EP4698148A1 - Verfahren zur fixierung von dna-bindenden proteinen in zellen und waschflüssigkeit - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren (100) zur Fixierung von DNA-bindenden Proteinen 5.2 in Zellen angegeben. Das Verfahren (100) weist auf: a) Bereitstellen (10) von Zielzellen 2, b) Bestrahlen (11) der Zielzellen (2) mit UV-Strahlen (3) einer Wellenlänge im Bereich von 240 nm bis 280 nm und einer Energiedichte im Bereich von wenigstens 0,01 mJ/cm2 bis 1000 mJ/cm2 und c) Inkubieren (12) der Zielzellen (2) in einer Waschflüssigkeit 200 und Auswaschen von nicht DNA-gebundenen Proteinen aus den Zielzellen (2). Daneben wird eine Waschflüssigkeit (200) angegeben, die beispielsweise in einem solchen Verfahren (100) verwendet werden kann.

Description

Verfahren zur Fixierung von DNA-bindenden Proteinen in Zellen und Waschflüssigkeit

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fixierung von DNA-bindenden Proteinen in Zellen, insbesondere Einzelzellen eines Zellgemisches, sowie eine Waschflüssigkeit und deren Verwendung.

Nukleinsäuren, wie Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA), sind die Träger der Erbinformation in allen Lebewesen und Viren. Für das Ablesen, die Erhaltung und die Vervielfältigung der Nukleinsäuren sind spezialisierte zelluläre Proteine notwendig, die direkt an die Nukleinsäuren binden und mit ihnen funktionell interagieren. Für den Menschen wurden bereits mehr als zweitausend verschiedene DNA- Bindeproteine beschrieben, was einem Anteil von ca. 10 % aller humanen Proteine entspricht. In jeder Zelle wird dabei aber nur der für die jeweilige Zellfunktion notwendige Teil an DNA-Bindeproteinen exprimiert, zudem ist die Bindung der Proteine an die Nukleinsäuren streng reguliert. Ein Anteil der DNA-Bindeproteine liegt in den Zellen in nicht-aktiver und nicht DNA-gebundener Form vor. Erst nach Stimulation der Zellen, beispielsweise durch eine veränderte Hormonausschüttung oder durch externe Faktoren, kommt es bei einigen Proteinen zur funktionellen Aktivierung und zur DNA-Bindung. Zellen besitzen somit je nach Zelltyp und Aktivierungszustand ein spezifisches DNA- Protein-Bindungsmuster. Fehlregulationen oder Mutationen von DNA-Bindeproteinen sind oftmals Auslöser pathogener Veränderungen und können sowohl als Marker für die Identifikation und die Prognose von Krankheiten als auch als therapeutische Ziele Verwendung finden.

Nukleinsäure-bindende Proteine müssen für die Erfüllung ihrer zellulären Funktionen im Regelfall direkt an die Nukleinsäure binden. In der Zelle liegt aber oft ein Überschuss des zu untersuchenden DNA-Bindeproteins im Zellplasma oder im Zellkern vor und nur eine Teilmenge des Proteins oder nur eine spezifische Unterform des Proteins (z.B. durch posttranslationale Modifikationen) bindet tatsächlich an die DNA und ist funktionell. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist die in vivo Bestimmung der tatsächlich mit der DNA interagierenden Proteine in Einzelzellen von Zellgemischen nicht möglich. Aktuelle High- throughput-Methoden, wie beispielsweise die intrazelluläre Färbung von Proteinen nach Formaldehydfixierung, erlauben nur die Detektion der Gesamtmenge eines spezifischen DNA-Bindeproteins in der Einzelzelle und können dabei nicht unterscheiden, ob das Protein zum Analysezeitpunkt tatsächlich an DNA gebunden vorlag.

Zudem haben vorhandene Methoden lediglich eine geringe zeitliche Auflösung. So haben beispielsweise bisher angewandte chemische Fixierungen eine Reaktionsdauer von mehreren Minuten.

Ein weiterer Nachteil bei der Fixierung mit Formaldehyd und anderen Fixierungsagenzien ist die Blockierung von Antikörperbindestellen durch ihre Bindung an Proteine. Dadurch können viele Antikörper nicht mehr zur Detektion des Proteins eingesetzt werden. Es müssen deshalb spezielle Antikörper produziert und getestet werden. Zurzeit gibt es nur für wenige Transkriptionsfaktoren (max. 100) geeignete Antikörper. Die Antikörperproduktion ist ein großer Markt, da es zurzeit keine alternativen nativen Methoden gibt, um Proteine zu erkennen/markieren.

Das Einbringen und Freisetzen von Substanzen in und aus Zellen wurde an verschiedenen Stellen beschrieben.

Beispielsweise beschreibt die US 2005/095578 A1 Verfahren und Vorrichtungen zum Einbringen und Freisetzen von Substanzen in und aus Zellen, und insbesondere Verfahren und Vorrichtungen zur vorübergehenden Permeabilisierung einer lebenden Zelle, so dass eine oder mehrere einer Vielzahl von Substanzen, wie Ionen, Proteine und Nukleinsäuren, in die Zelle geladen oder aus ihr freigesetzt werden können.

Die WO 2009/140701 A2 beschreibt die Verwendung von Ultrakurzpulslasern (USP) zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen. Hierin werden Verfahren zum Einbringen von Makromolekülen wie Proteinen, Peptiden, Aminosäuren, Nukleinsäuren, DNA, RNA, Oligonukleotiden, Lipiden, Kohlenhydraten oder beliebigen Kombinationen davon in Zellen mit Zellwänden, wie z. B. Bakterien, Archaeen, Pilze, Hefe, Algen und Pflanzenzellen, unter Verwendung eines ultravioletten USP-Lasers vorgestellt.

Spezifische, direkte DNA-Protein-Interaktionen können zurzeit auf Einzelzellebene nicht quantifiziert werden, da vorhandene Methoden, wie die intrazelluläre Färbung von Proteinen nach Formaldehydfixierung, nicht zwischen DNA-gebundenen (auch Transkriptionsfaktoren genannt) und DNA-nicht-gebundenen Proteinen unterscheiden können.

In der Veröffentlichung von REIM, A. et al. Atomic-resolution mapping of transcription factor-DNA interactions by femtosecond laser crosslinking and mass spectrometry. Nat. Commun. 2020, 11 (1):3019, Druckseiten 1-14 werden Zielzellen mit gepulster UV- Laserstrahlung bei 258 nm bestrahlt, wodurch Protein-DNA-Komplexe erzeugt werden, bzw. die Quervernetzungsrate zwischen DNA und Proteinen erhöht wird. Im Anschluss erfolgt eine Denaturierung der Proben, wobei unter anderem auch ein Waschpuffer zur Aufreinigung von Protein-DNA-Fragmenten verwendet wird. Die Fragmente der Protein- DNA-Komplexe werden anschließend massenspektrometrisch untersucht.

Eine Veröffentlichung von NIZAMUDDIN, S. et al. Integrating quantitative proteomics with accurate genome profiling of transcription factors by greenCUT&RUN. Nucleic Acids Res. 2021 , 49 (9):e49, Druckseite 1-18 offenbart einen Puffer, welcher unter anderem Digitonin enthält, zur Permeabilisierung der Kernmembran.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die Fixierung von DNA-bindenden Proteinen in Zellen ermöglicht, ohne die Zelle zu zerstören. Es soll weiterhin ein Puffer bereitgestellt werden, der in einem solchen Verfahren verwendet werden kann.

Die Aufgabe wird durch die Merkmale der unabhängigen Patentansprüche gelöst. Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren zur Fixierung von DNA-bindenden Proteinen in Zellen, insbesondere Einzelzellen eines Zellgemisches, vorgeschlagen. Beispielsweise kann das Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von DNAgebundenen Proteinen in solchen Zellen genutzt werden.

Das vorgeschlagene Verfahren weist die folgenden Schritte auf: a) Bereitstellen von Zielzellen, b) Bestrahlen der Zielzellen mit UV-Strahlen einer Wellenlänge im Bereich von 240 nm bis 280 nm und einer Energiedichte im Bereich von 0,01 mJ/cm² bis 1000 mJ/cm², c) Inkubieren der Zielzellen in einer Waschflüssigkeit und Auswaschen von nicht DNA-gebundenen Proteinen, insbesondere von nicht direkt DNA-gebundenen Proteinen, aus den Zielzellen.

Im Verfahrensschritt c) können dabei insbesondere nicht direkt an DNA gebundene Proteine ausgewaschen werden. Bevorzugt können Proteine ausgewaschen werden, die potenziell DNA binden, also prinzipiell an DNA binden könnten, aber bei der Bestrahlung im Verfahrensschritt b) nicht direkt an DNA gebunden worden sind. Mit anderen Worten können die direkt DNA-gebundenen Proteine in der intakten Zelle isoliert werden.

Das Verfahren wird außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers ausgeführt. Optional kann das Verfahren ein Detektieren von kovalent DNA-gebundenen Proteinen in den Zielzellen aufweisen. Ein solches Detektieren kann beispielsweise ein Quantifizieren der kovalent DNA-gebundenen Proteine umfassen. Der Ausdruck „in den Zielzellen“ bedeutet hierbei, dass die Zielzellen nicht lysiert werden, d. h. das Detektieren in den intakten Zielzellen erfolgt. Dies bedingt, dass auch bei den vorherigen Verfahrensschritte keine Lyse erfolgt, d. h. die Zielzellen intakt bleiben.

Zum Detektieren können die fixierten DNA-gebundenen Proteine gefärbt werden, z. B. mittels markierter Antikörper. Hierbei kann die Färbbarkeit durch die Bestrahlung mit UV- Strahlen und die Verwendung der Waschflüssigkeit beeinflusst sein oder werden, beispielsweise durch die Nichtmaskierung, kovalente Bindungen an anderen, eventuell durch Chemikalien, z. B. den Farbstoff, nicht erreichbare Bereiche des Genoms, und/oder der Färbung in anderen Puffern. Die Färbung oder Färbbarkeit nach UV- Fixierung/Crosslinking kann im Gegensatz chemischer Fixierung verändert sein, weil im Gegensatz zu Chemikalien, wie Formaldehyd, die sich um die Antikörperbindestelle legen können (Maskierung), UV-Bestrahlung keine Rückstände hinterlässt. Zudem werden durch UV-Bestrahlung zum Teil Protein-DNA Crosslinks in Genomregionen generiert, die eventuell für Chemikalen unzugänglich sind. Dadurch kann sich auch die Färbung oder Färbbarkeit ändern.

Das vorgeschlagene Verfahren ermöglicht es, unter Erhalt der Zielzellen, also ohne Lyse, kovalente DNA-Protein-Bindungen im Inneren der Zielzelle auszubilden und verbleibende nicht DNA-gebundene Proteine, insbesondere überschüssige, potenziell DNA-bindende Proteine, auszuwaschen, sodass nachfolgend eine Detektion der DNA-Protein-Bindungen in der intakten Zelle erfolgen kann. Vorteilhaft können alle nicht-DNA gebundenen Proteine vollständig ausgewaschen werden, um die Genauigkeit einer nachfolgenden Detektion zu verbessern.

Besonders vorteilhaft erlaubt das Verfahren die Detektion von ausschließlich DNAgebundenen Proteinen in Einzelzellen eines Zellgemisches.

Unter dem Begriff „Zielzellen“ werden vorliegend Zellen verstanden, in welchen gemäß dem vorgeschlagenen Verfahren DNA-bindende Proteine fixiert und isoliert sowie ggf. detektiert und quantifiziert werden können. Die gemäß Schritt a) bereitgestellten Zielzellen können dabei als homogene oder heterogene Einzelzellen oder als Zellgemisch oder Zellverband vorliegen. Beispielsweise können die Zielzellen vereinzelt, d. h. in Form von Einzelzellen, vorliegen oder als Zellgemisch, wobei auch mehrere unterschiedliche Zelltypen im Zellgemisch vorliegen können.

Das vorgeschlagene Verfahren ist für alle Zellarten anwendbar. Beispielsweise können die Zielzellen tierische Zellen, pflanzliche Zellen, eukaryotische Zellen oder prokarytoische Zellen sein. Bevorzugt können die Zielzellen Zellen von Metazoen oder höheren, also komplexeren, Lebewesen oder Mehrzellern sein. Je nach Zellart können die Verfahrensparameter variieren. Beispielsweise kann die zu wählende Energiedichte von der Zellart abhängen. So kann für pflanzliche Zellen eine hohe Energiedichte notwendig sein, während bei prokarytoischen Zellen eine niedrige Energiedichte, z. B. im Bereich zwischen 0,01 bis 1 mJ/cm², ausreichend sein kann. Auch die Waschflüssigkeit kann in Abhängigkeit der Zellart gewählt sein oder werden.

Die Zielzellen können in einer Flüssigkeit vorliegend bereitgestellt werden, so dass im Verfahrensschritt b) das Bestrahlen einer Zellsuspension erfolgen kann. Die Flüssigkeit kann daher auch als Bestrahlungsflüssigkeit bezeichnet werden. Die Flüssigkeit sollte vorzugsweise isotonisch sein, d. h. so beschaffen sein, dass eine in der Flüssigkeit dispergierte Zelle ihr Volumen nicht ändert. Außerdem sollte die Absorption der in Verfahrensschritt b) verwendeten UV-Strahlen möglichst gering sein, z. B. unter 10 %, bevorzugt unter 5 % und weiter bevorzugt unter 1 % liegen. Als Flüssigkeit kann beispielsweise eine phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) eingesetzt werden. Als Flüssigkeit kann ein Medium mit oder ohne Indikatorfarbstoff verwendet werden, z. B. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ohne Phenolrot, RPMI-1640 ohne Phenolrot, Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) ohne Phenolrot.

Unter dem Begriff „Waschflüssigkeit“ wird vorliegend eine Flüssigkeit, z. B ein Stoffgemisch in flüssiger Form, z. B. als wässrige Lösung verstanden. Vorzugsweise handelt es sich bei der Waschflüssigkeit um eine isotonische Salzlösung, die die Integrität der Zellen erhält, d. h. eine zellerhaltende Lösung. Die Waschflüssigkeit kann mit der Flüssigkeit identisch sein, in der die Zielzellen bereitgestellt und bestrahlt werden, d. h. die Waschflüssigkeit kann ebenso als Bestrahlungsflüssigkeit dienen. Ist die Waschflüssigkeit mit der Bestrahlungsflüssigkeit nicht identisch, so wird zur Durchführung des Verfahrensschritts c) die Waschflüssigkeit nach dem Bestrahlen zu den Zielzellen hinzugefügt. Optional kann die Bestrahlungsflüssigkeit ganz oder teilweise gegen die Waschflüssigkeit ausgetauscht werden.

Die Waschflüssigkeit kann eine Pufferlösung bzw. gepufferte Flüssigkeit sein, d. h. eine Flüssigkeit, deren pH-Wert sich bei Zugabe einer Säure oder Base wesentlich weniger stark ändert, als es bei einem ungepufferten System der Fall wäre. Beispielsweise kann die Waschflüssigkeit ein Waschpuffer, Inkubationspuffer oder ein vergleichbarer geeigneter Puffer sein. Die Waschflüssigkeit kann beispielsweise auf einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) basieren. Alternativ kann die Waschflüssigkeit Tyrode-Lösung, Balanced Salt Solution (BSS) oder Ringerlösung sein. Der pH-Wert der Waschflüssigkeit kann beispielsweise 7,4 betragen. Die Eigenschaft als Pufferlösung ermöglicht das Arbeiten bei diesem konstanten pH-Wert.

Der Begriff “Energiedichte“ bezeichnet ein Maß für den Energieeintrag pro Fläche der Zelle(n). Die Energiedichte kann beispielsweise anhand der Anzahl an Photonen, die in einem Laserpuls, z. B. 5 ns, auf die Zelloberfläche treffen, ermittelt werden. Dies kann mittels eines Sensor zur Ermittlung der aufgebrachten Energie, der anstelle der Probe in dem Laserstrahl positioniert wird, ermittelt werden. Da der Laserstrahl nicht fokussiert ist und das Medium die Laserstrahlung nicht absorbiert, entspricht die Energiedichte am Messgerät der Energiedichte auf den Zielzellen. Beispielsweise bedeutet Bestrahlen der Zielzellen mit einer Energiedichte von 10 mJ/cm² in Verfahrensschritt b), dass in 1 cm² Zelloberfläche 10 mJ Energie eingetragen werden. Hierfür können z. B. die Laserleistung und/oder die Bestrahlungsdauer, z. B. Pulsdauer und/oder Pulsanzahl, entsprechend variiert werden.

Das vorgeschlagene Verfahren beruht dabei auf zwei Eigenschaften der DNA:

1. der photochemischen Aktivierbarkeit von Nukleinsäuren durch UV-Strahlung, was zur Ausbildung von kovalenten Bindungen mit angelagerten Proteinen führt und

2. der Tatsache, dass die DNA auf Grund ihrer enormen Molekülgröße nach Permeabilisierung der Zellen den Zellkern nicht verlassen kann und damit die kovalent angelagerten Proteine in der Zelle für anschließende Nachweisreaktionen fixiert. Proteine, die zum Bestrahlungszeitpunkt nicht in unmittelbarer Nähe zur DNA vorliegen, werden nachfolgend als lösliche Bestandteile in Waschschritten entfernt und folglich nicht detektiert.

Die Bestrahlung der Zielzellen mit hochintensivem UV-Licht, z. B. UV-Laserlicht, führt zum einen zur Ausbildung von kovalenten Bindungen von bereits an die DNA gebundenen Proteinen mit der DNA. Unter kovalenter Bindung wird dabei im Sinne dieser Erfindung eine Form der chemischen Bindung mit bindenden Elektronenpaaren verstanden, welche für den festen Zusammenhalt von Atomen in molekular aufgebauten chemischen Verbindungen sorgt.

Im Gegensatz dazu werden bei der Verwendung herkömmlicher chemischer Fixierungsagenzien, beispielsweise Formaldehyd, nicht-selektive Querverbindungen zwischen Proteinen und Protein-Nukleinsäuren in der Zelle erzeugt, was den Nachweis direkter Protein-Nukleinsäure-Interaktionen unmöglich macht. Bei der gemäß Schritt b) des vorgeschlagenen Verfahrens durchgeführten Bestrahlung wird anstelle der nichtselektiven Querverbindungen die photochemische Vernetzung durch hochintensive UV- Strahlung induziert, die nur Vernetzungen zwischen Protein- und Nukleinsäure-Molekülen erzeugt, die in unmittelbarem Kontakt stehen, d. h. einer einzelnen DNA-Base mit jeweils einer sich in direktem Kontakt (Abstand im Ängström-Bereich) befindlichen Aminosäure vernetzt. Im Gegensatz dazu führt eine chemische Fixierung zur unspezifischen kovalenten Bindung von Proteinen an Strukturen in der gesamten Zelle und/oder anderen Proteinen. Zum anderen werden die Zellmembranen der Zielzellen durch die Bestrahlung geschädigt und dadurch porös, z. B. durchlässig für Farbstoffmoleküle. Die Bestrahlung bewirkt zusammen mit der Waschflüssigkeit eine effektive Porenbildung, wodurch nicht- kovalent gecrosslinkte Proteine besser ausgewaschen werden können. Folglich können nicht an DNA gebundene Proteine beim anschließenden Inkubieren der Zielzellen in der Waschflüssigkeit ausgewaschen werden. Da die DNA einer Zelle im Zellkern zu groß ist, um aus der Zelle ausgewaschen zu werden, verbleibt diese und alle durch die UV- Behandlung kovalent an sie gebundenen Proteine in der Zelle. Dort können sie markiert oder gefärbt und anschließend z. B. in Niedrig- und Hochdurchsatzverfahren analysiert werden. Ausgewaschen werden sowohl nicht an DNA gebundene Proteine als auch indirekt an DNA gebundene Proteine, also solche Proteine, die lediglich über andere Proteine an die DNA gebunden vorliegen. Der Grund dafür ist, dass die photochemische Reaktion, welche der Ausbildung einer kovalenten Bindung zugrunde liegt, von der DNA ausgeht.

Vorteilhafterweise verbleiben nur Proteine in den Zellen, welche zum Zeitpunkt der Bestrahlung in den lebenden Zellen direkt an die DNA gebunden waren. Diese stehen für Nachfolgeuntersuchungen zur Verfügung. Durch die Detektion mehrerer Zielproteine kann ein für die Zelle charakteristischer „Fingerabdruck“, der beispielsweise zu Diagnosezwecken verwendet werden kann, entstehen.

Bevorzugt wird das Verfahren hierfür derart durchgeführt, dass die kovalente Verbindung von DNA mit Proteinen in Kombination mit dem Auswaschen aller potenziell DNAbindenden, aber nicht kovalent an DNA fixierten Proteine aus den Zielzellen erfolgt.

Vorteilhaft ist, dass die Zellen bei der Induzierung der DNA-Proteinbindung intakt, insbesondere äußerlich intakt bleiben. Das heißt im Sinne der Erfindung, dass die Zellen nicht lysiert werden und insbesondere die Integrität der Zellen bestehen bleibt und die Epitope der zu detektierenden Proteine nicht beschädigt werden.

Das Bestrahlen der Zielzellen gemäß Verfahrensschritt b) und das Inkubieren der Zielzellen sowie Auswaschen gemäß Verfahrensschritt c) können bevorzugt zeitgleich oder zumindest unmittelbar aufeinander folgend erfolgen. Vorteilhafterweise kann sich dadurch die Wirkung der Waschflüssigkeit bereits bei der Bestrahlung entfalten und die Fixierung der DNA-bindenden Proteine kann zeitsparend erfolgen. Gemäß verschiedenen Ausführungsvarianten kann das Bestrahlen der Zielzellen mit gepulster UV-Laserstrahlung erfolgen. Vorteilhafterweise kann dadurch bei der Behandlung von wenigen oder einzelnen Zellen mittels Konzepten der Mikrofluidik die erreichbare Energiedichte insbesondere von Lasern mit geringer Leistung, also von schwachen Lasern, erhöht werden. Bei Verwendung eines eher schwachen Lasers können bevorzugt kurze Pulse mit niedriger Frequenz gewählt werden, damit die einzelnen Pulse die nötige Energiedichte erreichen.

Alternativ kann auch ein ungepulster Laser zur Bestrahlung der Zielzellen verwendet werden.

Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann die Bestrahlung kann derart erfolgen, dass die Mehrzahl der bestrahlten Zellen genau einmal bestrahlt wird.

Vorzugsweise sollte jede Zelle nur von einem Puls getroffen werden, weil das Crosslinking in fs passiert und ein weiterer Puls entstandene Crosslinks wieder lösen könnte. Ein Puls des Lasers kann beispielsweise eine Energie von ca. 50 mJ bereitstellen, ca. 5 ns dauern und eine Fläche von ca. 0,3 cm² bestrahlen. Die Energiedichte kann durch Verkleinerung der Fläche oder Erhöhung der Energie oder Verkürzung der Pulszeit erreicht werden. Der Hauptgrund ist, dass zwei Photonen sehr schnell nacheinander auf die gleiche Stelle treffen sollen, um das Crosslinking zu ermöglichen. Dafür ist die Wahrscheinlichkeit höher, je höher die Dichte der Photonen ist.

Dadurch können eine Mehrfachbestrahlung und eine damit einhergehende erneute Zerstörung der zuvor generierten DNA-Protein-Verbindungen vermieden werden.

Zur Beurteilung der Bestrahlungshäufigkeit können die Zellen mit einem Farbstoff gefärbt werden, der erst nach Bestrahlung fluoresziert. Hierfür kann als Farbstoff z. B. Rhodamin, beispielsweise ein caged-Rhodamin, verwendet werden.

Im Sinne der Erfindung meint die Formulierung „einmal bestrahlt werden“, dass die bestrahlte Zelle genau einmal von einem Laser getroffen wird. Dies kann einen Laserpuls oder eine sehr kurze Bestrahlung mit einem ungepulsten Laser einbeziehen. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Einmalbestrahlung das Optimum ist und Mehrfachbestrahlung die Effizienz reduziert, aber die Wirksamkeit nicht verhindert. Eine einmalige Bestrahlung der Zellen kann beispielsweise durch eine Bestrahlung der Zellen in einem geeigneten Gefäß, beispielsweise einem Tube, bei gleichzeitiger Durchmischung, insbesondere durch einen Rührer, erfolgen. Der Fachmann ist in der Lage, die Zellkonzentration und die Bestrahlungsdauer derart einzustellen, dass die Mehrzahl der Zellen nur einmal von einem Laserstrahl getroffen wird. Beispielhaft zu wählende Parameter wären für eine Zellkonzentration von 10 Mio. Zellen in 200 ml Flüssigkeit eine Bestrahlung für 5 Sekunden bei einer Pulsfrequenz von 10 Hz (entspricht 50 Pulsen) bei einer Rühr-Frequenz von 500 rpm.

Alternativ kann die Art und Weise der Bestrahlung mit Hilfe von Mikrofluidik beeinflusst werden. Hierzu kann beispielsweise der Zelldurchfluss derart eingestellt werden, dass jede Zelle von genau einem Laserpuls getroffen wird.

Die für das vorgeschlagene Verfahren zu erreichende Energiedichte im Bereich von 0,01 mJ/cm² bis 1000 mJ/cm², z. B. 5 mJ/cm² bis 1000 mJ/cm², bevorzugt von 10 mJ/cm² bis 1000 mJ/cm², weiter bevorzugt von 20 mJ/cm² bis 500 mJ/cm², besonders bevorzugt von 40 mJ/cm² bis 250 mJ/cm², wird von unterschiedlichen Faktoren, wie beispielsweise der Pulsdauer und der Pulsfrequenz beeinflusst.

Die Pulsdauer kann dabei vorzugsweise im Bereich von Femtosekunden über Pikosekunden bis wenigen Nanosekunden liegen, wobei bei einer Pulsdauer im Bereich von Pikosekunden bis wenigen Nanosekunden eine höhere Effizienz im Vergleich zu einer Pulsdauer im Femtosekundenbereich erreicht werden kann. Je energieärmer der verwendete Laser, desto kürzer sollte die anzuwendende Pulsdauer gewählt werden. Die Pulsfrequenz kann vorzugsweise im Bereich von einigen Hertz bis einigen Megahertz oder Gigahertz bei einer Pulsdauer im Bereich von Femptosekunden liegen.

Durch die Verwendung einer relativ langen Pulsdauer im Bereich von Pikosekunden bis Nanosekunden erfolgt das Crosslinking, also die Verbindung von DNA mit Proteinen, besonders effizient, während gleichzeitig die Zellen intakt bleiben.

Je geringer die Energiedichte bei der Bestrahlung, desto länger sollte die Einwirkzeit der Bestrahlung gewählt werden.

Es kann beispielsweise vorgesehen sein, dass das Bestrahlen der Zielzellen mit einer Bestrahlungsdauer im Bereich von wenigen Millisekunden bis zu wenigen Sekunden erfolgt.

Vorteilhafterweise ermöglicht die relativ kurze Fixierungsdauer zeitlich hochauflösende Untersuchungen, wohingegen eine chemische Fixierung zwischen 5 und 60 Minuten dauert, was dazu führen kann, dass Proteinbindungen sich in dieser Zeit ändern können und schnelle DNA-Protein-Bindungsänderungen nicht gemessen werden können. Durch das vorgeschlagene Verfahren wird eine Momentaufnahme der DNA-Protein-Bindung in lebenden Zellen erstellt (wobei die Zellen selbstverständlich nur bis zum Zeitpunkt der Bestrahlung leben, aber der Zustand der DNA-Protein-Bindung entspricht dem Zustand in den lebenden Zellen).

Neben Parametern wie der Leistung des Lasers, Pulsdauer, Pulsfrequenz und Bestrahlungsdauer kann die zu erreichende Energiedichte beispielsweise auch über lichtoptische und/oder elektronenoptische Systeme einer für das vorgeschlagene Verfahren verwendeten Vorrichtung beeinflusst werden. Beispielsweise kann die Verwendung eines optischen Systems mit optisch wirksamen Elementen, z. B. Linsen, Spiegeln, etc., beispielsweise eines Linsensystems mit ein oder mehreren Linsen, vorgesehen sein, um die Photonendichte eines schwächeren Lasers zu erhöhen.

Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann folglich zum Bestrahlen der Zielzellen ein UV-Laser in Kombination mit wenigstens einem lichtoptischen und/oder elektronenoptischen System verwendet werden.

Bei dem lichtoptischen und/oder elektronenoptischen System kann es sich vorzugsweise um eine Vorrichtung zur Vergrößerung der Photonendichte, beispielsweise eine Linse, einen Spiegel und/oder ein Prisma zur Ablenkung des Lichtstrahls, handeln.

Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass insbesondere in Kombination mit der Verwendung energieärmerer Laser eine Zellvereinzelung zur Bereitstellung der Zielzellen durchgeführt wird. Dadurch kann vorteilhafterweise sichergestellt werden, dass jede einzelne Zielzelle von Laserstrahlung mit der benötigten Energiedichte getroffen wird. Die Zellvereinzelung kann beispielsweise durch Methoden der Mikrofluidik erfolgen. Hierbei können die Zellen nacheinander in einem Kanal, z. B. aus UV-Strahlung durchlässigem Quarzglas, bestrahlt werden. Gemäß verschiedenen Ausführungsvarianten kann vorgesehen sein, dass die Waschflüssigkeit wenigstens eine Cholesterin-Iösende und/oder Poren-induzierende Substanz enthält.

Beispielhafte Cholesterin-Iösende und/oder Poren-induzierende Substanzen sind Saponine, wie z. B. Digitonin und/oder Polyoxyethylen20-sorbitan-monolaurat, auch bekannt unter dem Handelsnamen Tween® 20. Auch Produkte der Produktreihe Leucoperm können verwendet werden. Auch weitere Cholesterin-Iösende und/oder Poren-induzierende Substanzen sind denkbar und können im Rahmen der Erfindung zur Anwendung kommen.

Vorteilhafterweise wird durch die Verwendung der Cholesterin-Iösenden und/oder Poreninduzierenden Substanzen die Permeabilisierung der Zell- und Kernmembran, welche bereits durch die UV-Bestrahlung induziert wurde, weiter erhöht. Es können verstärkt Poren in der Zell- und in der Kernmembran gebildet werden, die groß genug sind, um durchgängig für nicht an die DNA gebundene Proteinkomplexe zu sein, sodass diese aus der Zelle einfacher ausgewaschen werden können. Gleichzeitig bleiben die Zellen intakt und es kommt nicht zu einer Lyse der Zellen. Es werden bevorzugt Poren gebildet, welche eine Größe von 8 bis 10 nm aufweisen können.

Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass der Puffer einen Bestandteil aufweist, welcher die Auswaschung von Proteinen unterstützt. Dabei handelt es sich bevorzugt um nichtionische Detergenzien bzw. Tenside, wie beispielsweise Octoxinol 9 (CAS-Nummer 9002-93-1), z. B. bekannt unter der Bezeichnung NP-40 bzw. Nonidet™ P40 oder Triton™ X-100.

Weiter optional kann die Waschflüssigkeit Enzyme oder Inhibitoren enthalten. Beispielsweise kann die Waschflüssigkeit Ribonukleasen (Rnasen) aufweisen, wodurch RNA verdaut und ebenfalls mit ausgewaschen werden kann. Enzyme, z. B. Proteaseinhibitoren, können zugesetzt werden, um eine Veränderung der zu detektierenden Proteine zu vermeiden.

Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann die Waschflüssigkeit ferner Bestandteile aufweisen, welche die Lösung von nicht-kovalenten DNA-Protein-Bindungen und/oder von Protein-Protein-Bindungen ermöglicht. Ein solcher Bestandteil ist beispielsweise ein Salz, bevorzugt ein anorganisches Salz, wie beispielsweise ein Metallchlorid.

Metallchloride zeichnen sich durch eine hohe Löslichkeit in wässrigen Medien, z. B. dem Puffermedium, aus.

Das Salz kann beispielsweise ausgewählt sein aus einer Gruppe umfassend NaCI, LiCI, KCl, MgCh und CaCh. Mit anderen Worten kann als Salz NaCI, LiCI, KCl, MgCh und/oder CaCh genutzt werden. Bevorzugt sind NaCI und/oder LiCI.

Das Salz kann beispielsweise in einer höheren, nichtphysiologischen Konzentration in der Waschflüssigkeit vorliegen. Die Salzkonzentration in der Waschflüssigkeit kann im Bereich von 300 mM bis 700 mM liegen, beispielsweise im Bereich von 450 mM bis 550 mM. Die Salzkonzentration kann beispielsweise 550 mM betragen.

Eine Aufgabe des Salzes kann es sein, die Interaktion von DNA und Protein zu stören. Je fester das Protein an der DNA hängt, z.B. je mehr DNA Bindedomänen das Protein hat, desto höher sollte die Salzkonzentration sein. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung gehen davon aus, dass sich Histone nicht von der DNA lösen lassen.

Diese höhere, nichtphysiologische Konzentration kann eine Lösung von nicht kovalenten DNA-Protein-Bindungen und/oder von Protein-Protein-Bindungen, welche durch das vorgeschlagene Verfahren nicht detektiert werden sollen, verbessern, so dass die Genauigkeit der Detektion von kovalent DNA-gebundenen Proteinen in den Zielzellen erhöht werden kann.

Alternativ kann das Salz in einer niedrigeren Konzentration in der Waschflüssigkeit vorliegen. Die Salzkonzentration in der Waschflüssigkeit kann im Bereich von 50 mM bis 100 mM liegen. Die Salzkonzentration kann beispielsweise 75 mM betragen.

Diese niedrigere Konzentration kann eine schonende Lösung der o. g. Bindungen ermöglichen. Gemäß verschiedener Ausführungsvarianten kann das Inkubieren der Zielzellen in der Waschflüssigkeit unter durchgängiger Bewegung der Zellen, beispielsweise unter Rotation und/oder Schütteln, erfolgen. Dadurch kann sichergestellt werden, dass jede einzelne Zelle in ausreichenden Kontakt mit den Inhaltsstoffen der Waschflüssigkeit kommt. Die Inkubationszeitdauer kann zudem verringert werden.

Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann das Inkubieren der Zielzellen in der Waschflüssigkeit für einen Zeitraum von 5 Minuten bis 60 Minuten erfolgen. Die Dauer des Inkubierens kann dabei in Abhängigkeit vom bzw. von den jeweiligen Zielprotein(en), d. h. denjenigen Proteinen, die an die DNA angebunden werden sollten, gewählt werden. Die Inkubationszeit kann beispielsweise von der Bindungsstärke des Proteins an die DNA abhängen. Proteine mit vielen DNA-Bindedomänen sollten länger inkubiert bzw. gewaschen werden.

Gemäß verschiedenen Ausführungsvarianten können zumindest einzelne Verfahrensschritte des vorgeschlagenen Verfahrens in einer Multiwell-Platte oder in oder auf einem mikrofluidischen Bauteil durchgeführt werden.

Unter der Bezeichnung mikrofluidisches Bauteil wird dabei im Sinne der Erfindung ein Bauteil verstanden, welches sich zur Durchführung einzelner Verfahrensschritte im Bereich der Mikrofluidik eignet, wie beispielsweise ein Chip-Labor. Die Mikrofluidik besteht im einfachsten Fall aus einem ersten Reservoir, einem Kanal und einem zweiten Reservoir. Die Zellen werden durch den Kanal vom ersten Reservoir zum zweiten Reservoir gepumpt und dabei bestrahlt.

Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann die Bestrahlung der Zielzellen bei einer Temperatur von maximal 10 °C, bevorzugt maximal 4 °C erfolgen.

Die Temperaturen sollten stets unter 42 °C bleiben, damit die Proteine nicht denaturieren. Niedrigere Temperaturen (< 10 °C) sind vorzuziehen, weil sie eventuelle Enzymaktivitäten, z. B. von Proteasen oder Nukleasen, reduzieren oder stoppen. Die niedrigste mögliche Temperatur liegt beim Gefrierpunkt der verwendeten Flüssigkeit.

Durch die Durchführung der Bestrahlung bei niedriger Temperatur können Schädigungen der Zellmembran und der zu detektierenden Proteine verringert werden.

Gemäß weiteren Ausführungsvarianten kann das Detektieren der kovalent DNAgebundenen Proteine eine Zugabe wenigstens eines Nachweisreagenz zu den bestrahlten Zielzellen umfasst, wobei das Nachweisreagenz mit den kovalent DNAgebundenen Proteinen in Wechselwirkung tritt.

Mit anderen Worten kann zur Detektion von DNA-gebundenen Proteinen in den intakten Zielzellen nach dem Inkubieren der Zielzellen in der Waschflüssigkeit eine Zugabe wenigstens eines Nachweisreagenz, zu den bestrahlten Zielzellen erfolgen, wobei das Nachweisreagenz mit kovalent an die DNA gebundenen Proteinen in Wechselwirkung tritt.

Das Nachweisreagenz kann mindestens einen fluoreszenzmarkierten Antikörper aufweisen. Neben fluoreszenzmarkierten Antikörpern sind weitere beispielhafte Nachweisreagenzien mit Metallen markierte Antikörper, enzym-markierte Antikörper oder Protein-Tags detektierende Agenzien. Des Weiteren kann die Detektion des Analyten über einen unmarkierten primären Antikörper in Kombination mit einem markierten sekundären Antikörper erfolgen. Die Zugabe eines spezifischen Nachweisreagenz ist nicht nötig, wenn das nachzuweisende Protein bereits vor der Fixierung markiert ist (z.B. fluoreszenzmarkierte Zellproteine).

Die durch das UV-Licht kovalent an die DNA gebundenen Proteine verbleiben in ihrer nativen Konformation und können so durch Antikörper, die das native Protein erkennen, detektiert werden.

Vorteilhafterweise können durch die zuvor erfolgte Permeabilisierung der Zellen die Nachweisreagenzien besser in die Zellen eindringen.

Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass nach der Zugabe wenigstens eines Nachweisreagenz die Detektion einer Wechselwirkung zwischen dem Nachweisreagenz und den kovalent an die DNA gebundenen Proteinen erfolgt, bevorzugt mittels Durchflusszytometrie und/oder Mikroskopie und/oder weiterer Einzelzellanalysemethoden.

Bevorzugt kann die Detektion der Wechselwirkung durch ein Hochdurchsatzverfahren erfolgen. Durchflusszytometrie kann vorteilhaft im Hochdurchsatz verwendet werden, Mikroskopie im Niedrigdurchsatz. Standarddurchflusszytometer messen nur die Gesamtfluoreszenz. Durch Mikroskopie kann hingegen vorteilhaft die Lokalisation der Proteine überprüft werden. Zudem kann bei der Mikroskopie die Hintergrundfärbung besser eliminiert werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Waschflüssigkeit. Die Waschflüssigkeit weist wenigstens eine Cholesterin-Iösende und/oder Poren-induzierende Substanz, wenigstens ein nichtionisches Detergens und wenigstens ein Salz auf. Die Waschflüssigkeit kann zur Inkubation von Zellen, zur Permeabilisierung von Zellmembranen und/oder Zellkernmembranen sowie zum Auswachen von nicht DNAgebundenen Proteinen aus Zellen verwendet werden, also beispielsweise in einem der vorstehend erläuterten Verfahren. Folglich dienen die Erläuterungen des Verfahrens auch zur Beschreibung der Waschflüssigkeit und mit der Waschflüssigkeit sind die Vorteile des Verfahrens entsprechend verbunden.

Bevorzugt kann als nichtionisches Detergens ein mildes Detergens verwendet werden. Milde Detergenzien weisen im Vergleich zu harschen Detergenzien eine geringere Tensidaktivität auf, sind weniger denaturierend und erhalten die Struktur von Proteinen besser.

Vorteilhaft wahrt die Waschflüssigkeit die Integrität der Zellen, wäscht unfixierte Proteine aus und ermöglicht eine intrazelluläre Proteinfärbung.

Durch die Cholesterin-Iösende und/oder Poren-induzierende Substanz kann die Permeabilisierung der Zell- und Kernmembran erhöht werden. Es können Poren in der Zell- und in der Kernmembran gebildet werden, die groß genug sind, um durchgängig für nicht an die DNA gebundene Proteinkomplexe zu sein, sodass diese aus der Zelle ausgewaschen werden können. Gleichzeitig bleiben die Zellen intakt und es kommt nicht zu einer Lyse der Zellen.

Gemäß verschiedenen Ausführungsvarianten kann die Waschflüssigkeit als Cholesterinlösende und/oder Poren-induzierende Substanz Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat und/oder ein Saponin, bevorzugt Digitonin, und/oder Leucoperm.

Das nichtionische Detergens kann die Auswaschung von nicht-gebundenen Proteinen unterstützen. Das nichtionische Detergens kann beispielsweise Octoxinol 9 sein.

Das in der vorgeschlagenen Waschflüssigkeit vorhandene Salz kann die Lösung von nicht kovalenten DNA-Protein-Bindungen und/oder von Protein-Protein-Bindungen verbessern.

Das Salz kann beispielsweise ausgewählt sein aus einer Gruppe umfassend NaCI, LiCI, KCl, MgCh und CaCh. Mit anderen Worten kann als Salz NaCI, LiCI, KCl, MgCh und/oder CaCh genutzt werden. NaCI und/oder LiCI ist bevorzugt.

Das Salz kann beispielsweise in einer höheren, nichtphysiologischen Konzentration in der Waschflüssigkeit vorliegen. Die Salzkonzentration in der Waschflüssigkeit kann im Bereich von 300 mM bis 700 mM liegen, beispielsweise im Bereich von 450 mM bis 550 mM. Die Salzkonzentration kann beispielsweise 550 mM betragen.

Alternativ kann das Salz in einer niedrigeren Konzentration in der Waschflüssigkeit vorliegen. Die Salzkonzentration in der Waschflüssigkeit kann im Bereich von 50 mM bis 100 mM liegen. Die Salzkonzentration kann beispielsweise 75 mM betragen.

Vorteilhafterweise ermöglicht die Erfindung erstmals die exklusive Quantifizierung von direkt an DNA gebundenen Proteinen in Einzelzellen eines Zellgemisches. Die Durchführung der Analyse zeichnet sich dabei durch eine hohe Simplizität und einen geringen Zeit- und Ressourcenaufwand aus. Zudem erlaubt das vorgeschlagene Verfahren die gleichzeitige Untersuchung mehrerer DNA-Bindeproteine pro Einzelzelle, was eine detaillierte Charakterisierung von Zellpopulationen ermöglicht.

Die UV-Laserstrahlung verändert die Bindungsstellen für Antikörper an Proteinen nicht, so dass durch das vorgeschlagene Verfahren die Verwendung vieler, sonst nicht verwendbarer Antikörper gegen die nativen Formen der Proteine und somit auch eine verbesserte Detektion ermöglicht wird.

Die bestrahlten Zellen werden porös und lassen sich schneller und einfacher permeabilisieren und färben. Das Eindringen und die Färbung von intrazellulären Proteinen durch farbmarkierte Antikörper wird im Gegensatz zur chemischen Fixierung, bei der die Zellen nur schwer zu permeabilisieren sind, verbessert.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil des vorgeschlagenen Verfahrens ist, dass Automatisierungsverfahren vereinfacht werden können. Zur chemischen Fixierung müssen Chemikalien den Zellen zugefügt und die Reaktion auch wieder durch Zugabe anderer Chemikalien gestoppt werden. Die Zugabe und Entfernung der Substanzen entfallen durch die Laser-induzierte optische Fixierung.

Die Technik kann in Kombination mit anderen Verfahren zur Bestimmung von zellulären Parametern wie Oberflächenmarkern oder anderen nicht auswaschbaren Proteinen, Fetten oder Nukleinsäuren verwendet werden.

Der Nachweis von direkter DNA-Bindung von Proteinen in der Hochdurchsatz- Einzelzellanalyse ist gegenwärtig durch alternative Methoden nicht möglich. Messmethoden, wie das intrazelluläre Färben von posttranslational modifizierten DNA- Bindeproteinen, können keine direkte DNA-Bindung nachweisen und benötigen modifikationsspezifische Antikörper, die nur für eine geringe Anzahl an Zielproteinen zur Verfügung stehen. Das vorgeschlagene Verfahren benötigt für den Nachweis der DNA- Bindung keine Antikörper gegen spezifische Proteinmodifikationen und kann somit potenziell für die Untersuchung aller DNA-Bindeproteine verwendet werden, für die spezifische Nachweisreagenzien (beispielsweise Antikörper) zur Verfügung stehen. Damit zielt dieser Messansatz auf ein breites Spektrum möglicher Untersuchungsobjekte für die zell- und molekularbiologische Forschung.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und zugehörigen Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigen

Fig. 1: ein vereinfachtes Ablaufschema eines beispielhaften Verfahrens;

Fig. 2: eine schematische Darstellung des Ablaufs eines beispielhaften Verfahrens;

Fig. 3: einen beispielhaften Versuchsaufbau zur Durchführung eines beispielhaften Verfahrens;

Fig. 4: die graphische Darstellung der Ergebnisse einer Durchflusszytometrie nach der Durchführung des beispielhaften Verfahrens; und

Fig. 5: eine Abbildung zur Mikrofluidik.

In Figur 1 ist ein vereinfachtes Ablaufschema eines beispielhaften Verfahrens 100 zur Fixierung von DNA-bindenden Proteinen in Zellen dargestellt. Dabei erfolgt in einem ersten Schritt 10 das Bereitstellen von Zielzellen. Im nachfolgenden Verfahrensschritt 11 werden die bereitgestellten Zielzellen mit UV-Strahlen einer Wellenlänge im Bereich von 240 nm bis 280 nm, bevorzugt im Bereich von 250 nm bis 270 nm, und einer Energiedichte im Bereich von 0,1 mJ/cm² bis 1000 mJ/cm², beispielsweise 5 mJ/cm² bis 1000 mJ/cm² oder 10 mJ/cm² bis 1000 mJ/cm², bevorzugt von 20 mJ/cm² bis 500 mJ/cm², besonders bevorzugt von 40 mJ/cm² bis 250 mJ/cm², bestrahlt, wodurch es zu kovalenten Quervernetzungen zwischen DNA und DNA-gebundenen Proteinen kommt. Die Zielzellen bleiben bei der Bestrahlung intakt. Es folgt im Verfahrensschritt 12 das Inkubieren der intakten Zielzellen in einer Waschflüssigkeit 200, wodurch die Kernmembran und die Zellmembran (weiter) permeabilisiert und nicht-DNA-gebundene Proteine aus den Zellen ausgewaschen werden. In einem letzten Schritt 13 erfolgt die Detektion der DNA-gebundenen Proteine in den intakten Zielzellen. Das Detektieren 13 kann dabei ein Quantifizieren der DNA-gebundenen Proteine umfassen.

Fig. 2 zeigt schematisch den Ablauf eines beispielhaften Verfahrens 100 zur Fixierung von DNA-bindenden Proteinen in Einzelzellen eines Zellgemisches 1. Das Verfahren 100 wird bei einer Temperatur von 4 °C, beispielsweise auf Eis, durchgeführt, um eventuelle Enzymaktivitäten niedrig zu halten.

In der Figur 2 ist in einem ersten Schritt a eine Einzelzelle/Zielzelle 2 dargestellt, welche exemplarisch aus einem Zellgemisch 1 hervorgehoben wurde. Die Zielzelle 2 weist einen Zellkern 2.1 mit einer Kernmembran 2.2 sowie den in dem Zellkern 2.1 befindlichen DNA- Strängen 2.4, üblicherweise in Form einer Doppelhelix vorliegend, auf. Die Zielzelle 2 ist von einer Zellmembran 2.3 umgeben. Die beschriebenen Komponenten der Zielzelle 2 sind der besseren Übersichtlichkeit halber lediglich im ersten Schritt a gekennzeichnet. In den späteren Schritten b-f werden die Komponenten lediglich einzeln hervorgehoben, sofern sie noch einmal für das Verständnis des beispielhaften Verfahrens 100 von Bedeutung sind.

Weiterhin in der Figur 2 zu erkennen und im ersten Schritt a einzeln gekennzeichnet sind Membranproteine 5.1, DNA-Bindeproteine 5.2 und Cofaktoren 5.3 (in Figur 2 in den Schritten a-d gepunktet dargestellt). Als Membranproteine 5.1 werden hierin membranständige Proteine bezeichnet, also Proteine, welche mit der Zellmembran 2.3 der Zielzelle 2 assoziiert sind, beispielsweise Rezeptoren, Transporter und/oder Kanäle. DNA-Bindeproteine 5.2 sind in der Lage, an den DNA-Strang 2.4 zu binden und sind als solche im Zellplasma frei beweglich, sowie in der Lage, die Kernmembran 2.2 zu passieren. Unter der Bezeichnung Cofaktor 5.3 werden hierin Proteine bezeichnet, welche direkt mit DNA-bindenden Proteinen interagieren. Diese werden, im Gegensatz zu chemischen Methoden, nicht durch UV-Laserstrahlung an das DNA-bindende Protein bzw. DNA-Bindeprotein 5.2 oder die DNA fixiert und somit in einem späteren Verfahrensschritt ausgewaschen. Im ersten Schritt a der Figur 2 ist beispielhaft ein Cofaktor 5.3 dargestellt, welcher mit einem DNA-gebundenen DNA-Bindeprotein 5.2 in Wechselwirkung steht. Auch Membranproteine 5.1, DNA-Bindeproteine 5.2 und Cofaktoren 5.3 sind der Übersichtlichkeit halber in Figur 2 lediglich im ersten Schritt a detailliert angetragen und werden in den Schritten b-f einzeln hervorgehoben, sofern sie noch einmal für das Verständnis des beispielhaften Verfahrens 100 von Bedeutung sind.

Nach dem Bereitstellen der in dem Zellgemisch 1 enthaltenen Zielzelle 2 wird das Zellgemisch 1 mit UV-Strahlen 3 bestrahlt. Die UV-Strahlen 3 liegen in Form von hochintensiven Laserstrahlen mit einer Wellenlänge im Bereich von 240 nm bis 280 nm, bevorzugt im Bereich von 250 nm bis 270 nm, und einer Energiedichte von wenigstens 10 mJ/cm², bevorzugt wenigstens 20 mJ/cm², besonders bevorzugt wenigstens 40 mJ/cm² pro Puls, vor. Die maximale Energiedichte beträgt 1000 mJ/cm².

Die Bestrahlung mit UV-Strahlen 3 bewirkt, dass ebensolche DNA-Bindeproteine 5.2, welche zum Zeitpunkt der Bestrahlung bereits an den DNA-Strang 2.4 gebunden vorliegen, nun eine kovalente Bindung zur DNA eingehen. Diese Proteine sind in Schritt b als kovalent an die DNA gebundene Proteine 5.4 schraffiert dargestellt. Gleichzeitig werden durch die UV-Strahlen 3 sowohl die Zellmembran 2.3 als auch die Kernmembran 2.2 porös, wodurch sich die Permeabilität der Zellmembran 2.3 und der Kernmembran 2.2 erhöht. Die Erhöhung der Permeabilität ist in Schritt c dargestellt, wobei die Schritte b und c üblicherweise zeitgleich stattfinden.

Im Anschluss werden die Zielzellen 2 in einer Waschflüssigkeit 200 inkubiert. Im Ausführungsbeispiel wird folgende Waschflüssigkeit 200 gewählt: 0,5 M NaCI, 0,02 M HEPES, 2 Ma.-% BSA, Proteaseinhibitor (z.B. 10 pg/mL Aprotinin, 10 pg/mL Leupeptin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)), 0,033 Ma.-% Digitonin, 0,1 Ma.-% Octoxinol 9, wobei selbstverständlich auch davon abweichende Zusammensetzungen verwendet werden können. Durch optional in der Waschflüssigkeit enthaltene Substanzen kann die Permeabilität der Zellmembran 2.3 und der Kernmembran 2.2 weiter erhöht werden. Insbesondere werden durch das Inkubieren der Zielzellen 2 in der Waschflüssigkeit sowohl Cofaktoren 5.3 als auch solche DNA-Bindeproteine 5.2 aus dem Zellkern 2.1 und aus der Zielzelle 2 ausgewaschen, welche nicht kovalent an die DNA gebunden vorliegen. In der Figur 2 wird das Auswaschen in Schritt d durch Pfeile grafisch verdeutlicht. Auch Cofaktoren 5.3, welche an kovalent an die DNA gebundene Proteine 5.4 gebunden vorliegen, werden ausgewaschen. In der Zielzelle 2 verbleiben lediglich die Membranproteine 5.1 sowie die kovalent an die DNA gebundenen Proteine 5.4.

In einem nächsten Schritt des beispielhaften Verfahrens 100, in Figur 2 dargestellt als Schritt e, erfolgt die Zugabe von Nachweisreagenzien 4 zu den Zielzellen 2, wobei die Nachweisreagenzien 4 beispielsweise als fluoreszenzmarkierte Antikörper vorliegen. Dabei können (auch zeitgleich) unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Antikörper für den Nachweis von verschiedenen kovalent an die DNA gebundenen Proteinen 5.4 verwendet werden. Auch die verbliebenen Membranproteine 5.1 können durch Nachweisreagenzien 4, wie beispielsweise fluoreszenzmarkierte Antikörper nachgewiesen werden.

Nach der Zugabe der Nachweisreagenzien 4 erfolgt in einem letzten Schritt (in Figur 2 dargestellt als Schritt f) eine Einzelanalyse im Hochdurchsatz, beispielsweise mittels Durchflusszytometrie und/oder Mikroskopie.

Im Ausführungsbeispiel werden 2,5 Mio Zellen in 200 pl PBS für 10 Sekunden mit einem Nd:YAG Laser bestrahlt. Der Laser leistet 30 mJ (variabel einstellbar) pro Puls bei einer Pulsfrequenz von 10 Hz (fest vorgegeben), einer Pulslänge von 5 ns (fest vorgegeben) und einem Strahlendurchmesser von 6 mm = 0,283 cm² (fest vorgegeben). Optische Vorbauten wie Linsen kommen bei dieser beispielhaft genannten Ausführungsform nicht zum Einsatz. Der Einsatz eines Prismas zum Umlenken des Strahls kann vorgesehen sein.

In Figur 3 ist ein beispielhafter Versuchsaufbau zur Durchführung des vorgeschlagenen Verfahrens 100, beispielsweise des vorstehend unter Bezugnahme auf Figur 2 beschriebenen Verfahrens 100, dargestellt. Ein Zellgemisch 1 mit Zielzellen 2 befindet sich in einem Flachbodenreaktionsgefäß und wird mittels eines Magnetrührers 9 in Suspension gehalten. Es erfolgt eine zeitlich begrenzte Bestrahlung der Zielzellen 2, beispielsweise für eine Dauer von 10 Sekunden, mit Hilfe eines Hochenergie-Lasers 6 mit einer Wellenlänge von 266 nm +/- 10 nm und einer Pulsfrequenz von 5 ns. Als Laser kann beispielsweise ein Neodym-dotierter Yttrium-Aluminium-Granat-Laser (Nd:YAG-Laser) verwendet werden. Die UV-Strahlen 3 passieren in dem dargestellten Ausführungsbeispiel zunächst einen Shutter 7 und anschließend ein Prisma 8, über welches sie auf das Zellgemisch 1 gelenkt werden. Durch die Anordnung verschiedener zusätzlicher Optiken kann die Photonendichte im Strahl erhöht werden, wodurch das Gerät stark verkleinert werden kann. Als zusätzliche Optiken können beispielsweise Linsen im Strahlengang zwischen Laser und Probe, d. h. den Zielzellen 2, angeordnet werden, wobei eine Anordnung unmittelbar vor der Probe, also vor den zu bestrahlenden Zellen, zu bevorzugen ist, um eine Beschädigung weiterer Optiken zu vermeiden. Eine Erhöhung der Leistungsdichte des Laserstrahls, z. B. durch eine Verengung oder Fokussierung mittels Optiken, wird dadurch erst unmittelbar vor der Probe vorgenommen, sodass ein Auftreffen von hochintensiver UV-Strahlung auf die Optiken und ein damit einhergehender Verschleiß vermieden werden können.

Figur 4 zeigt die graphische Darstellung der Ergebnisse einer Durchflusszytometrie nach der Durchführung des beispielhaften Verfahrens 100.

Der T ranskriptionsfaktor STAT 1 ist an der Hochregulierung von Genen aufgrund eines Signals Interferon-ß (IFNß bzw. IFNb) beteiligt. Als Reaktion auf IFN-ß-Stimulation bildet STAT1 ein Heterodimer mit STAT2, was in den Zellkern transloziert und ISRE- Promotorelemente (Interferon-Stimulated Response Element) binden kann. Die Bindung der Promotorelemente führt zu einer erhöhten Expression von ISG (Interferon-stimulierten Genen).

Zielzellen 2 wurden für 20 Minuten mit 100 ng/ml IFNß behandelt, um die STAT1-DNA- Bindung zu induzieren. Danach erfolgte die Proteinfixierung durch UV-Bestrahlung gemäß dem beispielhaften Verfahren und die Färbung von STAT1 Protein mittels eines spezifischen Allophycocyanin (APC)-gekoppelten STAT1 -Antikörpers. Die UV- Bestrahlung sowohl der unbehandelten als auch der IFNß behandelten Zellen erfolgte mit steigenden Dosen. Es erfolgte eine Vermessung mittels eines Durchflusszytometers.

Fig. 4a zeigt die Ergebnisse bei einer Bestrahlung mit 0 mW (also effektiv erfolgte keine Bestrahlung der Zielzellen). Der Anteil an STAT1 positiven Zellen betrug 27,3 %, das heißt, bei 27,3 % der Zellen konnten STAT1 -Proteine nachgewiesen werden.

Fig. 4b zeigt die Ergebnisse bei einer Bestrahlung mit 100 mW. Der Anteil an STAT1 positiven Zellen betrug 51,6 %, das heißt bei 51,6 % der Zellen konnten STAT1 -Proteine nachgewiesen werden. Fig. 4c zeigt die Ergebnisse bei einer Bestrahlung mit 400 mW. Der Anteil an STAT 1 positiven Zellen betrug 89,3%, das heißt bei 89,3% der Zellen konnten STAT1 -Proteine nachgewiesen werden.

Ausführungsbeispiel 1 : Bedeutung des vorgeschlagenen Verfahrens für den Nachweis von akuter Promyelozyten-Leukämie

Die akute promyelozytäre Leukämie (APL) ist eine Unterform der akuten myeloischen Leukämie. Sie ist gekennzeichnet durch eine Blockade der Differenzierung von myeloischen Vorläuferzellen zu reifen Zellen der myeloischen Linie und eine verstärkte Proliferation. Ungefähr 97% der APL-Patienten tragen die chromosomale Translokation t(15; 17), was zur Produktion des Promyelozyten-Leukämie-Proteins (PML) - Retinoic Acid Receptor Alpha (RARA) Fusionsproteins (PML-RARA) führt, das für die Bösartigkeit verantwortlich ist. Aufgrund des aggressiven Krankheitsverlaufs und der frühen lebensbedrohlichen hämorrhagischen und thrombotischen Komplikationen gilt sie als medizinischer Notfall.

Vollständiges Blutbild, Untersuchung der Gerinnungsparameter, peripherer Blutausstrich, Knochenmarkspunktion und Immunphänotypisierung werden bei allen Patienten empfohlen, die mit Verdacht auf Leukämie ins Krankenhaus aufgenommen werden. Obwohl die Ergebnisse dieser Tests auf eine APL hindeuten können, ist eine genetische Untersuchung obligatorisch, da das Vorhandensein der PML-RARA-Fusion das Ansprechen auf eine ATRA/ATO-Behandlung [Chemotherapie-freie Behandlung mit all- trans-Retinsäure (ATRA) und Arsentrioxid (ATO)] bestimmt.

Daher sind der Zugang zu einer frühzeitigen Behandlung und die Bestätigung der genetischen Diagnose entscheidend und lebensrettend für Patienten mit APL. Aufgrund der Risiken, die die Krankheit im Frühstadium birgt, und der hohen Wirksamkeit der Behandlung wird allen Patienten, bei denen eine akute myeloische Leukämie diagnostiziert wird, ein Test auf APL empfohlen.

Derzeit gibt es mehrere Strategien, die in der Klinik aktiv für die Identifizierung von PML- RARA Rearrangement eingesetzt werden: Konventionelle Karyotypisierung, Fluoreszenz- in-situ-Hybridisierung (FISH), reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT- PCR), oder monoklonale Anti-PML-Antikörper. All diese Methoden sind jedoch zeitaufwendig und lassen sich nicht ohne weiteres automatisieren.

Konventionelle Durchflusszytometrie kann zur Färbung von PML in APL-Zellen verwendet werden, aber aufgrund der nicht-selektiven Quervernetzung mit Formaldehyd wird das PML-RARA-Fusionsprotein überall in der Zelle fixiert. Deshalb kann daher nicht zwischen gesunden PML-haltigen Zellen und PML-RARA-mutierten APL-Zellen unterschieden werden.

In dem vorgeschlagenen Verfahren werden die Proteine ausschließlich mit der DNA vernetzt. RARA, aber nicht PML, kann an DNA binden. Daher kann durch UV- Laserbestrahlung nur die PML-RARA-Fusion, nicht aber PML in gesunden Zellen fixiert werden. Nach dem Auswaschen des nicht vernetzten PML werden durch konsekutive Färbung die PML-RARA-haltigen APL-Zellen sichtbar gemacht, was eine frühzeitige spezifische Behandlung von APL-Patienten mit all-trans-Retinsäure (ATRA) und Arsentrioxid (ATO) ermöglicht.

Das Auswaschen der Zellen kann beispielsweise mit einem wässrigen Waschflüssigkeit, beispielsweise einem Waschpuffer, bestehend aus 0,5 M NaCI, 0,02 M HEPES, 2 Ma.-% BSA, Proteaseinhibitor, 0,033 Ma.-% Digitonin, RNaseA 50 .g/ml erfolgen. Optional kann 0,1 Ma.-% Octoxinol 9 als nichtionisches Detergens hinzugefügt werden. Die Detektion des PML-RARA Fusionsproteins kann mit einem gegen PML gerichteten, farbstoffmarkierten Antikörper erfolgen.

Ausführungsbeispiel 2: Überwachung der Krebsbehandlung mit DNA- Demethylierungsmitteln durch das vorgeschlagene Verfahren

Die DNA-Methylierung ist einer der gut definierten Mechanismen bei der epigenetischen Kontrolle der Genexpression. Eine Gruppe von DNA-bindenden Enzymen, den DNA- Methyltransferasen (DNMT), katalysiert die DNA-Methylierung durch die kovalente Anlagerung einer Methylgruppe an den 5-Kohlenstoff des Cytosinrings, was zur 5 Methylcytosin (5mC)- Bildung in CpG-Regionen führt. Es wird angenommen, dass die DNA-Methylierung die Genexpression entweder durch die direkte Beeinträchtigung der Bindung von Transkriptionsfaktoren (TF) an CpG-Regionen oder indirekt durch die Proteine, die methylierte CpGs erkennen, blockiert.

Die nicht-mutative epigenetische Umprogrammierung ist eines der sich abzeichnenden Kennzeichen und wird als eines der entscheidenden Merkmale bei Krebs definiert. Eine abweichende Hypermethylierung von Tumorsuppressorgenen ist in hohem Maße an der Entstehung und dem Wachstum von Krebs beteiligt, was diesen Mechanismus zu einem attraktiven Ziel für die Entwicklung von Therapieansätzen macht. Die nukleosidanalogen DNMT-Inhibitoren 5-Azacytidin (Azacitidin) und 5-Aza-2'-Desoxycytidin (Decitabin) werden im Zusammenhang mit dem myelodysplastischen Syndrom (MDS) und der akuten myeloischen Leukämie (AML) ausgiebig untersucht und in die aktuellen Behandlungsleitlinien aufgenommen. Diese Wirkstoffe bauen sich in die DNA ein und binden an DNMTs, was zum Abbau von DNMT führt. Azacitidin zielt auf DNMT 1 , während Decitabin sowohl DNMT1 als auch 3A angreifen kann. Nach dem DNMT-Abbau kann die DNA-Methylierung nicht aufrechterhalten werden, und die CpGs verlieren ihre Methylierung nach der Zellreplikation, was zu Veränderungen bei der TF-Bindung und zur Aktivierung von zuvor zum Schweigen gebrachten Transkriptionsprogrammen führt.

Das vorgeschlagene Verfahren kann eingesetzt werden, um die Demethylierungsreaktion und die Bindungsdynamik von Transkriptionsfaktoren nach der Behandlung mit Demethylierungsmitteln aktiv zu überwachen. Dabei erfolgt der Nachweis der direkten Bindung von Transkriptionsfaktoren an die DNA. Bei konventionellen Durchflusszytometrie-Anwendungen können Transkriptionsfaktoren und intrazelluläre Proteine leicht nachgewiesen werden, aber diese Protokolle beruhen auf der Fixierung der Zellen mit Formaldehyd. Formaldehyd erzeugt nicht-selektive Querverbindungen zwischen Proteinen und Protein-Nukleinsäuren in der Zelle, was den Nachweis direkter Protein-Nukleinsäure-Interaktionen unmöglich macht. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird anstelle der Formaldehyd-Vernetzung die photochemische Vernetzung durch hochintensive UV-Laserstrahlung verwendet, die nur Vernetzungen zwischen Protein-Nukleinsäure-Molekülen erzeugt, die in unmittelbarem Kontakt stehen.

Nach der photochemischen UV-Vernetzung werden die Zellen permeabilisiert und die nicht vernetzten Moleküle ausgewaschen, gefolgt von der Markierung der interessierenden Transkriptionsfaktorsätze und Oberflächenantigene mit Fluorochrom- konjugierten Antikörpern. Beispielsweise können hierbei DNMT3A- und/oder MeCP2- Antikörper verwendet werden. Die Fluoreszenzsignale werden mit konventioneller Durchflusszytometrie gemessen und analysiert.

DNMT1 ist die am häufigsten vorkommende DNMT, die hauptsächlich für die Aufrechterhaltung der Methylierung verantwortlich ist und die durch DNA- Demethylierungsmittel angegriffen werden kann. NRF1 ist ebenfalls ein einzigartiger methylierungssensitiver Transkriptionsfaktor, der nur an unmethylierte DNA binden kann. Es hat sich gezeigt, dass er in Zellen mit niedrigem Methylierungsstatus und bei globaler Entfernung der DNA-Methylierung mehr Bindungsstellen aufweist. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann in den Leukämiezellen, die mit demethylierenden Medikamenten behandelt werden, eine Herunterregulierung von DNMT1 und eine verstärkte Bindung von NRF1 an die DNA nachgewiesen werden.

Fig. 5 zeigt eine Vorrichtung mit Mikrofluidik 19, die ebenfalls zur Durchführung der vorstehend erläuterten Verfahren 100 genutzt werden kann. Die Vorrichtung weist ein erstes Reservoir 14 auf, in dem die zu behandelnden Zielzellen 2 als Zellsuspension vorliegen. Zudem weist die Vorrichtung ein zweites Reservoir 15 mit Zellen mit fixierten DNA-gebundenen Proteinen auf. Über einen Zulaufschlauch 16 gelangen die zu behandelnden Zielzellen 2 der Zellsuspension vom ersten Reservoir 14 in den Kanal 20, welcher der Vereinzelung der Zellen dient und entsprechend dimensioniert ist. In dem Kanal 20 werden DNA-bindende Proteine der Zielzellen 2 fixiert, bevor die Zielzellen 2 über den Ablaufschlauch 17 in das zweite Reservoir 15 abgeführt werden. Die entsprechende Fließrichtung ist in Fig. 5 durch einen Pfeil 21 gekennzeichnet.

Zur Behandlung der Zielzellen 2 ist im Kanal 20 ein Quarzfenster 18, d. h. ein Fenster aus UV-Strahlen durchlässigem Quarzglas, vorgesehen. Befindet sich eine Zielzelle 2 im Bereich des Quarzfensters 18, so kann sie mittels UV-Strahlen 3, die von einer Laserquelle 6 emittiert und über einen Shutter 7 und ein Prisma 8 bis zum Quarzfenster 18 gelangen, derart behandelt werden, dass die in der Zielzelle 2 enthaltenen DNAbindenden Proteine fixiert werden.

Nachfolgend können die behandelten Zielzellen 2 im Reservoir 15 der Waschflüssigkeit 200 ausgesetzt werden, um wie bereits erläutert, nicht fixierte Zellbestandteile auszuwaschen. Weiter nachfolgend können die fixierten DNA-gebundenen Proteine detektiert werden, wofür eine Proteinfärbung verwendet werden kann.

Einige Aspekte der vorliegenden Erfindung können wie folgt zusammengefasst werden:

Das vorgeschlagene Verfahren ermöglicht, dass die Einzelzellen der Zellgemische erhalten bleiben und nicht lysiert werden. Die Detektion der DNA-Proteinbindung findet in der „äußerlich intakten“ Zelle statt. Dies stellt einen fundamentalen Unterschied zu allen bislang publizierten Methoden dar.

Folgende Einflussfaktoren können dies begünstigen:

1. Die Zellen können spezifisch bestrahlt werden, um ein effizientes Crosslinking (Vernetzen) von Proteinen und DNA zu gewährleisten, während die Integrität der Zellen bestehen bleibt und die Epitope der zu detektierenden Proteine nicht beschädigt werden. a. Bestrahlung kann in kalter Flüssigkeit erfolgen, um Schädigungen der Zellmembran und der zu detektierenden Proteine zu limitieren; b. Bestrahlung erfolgt mit einer Obergrenze der Energiedichte von 1000 mJ/cm², um die Integrität der Zellen zu gewährleisten und die Schädigung der mittels Antikörper zu detektierenden Epitope der Proteine zu verhindern; c. Bestrahlung kann mit langen Laserpulsen (ps or ns) erfolgen: Ein effizientes Crosslinking erfolgt in intakten Zellen bevorzugt mittels langer Pulse. Femtosekunden Pulse sind zumeist ineffizient in intakten Zellen. d. Optimales Crosslinking erfolgt durch die einmalige Bestrahlung einer Zelle, da Mehrfachbestrahlung generierte Crosslinks wieder zerstören kann. i. Bestrahlung der Zellen kann in Suspension in einem Tube mit Rührer erfolgen: Zellkonzentration und Bestrahlungsdauer (z.B. 10 Mio Zellen in 200 ml, 5 see x 10 Hz = 50 Pulse bei 500 rpm Rühren) können genau eingestellt werden, damit die Mehrzahl der Zellen nur einmal vom Laser getroffen werden. ii. Alternative Microfluidik: Der Zelldurchfluss kann so eingestellt werden, dass jede Zelle genau von einem Puls getroffen wird. 2. In den Zellen können mittels eines spezifischen Verfahrens Poren generiert werden, die groß genug sind, um nicht-gecrosslinkte Proteinkomplexe zu entfernen, während die Zellen intakt bleiben; nicht-kovalente DNA-Protein und Protein-Protein Bindungen gelöst werden und nicht- kovalent an der DNA fixierte Proteine mechanisch ausgewaschen werden. a. Porengenerierung, z. B. mittels Digitonin etc. b. Auswaschen nicht- kovalent an DNA gebundener Proteine in der intakten Zelle. Dies kann durch die Auswahl des Puffers und die Art und Weise der Durchführung des mechanischen Waschverfahrens beeinflusst werden.

Verschiedene Aspekte der Erfindung betreffen

1. Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von DNA-gebundenen Proteinen in Einzelzellen eines Zellgemisches (1), aufweisend die Schritte a) Bereitstellen von Zielzellen (2), b) Bestrahlen der Zielzellen (2) mit UV-Strahlen (3) einer Wellenlänge im Bereich von 240 nm bis 280 nm, bevorzugt im Bereich von 250 nm bis 270 nm und einer Energiedichte von wenigstens 5 mJ/cm², bevorzugt wenigstens 15 mJ/cm², besonders bevorzugt wenigstens 30 mJ/cm2, und c) Inkubieren der Zielzellen (2) in einem Waschpuffer.

2. Verfahren nach Aspekt 1 , wobei das Bestrahlen der Zielzellen (2) mit gepulster UV-Laserstrahlung erfolgt.

3. Verfahren nach Aspekt 1 oder 2, wobei zum Bestrahlen der Zielzellen (2) ein UV- Laser in Kombination mit wenigstens einem lichtoptischen und/oder elektronenoptischen System verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 3, wobei der Waschpuffer wenigstens eine Cholesterin-Iösende und/oder Poren-induzierende Substanz, bevorzugt Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat und/oder ein Saponin, bevorzugt Digitonin, und/oder Leucoperm enthält. 5. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 4, wobei nach dem Inkubieren der Zielzellen (2) in einem Waschpuffer eine Zugabe wenigstens eines Nachweisreagenz (4), bevorzugt eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers, zu den bestrahlten Zielzellen (2) erfolgt, wobei das Nachweisreagenz (4) mit kovalent an die DNA gebundenen Proteinen (5.4) in Wechselwirkung tritt.

6. Verfahren nach Aspekt 5, wobei nach der Zugabe wenigstens eines Nachweisreagenz (4) die Detektion einer Wechselwirkung zwischen dem Nachweisreagenz (4) und den kovalent an die DNA gebundenen Proteinen (5.4) erfolgt, bevorzugt mittels Durchflusszytometrie und/oder Mikroskopie.

7. Verfahren nach einem der Aspekte 1 bis 6, wobei zumindest einzelne Verfahrensschritte in einer Multiwell-Platte oder in oder auf einem mikrofluidischen Bauteil durchgeführt werden.

Der hier verwendete Ausdruck „und/oder“, wenn er in einer Reihe von zwei oder mehreren Elementen benutzt wird, bedeutet, dass jedes der aufgeführten Elemente alleine verwendet werden kann, oder es kann jede Kombination von zwei oder mehr der aufgeführten Elemente verwendet werden. Wird beispielsweise eine Zusammensetzung beschrieben, die die Komponenten A, B und/oder C, enthält, kann die Zusammensetzung A alleine; B alleine; C alleine; A und B in Kombination; A und C in Kombination; B und C in Kombination; oder A, B, und C in Kombination enthalten.

Es versteht sich, dass andere Ausführungsformen benutzt und strukturelle oder logische Änderungen vorgenommen werden können, ohne von dem Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die vorstehende Beschreibung ist deshalb nicht in einschränkendem Sinne aufzufassen, und der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung wird durch die angefügten Ansprüche definiert.

Bezugszeichenliste

Zellgemisch

Zielzelle

Zellkern

Kernmembran

Zellmembran

DNA-Strang

UV-Strahlen

Nachweisreagenz

Membranprotein

DNA-Bindeprotein

Cofaktor

Kovalent an die DNA gebundenes Protein

Laserquelle

Shutter

Prisma

Magnetrührer

Bereitstellen von Zielzellen

Bestrahlen der Zielzellen

Inkubieren der Zielzellen

Detektieren erstes Reservoir zweites Reservoir

Zulaufschlauch

Ablaufschlauch

Quarzfenster

Mikrofluidik

Kanal

Fließrichtung

Verfahren

Waschflüssigkeit

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren (100) zur Fixierung von DNA-bindenden Proteinen (5.2) in Zellen, das Verfahren (100) aufweisend die Schritte: a) Bereitstellen (10) von Zielzellen (2), b) Bestrahlen (11) der Zielzellen (2) mit UV-Strahlen (3) einer Wellenlänge im Bereich von 240 nm bis 280 nm und einer Energiedichte im Bereich von 0,01 mJ/cm² bis 1000 mJ/cm², c) Inkubieren (12) der Zielzellen (2) in einer Waschflüssigkeit (200) und Auswaschen von nicht DNA-gebundenen Proteinen aus den Zielzellen (2).

2. Verfahren (100) nach Anspruch 1 , aufweisend: d) Detektieren (13) von kovalent DNA-gebundenen Proteinen (5.4) in den Zielzellen (2).

3. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bestrahlen der Zielzellen (2) mit gepulster UV-Laserstrahlung erfolgt.

4. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei beim Bestrahlen der Zielzellen (2) die Mehrzahl der Zielzellen (2) genau einmal bestrahlt wird.

5. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei zum Bestrahlen der Zielzellen (2) ein UV-Laser in Kombination mit wenigstens einem lichtoptischen und/oder elektronenoptischen System verwendet wird.

6. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Waschflüssigkeit (200) wenigstens eine Cholesterin-Iösende und/oder eine Poreninduzierende Substanz, enthält.

7. Verfahren (100) nach Anspruch 6, wobei die Cholesterin-Iösende und/oder Poreninduzierende Substanz Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat und/oder ein Saponin ist.

8. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Waschflüssigkeit (200) wenigstens ein nichtionisches Detergens enthält.

9. Verfahren (100) nach Anspruch 8, wobei das nichtionische Detergens Octoxinol 9 ist.

10. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Waschflüssigkeit (200) wenigstens ein Salz enthält.

11. Verfahren (100) nach Anspruch 10, wobei das Salz ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend NaCI, LiCI, KCl, MgCh und CaCh.

12. Verfahren (100) nach Anspruch 10 oder 11 , wobei die Konzentration des Salzes in einem Bereich von 300 mM bis 700 mM, bevorzugt in einem Bereich von 450 mM bis 550 mM, liegt.

13. Verfahren (100) nach Anspruch 10 oder 11 , wobei die Konzentration des Salzes in einem Bereich von 50 mM bis 100 mM, bevorzugt in einem Bereich von 75 mM bis 100 mM, liegt.

14. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Inkubieren (12) der Zielzellen (2) in der Waschflüssigkeit (200) unter durchgängiger Bewegung der Zellen (2) erfolgt.

15. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Inkubieren (12) der Zielzellen (2) in der Waschflüssigkeit (200) für einen Zeitraum von 5 Minuten bis 60 Minuten erfolgt.

16. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bestrahlen (11) der Zielzellen (2) mit UV-Strahlen (3) einer Wellenlänge im Bereich von 250 nm bis 270 nm erfolgt.

17. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bestrahlen (11) der Zielzellen (2) mit UV-Strahlen (3) einer Energiedichte im Bereich von 5 mJ/cm² bis 1000 mJ/cm², bevorzugt von 40 mJ/cm² bis 250 mJ/cm², erfolgt.

18. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei zumindest einzelne Verfahrensschritte (10, 11 , 12, 13) in einer Multiwell-Platte oder in einem mikrofluidischen Bauteil oder auf einem mikrofluidischen Bauteil durchgeführt werden.

19. Verfahren (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Bestrahlen (11) der Zielzellen (2) bei einer Temperatur von maximal 10 °C erfolgt.

20. Verfahren (100) nach einem der Ansprüche 2 bis 19, wobei das Detektieren (13) der kovalent DNA-gebundenen Proteine eine Zugabe wenigstens eines Nachweisreagenz (4) zu den bestrahlten Zielzellen (2) umfasst, wobei das Nachweisreagenz (4) mit den kovalent DNA-gebundenen Proteinen (5.4) in Wechselwirkung tritt.

21. Verfahren (100) nach Anspruch 20, wobei das Nachweisreagenz (4) mindestens einen fluoreszenzmarkierten Antikörper aufweist.

22. Verfahren (100) nach Anspruch 20 oder 21 , wobei nach der Zugabe des wenigstens einen Nachweisreagenz (4) ein Detektieren (13) einer Wechselwirkung zwischen dem Nachweisreagenz (4) und den kovalent DNAgebundenen Proteinen (5.4) erfolgt.

23. Verfahren (100) nach Anspruch 22, wobei das Detektieren (13) der Wechselwirkung mittels Durchflusszytometrie und/oder Mikroskopie erfolgt.

24. Waschflüssigkeit (200) aufweisend: a) wenigstens eine Cholesterin-Iösende und/oder Poren-induzierende Substanz, b) wenigstens ein nichtionisches Detergens, und c) wenigstens ein Salz.

25. Waschflüssigkeit (200) nach Anspruch 24, wobei die Cholesterin-Iösende und/oder Poren-induzierende Substanz Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat und/oder ein Saponin ist.

26. Waschflüssigkeit (200) nach Anspruch 24 oder 25, wobei das nichtionische Detergens Octoxinol 9 ist.

27. Waschflüssigkeit (200) nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei das Salz ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend NaCI, LiCI, KCl, MgCh und CaCh.

28. Waschflüssigkeit (200) nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die Konzentration des Salzes in einem Bereich von 300 mM bis 700 mM, bevorzugt in einem Bereich von 450 mM bis 550 mM, liegt.

29. Waschflüssigkeit (200) nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die Konzentration des Salzes in einem Bereich von 50 mM bis 100 mM, bevorzugt in einem Bereich von 75 mM bis 100 mM, liegt.

30. Verwendung einer Waschflüssigkeit (200) nach einem der Ansprüche 24 bis 29 zur Inkubation von Zellen.

31. Verwendung einer Waschflüssigkeit (200) nach einem der Ansprüche 24 bis 29 zur Permeabilisierung von Zellmembranen und/oder Zellkernmembranen.

32. Verwendung einer Waschflüssigkeit (200) nach einem der Ansprüche 24 bis 29 zum Auswaschen von nicht DNA-gebundenen Proteinen aus Zellen.