EP4720082A1

EP4720082A1 - Pro-ligands analogues du mannose-6-phosphate ou du mannose, conjugués comprenant lesdits pro-ligands et leurs utilisations pour des applications thérapeutiques

Info

Publication number: EP4720082A1
Application number: EP24733668.8A
Authority: EP
Inventors: Alain Morere; Geoffrey DEPAEPE; Elodie MORERE; Khaled El Cheikh; Ilaria Basile; Morgane DAURAT; Marie Maynadier; Marcel Garcia
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM; Universite de Montpellier; Nanomedsyn SAS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Ecole Nationale Superieure de Chimie de Montpellier ENSCM; Universite de Montpellier; Nanomedsyn SAS
Priority date: 2023-05-31
Filing date: 2024-05-31
Publication date: 2026-04-08
Also published as: FR3149188A1; WO2024246474A1

Abstract

La présente invention a pour objet de nouveaux composés appelés pro-ligands ou ligands inactivés de formule (I). Elle a également pour objet les conjugués comprenant lesdits pro-ligands, lesdits conjugués répondant à la formule (II). L'invention a encore pour objet les conjugués (II) pour une utilisation comme médicament.

Description

Titre : Pro-ligands, conjugués comprenant lesdits pro-ligands et leurs utilisations pour des applications thérapeutiques

Domaine technique

[0001] La présente invention relève du domaine de la chimie thérapeutique. Elle a notamment pour objet de nouveaux composés appelés « pro-ligands » ou « ligands inactivés », les conjugués comprenant lesdits pro-ligands et leurs utilisations pour des applications thérapeutiques.

[0002] Le composé appelé pro-ligand au sens de l’invention désigne un ligand qui a été rendu temporairement inactif, par exemple par l’addition, au sein dudit ligand, d’un ou plusieurs groupements labiles. Dans la présente demande le pro-ligand pourra encore être appelé ligand inactivé. Le rôle d’un ligand étant d’être reconnu par son récepteur membranaire, un pro-ligand désigne ainsi un ligand qui n’est plus reconnu par son récepteur membranaire puisque le pro-ligand est rendu temporairement inactif.

Les pro-ligands de l’invention sont des analogues du mannose 6-phosphate (M6P) rendus temporairement inactifs.

Les analogues du mannose 6-phosphate (M6P) désignent des composés différents du M6P naturel mais qui présentent une reconnaissance élevée par le récepteur du mannose 6- phosphate cation indépendant (RM6P-CI).

Les analogues du M6P sont appelés « AMFA » (« Analogues synthétiques du Mannose 6- Phosphate Fonctionnalisés en position Anomère »). Les pro-ligands obtenus après inactivation des analogues AMFA sont appelés dans la présente demande « ProAMFA ». Les pro-ligands ProAMFA ne sont ainsi plus reconnus par le RM6P-CI.

[0003] Le conjugué de l’invention comprend le pro-ligand d’une part et un produit d’intérêt d’autre part. Le conjugué de l’invention, de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt », est en mesure de lier sélectivement une cible, par l’intermédiaire du produit d’intérêt apte à reconnaître ladite cible, ce qui permet d’obtenir un complexe présentant la structure « Pro- ligand - Produit d’intérêt - Cible ».

Technique antérieure

[0004] Les documents EP 2 448 600 B1 et EP 3 350 192 B1 décrivent des conjugués comprenant des analogues du M6P qui sont liés, par l’intermédiaire d’un bras espaceur, à un produit d’intérêt, comme par exemple une glycoprotéine. Les analogues du M6P présentent plusieurs avantages pour la fonctionnalisation de glycoprotéines, en particulier pour la fonctionnalisation d’enzymes lysosomales, notamment parce qu’ils sont de petite taille, sont peu immunogènes et peuvent être facilement liés avec l’enzyme lysosomale. Ces analogues du M6P sont de plus modulables, d’une part au niveau de la longueur et de la structure du bras espaceur et d’autre part au niveau du groupement réactif terminal du bras espaceur en fonction du type de liaison désirée avec le produit d’intérêt. Dans ces documents, les analogues du M6P sont plus particulièrement utilisés pour internaliser, via le RM6P-CI, des enzymes lysosomales dans les lysosomes de la cellule, afin que lesdites enzymes puissent jouer leur rôle physiologique. Les analogues du M6P sont également modulables au niveau du groupement phosphate en position 6 qui peut être remplacé par un groupement bio-isostère, à savoir un groupement qui remplit les mêmes fonctions biologiques que le groupement phosphate. Le groupement phosphate en position 6 peut par exemple ainsi être remplacé par un groupement phosphonate, carboxylate, malonate. Plusieurs publications indiquent que les dérivés substitués en position 6 du M6P possèdent des affinités significatives pour le RM6P-CI (Vidil C. et al., Eur.J. Org. Chem., 1999, 447 ; Jeanjean A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18, 6240 ; El Cheikh K. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 14774).

[0005] Dans les documents EP 2 448 600 B1 et EP 3 350 192 B1 , il n’est cependant pas envisagé de rendre temporairement inactifs les analogues du M6P, ce qui signifie que les conjugués, de structure « Analogues du M6P - Produit d’intérêt », sont, une fois introduits dans un organisme, immédiatement reconnus par les récepteurs du mannose 6-phosphate cation indépendant (RM6P-CI) et donc fixés par ces derniers. Le RM6P-CI est un récepteur ubiquitaire qui est présent à la fois dans des vésicules intracellulaires et à la membrane de toutes les cellules ; il ne s’agit donc pas d’un récepteur spécifique d’un tissu ou d’un type de cellules particuliers (Ghosh P. et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2003, 4, 202 ; Gauthier C. et al. J. Control. Release 2024, 365, 759). Cela signifie plus particulièrement que les conjugués, une fois dans l’organisme, n’auront pas forcément le temps nécessaire pour atteindre et lier une cible déterminée apte à être reconnue par le produit d’intérêt puisque l’analogue du M6P peut être rapidement reconnu par le RM6P-CI présent dans l’environnement immédiat. Le produit d’intérêt subira ainsi une baisse de sa libre circulation pour atteindre et fixer la cible biologique qu’il est en mesure de reconnaître. En d’autres termes cela signifie que les conjugués décrits dans ces documents pourraient réduire la détection de la cible prédéterminée.

[0006] Le document Kleeb et al. (Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 59, 3163) décrit l’ajout de groupement phosphate en position 2, 3 ou 4 du cycle du mannose pour améliorer la solubilité et la biodisponibilité de dérivés du mannose. Cependant il n’est jamais envisagé dans ce document d’utiliser les dérivés phosphatés du mannose ainsi obtenus pour empêcher la reconnaissance prématurée d’un ligand par son récepteur. [0007] Ainsi, à la connaissance des Inventeurs, il n’a jamais été décrit à ce jour un Proligand qui ne posséderait pas d’affinité pour des récepteurs du mannose 6-phosphate ou encore l’activation in situ dudit Pro-ligand par une phosphatase.

[0008] Les Inventeurs ont maintenant mis au point de nouveaux conjugués qui sont spécifiques de cibles préalablement déterminées. Pour ce faire, ils ont eu l’idée originale de mettre au point des pro-ligands qui sont des analogues du M6P et qui sont temporairement inactivés, puis de préparer des conjugués de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt ». Ainsi, lorsque les conjugués de l’invention sont introduits dans un organisme, ils ne seront pas directement reconnus par le récepteur du ligand, à savoir le RM6P-CI, ce qui leur permettra de circuler librement afin d’atteindre plus efficacement une cible spécifiquement reconnue par le produit d’intérêt. Le produit d’intérêt se lie à la cible, ce qui engendre la formation d’un complexe « Pro-ligand - Produit d’intérêt - Cible ». Ce complexe est ensuite activé afin que le Pro-ligand devienne ligand. Le complexe activé ainsi obtenu, de structure « Ligand - Produit d’intérêt - Cible » sera alors reconnu par le récepteur du ligand, à savoir le RM6P-CI, et fixé par ce dernier.

[0009] La destination et l’activité de conjugués « Ligand - Produit d’intérêt » ou de complexes « Ligand - Produit d’intérêt - Cible » ont quant à eux fait l’objet de plusieurs publications dans l’art antérieur.

Ainsi, dans le cas de couplage du Ligand à une enzyme lysosomale il a été démontré que le Ligand permet d’obtenir un ciblage efficace de cette enzyme dans les lysosomes grâce à l’internalisation par le RM6P-CI (Basile I. et al. J. Control. Release, 2018, 269, 15 ; Godefroy A. et al. J. Cell. Mol. Med., 2019, 23, 6499).

Dans le cas du couplage du Ligand à un anticorps visant une cible thérapeutique, l’entrée de l’anticorps et de sa cible via le RM6P-CI a été démontrée pour plusieurs anticorps dirigés contre :

- des cibles extracellulaires solubles (cibles non membranaires) telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) ou le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) (Daurat M. et al., Front. Immunol. 2024, 15, 1273280) ou,

- des cibles membranaires telles que le récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2) ou le récepteur du facteur de croissance épidermique 1 (REGF) (Gauthier et al., Biomed. Pharmacother. 2024, 175, 116707).

De plus, lorsque le produit d’intérêt est un anticorps, il a été démontré dans un modèle murin que les conjugués « Ligand-Produit d’intérêt » internalisés étaient recyclés dans la circulation (Gauthier C. et al., J. Control. Release 2023, 358, 465). Dans le cas du couplage du Ligand à des nanoparticules à visée thérapeutique, l’entrée des nanoparticules via le RM6P-CI a été démontrée dans le système endolysosomal (Vaillant O. et al., Angewandte Chemie, 2015, 54, 5952 ; Bouffard et al., Int J Mol Soi., 2019, 20, 2809 ; Daurat et al., Biomater. Soi., 2020, 8, 3678).

D’autre part, il a également été montré par les Inventeurs qu’une famille de Ligands du RM6P-CI était capable de se lier à l’hydroxyapatite qui est présente dans le tissu osseux (demande de brevet français FR2302097), ce qui en faisait des composés prometteurs pour le traitement des pathologies osseuses.

[0010] La mise au point de conjugués de type « Pro-ligand - Produit d’intérêt » et leur capacité à se lier in situ à une cible (de type membranaire ou non membranaire) puis à se transformer in situ en complexe activés de type « Ligand - Produit d’intérêt - Cible » constitue l’originalité et l’intérêt de la présente invention au vu de l’activité prometteuse de certains des composés « Ligand - Produit d’intérêt » et/ou « Ligand - Produit d’intérêt - Cible » décrits dans l’art antérieur ci-dessus cité.

Résumé

[0011] Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un pro-ligand de formule générale (I) telle que décrite dans la description détaillée ci-après.

[0012] Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un conjugué de formule générale (II) telle que décrite dans la description détaillée ci-après, de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt ».

[0013] Selon un troisième aspect, l’invention a pour objet le procédé de préparation des pro-ligands de formule (I) et des conjugués de formule (II).

[0014] Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un conjugué de formule (II) pour une utilisation comme médicament.

[0015] Selon un autre aspect, l’invention décrit un complexe de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt - Cible biologique ».

Brève description des dessins

[0016] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :

Fig. 1

[0017] [Fig. 1] illustre la séquence d’évènements se produisant lorsque le conjugué de l’invention, de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt », est introduit dans un organisme dans le but de lier une cible non membranaire.

Fig. 2 [0018] [Fig. 2] illustre la séquence d’évènements se produisant lorsqu’un conjugué de l’invention, de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt », est introduit dans un organisme dans le but de lier une cible membranaire.

Fig. 3

[0019] [Fig. 3] est une illustration de quatre modes de réalisation possibles pour la synthèse de conjugués de formule (II) obtenus par la réaction entre un pro-ligand de formule générale (I) avec un produit d’intérêt Y.

Fig. 4

[0020] [Fig. 4] illustre le schéma de synthèse détaillé du pro-ligand de formule générale (I) dénommé ProAMFAI .

Fig. 5

[0021] [Fig. 5] illustre les résultats obtenus par électrophorèse SDS-PAGE de l’enzyme Myozyme® commerciale seule ou liée au composé AMFA1 (obtention du conjugué Myo-AMFA1 ) ou au pro-ligand ProAMFAI (obtention du conjugué Myo-ProAMFA1 ). L’enzyme seule ou liée aux composés AMFA1 ou ProAMFAI est détectée par coloration au bleu de Coomassie.

Fig. 6

[0022] [Fig. 6] illustre les résultats obtenus par électrophorèse SDS-PAGE de l’anticorps Infliximab seul ou lié au composé AMFA1 (obtention du conjugué lnfli-AMFA1 ) ou au pro- ligand Pro-AMFA1 (obtention du conjugué Infli-ProAMFAI ). L’anticorps seul ou lié aux composés AMFA1 ou ProAMFAI est détecté par coloration au bleu de Coomassie.

Fig. 7

[0023] [Fig. 7] illustre la cytotoxicité sur des cellules humaines MCF-7 de cancer du sein du pro-ligand ProAMFAI en comparaison avec le composé M6P et le composé AMFA1 .

L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés M6P (histogramme blanc), AMFA1 (histogramme hachuré) et ProAMFAI (histogramme noir). L’axe des ordonnées représente la survie cellulaire des composés. La survie cellulaire observée en présence de M6P a été prise comme valeur du 100%.

Fig 8

[0024] [Fig. 8] illustre la cytotoxicité sur des fibroblastes humains FS01035 du ProAMFAI en comparaison avec M6P et AMFA1 .

La description des axes et des histogrammes de la figure 7 vaut pour la figure 8.

Fig. 9 [0025] [Fig. 9] illustre les interactions entre le RM6P-CI et le pro-ligand ProAMFAI en comparaison avec les composés M6P et AMFA1. L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés M6P (courbe pointillée), AMFA1 (courbe en tirets) et ProAMFAI (courbe pleine). L’axe des ordonnées représente le pourcentage de liaison desdits composés au RM6P-CI.

Fig. 10

[0026] [Fig. 10] est une série de spectres RMN à des temps différents (t = 0, t = 1 h, t = 11 h, t = 24h) montrant la cinétique de la dégradation de deux pro-ligands ProAMFAI et ProAMFAI ox en ligands AMFA1 et AMFAIox, en présence d’une phosphatase alcaline isolée de placenta humain.

La différence entre ProAMFAI et ProAMFAI ox réside dans le radical Li qui représente -O- NH2 dans ProAMFAI versus -O-N=C(CH3)2 dans ProAMFAI ox.

Les pics à gauche des spectres sont caractéristiques du radical X égal à phosphonate (à savoir X = CH2-P(O)(OH)2) présenté par chacun des ProAMFAI et ProAMFAI ox.

Les pics à droite des spectres sont caractéristiques du radical P1 égal à phosphate (à savoir X = P(O)(OH)2) présenté par chacun des ProAMFAI et ProAMFAI ox.

Fig. 11

[0027] [Fig. 11] illustre la cytotoxicité, sur des cellules humaines MCF-7 de cancer du sein, de l’enzyme Myozyme® (histogramme blanc) et des conjugués Myo-AMFA1 (histogramme hachuré) et Myo-ProAMFA1 (histogramme noir). L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés et celui des ordonnées la survie cellulaire des composés. La survie cellulaire observée en présence de Myozyme® a été prise comme valeur du 100%.

Fig. 12

[0028] [Fig. 12] illustre la cytotoxicité, sur des fibroblastes humains FS01035, de l’enzyme Myozyme® (histogramme blanc) et des conjugués Myo-AMFA1 (histogramme hachuré) et Myo-ProAMFA1 (histogramme noir). L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés et celui des ordonnées la survie cellulaire des composés. La survie cellulaire observée en présence de Myozyme® a été prise comme valeur du 100%.

Fig. 13

[0029] [Fig. 13] illustre les interactions entre le RM6P-CI et le composé M6P ou entre le RM6P-CI et I’ I nfliximab seul ou lié à AMFA1 ou ProAMFAI . L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés M6P (courbe en croix), Infliximab (courbe en pointillés), lnfli-AMFA1 (courbe en tiret) et Infli-ProAMFAI (courbe pleine). L’axe des ordonnées représente le pourcentage de liaison desdits composés au RM6P-CI.

Fig. 14

[0030] [Fig. 14] illustre la détection par Western blots de l’enzyme Myozyme®, des conjugués Myo-AMFA1 , Myo-ProAMFA1 et des conjugués Myo-ProAMFA1 incubés en présence de phosphatase alcaline isolée de placenta humain, à différents temps (t = 1 h, t = 24h et t = 96h).

Fig. 15

[0031] [Fig. 15] illustre la détection par Western blots des conjugués lnfli-AMFA1 , Infli-ProAMFAI et des conjugués Infli-ProAMFAI incubés ou non en présence de phosphatases acides ou alcalines à différents temps.

Fig. 16

[0032] [Fig. 16] illustre les interactions entre le RM6P-CI et le conjugué Infli-ProAMFAI préincubé ou non en présence de phosphatases alcalines.

Fig. 17

[0033] [Fig. 17] illustre la détection par Western blots du conjugué Infli-ProAMFAI incubé en présence de sérum humain à différents temps et sa quantification par densitométrie du signal AMFA1 .

Fig. 18

[0034] [Fig. 18] illustre les interactions entre le RM6P-CI et le composé M6P (courbe en tiret) ou entre le RM6P-CI et le conjugué Infli-ProAMFAI non incubé (courbe pleine) ou après incubation de 24 h avec le sérum humain (courbe en pointillés). L’axe des abscisses représente la concentration molaire des composés. L’axe des ordonnées représente le pourcentage d’inhibition de la liaison du RM6P-CI par les composés.

Fig. 19

[0035] [Fig. 19] illustre les résultats obtenus par électrophorèse SDS-PAGE de l’anticorps Cetuximab seul ou lié au composé AMFA1 (obtention du conjugué Cetux-AMFA1 ) ou au pro-ligand ProAMFAI (obtention du conjugué Cetux-ProAMFA1 ). L’anticorps seul ou lié aux composés AMFA1 ou ProAMFAI est détecté par coloration au bleu de Coomassie.

Fig. 20 [0036] [Fig. 20] illustre la détection par Western blots des conjugués Cetux-ProAMFA1 après incubation ou non en présence de phosphatases acides ou alcalines à différents temps en comparaison avec le conjugué Cetux-AMFA1 .

Fig. 21

[0037] [Fig. 21] illustre l’internalisation à 5 h dans les cellules Hela du conjugué Infli- ProAMFAI préalablement incubé ou non en présence de sérum humain pendant 48 h. L’internalisation est analysée par microscopie confocale et par quantification de la fluorescence.

Fig. 22

[0038] [Fig. 22] illustre l’internalisation à 18 h dans les cellules Hela du conjugué Cetux- ProAMFAI préalablement incubé ou non en présence de sérum humain pendant 24 h. La fluorescence cellulaire est mesurée par cytométrie en flux.

Fig. 23

[Fig. 23] illustre les liaisons du conjugué Infli-ProAMFAI et de l’anticorps Infliximab pour leur antigène, TNFa, mesurées par ELISA.

Fig. 24

[0039] [Fig. 24] illustre le schéma de synthèse du pro-ligand de formule générale (I) dénommé ProAMFA1 acétonide-oxime.

Fig. 25

[0040] [Fig. 25] illustre la transformation du ProAMFA1 acétonide-oxime en AMFAI ox.

Fig. 26

[0041] [Fig. 26] est une série de spectres RMN à des temps différents (t = 0, t = 30 min, t = 1 h30, t = 2h30) montrant la cinétique de la dégradation du pro-ligand ProAMFAIacétonide- oxime en ligand AMFAIox.

Description détaillée

[0042] Les pro-ligands de formule (I)

[0043] La présente invention a pour objet un pro-ligand caractérisé en ce qu’il présente la formule générale (I) suivante

[Cheml] dans laquelle : la ligne pointillée représente une liaison qui est présente ou non ;

X représente -CH₂-P(O)(OZ)₂ ; -CH₂-CO₂Z ; -CH(CO₂Z)₂ ; -CH(P(O)(OZ)₂)₂ ; -CHF-CO₂Z ; -CHF-P(O)(OZ)₂ ; -CF₂-CO₂Z ; -CF₂-P(O)(OZ)₂ ; -CH(CO₂Z)(P(O)(OZ)₂), dans ce cas la liaison représentée par la ligne pointillée n’est pas présente ; ou

X représente =CH-CO₂Z ; =CH-P(O)(OZ)₂ ; =CF-CO₂Z ; =CF-P(O)(OZ)₂, dans ce cas la liaison représentée par la ligne pointillée est présente ; avec Z représentant indépendamment l’un de l’autre H ; Na ; K ou NF ;

P1 , P2 et P3 représentent indépendamment les uns des autres H ; P(O)(OZ)₂ ; -S(O)₂(OZ) ; avec Z tel que défini précédemment et avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un atome d’hydrogène ; ou P2 et P3 forment ensemble un groupement acétonide

[Chem2]

H₃C CH₃ .

A représente un radical divalent choisi parmi -O- ; -S- ; -NH- ; -CH₂- ;

L représente

⁰⁰ -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)_n- avec n représentant un entier allant de 0 à 6 ;

⁰⁰ -H ; -NH₂ ; -(CH₂)_ni-CH=CH₂ ou -(CH₂)_ni-C=CH avec représentant un entier allant de 0 à 4, ce qui signifie que dans chacun de ces cas L1 est absent ;

⁰⁰ un radical hydrocarboné divalent saturé, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 30 atomes de carbone ; un radical hydrocarboné divalent insaturé, linéaire ou ramifié, ayant de 2 à 30 atomes de carbone ;

⁰⁰ un radical hydrocarboné divalent saturé ou insaturé tel que défini ci-dessus dont un ou plusieurs groupements -CH₂-, -CH=CH- et/ou -C=C- du radical hydrocarboné saturé ou insaturé est (sont) remplacé(s) indépendamment l’un de l’autre par :

⁰⁰⁰ un groupement -O- ; -NH- ; -S- ; -CO-NH- ; -NH-CO-O- ; et/ou

⁰⁰⁰ un système cyclique ou hétérocyclique choisi parmi ceux listés dans le tableau 1 ci- après

[Tableaul]

Li représente

⁰⁰ -O-NH2 ;

⁰⁰ un système cyclique ou hétérocyclique choisi parmi [Chem3] nt un alkyle en C1-C5, et est de préférence un éthyle ; [Chem5] [Chem6]

[Chem7]

[

⁰⁰ -O-N=C(CH₃)₂ ;

⁰⁰ -(CH₂)ni-CH=CH₂ ; -(CH₂)_ni-C CH ; -(CH₂)m-N₃ ; -(CH₂)m-SH ; -(CH₂)_ni-NH₂ ;

-(CH₂)ni-N=C=O ; -(CH₂)ni-N=C=S ; -(CH₂)_ni-NHRi ; -(CH₂)_ni-Ai-NH₂ ; -(CH₂)_ni-Ai-NHRi ;

-(CH₂)ni-NHCO-CH₂Hal ; -(CH₂)_ni-COZi ; -(CH₂)_ni-AiCOZi ; -(CH₂)_ni-O-NH₂ ;

-(CH₂)ni-CO-NH-NH₂ ; avec ni et Ri tels que définis ci-dessus ; Ai représentant -O- ; -NH- ; Hal représentant Cl ; Br ou I ; Z1 représentant -OH ; -OR1 ; -NHR1 ; -NH-NH₂ ; -NH-NHR1 avec Ri tel que défini ci-dessus ;

⁰⁰ un halogène choisi parmi F, Cl, Br ou I.

[0044] A titre d’exemples d’un radical hydrocarboné divalent saturé, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 30 atomes de carbone, on pourra notamment citer :

-CH₂- ; -CH₂-CH₂- ; -CH₂-(CH₂)_m- ; -(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m- ;

-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m- ; -(CH₂)_m-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m ;

-(CH₂)_m-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m- ;

-(CH₂)_m-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m- ; avec m représentant indépendamment l’un de l’autre un entier allant de 0 à 30 avec la condition que la longueur de la chaîne hydrocarbonée principale ne dépasse pas 30 atomes de carbone, et Ci-C₇ représentant un alkyle ayant de 1 à 7 atomes de carbone. A titre d’exemple d’alkyle en Ci-C₇, on pourra notamment citer le méthyle, l’éthyle, le propyle, l’isopropyle, le butyle, l’isobutyle, le pentyle, I’hexyle, I’heptyle.

Un radical hydrocarboné divalent insaturé, linéaire ou ramifié, ayant de 2 à 30 atomes de carbone, désigne un radical hydrocarboné comportant une ou plusieurs doubles liaisons carbone-carbone et/ou une ou plusieurs triples liaisons carbone-carbone.

A titre d’exemples d’un radical hydrocarboné divalent insaturé on pourra notamment citer : -CH=CH- ; -(CH₂)m-CH=CH-(CH₂)m- ;

-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_m- ;

-(CH₂)_m-CH=CH-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m- ;

-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m-CH=CH-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m- ;

-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-CH=CH-(CH₂)_m- ;

-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-CH=CH-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_m- ;

-(CH₂)_m-CH=CH-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m- ;

-(CH₂)_m-CH=CH-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m-CH=CH ;

-(CH₂)_m-CH=CH-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m-CH=CH ;

-C C- ; -(CH₂)_m-C C-(CH₂)_m- ; -(CH₂)_m-C C-(CH₂)_m-C=C-(CH₂)_m- ;

-(CH₂)_m-CH=CH-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m-C C-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)- ;

-(CH₂)_m-CH=CH-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m-C C-(CH₂)_m-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m-;

-(CH₂)_m-C C-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m-C C-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m ;

-(CH₂)_m-C C-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-;

-(CH₂)_m-CH=CH-C(Ci-C₇)₂-(CH₂)_m-CH(Ci-C₇)-(CH₂)_m-C C-CH=CH-(CH₂)_m-; avec m tel que défini précédemment.

[0045] Selon un mode de réalisation de l’invention, le pro-ligand (I) tel que défini ci-dessus est caractérisé en ce que :

X représente -CH₂-P(O)(OZ)₂ ; CH₂-CO₂Z ; -CH(CO₂Z)₂ ; -CH(P(O)(OZ)₂)₂ ; -CHF-CO₂Z ; -CHF-P(O)(OZ)₂ ; -CF₂-CO₂Z ; -CF₂-P(O)(OZ)₂ ; -CH(CO₂Z)(P(O)(OZ)₂) ; =CH-CO₂Z ; avec Z tel que défini ci-dessus ;

P1 , P2 et P3 représentent indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OZ)₂ ; avec Z tel que défini précédemment, et avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un atome d’hydrogène ; ou P2 et P3 forment ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] telle que définie ci-dessus ;

A représente un radical divalent choisi parmi -O- ; -S- ; -CH₂- ;

L représente : ^oo -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)_n- avec n tel que défini ci-dessus ; ^oo -H ; -NH₂ ; -(CH₂)_ni-CH=CH₂ ou -(CH₂)_ni-C CH avec tel que défini ci-dessus, ce qui signifie que dans chacun de ces cas Li est absent ; ^oo un radical hydrocarboné divalent saturé, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 30 atomes de carbone ; un radical hydrocarboné divalent insaturé, linéaire ou ramifié, ayant de 2 à 30 atomes de carbone ;

Li représente ^oo -O-NH2 ; ^oo -O-N=C(CH₃)₂ ; ^oo un système cyclique ou hétérocyclique choisi parmi [Chem3] ; [Chem4] ; [Chem5] ; ^oo -(CH₂)ni-CH=CH₂ ; -(CH₂)_ni-C CH ; -(CH₂)m-N₃ ; -(CH₂)m-SH ; -(CH₂)_ni-NH₂ ;

-(CH₂)ni-N=C=O ; -(CH₂)ni-N=C=S ; -(CH₂)_ni-NHCO-CH₂Hal ; avec m et Hal tels que définis ci-dessus ; ^oo un halogène choisi parmi Cl, Br ou I.

[0046] Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le pro-ligand tel que défini ci- dessus est plus particulièrement caractérisé en ce que :

X représente -CH₂-P(O)(OZ)₂ ; -CH₂-CO₂Z ; -CH(CO₂Z)₂ ; -CH(P(O)(OZ)₂)₂ avec Z tel que défini précédemment et de préférence Z égal à H ;

P1 , P2 et P3 représentent indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OZ)₂ avec Z tel que défini précédemment, et avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un atome d’hydrogène ; ou P2 et P3 forment ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] telle que définie précédemment ;

A représente un atome d’oxygène -O- ;

L représente -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)_n- avec n représentant un entier allant de 0 à 6, et de préférence n égal à 0 ;

Li représente -O-NH₂ ; -O-N=C(CH₃)₂ ; un substituant de formule [Chem3] ou [Chem4] telle que définie précédemment.

[0047] Selon encore un autre mode de réalisation de l’invention, le pro-ligand tel que défini ci-dessus est plus particulièrement caractérisé en ce que :

X représente -CH₂-P(O)(OZ)₂ avec Z tel que défini précédemment, et de préférence Z égal à H ;

P1 , P2 et P3 sont tels que définis dans le paragraphe ci-dessus, à savoir ils représentent indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OZ)₂ avec Z tel que défini ci-dessus, et avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un atome d’hydrogène ; ou P2 et P3 forment ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] telle que définie précédemment ;

A, L et L1 sont tels que définis dans le paragraphe ci-dessus, à savoir A représente un atome d’oxygène ; L représente -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)_n- avec n représentant un entier allant de 0 à 6, et de préférence n égal à 0 ; Li représente -O-NH₂ ; -O-N=C(CH₃)₂ ; un substituant de formule [Chem3] ou [Chem4] telle que définie précédemment. [0048] Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, le pro-ligand est plus particulièrement caractérisé en ce que :

X représente -CH2-P(O)(OZ)2 avec Z tel que défini précédemment et de préférence Z égal à H ;

P1 , P2 et P3 représentent indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OZ)2 avec Z tel que défini ci-dessus, et avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un atome d’hydrogène,;

A représente un atome d’oxygène -O- ;

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n représentant un entier allant de 0 à 6, et de préférence n égal à 0 ;

Li représente -O-NH2 ; un substituant de formule [Chem3] ou [Chem4] telle que définie précédemment.

[0049] A titre d’exemple d’un pro-ligand de l’invention, on pourra plus particulièrement citer le pro-ligand de formule (I) dans laquelle :

X représente CH2-P(O)(OZ)2 avec Z = H ;

P1 représente P(O)(OZ)2 avec Z = H et P2 et P3 = H ;

A représente un atome d’oxygène,

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à zéro ;

L1 représente -O-NH2.

[0050] Toujours à titre d’exemple on pourra également citer le pro-ligand de formule (l) dans laquelle :

X représente CH2-P(O)(OZ)2 avec Z = H ;

P1 représente H et P2 et P3 forment ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] telle que définie ci-dessus ;

A représente un atome d’oxygène,

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à zéro ;

L1 représente -O-NH2 ou -O-N=C(CH3)2.

[0051] Le tableau 2 ci-après exemplifie des ProAMFA de formule (I) dans laquelle :

X représente un groupement phosphonate de formule -CH2-P(O)(OH)2 ;

P1 , P2 et P3 représentant indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OH)2 avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un hydrogène ; ou P2 et P3 formant ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] ;

A représente un atome d’oxygène ;

L représente -(CH2)2- (soit le groupement -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à 0) ;

L1 représente -O-NH2 ; un substituant de formule [Chem3] ou [Chem4] telle que définie ci- dessus. [Tableau2]

[0052] Le tableau 3 ci-après exemplifie des ProAMFA de formule (I) dans laquelle :

X représente un groupement carboxylate de formule -CH2-COOH ; P1, P2 et P3 représentant indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OH)2 avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un hydrogène ; ou P2 et P3 formant ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] ;

A représente un atome d’oxygène ;

L représente -(CH2)2- (soit le groupement -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à 0) ; L1 représente -O-NH2 ; un substituant de formule [Chem3] ou [Chem4] telle que définie ci- dessus. [Tableaus]

[0053] Le tableau 4 ci-après exemplifie des ProAMFA de formule (I) dans laquelle :

X représente un groupement malonate de formule -CH(CO2H)2 ; P1, P2 et P3 représentant indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OH)2 avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un hydrogène ; ou P2 et P3 formant ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] ;

A représente un atome d’oxygène ;

L représente -(CH2)2- (soit le groupement -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à 0) ; Li représente -O-NH2 ; un substituant de formule [Chem3] ou [Chem4] telle que définie ci- dessus. [Tableau4]

[0054] Le tableau 5 ci-après exemplifie des ProAMFA de formule (I) dans laquelle :

X représente un groupement bisphosphonate de formule -CH(P(O)(OH)2)2 ; P1, P2 et P3 représentant indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OH)2 avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un hydrogène ; ou P2 et P3 formant ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] ;

A représente un atome d’oxygène ;

L représente -(CH2)2- (soit le groupement -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à 0) ; Li représente -O-NH2 ; un substituant de formule [Chem3] ou [Chem4] telle que définie ci- dessus. [Tableaus]

[0055] Les conjugués de formule (II)

[0056] Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet un conjugué caractérisé en ce qu’il présente la formule générale (II) suivante

[Chem9] dans laquelle ri2 est un entier allant de 1 à 1000, de préférence de 1 à 20, et plus préférentiellement de 1 à 10,

P1 , P2, P3, X, A et L sont tels que définis ci-dessus,

L’i représente le substituant Li tel que défini ci-dessus lorsque ledit Li se trouve impliqué dans une liaison covalente avec Yi,

Yi représente un produit d’intérêt Y, ledit produit d’intérêt Y étant choisi dans le groupe comprenant des protéines, notamment des anticorps et des enzymes lysosomales, des nanoparticules, des activateurs ou des inhibiteurs de protéines, des composés cytotoxiques et des marqueurs pour l’imagerie médicale,

Yi formant n2 liaison(s) covalente(s) avec L’i.

Les anticorps ci-dessus cités englobent les anticorps armés, les conjugués anticorps- médicaments et les fragments d’anticorps.

[0057] On entend par « conjugué » au sens de l’invention un composé comprenant deux parties liées entre elles par une liaison covalente. La première partie du conjugué représente ainsi le pro-ligand tandis que la deuxième partie du conjugué représente le produit d’intérêt.

Le produit d’intérêt Y désigne le produit d’intérêt « libre » lorsqu’il ne forme pas de liaison avec le pro-ligand de formule (I).

Le produit d’intérêt Yi désigne le produit d’intérêt Y lorsque ce dernier est lié de façon covalente au pro-ligand.

Dans la formule (II) du conjugué de l’invention, le composé représenté dans la parenthèse correspond au pro-ligand de formule (I) tel que défini ci-dessus lorsque ce dernier est impliqué dans une liaison covalente avec un produit d’intérêt Yi. L’entier n2 indique le nombre de pro-ligand(s) lié(s) au produit d’intérêt Yi. Selon l’invention, n2 pro-ligand(s) peut (peuvent) être lié(s) de façon covalente à un produit d’intérêt Yi. Ces n2 pro-ligands sont liés au produit d’intérêt par l’intermédiaire du radical Li ou LLi du pro-ligand de formule (I).

[0058] Selon un mode de réalisation de l’invention, le produit d’intérêt Yi du conjugué (II) tel que défini ci-dessus est un anticorps ou une enzyme lysosomale.

[0059] A titre d’exemple de conjugué de l’invention, on pourra citer celui de formule (II) dans laquelle :

X représente CH2-P(O)(OZ)2 avec Z = H ;

P1 représente P(O)(OZ)2 avec Z = H et P2 et P3 = H ;

A représente un atome d’oxygène,

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à zéro,

L’i représente -O-N= ; ri2 est un entier allant de 1 à 7 ;

Yi représente le produit d’intérêt Y qui est un anticorps ou une enzyme lysosomale.

[0060] Toujours à titre d’exemple de conjugué de l’invention, on pourra citer celui de formule (II) dans laquelle :

X représente CH2-P(O)(OZ)2 avec Z = H ;

A représente un atome d’oxygène,

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à zéro ;

L’i représente -O-N= ; ri2 est un entier allant de 1 à 7 ;

[0061] Préparation des conjugués de formule (II)

Le conjugué de formule (II) tel que défini ci-dessus est préparé en faisant réagir :

- un produit d’intérêt Y tel que défini ci-dessus, avec

- n2 pro-ligand(s) de formule générale (I) telle que définie ci-dessus.

Le produit d’intérêt Y libre peut être représenté par Yi’-L’, avec L’ représentant un groupe fonctionnel ou une fonction réactive porté(e) par le produit d’intérêt Y. Autrement dit, Y/ représente le produit d’intérêt Y sans son groupe fonctionnel L’.

C’est le groupe fonctionnel L’ de Y qui va réagir avec un groupe fonctionnel ou une fonction réactive porté(e) par le pro-ligand (I) (en l’occurrence Li ou LLi) afin de former une liaison covalente entre le produit d’intérêt Y et le pro-ligand (I) et obtenir ainsi le conjugué de formule (II) de l’invention.

Dans la présente demande, on peut employer indifféremment les termes « groupe fonctionnel », « fonction réactive » ou « groupe chimique réactif ». Chacun de ces termes désigne un groupe porté par le produit d’intérêt Y (ou porté par le pro-ligand (I)) capable d’entrer en réaction avec un groupe porté par le pro-ligand (I) (ou porté par le produit d’intérêt Y).

[0062] Selon un mode de réalisation de l’invention, dans le conjugué de formule (II) telle que définie ci-dessus, n2 est un entier égal à 1 .

La figure 3 est une illustration de quatre modes de réalisation possibles pour la synthèse de conjugués de formule (II) obtenus par la réaction entre un pro-ligand de formule générale (I) avec un produit d’intérêt Y.

Dans les formules générales (I) et (II) représentées aux points 1/ à 4/ :

- X, P1 , P2 et P3 sont tels que définis ci-dessus,

- n2 est égal à 1 , - A représente un atome d”oxygène,

- L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n étant un entier allant de 0 à 2.

La variable réside dans le radical Li du pro-ligand (I) et dans le groupe fonctionnel porté par le produit d’intérêt Y.

La figure 3 point 1/ illustre la réaction entre le groupement fonctionnel Li du pro-ligand (I) dans lequel Li représente -ONH2 avec une fonction aldéhyde (-CHO) d’un produit d’intérêt Y qui est un anticorps ou une enzyme lysosomale, ladite fonction aldéhyde ayant préalablement été générée lors d’un processus oxydatif sur une chaîne/partie oligosaccharidique de la partie glycosidique de l’anticorps ou de l’enzyme lysosomale. Le produit Y est représenté par Yi’-CHO, Y1’ représentant le produit Y sans son groupe fonctionnel L’ qui est égal à -CHO.

La figure 3 point 21 illustre la réaction entre le groupement fonctionnel L1 du pro-ligand (I) dans lequel L1 représente [Chem3] avec une fonction amine (-NH2) portée par un produit d’intérêt Y tel qu’un anticorps ou une enzyme lysosomale. Le produit d’intérêt Y est représenté par Yi’-NH2, Y1’ représentant Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -NH2. La fonction amine provient par exemple d’un résidu d’acide aminé lysine.

La figure 3 point 3/ illustre la réaction entre le groupement fonctionnel L1 du pro-ligand (I) dans lequel L1 représente [Chem4] avec une fonction thiol (-SH) portée par un produit d’intérêt Y tel qu’un anticorps ou une enzyme lysosomale. Le produit d’intérêt Y est représenté par Yi’-SH, Y1’ représentant Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -SH. La fonction thiol provient par exemple d’un résidu d’acide aminé cystéine.

La figure 3 point 4/ illustre la réaction entre le groupement fonctionnel L1 du pro-ligand (I) dans lequel L1 représente [Chem5] avec une fonction thiol (-SH) d’un produit d’intérêt Y (comme un anticorps ou une enzyme lysosomale). Le produit d’intérêt Y est représenté par Yi’-SH, Yi’ représentant Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -SH.

[0063] Utilisation des conjugués (II) de l’invention.

[0064] La présente invention a encore pour objet les conjugués de formule (II) pour une utilisation comme médicament.

[0065] Les conjugués (II) de l’invention se lient in situ, de façon covalente ou non covalente, à une cible membranaire ou non membranaire d’un organisme.

A titre d’exemples d’une cible membranaire on pourra citer :

- les récepteurs des facteurs de croissance, tels que REGF, RFGF, RVEGF, TrK, NGF, RPDGF, le récepteur de l’insuline, le récepteur de l’erythropoïétine, le récepteur des éphrines ou

- des molécules membranaires impliquées dans le contrôle immunitaire, tels que les facteurs CD ou ILT, PD-1 , TIGIT, LAG, PD-L1 , TIM3. A titre d’exemples d’une cible non membranaire extracellulaire on pourra citer les protéines circulantes telles que des cytokines (TNFa, CD20, interférons, interleukines), les facteurs de croissance (VEGF, EGF, FGF), les anticorps, les agrégats sanguins protéiques ou non protéiques, les exosomes, I’ hydroxyapatite du tissu osseux.

[0066] En fonction de la cible à laquelle le conjugué de formule (II) se lie, alors le complexe pourra, après activation, être internalisé dans une cellule spécifique, via la reconnaissance du ligand par le RM6P-CI de ladite cellule. La spécificité du ciblage de cette cellule pourra être liée à la nature de la cible.

Par exemple, si la cible biologique est un récepteur du facteur de croissance épidermique REGF, alors le complexe activé sera internalisé dans la cellule et la cible biologique sera dégradée ou pas dans les lysosomes.

Si la cible est l’hydroxyapatite présente dans le tissu osseux, alors le complexe activé pourra être internalisé dans une cellule de tissu osseux.

Si la cible biologique est constituée par un agrégat sanguin constitué de plusieurs composantes de type protéique, acides nucléiques, collagène ou de fibrilles, alors le complexe activé pourra être internalisé dans les cellules environnantes.

[0067] A titre d’exemple, si le produit d’intérêt Y du conjugué de l’invention est un anticorps tel que l’infliximab, il pourra se lier à une cible non membranaire telle que la cytokine TNFa, ce qui pourrait permettre de traiter la maladie de Crohn, la spondylarthrite ankylosante ou la polyarthrite rhumatoïde.

De même, si le produit d’intérêt est un anticorps tel que le cetuximab, il pourra se lier à une cible membranaire telle que le récepteur du facteur de croissance épidermique REGF, ce qui pourrait permettre de traiter le cancer colorectal métastatique ou les cancers de la tête et du cou.

[0068] A titre d’exemples de pathologies pouvant être traitées à l’aide des conjugués de l’invention (II) on pourra citer celles choisies dans le groupe comprenant :

- les cancers, notamment les cancers solides comprenant les cancers de la prostate, du sein, du pancréas, du colon, du poumon, du foie ou des os,

- les maladies auto-immunes et inflammatoires, notamment la spondylarthrite ankylosante, la sclérose en plaques, le diabète de type 1 , la maladie de Crohn, le lupus, les thyroïdites auto-immunes, la polyarthrite rhumatoïde,

- les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, Charcot) et,

- les maladies infectieuses.

[0069] Les figures 1 et 2 illustrent l’intérêt des pro-ligands (I) et des conjugués (II) de l’invention. La figure 1 illustre la séquence d’évènements se produisant lorsque le conjugué (II) de l’invention, de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt », est introduit dans un organisme dans le but de lier une cible non membranaire (la cible non membranaire est représentée par une étoile dans la figure 1 ).

Le conjugué (II), une fois introduit dans l’organisme, se lie, par l’intermédiaire du produit d’intérêt à une cible non membranaire afin de former un complexe de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt - Cible non membranaire ». La liaison entre le produit d’intérêt et la cible non membranaire peut être de nature covalente ou non covalente. La cible non membranaire sert de point d’ancrage pour le produit d’intérêt. La cible non membranaire permet plus particulièrement de concentrer le produit d’intérêt à un endroit particulier et recherché de l’organisme.

Ensuite le pro-ligand est activé, par un mécanisme in situ dans l’organisme, en ligand ce qui conduit au complexe activé de structure « Ligand - Produit d’intérêt - Cible non membranaire ».

Le mécanisme d’activation du pro-ligand se produisant dans l’organisme peut être un processus enzymatique ou un processus chimique.

Par processus enzymatique, on entend une hydrolyse par l’action d’une enzyme présente naturellement dans l’organisme, comme par exemple une phosphatase, une estérase, une protéase, une nucléase, une sulfatase.

Selon un mode de réalisation avantageux, l’activation du pro-ligand en ligand est effectuée à l’aide de phosphatases alcalines ou acides présentes dans différents tissus de l’organisme.

Par processus chimique, on entend soit une hydrolyse dans des conditions acides, basiques ou neutres, soit une réaction d’oxydo-réduction. L’organisme présente en effet naturellement dans son environnement des conditions acides pouvant hydrolyser par exemple l’acétonide du proligand pour former le ligand, notamment dans des compartiments acides générés par les tumeurs solides ou les tissus osseux.

L’activation du pro-ligand en ligand permet ainsi la transformation du complexe de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt - Cible non membranaire » en complexe activé de structure « Ligand - Produit d’intérêt - Cible non membranaire ».

La transformation du pro-ligand en ligand (par le mécanisme in situ ci-dessus décrit) permet au ligand de pouvoir à nouveau être reconnu et fixé au niveau de son récepteur membranaire extracellulaire.

Une fois le complexe activé fixé au niveau du récepteur membranaire de la cellule par l’intermédiaire du ligand, deux cas de figure sont possibles. Dans le cas 1 , seul le conjugué est internalisé (donc sans la cible non membranaire) car l’objectif principal est d’internaliser le produit d’intérêt dans la cellule. Dans le cas 2, c’est l’ensemble du complexe qui est internalisé dans la cellule car l’objectif principal est d’éliminer la cible non membranaire en l’internalisant dans la cellule.

La figure 2 illustre la séquence d’évènements se produisant lorsqu’un conjugué de l’invention, de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt », est introduit dans un organisme dans le but de lier une cible membranaire (la cible membranaire est représentée par une étoile dans la figure 2).

Le conjugué (II), une fois introduit dans l’organisme, se lie, par l’intermédiaire du produit d’intérêt à une cible membranaire afin de former un complexe de structure « Pro-ligand - Produit d’intérêt - Cible membranaire ». La liaison entre le produit d’intérêt et la cible membranaire peut être de nature covalente ou non covalente. La cible membranaire sert de point d’ancrage à la surface d’une cellule particulière : elle permet plus particulièrement de concentrer le produit d’intérêt à un endroit particulier et recherché de l’organisme.

Ensuite le pro-ligand est activé, par un mécanisme in situ dans l’organisme, en ligand ce qui conduit au complexe activé de structure « Ligand - Produit d’intérêt - Cible membranaire ». Le mécanisme in situ se produisant est celui décrit précédemment à propos de la figure 1 .

Le ligand redevenu actif est reconnu et fixé au niveau du récepteur membranaire extracellulaire de la cellule.

Une fois le complexe activé fixé au niveau du récepteur membranaire de la cellule par l’intermédiaire du ligand, deux cas de figure sont possibles. Dans le cas 1 , seul le conjugué est internalisé (donc sans la cible membranaire) car l’objectif principal est d’internaliser le produit d’intérêt dans la cellule. Dans le cas 2, c’est l’ensemble du complexe qui est internalisé dans la cellule car l’objectif principal est d’internaliser dans la cellule le produit d’intérêt et la cible.

[0070] Dans la présente invention, le récepteur membranaire extracellulaire de la cellule est le RM6P-CI étant donné que le pro-ligand (I) de l’invention est un ProAMFA, à savoir un analogue du mannose 6-phosphate (M6P).

[0071] Comme indiqué ci-dessus, la liaison entre le conjugué (II) de l’invention et la cible (non membranaire ou membranaire) peut être de nature covalente ou non covalente. Le composé obtenu après la liaison du conjugué avec la cible sera nommé « complexe » dans la présente demande.

La présente invention décrit également un complexe constitué :

- d’un conjugué de formule (II) tel que défini ci-dessus,

- d’une cible non membranaire ou membranaire, ladite cible étant telle que définie ci-dessus, le conjugué (II) et la cible étant liés l’un à l’autre par une liaison de type non covalente ou covalente. [0072] Le ligand activé obtenu à l’issue du mécanisme in situ ci-dessus décrit correspond à un composé de formule générale (I) dans laquelle les radicaux P1 , P2 et P3 représenteraient chacun un atome d’hydrogène.

Le ligand activé AMFA est alors en mesure d’être reconnu et fixé par le RM6P-CI.

[0073] Le conjugué activé obtenu à l’issue du mécanisme in situ se produisant dans l’organisme peut être représenté par la formule générale (Il bis) suivante

[Cheml O] dans laquelle :

X, A, L, L’i, ri2 et Yi sont tels que définis ci-dessus, P’1 , P’2 et P’3 représentent chacun un hydrogène.

[0074] L’ activation du conjugué (II) au sein du complexe engendre un complexe activé constitué :

- d’un conjugué activé de formule (Il bis)

- d’une cible telle que ci-dessus définie, le conjugué activé de formule générale (Il bis) et la cible étant liés l’un à l’autre par une liaison de type non covalente ou covalente.

Le complexe activé ainsi obtenu est utilisé pour lier le RM6P-CI.

[0075] Selon un mode de réalisation de l’invention, le conjugué activé de formule (Il bis) présente une affinité, mesurée par la concentration inhibant de 50% (IC50), vis-à-vis du RM6P-CI, allant de 10'⁵ à 10'⁹ M.

[0076] Selon un autre aspect de l’invention, il est proposé une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu’elle comprend un conjugué de formule (II) tel que ci-dessus défini.

[0077] L’ invention concerne également un conjugué de formule (II) pour une utilisation telle que ci-dessus définie, à savoir pour une utilisation comme médicament, caractérisée en ce que le conjugué est sous une forme adaptée pour une administration par voie orale, parentérale, intraveineuse, musculaire ou sous-cutanée.

Exemples

[0078] Les exemples qui suivent font notamment référence aux figures et décrivent la synthèse de pro-ligands de formule (I), de conjugués (II) de l’invention, ainsi que l’étude de leur effets biologiques, et notamment de l’activation du pro-ligand en ligand. Le pro-ligand ProAMFAI (I) de l’invention est comparé au composé AMFA1 et au composé mannose 6- phosphate (M6P).

[0079] Exemple 1 : Synthèse du pro-ligand ProAMFAI de formule (I) et du pro-ligand ProAMFAI acétonide-oxime de formule (I)

[0080] Synthèse du ProAMFAI

[0081] Le pro-ligand ProAMFAI présente la formule développée suivante :

[Chem11]

Le pro-ligand ProAMFAI correspond à la formule générale (I) dans laquelle :

X représente CH2-P(O)(OZ)2 avec Z= H (donc le groupe phosphonate CH2-P(O)(OH)2) ;

P1 représente P(O)(OZ)2 avec Z= H (donc le groupe phosphate P(O)(OH)2) ;

P2 = P3 = H ;

A représente un oxygène ;

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n = à 0 (donc le groupe (CH2)2) et

Li représente ONH2.

Le schéma de synthèse du ProAMFAI est illustré à la figure 4 et est détaillé ci-dessous.

[0082] « 2, 3 ; 4, 6-di-O-isopropylidène-a-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle » (2)

À 14,300 g (1 ,0 eq ; 49,81 mmol) de 1 (« a,D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle ») sont additionnés 50 mL d’acétone anhydre.

31 mL (5,0 eq ; 249,05 mmol) de 2,2-diméthoxypropane sont ensuite ajoutés, suivi de 0,430 g (0,05 eq ; 2,49 mmol) d’acide paratoluènesulfonique. Après une heure de réaction le composé 2 est obtenu, il n’est pas isolé et est engagé tel quel dans la réaction suivante. Rf : 0,83 (AcOEt/cyclohexane (8:2)) ESI⁺ m/z : 367 [M+H]⁺

SMHR : 367,0765 Da ; Conf (%) : 100,00%

[0083] « 2,3 -O-lsopropylidène-a-D-mannopyranoside de 2-bromoéthyle » (3)

À la suite de la réaction précédente, 10 mL d’eau mQ sont rajoutés. Après 5h30, le milieu est neutralisé avec du NaHCOs (bicarbonate de sodium), la phase organique est séchée et évaporée. Le brut est purifié sur colonne de gel de silice, à l’aide de l’éluant AcOEt/cyclohexane (1 :9). Le composé 3 est obtenu avec un rendement de 66% sur 2 étapes.

Rf : 0,43 (AcOEt/cyclohexane (8:2))

ESI⁺ m/z : 327 [M+H]⁺

SMHR : 327,0439 Da ; Conf (%) : 100,00%

[0084] « 2,3 -O-lsopropylidène-a-D-manno-hexodialdo-1 ,5-pyranoside de 2-bromoéthyle » (4)

2,2 g (1 ,0 eq ; 6,72 mmol) de composé 3 et 0,105 g (0,1 eq ; 0,67 mmol) de TEMPO ((2,2,6,6-Tétraméthylpipéridin-1-yl)oxy) sont pesés et conditionnés sous atmosphère inerte puis 100 mL de dichlorométhane anhydre sont ajoutés.

1 ,496 g (1 ,0 eq ; 6,72 mmol) de TCCA (acide trichloroisocyanurique) sont ajoutés à 0°C. Une fois la réaction terminée, 10 mL de méthanol anhydre sont rajoutés puis le milieu est filtré sur célite. Après évaporation, une mousse blanche est obtenue. Le produit 4 n’est pas isolé et est engagé tel lors de la réaction suivante.

Rf : 0,54 (AcOEt/cyclohexane (8:2))

[0085] « (6E)-2,3-O-lsopropylidène-6,7-didésoxy-7-diéthoxyphosphinyl-a-D-manno-hept- 6-énopyranoside de 2-bromoéthyle » (5)

0,269 g (1 ,0 eq ; 6,72 mmol) de NaH (hydrure de sodium) à 60% sont conditionnés sous atmosphère inerte. 100 mL de THF (tétrahydrofurane) anhydre sont ajoutés pour former une suspension.

10 minutes après, 1 ,67 mL (1 ,0 eq ; 6,72 mmol) de méthylènediphosphonate de tétraéthyle (MDPTE) sont additionnés à la solution, sous agitation. Après 30 minutes, la solution d’anion est refroidie à 0°C puis canulée sur le composé 4 brut précédemment obtenu. En fin de réaction, le milieu est dilué dans 300 mL d’acétate d’éthyle et des lavages à la saumure puis à l’eau distillée sont effectués. La phase organique est séchée puis filtrée avant d’être évaporée à sec. Le brut est purifié sur colonne de gel de silice à l’aide de l’éluant AcOEt/cyclohexane (8 :2). Les fractions sont rassemblées et permettent d’obtenir le composé 5 avec un rendement de 51 % sur 2 étapes.

Rf : 0,18 (AcOEt/cyclohexane (8:2))

SMHR : 459,0786 Da ; Conf (%) : 100,00%

[0086] « 2,3 -O-lsopropylidène-6-désoxy-6-diéthoxyphosphinylméthylène-a-D- mannopyranoside de 2-bromoéthyle » (6)

1 ,250 g (1 ,0 eq ; 2,72 mmol) de composé 5 et 0,125 g (10% wt) de Pd/C sont conditionnés sous atmosphère inerte. 27 mL de méthanol anhydre sont ajoutés pour dissoudre le composé 5 puis 2,17 mL (5,0 eq ; 13,61 mmol) de triéthylsilane sont ajoutés au goutte à goutte. Après réaction, le milieu est filtré sur célite puis le solvant est évaporé. 1 ,200 g de composé 6 sont finalement obtenus, soit un rendement de 96%. Rf : 0,23 (AcOEt)

SMHR : 461 ,0924 Da ; Conf (%) : 100,00%

[0087] « 2,3 -O-lsopropylidène-6-désoxy-6-diéthoxyphosphinylméthylène-a-D- mannopyranoside de 2-(phtalimidooxy)éthyle » (7)

0,469 g (1 ,1 eq ; 2,87 mmol) de /V-hydroxyphtalimide sont pesés et conditionnés sous atmosphère inerte, puis 5 mL de THF anhydre sont ajoutés. 0,470 mL (1 ,2 eq ; 3,14 mmol) de DBU (1 ,8-Diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène) sont ajoutés et la solution est portée à 45°C. 30 minutes après, 1 ,2 g (1 ,0 eq ; 2,61 mmol) d’intermédiaire 6 dissous dans 8 mL de THF sont ajoutés au goutte à goutte sur l’anion.

Après 22 h de réaction, le milieu réactionnel est dilué dans du dichlorométhane puis des lavages à la saumure sont effectués. La phase organique est séchée sur du sulfate de magnésium (MgSC ) puis évaporée.

Le brut obtenu est purifié sur colonne de gel de silice avec de l’acétate d’éthyle (AcOEt). 0,915 g de composé 7 sont obtenus pour un rendement de 64%.

Rf : (CH2Cl2/éther éthylique 95/5 (v/v))

SMHR : 544,1946 Da ; Conf (%) : 100,00%

[0088] « 2,3 -O-lsopropylidène-4-O-diméthoxyphosphinyl-6-désoxy-6- diéthoxyphosphinylméthylène-a-D-mannopyranoside de 2-(phtalimidooxy)éthyle » (8)

0,915 g (1 ,0 eq ; 1 ,69 mmol) de composé 7 et 1 ,296 g (4,0 ; 6,74 mmol) de 5-(Benzylthio)- 1 H-tétrazole sont pesés, conditionnés sous atmosphère inerte et dissous dans 35 mL de dichlorométhane. La solution est refroidie avant d’ajouter au goutte-à-goutte 0,724 mL (2,0 eq ; 3,37 mmol) de diméthyl A/,/V-diisopropylphosphoramidite.

En fin de réaction, 0,670 mL (13,0 eq ; 21 ,8 mmol) de H2O2 (peroxyde d’hydrogène) à 30% sont directement ajoutés à la solution à température ambiante. Après 10 mn, le milieu est dilué dans du dichlorométhane puis 2 lavages avec NaHCOs sont effectués. La phase organique est séchée sur MgSC puis concentrée. Une purification sur colonne de gel de silice est effectuée avec de l’AcOEt. Après évaporation des fractions, 0,953 g de composé 8 sont obtenus. Le rendement est de 87%.

Rf : (CH2Cl2/éther éthylique 95/5 (v/v))

SMHR : 652,1922 Da ; Conf (%) : 100,00%

[0089] « 4-O-diméthoxyphosphinyl-6-désoxy-6-diéthoxyphosphinylméthylène-a-D- mannopyranoside de 2-(phtalimidooxy)éthyle » (9)

0,953 g (1 ,0 eq ; 1 ,46 mmol) de composé 8 sont pesés puis 7,3 mL de THF sont ajoutés. 1 ,625 g de résine Dowex H⁺ sont ensuite introduits dans le milieu réactionnel.

Après 18 h, la réaction est totale et la résine est éliminée par filtration. Le filtrat après évaporation permet d’obtenir le composé 9 avec un rendement de 34%. Rf : (CF^Ch/éther éthylique 95/5 (v/v))

SMHR : 612,1610 Da ; Conf (%) : 100,00%

[0090] « 4-O-dihvdroxyphosphinyl-6-désoxy-6-dihvdroxyphosphinylméthylène-a-D- mannopyranoside de 2-aminooxyéthyle » (ProAMFAI )

0,300 g (1 ,0 eq ; 0,49 mmol) de composé 9 sont conditionnés en présence de 0,882 g (12,0 eq ; 5,89 mmol) de iodure de sodium (Nal) et puis 1 ,1 mL d’acétonitrile anhydre, 0,55 mL (9,0 eq ; 3,93 mmol) de triéthylamine et 0,745 mL (12,0 eq ; 5,89 mmol) de chlorure de triméthylsilyle (TMSCI) sont rajoutés. La solution est agitée à température ambiante sous agitation et sous atmosphère inerte pendant 24h puis les solvants sont évaporés. Le résidu est repris dans du méthanol et les sels en excès sont éliminés par filtration. Le filtrat est traité par une résine échangeuse de cation (DOWEX® 50WX2, sous la forme H⁺) puis la résine est enlevée par filtration et une solution de 0,337 mL (15,0 eq ; 7,37 mmol) d’hydrazine monohydratée diluée dans 2,5 mL de méthanol est ajoutée sur le filtrat. Après réaction et évaporation à sec du milieu réactionnel, ce dernier est purifié sur une colonne de gel de silice 100 C (éluant : H2O). 68 mg de ProAMFAI ont été récoltés. Le rendement sur 2 étapes est de 35%.

Rf : 0,69 (2-Propanol/NH₄OH/H₂O 30/40/30 (v/v))

SMHR : 398,0607 Da ; Conf (%) : 100,00%

[a]_D ²⁰ : + 32,5° (4 mg pour 1 mL de H₂O)

[0091] Préparation du composé AMFA1

Le composé AMFA1 est un analogue du mannose 6-phosphate (M6P). Il est synthétisé selon un protocole décrit dans le document EP 2 448 600 B1 et présente la formule développée suivante :

[Chem12]

La différence entre ProAMFAI et AMFA1 réside dans la définition du radical P1 qui représente le groupe phosphate P(O)(OH)2 dans ProAMFAI versus l’atome d’hydrogène dans AMFA1 .

[0092] Composé mannose 6-phosphate (M6P)

Le composé mannose 6-phosphate (M6P) est acheté dans le commerce et présente la formule développée suivante :

[Chem13]

Le pro-ligand ProAMFA1acétonide-oxime correspond à la formule générale (I) dans laquelle :

A représente un oxygène ;

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n = à 0 (donc le groupe (CH2)2) et,

Li représente -O-N=C(CH3)2.

Le schéma de synthèse du ProAMFA1acétonide-oxime est illustré à la figure 24 et est détaillé ci-dessous.

[0095] « ProAMFA1acétonide-oxime » ou « oxime du 2,3-O-isopropylidène-6-désoxy-6- dihydroxyphosphinylméthylène-a-D-mannopyranoside de 2-aminooxyéthyle »

Une quantité de 0,010 g (1 ,0 eq ; 0,032 mmol) du composé AMFA1 est solubilisée dans un mélange de DMSO/acétone (0,5 mL/0,2 mL) anhydre. Après 18 h, les solvants sont évaporés. La purification est réalisée sur une colonne de gel de silice (220 mg) (éluant : isopropanol) ce qui permet d’obtenir le composé dénommé AMFAI ox (9 mg) (voir figure 24).

ESI⁺ m/z : 358 [M+H]⁺

[0096] Le composé AMFAI ox (9 mg) est repris dans du diméthylformamide anhydre (0,2 mL) et 0,3 mg d’acide para-tuoluènesulfonique (APTS) (0,05 eq ; 0,002 mmol) ainsi que du 2,2-diméthoxypropane (0,02 mL) sont ajoutés. Après 18h sous agitation le milieu est neutralise, avec une solution d ammoniaque et le ProAMFA1 acetonide-oxime (I) (9 mg) est obtenu après purification sur gel de silice (éluant : eau) (voir figure 24).

ESI⁺ m/z : 398 [M+H]⁺

[0097] Activation du ProAMFA1acétonide-oxime en AMFAIox

Afin de vérifier son potentiel en qualité de pro-ligand, la capacité du ProAMFAIacétonide- oxime à être dépourvu du groupement acétonide de formule [Chem2] en P2 et P3 a été étudiée. Une étude cinétique de l’hydrolyse acide du groupement acétonide a été réalisée en solubilisant le ProAMFA1acétonide-oxime dans du méthanol deutéré (MeOD), en ajustant le pH à 5,5 et la réaction a été suivie par une analyse par RMN ³¹ P selon le protocole décrit ci-après. La transformation du ProAMFA1acétonide-oxime en AMFAI ox est décrite dans la figure 25.

Test d’hydrolyse du groupement acétonide du ProAMFA1 acétonide-oxime

Le ProAMFA1 acétonide-oxime (9 mg) est dissout dans 500 pL de MeOD. Le pH est ajusté à 5,5 par l’addition de 4 pL d’une solution d’acide chlorhydrique 1 N. Les analyses de l’échantillon placé dans le tube RMN sont effectuées à 37°C à l’aide d’un spectromètre Bruker AVANCE 400 MHz avec les paramètres suivants : 162 MHz, ns=32, D1 =2s, largeur d’impulsion : 15°, 310 K.

Les résultats obtenus lors de cette étude de conversion du ProAMFA1acétonide-oxime en AMFAIox sont illustrés à la figure 26. Comme indiqué sur la série de spectres de cette figure, le signal ³¹ P du phosphonate du ProAMFA1 acétonide-oxime disparaît au profit du signal ³¹ P du phosphonate de l’AMFAIox. La formation de l’AMFAIox a été confirmée par l’addition d’une quantité connue d’AMFAIox entraînant l’augmentation du signal spécifique de l’AMFAIox (t = 2h30 + AMFAIox).

[0098] Exemple 2 : Préparation des conjugués de l’invention de formule (II)

[0099] Trois produits d’intérêt Y, à savoir une enzyme lysosomale et deux anticorps, ont respectivement été fonctionnalisés avec les composés Pro-AMFA1 ou AMFA1 .

[0100] L’ enzyme lysosomale testée est achetée dans le commerce sous la dénomination Myozyme®. Il s’agit de l’enzyme alpha alglucosidase (ou alpha glucosidase acide). Elle peut être représentée dans ce qui suit par « Myo ». Elle contient dans sa structure des résidus M6P permettant le ciblage du RM6P-CI. L’enzyme lysosomale Myo est utilisée pour le traitement de la maladie de Pompe par thérapie enzymatique substitutive. Les anticorps testés sont l’infliximab et le cetuximab, deux anticorps monoclonaux chimériques de type lgG1 qui ne possèdent pas de résidus M6P dans leur structure. Ils peuvent être représentés dans ce qui suit par « Infli » et « Cetux » ;

Comme déjà indiqué :

- l’anticorps Infliximab se lie à la cytokine extracellulaire soluble, TNFa, et est utilisé pour le traitement de maladies auto-immunes et inflammatoires (maladie de Crohn, la spondylarthrite ankylosante ou la polyarthrite rhumatoïde) (Melsheimer R et al., Biologies. 2019, 13,139) ;

- l’anticorps Cetux quant à lui se lie au REGF extracellulaire et membranaire et est utilisé pour le traitement de différents cancers (cancer colorectal métastatique ou les cancers de la tête et du cou) (Baselga J. et al., J. Clin.Oncol., 2005, 23, 5560 ; Galizia G et al., Oncogene. 2007, 26, 3654).

[0101] Les conjugués ainsi formés peuvent indifféremment être représentés dans la présente demande par « AMFA1-Myo » ou « Myo-AMFA1 », « ProAMFA1-Myo » ou « Myo-ProAMFA1 », « AMFA1-lnfli » ou « lnfli-AMFA1 », « ProAMFA1-lnfli » ou « Infli-ProAMFAI », « AMFA1-Cetux » ou « Cetux-AMFA1 », « ProAMFAI -Cetux » ou « Cetux-ProAMFA1 ».

Les conjugués de l’invention sont ceux qui comprennent la partie ProAMFAI . Avantageusement selon l’invention la partie ProAMFAI permet que le conjugué, une fois introduit dans un organisme, ne soit pas immédiatement reconnu par le récepteur RM6P- Cl, ce qui permet ainsi le ciblage spécifique d’une cible biologique prédéterminée (membranaire ou non membranaire) par le composé d’intérêt Y, à savoir dans le cas des exemples la Myozyme ® ou les anticorps Infliximab et Cetuximab.

[0102] Couplage et quantification des composés AMFA1 et ProAMFAI avec un produit d’intérêt Y (Myozyme ®, Infliximab ou Cetuximab)

Le couplage de AMFA1 ou ProAMFAI avec un produit d’intérêt Y (Myozyme ®, Infliximab ou Cetuximab) est réalisé grâce à la fonction éthyloxyamine présente sur le bras espaceur de AMFA1 ou ProAMFAI , qui permet la formation d’une liaison covalente de type oxime avec les fonctions aldéhydes préalablement générées par oxydation ménagée sur les chaînes oligosaccharidiques du produit d’intérêt Y (Myozyme ®, Infliximab ou Cetuximab). Le couplage d’un produit d’intérêt Y comprenant une fonction aldéhyde (générée préalablement par oxydation) avec ProAMFAI de formule (I) (ou avec AMFA1) comprenant un bras espaceur avec une fonction éthyloxyamine (L= -(CH2)2- et Li= -ONH2) est notamment illustré en figure 3 point 1/.

Couplage des AMFA1 ou ProAMFAI avec la Myozyme®

Dans un premier temps, l’enzyme Myozyme® est oxydée au niveau de ses chaînes oligosaccharidiques. Pour ce faire la Myozyme® est filtrée sur sépharose G25 avant d’être oxydée par 1 mM de métaperiodate de sodium pendant 30 min à 4°C. L’ajout de glycérol (20 pL par mL) pendant 10 min à 4°C permet d’arrêter l’oxydation.

La solution d’enzyme est ensuite filtrée sur sépharose G25 et le composé ProAMFAI ou AMFA1 est ajouté avec un excès molaire de 100 fois. Après 2 h à 37°C, la Myozyme® est couplée et l’excès de ProAMFA 1 ou AMFA1 non couplé présent dans la solution est éliminé par une dialyse sur tampon contenant, pour 1 L : 2% mannitol, 3 mM Na2HPO4, 22,1 mM NaH2PO4-et 0,005% polysorbate 80.

Les conjugués Myo-AMFA1 et Myo-ProAMFA1 ainsi obtenus sont conservés dans ce tampon à 4°C.

Quantification

Une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF a permis d’estimer à environ 1 le nombre de ProAMFAI ou d’AMFAI couplés à l’enzyme Myozyme®.

Couplage des AMFA1 ou ProAMFAI avec l’infliximab

Dans un premier temps, l’anticorps infliximab est oxydé au niveau de ses chaînes oligosaccharidiques. Pour ce faire l’infliximab (5 mg) préalablement filtré sur sépharose G25 est oxydé par 1 mM de métaperiodate de sodium pendant 30 min à 4°C. L’ajout de glycérol (20 pL par mL) pendant 10 min à 4°C permet d’arrêter l’oxydation.

La solution d’anticorps est ensuite filtrée sur sépharose G25 et le composé ProAMFAI ou AMFA1 est ajouté avec un excès molaire de 200 fois. Après 2 h à 37°C, l’infliximab est couplé et l’excès de ProAMFAI ou AMFA1 non couplé présent dans la solution est éliminé par une dialyse sur tampon contenant, pour 1 L : 2% mannitol, 3 mM Na2HPO4, 22,1 mM NaH2PO4-et 0,005% polysorbate 80.

Les conjugués lnfli-AMFA1 et Infli-ProAMFAI ainsi obtenus sont conservés dans ce tampon à 4°C.

Quantification

Une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF a permis d’estimer à environ 5 le nombre de ProAMFAI ou d’AMFAI couplés à l’anticorps infliximab.

Couplage des AMFA1 ou ProAMFAI avec le cetuximab

Le protocole est similaire à celui décrit pour l’infliximab.

[0103] Caractérisation des conjugués obtenus par coloration au bleu de Coomassie L’intégrité du produit d’intérêt (Myozyme®, infliximab ou cetuximab) après le couplage avec AMFA1 ou ProAMFAI est vérifiée par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide-SDS 12% suivie d’une coloration au bleu de Coomassie. Après migration, le gel est coloré pendant 1 h avec une solution de bleu de Coomassie pour le marquage du produit d’intérêt. Il est en effet important de s’assurer que le couplage entre le produit d’intérêt et le proligand n’a pas engendré de dégradation.

Les échantillons de Myozyme®, Myo-AMFA1 et Myo-ProAMFA1 ont été déposés sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes et suivis par une coloration au bleu de Coomassie. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 5.

On peut en conclure que le couplage n’a pas engendré de dégradation puisque les mêmes bandes caractéristiques de l’enzyme à 110 kDa sont observées avant et après couplage.

De la même façon les échantillons d’Infliximab, lnfli-AMFA1 et Infli-ProAMFAI ont été déposés sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes et suivis par une coloration au bleu de Coomassie. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 6.

On peut en conclure que le couplage n’a pas engendré de dégradation puisque les mêmes bandes caractéristiques de l’anticorps à 50 kDa et 25 kDa sont observées avant et après couplage.

[0104] Exemple 3 : Evaluation biologique des pro-ligands (I)

[0105] Évaluation de la cytotoxicité du ProAMFAI

La cytotoxicité du ProAMFAI de formule (I) a été évaluée en comparaison avec celle du M6P et de l’AMFAI sur des cellules humaines MCF-7 de cancer du sein (figure 7) et sur des fibroblastes humains sains (figure 8) selon le protocole décrit ci-dessous.

Protocole expérimental :

Les cellules humaines de cancer du sein (MCF-7) et les fibroblastes humains (FS01035) sont cultivés respectivement en milieu DMEM/F12 et DMEM additionnés de 10% de sérum de veau foetal (SVF) et de pénicilline-streptomycine. Les cellules sont maintenues à 37°C en présence de 5% CO2. Après un traitement par la trypsine, les cellules sont ensemencées dans des plaques 96-puits à 20% de confluence pour les cellules MCF-7 et 40% pour les fibroblastes. Le lendemain, les cellules adhérentes sont traitées. Les traitements avec les composés M6P, AMFA1 et ProAMFAI sont réalisés à des concentrations comprises entre 10'⁴ et 10'⁷ M (figures 7 et 8). Chaque condition est analysée en triplicat. Après 72 h d’incubation, la viabilité cellulaire est évaluée par un test utilisant du 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromure (MTT).

Les résultats concernant l’étude de la cytotoxicité sont illustrés à la figure 7 pour les cellules de cancer du sein et à la figure 8 pour les fibroblastes.

Il ressort de ces figures que le composé ProAMFAI ne présente pas de toxicité significative pendant un traitement de 72 h jusqu’à la concentration de 10'⁴ M sur les modèles cellulaires choisis. Le composé AMFA1 est également non toxique par rapport au composé M6P naturel.

[0106] Affinité du ProAMFAI pour le RM6P-CI

Le ProAMFAI a été évalué pour son affinité éventuelle pour le récepteur RM6P-CI en comparaison avec l’AMFAI et le M6P. Comme déjà indiqué, l’affinité désigne l’intensité de l’interaction du ligand, par exemple l’AMFAI , pour son récepteur, à savoir pour le RM6P- Cl. Pour ce faire, un test basé sur la compétition d’interaction avec le RM6P-CI est réalisé selon le protocole décrit ci-dessous. Protocole expérimental :

Les tests d’affinité sont réalisés en utilisant du RM6P-CI biotinylé (RM6P-Clb) qui reconnaît du pentamannose 6-phosphate (PMP) préalablement adsorbé sur des plaques de 96 puits MaxiSorp™. Avant d’être distribué dans les puits, le RM6P-Clb est pré-incubé 2 h en présence de M6P, AMFA1 ou ProAMFAI à différentes concentrations. Les solutions préincubées sont ensuite distribuées dans les puits contenant le PMP. Après 2 h à température ambiante, la quantité de RM6P-Clb lié au PMP est déterminée en utilisant une solution de streptavidine couplée à la peroxydase en présence de substrat OPD (o-phénylènediamine) et par mesure de densité optique à 450 nm.

Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 9 et dans le tableau 7 ci-après. Le tableau 7 indique les concentrations nécessaires de M6P, AMFA1 et ProAMFAI pour avoir une interaction de 50% avec le RM6P-CI (IC50).

[0107] [Tableau?]

[0108] Il ressort de la figure 9 et du tableau 7 que le ProAMFAI n’a pas d’affinité pour le RM6P-CI. L’absence d’affinité du ProAMFAI pour le RM6P-CI est inattendue car il n’était pas prévisible pour l’homme de l’art que le seul ajout d’un phosphate sur le M6P (à savoir P1 = P(O)(OH)2) permettrait de neutraliser totalement son interaction avec ledit récepteur RM6P-CI. Cette caractéristique inédite permet de valider son potentiel de pro-ligand. L’absence d’affinité du ProAMFAI vis-à-vis du RM6P-CI permet d’éviter l’internalisation cellulaire par ces récepteurs des principes actifs auxquels le ProAMFAI sera associé (le produit d’intérêt et la cible biologique).

[0109] Activation du ProAMFAI en AMFA1

Afin de vérifier son potentiel thérapeutique en qualité de pro-ligand, la capacité du ProAMFAI à être dépourvu de son groupement P1 = phosphate (P(O)(OH)2) a été étudiée. Une étude cinétique de déphosphorylation a été réalisée en incubant le ProAMFAI en présence de phosphatases alcalines isolées de placenta humain et suivie par une analyse par RMN ³¹ P selon le protocole décrit ci-après.

Test de digestion enzymatique par la phosphatase alcaline de ProAMFAI

Un aliquote de 2,3 mg de ProAMFAI est dissout dans 200 pL de D2O et 300 pL de tampon Tris 50 mM pH 7,4. Une première analyse de l’échantillon placé dans le tube RMN est effectuée à 37°C à l’aide d’un spectromètre Bruker AVANCE 400 MHz avec les paramètres suivants : 162 MHz, ns=16, Di=2s, largeur d’impulsion : 15°, 310 K. Un aliquote de 2,3 mg de phosphatase alcaline isolée de placenta humain est dissout dans 100 pL de Tris 50 mM pH 7,4 puis additionné dans le tube RMN. Les paramètres indiqués sont employés pour une étude cinétique de la digestion enzymatique.

La cinétique de conversion du ProAMFAI en AMFA1 a pu être établie après intégration des différents signaux observés en RMN.

Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 10. Comme indiqué sur la série de spectres de cette figure, la diminution du signal du phosphate du ProAMFAI au profit de l’apparition du phosphate minéral (formé lors de la réaction d’hydrolyse par la phosphatase) est observée en présence de phosphatase. Dans le même temps, le signal ³¹ P du phosphonate du ProAMFAI disparaît au profit du signal ³¹P du phosphonate de l’AMFAI . La formation de l’AMFAI a été confirmée par l’addition d’une quantité connue d’AMFAI entraînant l’augmentation du signal spécifique de l’AMFAI . Dans le cadre du test, un échantillon de ProAMFAI de pureté égale à 87% a été utilisé. Le sous-produit présent est le ProAMFAI - oxime (ProAMFAI ox), qui provient de la réaction entre le ProAMFAI et de l’acétone.

ProAMFAI ox présente la formule développée suivante :

[Chem14]

Il ressort également de la série de spectres de la figure 10 que la phosphatase alcaline hydrolyse de la même manière le phosphate du ProAMFAI ox conduisant à la formation du ligand AMFA1 -oxime (AMFAI ox).

[0110] Exemple 4 : Évaluation biologique des conjugués (II), Myo-ProAMFA1 et Infli- ProAMFAI : cytotoxicité et affinité pour le RM6P-CI

[0111] Évaluation de la cytotoxicité du conjugué Myo-ProAMFA1

La cytotoxicité du conjugué Myo-ProAMFA1 de l’invention et du conjugué Myo-AMFA1 a été évaluée en comparaison avec l’enzyme lysosomale seule Myo, sur des cellules humaines MCF-7 du cancer du sein (figure 11 ) et sur des fibroblastes humains sains (figure 12) selon le même protocole que celui décrit dans l’exemple 3.

Les résultats illustrés aux figures 11 et 12 démontrent que les conjugués Myo-ProAMFA1 et Myo-AMFA1 ne présentent pas de cytotoxicité significative dans les modèles cellulaires choisis par rapport à la Myozyme® ou par rapport aux cellules témoins non traitées (100 % ± 10%).

[0112] Évaluation de l’affinité du conjugué lnfli-ProAMFA1 pour le RM6P-CI

Le conjugué lnfli-ProAMFA1 de l’invention et le conjugué lnfli-AMFA1 ont été évalués pour leur affinité pour le récepteur RM6P-CI selon le même protocole que celui décrit dans l’exemple 3. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 13 et dans le tableau 8 ci-après. Le tableau 8 indique les concentrations nécessaires de M6P et lnfli-AMFA1 pour avoir une interaction de 50% avec le RM6P-CI (IC50). Les concentrations de l’Infliximab et infli- ProAMFAI n’ont pu être déterminées dans la gamme de concentration testée et sont supérieures à 10'⁵ M.

[0113] [Tableaus]

[0114] Le test d’affinité pour le RM6P-CI du conjugué Infli-ProAMFAI montre que ledit conjugué Infli-ProAMFAI présente une très faible affinité pour le RM6P-CI (figure 13 et tableau 8). Cette affinité est comparable à celle de l’anticorps infliximab seul, alors que le conjugué lnfli-AMFA1 présente une forte affinité pour le RM6P-CI. La très faible affinité du conjugué Infli-ProAMFAI est en accord avec les résultats ci-dessus obtenus avec le ProAMFAI seul.

[0115] Exemple 5 : évaluation de l’activation du conjugué (II) Myo-ProAMFA1 par les phosphatases alcalines

[0116] Activation du conjugué Myo-ProAMFA1 en conjugué Myo-AMFA1 par les phosphatases alcalines

Afin de vérifier son potentiel thérapeutique et sa capacité à être activé, la transformation du conjugué Myo-ProAMFA1 , présentant un groupement P1 = phosphate, en conjugué Myo-AMFA1 , présentant un groupement P1 = H, a été étudiée.

Une étude cinétique de déphosphorylation a été réalisée en incubant le Myo-ProAMFA1 en présence d’une phosphatase alcaline isolée de placenta humain selon le protocole décrit ci-après.

Protocole de digestion enzymatique par la phosphatase alcaline des conjugués Myo-AMFAI et Myo-ProAMFA1

Le conjugué Myo-ProAMFA1 est incubé avec la phosphatase alcaline à 37°C. Après 1 h, 24 h et 96 h la réaction est arrêtée dans la glace et les échantillons sont préparés pour être analysés par Western blot en utilisant un gel de polyacrylamide SDS-PAGE et sont comparés à l’enzyme seule (Myozyme®) et le conjugué Myo-AMFA1 . Après un transfert sur membrane, la fraction de Myo-ProAMFA1 devenue Myo-AMFA1 est caractérisée en utilisant un anticorps spécifique dirigé contre l’AMFAI suivi par un anticorps secondaire anti-IgG de lapin conjugué à la peroxydase. Les membranes sont ensuite révélées par un substrat chimio-luminescent. Pour vérifier les quantités d’enzymes présentent sur la membrane, l’enzyme est reconnue par un anticorps de lapin spécifique de ladite enzyme (Anti-Myo), puis par un anticorps secondaire anti-IgG de lapin conjugué à la peroxydase de raifort et suivi d’une révélation chimio-luminescente.

Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 14. Au cours du temps, le traitement du conjugué Myo-ProAMFA1 par la phosphatase induit une augmentation d’intensité du signal à 110 kDa correspondant à Myo-AMFA1 reconnu par l’anticorps anti-AMFA1. Ce résultat permet de démontrer la capacité du conjugué Myo-ProAMFA1 à être déphosphorylée en Myo-AMFA1 en présence de phosphatase alcaline.

[0117] Exemple 6 : évaluation de l’activation des conjugués (II) Infli-ProAMFAI par les phosphatases et le sérum humain

[0118] Évaluation de l’activation du conjugué Infli-ProAMFAI en conjugué lnfli-AMFA1 par les phosphatases acides et alcalines par Western Blots

Le conjugué Infli-ProAMFAI est incubé avec 8 Ul/ml de phosphatases alcalines de placenta humain ou avec 3 Ul/ml de phosphatases acides issues de Solanum Tuberosum à 37°C. Après 16, 24, 48 ou 72 h la réaction est arrêtée dans la glace et les échantillons sont analysés par Western blot comme décrit ci-dessus pour la Myo-ProAMFA (figure 14). Les échantillons sont révélés avec un anticorps anti-AMFA1 (qui reconnaît l’AMFAI ) et avec un anticorps anti-IgG humaines (afin de vérifier que les quantités d’anticorps déposées sont comparables).

Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 15. Au cours du temps, le traitement du conjugué Infli-ProAMFAI par les phosphatases induit une augmentation d’intensité du signal à 50 kDa correspondant à lnfli-AMFA1 reconnu par l’anticorps anti-AMFA1. Ce résultat permet de démontrer la capacité du conjugué Infli-ProAMFAI à être déphosphorylé en lnfli-AMFA1 en présence de phosphatases acides et alcalines.

[0119] Affinité de I’infli-ProAMFAl pour le RM6P-CI après activation par les phosphatases alcalines

L’affinité pour le récepteur RM6P-CI du conjugué Infli-ProAMFAI avant et après digestion par les phosphatases alcalines (8 Unités/ml) à 37°C pendant 24 h est analysée par ELISA par fixation des anticorps pendant 90 min sur le RM6P-CI (0,5 pg/ml) préalablement adsorbé sur une microplaque 96-puits. Les anticorps retenus sont quantifiés par un second anticorps anti-IgG humaines conjugué à la peroxidase et le substrat 3, 3', 5,5'- tétraméthylbenzidine (TMB). L'absorbance est lue à 650 nm.

Les résultats présentés à la figure 16 montrent que l’action des phosphatases permet d’obtenir une affinité dès la concentration de 2.10'⁷ M pour le conjugué Infli-ProAMFAI digéré/activé (à savoir le conjugué lnfli-AMFA1 ), alors que l’affinité de Infli-ProAMFAI n’est pas détectable. Ce résultat démontre pour la première fois que l’activation par les phosphatases alcalines du Pro-AMFA1 en AMFA1 à la surface d’un anticorps peut créer une affinité pour le RM6P-CI et que cette affinité est même très supérieure à celle du M6P décrite en figure 13.

[0120] Évaluation de l’activation du conjugué Infli-ProAMFAI en conjugué lnfli-AMFA1 dans le sérum humain par Western Blots

Le conjugué Infli-ProAMFAI est incubé en présence de sérum humain (40 p.1) à 37°C. Après 4, 16 ou 24 h la réaction est arrêtée dans la glace et les échantillons sont analysés par Western blot et révélés avec un anticorps anti-AMFA1 et par un anticorps anti-IgG humaines comme décrit ci-dessus pour la figure 15.

Les résultats présentés à la figure 17 montrent au cours du temps que le traitement du conjugué Infli-ProAMFAI par le sérum humain induit une augmentation d’intensité du signal à 50 kDa correspondant au conjugué lnfli-AMFA1 reconnu par l’anticorps anti-AMFA1. Ce résultat permet de démontrer la capacité du conjugué Infli-ProAMFAI à être déphosphorylé en lnfli-AMFA1 par des phosphatases présentes dans le sérum humain.

[0121] Affinité de I’infli-ProAMFAl pour le RM6P-CI après activation dans le sérum humain L’affinité pour le récepteur RM6P-CI du conjugué Infli-ProAMFAI est mesurée selon le même protocole que celui décrit dans l’exemple 3, avant et après digestion par le sérum humain (40 p.1) à 37°C pendant 24 h.

Les résultats présentés à la figure 18 montrent que l’action des phosphatases du sérum humain permet d’obtenir une affinité détectable dès la concentration de 10'⁷ M pour le conjugué Infli-ProAMFAI digéré, à savoir le conjugué lnfli-AMFA1 , alors que l’affinité de l’Infli-ProAMFAI n’est pas détectable.

[0122] Exemple 7 : évaluation de l’activation des conjugués (II) Cetuximab- ProAMFAI par les phosphatases

[0123] Couplage des AMFA1 ou ProAMFAI avec le Cetuximab

Une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF a permis d’estimer à environ 7 le nombre de ProAMFAI ou AMFA1 couplés à l’anticorps Cetuximab. L’intégrité du produit d’intérêt (Cetux) après le couplage avec AMFA1 ou ProAMFAI est vérifiée par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide-SDS 12% suivie d’une coloration au bleu de Coomassie. Les résultats illustrés à la figure 19 indiquent que les couplages n’ont pas engendré de dégradation puisque les mêmes bandes caractéristiques de l’anticorps à 50 kDa et 25 kDa sont observées avant et après couplage.

[0124] Evaluation de l’activation du conjugué Cetux-ProAMFA1 en conjugué Cetux-AMFA1 par les phosphatases acides et alcalines par Western Blots

Le conjugué Cetux-ProAMFA1 est incubé avec 8 Ul/ml de phosphatases alcalines de placenta humain ou avec 3 Ul/ml de phosphatases acides issues de Solanum Tuberosum à 37°C. Après 24, 48, 72 ou 96 h, la réaction est arrêtée dans la glace et les échantillons sont analysés par Western blot comme décrit ci-dessus pour la Myo-ProAMFA (figure 14). Les échantillons sont révélés avec un anticorps anti-AMFA1 et avec un anticorps anti-IgG humaines.

Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 20. Au cours du temps, le traitement du conjugué Cetux-ProAMFA1 par les phosphatases induit une augmentation d’intensité du signal à 50 kDa correspondant au conjugué Cetux-AMFA1 reconnu par l’anticorps anti- AMFA1 . Ce résultat permet de démontrer la capacité du conjugué Cetux-ProAMFA1 à être déphosphorylé en Cetux-AMFA1 en présence de phosphatases acides et alcalines.

[0125] Exemple 8 : internalisation cellulaire des conjugués (II) Infli-ProAMFAI et Cetux-ProAMFA1 après activation par les phosphatases

[0126] Internalisation cellulaire du conjugué Infli-ProAMFAI dans les cellules Hela

Le conjugué Infli-ProAMFAI qui a été préalablement couplé au fluorochrome AlexaFluor647 est ensuite incubé ou pas pendant 48 h en présence de sérum humain pour son activation par les phosphatases. Les deux lots d’anticorps (0,75 mg/ml) sont ensuite incubés 5 h avec des cellules humaines Hela, de cancer de l’utérus. La fluorescence des cellules est observée par microscopie confocale.

Les résultats, illustrés à la figure 21 , indiquent une augmentation de 2,7 fois de l’internalisation du conjugué grâce à la digestion du ProAMFAI par les phosphatases sériques.

[0127] Internalisation cellulaire du conjugué Cetux-ProAMFA1 dans les cellules Hela

Le conjugué Cetux-ProAMFA1 qui a été préalablement couplé au fluorochrome AlexaFluor488 est ensuite incubé ou pas pendant 24 h en présence de sérum humain pour son activation par les phosphatases. Les deux lots d’anticorps (0,75 -g/ml) sont ensuite incubés 18 h avec des cellules Hela. La fluorescence des cellules est mesurée par cytométrie en flux.

Les résultats, illustrés à la figure 22, indiquent une augmentation de 2 fois de l’internalisation du conjugué après la digestion du ProAMFAI par les phosphatases sériques.

[0128] Exemple 9 : Affinité du conjugué (II) Infli -ProAMFAI et de l’anticorps Infliximab pour son antigène, le TNFa

[0129] Les affinités des anticorps pour l’antigène sont quantifiées par ELISA. Les anticorps sont incubés avec l'antigène TNFa préalablement adsorbé sur une microplaque pendant 1 h à 37 °C. Les anticorps retenus sur la plaque sont quantifiés à l'aide d’un second anticorps anti-IgG humaines couplé à la peroxidase et par l'ajout du substrat de chlorhydrate d'o- phénylènediamine (OPD). Les absorbances ont été lues à 450 nm.

Les résultats illustrés à la figure 23 indiquent que le couplage du ProAMFAI avec l’infliximab ne modifie pas l’affinité de l’anticorps Infliximab pour son antigène. La modification de l’anticorps par le greffage de plusieurs ProAMFA n’apporte donc pas de modification de la structure tridimensionnelle de l’anticorps empêchant sa reconnaissance de l’antigène.

[0130] La présente divulgation ne se limite pas aux exemples décrits ci-avant, seulement à titre d’exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l’homme de l’art dans le cadre de la protection recherchée.

Liste des documents cités

Documents brevets

[0131] À toute fin utile, les documents brevets suivants sont cités :

- patcitl : EP 2 448 600 B1 ;

- patcit2 : EP 3 350 192 B1 ;

- patcit3 : demande FR2302097 déposée le 07/03/2023.

Littérature non-brevet

[0132] À toute fin utile, les éléments non-brevets suivants sont cités :

- nplcitl : Vidil C. et al., Eur.J. Org. Chem., 1999, 447 ;

- nplcit2 : Jeanjean A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2008, 18, 6240 ;

- nplcit3 : El Cheikh K. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 14774 ;

- nplcit4 :Ghosh P. et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2003, 4, 202 ;

- nplcit5 :Gauthier C. et al. J. Control. Release 2024, 365, 759 ;

- nplcit6 : Kleeb et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 59, 3163 ;;

- nplcit7 : Basile I. et al., J. Control. Release, 2018, 269, 15 ; - nplcit8 : Godefroy A. et al., J. Cell. Mol. Med., 2019, 23, 6499) ;

- nplcit9 : Daurat M. et al., Front. Immunol., 2024, 15, 1273280 ;

- npIcitIO : Gauthier et al., Biomed. Pharmacother., 2024, 175, 116707 ;

- nplcitl 1 : Gauthier C. et al., J. Control. Release, 2023, 358, 465 ; - nplcitl 2 : Vaillant O. et al., Angewandte Chemie, 2015, 54, 5952 ;

- nplcitl 3 : Bouffard et al., Int J Mol Sel., 2019, 20, 2809 ;

- nplcitl 4 : Daurat et al., Biomater. Sel., 2020, 8, 3678 ;

- nplcitl 5 : Melsheimer R et al., Biologies. 2019, 13,139 ;

- nplcitl 6 : Baselga J. et al., J. Clin. Oncol., 2005, 23, 5560 ; - nplcitl 7 : Galizia G et al., Oncogene. 2007, 26, 3654.

Claims

Revendications

[Revendication 1] Pro-ligand caractérisé en ce qu’il présente la formule générale (I) suivante dans laquelle : la ligne pointillée représente une liaison qui est présente ou non ;

X représente -CH₂-P(O)(OZ)₂ ; -CH₂-CO₂Z ;- -CH(CO₂Z)₂ ; -CH(P(O)(OZ)₂)₂ ; -CHF-CO₂Z ; -CHF-P(O)(OZ)₂ ; -CF₂-CO₂Z ; -CF₂-P(O)(OZ)₂ ; -CH(CO₂Z)(P(O)(OZ)₂), dans ce cas la liaison représentée par la ligne pointillée n’est pas présente ; ou,

[Chem2]

H₃C CH₃ .

A représente un radical divalent choisi parmi -O- ; -S- ; -NH- ; -CH₂- ;

L représente ^oo -(CH₂)₂-(O-CH₂-CH₂)_n- avec n représentant un entier allant de 0 à 6 ;

°° -H ; -NH₂ ; -(CH₂)_ni-CH=CH₂ ou -(CH₂)_ni-C=CH avec représentant un entier allant de 0 à 4, ce qui signifie que dans chacun de ces cas Li est absent ; ^oo un radical hydrocarboné divalent saturé, linéaire ou ramifié, ayant de 1 à 30 atomes de carbone ; un radical hydrocarboné divalent insaturé, linéaire ou ramifié, ayant de 2 à 30 atomes de carbone ; ^oo un radical hydrocarboné divalent saturé ou insaturé tel que défini ci-dessus dont un ou plusieurs groupements -CH₂-, -CH=CH- et/ou -C=C- du radical hydrocarboné saturé ou insaturé est (sont) remplacé(s) indépendamment l’un de l’autre par :

⁰⁰⁰ un groupement -O- ; -NH- ; -S- ; -CO-NH- ; -NH-CO-O- ; et/ou ⁰⁰⁰ un système cyclique ou hétérocyclique choisi parmi ceux listés dans le tableau 1 ci- après

[Tableau"!] Li représente ^oo -O-NH₂ ; ^oo un système cyclique ou hétérocyclique choisi parmi

[Chem3] un alkyle en C1-C5, et est de préférence un éthyle ;

[Chem5]

[Chem6]

[Chem7]

[Chem8]

⁰⁰ -O-N=C(CH₃)₂;

⁰⁰ un halogène choisi parmi F, Cl, Br ou I.

[Revendication 2] Pro-ligand selon la revendication 1 , caractérisé en ce que :

X représente -CH₂-P(O)(OZ)₂ ; CH₂-CO₂Z ; -CH(CO₂Z)₂ ; -CH(P(O)(OZ)₂)₂ ; -CHF-CO₂Z ; - CHF-P(O)(OZ)₂ ; -CF₂-CO₂Z ; -CF₂-P(O)(OZ)₂ ; -CH(CO₂Z)(P(O)(OZ)₂) ; =CH-CO₂Z ; avec Z tel que défini dans la revendication 1 ;

P1 , P2 et P3 représentent indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OZ)₂ ; avec Z tel que défini précédemment, et avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un atome d’hydrogène ; ou P2 et P3 forment ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] telle que définie à la revendication 1 ;

A représente un radical divalent choisi parmi -O- ; -S- ; -CH2- ;

L représente :

⁰⁰ -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n tel que défini à la revendication 1 ;

⁰⁰ -H ; -NH2 ; -(CH₂)ni-CH=CH₂ ou -(CH2)ni-C=CH avec tel que défini à la revendication 1 , ce qui signifie que dans chacun de ces cas L1 est absent ;

L1 représente

⁰⁰ -O-NH2 ;

⁰⁰ -O-N=C(CH₃)₂ ;

⁰⁰ un système cyclique ou hétérocyclique choisi parmi [Chem3] ; [Chem4] ; [Chem5] ;

⁰⁰ -(CH₂)ni-CH=CH₂ ; -(CH₂)m-CECH ; -(CH₂)m-N₃ ; -(CH₂)m-SH ; -(CH₂)m-NH₂ ;

-(CH₂)ni-N=C=O ; -(CH₂)ni-N=C=S ; -(CH₂)ni-NHCO-CH₂Hal ; avec m et Hal tels que définis à la revendication 1 ;

⁰⁰ un halogène choisi parmi Cl, Br ou I.

[Revendication 3] Pro-ligand selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que :

X représente -CH₂-P(O)(OZ)₂ ; -CH2-CO2Z ; -CH(CO₂Z)₂ ; -CH(P(O)(OZ)₂)₂ avec Z tel que défini à la revendication 1 ou 2, et de préférence Z égal à H ;

P1 , P2 et P3 représentent indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OZ)₂ avec Z tel que défini précédemment, et avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un atome d’hydrogène ; ou P2 et P3 forment ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] telle que définie à la revendication 1 ;

A représente un atome d’oxygène -O- ;

L1 représente -O-NH2 ; -O-N=C(CH₃)2 ; un substituant de formule [Chem3] ou [Chem4] telle que définie à la revendication 1.

[Revendication 4] Pro-ligand selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que :

X représente -CH2-P(O)(OZ)2 avec Z tel que défini à la revendication 3 ;

P1 , P2 et P3 sont tels que définis à la revendication 3 ;

A, L et L1 sont tels que définis à la revendication 3. [Revendication 5] Pro-ligand selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que :

X est tel que défini à la revendication 4,

A, L et L1 sont tels que définis à la revendication 4,

P1 , P2 et P3 représentent indépendamment les uns des autres H ou P(O)(OZ)2 avec Z tel que défini à la revendication 4, et avec la condition qu’au moins un des P1 , P2 et P3 soit différent d’un atome d’hydrogène.

[Revendication 6] Pro-ligand selon la revendication 5, caractérisé en ce que :

X représente CH2-P(O)(OZ)2 avec Z = H ;

P1 représente P(O)(OZ)2 avec Z = H et P2 et P3 = H ;

A représente un atome d’oxygène,

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à zéro ;

Li représente -O-NH2.

[Revendication 7] Pro-ligand selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que :

X représente CH2-P(O)(OZ)2 avec Z = H ;

P1 représente H et P2 et P3 forment ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] telle que définie à la revendication 1 ;

A représente un atome d’oxygène,

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à zéro ;

L1 représente -ONH2 ou -O-N=C(CH3)2.

[Revendication 8] Conjugué caractérisé en ce qu’il présente la formule générale (II) suivante dans laquelle n2 est un entier allant de 1 à 1000, de préférence de 1 à 20, et plus préférentiellement de 1 à 10,

P1 , P2, P3, X, A et L sont tels que définis à l’une quelconque des revendications 1 à 7, L’i représente le substituant L1 tel que défini à l’une quelconque des revendications 1 à 7 lorsque ledit L1 se trouve impliqué dans une liaison covalente avec Y1, Yi représente un produit d’intérêt Y, ledit produit d’intérêt Y étant choisi dans le groupe comprenant des protéines, notamment des anticorps et des enzymes lysosomales, des nanoparticules, des activateurs ou des inhibiteurs de protéines, des composés cytotoxiques et des marqueurs pour l’imagerie médicale,

Yi formant n2 liaison(s) covalente(s) avec L’i.

[Revendication 9] Conjugué selon la revendication 8, caractérisé en ce que le produit d’intérêt est un anticorps ou une enzyme lysosomale.

[Revendication 10] Conjugué selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que :

X représente CH2-P(O)(OZ)2 avec Z = H ;

P1 représente P(O)(OZ)2 avec Z = H et P2 et P3 = H ; ou alors, P1 représente H et P2 et P3 forment alors ensemble un groupement acétonide de formule [Chem2] telle que définie à la revendication 1 ;

A représente un atome d’oxygène,

L représente -(CH2)2-(O-CH2-CH2)n- avec n égal à zéro ;

L’i représente le radical -O-N=.

[Revendication 11] Conjugué tel que défini à l’une quelconque des revendications 8 à 10, pour une utilisation comme médicament.

[Revendication 12] Conjugué pour une utilisation selon la revendication 11 , caractérisée en ce que le conjugué est sous une forme adaptée pour une administration par voie orale, parentérale, intraveineuse, musculaire ou sous-cutanée.