EP4713026A1 - Formulation antidouleur à effet prolongé - Google Patents

Formulation antidouleur à effet prolongé

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EP4713026A1
EP4713026A1 EP24725220.8A EP24725220A EP4713026A1 EP 4713026 A1 EP4713026 A1 EP 4713026A1 EP 24725220 A EP24725220 A EP 24725220A EP 4713026 A1 EP4713026 A1 EP 4713026A1
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EP
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cyclodextrin
polymer
pcd
compound
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EP24725220.8A
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Ruxandra Gref
Laurent MARSOLLIER
Estelle MARION
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dAngers
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Saclay
Nantes Université
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite dAngers
Universite de Nantes
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Saclay
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Abstract

La présente invention concerne une composition comprenant un polymère de β-cyclodextrine (a); et au moins un composé (b) choisi parmi la mycolactone et ses dérivés.

Description

DESCRIPTION
TITRE : Formulation antidouleur à effet prolongé
L’objet de la présente invention concerne une composition comprenant un polymère de p-cyclodextrine et au moins un composé choisi parmi la mycolactone et ses dérivés, et ses utilisations, notamment pour le traitement de la douleur.
Partout dans le monde, plus de 100 millions de personnes souffrent de douleurs chronique liées à de nombreuses pathologies (arthrose, cancer, douleurs lombaires, sciatique, zona, douleurs neuropathiques, brûlures). En particulier, les douleurs neuropathiques, provenant de dommages directs au niveau du neurone sensoriel sont résistant à la plupart des traitements. En effet, la douleur est l’un des symptômes les plus difficile à traiter et à supporter pour le patient. Actuellement, il existe de nombreux traitements pour soulager la douleur notamment basée sur l’utilisation de dérivé à base de morphine. Ces traitements présentent de nombreuses limitations telles que : une action de courte durée, une fenêtre thérapeutique étroite, d’importants effets secondaires indésirables (nausées, constipation, troubles de l’équilibre, somnolence, accoutumance) ainsi qu’un risque accru de provoquer un phénomène de dépendance chez le patient. Il y a donc un réel besoin de trouver des alternatives permettant un traitement efficace et de longue durée de la douleur.
L’utilisation de la mycolactone et de ses dérivés à titre d’analgésique semble être une alternative prometteuse. En effet, la demande WO 2015/189342 décrit l’utilisation de ces molécules pour le traitement contre la douleur ainsi que leur mécanisme d’action comme agoniste du récepteur de type 2 de l’angiotensine 2 (AT2R), des cyclo-oxygénases de type I et des canaux potassiques de la famille TRAAK. Cela implique ainsi une hyperpolarisation des neurones empêchant la transmission de l’information nerveuse responsable de la douleur au cerveau. Ainsi, cette utilisation présente l’avantage de ne pas induire de dépendance chez le patient.
Néanmoins, l’utilisation de ce puissant analgésique est limitée en grande partie par la nature chimique des dérivés de mycolactone qui les rende difficiles à administrer. En effet, ces dérivés polycétidiques sont extrêmement sensibles à la lumière et donc se dégradent rapidement. Par ailleurs, leur nature chimique les rend totalement insolubles en milieux aqueux et requiert l’utilisation d’un solvant organique pour ses administrations. Enfin, la mycolactone et ses dérivés présentent une faible diffusion dans l’organisme une fois administrés.
L'utilisation de nanoparticules ou polymères pour faciliter l’administration d'agents pharmaceutiques particulièrement peu solubles constitue actuellement un point important de la recherche médicale. Ainsi, Gouveia et al. Nature Scientific Reports 7, 5390 (2017) décrit l’utilisation de nanoparticules de p-cyclodextrine pour encapsuler l’éthionamide (ETH) utilisé notamment pour le traitement de la tuberculose. L’incorporation du principe actif permet en outre une préservation de son activité, une meilleure libération de l’agent dans les poumons et donc un traitement plus efficace de la tuberculose. Cependant cette formulation n’a été testée que pour une administration dans les poumons.
Il existe donc un besoin de fournir de nouveaux traitements plus efficaces pour traiter la douleur.
Il existe par ailleurs un besoin de trouver une composition adéquate permettant la libération progressive et prolongée de la mycolactone et de ses dérivés, tout en les protégeant vis-à-vis des dégradations et en évitant leurs effets potentiellement toxiques.
La présente invention répond notamment à ces besoins.
En effet, comme démontré dans les exemples, les inventeurs ont découvert de manière surprenante que la combinaison d’un polymère de p-cyclodextrine avec une molécule choisie parmi la mycolactone ou ses dérivés permet de solubiliser la mycolactone ou ses dérivés en milieu aqueux et ce sans l’utilisation d’un solvant organique. De plus, elle permet de manière avantageuse de protéger la mycolactone de la dégradation sous irradiation UV.
Alors, un premier objet de la présente invention est une composition comprenant :
- (a) un polymère de p-cyclodextrine; et
- (b) au moins un composé choisi parmi la mycolactone et ses dérivés.
Un second objet de la présente invention est un procédé de préparation de ladite composition.
Un autre objet de la présente invention est une composition pharmaceutique comprenant au moins la composition selon l’invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Un autre objet de la présente invention est une composition pour son utilisation dans le traitement de la douleur. La composition selon l’invention comprend un composé (a) qui est un polymère de P-cyclodextrine.
Par « polymère de p-cyclodextrine », on entend tous les composés pouvant être obtenus par polymérisation d’un composé choisi parmi la famille des p-cyclodextrines, ou par greffage d’un composé choisi parmi la famille des p-cyclodextrines sur un (co)polymère.
Le terme « cyclodextrine » a un sens commun dans l’état de la technique et se réfère à une famille d’oligosaccharides cycliques, consistant en des composés macrocycliques comprenant plusieurs sous-unités glucopyranoses liées entre elles par une liaison 1 , 4- glycosidique.
Les cyclod extri nés sont principalement produites par dégradation enzymatique de l’amylose et de ses dérivés.
Les cyclod extri nés principalement utilisées sont divisées en trois familles : les a-, p- et y-cyclodextrines. Ces familles se distinguent par le nombre d’unités qui compose la structure cyclique des cyclod extri nés. L’« a-cyclodextrine» est composée de 6 groupements glucopyranoses dans leur structure cyclique, la « p-cyclodextrine » est composée de 7 groupements glucopyranoses dans leur structure cyclique et la « y- cyclodextrine » est composée de 8 groupements glucopyranoses dans leur structure cyclique.
La structure chimique de la p-cyclodextrine est telle que représentée dans la formule (A).
[Chem 1] Les molécules de p-cyclodextrine possèdent une structure en cône tronqué, délimitant une cavité en leur centre. Cette cavité présente un environnement carboné apolaire et hydrophobe (squelette carboné et oxygène en liaison éther), capable d'accueillir des molécules peu hydrosolubles, tandis que l'extérieur du cône tronqué présente de nombreux groupements hydroxyle, conduisant à une bonne solubilité de la p- cyclodextrine en milieu aqueux. Ce caractère amphiphile permet en outre à la p- cyclodextrine d’inclure dans sa cavité des molécules hydrophobes (ou des parties de celles- ci) pour former des complexes d’inclusion en milieu aqueux.
La formation de ces complexes d’inclusion permet de manière avantageuse d'encapsuler diverses molécules, notamment la mycolactone et éventuellement d’autres molécules d'intérêt thérapeutique dans les molécules de p-cyclodextrine Avantageusement, un polymère de cyclodextrine comporte plus d’une vingtaine de cages de p-cyclodextrine qui ne sont pas toutes occupées par la mycolactone. Il devient ainsi possible de co-incorporer une variété de molécules actives d’intérêt dans la famille des antibiotiques, analgésiques, anticancéreux ...
Par « complexe d’inclusion », on entend un système composé d’une molécule hôte (ici la p-cyclodextrine) capable d’accueillir une espèce chimique (ici la mycolatone et ses dérivés).
Le terme « encapsuler » indique que l’espèce chimique est incluse au sein de la molécule hôte.
Selon un mode de réalisation, le polymère (a) de p-cyclodextrine est préparé par réaction de polymérisation entre la p-cyclodextrine modifiée ou non, et au moins un autre composé chimique choisi parmi le groupe constitué de l’épichlorhydrine, l’acide tartrique, l’acide citrique, le poly(éthylène glycol) acylé, le chlorure d’adipoyle, le chlorure de succinyle, le glutaraldehyde, le diphenyl carbonate, le 1 ,4-butanediol diglycidyl éther, le toluène diisocyanate, le naphtalène diisocyanate, l’anhydride succinique, l’anhydride 1 ,2, 4, 5 benzène tetracarboxylique, le monochlorotriazine, les dérivés de trimethoxysilane, le diéthynyl benzène, le tetrafluoro terephtalonitrile. Un autre type de polymère de cyclodextrine est obtenu à partir de particules poreuses organiques-inorganiques (metalorganic frameworks, MOFs) à base de cyclodextrine qui peuvent ensuite être réticulées en utilisant les agents cités plus haut dans ce paragraphe.
Alternativement, des copolymères hydrosolubles peuvent être greffés avec des cyclodextrines. Ces copolymères sont parmi le groupe constitué de : alginates, poly(éthylène imine), poly(N-hydroxy éthyl acrylamide), chitosane, acide hyaluronique, phenylalanine, polyanhydrides, polyaspartamide, cellulose.
Selon un autre mode réalisation, le polymère (a) est le produit de la réaction entre la P-cyclodextrine modifiée ou non et l’épichlorhydrine.
Selon un autre mode réalisation, le polymère (a) est le produit de la réaction entre la P-cyclodextrine modifiée et l’épichlorhydrine.
Par « p-cyclodextrine modifiée », on entend toute p-cyclodextrine ayant été modifiées par au moins une réaction chimique sans pour autant modifier les propriétés intrinsèques de la p-cyclodextrine.
Par réaction chimique on entend notamment des réactions d’addition, de substitution, ou même des réactions de greffage de polymère.
De manière générale, les p-cyclodextrines modifiées utilisées selon l'invention sont notamment des p-cyclodextrines dont les groupes hydroxy, de préférence les hydroxy secondaires de chaque unité glucose la formant ont été modifiées par ajout d’un ou plusieurs substituants identiques ou différents.
Une « p-cyclodextrine modifiée » utilisée dans la composition selon l’invention est une p-cyclodextrine qui porte un ou plusieurs substituants identiques ou différents, choisis parmi les radicaux alkyles fonctionnalisés ou non, les radicaux hydroxyalkyles, les radicaux carboxyles, carboxylates, nitro, amino, sulfonates, sulfates, phosphates, éthers, polyéthers, ammonium et les radicaux comprenant une fonction ester. Comme radical alkyle, on peut citer un radical alkyle linéaire ou ramifié ayant de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone, plus particulièrement un radical méthyle ou éthyle. Comme radical hydroxyalkyle, on peut citer un groupe hydroxyalkyle ayant de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence 1 à 5 de carbone, plus particulièrement un radical -CH2CH2OH ou -CH2OH. Comme radical contenant une fonction ester, on peut citer un groupement ester ayant de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence 1 à 5 de atomes de carbone, plus particulièrement les groupements -O(CO)CH3, -O(CO)CH2CH3.
A titre d'exemple, on peut citer les cyclod extri nés méthylées, éthylées, propylées, succinylées, carboxylées, acétylées, 2-hydroxypropylées, polyoxyéthylées.
De préférence, le polymère (a) est un polymère réticulé, c’est-à-dire que le polymère se présente en un réseau tridimensionnel et non linéaire, formé par la création de liaisons entre les chaînes macromoléculaires d’un polymère lors de la réaction de polymérisation. Ce polymère peut ensuite être modifié afin de rajouter des nouvelles fonctionnalités comme des charges négatives ou positives, ou encore en greffant des molécules fluorescentes.
De préférence, le polymère (a) est le produit de la réaction entre la p-cyclodextrine et l’épichlorhydrine.
Selon ce mode de réalisation, ce polymère est connu et décrit par Grefet al. Journal of controlled release: official journal of the controlled release Society 2006, 111 (3), 316- 324 sous le nom de pCD.
Les polymères (a) peuvent être préparés par adaptation ou application de la méthode décrite par Gref et al. Journal of controlled release: official journal of the controlled release Society 2006, 111 (3), 316-324, et Othman et al., J Colloid Interface Sci 2011, 354 (2), 517- 27.
Plus précisément, un polymère (a) peut être préparé par réaction de polymérisation entre la p-cyclodextrine et l’épichlorhydrine en milieu alcalin en présence de NaOH. Par exemple, la p-cyclodextrine est dissoute sous forte agitation dans une solution comprenant 33% en masse de NaOH, puis l’épichlorhydrine est ensuite ajoutée sous agitation et la réaction est arrêtée par rajout d’acétone avant le point de gélation.
Selon ce mode réalisation, la structure chimique du polymère (a) est telle que représentée par la formule générale (B) :
[Chem 2]
Dans laquelle les cônes tronqués représentent les molécules de p-cyclodextrine et n représente un motif répétitif correspondant aux molécules d’épichlorhydrine ayant réagi et séparant deux molécules de p-cyclodextrine.
La composition selon l’invention comprend un composé (b) choisi parmi la mycolactone et ses dérivés. La mycolactone et ses dérivés sont des dérivés polycétidiques à 12 chaînons originellement produits par différentes souches bactériennes de la famille des Mycobacterium, ulcerans (Mu), et qui sont impliqués dans les ulcères de Buruli (BU).
Les composés (b) sont accessibles.
Ils peuvent par exemple être obtenus par extraction et purification à partir d’extrait de Mycobacterium ulcerans). Cette méthode est décrite dans George et al ; SCIENCE Volume 283, Issue 5403, 5 February 1999.
Il est possible d'utiliser différentes souches de Mycobacterium ulcerans qui produisent différents isomères. La production des isomères dépendant de la zone d'où provient la souche bactérienne.
La mycolactone utilisée dans ces exemples provient de la souche 1615 qui correspond à la référence bibliographique citée George et al ; SCIENCE Volume 283, Issue 5403, 5 February 1999. Il est également possible d’extraire la mycolactone à partir de souches provenant directement de patients.
Alternativement, les composés peuvent être synthétisés. Une méthode synthétique de préparation de la mycolactone et de ses dérivés a été développée et décrite dans la demande EP 2 594 561.
Selon un mode de réalisation, le composé (b) est un composé de formule (I) :
- Ri, R2, R4 et R5 sont identiques ou différents et sont indépendamment choisis parmi le groupe consistant en H, Re, C(O)R7, C(S)R7, C(O)NHR7 et C(S)NHR7,
- R3 est choisi dans le groupe consistant en H, OH, ORe, OC(O)R7, OC(S)R7, OC(O)NHR7, OC(S)NHR7 OU OCH(OH)R7, - Re est un groupement choisi parmi le groupe consistant en Ci-Ce alkyl, C6-C12 aryl, C6-C12 heteroaryl et les dérivés de sucre, et
- R? est choisi parmi les groupements H, Ci-Ce alkyl, C6-C12 heteroaryl, et C6-C12 aryl, où
- Ri et R2, 2 et R3, et/ou R4 et R5 forment ensemble un groupement acétal, ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables.
Par groupement « Ci-Ce alkyl », on entend un groupement aliphatique hydrocarboné, linéaire ou ramifié comprenant, sauf mention contraire, de 1 à 6 atomes de carbone au total, et pouvant comprendre une ou plusieurs insaturations. A titre d’exemples, on peut citer les groupes méthyl, éthyl, n-propyl, butyl, isobutyl, tertiobutyl, pentyl ou encore hexyl.
Par groupement « C6-C12 aryl », on entend des composés aromatiques hydrocarbonés monocycliques, bicycliques ou tricycliques, comprenant, sauf mention contraire, de 6 à 12 atomes de carbone au total. A titre d’exemples, on peut notamment citer les groupes phényl et naphtyl.,
Par groupement «C6-C12 hétéroaryle », on entend un des composés aromatiques monocycliques, bicycliques ou tricycliques comprenant de 6 à 12 atomes de carbone au total, dont au moins un atome est un hétéroatome choisi parmi le groupe constitué de l’azote, le phosphore, l’oxygène et le souffre. A titre d’exemple, on peut notamment citer les groupements pyrrole, furane, thiophene, imidazole, furazane, oxazole, oxadiazole, oxatriazole, isoxazole, thiazole, isothiazole, pyrazole, triazole ou tetrazole. Par « dérivé de sucre », on entend des composés comprenant au moins un motif sucre choisi parmi les mono- et les polysaccharides. A titre d’exemple, le motif monosaccharide peut être le glucose, le galactose, le fructose ou encore le pentose.
Selon un autre mode de réalisation, le composé b) est un composé de formule (II) : ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables.
Ce composé est un composé de formule (I) dans lequel Ri, R2, R4, Rs sont des groupements -H et R3 est un groupement -OH ; il correspond à la mycolactone
Selon un mode de réalisation, la composition selon l’invention comprend un composé (b) qui est encapsulé dans le polymère (a) de p-cyclodextrine. Par encapsulé dans le polymère (a) nous comprenons l’incorporation de la mycolactone par solubilisation en milieu aqueux. Pratiquement, cela est réalisé en rajoutant une solution aqueuse de polymère (a) de p-cyclodextrine dans un récipient contenant de la mycolactone pure. Par contact avec (a) celle-ci est solubilisée, avec ou sans agitation mécanique. Alternativement, pour accélérer le processus, une sonication ou un ultraturrax peuvent être employés.
En effet, sans vouloir être lié à une quelconque théorie, les molécules de mycolactone et/ ou ses dérivés forment des complexes d’inclusion avec les molécules de p-cyclodextrine composant le polymère (a). La formation de ces complexes d’inclusion permet en outre d’encapsuler les composés (b) au sein des molécules de p-cyclodextrine composant le polymère.
Avantageusement, la formation de ces complexes d’inclusion permet de solubiliser de manière spontanée les composés (b) sans l’utilisation de solvant organique.
Avantageusement, l’encapsulation des composés (b) dans le polymère de p- cyclodextrine (a) permet également de stabiliser de manière significative les composés (b) vis-à-vis de la dégradation, notamment sous irradiation UV.
Avantageusement, l’affinité très forte de la mycolactone et de ses dérivés pour la p- cyclodextrine, permet une libération prolongée du composé (b) dans l’organisme après administration de la composition.
En d’autres termes, la composition selon l’invention est une composition comprenant un polymère de p-cyclodextrine dans lequel est encapsulé le composé (b).
De préférence, la composition selon l’invention se présente sous forme de poudre ou peut être en solution aqueuse, encore plus préférentiellement la composition est en solution aqueuse.
Notamment, la poudre peut être obtenue par lyophilisation de ladite composition selon l’invention en solution aqueuse. Avantageusement, l’encapsulation des composés (b) par le polymère de p- cyclodextrine permet d’obtenir de manière surprenante une composition aqueuse ayant une concentration élevée en composé (b).
Selon un mode de réalisation, la composition est une solution aqueuse dans laquelle la concentration du composé (b) est comprise entre 0.001 mg/mL et 10 mg/mL, préférablement de 0.05 à 5 mg/mL.
De préférence, la composition selon l’invention est une solution aqueuse dans laquelle la concentration du composé (a) est comprise entre 25 mg/mL et 250 mg/mL, préférentiellement de 50 mg/mL à 150 mg/mL.
De préférence, la composition selon l’invention comprend un rapport de la quantité de composé (b) en pourcentage en poids sur la quantité de polymère (a) en pourcentage en poids pouvant être de 0.1 à 10, préférentiellement de 0.5 à 7, et encore plus préférentiellement de 1 à 5, les pourcentages étant exprimés par rapport au poids total de la composition.
Selon un autre mode de réalisation, le polymère (a) de p-cyclodextrine peut encapsuler typiquement au moins un autre principe actif ayant par exemple une action complémentaire, potentialisée ou synergique avec le composé (b). Généralement, les principes actifs sont encapsulés au sein des cavités des molécules de p-cyclodextrine libres formant le polymère (a), c’est-à-dire n’étant pas déjà des complexes d’inclusion avec un composé (b).
Selon un mode de réalisation, la composition selon l’invention peut comprendre en outre un ou plusieurs principes actifs (c) choisi parmi les agents anti-cancéreux, les agents analgésiques, anesthésiques, les molécules actives à effet cicatrisant, les agents antibactériens, les antibiotiques, les antiseptiques, hémostatiques, antifongiques, antiviraux, antithrombotiques, antiinflammatoires, antiprurigineux, produits de contraste, hormones.
Typiquement, le principe actif est un antiseptique, tel que la chlorhexidine ou le chlorure de benzalkonium, l’éthanol, l'hexamidine, la bétadine, les dérivés chlorés, le triclocarban.
Selon un autre mode de réalisation, le principe actif (c) est un agent analgésique, tel que la lidocaine, la codéine, le tramadol.
Selon un autre mode de réalisation, le principe actif (c) est un agent antibiotique tel que la vancomycine (VCM), l’amikacine, la gentamicine ou l’amoxicilline. Selon un autre mode de réalisation, le principe actif (c) est un agent anticancéreux tel que la doxorubicine, le cyclophosphamide, le cisplatine, le docétaxel, la gemcitabine, ou l’oxaliplatine.
Le composé (b) ainsi que lesdits principes actifs peuvent être présents sous forme d’hydrate et/ou de sel pharmaceutiquement acceptable. En effet, ces composés peuvent être présents sous forme de sels correspondants d’acide organique ou minéral ou de base organique ou minérale pharmaceutiquement acceptables.
L’expression « sels pharmaceutiquement acceptables » fait référence aux sels d’addition acide relativement non toxiques, inorganiques et organiques, et les sels d’addition de base, des composés de la présente invention. Ces sels peuvent être préparés in situ pendant l’isolement final et la purification des composés. En particulier, les sels d’addition acide peuvent être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme épurée avec un acide organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Parmi les exemples de sels d’addition acide on trouve les sels bromhydrate, chlorhydrate, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acétate, oxalate, valerate, oléate, palmitate, stéarate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maléate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mésylate, glucoheptanate, lactobionate, sulfamates, malonates, salicylates, propionates, méthylènebis-b-hydroxynaphtoates, acide gentisique, iséthionates, di-p-toluoyltartrates, methanesulfonates, éthanesulfonates, benzenesulfonates, p-toluenesulfonates, cyclohexyl sulfamates et quinateslaurylsulfonate, et analogues. (Voir par exemple S.M. Berge et al. « Pharmaceutical Salts » J. Pharm. Sci, 66 : p.1-19 (1977)). Les sels d’addition acide peuvent également être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme acide avec une base organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Les sels d’addition acide comprennent les sels aminés et métalliques. Les sels métalliques adaptés comprennent les sels de sodium, potassium, calcium, baryum, zinc, magnésium et aluminium. Les sels de sodium et de potassium sont préférés. Les sels d’addition inorganiques de base adaptés sont préparés à partir de bases métalliques qui comprennent hydrure de sodium, hydroxyde de sodium, hydroxyde de potassium, hydroxyde de calcium, hydroxyde d’aluminium, hydroxyde de lithium, hydroxyde de magnésium, hydroxyde de zinc. Les sels d’addition aminés de base adaptés sont préparés à partir d’amines qui ont une alcalinité suffisante pour former un sel stable, et de préférence comprennent les amines qui sont souvent utilisées en chimie médicinale en raison de leur faible toxicité et de leur acceptabilité pour l’usage médical : ammoniac, éthylènediamine, N-méthyl-glucamine, lysine, arginine, ornithine, choline, N,N’- dibenzylethylenediamine, chloroprocaïne, diéthanolamine, procaine, N-benzyl- phénéthylamine, diéthylamine, pipérazine, tris(hydroxymethyl)-aminomethane, hydroxyde de tétraméthylammonium, triéthylamine, dibenzylamine, éphénamine, dehydroabietylamine, N-ethylpiperidine, benzylamine, tétra-méthylammonium, tétraéthylammonium, méthylamine, diméthylamine, triméthyl-amine, éthylamine, acides aminés de base, par exemple lysine et arginine, et dicyclohexylamine, et analogues.
Selon un autre mode de réalisation, le polymère (a) de p-cyclodextrine peut avantageusement être associé avec d’autres composés tels que des composés lipidiques (cholésterol, huiles injectables comme le Migliol), des glycoprotéines (tels les laminines), des nanoparticules (NPs) conférant ainsi de manière avantageuses des propriétés complémentaires à la composition selon l’invention tels que des propriétés antibactérienne ou antifongiques, des propriétés de ciblage ou encore l’inclusion d’autres principes actifs dans la composition.
Cette encapsulation est généralement envisageable si la taille desdites nanoparticules permet leur inclusion au sein des cavités des molécules de p-cyclodextrine libre.
De préférence, la taille des nanoparticules (d) est comprise entre 50 nm et 400 nm, encore plus préférentiellement entre 50 nm et 250 nm. Les composés lipidiques peuvent former des microgouttelettes d’une taille allant de 50 nm à 2-5 microns au sein de la formulation.
Selon un autre objet, la présente invention concerne également, une composition pharmaceutique comprenant la composition selon l’invention et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La composition pharmaceutique de l’invention peut se présenter sous différentes formes destinées à l’administration par voie topique, parentérale ou intrathéchale. De préférence, ladite composition est administrée à un patient qui en a besoin.
Par administration par voie topique, on entend l’administration d’un produit sur une surface du corps telle que la peau ou les muqueuses. Par administration par voie parentérale, on entend une administration d’un produit au moyen d’une injection. L’administration par voie parentérale comprend les injections par voie intramusculaire (IM), par voie intraveineuse (IV), par voie sous-cutanée (SC), par voie intradermique, par voie intra-artérielle ou encore par voie intra-articulaire.
Par administration par voie intrathéchale, on entend une injection dans l’espace sous- arachoïdien permettant d’atteindre le liquide céphalo-rachidien qui diffusera à son tour le produit injecté.
Les formes pharmaceutiques injectables notamment pour un usage parentéral ou intrathéchal sont généralement des solutions injectables pouvant être obtenues, par exemple, par le procédé suivant : la composition selon l’invention est dissoute, mise en suspension ou émulsionnée soit dans un milieu aqueux (par exemple eau distillée, sérum physiologique ou solution de Ringer), avec un dispersant (par exemple Tween® 80, HCO® 60 (Nikko Chemicals), polyéthylène glycol, carboxyméthylcellulose ou alginate de sodium), un agent conservateur (par exemple p-hydroxybenzoate de méthyle, p-hydroxybenzoate de propyle, alcool benzylique, chlorobutanol ou phénol), un agent isotonique (par exemple chlorure de sodium, glycérol, sorbitol ou glucose) et éventuellement d'autres additifs, tels que, si désiré, un agent solubilisant (par exemple salicylate de sodium ou acétate de sodium) ou un stabilisant (par exemple albumine de sérum humain).
Les formes pharmaceutiques à usage topique peuvent être obtenues à partir d'une composition solide, semi-solide ou liquide contenant la composition de l’invention. Par exemple, pour obtenir une forme solide, la composition selon l’invention peut être mélangé avec des excipients (par exemple lactose, tréhalose, sucrose, mannitol, amidon, cellulose microcristalline ou saccharose) et un épaississant (par exemple gommes naturelles, dérivés de cellulose ou polymères acryliques) afin de les transformer en poudre. Les compositions pharmaceutiques liquides sont préparées sensiblement de la même manière que les formes injectables, comme indiqué précédemment. Les formes pharmaceutiques semi-solides se présentent de préférence sous forme de gels aqueux ou huileux ou sous forme de pommades. Ces compositions peuvent éventuellement contenir un régulateur de pH (par exemple l'acide carbonique, l'acide phosphorique, l'acide citrique, l'acide chlorhydrique ou l'hydroxyde de sodium) un composé antioxydant (vitamine C, tocophérol, polyphénols) et/ou un agent conservateur (par exemple un ester de l'acide p-hydroxybenzoïque, le chlorobutanol ou le chlorure de benzalkonium). Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique selon l’invention comprend un excipient pharmaceutiquement acceptable choisi parmi le dextran et ses dérivés, préférentiellement du dextran hydrophobisé.
De manière avantageuse, l’utilisation du dextran hydrophobisé dans la composition pharmaceutique selon l’invention permet la formation de gels ou de nanoparticules. Dans ce cas il est envisageable l’incorporation de nanoparticules comme décrit dans l’exemple 13 ou des gouttelettes d’huile.
De préférence, la taille des nanoparticules (d) est comprise entre 50 nm et 400 nm, encore plus préférentiellement entre 50 nm et 250 nm. Les composés lipidiques peuvent former des microgouttelettes d’une taille allant de 50 nm à 2-5 microns au sein de la formulation.
Selon un mode de réalisation, la composition selon l’invention peut comprendre en outre des nanoparticules (d) choisies parmi les nanoparticules inorganiques, les nanoparticules hybrides organiques-inorganiques, ou les nanoparticules polymériques.
Par « nanoparticule » (NP), on entend généralement une particule de forme sphérique, de diamètre moyen (en nombre) compris entre 1 nm et 1 pm. Dans le cadre de l’invention, lesdites NPs ont typiquement un diamètre moyen inférieur à 400 nm, notamment inférieur à 250 nm, avec un indice de polydispersité inférieur à 0.25.
Le diamètre moyen (en nombre) et la polydispersité peuvent être mesurés par diffusion dynamique de la lumière (DLS: dynamic light scattering) ou par microscopie électronique à transmission (TEM).
A titre d’exemple pour les nanoparticules inorganiques, on peut notamment citer les nanoparticules magnétiques, les nanoparticules d’argent à effet anti-bactérien, les nanoparticules d’or ou encore les nanoparticules de cuivre.
Les nanoparticules hybrides organiques-inorganiques sont par exemple des particules de trimésate de fer MIL-100(Fe), ou autres carboxylates de fer, ou encore des UIO-66.
A titre d’exemple de nanoparticules polymériques, on peut notamment citer les particules de PLGA (poly(acide lactique-co-glycolique), de copolymère poly(éthylène glycol) (PEG)-PLGA (PEG-PLGA) ou encore de polycaprolactone (PCL).
Avantageusement, les nanoparticules (d) peuvent elles-mêmes inclure un principe actif. Selon un autre objet, la présente invention concerne également un procédé de préparation de la composition selon l’invention, comprenant une étape de mélange des composés (a) et (b) en solution aqueuse.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention peut éventuellement comprendre une étape d’ajout dans la solution aqueuse d’un principe actif (c) et/ou de nanoparticules (d).
De préférence, le procédé selon l’invention peut aussi comprendre une étape de lyophilisation permettant l’obtention de ladite composition sous forme de poudre.
Un autre objet de la présente invention concerne l’utilisation de la composition selon l’invention pour le traitement de la douleur.
Le terme « douleur » fait également référence aux « troubles douloureux » et désigne une souffrance plus ou moins vive, produite par une blessure, une brûlure, une lésion ou toute autre cause, qui manifeste une rupture du bien-être, de l'équilibre de la santé, la perte ou la diminution de l'intégrité physique.
La douleur est généralement classée comme aiguë ou chronique. Par douleur « aiguë », on entend une expérience soudaine et de courte durée associée à une cause spécifique telle qu’une blessure spécifique résultant par exemple d’une intervention chirurgicale, de soins dentaires ou une entorse.
Par « douleur chronique », on entend une douleur à long terme entraînant des problèmes psychologiques et émotionnels importants, ces douleurs sont notamment liées à de nombreuses pathologies telles que par exemple l’arthrose, les cancers ou encore le diabète.
La composition selon l’invention convient au traitement d'un large éventail de troubles douloureux, y compris lorsque ceux-ci apparaissent en tant que symptômes de pathologies, en particulier la douleur aiguë, la douleur chronique, la douleur neuropathique, la douleur inflammatoire, la douleur iatrogène, y compris la douleur cancéreuse, la douleur infectieuse, y compris la douleur herpétique, la douleur viscérale, la douleur centrale, les douleurs dysfonctionnelles , y compris la fibromyalgie, la douleur nociceptive, y compris la douleur post-chirurgicale, et les types de douleur mixte impliquant les viscères, le tractus gastrointestinal, les structures crâniennes, le système musculo-squelettique, la colonne vertébrale, le système urogénital, le système cardiovasculaire et le SNC, y compris la douleur cancéreuse, la douleur dorsale et orofaciale. De manière générale, les troubles douloureux sont considérés comme des symptômes d'une pathologie qu’il est nécessaire de traiter indépendamment de ladite pathologie pour le bien être du patient.
Par « symptôme », on entend une manifestation anormale provoquée par une pathologie dont le patient se plaint.
Le terme « traitement de la douleur » utilisé ici désigne le soulagement, l'inhibition de la progression ou l’élimination des troubles douloureux tels que décrits ici, sans nécessairement traiter la pathologie qui pourrait en être éventuellement responsable. Ainsi, le traitement de la douleur peut être typiquement symptomatique et peut éventuellement être étiologique.
De manière générale, la douleur ou les « troubles douloureux » chez le patient sont généralement traités par l’administration d’analgésique à courte durée d’action ou d’antalgique.
Par « analgésique », on entend des médicaments utilisés pour supprimer la sensibilité à la douleur comme par exemple les dérivés opioïdes.
Par « antalgique », on entend des médicaments utilisés pour diminuer la douleur.
De préférence, la composition selon l’invention est utilisée comme analgésique afin de traiter la douleur ou les troubles douloureux.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l’invention est utilisée comme antalgique afin de traiter la douleur et les troubles douloureux.
De manière avantageuse, la composition selon l’invention peut être utilisée de manière complémentaire afin de traiter les troubles douloureux provoqués par une pathologie.
Figures
[Fig 1] Figure 1. A : Amélioration de l’encapsulation de la mycolactone (ML) avec l’augmentation de la quantité de pCD. B : extractions successives de la ML à partir du ML- pCD.
[Fig 2] Figure 2. Rôle protecteur de la pCD contre la dégradation de la mycolactone exposée aux UV.
[Fig 3] Figure 3. A) Aucun effet cytotoxique supplémentaire causé par la pCD. B-D) La pCD ne modifie pas les effets immunomodulateurs (production de IL-6, TNF-a et I L-1 p) de la mycolactone. Noir = ML libre ; gris= ML incorporée (pCD-ML)
[Fig 4] Figure 4. Effet analgésique de la mycolactone encapsulée en pCD chez la souris (# : différence entre ML et pCD-ML).
[Fig 5] Figure 5. Les cyclod extri nés biodégradables réduisent l’effet analgésique de la mycolactone par rapport à la pCD.
[Fig 6] Figure 6. Effet analgésique de la mycolactone encapsulée en pCD dans un modèle incisionnel plantaire chez la souris (modèle de douleur chirurgicale) (# : différence entre ML et pCD-ML).
[Fig 7] Figure 7. Effet analgésique de la mycolactone encapsulée en pCD dans un modèle incisionnel plantaire chez la souris (modèle de douleur chirurgicale) (# : différence entre ML et pCD-ML).
Exemples
Exemple 1 - Synthèse et caractérisation d’un polymère de cyclodextrine (pCD)
Dans un ballon de 500mL, on introduit 50g de -CD dans 80mL de NaOH 33% puis on laisse sous agitation toute la nuit. Le lendemain, on chauffe le ballon à 30°C puis on rajoute 35mL d’épichlorohydrine (EP) sous agitation (Schéma 1). On maintient le mélange réactionnel sous agitation à 30°C pendant 1 h-1 h30 afin de bien l’homogénéiser. On arrête la réaction lorsque la viscosité augmente, juste avant le point de prise en masse, par rajout d’un volume de 80 mL d’acétone.
Schéma 1. Schéma réactionnel de synthèse du pCD à partir de la p-CD réticulée à l’épichlorhydrine.
On monte la température du bain à 50°C et on laisse sous agitation toute la nuit. Le lendemain on neutralise avec une solution de HCl à 6 M afin d’obtenir un pH de 7. Le résidu non soluble est éliminé puis le reste du polymère est purifié par dialyse à l’aide d’une membrane Spectra/por (seuil de coupure 100.000 g /mole) puis lyophilisé. Le polymère pCD ainsi obtenu est caractérisé par RMN et SEC afin de déterminer sa teneur en p-CD qui se situe aux alentours de 70 % (pds).
Par la même méthodologie, sont synthétisés un polymère de a-CD et un polymère de y - CD.
Les échantillons de pCD peuvent être fractionnés par dialyses successives (en utilisant par exemple des membranes SpectraPor de seuils de coupure 20, 50, 100, 300 et 1000 KDa) afin d’obtenir des échantillons avec des faibles polydispersités.
Exemple 2 - Synthèse et caractérisation d’un polymère de cyclodextrine à base d’acide malique
Dans un ballon de 25 mL, sont mélangés 0.2 mmol NaH2PO4 2H2O (catalyseur), 0.09 mmol p-CD, et 0.45 mmol acide malique dans 2 mL eau. Le mélange est ensuite concentré par évaporation à 140 °C pendant 10 min puis chauffé à 140°C pendant 25 min sous pression réduite (pompe à vide). Le polymère ainsi formé est repris avec 10 mL d’eau MilliQ et dispersé par ultrasons. La fraction insoluble est retirée par filtration. La fraction soluble est ensuite purifiée par dialyse (membrane Spectra/por, seuil de coupure 20000 g /mole) puis lyophilisé. Le polymère est ensuite caractérisé par 1H RMN et SEC afin de déterminer sa teneur en p-CD qui se situe aux alentours de 70 % (pds).
Ce polymère est nommé pCD.
Un polymère biodégradable de p-CD est synthétisé de manière similaire, en remplaçant l’acide malique par de l’acide citrique.
Exemple 3 - Synthèse de dextrane modifié avec des chaînons alkyles
Pour synthétiser le dextrane greffé avec des chainons lauryle hydrophobes (DM), 4 g de dextrane (40000 g/mol) ont été solubilisés dans 100 mL de diméthylformamide contenant 1 g de chlorure de lithium. Ensuite, 0,62 mL de chlorure de lauryle et 0,031 mL de pyridine ont été ajoutés à la solution de dextrane. La réaction a été effectuée à 80°C pendant 3 heures. Le MD obtenu a été isolé par précipitation dans l'alcool isopropylique. Il a ensuite été solubilisé dans de l'eau distillée, purifié par dialyse pendant 48 h et ensuite lyophilisé. Le taux de greffage des chainons alkyle déterminé par 1H RMN se situe aux environs de 6%.
Exemple 4 - Production de la mycolactone
La mycolactone est purifiée à partir de culture de M. ulcerans souche 1615 selon le protocole décrit par Georges 1999 (1). Brièvement, les lipides mycobactériens totaux sont extraits selon la méthode de Folch. Puis, après précipitation des phospholipides dans de l’acétone froid, le surnageant contenant la mycolactone est déposé sur une plaque de silice pour réaliser une chromatographie couche fine. Après migration, la silice sur laquelle s’est adsorbée la mycolactone (rf de 0.23) est grattée puis la mycolactone y est désorbée de la silice par filtration (en chloroforme/méthanol). Enfin, la mycolactone est quantifiée par chromatographie liquide haute performance (2). 1 . George KM, Chatterjee D, Gunawardana G, Welty D, Hayman J, Lee R, Small PL. 1999. Mycolactone: a polyketide toxin from Mycobacterium ulcerans required for virulence. Science 283:854-857.
2. Marion E, Prado S, Cano C, Babonneau J, Ghamrawi S, Marsollier L. 2012. Photodegradation of the Mycobacterium ulcerans toxin, mycolactones: considerations for handling and storage. PLoS One 7:e33600.
Exemple 5 - Incorporation de la mycolactone dans la pCD
Dans un flacon ambré en verre de 1 ,5 mL, sont introduits 0,5 mg de ML (mycolactone) solubilisée dans l’éthanol. L’éthanol est évaporé à l’aide d’un concentrateur à vide (SpeedVac). Est ajouté alors 1 mL de solution de pCD à une concentration de 100 mg/mL. La préparation est agitée pendant 48h puis conservée à 4°C. Ce temps permet une incorporation complète de la ML dans le pCD. Cette solution est nommée pCD-ML.
L’expérience est reproduite en remplaçant la pCD par un polymère de p -CD et par un polymère de p -CD. La ML ne se solubilise pas, même en prolongeant le temps d’incubation jusqu’à 72h.
Exemple 6- Amélioration de l’encapsulation de la mycolactone avec l’augmentation de la quantité de pCD
A partir d’une solution de pCD à 100 mg/mL, des dilutions en cascades sont réalisées dans de l’eau MilliQ afin d’obtenir les concentrations suivantes en pCD : 1 , 10, 50 et 100 mg/mL. Dans un flacon ambré en verre de 1 ,5 mL, sont introduits 0,5 mg de ML solubilisée dans l’éthanol. L’éthanol est évaporé à l’aide d’un concentrateur à vide (SpeedVac). Est ajouté alors 1 mL de solution de pCD aux concentrations 1 , 10, 50 et 100 mg/mL. La préparation est agitée pendant 48h.
Des aliquotes sont récupérés et dosés par HPLC comme dans l’exemple 5, afin de déterminer la quantité de ML incorporée. On constate qu’il faut au moins 100 mg/mL de pCD pour incorporer 0.5 mg de ML (Figure 1 A).
Après incubation sous agitation, 30 pL de chacune des préparations de pCD-ML sont prélevés puis dilués au 1/10ème dans l’acétonitrile. Après centrifugation (3000 g, 5 min), les surnageants sont dosées par l’HPLC. Tous les culots sont repris en eau MilliQ puis dilués au 1/1 Oème en acétonitrile avant d’être centrifugés et dosés de nouveau par l’HPLC. Ces étapes sont répétées 3 fois afin d’extraire tout le contenu de ML encapsulée aux différentes concentrations de pCD testées.
Le reste de la préparation est repris en éthanol puis dosé à l’HPLC après avoir été dilué au 1/10ème en acétonitrile et centrifugé (3000g, 5min).
En conclusion, plus la teneur en ML dans le pCD est importante, plus il devient difficile d’extraire la ML du pCD. Ainsi, 4 extractions successives sont nécessaires pour extraire la totalité de ML du pCD (100 mg/mL de pCD et 0.5 mg de ML incorporée). Cela démontre la forte affinité de la ML pour le pCD. Il est fort probable qu’à des fortes concentrations, la ML très hydrophobe puisse s’auto-associer au sein du pCD (Figure 1 B).
Exemple 7 - stabilité de pCD-ML lors de la conservation
De manière surprenante, la ML incorporée dans le pCD ne s’adsorbe plus sur les récipients en verre ou en plastique, ce qui rend sa manipulation possible. Cela a été démontré en mesurant la concentration de la ML par HPLC, dans le cas d’une solution de pCD-ML préparée comme dans l’exemple 5. Après 3 mois, il y avait moins de 4 % de variation de concentration.
Exemple 8 - Rôle protecteur de la pCD contre la dégradation de la mycolactone exposée aux UV
50 pL de solution pCD-ML préparée selon l’exemple 5 (correspondant à 0,5 mg/mL de ML) sont disposés dans des tubes en verre transparents. Puis les tubes sont exposés à une irradiation UV (température ambiante, longueur d’onde 312 nm) : 15 min, 1 h, 2h, 6h, 24h. Un tube est quant à lui maintenu dans l’obscurité et sert de témoin. Tous les tubes sont fermés hermétiquement pour éviter les problèmes d’évaporation.
Après ces différents temps d’exposition aux UVs, la ML est dosée par HPLC. Une série d’extractions de la ML est réalisée comme décrit de dans l’exemple 6. Pour cela, 450 pL d’acétonitrile sont ajoutés dans chaque tube contenant 50 pL de pCD-ML. Après 6 heures d’exposition, 80% de la ML contenue en éthanol a été dégradée alors que sur la même période seulement 50% de la ML associée à la pCD a été dégradée (Figure 2). Exemple 9- Evaluation in vitro des effets cytotoxiques et immunomodulateurs de la pCD sur des macrophages murins
Deux préparations sont effectuées : une solution éthanolique de ML et une solution aqueuse de pCD-ML à 0,5 mg/mL. Des dilutions en cascade sont effectuées afin d’obtenir des solutions avec des concentrations de 100 - 10 - 1 pg/mL puis 60 - 20 - 2 ng/mL en ML. 100 pL de chaque dilution sont distribués par puits contenant 100 pL de cellules (100 000 cellules/puits), soit une concentration finale de 30 - 10 - 1 ng/mL de ML. Les cellules sont incubées 24h (à 37°C, 5% CO2), puis stimulées avec 20 pL d’une solution de lipopolysaccharides (LPS) à 500 ng/mL soit 50 ng/mL LPS au final dans chaque puits. Après 24h d’incubation, les surnageants sont récupérés.
Pour déterminer l’effet cytotoxique de la ML, le test Lonza™ ToxiLight™ (Fisher Scientific) est utilisé. Pour cela, 5 pL de chaque surnageant sont mélangés avec 25 pL de réactif.
Pour déterminer l’effet immunomodulateur de la ML, des kits ELISA kits (IL-6, TNF-a, IL- 1 b) sont utilisés, après dilution des surnageants au 1/10e pour les kits IL-6 et TNF-a, et au 1 pour le kit I L-1 b.
Il apparait que l’incorporation de la ML dans le pCD ne modifie pas son effet immunomodulateur de manière significative (Figure 3. A-D).
Exemple 10 - Effet analgésique de la mycolactone encapsulée en pCD chez la souris
Dans 3 tubes différents, des solutions de pCD dans l’eau (100 mg/mL), ML en éthanol (3 mg/mL) et pCD-ML (3 mg/mL) sont préparées comme précédemment décrit. Par la suite, la pCD est dilué avec du sérum physiologique à une concentration de 8,33 mg/mL. La ML est diluée dans l’huile de maïs (1) à une concentration de 250 pg/mL. Enfin, la préparation de pCD-ML est diluée avec du sérum physiologique à une concentration de ML de 250 pg/mL.
1 . Babonneau J, Bréard D, Reynaert ML, Marion E, Guilet D, Saint Andre JP, Croue A, Brodin P, Richomme P, Marsollier L. 2019. Mycolactone as Analgesic: Subcutaneous Bioavailability Parameters. Front Pharmacol 10:378. Les expérimentations sont réalisées sur des souris Balb/c femelles âgées de 7 à 10 semaines. 15 pL de préparation sont injectés en sous cutané dans le coussinet. Ensuite, le temps de latence des souris à retirer leur patte suite à un stimulus thermique est mesuré à l’aide de l’appareil de test plantaire Hargreaves. La valeur exprimée correspond au ratio groupe testé/groupe témoins (pCD seule).
Comme le montre la Figure 4, l’effet analgésique induit par la pCD-ML est supérieur à celui de la ML seule et cet effet dure plus longtemps Pour les analyses statistiques ont été utilisés un ANOVA à deux facteurs suivi d'un test de comparaison multiple de Dunnett.: * p<0.05, p**<0.01 , **** p<0.0001))
Exemple 11 - Les cyclodextrines biodégradables réduisent l’effet analgésique de la mycolactone
A partir de pCD et de cyclodextrines biodégradables (nommée pCD-citrate), des solutions à une concentration de 100 mg/mL sont préparées. La ML est encapsulée dans chacune de ces solutions à une concentration de 3 mg/mL. Ensuite, ces préparations sont diluées dans du sérum physiologique à une concentration de 250 pg/mL. En parallèle des solutions témoins sans ML sont préparées de la même façon.
Ces expérimentations sont réalisées sur des souris Balb/c âgées de 7 à 10 semaines. 15 pL de préparation sont injectés en sous cutané dans le coussinet. Ensuite, le temps de latence des souris à retirer leur patte suite à un stimulus thermique est mesuré à l’aide de l’appareil de test plantaire par la méthode de Hargreaves. La valeur exprimée correspond au ratio groupe testé/groupe témoin (pCD seule). Comme le montre la Figure 5, l’effet analgésique induit par la pCD-ML est supérieur à celui de la ML seule et cet effet dure plus longtemps. Pour les analyses statistiques ont été utilisés un ANOVA à deux facteurs suivi d’un test de comparaison multiple de Dunnett. * p<0.05, p**<0.01 , **** p<0.0001). Dans nos conditions seules la ML incorporée présente un effet analgésique significatif. Ce résultat montre la spécificité de la ML-pCD pour induire un effet analgésique.
Exemple 12 - Effet analgésique de la mycolactone encapsulée en pCD dans un modèle incisionnel plantaire chez la souris (modèle de douleur chirurgicale) Dans 2 tubes différents, des solutions de pCD en eau (100 mg/mL) et pCD-ML (3 mg/mL) sont préparées comme précédemment décrit. Ensuite ces solutions sont diluées avec du sérum physiologique afin d’obtenir des préparations finales à 3,75 pg de ML, 1 ,875 pg de ML et 0,937pg de ML pour 15 pL de solution.
La valeur exprimée correspond au ratio groupe testé/groupe témoins (pCD seule). Comme le montre les Figures 6 et 7, l’effet analgésique induite par la pCD-ML est supérieur à celui de la ML seule et cet effet dure plus longtemps. Pour les analyses statistiques ont été utilisés un ANOVA à deux facteur suivi d’un test de comparaison multiple de Dunnett.: * p<0.05, p**<0.01 , **** p<0.0001)). Dans nos conditions, seule la ML-pCD présente un effet analgésique significatif. Ce résultat montre la spécificité de la ML-pCD pour induire un effet analgésique.
Ces expérimentations sont réalisées sur des souris C57BI/6 âgées de 7 à 10 semaines. Les incisions sont pratiquées sur le muscle court fléchisseur des orteils. 15 pL de préparation sont injectés en sous cutané au plus près de l’incision. Ensuite, le temps de latence des souris à retirer leur patte suite à un stimulus thermique est mesuré à l’aide de l’appareil de test plantaire Hargreaves. Les résultats obtenus montrent que jusqu’à une dose de 0,9 pg ML en pCD (Figure 7), un effet analgésique significatif est observé plus de 30 h après l’application. L’effet est plus durable pour des doses < 3,75 pg de ML (Figure 6. A). Ce résultat est surprenant mais peut s’expliquer par le fait qu’aux faibles doses il n’y plus d’effet adverse (effet immunomodulateur) de la ML pouvant diminuer son effet analgésique.
Exemple 13 - Co-incorporation de particules magnétiques
Une solution de DM et une solution de pCD sont préparées, chacune à 75 mg/mL. Le mélange de volumes égaux de ces solutions produit instantanément la formation d’un système gélifié mou qui se dépose au fond du récipient. Ce gel peut être récupéré et passé à travers un seringue (aiguille 20G).
La même opération est réalisée, sauf que dans le DM (1 mL) on incorpore 0.5 mg de nanoparticules d’oxide de fer (Aldrich, < 5 micron) ref 310069 et on laisse incuber 4h. Après mélange avec 1 mL de pCD un système gélifié de couler foncée est formé. Il peut être déplacé à l’aide d’un aimant car il contient des particules magnétiques. La quasi-totalité des particules magnétiques se retrouve incorporée dans ce gel. Par ailleurs, le système garde sa cohésion même lors d’un dilution importante (rajout de 3 L d’eau).
La même expérience est réalisée en incorporant la ML dans le pCD comme dans l’exemple 5 puis en mélangeant avec la solution de DM contenant les particules magnétiques. Le même type de gel est formé.
Exemple 14 - Elaboration de nanoparticules
On mélange des volumes identiques de DM (10 mg/mL) et de pCD (10 mg/mL) avec ou sans ML. Des nanoparticules d’environ 120 nm sont instantanément formées, on observe l’obtention d’une solution trouble.
Exemple 15 : Lyophilisation
On prépare des solutions aqueuses de pCD-ML comme décrit auparavant dans l’exemple 5, dans des flacons ambrés. Les concentrations finales de pCD sont de 10 et de 100 mg/mL, et celles de ML 0.3 et 0.5 mL, respectivement. Ces solutions sont directement congelées à -80°C puis lyophilisées (typiquement, en utilisant un lyophilisateur Alpha 1-2 LD Plus, -65°C, 0.018 mbar, 24 h).
A la fin de la lyophilisation, un solide blanc est obtenu. Les solutions de pCD-ML sont facilement reconstituées par rajout d’eau à ce lyophilisât.
La forme lyophilisée protège mieux la ML de la dégradation à la lumière que la forme solubilisée.
De manière avantageuse, le lyophilisât peut être conservé sur plus de 8 mois à l’abri de la lumière, sans dégradation détectable de la ML incorporée. L’intégrité de la ML incorporée dans le pCD est déterminée par HPLC (Agilent, avec une colonne C18 Kinetex® 5pm x 250mm x 4,6mm ; 100 Â). La détection se fait à 30°C, à la longueur d’onde de 363nm, avec un débit de 1 mL/min, et un volume d’injection de 20pL. Le gradient est : 0min = 90/10 eau/acétonitrile ; 3min = 50/50 eau/acétonitrile ; 13min = 0/100 eau/acétonitrile ; 23min = 0/100 eau/acétonitrile ; 33min = 90/10 eau/acétonitrile.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition comprenant :
- (a) un polymère de p-cyclodextrine; et
- (b) au moins un composé choisi parmi la mycolactone et ses dérivés.
2. Composition selon la revendication 1 , dans laquelle le composé (b) répond à la formule (I) suivante : dans laquelle :
- Ri, R2, 4 et R5 identiques ou différents, sont indépendamment choisis parmi le groupe consistant en H, Re, C(O)R7, C(S)R7, C(O)NHR7 et C(S)NHR7,
- R3 est choisi dans le groupe consistant en H, OH, ORe, OC(O)R7, OC(S)R7, OC(O)NHR7, OC(S)NHR7 OU OCH(OH)R7,
- Re est un groupement choisi parmi le groupe consistant en Ci-Ce alkyl, C6-C12 aryl, et les dérivés de sucre, et
- R7 est choisi parmi les groupements H, Ci-Ce alkyl and C6-C12 aryl, ou
- Ri et R2, R2 et R3, et/ou R4 et R5 forment ensemble un groupement acétal, ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le composé (b) est la mycolactone correspondant à la formule (II) :
ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables
4. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle le composé (b) est encapsulé dans le polymère (a) de p-cyclodextrine.
5. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, telle qu’elle est présente sous forme de poudre ou en solution aqueuse.
6. Composition selon l’une des revendications 1 à 5, telle que la concentration du composé (b) est comprise entre 0.001 mg/mL et 10 mg/mL, préférablement de 0.05 à 5 mg/mL.
7. Composition selon la revendication 1 à 6, dans laquelle le polymère (a) est le produit de la réaction de polymérisation entre la p-cyclodextrine modifiée ou non et au moins un autre composé chimique choisi parmi le groupe constitué de l’épichlorhydrine, l’acide tartrique, l’acide citrique, le poly(éthylène glycol) acylé, le chlorure d’adipoyle, le chlorure de succinyle, le glutaraldehyde, le diphenyl carbonate, le 1 ,4-butanediol diglycidyl éther, le toluène diisocyanate, le naphtalène diisocyanate, l’anhydride succinique, l’anhydride 1 ,2, 4, 5 benzène tetracarboxylique, le monochlorotriazine, les dérivés de trimethoxysilane, le diéthynyl benzène et le tetrafluoro terephtalonitrile.
8. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le polymère (a) est un polymère de p-cyclodextrine modifiée ou non et réticulé avec l’épichlorhydrine.
9. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un principe actif (c) choisi parmi les agents anti-cancéreux, les agents analgésiques, anesthésiques, les molécules actives à effet cicatrisant, les agents antibactériens, les antibiotiques, les antiseptiques, hémostatiques, antifongiques, antiviraux, antithrombotiques, antiinflammatoires, antiprurigineux, produits de contraste, hormones.
10. Composition selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant un composé (d) choisi parmi les nanoparticules inorganiques, les nanoparticules hybrides organiques-inorganiques ou les nanoparticules polymériques.
11. Composition pharmaceutique comprenant la composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 , dans laquelle l’excipent pharmaceutiquement acceptable est choisi parmi le dextran et ses dérivés.
13. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 , dans laquelle l’excipent pharmaceutiquement acceptable est le dextran hydrophobisé, conduisant à la formation de gels ou de nanoparticules
14. Procédé de préparation de la composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant une étape de mélange des composés (a) et (b) en solution aqueuse.
15. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, pour son utilisation dans le traitement de la douleur.
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