplantae gewonnen werden um exakt definierte Antikörper, d.h. um Antikörper, deren Aminosäuresequenz vordefiniert und gleichbleibend ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden die rekombinanten Antikörper durch Expression aus der Kieselalge (Diatomeen), der Grünalge (Chlorobionta) oder einer Samenpflanze gewonnen, wobei vorteilhafterweise sehr hohe Ausbeuten erreicht werden, beispielsweise für die Expression aus Samenpflanzen Ausbeuten von mehr als 20 mg Antikörper pro Liter Kultur (bei Einzelzellen) bzw. pro 100 g Frischgewicht. Besonders bevorzugt werden die rekombinanten Antikörper aus der Kieselalge oder der Grünalge, insbesondere in der Kieselalge, wie bspw. Phaeodactylum tricornutum, gewonnen. Nukleinsäuresequenz

Die Erfindung betrifft zum einen eine Nukleinsäuresequenz mit einer erhöhten Expressionsrate zur Produktion von rekombinanten Proteinen, aufweisend zumindest eine Expressionskassette zur Expression eines Proteins, wobei die Expressionskassette wenigstens ein Promotorelement, und wenigstens eine erste Transkriptionseinheit, die für wenigstens ein Peptid, bevorzugt für einen Antikörper codiert, aufweist und wobei das Promotorelement aus der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder einer Nukleinsäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 %, bevorzugt zumindest 80 %, besonders bevorzugt zumindest 90 %, ganz besonders bevorzugt zumindest 95 %, weiter bevorzugt zumindest 99 % zur SEQ ID NO: 1 besteht.

Der Begriff „Homologie“ bezeichnet im Sinne der Erfindung die Ähnlichkeit zwischen Nukleotid-Sequenzen der DNA bzw. RNA und/oder zwischen Aminosäuresequenzen von Proteinen.

Eine Expressionskassette im Sinne der Erfindung besteht zumindest aus einem regulierenden Promotorelement, einem 5‘-UTR (untranslatierte Region am 5‘-Ende), einer Codon-bestimmenden Sequenz (CDS, welche in ein Peptid translatiert wird), einem 3’UTR (untranslatierte Region am 3‘-Ende) sowie einem Terminator, welcher als Stop-Codon den Abbruch der Translation herbeiführt. Die CDS kann verschiedene Unterelemente enthalten, wie Signalpeptide, welche Antikörper oder Antigen in ein bestimmtes Zellkompartiment dirigieren, Tag-Sequenzen, wie Strep-Tag oder ßx His-Tag, die primär zur Aufreinigung oder Detektion des Peptids dienen oder Fluoreszenzmarker wie GFP (Green Fluorescent Protein) etc., die primär der Detektion über ihre Fluoreszenz dienen.

Der Begriff „Promotor“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine Polynukleotidsequenz, die stromaufwärts eines Gens lokalisiert ist und die Transkription eines funktionsfähigen Gens reguliert. Der Promotor bildet eine Erkennungs- und Bindestelle für eine RNA-Polymerase, welche die Transkription des Gens einleitet.

Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung eines Promotorelements herausgestellt, welches aus dem HASP1 -Promotor (Highly Abundant Secreted Protein aus P. tricorn ut um) abgeleitet wurde und im Folgenden als HASP1^mod bezeichnet wird. Die Nukleinsäuresequenz von HASP1^mod ist unter der SEQ ID NO:1 aufgeführt und lautet wie folgt: 5'-

CATACAGTGAATGTAACTTTCGAATTGACAGTATTAGTAGTCGTATTGACAGTGAGGCAC GCCCCTCAATGTGCGAGGTGGAAAATATACCAGCATGACAATGAATCTTGGAGATTCTT TTGCTGTCATCAAGATTCACCGCCAAATCTTCAGGAACCTATCACGTCCACAGGCGATG TTAATTCTTGAGTCGTCAAAACAAAGTCCTGTCCTACCTGTAGAAGTTGACAGCGAGCAA TTGTATGCAAACTTCTGACTTTGTTATAATAACATTAAAGGTAATTAAGTATCTTCAATTAG GCATTTTGTCACTGTCAGTCCGTTCCGACAATATAGGTAGATTTGGAATGAATCTTTTCT ATGCTCATACAGTGAATGTAACTTTCGAATTGACAGTATTAGTAGTCGTATTGACAGTGA GGCACGCCCCTCAATGTGCGAGGTGGAAAATATACCAGCATGACAATGAATCTTGGAGA TTCTTTTG CTGTCATCAAG ATTCACCG CCAAATCTTCAG G AACCTATCACG TCCACAG GC GATGTTAATTCTTGAGTCGTCAAAACAAAGTCCTGTCCTACCTGTAGAAGTTGACAGCGA GCAATTGTATGCAAACTTCTGACTTTGTTATAATAACATTAAAGGTAATTAAGTATCTTCA ATTAGGCATTTTGTCACTGTCAGTCCGTTCCGACAATATAGGTAGATTTGGAATGAATCT

TTTCTATGCTGCTGCGAATCTTGTACACCTTTGAGGCCGTAGATTCTGTCCGACGAAGC GATAATTATTGCAAAATACATGGACTCATTATTTTGATTCGATTTCTTTTTGGTATCCGAC TCGAAAAGATCCATCACGGCGAGC-3'

Von der Erfindung umfasst sind dabei auch Nukleinsäuresequenzen, deren Promotorelement einzelne HASP1 -Sequenzabschnitte repetitiv aufweist, beispielsweise bezogen auf das Startcodon ATG zwischen -100 und -1 , zwischen -200 bis -101 , zwischen -300 bis -201 , zwischen -400 bis -301 und/oder zwischen -500 bis -400. Dabei können diese Abschnitte in beliebiger Konstellation und Kopienzahl kombiniert werden. So ergibt sich eine neue Sequenz, die weniger als 85 % Homologie zum nativen und HASP1 ^mod Promotor ergibt.

Gemäß einer Ausbildung der Erfindung kann es vorgesehen sein, dass das Promotorelement aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, in welcher bis zu 30 % der Basen, insbesondere in den proximalen Promotorbereichen, abweichen. Letztere können entweder ebenfalls aus P. tricornutum oder auch aus anderen Organismen, inklusive solchen aus Menschen oder Wirbeltieren stammen. Diese Modifikation ist eine weitere Ursache für die hohe Performance des entwickelten Expressionssystems.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die Expressionskassette weiterhin wenigstens eine zweite Transkriptionseinheit auf, die für ein Reporterprotein codiert. Diese zweite Transkriptionseinheit wird hierin auch als Reportergen bezeichnet. Als Reportergen wird vorzugsweise ein Gen verwendet, welches normalerweise nicht in eukaryotischen Zellen, bevorzugt in photosynthetisch aktiven Zellen, insbesondere in einzelligen Pflanzen oder Viridiplantae, vorkommt. Das Reportergen dient in erster Linie dazu, die Aktivität des Promotors, unter den es eingeführt wurde und/oder die Expression der ersten Transkriptionseinheit, mit weicher es funktionell verbunden ist, anzuzeigen bzw. nachzuweisen. Beispielsweise kann als Reporterprotein ein Reporterenzym, beispielsweise ein Biolumineszenz-Enzym, ein fluoreszentes Reporterprotein, wie beispielsweise GFP (Grün Fluoreszierendes Protein), oder ein detektierbares Antigen verwendet werden.

Als Reporter werden somit Proteine bezeichnet, die direkt oder indirekt ein detektierbares Signal generieren. Dieses Signal kann z. B. eine Fluoreszenz sein (z. B. tGFP (turbo Grün Fluoreszierendes Protein), GFP (Grün Fluoreszierendes Protein), BFP (Blau Fluoreszierendes Protein), YFP (Gelb Fluoreszierendes Protein), CFP (Cyan Fluoreszierendes Protein), DsRed (Discosoma sp. rot fluoreszierendes Protein)), eine Lumineszenz (z. B. Luciferase), eine Färbung durch Chromoproteine (z. B. meffBlue, aeBlue, cjBlue, amilGFP, fwYellow, amajLime, scOrange, amilCP gfasPurple, eforRed, asPink (asCP), meffRed, tsPurple und spisPink, sowie mCherry, eine Farbreaktion (z. B. ß- Glucoronidase, ß-Galatosidase) oder die Umsetzung eines Substrats in ein Produkt, wodurch sich das Absorptionsspektrum der jeweiligen Lösung ändert.

In Kombination mit einem Nährstoffmangel-getriggerten oder einem Nährstoff-getriggerten Promotor kann ein Reportergen genutzt werden, um eine Optimierung der Kulturbedingungen zu vereinfachen und/oder die Zellvitalität oder Nährstoffverfügbarkeit in einer Zellkultur zu kontrollieren. Das ermöglicht eine in-time Analyse der kultivierten Zellen. Die Stärke des Signals korreliert dabei mit der Verfügbarkeit bzw. des Mangels des zu untersuchenden Nährstoffes. Es hat sich herausgestellt, dass der HASP1^mod-Prornotor (gemäß SEQ ID NO:1) durch Phosphat inhibiert wird und durch Phosphatmangel getriggert wird. Hierbei sind mit „Phosphat“, alle Phosphat-Salze und phosphathaltigen organischen Verbindungen und alle chemischen Formen von Phosphor gemeint.

Phosphatkonzentrationen von über 360 pM sind besonders für die Regulation des

H AS P1^mod- Pro motors geeignet. Durch solch hohe Konzentrationen kann die Expressionsrate des HASP1 ^mod-Prornotors nicht nur sehr effizient und über einen längeren Zeitraum gehemmt, sondern auch eine höhere Zelldichte erreicht werden, bevor es - durch Verbrauch von Phosphat - zu einer starken Expressionssteigerung kommt. Somit stellt der HASP1^mod- Promotor die ideale Steuerung bereit, einerseits hohe Zelldichten ohne Expression des kontrollierten Gens zu erreichen, bevor die Expression durch Verbrauch von Phosphat massiv gesteigert wird. Andererseits ist seine Expressionsstärke sehr fein steuerbar und sind die maximal möglichen Expressionsraten sehr hoch.

Vorzugsweise weist die Expressionskassette weiterhin wenigstens einen Sequenzbereich auf, der für einen Selektionsmarker, vorzugsweise ein Resistenzgen, codiert. Als Resistenzgen werden dabei Gene bezeichnet, die für Faktoren codieren, welche die Zelle gegenüber bestimmten Stoffen, beispielsweise gegenüber Antibiotika und/oder Pflanzenpathogene und/oder Schwermetallen, widerstandsfähig machen. Resistenzgene werden üblicherweise als Selektionsmarker für den Nachweis einer erfolgten Transformation eines Vektors in eine Zelle eingesetzt.

Beispiele für bevorzugte Resistenzgene sind das Zeocin-Resistenzgen (Zeocin ist der allgemein bekannte Handelsname für Phleomycin D1), das Nourseothricin-Resistenzgen, das Blasticidin-Resistenzgen und das Chloramphenicol-Resistenzgen.

Besonders vorteilhaft ist es dabei, wenn das Resistenzgen an die zweite Transkriptionseinheit, welche für ein Reporterprotein codiert, gekoppelt vorliegt.

Es kann vorgesehen sein, dass Resistenzgen über genetische Kopplung in einer polycistronischen mRNA an das Reportergen gekoppelt ist. Dem Fachmann ist bekannt, dass unter polycistronischer mRNA eine mRNA verstanden wird, die von mehreren hintereinanderliegenden genetischen Einheiten auf der Nukleinsäuresequenz der DNA codiert wird und die demzufolge mehrere offene Leserahmen (open reading frames, ORFs) aufweist.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform liegt die zweite Transkriptionseinheit fusioniert an der ersten Transkriptionseinheit vor, wobei eine Abtrennung bei oder unmittelbar nach der Translation erfolgt, beispielsweise verursacht durch P2 Peptide (z. B. P2A, P2B, P2T) oder IRES-Elemente (interne Ribosom-Eintrittsstelle). Sowohl Vertreter von P2 Peptiden als auch von IRES-Elementen konnten als aktiv in P. tricornutum nachgewiesen werden.

Eine weitere Möglichkeit der Kopplung des Reporterproteins liegt in der direkten Kopplung auf Proteinebene an das zu detektierende Protein, vorzugsweise an den zu detektierenden Antikörper.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind einzelne genetische Elemente, bevorzugt das Promotorelement und/oder die erste Transkriptionseinheit und/oder eine komplette Expressionskassette repetitiv vorhanden. Durch die repetitive Verwendung, also die sich mehrfach wiederholende Nutzung, genetischer Elemente, insbesondere regulatorischer Elemente, wie beispielsweise dem Promotorelement, kann eine Steigerung der Expressionsrate der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz erreicht werden. Insbesondere werden die betreffenden genetischen Elemente und/oder die betreffende Expressionskassette bei einer repetitiven Verwendung wenigstens in doppelter Ausführung, bevorzugt wenigstens in dreifacher Ausführung, vorzugsweise unmittelbar hintereinander eingesetzt.

Die repetitive Verwendung von Transkriptionseinheiten, insbesondere der ersten Transkriptionseinheit, welche für ein zu produzierendes rekombinantes Protein, insbesondere einen Antikörper, codiert, führt zu einer deutlichen Steigerung der Ausbeute sowie der Anzahl an Klonen bzw. dem Anteil an Klonen, die eine detektierbare Produktion zeigen. Dies minimiert den Prozessaufwand. Dabei werden mehrere Kopien der genetischen Information bzw. der Transkriptionseinheit des zu produzierenden Proteins (oder Antikörpers) auf einem Plasmid bzw. Vektor kloniert. Diese Transkriptionseinheiten flankieren dabei vorzugsweise ein Resistenzgen. Dabei wird der Positionseffekt ausgenutzt, d. h., bei einer Integration ins Genom an einem „günstigen“ Lokus liegt das sogenannte gene of interest (GOI) in mehrfacher Kopienzahl vor und sorgt für eine gesteigerte Transkript- Menge, wodurch letztendlich die Ausbeute an rekombinantem Protein erhöht wird.

Vorzugsweise ist bei einem repetitiven Vorhandensein einer Transkriptionseinheit oder bei einem Vorhandensein mehrerer unterschiedlicher Transkriptionseinheiten das Resistenzgen besonders „eng“ an die Transkriptionseinheiten gekoppelt angeordnet. Insbesondere wird unter einer „engen“ Kopplung verstanden, dass die genetische Verbindung zwischen Transkriptionseinheit und Resistenzgen nicht durch eine genetische Rekombination (über interne oder von außen zugeführte Rekombinasen getrennt wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure für die Verwendung in einem bestimmten Wirtsorganismus, beispielsweise in Kieselalgen, bevorzugt in P. tricornutum, codonoptimiert

Eine Sequenz einer Nukleinsäure ist insbesondere codonoptimiert, wenn die Codons optimal auf die Häufigkeit der entsprechenden t-RNAs angepasst sind, so dass die effiziente Translation nicht durch fehlende mit der entsprechenden Aminosäure beladene tRNAs gehemmt wird. Weiterhin wird als eine Optimierung betrachtet, dass bestimmte Erkennungsstellen von Restriktionsenzymen, welche die Klonierungsvorgänge erschweren können, beseitigt worden sind. Die Erfindung umfasst daher auch eine Nukleinsäure, die für einen Antikörper codiert, wobei die Sequenz der Nukleinsäure für die Expression in einer Kieselalge, einzelligen Pflanze oder Viridiplantae, insbesondere in einer Kieselalge codonoptimiert ist.

Die Erfinder haben zudem herausgefunden, dass bei der Codonoptimierung der Sequenz der Nukleinsäure das Profil der Aminosäurensequenz aus der Ursprungssequenz berücksichtigt werden kann. Hierdurch wird insbesondere die korrekte Faltung des Antikörpers im Vergleich zum nativen Pendant des Antikörpers verbessert, was zu einer erhöhten Stabilität des Antikörpers und einer erhöhten biologischen Aktivität des in dem Wirtsorganismus (wie hierin definiert) exprimierten Antikörpers führt.

Darüber hinaus hat eine codonoptimierte Sequenz einer Nukleinsäure den Vorteil, dass die Expressionsrate in dem Wirtsorganismus gegenüber einer nicht codonoptimierten Sequenz einer Nukleinsäure zumindest um den Faktor 10, vorzugsweise zumindest um den Faktor 20, besonders bevorzugt zumindest um den Faktor 30, ganz besonders bevorzugt zumindest um den Faktor 40 erhöht ist. Beispielsweise kann dadurch die Produktionsrate in der Kieselalge von herkömmlicherweise maximal 3 mg Antikörper pro Liter Kultur auf 160 mg Antikörper pro Liter Kultur erhöht werden.

Zudem hat eine für die Expression in einem Wirtsorganismus (wie hierin definiert) codonoptimierte Sequenz einer Nukleinsäure den Vorteil, dass die Faltung des Antikörpers entsprechen dem nativen Pendant des Antikörpers verbessert ist, was zu einer erhöhten Stabilität des Antikörpers und einer erhöhten biologischen Aktivität des in dem Wirtsorganismus exprimierten Antikörpers führt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz wenigstens eine replikative virale Einheit, bevorzugt ein Replikon aus dem Weed Dwarf Virus (WDV), auf. Derartige virale Elemente ermöglichen eine unabhängige Vervielfältigung der transformierten DNA in Form von DNA bzw. RNA. Dadurch erhöht sich die Kopienzahl transformierter DNA bzw. RNA, wodurch z. B. die Transkript- Menge (mRNA) ansteigt und mehr Protein entsteht. Weiterhin kann eine erhöhte Kopienzahl der einzubringenden Transkriptionseinheit zur Folge haben, dass diese DNA mehrfach ins Genom integriert wird, was die Chance einer Integration an einem „günstigen“ Lokus erhöht.

Weiterhin bevorzugt weist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz wenigstens einen Sequenzbereich auf, der für ein Retentionssignal, bevorzugt für die Aminosäuresequenz KDEL und/oder HDEL, codiert. Dabei sorgt die Ausstattung heterolog zu exprimierender Proteine mit einem Retentionssignal dafür, dass das exprimierte Protein im Endoplasmatischen Retikulum verbleibt. Beispiele für solche Retentionssignale sind die Aminosäuresequenzen KDEL und HDEL. Normalerweise wird nur die schwere Kette mit einer solchen Sequenz ausgestattet. Bei einer Produktion von Antikörpern in der Kieselalge wird jedoch nicht nur die schwere Kette mit einem solchen Signal ausgestattet, sondern auch die leichte Kette. Dadurch soll der mögliche Transport der leichten Kette in den Golgi- Apparat verhindert und der Zusammenbau beider Moleküle gefördert werden. Zudem sorgt ein Verbleib der exprimierten Proteine im Endoplasmatischen Retikulum für einen Schutz vor Proteasen und für eine erfolgreiche Glykosylierung, wodurch die Ausbeute gesteigert und die Funktionalität beibehalten wird.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung umfasst die erste Transkriptionseinheit ein Polynukleotid, welches für eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 %, bevorzugt zumindest 80 %, besonders bevorzugt zumindest 90 %, ganz besonders bevorzugt zumindest 95 %, weiter bevorzugt zumindest 99 % zur SEQ ID NO:2 codiert.

Die SEQ ID NO:2 stellt dabei eine Aminosäuresequenz der hinge-Region eines Antikörpers dar, welche aus equinen Immunglobulin-Sequenzen abgeleitet wurde und sich als besonders Protease-resistent herausgestellt hat. Die Verwendung dieser Protease-resistenten Hinge- Region reduziert maßgeblich die Proteolyse der in P. tricornutum hergestellten Antikörper verschiedener Formate und aus verschiedenen Spezies, sowohl in vivo als auch in vitro.

Die SEQ ID NO:2 lautet wie folgt:

VIKEPCCCPKCP

Vektor oder isolierte Nukleinsäure

Ein erfindungsgemäßer Vektor oder eine erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäure zur heterologen Expression von Proteinen, bevorzugt von Antikörpern weist wenigstens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz in einfacher oder repetitiver Form auf.

Auf die Beschreibung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz wird hiermit ausdrücklich verwiesen. Bevorzugt beträgt die Anzahl an Transkriptionskassetten im Vektor oder in der isolierten Nukleinsäure mehr als 1 und besonders bevorzugt mehr als 2. Der erfindungsgemäße Vektor oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure weist somit wenigstens zwei, bevorzugt wenigstens drei erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen auf. Dabei codieren die so regulierten Transkriptionskassetten bevorzugt ein Protein, besonders bevorzugt einen Antikörper (mit anderen Worten: mehrere Transkriptionskassetten codieren alle ein und dasselbe Protein bzw. ein und denselben Antikörper), wobei das Protein, bevorzugt der Antikörper eine Sequenzidentität von wenigstens 50 %, besonders bevorzugt wenigstens 60 %, ganz besonders bevorzugt wenigstens 70 %, insbesondere wenigstens 80 % auf der Aminosäure-Ebene aufweist.

Dabei besteht eine Transkriptionskassette (wie hierin beschrieben) wenigstens aus einem regulierenden Promotorelement, einem 5‘-UTR, einer Codon-bestimmenden Sequenz (CDS, welche in ein Peptid translatiert wird), einem 3’UTR sowie einem Terminator. Die CDS kann verschiedene Unterelemente enthalten, wie Signalpeptide, welche Antikörper oder Antigen in ein bestimmtes Zellkompartiment dirigieren, Tag-Sequenzen, wie Strep-Tag oder 6x His-Tag, die primär zur Aufreinigung oder Detektion des Peptids dienen oder Fluoreszenzmarker wie GFP (Green Fluorescent Protein) etc., die primär der Detektion über ihre Fluoreszenz dienen.

Vorzugsweise weist der erfindungsgemäße Vektor oder die erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäure wenigstens zwei, bevorzugt wenigstens drei, besonders bevorzugt wenigstens vier Expressionskassetten in repetitiver Form auf.

Dabei können die Expressionskassetten eines Vektors oder einer isolierten Nukleinsäure zueinander identisch sein oder eine Identität von zumindest 70 %, bevorzugt zumindest 80 % zueinander aufweisen. Es können weiterhin eine oder mehrere von einer ersten Expressionskassette abweichende zweite und/oder weitere Expressionskassetten in dem erfindungsgemäßen Vektor oder der erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäure angeordnet sein.

Durch die repetitive Verwendung, also die sich mehrfach wiederholende Nutzung, einer oder mehrerer Expressionskassetten, kann eine Steigerung der Expressionsrate der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz erreicht werden. Ebenso steigt die Anzahl an Produzenten mit höherer Produktionsmenge, die Anzahl an transgenen Klonen, sowie der Anteil an Klonen mit detektierbarem Signal. Das Signal des Reporterproteins ist dabei ein direktes Maß für die Proteinproduktion/Antikörperprodukten. Insbesondere werden die betreffenden Expressionskassetten bei einer repetitiven Verwendung wenigstens in doppelter Ausführung, bevorzugt wenigstens in dreifacher Ausführung, vorzugsweise unmittelbar hintereinander eingesetzt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der erfindungsgemäße Vektor oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiterhin wenigstens einen Sequenzbereich auf, der für einen Selektionsmarker, vorzugsweise ein Resistenzgen (wie hierin beschrieben), codiert.

Aminosäuresequenz

Die Erfindung betrifft auch eine Aminosäuresequenz, umfassend SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 %, bevorzugt zumindest 80 %, besonders bevorzugt zumindest 90 %, ganz besonders bevorzugt zumindest 95 %, weiter bevorzugt zumindest 99 % zur SEQ ID NO: 2.

Die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz bildet eine besonders Protease-resistente Gelenkregion (Hinge-Region) in einem rekombinanten Antikörper aus. Vorteilhafterweise ist der resultierende rekombinante Antikörper derart modifiziert, dass dieser gegenüber kieselalgen-, human-, pflanzen- oder mikroalgenspezifischen Proteasen eine erhöhte Stabilität aufweist. Hierdurch kann die Stabilität des Antikörpers in dem Wirtsorganismus, in welchem der Antikörper exprimiert wird, und somit auch die Expressionsrate erhöht werden.

Der Begriff „Antikörper“ bezeichnet hierin ein Immunglobulin (Ig) oder ein Derivat eines Immunglobulins, wie es vom erworbenen Immunsystem von Wirbeltieren produziert wird. Beispiele für natürlich vorkommende Antikörper sind die Antikörper der Klasse M (IgM), G (IgG), A (IgA), und E (IgE) , insbesondere aus Säugern wie Mensch, Kaninchen, Maus, Ratte, Kamel, Lama, Ziege und/oder Pferd. Weiterhin sind auch künstliche Formate, die auf solchen Proteinen beruhen sind eingeschlossen, Beispiele sind hier scFvs (single chain variable Fragments), oder scFv-Fc (single chain variable Fragments fused to a crystalline Fragment).

Ein „nativer Antikörper“ ist im Sinne der vorliegenden Erfindung ein natürlicher Antikörper, wie dieser in einem Individuum, wie hierin definiert, insbesondere einem Vertebraten, besonders bevorzugt einem Säugetier, ganz besonders bevorzugt einem Primaten, insbesondere einem Menschen, vorzufinden ist. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz eine Cyste in- reiche Aminosäuresequenz die mindestens 20 Cysteine, vorzugsweise mindestens 15 Cysteine, besonders bevorzugt mindestens 12 Cysteine enthält. Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst oder besteht die Aminosäuresequenz in der Gelenkregion aus (a) der Sequenz VIKEPCCCPKCP oder (b) einer um maximal 30 %, insbesondere um maximal 20 %, besonders bevorzugt um maximal 15 % von dieser Aminosäuresequenz abweichenden Sequenzidentität oder (c) einer Aminosäuresequenz, die gegenüber der Variante gemäß (a) lediglich einen Aminosäureaustausch aufweist.

Ebenfalls erfindungsgemäß ist eine Nukleinsäuresequenz, codierend für eine Aminosäuresequenz umfassend SEQ ID NO: 2 oder für eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 %, bevorzugt zumindest 80 %, besonders bevorzugt zumindest 90 %, ganz besonders bevorzugt zumindest 95 %, weiter bevorzugt zumindest 99 % zur SEQ ID NO: 2.

Zelle

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zelle umfassend einen erfindungsgemäßen Vektor oder eine erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäure (wie hierin beschrieben) oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz (wie hierin beschrieben), wobei die Zelle eine photosynthetisch aktive Zelle, insbesondere eine einzellige Pflanze oder Viridiplantae, bevorzugt eine Kieselalge ist.

Vorteilhafterweise kann durch die Verwendung photosynthetisch aktiver Zellen zumindest ein Großteil bis hin zu dem ganzen Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine in nicht tierischen Organismen erfolgen und somit den Vorgaben einer veganen Produktion entsprechen.

Screening-Verfahren

Ein erfindungsgemäßes Screening-Verfahren zur Auswahl von Zellen mit einer erhöhten Expressionsrate einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz (wie hierin beschrieben) umfasst die Schritte: a) Bereitstellen von Zellen, welche mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder einer erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäure und/oder mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz transformiert wurden, b) Vereinzelung und Überführung der Zellen in ein Kulturmedium, c) Anreichern des Kulturmediums mit einer Phosphatkonzentration im Bereich von 0,1 pM bis 200 pM, bevorzugt 0,5 pM bis 200 pM, besonders bevorzugt 1 pM bis 200 pM, ganz besonders bevorzugt 1 pM bis 20 pM. d) Untersuchung der Zellen auf eine gewünschte Expressionsrate.

Zum Transformieren der Zellen mit dem erfindungsgemäßen genetischen Material kommen gängige Verfahren, wie beispielsweise ballistische Verfahren oder Elektroportion zum Einsatz. Während bei der ballistischen Transformation DNA-beschichtete Nanopartikel auf die Zellen geschossen werden, werden bei der Elektroporation Zellen kurzzeitig mit einem elektrischen Schock im Bereich von 2000 V bis 2500 V behandelt, wodurch die Zellmembran für die DNA durchlässig wird.

Anschließend müssen die Zellen, welche das Transgen aufgenommen haben, identifiziert und selektiert werden. Das erfolgt typischerweise über die Selektion gegenüber einem Selektionsstoff, welcher mit einem in den Expressionskassetten enthaltenen Selektionsmarker zusammenwirkt.

Bevorzugt werden als Selektionsmarker Resistenzgene (wie hierin beschrieben) eingesetzt. Die Zellen werden im Anschluss an die Transformation auf eine Selektionsplatte und/oder in ein Selektionsmedium überführt, wobei die Selektionsplatte bzw. das Selektionsmedium den jeweiligen Selektionsstoff in einer ausreichenden Konzentration enthält. Dem Fachmann ist dabei bekannt, in welcher Konzentration er den Selektionsstoff einsetzen muss.

Als selektierende Reagenzien werden in einer bevorzugten Ausführungsform Zeocin (Phleomycin D1) und/oder Blasticidin eingesetzt.

Nur Zellen, in welchen ein erfolgreicher Gentransfer stattgefunden hat, weisen (neben dem gene of interest) auch das jeweilige Resistenzgen auf und besitzen somit eine Resistenz gegen den Selektionsstoff, was sie befähigt, auf oder in einem den entsprechenden Selektionsstoff enthaltenden Medium zu überleben. Der Fachmann spricht hierbei von positiver Selektion.

Die Selektion erfolgt dabei vorzugsweise auf einem festen Nährmedium, bevorzugt auf einer Agar-Platte, insbesondere auf einer Agar-Platte mit einer Agarkonzentration von weniger als 1 ,5 %, bevorzugt von weniger als 1 %. Vorteilhafterweise reduziert sich die Wachstumsdauer der Zellen auf Agarplatten mit einer derart verringerten Agarkonzentration, im Vergleich zu einer standardmäßig verwendeten Agarkonzentration von 1 ,5 %, deutlich. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Selektion auf einem Festmedium bzw. festen Nährmedium, welches 0,5 % bis 1 % Agar, bevorzugt 0,6 % bis 1 % Agar, besonders bevorzugt 0,7 % bis 1 % Agar, ganz besonders bevorzugt 0,8 % bis 1 % Agar enthält. Ein derartiges Festmedium wird vorteilhafterweise auch für die Stammerhaltung der verwendeten Zellen, sowohl transformierter als auch nicht transformierter Zellen, verwendet.

Eine zentrale Anforderung ist, nicht nur produzierende Zelllinien zu finden, sondern zu einem möglichst frühen Zeitpunkt des Selektionsverfahrens die Zelllinien zu identifizieren, welche die höchsten Proteinausbeuten erbringen. Um dies zu erreichen, werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform Reporter-Proteine (wie hierin beschrieben) verwendet. Diese können entweder als Fusionsprotein oder dicistronisch (z. B. mittels IRES-Elements verknüpft) vorliegen. Die massiv parallele Fluoreszenz-basierte Detektion durch die Reporter-Proteine korreliert deutlich mit der Menge an rekombinanten Proteinen, die später von dieser Zelllinie produziert wird. Bei Verwendung von Nährstoff oder Nährstoffmangelgetriggerten Promotoren, wie beispielsweise dem hierin beschriebenen modifizierten HASP1 -Promotor HASP1^mod, ist die Herstellung einer Korrelation zwischen Reportersignal und Proteinproduktion jedoch nicht direkt nach der Selektion möglich. Um eine aussagekräftige Korrelation herzustellen, müssen die Klone von der Selektionsplatte oder aus dem Selektionsmedium in ein flüssiges Medium überführt werden (z.B. in eine Multiwell- Platte). Anschließend müssen die Klone in einem bestimmten Zeitraum, optimalerweise zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessen werden, um eine aussagekräftige Korrelation zu erreichen. Der Zeitpunkt der Auswertung richtet sich an der Konzentration des relevanten Nährstoffs (z.B. Phosphat im Fall von HASP1 ^mod). Die Konzentration muss dabei so eingestellt werden, dass die Zellen einen kritischen Wert nicht überschreiten und der Zeitraum bis zur Auswertung möglichst kurz ist und gleichzeitig der Realität möglichst nah kommt. So kann beispielsweise die Intensität der Fluoreszenz der Reporterproteine mit der Menge an gebildetem Antikörper korreliert werden. Diese Korrelation ist jedoch, wie nachfolgend dargestellt, nicht trivial und von vielen Faktoren abhängig (z. B. der Zellzahl). Das hier beschriebene Selektionsverfahren ist daher so konzipiert, dass mit minimalem Aufwand sehr verlässlich die Korrelation zwischen Fluoreszenz und Antikörperproduktion hergestellt werden kann.

Die vorselektierten Zellen werden gemäß Schritt (b) vereinzelt und in ein Kulturmedium überführt. Als Kulturmedium kann beispielsweise ein modifiziertes f/2-Medium verwendet werden. Vorzugsweise erfolgt die Überführung zumindest eine Multiwell-Platte von wenigstens 6- Well, bevorzugt wenigstens 12- Well, besonders bevorzugt wenigstens 24- Well, ganz besonders bevorzugt wenigstens 48-Well, weiter bevorzugt wenigstens 96-Well, insbesondere wenigstens 384-Well. Dabei werden die entstandenen Klone vereinzelt.

Die Nutzung von Multiwell-Platten stellt eine Hochdurchsatz-Methode dar, die den nötigen Aufwand und die Kosten der Selektion z. B. expressionsstarker Klone signifikant reduziert, da hierdurch eine simultane Messung von bis zu 384 unabhängigen Klonen ermöglicht wird.

Dabei enthält das Medium eine Phosphatkonzentration von 0,1 pM bis 50 pM, bevorzugt 0,25 pM bis 35 pM, besonders bevorzugt 0,5 pM bis 30 pM ganz besonders bevorzugt 0,75 pM bis 25 pM, insbesondere 0,1 pM bis 20 pM, weiterhin insbesondere 1 pM bis 20 pM, gemäß Schritt (c) führt vorteilhafterweise dazu, dass der hierin beschriebene Phosphatmangel-getriggerte modifizierte Promotor HASP1 ^mod aufgrund der geringen Phosphatkonzentration des Mediums mit einer erhöhten Aktivität reagiert und die somit getriggerte Proteinproduktion zu einem früheren Zeitpunkt ausgewertet kann, als bei höheren Phosphatkonzentrationen. Eine daraus resultierende verstärkte Produktion des Reporterproteins kann einfach ausgelesen werden.

Hierbei sind mit „Phosphat“, alle Phosphat-Salze und phosphathaltigen organischen Verbindungen und alle chemischen Formen von Phosphor gemeint.

Bei der Auswertung von Reporter-Signalen können die Klone zwar direkt nach der Vereinzelung und Überführung der Zellen in ein Kulturmedium analysiert werden, jedoch ist die Zellzahl zu diesem Zeitpunkt gering, wodurch die Messungenauigkeit erhöht wird. Um dieses Problem zu adressieren, werden die Zellen bis zu einer optimalen Zelldichte in dem Kulturmedium, bevorzugt in einer Multiwell-Platte, kultiviert. Dabei muss, vor allem bei Arbeiten mit Nährstoffmangel-getriggerten Promotoren, berücksichtigt werden, dass die initiale Nährstoffkonzentration einen wesentlichen Einfluss auf die zu erwartende Zelldichte im Verlauf der Kultivierung und damit auch auf den Auswertungszeitpunkt hat. Dieser wird durch mehrere Faktoren beeinflusst: Um verlässliche Reportersignale zu erhalten, darf die Zelldichte nicht zu hoch sein, denn oberhalb einer bestimmten Zelldichte ist die Signalstärke des Reporters nicht mehr proportional zur Zellzahl. Zwar wäre ein qualitativer Vergleich unter Umständen möglich, für eine quantitative Aussage jedoch nicht zulässig.

Vorteilhafterweise erfolgt die Untersuchung der Zellen auf eine Expressionsrate der

Nukleinsäuresequenz zu mehreren Zeitpunkten der Kultivierung der Zellen. Insbesondere bei Verwendung des hierin beschriebenen Phosphatmangel-getriggerten HASP1 ^mod-Promotors in Kombination mit einem fluoreszierenden Reporter-Protein besteht kein linearer Zusammenhang zwischen der Zellmenge und der Signalintensität mehr, sobald eine kritische Zelldichte überschritten wurde. Der Phosphatmangel muss somit entstehen, bevor die Zelldichte den kritischen Wert überschreitet, ansonsten ist ein Vergleich zwischen den Klonen nicht möglich. Bei Verwendung von Nährstoffmangel-getriggerten Promotoren muss zudem beachtet werden, dass nur Klone miteinander verglichen werden, die eine ähnliche Zellzahl zeigen und es müssen globale Peaks der einzelnen Signalzeitreihe zur Bewertung der Produktion herangezogen werden.

Der Fachmann weiß, wie er die Zellzahl bestimmen kann. Eine geeignete Methode ist die Bestimmung der optischen Dichte (OD), beispielsweise mittels Absorptionsmessung, wobei ein Lichtstrahl in das Medium geleitet und der Lichtverlust mit einem Detektor gemessen wird. Bis zu einer bestimmten Zelldichte weist die optische Dichte dabei einen im Wesentlichen linearen Anstieg auf.

Für die photometrische Messung (sowohl zur Bestimmung der Zelldichte als auch zur Untersuchung der Zellen auf eine Expressionsrate der Nukleinsäuresequenz, insbesondere durch die Bestimmung der Aktivität des Reporterproteins, beispielsweise über Fluoreszenzmessungen) wird die Multiwell-Platte vorzugsweise mit jeweils 30 % bis 70 %, bevorzugt von 45 % bis 55 % des Gesamtvolumens jedes einzelnen Wells mit dem Kulturmedium gefüllt. In diesem Bereich ist die Messungenauigkeit am höchsten, wobei 50 % Füllvolumen sowohl für eine Kultivierung der Zellen im Multiwell-Format als auch für eine fehlertolerantere Messung (z. B. bei Volumenabweichungen durch Verdunstung im Laufe der Kultivierung oder durch Pipettierfehler) geeignet ist. Vorzugsweise werden daher bei der Überführung der vorselektierten Zellen gemäß Schritt (b) die Wells der Multiwell-Platte zu einem Volumen von jeweils 30 % bis 70 %, bevorzugt von 45 % bis 55 % des Gesamtvolumens jedes einzelnen Wells mit dem Kulturmedium gefüllt. Zum Auslesen der Parameter kann ein Mikroplattenlesegerät verwendet werden.

Zur Bestimmung der Zellzahl in einer Phaeodactylum tricornutum -Kultur können unterschiedliche Wellenlängen verwendet werden, welche bevorzugt bei 600 - 800 nm liegen. Besonders bevorzugt wird die Messung bei einer Wellenlänge von 600 - 750 nm durchgeführt.

Sowohl bei Fluoreszenzmessungen als auch bei Messungen der optischen Dichte dürfen die Zellen eine gewisse Zellzahl nicht überschreiten, um einen linearen Zusammenhang bzw. verlässliche, lineare Messergebnisse zu erhalten. Der Bereich, in dem die Zellzahl liegen muss, ist von der Zellgröße und -art abhängig und wird vorzugsweise empirisch, z. B. über Verdünnungsreihen, bestimmt. Für Kieselalgen liegt die Zellzahl, bei der die Untersuchung gemäß Schritt (d) bevorzugt durchgeführt wird bei 0,1 Millionen Zellen * mL^-1 bis 120 Millionen Zellen * mL^-1, bevorzugt bei 0,25 Millionen Zellen * mL^-1 bis zumindest 100 Millionen Zellen * mL^-1, besonders bevorzugt bei 0,5 Millionen Zellen * mL^-1 bis 100 Millionen Zellen * mL^-1 ganz besonders bevorzugt bei 1 Millionen Zellen * mL^-1 bis 90 Millionen Zellen * mL^-1, weiter bevorzugt bei 2 Millionen Zellen * mL^-1 bis 80 Millionen Zellen * mL^-1, noch weiter bevorzugt bei 3 Millionen Zellen * mL^-1 bis 70 Millionen Zellen * mL¹, insbesondere bei 4 Millionen Zellen * mL^-1 bis 60 Millionen Zellen * mL^-1.

Vorteilhafterweise wird zur Bestimmung der Zellzahl die Morphologie der jeweiligen Zellen, insbesondere in Bezug auf eine mögliche Einflussnahme auf die Messergebnisse der jeweils verwendeten Methode, beachtet. Beispielsweise kann bei der Bestimmung der Zellzahl von Phaeodactylum das Auftreten zweier unterschiedlicher Zellformen (fusiforme Zellen und ovale Zellen) zu einer fehlerhaften Korrelation zwischen Zellzahl und optischer Dichte führen.

Bevorzugt wird für die Untersuchung der Zellen auf eine Expressionsrate der Nukleinsäuresequenz gemäß Schritt (d) ein immunbiochemisches und/oder ein photometrisches Verfahren, bevorzugt ein Hochdurchsatz-Verfahren, durchgeführt. Als immunbiochemische Verfahren kommen beispielsweise ELISA, SDS-PAGE oder Dot Blot infrage. Als photometrische Verfahren können beispielsweise die photometrische Bestimmung der Zelldichte und/oder des Chlorophyllgehalts und/oder von Fluoreszenzproteinen und/oder von Chromoproteinen und/oder von Farbreaktionen und/oder einer Lumineszenz infrage kommen. Alle infrage kommenden Verfahren können auch ergänzend und/oder aufeinander aufbauend bzw. alternativ zueinander angewandt werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Untersuchung gemäß Schritt (d) nach einem Zeitraum von 1 bis 21 Tagen, bevorzugt von 1 ,5 bis 21 Tagen, besonders bevorzugt von 2 bis 14 Tagen nach der Durchführung von Schritt (c). Es hat sich gezeigt, dass nach diesem Zeitraum die optimale Zelldichte zur Durchführung der Untersuchung gemäß Schritt (d) zu erwarten ist.

Vorzugsweise werden in dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren wenigstens 5, bevorzugt wenigstens 10, besonders bevorzugt wenigstens 30, ganz besonders bevorzugt wenigstens 60, weiter bevorzugt wenigstens 96 unterschiedliche Klone untersucht, um Zellen mit einer erhöhten, bevorzugt mit der höchsten Expressionsrate einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz zu ermitteln.

Im Anschluss an das erfindungsgemäße Screening-Verfahren können ergänzend weitere Untersuchungen der als am stärksten exprimierenden Zellen, wie beispielsweise ELISA oder SDS-PAGE durchgeführt werden, um zu bestimmen ob und welche Antikörper in welcher Qualität und mit welchen Bindungseigenschaften produziert werden.

Der Aufschluss von Zellen in einem Multiwell-Format (insbesondere 2 - 384 Well) erfolgt bevorzugt durch einen Puffer (z. B. PBS, HEPES, Tris-HCI, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS), der Detergenzien enthält oder mittels einer gegenüber dem physiologischen Zustand erhöhten Temperatur oder einer Kombination aus Detergenzien und einer gegenüber dem physiologischen Zustand erhöhten Temperatur.

Dabei beträgt die Temperatur bevorzugt mehr als 40 °C, besonders bevorzugt: mehr als 50 °C und ganz besonders bevorzugt wenigstens 60 °C. Dabei werden vorzugweise Inkubationszeiten zwischen 0,5 h und 72 h genutzt.

Geeignete Detergenzien sind dem Fachmann bekannt. Bespiele hierfür sind Tween20, Triton X 100, Natriumdodecylsulfat (SDS), Digitonin oder Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB). Das jeweilige Detergens wird in einer Endkonzentration bevorzugt zwischen 0,1 % und 10 %, besonders bevorzugt zwischen 0,2 % und 10 %, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,3 % und 10 %, weiter bevorzugt zwischen 0,4 % und 10 %, insbesondere zwischen 0,5 % und 10 % eingesetzt.

Eine Zentrifugation nach dem Aufschluss der Zellen führt zu qualitativ besseren Ergebnissen bei der Analyse der Aufreinigung, z. B. mittels ELISA oder SDS-PAGE.

Das aufgeschlossene Material kann für das Screening im ELISA-Verfahren mittels Multiwell- Platten, aber auch - nach Zugabe von sog. SDS-PAGE-Ladepuffer und Erhitzen auf 80 °C bis 100 °C - in der SDS-PAGE direkt eingesetzt werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Allerdings führt die hier beschriebene Sedimentierung der Feststoffe und Pigmente zu qualitativ besseren Ergebnissen in ELISA und SDS-PAGE und spielt eine zentrale Rolle bei der Analyse der Aufreinigungsschritte. Herstellung-Verfahren

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors und/oder einer erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäure und/oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weist die folgenden Schritte auf: a) Bereitstellen von Zellen mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz, bevorzugt ermittelt durch ein erfindungsgemäßes Screening-Verfahren, b) Kultivieren der transformierten Zellen in einem Kulturmedium, wobei das Kultivieren zunächst in einer Vorkultur und anschließend in einer Hauptkultur erfolgt und wobei ein Anpassen der Kulturbedingungen dahingehend erfolgt, dass eine Maximierung der Ausbeute heterolog produzierter Proteine erreicht wird, und c) Extrahieren der heterolog produzierten Proteine.

Dabei kann das Bereitstellen der Zellen gemäß Schritt (a) auch das Transformieren der Zellen (wie hierin beschrieben) durch geeignete Methoden wie beispielsweise die ballistische Transformation oder die Elektroporation, umfassen.

Bei dem Kultivieren der transformierten Zellen gemäß Schritt (b) steht die Optimierung auf hohe Ausbeuten heterolog produzierter Proteine, insbesondere in geschlossenen Kultvierungssystemen, im Vordergrund.

Das Kultivieren kann dabei im Batch-Format, sprich unter den statischen Bedingungen eines gleichbleibenden Kulturmediums, oder im Fed-Batch-Format, sprich unter regelmäßiger Zugabe von frischem Medium, erfolgen, wobei der Fachmann weiß, mit welcher Kultur er die höchste Ausbeute erreichen kann.

Es wird an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass es unterschiedliche Kultivierungsweisen, wie Batch, Fed-Batch und die kontinuierliche Kultivierungsmethode gibt und dass sich die Erfindung auf alle Kulturweisen bezieht, insbesondere jedoch auf die Batch-Kultivierung, bei der alle Nährstoffkonzentrationen nur zu Beginn der Kultivierung eingestellt werden.

Bei der Fed- Batch Kultivierung werden die Nährstoffe im Laufe der Kultivierung zugeführt. Dabei ist es entscheidend, dass die mehrfache Phosphatzugabe in einer Fed-Batch Kultivierung die Induktion des (hierin beschriebenen) Promotors beschleunigt und damit die Kultivierungsdauer senkt. Zudem kann Phosphat (unabhängig von der chemischen Form, in der das Phosphat vorliegt), besonders zum Ende der Kultivierung, in geringen Mengen dazugegeben werden, um eine komplette Erschöpfung des Phosphats zu vermeiden und damit die Ausbeute zu optimieren.

Die Erfindung wird nicht auf die Kulturabfolge (Vorkultur -> Hauptkultur) beschränkt. Die Kultivierung kann auch ohne vorhergehende Vorkultur durchgeführt werden. Erfindungsgemäß werden die Zellen während der Vorkultur auf eine bestimmte Zelldichte gebracht. Anschließend werden diese Zellen in die Hauptkultur überführt. Aus der Hauptkultur wird das gewünschte Produkt gewonnen. Die Vitalität und die Teilungsrate der Zellen in der Vorkultur ist dabei entscheidend für die Biomassezunahme in der Hauptkultur, je vitaler und teilungsaktiver die Zellen in der Vorkultur, desto höher die Zunahme der Biomasse. Höhere Biomasse führt zu einer höheren Ausbeute bei der Hauptkultur.

Bevorzugt werden die Zellen daher im Bereich einer gewissen Teilungsrate aus der Vorkultur in die Hauptkultur überführt und erfolgt demnach zur Bestimmung des optimalen Zeitpunktes zur Überführung der Vorkultur in die Hauptkultur eine Bestimmung der Teilungsrate der Zellen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Vorkultur gemäß Schritt (b) ohne eine externe Begasung des Kulturmediums.

In dieser Ausführungsform wird die Vorkultur im Bereich einer gewissen Teilungsrate, bevorzugt nach einem Zeitraum von wenigstens 4 Tagen, besonders bevorzugt von wenigstens 7 Tagen, ganz besonders bevorzugt von wenigstens 12 Tagen in die Hauptkultur überführt. Der Zeitraum bezieht sich dabei auf den Kulturstart. Das Fachpersonal weiß, wie die Teilungsrate bestimmt werden kann.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Vorkultur gemäß Schritt (b) unter externer Begasung des Kulturmediums.

In dieser weiteren Ausführungsform wird die Vorkultur im Bereich einer gewissen Teilungsrate, bevorzugt nach einem Zeitraum von wenigstens 4 Tagen, besonders bevorzugt von wenigstens 7 Tagen, ganz besonders bevorzugt von wenigstens 12 Tagen in die Hauptkultur überführt. Der Zeitraum bezieht sich dabei auf den Kulturstart.

Insbesondere ist der optimale Zeitpunkt zum Überführen der Vorkultur in die Hauptkultur von der Vitalität der Zellen abhängig. Die Vitalität ist wiederum von der Nährstoffzusammensetzung des Kulturmediums abhängig. Je niedriger das Nährstoffangebot, desto schneller wird der optimale Zeitpunkt der Vorkultur zum Überführen in die Hauptkultur überschritten. Besonders relevant für die Vorkultur sind folgende Konzentrationen an Phosphat: 37 pM - 5000 M Phosphat; besonders bevorzugt 40 pM - 5000 pM; ganz besonders bevorzugt 50 pM - 5000 pM.

Bei Phaeodactylum tricornutum kann alternativ zur Teilungsrate die Morphologie der Zellen, insbesondere das Verhältnis zwischen doppelt und einfach vorliegenden Zellen herangezogen werden oder die Menge an Chlorophyll pro Zelle oder ein anderes, die Zellmenge repräsentierendes Maß, wie z.B. die optische Dichte (OD).

Phaeodactylum-ZeWen können unterschiedliche Morphotypen annehmen, eine fusiforme und eine ovale Form. Dabei sind beide morphologische Typen in jeder Kultur vorhanden, wobei das Verhältnis zwischen den Anteilen zwischen > 0 und < 1 variieren kann. Ein Morphologie- Wechsel kann durch folgende Methode vollzogen werden:

1. Ausbringen der Zellen auf einer Agarplatte und Selektion von Kolonien,

2. Anschließendes Durchführen einer „Limiting Dilution“, bei der einzelne Zellen Ausgangspunkt für neue Kolonien werden, die alle dem gleichen Morphotyp angehören.

Alternativ kann die Anreicherung oder der Wechsel zu einer bestimmten Morphologie durch physikalische oder chemische Bedingungen gefördert oder induziert werden.

Es hat sich gezeigt, dass ein Morphologie-Wechsel die Transformationseffizienz deutlich erhöhen kann/erhöht. Hierbei erreichen die fusiformen Zellen eine höhere Transformationseffizienz als ovale Zellen. Des Weiteren kann der Morphologie-Wechsel in die optimale Zellform die Ausbeute von rekombinant produzierten Proteinen deutlich erhöhen. Ein weiterer Grund, der für einen Morphologie-Wechsel spricht, ist, dass durch dieses Verfahren das „Verklumpen“ von Zellen nach dem Morphologie- Wechsel deutlich reduziert werden kann. „Verklumpte“ Zellen stören den Kultivierungsprozess, den Überwachsungsprozess und die Extraktion der heterologen Proteine.

Für den optimalen Zeitpunkt der Überführung der Vorkultur in die Hauptkultur bei Phaeodactylum tricornutum liegt das Verhältnis von einfach vorliegenden Zellen zu wenigstens zweifachen Zellketten zwischen 0,1 und 10, bevorzugt zwischen 0,1 und 4, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 3.

Des Weiteren kann für den optimalen Zeitpunkt der Überführung der Vorkultur in die Hauptkultur bei Phaeodactylum tricornutum die Teilungsrate herangezogen werden. Dabei liegt die optimale extrapolierte oder tatsächliche wöchentliche Teilungsrate log₂ > 0,1 , bevorzugt log₂ > 0,2, besonders bevorzugt log₂>0,3, ganz besonders bevorzugt log₂>0,5, des Weiteren bevorzugt zwischen log₂>= 0,5 und 20, des Weiteren besonders bevorzugt log₂>= 0,5 und 10, des Weiteren ganz besonders bevorzugt log₂ >= 0,5 und 5.

Vorteilhafterweise wird ein Kulturmedium verwendet, welches auf die erfindungsgemäßen genetischen Elemente, insbesondere die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder den erfindungsgemäßen Vektor oder die erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäure hin angepasst ist.

Insbesondere weist das Kulturmedium Phosphat in einer Menge von 20 pM bis 300 pM, bevorzugt von 20 pM bis 400 pM, besonders bevorzugt von 20 pM bis 500 pM auf.

Phosphat spielt nicht nur bei der Aktivierung des HASP1^mod-Prornotors (wie hierin definiert) eine zentrale Rolle, sondern ist auch für das Erreichen höchster Zelldichten entscheidend. Es hat sich gezeigt, dass pro:

8 -50 Millionen Zellen*!.'¹: 20 pM - 500 pM Phosphat,

Bevorzugt 12 -50 Millionen Zellen*!.'¹: 20 pM - 400 pM Phosphat, besonders bevorzugt 15 -50 Millionen Zellen*!.'¹: 20 pM - 300 pM Phosphat, im Medium benötigt werden. So kann die nötige Phosphatmenge berechnet werden, um die gewünschte Biomasse zu erreichen und eine vorzeitige Phosphat-Erschöpfung zu vermeiden.

Hierbei ist zu erwähnen, dass Phosphatkonzentrationen von über 360 pM besonders für die Regulation des hierin beschriebenen HASP1^mod-Prornotors geeignet sind. Durch solch hohe Konzentrationen kann die Expressionsrate des HASP1^mod-Prornotors nicht nur sehr effizient und über einen längeren Zeitraum gehemmt, sondern auch eine höhere Zelldichte erreicht werden, bevor es - durch Verbrauch von Phosphat - zu einer starken Expressionssteigerung kommt. Somit stellt der H AS P1^mod- Pro motor die ideale Steuerung bereit, einerseits hohe Zelldichten ohne Expression des kontrollierten Gens zu erreichen bevor die Expression durch Abbau von Phosphat massiv gesteigert wird. Andererseits ist seine Expressionsstärke sehr fein steuerbar und die maximal möglichen Expressionsraten sehr hoch.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das Kulturmedium als Kohlenstoffquelle Glycerin in einer Menge von mehr als 50 mM, bevorzugt mehr als 60 mM, besonders bevorzugt mehr als 70 mM, ganz besonders bevorzugt mehr als 80 mM, weiter bevorzugt mehr als 90 mM, insbesondere mehr als 100 mM auf. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das initiale Kulturmedium als Kohlenstoffquelle Glucose in einer Menge von mehr als 0,5 g/L, bevorzugt mehr als 1 g/L, besonders bevorzugt mehr als 2 g/L, ganz besonders bevorzugt mehr als 5 g/L, weiter bevorzugt mehr als 10 g/L, insbesondere mehr als 20 g/L auf.

Im Verlauf der gesamten, weiteren Kultivierung erfolgt eine Gabe von Glucose 0,5 g/L, bevorzugt mehr als 1 g/L, besonders bevorzugt mehr als 2 g/L, ganz besonders bevorzugt mehr als 5 g/L, weiter bevorzugt mehr als 10 g/L, insbesondere mehr als 20 g/L alle 2 bis 14 Tage; bevorzugt alle 2 bis 10 Tage, besonders bevorzugt alle 3 bis 7 Tage. Die Gabe kann nur Glucose beinhalten aber auch andere Nährstoffe wie Phosphat, beliebige Stickstoffquelle besonders bevorzugt Salze des NO3. Dabei kann entweder das komplette Medium ausgewechselt oder die Nährstoffe direkt zur Kultur zugegeben werden (kontinuierliche Kultur oder Fed-Batch).

Alternativ kann als Kohlenstoffquelle Acetat, Saccharose, Fructose, Stärke oder eine gleichwertige Kohlenstoffquelle im Kulturmedium vorhanden sein.

Eine Kohlenstoffquelle ist notwendig, da die Lichtdurchflutung des Mediums kontinuierlich durch die steigende Zelldichte reduziert wird.

Trotz Kohlenstoffquelle ist das Wachstum durch das Lichtangebot begrenzt: Es hat sich herausgestellt, dass Licht-bedingt das Zellwachstum bei einer Zelldichte zwischen 30 Millionen Zellen*ml^-1 Millionen und 400 Millionen Zellen*ml^-1 signifikant abnimmt. Somit wird bei einer Zelldichte zwischen 35 Millionen Zellen*ml^-1 und 350 Millionen Zellen*ml’¹, bevorzugt bei einer Zelldichte zwischen 40 Millionen Zellen*ml^-1 und 300 Millionen Zellen*ml^{_ 1}, besonders bevorzugt bei einer Zelldichte zwischen 45 Millionen Zellen*ml^-1 und 400 Millionen Zellen*ml^-1 und insbesondere bevorzugt bei einer Zelldichte zwischen 55 Millionen Zellen*ml^-1 und 200 Millionen Zellen*ml^-1 entweder ein Licht-unabhängiges Zellwachstum oder eine kontinuierliche Verdünnung der Zellkultur oder ein Verfahren benötigt, welches eine Lichtdurchflutung des Mediums ermöglicht. Glycerin und oder Glucose haben sich in den hierin angegebenen Mengen für die Produktion einer hohen Biomasse mit gleichzeitiger hoher Produktion an heterologem Protein als besonders vorteilhaft erwiesen.

Weiterhin bevorzugt weist das Kulturmedium Stickstoff, bevorzugt in Form von NO₃ und/oder NH₄, in einer Menge von mehr als 10 mM, bevorzugt mehr als 15 mM, besonders bevorzugt mehr als 20 mM, ganz besonders bevorzugt mehr als 30 mM, weiter bevorzugt mehr als 40 mM, insbesondere mehr als 50 mM auf. Dabei ist vorteilhafterweise eine ausreichende Verfügbarkeit einer Stickstoffquelle, insbesondere in Form von NO₃ und/oder NH₄, entscheidend für die optimale Proteinproduktion. Liegt die Stickstoffkonzentration unter einem kritischen Wert, so kann die Zelldichte selbst zwar unbeeinflusst bleiben, die Proteinausbeute sinkt jedoch dramatisch ab. Um Einbußen in der Ausbeute zu vermeiden, muss die Stickstoffmenge zum Erreichen einer bestimmten Zelldichte in einem bestimmten Bereich liegen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können dabei NH₄ und/oder NO₃ in jeglicher chemischen Form und Bindung vorliegen.

Stickstoff wird dabei entweder initial und/oder sukzessive zugeführt, um die angegebenen Werte zu erreichen. Bevorzugt wird Stickstoff initial und sukzessive zugegeben.

Bevorzugt beträgt die initiale N0₃-Konzentration des Kulturmediums zwischen 5 mM und 250 mM, bevorzugt zwischen 10 mM und 250 mM, besonders bevorzugt zwischen 20 mM und 250 mM, insbesondere bevorzugt zwischen 50 mM und 250 mM.

Bevorzugt beträgt die sukzessive NO₃-Gabe zum Kulturmediums zwischen 5 mM und 250 mM, bevorzugt zwischen 10 mM und 250 mM, besonders bevorzugt zwischen 20 mM und 250 mM, insbesondere bevorzugt zwischen 50 mM und 250 mM.

Wird als Stickstoffquelle NH₄ verwendet, so erfolgt vorzugsweise ein kontinuierliches Monitoring des pH-Wertes, sowie eine kontinuierliche Pufferung des Kulturmediums, da andernfalls ein Abfall des pH-Wertes zu einer starken Reduktion der Vitalität der Zellkultur führt.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist das Kulturmedium eine initiale Menge an Mikronährstoffen/Spurenelementen und Vitaminen von dem 2- bis 400-fachen, bevorzugt dem 3- bis 400-fachen, besonders bevorzugt dem 4- bis 400-fachen, ganz besonders bevorzugt von dem 5- bis 400-fachen über der jeweiligen „normalen“ Konzentration auf.

„Normale“ Konzentrationen für Spurenelemente und Vitamine wurden für die Kultivierung von Kieselalgen beschrieben und sind dem Fachmann bekannt. Sie können von Publikation zu Publikation abweichen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegenden Referenzwerte für „normale“ Konzentrationen beziehen sich auf das f/2-Medium und sind im Folgenden dargestellt: Tabelle 1 : Zusammensetzung der Medien: enthaltene Spurenelemente.

Tabelle 2: Spurenelemente, die in erhöhten Konzentrationen dem Medium zugesetzt werden.

Hier sind die typischen Konzentrationen des f/2-Mediums (Guillard, 1975) aufgeführt.

Beispielhafte Vitamine, welche in der angegebenen erhöhten Konzentration im Kulturmedium enthalten sind, sind Biotin (standardmäßig in „normaler“ Konzentration von 2 pM eingesetzt), Cyanocobalamin (standardmäßig in „normaler“ Konzentration von 0,37 pM eingesetzt) und Thiamin (standardmäßig in „normaler“ Konzentration von 297 pM eingesetzt).

Das Kulturmedium weist bevorzugt einen pH-Wert von 6 bis 9,5, bevorzugt von 6,5 bis 9, besonders bevorzugt von 7 bis 8,5 auf. Vorzugsweise wird das Kulturmedium mittels Tris- Puffer gepuffert, wobei auch andere, dem Fachmann bekannte pufferaktive Substanzen geeignet sind, welche im genannten pH-Bereich eine gleichwertige Eigenschaft besitzen, beispielsweise HEPES- oder MOPS- Puffer.

Insbesondere enthält das Kulturmedium mehr als 2,5 mM Tris-HCI, pH 8, bevorzugt mehr als 5 mM Tris-HCI, pH 8, besonders bevorzugt mehr als 7,5 mM Tris-HCI, pH 8, ganz besonders bevorzugt mehr als 10 mM Tris-HCI, pH 8.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das Kulturmedium eine Sauerstoffsättigung im Bereich von 40 % bis 100 %, bevorzugt im Bereich von 50 % bis 100 %, besonders bevorzugt im Bereich von 60 % bis 100 %, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 70 % bis 100 %, insbesondere im Bereich von 80 % bis 100 %, auf.

Insbesondere bei höheren Zelldichten hat die Kohlenstoffquelle (beispielsweise in Form von Glycerin, Acetat, Glucose, Saccharose, Fructose, Stärke) des Kulturmediums einen starken Einfluss auf die Zunahme der Biomasse. Bei geringer Lichtverfügbarkeit wirkt nicht mehr das CO2, sondern O2 als Treiber des Zellwachstums. Sauerstoff kann dem Kulturmedium entweder aus der Luft oder als konzentriertes O₂ oder als Gemisch, welches O₂ enthält, zugeführt werden. Entscheidend ist dabei die Sättigung des Kulturmediums mit O2.

Bei heterotrophen oder mixotrophen Bedingungen erfolgt die Kultivierung mit Luft oder O₂ oder einem Gemisch, das O₂ enthält. Diese Weise der Belüftung sorgt dafür, dass das Kulturmedium mit Sauerstoff versorgt bleibt.

Bei der Belüftung mit Luft liegt die initiale Belüftung bei wenigstens 1 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, bevorzugt bei wenigstens 2 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, besonders bevorzugt bei wenigstens 3 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, ganz besonders bevorzugt bei wenigstens 4 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium. Es erfolgt vorzugsweise eine sukzessive Erhöhung der Belüftung mit Luft auf wenigstens 8 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium.

Bei der Belüftung mit Sauerstoff liegt die initiale Belüftung bei wenigstens 0,1 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, bevorzugt bei wenigstens 0,2 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, besonders bevorzugt bei wenigstens 0,3 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, ganz besonders bevorzugt bei wenigstens 0,4 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium. Es erfolgt vorzugsweise eine sukzessive Erhöhung der Belüftung mit O₂ und/oder Luft auf wenigstens 8 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium. Für die photoautotrophe Kultivierung wird zur Belüftung des Kulturmediums vorzugsweise ein Gasgemisch, welches Luft oder ein anderes Gasgemisch mit CO₂ enthält, verwendet. Dabei liegt auch in diesem Anwendungsfall die initiale Belüftung bei der Belüftung mit Luft bei wenigstens 1 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, bevorzugt bei wenigstens 2 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, besonders bevorzugt bei wenigstens 3 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, ganz besonders bevorzugt bei wenigstens 4 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium. Es erfolgt vorzugsweise eine sukzessive Erhöhung der Belüftung mit Luft auf wenigstens 8 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium.

Bei der Belüftung mit einem CO₂ enthaltendem Gasgemisch liegt der CO₂-Gehalt der initialen Belüftung bei wenigstens 0,1 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, bevorzugt bei wenigstens 0,2 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, besonders bevorzugt bei wenigstens 0,3 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium, ganz besonders bevorzugt bei wenigstens 0,4 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium. Es erfolgt vorzugsweise eine sukzessive Erhöhung der Belüftung mit CO₂ auf wenigstens 8 L * min^-1 * L^-1 Kulturmedium.

Eine erhöhte Belüftung führt dabei zu einem deutlich schnelleren Zuwachs der Biomasse.

Ein weiterer, wesentlicher Parameter für die optimierte Kultivierung in Bezug auf Biomasse und heterologer Proteinproduktion stellt die Art (bezüglich des verwendeten Spektrums) und Stärke der Belichtung dar.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Kulturmedium während der Kultivierung gemäß Schritt (b) einer Belichtung mit einer Belichtungsstärke (Lichtintensität) von 20 - 400 pmol *nr² * s^-1, bevorzugt von 40 - 400 pmol *nr² * s^-1, besonders bevorzugt von 60 - 400 pmol *nr² * s^-1, ganz besonders bevorzugt von 80 - 400 pmol *nr² * s^-1, insbesondere von 100 - 400 pmol *nr² * s^-1 ausgesetzt, gemessen im Inneren des Kulturmediums, vorzugsweise mittig in dem Kulturmedium.

Die Messung der Belichtungsstärke erfolgt bevorzugt entweder mit einem PAR-Sensor oder einem ePAR-Sensor (Extended Photosynthetically Active Radiation), welche beide die Messung der Gesamtphotonenflussintensität erlauben, wobei der Messbereich der ePAR Sensoren (400 nm bis 750 nm) im Spektrum über den von PAR-Sensoren (400 nm bis 700 nm) hinausgeht. Alternativ kann die Messung der Belichtungsstärke mit einem anderen geeigneten Lichtintensität und Spektrum erfassenden Sensor erfolgen.

Vorzugsweise ist der verwendete Sensor zur Lichtmessung in einem Winkel von 90 ° zur Lichtquelle ausgerichtet. Dabei befindet sich der Sensor in einer Entfernung relativ zur Gefäßwand, die der Lichtquelle am nächsten steht von dem 0,3- bis 0,5-fachen des Durchmessers des Kultivierungsgefäßes.

Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass eine sukzessive Erhöhung der Belichtungsstärke um 20 - 400 pmol *nr² * s^-1, bevorzugt von 40 - 400 pmol *nr² * s^-1, besonders bevorzugt von 60 - 400 pmol *rrr² * s^-1, ganz besonders bevorzugt von 80 - 400 pmol *m^-2 * s^-1, insbesondere von 100 - 400 pmol *m^-2 * s^-1 erfolgt, gemessen (wie hierin beschrieben) im Inneren des Kulturmediums, vorzugsweise mittig in dem Kulturmedium.

Im Anschluss an das Kultivieren der transformierten Zellen erfolgt erfindungsgemäß die Extraktion der heterolog produzierten Proteine.

Neben dem heterolog produzierten Protein bzw. den heterolog produzierten Proteinen, hierin auch bezeichnet als protein of interest, können die aufgeschlossenen Zellen eine Vielzahl von niedermolekularen Substanzen enthalten, welche für die nachfolgenden Prozesse einen Störfaktor darstellen können. Zu diesen Substanzen zählen beispielsweise Pigmente, also Farbmittel, die mit bloßem Auge sichtbar sind. Es hat sich herausgestellt, dass nach dem Abkühlen der aufgeschlossenen Zellen, insbesondere der aufgeschlossenen Kieselalgenzellen, die Pigmente abgetrennt werden können, was durch gängige Abtrennungsverfahren wie beispielsweise Zentrifugation oder Filtration erfolgen kann. Dazu werden bei den Abtrennungsverfahren die folgenden Temperaturen eingestellt: bevorzugt maximal 4 °C, besonders bevorzugt maximal 2 °C und ganz besonders bevorzugt maximal 0 °C. Weiterhin liegt der pH-Wert des Aufschlusspuffers bevorzugt zwischen pH 2 - 12 und besonders bevorzugt zwischen pH 4 - 10.

Das Extrahieren der heterolog produzierten Proteine erfolgt darüber hinaus durch dem Fachmann bekannte Methoden.

AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die vorliegende Erfindung näher erläutert, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.

Dabei zeigt

Fig. 1 : Eine schematische Übersicht über den Zusammenhang einzelner Erfindungsgegenstände;

Fig. 2A: die Repetition von zwei Promotoren;

Fig. 2B: einen erfindungsgemäßen Vektor mit repetitiv eingesetzten Expressionskassetten;

Fig. 3: ein Diagramm zur Ausbildung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Kopienzahl des verwendeten Promotors in einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder einem erfindungsgemäßen Vektor;

Fig. 4A: ein Diagramm zur Verteilung der Signalintensitäten in Abhängigkeit von der Anzahl der Expressionskassetten in einem erfindungsgemäßen Vektor;

Fig. 4B: ein Diagramm zur Anzahl transgener Kolonien und dem Anteil fluoreszierender Klone in Abhängigkeit von der Anzahl der Expressionskassetten in einem erfindungsgemäßen Vektor;

Fig. 5A: ein Diagramm zur Verteilung der Signalintensitäten in Abhängigkeit von der Art der Vektormodifikation im Bezug auf ein Replikon;

Fig. 5B: einen Nachweis der Ausbildung eines Replikon in Phaeos;

Fig. 6A: das Resultat dreier Gelelektrophoresen zum Vergleich des proteolytischen Abbaus abhängig von der verwendeten Hinge-Region;

Fig. 6B: die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz der Hinge-Region;

Fig. 7: ein Diagramm zur Abhängigkeit des HASP1 ^mod-Prornotors durch Phosphatverbrauch bzw. Repression des HASP1 ^mod-Prornotors durch regelmäßige Phosphatzugabe;

Fig. 8A: ein Diagramm zur Abhängigkeit zwischen Zelldichte und gemessenem GFP- Signal;

Fig. 8B: ein Diagramm zu den Reaktionen sieben unabhängiger Klone auf einen Phosphatmangel im Vergleich zu einem Diagramm der gleichen Klone unter Phosphatzugabe; Fig. 9: ein Diagramm zur Phosphatmangel-abhängigen Aktivierung des erfindungsgemäßen HASP1 ^mod-Prornotors;

Fig. 10: ein Diagramm zur Verkürzung des Erntezyklus durch Phosphatzugabe;

Fig. 11 : eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Vektors;

Fig. 12: ein Diagramm zum Vergleich der tGFP-Signal Intensitäten unabhängiger Klone zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten in 96-Well Platten mit der Referenz in 100 ml Kolben.;

Fig. 13A: Mikroskopische Aufnahme von fusiformen Zellen von P. tricornutunr,

Fig. 13B: Mikroskopische Aufnahme von ovalen Zellen von P. tricornutunr,

Fig. 13C/D: Diagramme zur Korrelation der Optischen Dichte und der Zellzahl bei fusiformen Zellen (C) und ovalen Zellen (D) von P. tricornutunr,

Fig. 13E: ein Diagramm zur Korrelation zwischen erwarteter und gemessener Optischer Dichte in Abhängigkeit von der Zelldichte;

Fig. 14: ein Diagramm zur Korrelation zwischen ELISA-Signalen und GFP-Signalen im Anschluss an ein erfindungsgemäßes Screening-Verfahren;

Fig. 15A: eine mikroskopische Aufnahme von P. tricornutum-ZeWerr,

Fig. 15B: ein Diagramm zum Anteil an verschiedenen Zellformen in Abhängigkeit vom Kulturalter;

Fig. 15C: eine Darstellung von Vitalität und Teilungsrate der Zellen einer Vorkultur von P. tricornutum zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe der Kultivierung;

Fig. 15D: ein Diagramm zum Wachstum der Hauptkultur in Abhängigkeit vom Alter der Vorkultur;

Fig. 16A: ein Diagramm zum Zusammenhang zwischen Proteinproduktion, Kulturalter und Menge der Stickstoffquelle;

Fig. 16B: ein Diagramm zum Zusammenhang zwischen Zelldichte, Kulturalter und Menge der Stickstoffquelle;

Fig. 16C: ein Diagramm zum Zusammenhang zwischen Proteinproduktion, Kulturalter und Menge der Harnstoffquelle;

Fig. 16D: ein Diagramm zum Zusammenhang zwischen Zelldichte, Kulturalter und Menge der Harnstoffquelle;

Fig. 17: ein Diagramm zur Abhängigkeit des Zellwachstums von der Phosphatkonzentration; Fig. 18: ein Diagramm zur Abhängigkeit der absoluten Biomasse von der verfügbaren Konzentration an Spurenelementen und Vitaminen;

Fig. 19: ein Diagramm zur Abhängigkeit der Zunahme der Zellzahl von der Belüftung;

Fig. 20: das Resultat von Gelelektrophoresen nach Aufschluss, Abtrennung von Pigmenten und Aufreinigung von Antikörpern im IgG-Format aus P. tricornutunr,

Fig. 21 : Korrelation zwischen Fluoreszenz und Expressionsrate in 10 unabhängigen Klonen; und

Fig. 22: Ein Diagramm zum Vergleich der Bindungsaffinität zweier Kieselalgen Antikörper(formate) mit den sequenzgleichen aus humaner Zellkultur (Expi^293F).

Die Figur 1 zeigt eine schematische Übersicht über den Zusammenhang einzelner Erfindungsgegenstände. Alle dargestellten Teilschritte (einzeln oder in Kombination) führen zu einer Verbesserung/Optimierung der heterologen Produktion von Proteinen, insbesondere von Antikörpern, insbesondere in der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum.

Wie bereits im Einzelnen erläutert, erfolgt zunächst eine Sequenzoptimierung (1) einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz. Diese kann beispielsweise eine Codonoptimierung und/oder die Verwendung besonders Protease-resistenter genetischer Elemente (wie hierin beschrieben), wie beispielsweise Hinge-Regionen, die aus equinen IgGs (Immunoglobulin G) abgeleitet wurden, beinhalten.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz wird anschließend in einen erfindungsgemäßen Vektor (oder eine erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäure) eingebracht (2), wobei einzelne genetische Elemente und/oder komplette Expressionskassetten repetitiv verwendet werden. Des Weiteren werden spezielle induzierbare Promotoren verwendet, insbesondere ein Promotorelement aus der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1.

Durch die Nutzung bestimmter Signalsequenzen (wie hierin beschrieben) erfolgt die Expression der heterolog zu produzierenden Proteine in das Endoplasmatische Retikulum der Zellen, was zu einem Schutz der Proteine vor Proteasen und zu einer erfolgreichen Glykosylierung führt, wodurch die Ausbeute gesteigert und die Funktionalität der Proteine beibehalten wird.

In einem nächsten Schritt erfolgt die Transformation (3) des erfindungsgemäßen Vektors (oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure) in Zielzellen, bevorzugt in photosynthetisch aktive Zellen, insbesondere Zellen einer einzelligen Pflanze oder Viridiplantae, bevorzugt Zellen von Phaeodactylum tricornutum. Die Transformation kann dabei ballistisch oder mittels Elektroporation in einem geeigneten Medium erfolgen. Im Anschluss erfolgt ein erfindungsgemäßes Screening-Verfahren (4) zur Auswahl von Zellen mit einer erhöhten Expressionsrate einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz. Dabei kann ein Screening mittels Reportergenen nach Hochleistungsproduzenten, sprich nach Zellen mit erhöhter Expressionsrate durchgeführt werden. Weiterhin kann die Korrelation zwischen der Expression der Reportergene und der Expressionsstärke der zu produzierenden Proteine ermittelt werden. Vorzugsweise werden sowohl für das Screening- Verfahren als auch für die Kulturüberwachung Multiwell-Platten verwendet.

Im Anschluss an das erfindungsgemäße Screening-Verfahren (4) kann ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen, vorzugsweise rekombinanten Antikörpern, (5) auf Basis der im Screening-Verfahren (4) ermittelten Zellen mit erhöhter Expressionsrate erfolgen.

Die Herstellung rekombinanter Proteine erfolgt dabei erfindungsgemäß in einem Kulturmedium, welches auf die verwendeten genetischen Elemente, insbesondere auf die verwendeten Promotoren, abgestimmt ist. Auch die Kultivierungsbedingungen, wie beispielsweise Mindestlichtstärken und Belüftungsmengen, sind (wie hierin definiert) angepasst.

Sowohl in Bezug auf die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz als auch in Bezug auf den erfindungsgemäßen Vektor (6) oder die erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäure führt die Verwendung repetitiver genetischer Elemente zu einer enormen Steigerung der Expressionsraten in P. tricornutum. Figur 2A zeigt die Repetition von zwei HASP1- Promotoren. In Figur 2B ist beispielhaft eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Vektors (6) dargestellt, in welchen eine Expressionskassette (9) repetitiv eingesetzt wurde, hier in Form einer dreifachen Kassette für die Produktion von Antikörpern im scFv-Fc- Format. Insbesondere führt diese repetitive Verwendung der Expressionskassette (9) zu einer deutlichen Steigerung der Ausbeute sowie der Anzahl an Klonen bzw. dem Anteil an Klonen, die eine detektierbare Produktion zeigen, wodurch insgesamt der Prozessaufwand minimiert wird. Die Expressionskassette (9) weist im dargestellten Ausführungsbeispiel ein Promotorelement (9.1), eine erste Transkriptionseinheit (9.2), welche für ein rekombinant zu erzeugendes Protein codiert, sowie eine zweite Transkriptionseinheit (9.3), welche für das Reportergen tGFP codiert, auf, wobei die einzelnen genetischen Elemente (9.1 , 9.2, 9.3) in Figur 2B beispielhaft an einer Expressionskassette (9) angetragen sind, jedoch in den anderen Expressionskassetten (9) ebenfalls vorliegen.

In Figur 3 ist ein Diagramm zur Ausbildung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der

Kopienzahl des verwendeten Promotors (9.1) in einer erfindungsgemäßen

Nukleinsäuresequenz oder einem erfindungsgemäßen Vektor (6) oder einer erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäure dargestellt. Insbesondere ist in Figur 3 die Verteilung der Mediane der GFP-Signale (mittels ODeoo normalisierte Fluoreszenz-Signale des Green Fluorescent Protein) in Abhängigkeit von dem verwendeten Promotor (9.1) dargestellt, wobei der HASP1 ^mod-Prornotor entweder in einfacher Ausführung (links) oder in doppelter Ausführung (rechts) eingesetzt wurde. Es ist erkennbar, dass die repetitive (hier doppelte) Verwendung des HASP1^m°^d-Prornotors zu einer Verstärkung der gemessenen GFP-Signale führt.

Figur 4A zeigt ein Diagramm zur Verteilung der Signalintensitäten in Abhängigkeit von der Anzahl der Expressionskassetten (9) in einem erfindungsgemäßen Vektor (6). Es ist zu erkennen, dass eine erhöhte Anzahl an Expressionskassetten (9) im Vektor (6) zu einer Verstärkung des Fluoreszenzsignals (gemessen als normalisiertes tGFP-Signal, beachte Iog2-Skalierung) führt, was auf die verstärkte Expression des Reportergens zurückzuführen ist. In Figur 4B ist ein Diagramm zur Anzahl transgener Kolonien und dem Anteil fluoreszierender Klone in Abhängigkeit von der Anzahl der Expressionskassetten (9) in einem erfindungsgemäßen Vektor (6) dargestellt (hierbei handelt es sich um eine Iog2- Skala). Es wird deutlich, dass eine erhöhte Anzahl an Expressionskassetten (9) sowohl die Anzahl an transgenen Klonen als auch den Anteil an Klonen mit detektierbarem Fluoreszenz-Signal erhöht, wobei das fluoreszierende Signal ein direktes Maß für die Proteinproduktion/ Antikörperproduktion ist.

Figur 5A verdeutlicht die Steigerung der Ausbeute an heterolog produziertem Protein in Abhängigkeit von der Verwendung von replikativen, viralen Einheiten. Dargestellt ist ein Diagramm zur Verteilung der Signalintensitäten in Abhängigkeit von der Art der Vektormodifikation im Bezug auf ein Replikon, wobei in dem gezeigten Ausführungsbeispiel das Replikon aus dem Weed Dwarf Virus (WDV) verwendet wurde. Die Verwendung des Replikons (rechts im Diagramm) führt zu einer deutlichen Verstärkung des Fluoreszenzsignals (gemessen als normalisiertes tGFP-Signal, beachte Iog2-Skalierung) im Vergleich zu nicht derart modifizierten Vektoren (links im Diagramm) und somit zu einer Steigerung der Ausbeute heterolog produzierter Proteine. Dem zugrunde liegt, dass das Replikon eine unabhängige Teilung der transformierten DNA ermöglicht. Dadurch erhöht sich die Kopienzahl transformierter DNA, wodurch z. B. die Transkript-Menge (mRNA) ansteigt und mehr Protein entsteht. Weiterhin kann eine erhöhte Kopienzahl der einzubringenden Transkriptionseinheit (9.2) zur Folge haben, dass diese DNA mehrfach ins Genom integriert wird, was die Chance einer Integration an einem „günstigen“ Lokus erhöht.

Figur 5B zeigt eine schematische Darstellung des repModi Vektor (mit sog. Replikon modifizierter Vektor) und putativen Replikon und die Analyse einiger Klone aus dem von repModi Ansatz. Oben in der Abbildung) Schematische Darstellung des repModi Vektors und des putativen Replikons mit entsprechender Primer-Position für Nachweis und Sequenzierung. Unten links in der Abbildung) PCR-Analyse der Kontrolle und der Klone D6, E2, E12, F8 auf Antikörper und Replikon Formierung. Unten rechts in der Abbildung) Sequenzierergebnis der Replikon Amplifikate der Klone E12 und F8. Marker (M): GeneRuler 1 kb Plus. Das Primerpaar R1/R2 diente dem Nachweis einer Replikon (480 bp) Formierung und das Primerpaar AK1/AK2 diente dem Nachweis der Antikörpersequenz (390 bp). Schwarze Pfeile in der Abbildung unten links zeigen auf die jeweiligen Amplifikate auf korrekter Höhe.

Der repModi Vektor (in Fig. 5B repModi) wurde mit genetischen Elementen aus dem Weed Dwarft Virus (WDV) ausgestattet. Die Replikon formierende Einheiten (2x LIR, RepA und SIR) flankieren dabei die Antikörperkassette und sind an der Rekombination des Vektors beteiligt. Nach dem Rekombinationsereignis besteht der Vektor aus einem LIR-Element, dem RepA, dem SIR-Element und der Antikörperkassette, das Backbone und ein LIR-Element werden entfernt. Eine solche Einheit ist in der Lage, sich im Wirtsorganismus unabhängig zu Replizieren.

Um zu überprüfen, ob es zu diesem Rekombinationsereignis gekommen war, wurden entsprechende Primer synthetisiert. Das Primerpaar R1/R2 sollte dabei das Rekombinationsereignis nachweisen (480 bp) und das Primerpaar AK1/AK2 einen kleinen Teil der Antikörperkassette (390 bp). Im Falle einer Rekombination reduziert sich der Abstand zwischen Primer R1 und R2 von 3720 bp auf 480 bp.

In Figur 5B links unten sind die Resultate der PCR dargestellt. Als Kontrolle wurde ein Klon verwendet, der dieselbe Antikörpersequenz enthält wie die repModi Ansätze, jedoch in den noModi Vektor kloniert worden war. Mit dem Primerpaar AK1/AK2 konnten in allen Klonen eine Bande bei ca. 400 bp nachgewiesen werden. Mit dem Primerpaar R1/R2 konnte, bis auf die Kontrolle, in allen getesteten Klonen D6, E2, E12 und F8 eine Bande von ca. 500 bp nachgewiesen werden. Die Amplifikate der Klone E12 und F8 wurden anschließend sequenziert. Die Sequenzierung ergab eine Basenabfolge, wie sie bei einer Rekombination zu erwarten wäre (Figur 5B rechts unten). Das PCR-Ergebnis und die Sequenzierung deuten stark auf die Formierung eines Replikons hin.

In Figur 6A ist das Resultat verschiedener Gelelektrophoresen zum Vergleich des proteolytischen Abbaus abhängig von der verwendeten Hinge-Region dargestellt.

Die mit M beschrifteten Spuren zeigen immer den gleichen Größenmarker. In den verschiedenen Bahnen sind verschiedene IgGs aufgetragen: Spur 1 : equines lgG6, Spur 2: equines scFv-Fc, Spur 3: murines lgG1 und Spur 4: humanes lgG1. Die ausgefüllten Pfeile weisen auf die nicht proteolytisch gespaltenen schweren Kette (HC), die schraffierten Pfeile auf die Leichten Ketten (LC). In Bahn 2 fehlt diese Bande, weil im scFv-Fc-Format die LC kovalent an die anderen Bereiche des scFv-Fc gebunden ist und daher im SDS-PAGE nicht abgetrennt wird. Daher ist die obere Bande in Bahn 2 auch weniger weit gelaufen als die in allen anderen Bahnen. Die nicht ausgefüllten Pfeile weisen auf die bei murinen und humanen IgGs auftretenden Spaltprodukte. Dabei ist zu erkennen, dass die Verwendung Protease-resistenter Elemente, hier einer Protease-resistenten Hinge-Region, maßgeblich die Proteolyse der in P. tricornutum hergestellten Antikörper verschiedener Formate und aus verschiedenen Spezies, sowohl in vivo als auch in vitro, reduziert.

Figur 6B zeigt die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz der equinen Hinge-Region aus eqlgG6. Der beschriebene Effekt der Reduktion der Proteolyse durch die Hinge-Region trifft dabei auch auf solche genetischen Elemente zu, in denen diese Aminosäuresequenz um bis zu 30 % verändert wurde.

In Figur 7 ist ein Diagramm zur Abhängigkeit des HASP1 ^mod Promotors durch Phosphatverbrauch (dunkelgraue Kurve) bzw. Repression des HASP1^mod Promotors durch regelmäßige Phosphatzugabe (hellgraue Kurve) dargestellt. Das GFP-Signal ist ein direktes Maß für die Promotoraktivität bzw. Proteinproduktion. Mehrere unabhängige Klone zeigten diese Phosphat-Abhängigkeit. Repräsentativ wird einer der Klone hier dargestellt. Es ist zu erkennen, dass der HASP1^mod -Promotor durch Phosphat inhibiert wird und durch Phosphatmangel getriggert wird. Hierbei sind mit „Phosphat“, alle Phosphat-Salze und phosphathaltigen organischen Verbindungen und alle chemischen Formen von Phosphat gemeint. Es ist zu erwähnen, dass Phosphatkonzentrationen von über 360 pM besonders für die Regulation des Promotors geeignet sind. Durch solch hohe Konzentrationen kann die Expressionsrate des HASP1^mod-Prornotors nicht nur sehr effizient und über einen längeren Zeitraum gehemmt, sondern auch eine höhere Zelldichte erreicht werden, bevor es - durch Verbrauch von Phosphat - zu einer starken Expressionssteigerung kommt. Somit stellt der HASP1^mod-Prornotor die ideale Steuerung bereit, einerseits hohe Zelldichten ohne Expression des kontrollierten Gens zu erreichen, bevor die Expression durch Abbau von Phosphat massiv gesteigert wird. Andererseits ist seine Expressionsstärke sehr fein steuerbar und die maximal möglichen Expressionsraten sehr hoch.

Figur 8A zeigt ein Diagramm zur Abhängigkeit zwischen Zelldichte und gemessenem GFP- Signal in drei unterschiedlichen Zellkulturen (dunkelgrau, mittelgrau, hellgrau). Dabei ist jeweils in gestrichelter Linie das zu erwartende (bei uneingeschränkt linearem Verhalten), in durchgängiger Linie das gemessene GFP-Signal dargestellt. Es ist zu erkennen, dass das gemessene Signal von dem erwarteten Signal abweicht. Der Grund dafür ist die steigende Zelldichte. Der Zusammenhang zwischen Zelldichte und Signalstärke ist in einem bestimmten Bereich linear. Werden Signale über einer kritischen Zelldichte gemessen, muss somit eine entsprechende Korrektur durchgeführt werden. Insbesondere führt diese Abweichung dazu, dass bei Verwendung eines Nährstoffmangel abhängigen Promotors (z. B. HASP1^mod, alkalische Phosphatase) oder eines Nährstoff-getriggerten Promotors (z. B. Nitratreduktase) die Nährstoffkonzentration der Zellkultur für Studien auf molekularer Ebene (z. B. Testung von weiteren regulatorischen Sequenzen als auch für Kultivierungsstudien) überlegt gewählt werden muss. Der Mangel muss entstehen, bevor die Zelldichte den kritischen Wert überschreitet, ansonsten ist ein Vergleich zwischen den Klonen nicht möglich. Bei Verwendung von Nährstoffmangel-getriggerten Promotoren muss zudem beachtet werden, dass nur Klone miteinander verglichen werden, die eine ähnliche Zellzahl zeigen und es müssen globale Peaks der einzelnen Signalzeitreihe zur Bewertung der Produktion herangezogen werden. Sollte die kritische Zelldichte überschritten werden, besteht kein linearer Zusammenhang zwischen der Zellmenge und Signalintensität. Da die zugrundeliegenden Effekte überwiegend von der Zelldichte abhängen, kann die Messung mittels eines Standards korrigiert werden.

Figur 8B zeigt ein Diagramm zu den Reaktionen sieben unabhängiger Klone auf einen Phosphatmangel (links) im Vergleich zu einem Diagramm der gleichen Klone unter Phosphatzugabe (rechts). Der Wildtyp ist in beiden Diagrammen als Graph mit kenntlich gemacht veranschaulicht. Ohne Zugabe von Phosphat (linkes Diagramm) stiegen die tGFP- Signale aller transgener Klone an. Mit Zugabe von Phosphat (rechtes Diagramm) sanken die tGFP-Signale auf ein niedriges Niveau.

Ein Diagramm zur Phosphatmangel-abhängigen Aktivierung des erfindungsgemäßen H AS P1^mod- Pro motors ist in Figur 9 dargestellt. Verdeutlicht wird die Stärke des GFP-Signals in Abhängigkeit vom Kulturalter anhand von vier unterschiedlichen Kulturen. Die vier Kulturen wurden in Kulturmedien mit unterschiedlichen Phosphatkonzentrationen kultiviert, wobei 36 pM die geringste und 360 pM die höchste Phosphatkonzentration darstellte. Das GFP-Signal ist auch hier ein direktes Maß für die Aktivierung des Promotors und die Proteinproduktion. Mit Erhöhung der Phosphatkonzentration verschiebt sich der Peak des GFP-Signals, da der Phosphat-Mangel zu einer späteren Zeit entsteht, bzw. bei einer höheren Zelldichte. Während in einem Medium mit der niedrigsten Phosphatmenge der Peak nach ca. 16 Tage auftritt (36 pM), tritt dieser Peak bei höheren Konzentrationen an ca. Tag 24 (72 pM), Tag 29 (140 pM) auf bzw. wird der Peak nicht erreicht (360 pM). Wann dieser Peak erreicht wird, hängt von der initialen Phosphatkonzentration, der Wachstumsrate der Zellen und der absoluten Zellzahl ab. Zwar wird der Peak der Kultur mit der hier höchsten Phosphatkonzentration nicht erreicht, trotzdem ist die Ausbeute hier am höchsten, da die Zelldichte durch die erhöhte Phosphatverfügbarkeit um vielfaches höher ist als die Zelldichte übriger Kulturen. Über die Phosphatmenge lässt sich auf diese Weise sowohl die Ausbeute als auch der „Erntezeitpunkt“ genau kontrollieren.

Figur 10 zeigt ein Diagramm zur Verkürzung des Erntezyklus durch Phosphatzugabe bei Verwendung eines Phosphatmangel-getriggerten Promotors. Im Vergleich zur Kontrolle wird der Peak der Produktion früher erreicht, wenn die Phosphatmenge im Medium auf einem konstant „niedrigen“ Niveau gehalten wird oder Phosphat in bestimmten Abständen zugeführt wird. Dieser Effekt entsteht, weil die Zellen durch einen niedrigeren Phosphatgehalt (als der maximal erwünschte Phosphatgehalt) im Kulturmedium einen zu einem früheren Zeitpunkt (als bei der initialen Zugabe der maximal erwünschten Phosphatmenge) einen Phosphatmangel "erwarten" und deshalb alle Phosphat-abhängigen Promotoren entsprechend reguliert werden (so wie z.B. den HASP1^mod). Durch erneutes Hinzufügen von Phosphat tritt der "erwartete" Mangel zwar nicht ein (oder nicht in dem "erwarteten" Ausmaß), die durch die "Erwartung" erfolgte Aktivierung des z. B. HASP1^mod Promoters wirkt jedoch noch einige Zeit nach, wodurch bereits das mit dem HASP1^mod Promotor verknüpfte Protein of Interest (z.B. ein Antikörper) produziert wird. So kann der o.g. Prozess fortgesetzt werden, in dem die Zellen "in dem Glauben" gelassen werden, dass ein Phosphatmangel eintritt. Ob und wann dieser Mangel eintrifft, ist von der gewünschten Dauer der Kultivierung abhängig und wird durch die zuständige Person kontrolliert. Im dargestellten Ausführungsbeispiel wird Phosphat in Form von NaH₂PO₄ in bestimmten Abständen zugeführt.

In Figur 11 ist beispielhaft eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Vektors (6) zur Transformation von P. tricornutum dargestellt. Nur Elemente, die für P. tricornutum wichtig sind, sind dargestellt. Dieses Konstrukt führt in der transformierten Kieselalge zur Produktion eines Antikörpers im sogenannten scFv-Fc-Format (dessen einzelne Elemente sind: eine variable schwere Kette VH (9.21), welche mittels Linker mit einer variablen leichten Kette VL (9.22) verbunden ist. Diese liegt vor den konstanten Bereichen, hier eine humane Zwischensequenz, der Hinge-Region (9.23) sowie einer equinen konstanten Region (CH2 und CH3) (9.24). Dieser Bereich ist über einen proteolytisch spaltbaren Flag-Tag mit einem Reportergen (9.3), hier turboGFP verbunden, welches wiederum mit einem Strep-Tag fusioniert ist. Ein weiteres genetisches Konstrukt unter der Kontrolle eines konstitutiven fcpB- Promotors ist ein Selektionsmarker (9.5), hier das Zeocin-Resistenzgen. Es wird deutlich, dass genetische Elemente unterschiedlichen Ursprungs (hier Antikörper im scFv-Format mit synthetischen, humanen und equinen Ursprung) miteinander kombiniert werden können und trotzdem funktionale Proteine bilden.

Figur 12 verdeutlicht einen Vergleich der tGFP-Signal Intensitäten unabhängiger Klone zu drei unterschiedlichen Zeitpunkten in 96- Well Platten mit der Referenz in 100 ml Kolben. Um eine Auswertung der tGFP-Signale in einer Multiwell-Platte zu etablieren, wurde überprüft zu welchem Zeitpunkt die tGFP-Signale in der Multiwell-Platte dem „finalen/tatsächlichen“ tGFP- Signal am nächsten kommen. Dazu wurden die tGFP-Signale von 29 unabhängigen Klonen zu mehreren Zeitpunkten in einer 96-Well-Platte gemessen und anschließend die tGFP- Signale derselben Kulturen in 100 ml Kolben bestimmt. In vorangegangenen Experimenten wurde mittels SDS-PAGE gezeigt, dass die tGFP Signale in 100 ml Kolben mit der tatsächlichen Proteinmenge korrelieren. In der Figur 12 wurde die Entwicklung der tGFP- Signale in den 96-Well-Platten zu 4 unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Animpfen der Kultur dargestellt (Tag 1 , Tag 4, Tag 6, Tag 8). In der Legende sind entsprechenden R²- Werte angegeben. Die R²- Werte liegen bei 0,1 ; 0,86; 0,93 und 0,93 für die entsprechenden Zeitpunkte 1 , 4, 6 und 8. Die Korrelation zwischen dem gemessenen tGFP-Signal in der 96- Wellplatte und dem maximal zu erreichendem tGFP-Signal am 1. Tag nach der Innokulation war nicht gegeben. An Tag 4 stieg der R²-Wert auf 0,86 und erhöhte sich auf 0,93 am 6. Tag. Von Tag 6 auf Tag 8 gab es keine durch den R²-Wert messbare Veränderung der Korrelation.

Die Figuren 13A und 13B zeigen mikroskopische Aufnahmen von verschiedenen Zellformen der P. tricornutum Kultur, wobei Figur 13A fusiforme Zellen und Figur 13B ovale Zellen zeigt. Dabei sind beide morphologischen Typen in jeder Kultur vorhanden, wobei das Verhältnis zwischen den Anteilen zwischen > 0 und < 1 variieren kann. Bei der Bestimmung der Zellzahl von Phaeodactylum mittels der optischen Dichte muss die Morphologie der Zellen beachtet werden, um eine fehlerhafte Korrelation zu vermeiden. Der entsprechende Faktor ist dabei von dem Gerät abhängig.

In den Figuren 13C und 13D sind Diagramme zur Korrelation der optischen Dichte (OD) und der Zellzahl bei fusiformen Zellen (C) und ovalen Zellen (D) von P. tricornutum dargestellt. Aus dem in Figur 13E dargestellten Diagramm zur Korrelation zwischen erwarteter und gemessener Optischer Dichte in Abhängigkeit von der Zelldichte wird deutlich, dass die Zellen eine gewisse Zellzahl nicht überschreiten dürfen, um einen linearen Zusammenhang bzw. verlässliche, lineare Messergebnisse zu erhalten. Der Bereich, in dem die Zellzahl liegen muss, ist von der Zellgröße, -art und dem Messinstrument abhängig und muss dadurch empirisch, z. B. über Verdünnungsreihen, bestimmt werden. Zur Bestimmung der Zellzahl in einer Phaeodactylum tricornutum -Kultur können unterschiedliche Wellenlängen verwendet werden, welche bevorzugt bei 600 - 800 nm liegen. Besonders bevorzugt wird die Messung bei einer Wellenlänge von 600-750 nm durchgeführt.

Figur 14 zeigt ein Diagramm zur Korrelation zwischen ELISA-Signalen und GFP-Signalen im Anschluss an ein erfindungsgemäßes Screening-Verfahren. GFP-Signale repräsentieren hier die Proteinmenge. Diese Korrelation mit einem R²-Wert von 0,92 zeigt, dass die angewandte Hochdurchsatzmethode zur Lyse der Zellen im ELISA Verfahren verwendet werden kann.

Figur 15A zeigt eine mikroskopische Aufnahme von P. tricomutum-ZeWen, wobei die Zellen entweder als einzelne Zelle (11.1), als Zellkette aus zwei Zellen (11.2) oder als vielfache Zellketten (11 .3) vorliegen. Der optimale Zeitpunkt für die Überführung der Vorkultur in die Hauptkultur (im Rahmen des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens) ist ein Zeitpunkt, an dem das Verhältnis von einfach vorliegenden Zellen zu zweifachen Zellketten zwischen

O,3 und 10 liegt.

Ein Diagramm zum Anteil an verschiedenen Zellformen in Abhängigkeit vom Kulturalter ist in Figur 15B dargestellt. Dabei ist mit „1x“ der Anteil an einzelnen Zellen (11.1), mit „2x“ der Anteil an Zellketten aus zwei Zellen (11 .2) und mit „>2x“ der Anteil an vielfachen Zellketten (11.3) bezeichnet.

Figur 15C zeigt eine Darstellung von Vitalität und Teilungsrate der Zellen einer Vorkultur von

P. tricornutum zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe der Kultivierung der Vorkultur. Schließlich ist in Figur 15D ein Diagramm zum Wachstum der Hauptkultur in Abhängigkeit vom Alter der Vorkultur dargestellt. Anhand der Figuren 15B, 15C und 15D wird deutlich, dass der Zeitpunkt, an dem die Vorkultur in Hauptkultur überführt werden sollte, eine wichtige Rolle spielt. Dabei besteht ein Zusammenhang zwischen Vitalität, Teilungsrate und/oder dem Verhältnis zwischen einzeln vorliegender Zelle und Zellketten aus zwei oder mehr Zellen in der Vorkultur und der anschließenden Wachstumsgeschwindigkeit der Hauptkultur. Dabei muss der Anteil lebender Zellen hoch sein und eine gewisse Teilungsaktivität der Vorkultur nicht unterschritten werden, um so die optimale Zunahme der Biomasse zu ermöglichen. Höhere Biomasse führt zu einer höheren Ausbeute bei der Hauptkultur. Zum Bestimmen des optimalen Zeitpunktes kann entweder der Anteil an lebenden Zellen (Fig. 15C), das Verhältnis zwischen doppelt und einfach Vorliegenden Zellen herangezogen werden oder die Teilungsrate in über einem gewissen Schwellenwert liegen (Fig. 15A und 15B).

In Figur 16A ist ein Diagramm zum Zusammenhang zwischen Proteinproduktion, Kulturalter und Menge der Stickstoffquelle und in Figur 16B ein Diagramm zum Zusammenhang zwischen Zelldichte, Kulturalter und Menge der Stickstoffquelle dargestellt. Die Angaben zu den Stickstoffquellen sind dabei jeweils in mM angegeben. Während die Zelldichte nur minimal von der Stickstoffkonzentration beeinflusst wird (Fig. 16B), hängt die Menge des produzierten Proteins sehr stark von der Menge der Stickstoffquelle ab (Fig. 16A). Das GFP- Signal ist auch hier ein direktes Maß für die Menge an heterolog exprimiertem Protein. Eine ausreichende Verfügbarkeit einer Stickstoffquelle ist entscheidend für die optimale Proteinproduktion (besonders NO₃ und NH₄). Liegt diese unter einem kritischen Wert, so kann die Zelldichte selbst zwar unbeeinflusst bleiben, die Proteinausbeute sinkt jedoch dramatisch ab. Um Einbußen in der Ausbeute zu vermeiden, muss die Stickstoffmenge zum Erreichen einer bestimmten Zelldichte in einem bestimmten Bereich liegen (z. B. NH₄ oder NO₃ in jeglicher chemischen Form und Bindung).

Die Figur 16C zeigt ein Diagramm zum Zusammenhang zwischen Proteinproduktion, Kulturalter und Menge der Harnstoffquelle, während Figur 16D ein Diagramm zum Zusammenhang zwischen Zelldichte, Kulturalter und Menge der Harnstoffquelle zeigt. Auch hier sind die Angaben zu den Harnstoffquellen im mM angetragen. Ähnlich wie in Figur 16A und 16B beeinflusst auch hier die Stickstoffmenge die Proteinproduktion. Wie in 16D zu erkennen ist Harnstoff (Urea) jedoch ab einer gewissen Konzentration schädlich für die Kultur, da die Kultur nach einiger Zeit in einer Konzentration von 10 mM Urea stirbt. Somit ist die initiale Konzentration von Urea auf >10 mM limitiert.

Figur 17 zeigt ein Diagramm zur Abhängigkeit des Zellwachstums von der Phosphatkonzentration. Es wird eine bestimmte Menge an Phosphat benötigt, um eine bestimmte maximale Zelldichte zu erreichen. Die unterschiedlichen Phosphat- Konzentrationen sind in pM angegeben. Hier zeigt sich deutlich die feine Balance zwischen Aktivierung des Promoters HASP1^mod und dem Erreichen einer hohen Zelldichte (vergleiche mit Figur 9).

Figur 18 zeigt ein Diagramm zur Abhängigkeit der absoluten Biomasse von der verfügbaren Konzentration an Spurenelementen und Vitaminen. Bei der Kontrolle werden dabei Vitamine und Spurenelemente mit einer Konzentration verwendet, wie sie im f/2-Medium („Standardmedium“) beschrieben wird. In den vier nachfolgenden Proben wurden jeweils Vitamine (V) und Spurenelemente (S) in einer x-fachen Menge zum Standardmedium eingesetzt: 5-fache Menge, 40-fache Menge, 80-fache Menge und 160-fache Menge. Zu erkennen ist, dass auch eine extreme Steigerung der Konzentration nicht zu einer signifikanten Reduktion der Biomasse führt. Gerade in einer Batch Kultur ist es von Vorteil das Medium mit möglichst viel Nährstoff anzureichern um einen möglichen Mangel zu vermeiden.

Ein Diagramm zur Abhängigkeit der Zunahme der Zellzahl von der Belüftung des Kulturmediums ist in Figur 19 dargestellt. Eine erhöhte Belüftung mit 3 L/min (obere Linie) zeigte gegenüber der Kontrolle (Belüftung mit 1 L/min untere Linie) einen deutlich schnelleren Zuwachs der Biomasse. Hier zeigt sich, dass eine ausreichende Versorgung mit Gasen wie CO2 und O2 eingestellt werden muss. Vor allem nimmt die Durchflutung des Mediums mit Licht bei bereits geringen Zelldichten sehr stark ab, wodurch die Photosynthese zum Erliegen kommt. Ab diesem Zeitpunkt setzt die Zelle vermehrt auf die Aufnahme externer, organischer C-Quellen wie Glycerin oder Glucose und benötigt somit immer mehr O₂.

Figur 20 (A und B) zeigt das Resultat von Gelelektrophoresen nach Aufschluss und Aufreinigung von Antikörpern im IgG-Format aus P. tricornutum. Figur 20A zeigt die Coomassie-gefärbte SDS-PAGE, Figur 20B die zugehörige Immunfärbung. Auf den mit „Ü“ bezeichneten Spuren ist jeweils der Überstand aufgetragen, die mit „PP“ bezeichneten Spuren weisen pigmenthaltiges Pellet auf. Das Pigment konnte von dem rekombinanten Antikörper abgetrennt werden, ohne hohe Einbussen der Ausbeute zu erleiden. Eine Störung durch das Pigment im weiteren Verfahren ist auf ein Minimum reduziert. Die Immunfärbung erfolgte mit Maus-Anti-Strep Antikörper und Kaninchen-Anti-MauslgG-AP, weshalb in der Immunfärbung nur die schwere Kette detektiert wird, da die leichte Kette keinen Strep-Tag enthält. Das Rohlysat von Kieselalgen wurde abgekühlt. Nach dem Zentrifugieren oder Filtrieren haben sich 2 Fraktionen ausgebildet. Die Fraktion „Ü“ war der lösliche Überstand und die Fraktion „PP“ war das pigmenthaltige Pellet. Dabei ist entscheidend, dass das Pigment abgetrennt werden konnte und dass der größte Anteil des Antikörpers im löslichen Überstand verbleibt.

Die Figuren 21A-D zeigen die Korrelation zwischen der Fluoreszenz und der Expressionsrate in 9 von insgesamt 30 unabhängigen Klonen. Die Figur 21A zeigt tGFP- Fluoreszenz-Units (Turbo-Green Fluorescent Protein, tGFP) für die 9 Klone. Figur 21 B zeigt zugehörige Proteinextrakte aufgetrennt einer Coomassie-gefärbten SDS-PAGE, wobei die Zahlen oberhalb der Bahnen unterschiedliche, voneinander unabhängige Klone repräsentieren (schwarzer Pfeil markiert die schwere Kette des Antikörpers). Figur 21C zeigt die Immunfärbung der exprimierten Antikörper in den entsprechenden Proben, deren Beschriftung denen in Figur 21 B entspricht (schwarzer Pfeil markiert die schwere Kette des Antikörpers). Figur 21 D eine zeigt eine starke Korrelation zwischen dem GFP-Signal aus 21 A und der Pixelintensität der schweren Kette aus 21 B mit einem R²-Wert von 0,94 und Figure 21 E zeigt die dazugehörige Balkengraphik, in welcher die Werte aus tGFP-Signal und SDS-Bandenstärke (Antikörperbande, densitometrisch in der Bio-Doc (Bio-Rad) gemessen) jeweils nebeneinander aufgetragen sind.

Das durch das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren hergestellte Produkt ist somit nicht nur preiswerter in der Produktion, sondern das Herstellungsverfahren besitzt gegenüber klassischen Verfahren eine Reihe von Vorteilen: Die produzierten Antikörper besitzen die gleichen Aviditäten wie das Pendant aus Expi^293F-Zellen (Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden. 22). Weiterhin ist das hier vorgestellte Verfahren nachhaltig, tierfrei und - abhängig von der Herkunft der zu produzierenden Antikörpersequenz - sogar vegan. Im Vergleich zu Antikörperseren aus Tieren sind die hier vorgestellten Antikörper dauerhaft verfügbar. Die Produktion kann sehr einfach erhöht werden und die Produkte sind frei von Humanpathogenen.

In Figur 22 ist ein Diagramm zum Vergleich der Bindungsaffinität zweier Kieselalgen Antikörper(formate) (hellgrau, mit Dreiecken versehene Graphen) mit den sequenzgleichen aus humaner Zellkultur (Expi293F) (dunkelgrau, mit Vierecken versehene Graphen) dargestellt. In einem kompetitiven Titrationsassay wurden die Aviditäten von Antikörpern verschiedener Formate (IgG bzw. scFv-Fc) gegen equines Interleukin 31 bei steigenden Antikörperkonzentrationen analysiert. Bei den sequenzgleichen IgGs (durchgezogene Linien) aus Kieselalgen bzw. Expi^293F-Zellen zeigen sich keine Unterschiede, bei den scFv-Fc’s (gestrichelt) der unterschiedlichen Ausgangszeilen ist der scFv-Fc aus Kieselalgen sogar affiner als das Original aus der humanen Zellkultur.

Konkretes Ausführunqsbeispiel

Das Ausführungsbeispiel, dessen Ablauf in Fig. 1 skizziert ist, zeigt die Produktion eines Antikörpers mit dem erfindungsgemäßen Verfahren. Dieser Antikörper im IgG-Format ist gegen equines Interleukin 31 gerichtet und wurde mit mehr als 160 mg aufgereinigtem eqlgG * L^-1 Zellkultur innerhalb einer 14-tägigen Kulturdauer produziert.

In einem ersten Schritt wird die Codon-Nutzung an P. tricornutum angepasst. Im vorliegenden Fall stammt die Ausgangssequenz aus einer humanen scFv-Bank und wurde vor Einsatz in den Kieselalgen Codon-optimiert. Die benötigten genetischen Elemente, typischerweise die variable leichte Kette (V_L) sowie die variable schwere Kette (V_H) wurden von der Firma IDT-DNA (Coralville, Iowa) synthetisiert, so dass sie optimal in die erstellten Vektoren passen (Fig. 2B). Dabei wurden auch störende Restriktionsstellen entfernt, bzw. modifiziert. Eine Variante der erfindungsgemäßen Vektoren für die Produktion von Antikörpern im scFv-Fc-Format ist in Fig. 2B dargestellt. Hier kann die variable leichte Kette (kappa- oder lambda-Format (V_LK oder V_LA)) sowie die variable schwere Kette (V_H) eingesetzt werden. In diesem Beispiel stammen die konstanten Bereiche beider Ketten aus dem Pferd. Es wurden auch Konstrukte generiert, die konstante Antikörperbereiche aus anderen Wirtsorganismen (z. B. Maus oder Mensch) enthalten. Weitere Varianten der erfindungsgemäßen Vektoren sind für die heterologe Produktion anderer Formate wie Fab oder scFv-Fc hergestellt und erfolgreich eingesetzt worden. Das in Fig. 2B dargestellte Beispiel enthält das fertige Vektorkonstrukt und neben den in P. tricornutum einzubringenden Elementen auch bakterielle, genetische Elemente, die der Klonierung in E. coli dienen (colE1 -Origin und Gentamycin-Resistenzgen). Im Konstrukt wurde das Gene of Interest in drei Kopien eingesetzt. Nach der ballistischen oder auf Elektroporation beruhenden Transformation von P. tricornutum müssen die erhaltenen Klone nicht nur auf die Aufnahme der Antikörpergene hin überprüft werden, sondern auch die schnelle Identifizierung von Klonen, die das eingebrachte Antikörpergen besonders stark exprimieren, stellt eine zentrale Innovation dieser Erfindung dar. Das zugrundeliegende erfindungsgemäße Screeningverfahren ermöglicht die Korrelation der durch tGFP (Turbo-Green Fluorescent Protein) bewirkten Fluoreszenz, welche in einem speziellem Mikrotiterplatten-Reader gemessen wird, mit der später zu erwartenden Menge an gebildetem Antikörper (Figur 21 zeigt dazu die Korrelation zwischen Fluoreszenz und Expressionsrate in 9 unabhängigen Klonen).

Im Vergleich zu im Stand der Technik beschriebenen Produktionsraten von maximal 3 mg Antikörper * L¹ Kultur konnte in dem erfindungsgemäßen System aus 1 L Kultur 160 mg aufgereinigter Antikörper erhalten werden. Um dies zu erreichen, wurden neue Medienzusammensetzungen, eine Belüftung mit mehr als 3 L * min^-1 Druckluft sowie eine Beleuchtung mit einer Lichtstärke von 100 - 1000 W * nr² in einer eigens entwickelten Reaktorsäule eingesetzt.

Eine beispielhafte Medienzusammensetzung ist in der folgenden Tabelle angegeben:

Nach typischerweise vierzehn bis zwanzig Tagen Fed-Batch-Kultur können die Kieselalgen geerntet und aufgeschlossen werden. Die Aufreinigung folgt dem klassischen Verfahren, d. h. nach der Lyse und Zentrifugation und/oder einer Ultrafiltration erfolgt die Aufreinigung entweder über Protein A, Protein G oder über die eingesetzten Tag-Sequenzen, beispielsweise den 6xHis-Tag. Hier liegt ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, denn im Gegensatz zu höheren Pflanzen, die transient oder stabil Antikörper produzieren, enthalten die Kieselalgen keine die Aufreinigung der Antikörper enorm erschwerenden Fasern. Die Aufreinigung entspricht daher zu großen Teilen dem Verfahren, wie es beispielsweise für tierische Zellkulturen, wie CHO-Zellen, eingesetzt wird. BEZUGSZEICHENLISTE

1 Sequenzoptimierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz

2 Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in einen erfindungsgemäßen Vektor

3 Transformation

4 Screening-Verfahren

5 Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen

6 Vektor

7 Zellen

8 Kulturmedium

9 Expressionskassette

9.1 Promotorelement

9.2 erste Transkriptionseinheit

9.21 variable schwere Kette

9.22 variable leichte Kette

9.23 Hinge-Region

9.24 equine konstante Region (CH2 und CH3)

9.3 zweite Transkriptionseinheit

9.4 Signalpeptid

9.5 Selektionsmarker

10.1 Längenstandard der Gelelektrophorese

10.2 Wildtyp-Extrakt in der Gelelektrophorese

10.3 equines lgG6 in der Gelelektrophorese

10.4 scFv-Fc in der Gelelektrophorese

10.5 murines lgG1 in der Gelelektrophorese

10.6 humanes IgG in der Gelelektrophorese

10.7 humanes lgG1 in der Gelelektrophorese

11.1 einzelne Zellen von Phaeodactylum tricornutum

11.2 zweifache Zellketten von Phaeodactylum tricornutum

11.3 vielfache Zellketten von Phaeodactylum tricornutum

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1 . Nukleinsäuresequenz aufweisend zumindest eine Expressionskassette zur Expression eines Proteins, wobei die Expressionskassette wenigstens ein Promotorelement, und wenigstens eine erste Transkriptionseinheit, die für wenigstens ein Peptid codiert, aufweist, wobei das Promotorelement aus der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder einer Nukleinsäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 %, zur SEQ ID NO: 1 besteht.

2. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 , wobei die Expressionskassette weiterhin wenigstens eine zweite Transkriptionseinheit, die für ein Reporterprotein codiert, aufweist.

3. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Expressionskassette weiterhin wenigstens einen Sequenzbereich, der für einen Selektionsmarker codiert, aufweist.

4. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Promotorelement und/oder die erste Transkriptionseinheit und/oder eine komplette Expressionskassette repetitiv vorhanden ist.

5. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die erste Transkriptionseinheit wenigstens doppelt vorhanden ist und die beiden ersten Transkriptionseinheiten den Sequenzbereich, der für ein Resistenzgen codiert, flankieren.

6. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 weiterhin aufweisend wenigstens eine replikative virale Einheit.

7. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiterhin aufweisend wenigstens einen Sequenzbereich, der für ein Retentionssignal codiert.

8. Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die erste Transkriptionseinheit ein Polynukleotid umfasst, welches für eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 % zur SEQ ID NO: 2 codiert.

9. Vektor oder isolierte Nukleinsäure umfassend wenigstens eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einfacher oder repetitiver Form.

10. Vektor oder isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 9, aufweisend wenigstens zwei, bevorzugt wenigstens drei Expressionskassetten.

11. Vektor oder isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 9 oder 10, weiterhin aufweisend wenigstens einen Sequenzbereich, der für einen Selektionsmarker codiert.

12. Nukleinsäuresequenz, codierend für eine Aminosäuresequenz umfassend SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 % zur SEQ ID NO: 2.

13. Aminosäuresequenz, umfassend SEQ ID NO: 2 oder eine Aminosäuresequenz mit einer Homologie von zumindest 70 % zur SEQ ID NO: 2.

14. Zelle umfassend einen Vektor oder eine isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , oder eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, oder eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 12, oder eine Aminosäuresequenz nach Anspruch 13, wobei die Zelle eine photosynthetisch aktive Zelle, insbesondere eine Viridiplantae oder eine einzellige Pflanze, bevorzugt eine Kieselalge ist.

15. Screening-Verfahren zur Auswahl von Zellen mit einer erhöhten Expressionsrate einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend die Schritte a) Bereitstellen von Zellen, welche mit einem Vektor oder einer isolierten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und/oder mit einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8 transformiert wurden, b) Vereinzelung und Überführung der Zellen in ein Kulturmedium, c) Anreichern des Kulturmediums mit einer Phosphatkonzentration im Bereich von 0,1 pM bis 200 pM und d) Untersuchung der Zellen auf eine Expressionsrate der Nukleinsäuresequenz.

16. Screening-Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Expressionsrate der Nukleinsäuresequenz gemäß Schritt (d) anhand der Aktivität eines Reporterproteins bestimmt wird oder nach der beschriebenen ELISA-Methode erfolgt.

17. Screening-Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Untersuchung gemäß Schritt (d) nach einem Zeitraum von 1 bis 21 Tagen, bevorzugt von 1 ,5 bis 21 Tagen, besonders bevorzugt von 2 bis 21 Tagen nach der Durchführung von Schritt (c) erfolgt.

18. Screening-Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Untersuchung gemäß Schritt (d) bei einer Zellzahl von 20 bis 120 Millionen Zellen * ml_^-1 erfolgt.

19. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern unter Verwendung eines Vektors oder einer isolierten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und/oder einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, aufweisend die Schritte a) Bereitstellen von Zellen mit einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bevorzugt ermittelt durch ein Screening-Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, b) Kultivieren der transformierten Zellen in einem Kulturmedium, wobei das Kultivieren zunächst in einer Vorkultur und anschließend in einer Hauptkultur erfolgt und wobei ein Anpassen der Kulturbedingungen dahingehend erfolgt, dass eine Maximierung der Ausbeute heterolog produzierter Proteine erreicht wird, und c) Extrahieren der heterolog produzierten Proteine.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Vorkultur gemäß Schritt (b) ohne externe Begasung des Kulturmediums kultiviert wird.

21 . Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Vorkultur mit beschriebener Teilungsrate nach einem Zeitraum von wenigstens 20 Tagen in die Hauptkultur überführt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Vorkultur gemäß Schritt (b) unter externer Begasung des Kulturmediums kultiviert wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Vorkultur zum Zeitpunkt der höchsten Teilungsrate nach einem Zeitraum von wenigstens 16 Tagen in die Hauptkultur überführt wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei das Kulturmedium Phosphat in einer Menge von 20 pM bis 300 pM, bevorzugt von 20 pM bis 400 pM, besonders bevorzugt von 20 pM bis 500 pM aufweist.