EP4689059A1 - Bacteries clostridium modifiees, outil d'edition genetique du plasmide psol de bacteries clostridium, et utilisations - Google Patents

Bacteries clostridium modifiees, outil d'edition genetique du plasmide psol de bacteries clostridium, et utilisations

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Publication number
EP4689059A1
EP4689059A1 EP24722062.7A EP24722062A EP4689059A1 EP 4689059 A1 EP4689059 A1 EP 4689059A1 EP 24722062 A EP24722062 A EP 24722062A EP 4689059 A1 EP4689059 A1 EP 4689059A1
Authority
EP
European Patent Office
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bacterium
psol
plasmid
genus clostridium
sequence
Prior art date
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Pending
Application number
EP24722062.7A
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German (de)
English (en)
Inventor
François WASELS
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IFP Energies Nouvelles IFPEN
Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
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Filing date
Publication date
Application filed by IFP Energies Nouvelles IFPEN filed Critical IFP Energies Nouvelles IFPEN
Publication of EP4689059A1 publication Critical patent/EP4689059A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01157—3-Hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (1.1.1.157)

Definitions

  • the present invention relates to the genetic modification of bacteria of the genus Clostridium, typically solvent-producing bacteria of the genus Clostridium, and the possible use of a genetic editing tool suitable for modifying the pSOL megaplasmid within said bacteria. It further relates to methods, tools and kits for removing, modifying or introducing sequence(s) coding for, or controlling the transcription of sequence(s) coding for, products of interest, the genetically modified bacteria obtained and their uses, in particular for producing one or more biosourced molecules, for example a solvent, a biofuel or any (bio)chemical intermediate product.
  • Clostridium Gram-positive, strict anaerobic bacilli capable of forming endospores and belonging to the phylum Firmicutes. This genus contains many species studied because of their pathogenic nature or their industrial and medical interest.
  • the so-called industrially interesting, non-pathogenic Clostridium species are capable of producing compounds of interest such as acids and solvents from a wide variety of sugars and substrates ranging from glucose to cellulose.
  • the growth of solvent-producing Clostridium bacteria is said to be biphasic. Acids are produced during the acidogenesis phase, which corresponds to the exponential growth phase.
  • Clostridium acetobutylicum is naturally capable of producing a mixture of ethanol, acetone and n-butanol during a so-called ABE fermentation ( Figure 1).
  • C. acetobutylicum is considered a model organism for the study of solvent-forming microorganisms, due to the relatively high titres obtained during fermentations. Its genome was sequenced in 2001, and consists of a chromosome and the 180 Kb megaplasmid pSOL (Nölling J.
  • CRISPR-Cas9 The strength of the CRISPR-Cas9 tool lies in the ability of the Cas9 nuclease to create a double-stranded break within the targeted nucleic acid at a specific site.
  • an essential nucleic acid — such as the chromosome — is targeted, the microorganism will only be able to survive by repairing this break, via a modification of the targeted sequence using a provided editing template.
  • the modification described in the present invention and which gives the pSOL megaplasmid its essential character can be canceled by reintroducing the deleted genetic information using a genetic tool such as the CRISPR-Cas9 tool for example.
  • a genetic tool such as the CRISPR-Cas9 tool for example.
  • the inventors describe, in the context of the present invention, bacteria of the genus Clostridium, typically solvent-forming bacteria, whose megaplasmid pSOL can be genetically modified.
  • the inventors describe the use of a genetic editing tool, preferably the CRISPR-Cas tool, for genetically modifying the plasmid pSOL of a bacterium belonging to the genus Clostridium, in particular Clostridium acetobutylicum, said bacterium being distinguished from the wild-type strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential for its survival.
  • a particular chromosomal modification, preferred in the case of C. acetobutylicum, is the deletion or inactivation of the hbd gene.
  • a particular genetically modified bacterium not expressing the product of the hbd gene does not express the product of the gene of sequence SEQ ID NO: 34, or expresses a non-functional version of said product.
  • a particular bacterium described by the inventors in the present text further does not express the pdc gene of sequence SEQ ID NO: 35 or expresses a non-functional version thereof.
  • the particular genetically modified bacterium not expressing the product of the hbd gene or expressing a non-functional version of said product can indeed be advantageously used to obtain a bacterium not further expressing a nucleic acid present on the pSOL megaplasmid, for example a non-essential nucleic acid such as the pdc gene, or expressing a non-functional version thereof.
  • a particularly preferred genetically modified bacterium according to the invention corresponds to the strain identified in the present description as IFP 969, as registered on February 17, 2023 under the deposit number LMG P-32993 with the BCCM-LMG collection (also identified in the present text as " ⁇ hbd").
  • the invention also relates to any bacterium derived, cloned, mutant or genetically modified version thereof.
  • the inventors further describe methods for producing a recombinant bacterium as described in the present text, in particular methods comprising the deletion or inactivation of the hbd gene, so as to prevent or decrease the expression of the corresponding functional protein.
  • the inventors further describe the plasmids pCas9acr of sequence SEQ ID NO: 23, pEC750C of sequence SEQ ID NO: 24, pGRNAind of sequence SEQ ID NO: 25, pGRNAcon of sequence SEQ ID NO: 26, pAN2 of sequence SEQ ID NO: 27, pGRNA-hbd of sequence SEQ ID NO: 28, pGRNA- ⁇ hbd of sequence SEQ ID NO: 29, pGRNA-pdc of sequence SEQ ID NO: 30, pGRNA- ⁇ pdc of sequence SEQ ID NO: 31 and pGRNA-C ⁇ hbd of sequence SEQ ID NO: 32, as well as the use of one, several or all of them for transforming, and preferably genetically modifying, a bacterium of the genus Clostridium so as to improve its capacity for producing molecule(s).
  • the invention relates in particular to a CRISPR tool, in particular CRISPR-Cas, for transforming and genetically modifying a bacterium.
  • This genetic tool comprises a nuclease capable of targeting the pSOL megaplasmid. It further comprises i) a guide RNA (gRNA) comprising an RNA structure for attachment to the Cas enzyme and a sequence complementary to a portion of the pSOL plasmid targeted by the Cas enzyme, and ii) a repair matrix allowing, by a homologous recombination mechanism, the replacement of the targeted portion within pSOL by a sequence of interest.
  • gRNA guide RNA
  • the invention also relates to allelic exchange tools, such as the ACE® tool, for transforming and genetically modifying a bacterium.
  • This genetic tool comprises i) a selection marker, ii) a counter-selection marker and iii) a nucleic acid, allowing, by a homologous recombination mechanism, to modify the recognized portion or to replace the recognized portion within pSOL by a sequence of interest.
  • the invention also relates to a method for transforming, and preferably genetically modifying, a bacterium belonging to the genus Clostridium comprising a pSOL plasmid in the wild state, as well as the genetically modified bacterium capable of being obtained by this method.
  • Said method comprises a step of transforming the bacterium by introducing into said bacterium a plasmid selected from the plasmids pCas9acr of sequence SEQ ID NO: 23, pEC750C of sequence SEQ ID NO: 24, pGRNAind of sequence SEQ ID NO: 25, pGRNAcon of sequence SEQ ID NO: 26, pAN2 of sequence SEQ ID NO: 27, pGRNA-hbd of sequence SEQ ID NO: 28, pGRNA- ⁇ hbd of sequence SEQ ID NO: 29, pGRNA-pdc of sequence SEQ ID NO: 30, pGRNA- ⁇ pdc of sequence SEQ ID NO: 31 and pGRNA-C ⁇ hbd of sequence SEQ ID NO: 32.
  • said method also comprises a step of deleting or inactivating a gene making the presence of the plasmid pSOL essential for the survival of said bacterium, or involves otherwise a recombinant bacterium of the genus Clostridium already comprising a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential for its survival.
  • the inventors also describe the use of a bacterium belonging to the genus Clostridium distinguished from the corresponding wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential for its survival, in a method of genetically modifying a bacterium of the genus Clostridium, or for manufacturing a genetically modified derived bacterium.
  • bacterium belonging to the genus Clostridium distinguished from the corresponding wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential for its survival, or of a bacterium whose chromosomal modification having made the presence of the plasmid pSOL essential for the survival of said bacterium has been corrected, for producing a biosourced molecule or a mixture of biosourced molecules, for example a solvent, a biofuel or a mixture of fuels, in particular on an industrial scale.
  • the invention also relates to a fermentation process involving the use of a genetically modified bacterium as described in the present text, typically a bacterium belonging to the genus Clostridium distinguished from the wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential to its survival, or a bacterium whose chromosomal modification having made the presence of the plasmid pSOL essential to the survival of said bacterium has been corrected.
  • a genetically modified bacterium as described in the present text, typically a bacterium belonging to the genus Clostridium distinguished from the wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential to its survival, or a bacterium whose chromosomal modification having made the presence of the plasmid pSOL essential to the survival of said bacterium has been corrected.
  • kits in particular a kit for transforming and preferably genetically modifying a bacterium belonging to the genus Clostridium, and a kit for producing a biosourced molecule, for example a solvent, a biofuel or any (bio)chemical intermediate product, using a bacterium belonging to the genus Clostridium, said kit comprising i) a bacterium belonging to the genus Clostridium according to the invention, in particular a bacterium distinguished from the wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential to its survival or a bacterium whose chromosomal modification having made the presence of the plasmid pSOL essential to the survival of said bacterium has been corrected, and ii) a preservation medium or a culture medium for said bacterium, in particular a suitable culture medium containing a sugar or a mixture of sugars, preferentially a hexose and/or a pentos
  • Clostridium acetobutylicum bacterium is considered to be a model representative of solventogenic Clostridia
  • the experimental data disclosed in the context of the present description provide a proof of concept to those skilled in the art.
  • Such a modification strategy had never been used until now in C. acetobutylicum.
  • the inventors thus reveal for the first time that the pSOL megaplasmid is essential in a C. acetobutylicum strain whose hbd gene has been inactivated (also identified in the present text as a “ ⁇ hbd” strain).
  • the chromosomal modification that made the presence of the pSOL plasmid essential for bacterial survival can easily be corrected (for example, the deleted hbd gene can be reintroduced) into the genome at its original locus, thus making it possible to obtain a microorganism that only has the genetic modifications of interest, for example modifications that improve its ability to produce a biofuel or a biosourced molecule, such as for example a solvent or a chemical intermediate product, from a biomass or from a dedicated energy crop.
  • biosourced molecule means a molecule, such as an alcohol or ketone, the specificity of which is that the raw material used for its production must necessarily come from plant biomass, for example from lignocellulosic biomass, and not from resources of fossil origin such as oil, coal or natural gas.
  • the implementation of the present invention may, more generally, be envisaged for modifying any non-essential genetic element, such as the pSOL plasmid, since a prior chromosomal modification has made it possible to make said "non-essential genetic element” essential for the survival of the bacterium (in at least one given culture condition of said bacterium).
  • the present description thus relates in particular to the use of a genetic editing tool, preferably a CRISPR tool, involving an (endo)nuclease capable of targeting the pSOL megaplasmid to genetically modify said pSOL plasmid of a bacterium belonging to the genus Clostridium, said bacterium being distinguished from the wild-type strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the pSOL plasmid essential for its survival. It also relates to allelic exchange tools for transforming and genetically modifying a bacterium.
  • a particular allelic exchange tool is for example an ACE® tool comprising a nucleic acid comprising a sequence complementary to a portion of the pSOL plasmid usable as a homologous recombination template, allowing, by a homologous recombination mechanism, to modify the recognized portion or to replace the recognized portion within pSOL with a sequence of interest.
  • bacteria of the genus Clostridium we mean in particular the Clostridium species said to be of industrial interest, typically the solventogenic or acetogenic bacteria of the genus Clostridium.
  • the expression "bacteria of the genus Clostridium” includes wild bacteria as well as strains derived from them, genetically modified with the aim of improving their performance.
  • Clostridium species of industrial interest or “Clostridium bacteria of industrial interest” is meant species capable of producing, by fermentation, solvents such as ethanol, butanol, acetone or isopropanol and/or acids such as butyric acid, acetic acid or lactic acid, from sugars or oses, typically from sugars comprising 5 carbon atoms such as xylose, arabinose or fructose, from sugars comprising 6 carbon atoms such as glucose or mannose, from polysaccharides or polysaccharides such as cellulose or hemicellulose, and/or from any other source of carbon assimilable and usable by bacteria of the genus Clostridium (CO, CO2 , and methanol for example).
  • solvents such as ethanol, butanol, acetone or isopropanol and/or acids such as butyric acid, acetic acid or lactic acid
  • sugars or oses typically from sugars comprising 5 carbon atoms such as xy
  • solvent-producing bacteria of interest are bacteria of the genus Clostridium producing acetone, butanol, ethanol and/or isopropanol (propan-2-ol), such as the strains identified in the literature as "ABE strain” [strains carrying out fermentations allowing the production of acetone, butanol and ethanol], "IBE strain” [strains carrying out fermentations allowing the production of isopropanol (or propan-2-ol) by reduction of acetone, butanol and ethanol] and "AIBE strain” [strains carrying out fermentations allowing the production of acetone, isopropanol (or propan-2-ol), butanol and ethanol].
  • ABE strain strainstrains carrying out fermentations allowing the production of acetone, butanol and ethanol
  • IBE strain strainstrains carrying out fermentations allowing the production of isopropanol (or propan-2-ol) by reduction of acetone, butanol and
  • the bacterium belonging to the genus Clostridium is the bacterium Clostridium acetobutylicum, for example a strain selected from ATCC 824, ATCC 55025, LMG 5710, DSM 792, DSM 1731, DSM 1732, LMG 5710, in particular the strain DSM 792.
  • the terms "gene editing tool” refer to any genetic tool known to those skilled in the art which the latter knows does not allow modification of a genetic element not essential to the bacterial survival of the wild bacterium, such as the plasmid pSOL.
  • This is for example a genetic tool allowing modification of the genome of a microorganism such as a bacterium whose functioning involves homologous recombination events requiring the use of a counter-selection marker.
  • the term "homologous recombination” refers to the event of substitution of a DNA segment by another that has identical (homologous) or nearly identical regions.
  • the most efficient known modification methods for obtaining genetically modified strains are based on homologous recombination events, which make it possible to modify the genome in a precise and stable manner.
  • a "genetic element not essential for bacterial survival” is an element that can be deleted or inactivated without harming the survival of the bacterium, such as for example a plasmid or any mobilizable element not containing a gene essential for the survival of the bacterium under the culture conditions conventionally used by those skilled in the art.
  • counter-selection marker or “negative selection marker” designate any product capable of causing the death of the genetically modified cell or microorganism (for example, bacteria) under certain conditions, controllable and known to those skilled in the art, for example any toxic molecule (toxin) or any gene whose expression product allows the synthesis of a molecule toxic to the microorganism, as well as any nuclease capable of specifically targeting a nucleic acid sequence of interest within the microorganism, and any protein associated with the CRISPR tool.
  • toxin toxic molecule
  • nuclease capable of specifically targeting a nucleic acid sequence of interest within the microorganism, and any protein associated with the CRISPR tool.
  • the toxin may be, for example, 5-Fluorouridine monophosphate (5-FUMP) or the MazF toxin of the MazE-MazF toxin-antitoxin system of Escherichia coli.
  • the gene whose expression product allows the synthesis of a molecule toxic to the microorganism may be, for example, upp, whose product allows, among other things, the formation of 5-FUMP from 5-Fluorouracil, or mazF.
  • the nuclease capable of specifically targeting (recognizing and binding) a nucleic acid sequence of interest within the microorganism may be, for example, a TALEN-type enzyme, a zinc finger nuclease, or a Cas nuclease of the Cas9 or Cas12 type, in particular Cas12a, for example MAD7.
  • the nucleic acid sequence of interest recognized by the nuclease is a genetic element that is not essential for the survival of the wild-type form of the microorganism of interest, for example the bacterium.
  • the genetic editing tool is typically a tool for modifying the genetic material of a microorganism by homologous recombination, typically by mutation, insertion or deletion of a sequence of interest. It can be selected for example from allelic exchange tools (for example the ACE® tool) or CRISPR tools using nucleases performing double-strand cuts at the target DNA. Regardless of the genetic editing tool chosen, the (endo)nuclease type enzyme that can be used in the context of the invention must be capable of recognizing a genetic element that is not essential for the survival of the wild form of the microorganism of interest. In the case of the bacterium belonging to the genus Clostridium, in particular in the case of C.
  • the enzyme preferably recognizes the megaplasmid pSOL.
  • the genetic editing tool is a CRISPR tool, preferably CRISPR-Cas9 or CRISPR-Cas12, even more preferably CRISPR-Cas9.
  • the introduction into the bacterium of any nucleic acid of interest can be carried out by any method, direct or indirect, known to those skilled in the art, for example by transformation, conjugation, microinjection, transfection, electroporation, etc., preferably by electroporation (Mermelstein et al, 1993).
  • nucleic acids of interest for example DNA fragments, RNA fragments, expression cassettes or expression vectors
  • a particular subject of the invention thus relates to a CRISPR-Cas genetic editing tool or an allelic exchange tool, for transforming and genetically modifying a bacterium.
  • transformation refers to the incorporation of at least one exogenous nucleic acid by a cell, this acquisition of new sequence(s), for example new gene(s), being transient. (if the exogenous nucleic acid carrying the genes can subsequently be eliminated) or permanent (in the case where the exogenous nucleic acid is integrated into the DNA of the host cell).
  • the gene editing tool when it is a CRISPR-Cas tool, it preferably comprises a nuclease capable of targeting the pSOL megaplasmid. It further comprises i) one or more guide RNAs (gRNAs), each guide RNA comprising an RNA structure for attachment to the Cas enzyme and a sequence complementary to all or part, typically a portion, of the pSOL plasmid (of 180 kB) targeted by the Cas enzyme, and ii) a repair template allowing, by a homologous recombination mechanism, the replacement of the targeted portion within pSOL by a sequence of interest.
  • gRNAs guide RNAs
  • each guide RNA comprising an RNA structure for attachment to the Cas enzyme and a sequence complementary to all or part, typically a portion, of the pSOL plasmid (of 180 kB) targeted by the Cas enzyme
  • a repair template allowing, by a homologous recombination mechanism, the replacement of the targeted portion
  • the inventors have in particular developed tools and methods, described in patent EP3362559 and in application EP3578662 as well as in applications EP3898970 and FR3096373 (incorporated by reference), making it possible to modify the genome of this microorganism in a targeted manner.
  • they have described a tool using CRISPR-Cas technology comprising two nucleic acids, one containing the genetic elements allowing the controlled expression of the Cas nuclease (which performs a double-strand cut within a nucleic acid molecule), and the other at least one guide RNA (gRNA) targeting the DNA region to be modified as well as a repair template.
  • CRISPR-Cas technology comprising two nucleic acids, one containing the genetic elements allowing the controlled expression of the Cas nuclease (which performs a double-strand cut within a nucleic acid molecule), and the other at least one guide RNA (gRNA) targeting the DNA region to be modified as well as a repair template.
  • gRNA guide
  • At least one of said nucleic acids further comprises a sequence encoding an anti-CRISPR protein placed under the control of an inducible promoter.
  • the genetic tool may otherwise further comprise a third nucleic acid encoding an anti-CRISPR protein preferably placed under the control of an inducible promoter.
  • a particular preferred CRISPR-Cas tool comprises at least: - a "first" nucleic acid encoding at least one DNA endonuclease, for example the Cas9 enzyme, in which the sequence encoding the DNA endonuclease is placed under the control of a promoter, and - at least one "second" nucleic acid containing a repair template allowing, by a homologous recombination mechanism, the replacement of a portion of the targeted bacterial DNA ("target DNA sequence”) by the endonuclease with a "sequence of interest”.
  • either at least one of said nucleic acids further encodes one or more guide RNAs (gRNAs) or the genetic tool further comprises one or more guide RNAs, each guide RNA comprising a DNA endonuclease binding RNA structure and a sequence complementary to the targeted portion of the bacterial DNA.
  • gRNAs guide RNAs
  • the genetic tool further comprises one or more guide RNAs, each guide RNA comprising a DNA endonuclease binding RNA structure and a sequence complementary to the targeted portion of the bacterial DNA.
  • at least one of said nucleic acids further comprises a sequence encoding an anti-CRISPR protein placed under the control of an inducible promoter
  • the genetic tool further comprises a third nucleic acid encoding an anti-CRISPR protein placed under the control of an inducible promoter.
  • Another particular subject of the invention relates to a genetic editing tool of the allelic exchange tool type, for example an ACE® tool, for transforming and genetically modifying a bacterium, based on the use of at least one selection marker and at least one counter-selection marker located between two nucleic sequences homologous to the regions located on either side of the nucleic sequence to be modified.
  • a genetic editing tool of the allelic exchange tool type for example an ACE® tool
  • the ACE tool comprises i) a selection marker, ii) a counter-selection marker, and iii) a sequence complementary to a portion of the plasmid pSOL usable as a homologous recombination template, allowing, by a homologous recombination mechanism, to modify the recognized portion or to replace the recognized portion within pSOL with a sequence of interest in addition.
  • the expression "marker” or “marker gene” refers to a sequence encoding a marker protein under the control of functional regulatory elements allowing the synthesis of said protein in Clostridia.
  • Selection marker genes can be divided into several subcategories depending on whether they confer positive or negative selection, and whether the selection is conditional or not conditional on the presence of external substrates. So-called "positive selection” marker genes promote the growth of cells whose genome has been genetically modified. The detection of these positive selection marker genes is subject to the use of toxic agents (antibiotics, herbicides or drugs). These genes are, for example, antibiotic resistance genes such as the nptI and nptII genes conferring resistance to the antibiotic kanamycin; in this case, all cells having acquired the transgene will resist the antibiotic while the others will be killed.
  • positive selection marker genes of this type has the double “advantage” of allowing both the identification and rapid sorting of genetically modified cells (the only ones to survive), compared to those that have not acquired the nucleic acid of interest (the "transgene”).
  • so-called “counter-selection” or “negative selection” marker genes, “negatively selectable” cause the death of genetically modified cells or organisms under certain conditions, controllable and known to the experimenter.
  • the selection marker typically makes it possible to select the integration event, by homologous recombination, in the host genome of the sequence of interest provided by the genetic tool.
  • the counter-selection marker makes it possible to select the second homologous recombination event linked to the excision of the genetic tool.
  • the ACE® technology is based, for example, on the use of an auxotrophic mutant (for uracil in C. acetobutylicum ATCC 824 by deletion of the pyrE gene, which also causes resistance to 5-fluoroorotic acid (A-5-FO); Heap et al., 2012).
  • the system uses the allelic exchange mechanism, well known to those skilled in the art. Following transformation with a pseudo-suicide vector, the integration of the latter into the bacterial chromosome by a first allelic exchange event is selected thanks to the resistance gene initially present on the plasmid.
  • the integration step can be carried out by two different ways, either within the pyrE locus or within another locus: in the case of integration at the pyrE locus, the pyrE gene is also placed on the plasmid, but without being expressed (no functional promoter). The second recombination restores a functional pyrE gene and can then be selected by auxotrophy (minimal medium, not containing uracil). Since the non-functional pyrE gene also has a selectable character (sensitivity to A-5-FO), other integrations can then be envisaged on the same model, by successively alternating the state of pyrE between functional and non-functional.
  • target DNA sequence designates any gene, intergenic region, promoter and/or regulatory sequence of interest chosen by a person skilled in the art, preferably located on the pSOL megaplasmid. These include genes coding for proteins of interest, for example enzymes involved in cellular metabolism.
  • target DNA sequence corresponds to i) all or part of the sequence coding the hbd gene (SEQ ID NO: 34), to a sequence comprising at least 1 nucleotide, preferably at least 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 40 nucleotides, typically between 1 and 40 nucleotides, preferably a sequence comprising 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 nucleotides of said coding sequence, ii) to a sequence controlling the transcription of said coding sequence, typically a promoter sequence, or iii) a sequence flanking said coding sequence.
  • a flanking sequence typically comprises 1, 10 or 20 and 1000 nucleotides, for example between 1, 10 or 20 and 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 or 200 nucleotides, between 1, 10 or 20 and 100 nucleotides, between 1, 10 or 20 and 50 nucleotides, or between 1, 10 or 20 and 40 nucleotides, for example between 10 and 40 nucleotides, between 10 and 30 nucleotides, between 10 and 20 nucleotides, between 20 and 30 nucleotides, between 15 and 40 nucleotides, between 15 and 30 nucleotides or between 15 and 20 nucleotides.
  • sequence of interest and “nucleic acid of interest” designate a coding or non-coding sequence.
  • nucleic acid means any natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant DNA or RNA molecule, optionally chemically modified (i.e. comprising non-natural bases, modified nucleotides comprising, for example, a modified bond, modified bases and/or modified sugars), or optimized so that the codons of the transcripts synthesized from the coding sequences are the codons most frequently found in a bacterium of the genus Clostridium for use therein.
  • the optimized codons are typically codons rich in adenine ("A") and thymine (“T”) bases.
  • the nucleic acid of interest comprises at least two complementary regions each of a target sequence, 100% identical or at least 80% identical, of preferably at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% to said targeted DNA region/portion/sequence within the genome of the microorganism, for example the bacterial genome.
  • regions are capable of hybridizing to all or part of the complementary sequence of said region/portion/sequence, typically to a sequence as described above comprising at least 1 nucleotide, preferably at least 100 nucleotides, typically between 100 and 1000 nucleotides.
  • the complementary regions of the target sequence present within the nucleic acid of interest can recognize, preferably target, the 5' and 3' flanking regions of the targeted sequence in a genetic modification tool known to those skilled in the art, typically any tool based on homologous recombination.
  • a portion of the nucleic acid of interest further recognizes (at least partially binds), and preferably targets, i.e.
  • the recognized sequence is also identified in the present text as a "target sequence” or "targeted sequence”.
  • the nucleic acid of interest comprises at least one complementary region of the target sequence identical to 100% or identical to at least 80%, preferably to 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% at least to the targeted DNA region/portion/sequence within the bacterial genome and is capable of hybridizing to all or part of the complementary sequence of said region/portion/sequence, typically to a sequence comprising at least 5 nucleotides, preferably at least 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 or 40 nucleotides, typically between 15 and 30 nucleotides, preferably to a sequence comprising 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 nucleotides.
  • the nucleic acid(s) of interest as described in the context of the present invention are capable of deleting said target sequence(s) from the genome of the microorganism or of modifying their expression, for example of modulating/regulating them, in particular of inhibiting them, preferably of modifying them so as to render said microorganism incapable of expressing one or more proteins, in particular one or more functional proteins, from said sequence(s).
  • the nucleic acid(s) of interest as described in the context of the present invention are capable of introducing a sequence of interest into the genome of the microorganism so as to render said microorganism capable of expressing one or more proteins, in particular one or more functional proteins, from said sequence(s).
  • the sequence of interest may be a mutated sequence of the target DNA sequence, for example the target gene, promoter or regulatory sequence and/or a marker such as an antibiotic resistance gene or a color-generating enzyme.
  • the sequence of interest may be termed an “exogenous nucleic acid” if its coding portion has no homology with the wild-type sequence for which genetic modification is sought.
  • the sequence of interest may be longer or shorter than the replaced sequence (“target DNA sequence”), depending on the distance separating the two homologous regions.
  • the nucleic acid of interest may be a natural RNA, synthetic RNA or RNA produced by a recombinant technique.
  • This nucleic acid of interest may be prepared by any method known to those skilled in the art such as, for example, chemical synthesis, in vivo transcription or amplification techniques.
  • RNA molecules mature or precursors
  • gRNA guide RNA
  • these molecules may contain modified nucleotides or chemical modifications allowing them, for example, to increase their resistance to nucleases and thus increase their lifespan in the cell.
  • They may in particular comprise at least one modified or non-natural nucleotide such as, for example, a nucleotide comprising a modified base, such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • nucleic acids of interest used according to the invention may also be modified at the level of the internucleotide bond as are for example phosphorothioates, H-phosphonates or alkyl-phosphonates, or at the level of the skeleton as are for example alpha-oligonucleotides, 2'-O-alkyl riboses or PNA (Peptide Nucleic Acids) (Egholm et al., 1992).
  • a particular example of a nucleic acid of interest, used to transform and/or genetically modify a Clostridium bacterium of interest is a DNA fragment i) recognizing a coding sequence, ii) controlling the transcription of a coding sequence, or iii) flanking a coding sequence, the enzyme Hbd (3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase).
  • the nucleic acid of interest as described in the context of the present invention is preferably capable of deleting said target sequence from the genome of the microorganism, for example of the bacterium, or of modifying its expression, for example of modulating/regulating it, in particular of inhibiting it, preferably of modifying it so as to render said microorganism incapable of expressing a protein (typically an Hbd protein), in particular a functional protein, from said sequence.
  • a protein typically an Hbd protein
  • the nucleic acid of interest is capable of modifying the microorganism so as to render it incapable of expressing the Hbd protein.
  • the anti-CRISPR protein is a protein capable of inhibiting or preventing/neutralizing the action of the DNA endonuclease, typically Cas, and/or a protein capable of inhibiting or preventing/neutralizing the action of a CRISPR-Cas system, for example a type II CRISPR-Cas system when the nuclease is a Cas9-type nuclease, preferably during the phase of introducing the nucleic acid sequences of the genetic tool into the bacterial strain of interest.
  • This sequence is typically placed under the control of an inducible promoter different from the promoters controlling the expression of the DNA endonuclease and/or the gRNA(s), and is inducible by another inducing agent.
  • This promoter can be for example selected from the Pbgal promoter (lactose-inducible), the promoter of the tetA gene, the xylA gene or the lacI gene, or a derivative thereof.
  • the promoter controlling the expression of the anti-CRISPR protein allows the action of the endonuclease to be advantageously controlled DNA, for example the Cas9 enzyme, and thus facilitate the transformation of bacteria and the obtaining of transformants having undergone the desired genetic modifications.
  • the anti-CRISPR protein is typically an “anti-Cas9” protein or an “anti-MAD7” protein, i.e. a protein capable of inhibiting or preventing/neutralizing the action of Cas9 or MAD7.
  • the anti-CRISPR protein is advantageously an “anti-Cas9” protein, for example selected from AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3, AcrIIA4, AcrIIA5, AcrIIC1, AcrIIC2 and AcrIIC3 (Pawluk et al, 2018).
  • the “anti-Cas9” protein is AcrIIA2 or AcrIIA4.
  • the “anti-Cas9” protein is AcrIIA4.
  • Such a protein is typically capable of very significantly limiting, ideally preventing, the action of Cas9, for example by binding to the Cas9 enzyme (Dong et al, 2017; Rauch et al, 2017).
  • anti-MAD7 protein
  • AcrVA1 protein Marino et al, 2018
  • a particular chromosomal modification particularly preferred in the case of C. acetobutylicum, is the deletion or inactivation of the hbd gene.
  • a particular genetically modified bacterium does not express the product of the gene of sequence SEQ ID NO: 34, or expresses a non-functional version of said product.
  • the term “hbd gene” refers in particular to the sequence SEQ ID NO: 34 (CA_C2708).
  • hbd gene also refers to variants of said sequence SEQ ID NO: 34, in particular variants exhibiting sequence homology with said sequence SEQ ID NO: 34.
  • the term “hbd gene” also refers to a sequence encoding a functional fragment or variant of the protein (enzyme) (S)-3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (Hbd), in particular a protein capable of/capable of exerting a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase activity.
  • Hbd gene also refers to a variant nucleotide sequence encoding a protein capable of binding in particular the promoter of the "hbd” gene (CA_C2708, SEQ ID NO: 34).
  • the term "hbd gene” also refers to a sequence encoding a functional fragment or variant of the Hbd protein, in particular a protein capable of/able to exert a 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase activity. Conversely, the non-functional version of the hbd gene product is incapable of exerting this activity.
  • a particular bacterium described by the inventors in the present text further does not express the pdc gene of sequence SEQ ID NO: 35 or expresses a non-functional version thereof.
  • the term “pdc gene” refers in particular to the sequence SEQ ID NO: 35 (CA_P0025).
  • pdc gene also refers to variants of said sequence SEQ ID NO: 35, in particular variants exhibiting sequence homology with said sequence SEQ ID NO: 35.
  • the pdc gene is only an example intended to demonstrate the possible implementation of the present invention with any gene of interest.
  • a typical example of a variant according to the invention has a sequence homology with a sequence of interest such as the sequence SEQ ID NO: 34 or with the SEQ ID NO: 35 of between 95% and 100%, and preferably between 96% and 100%.
  • the sequence SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35 and its variant are for example homologous to at least 95%, for example to at least 96%, to at least 97%, to at least 98%, or to at least 99%.
  • sequence SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35 and its variant have sequences homologous to at least 96%, at least 97%, or at least 98%.
  • the particular genetically modified bacterium not expressing the hbd gene product or expressing a non-functional version of said product can be advantageously used to obtain a bacterium having at least one other genetic modification, typically a genetic modification of the pSOL megaplasmid.
  • this bacterium having at least one other genetic modification does not express a nucleic acid present on the pSOL megaplasmid, for example a nucleic acid such as the pdc gene, the adhE1 gene, the adhE2 gene, the ctfA gene, the ctfB gene, or the adc gene, or expresses a non-functional version thereof.
  • this bacterium having at least one other genetic modification expresses a modified version of a gene present on the pSOL megaplasmid and/or expresses an exogenous gene, ie absent from the wild-type version of the pSOL megaplasmid.
  • a particularly preferred genetically modified bacterium according to the invention corresponds to the strain identified in the present description as IFP 969 as registered on February 17, 2023 under the deposit number LMG P-32993 with the BCCM-LMG collection (also identified in the present text as “ ⁇ hbd”).
  • the invention also relates to any bacteria derived, cloned, mutant or genetically modified version thereof.
  • the inventors further describe methods for producing a recombinant bacterium as described in the present text, in particular methods comprising the deletion or inactivation of the hbd gene, so as to prevent or reduce the expression of the corresponding functional protein, or even, possibly in addition, the addition of a sequence encoding a product of interest, preferably a method involving CRISPR technology, as well as the genetically modified bacteria capable of being obtained by this method, in particular the bacterium IFP 969.
  • the method implemented uses CRISPR technology, it typically comprises the steps of a method described in patent EP3362559 or in application EP3578662.
  • the inventors further describe nucleic acids used to transform a bacterium, or a population of bacteria, belonging to the genus Clostridium.
  • nucleic acid is typically in the form of an expression cassette (or “construct”) such as, for example, a nucleic acid comprising at least one transcriptional promoter or regulatory sequence of interest, linked in a manner operational (in the sense understood by a person skilled in the art) to one or more sequences (coding or not) of interest, for example to an operon comprising several coding sequences of interest whose expression products contribute to the realization of a function of interest within the bacterium, or a nucleic acid further comprising an activator sequence and/or a transcription terminator.
  • an expression cassette such as, for example, a nucleic acid comprising at least one transcriptional promoter or regulatory sequence of interest, linked in a manner operational (in the sense understood by a person skilled in the art) to one or more sequences (coding or not) of interest, for example to an operon comprising several coding sequences of interest whose expression products contribute to the realization of a function of interest within the bacterium, or a nucleic acid further comprising an activator sequence and
  • the vector is typically in the form of a vector, circular or linear, single or double stranded, for example a plasmid, a phage, a cosmid, an artificial or synthetic chromosome, comprising one or more expression cassettes as defined above.
  • the vector is a plasmid.
  • the nucleic acids of interest typically the expression cassettes or vectors, can be constructed by conventional techniques well known to those skilled in the art and can comprise one or more promoters, bacterial origins of replication (ORI sequences), termination sequences, selection genes, for example antibiotic resistance genes, and sequences ("flanked regions") allowing the targeted insertion of the cassette or vector.
  • these expression cassettes and vectors can be integrated into the bacterial genome by techniques well known to those skilled in the art.
  • ORI sequences of interest can be chosen from pIP404, pAM ⁇ 1, repH (origin of replication in C. acetobutylicum), ColE1 or rep (origin of replication in E. coli), or any other origin of replication allowing the maintenance of the vector, typically the plasmid, within a bacterial cell belonging to the genus Clostridium.
  • Termination sequences of interest may be selected from those of the adc, thl genes, the bcs operon, or any other terminator, well known to those skilled in the art, allowing the termination of transcription within a bacterial cell.
  • Selection genes (resistance genes) of interest may be selected from ermB, catP, bla, tetA, tetM, and/or any other gene for resistance to ampicillin, erythromycin, chloramphenicol, thiamphenicol, spectinomycin, tetracycline or any other antibiotic that can be used to select bacteria of the genus Clostridium well known to those skilled in the art.
  • the plasmids pCas9acr of sequence SEQ ID NO: 23, pEC750C of sequence SEQ ID NO: 24, pGRNAind of sequence SEQ ID NO: 25, pGRNAcon of sequence SEQ ID NO: 26, pAN2 of sequence SEQ ID NO: 27, pGRNA-hbd of sequence SEQ ID NO: 28, pGRNA- ⁇ hbd of sequence SEQ ID NO: 29, pGRNA-pdc of sequence SEQ ID NO: 30, pGRNA- ⁇ pdc of sequence SEQ ID NO: 31 and pGRNA-C ⁇ hbd of sequence SEQ ID NO: 32 are thus described, as well as the use of one, several or all of them for transforming, and preferably genetically modifying, a bacterium of the genus Clostridium so as to improve its capacity for producing biofuel(s) and/or biosourced molecule(s).
  • the invention also relates to a method for transforming, and preferably genetically modifying, a bacterium belonging to the genus Clostridium comprising a pSOL plasmid in the wild state, preferably C. acetobutylicum, as well as the genetically modified bacterium capable of being obtained by this method.
  • Said method comprises a step of transforming the bacterium by introducing into said bacterium a modification tool by homologous recombination as described above, typically an expression cassette or vector, for example a plasmid selected from the plasmids pCas9acr of sequence SEQ ID NO: 23, pEC750C of sequence SEQ ID NO: 24, pGRNAind of sequence SEQ ID NO: 25, pGRNAcon of sequence SEQ ID NO: 26, pAN2 of sequence SEQ ID NO: 27, pGRNA-hbd of sequence SEQ ID NO: 28, pGRNA- ⁇ hbd of sequence SEQ ID NO: 29, pGRNA-pdc of sequence SEQ ID NO: 30, pGRNA- ⁇ pdc of sequence SEQ ID NO: 31 and pGRNA-C ⁇ hbd of sequence SEQ ID NO: 32.
  • a plasmid selected from the plasmids pCas9acr of sequence SEQ ID NO: 23, pEC750
  • the transformation step is preferably carried out in the presence of an agent inducing the expression of the anti-CRISPR protein encoded by one of the sequences of the editing tool.
  • the method preferably also comprises a step of culturing the transformed bacterium.
  • This culturing step may be carried out on a medium not containing (or under conditions not involving) the agent inducing the expression of the anti-CRISPR protein when the latter is used, and typically allowing the expression of the ribonucleoprotein complex endonuclease of DNA and the gRNA, for example Cas9-gRNA (in order to stop the production of said anti-CRISPR protein and to allow the action of the endonuclease).
  • a medium not containing (or under conditions not involving) the agent inducing the expression of the anti-CRISPR protein when the latter is used and typically allowing the expression of the ribonucleoprotein complex endonuclease of DNA and the gRNA, for example Cas9-gRNA (in order to stop the production of said anti-CRISPR protein and to allow the action of the endonuclease).
  • the method for transforming, and preferably genetically modifying, a bacterium belonging to the genus Clostridium comprising a wild-type pSOL plasmid comprises a step of genetic modification, typically of deletion or inactivation, of the gene(s) making the presence of the pSOL plasmid essential to the survival of said bacterium, or otherwise involves a recombinant bacterium of the genus Clostridium already comprising a chromosomal modification making the presence of the pSOL plasmid essential to its survival.
  • the deletion or inactivation step is preferably carried out using a CRISPR-type genetic editing tool, for example of the CRISPR-Cas type.
  • the bacterium of the genus Clostridium comprising a chromosomal modification making the presence of the pSOL plasmid essential to its survival is a bacterium lacking the hbd gene or comprising a non-functional hbd gene.
  • the method for transforming, and preferably genetically modifying, a bacterium belonging to the genus Clostridium comprising a pSOL plasmid in the wild preferably comprises a step of introducing into the bacterium a genetic tool according to the invention.
  • the method for transforming, and preferably genetically modifying, a bacterium belonging to the genus Clostridium comprising a wild-type pSOL plasmid preferably comprises an additional step of genetic modification of the transformed bacterium using a genetic tool according to the invention, preferably a CRISPR-type tool, for example of the CRISPR-Cas type, so as to correct the chromosomal modification that made the presence of the pSOL plasmid essential for the survival of said bacterium by restoring the wild-type version of the corresponding sequence.
  • a genetic tool according to the invention preferably a CRISPR-type tool, for example of the CRISPR-Cas type
  • a particular method according to the invention is characterized in that the bacterium of the genus Clostridium is a bacterium of the genus Clostridium lacking the hbd gene or comprising a non-functional hbd gene and in that that the additional step of genetic modification of the transformed bacterium aims to reintroduce the hbd gene into the genome of said bacterium or to make it functional.
  • the inventors also describe the use of a bacterium belonging to the genus Clostridium distinguished from the corresponding wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential for its survival, in a method of genetic modification of a bacterium of the genus Clostridium, or for manufacturing a genetically modified derived bacterium.
  • a preferred subject thus aims at the use of a recombinant bacterium according to the invention, preferably the bacterium identified in the present description as IFP 969 as registered on February 17, 2023 under the deposit number LMG P-32993 with the BCCM-LMG collection (also identified in the present text as " ⁇ hbd"), in a method of genetic modification/improvement of a bacterium of the genus Clostridium.
  • a bacterium is typically usable as a laboratory tool for obtaining genetically improved strains of bacteria of the genus Clostridium.
  • the inventors thus also describe the use of a bacterium belonging to the genus Clostridium distinguished from the corresponding wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential to its survival, or of a bacterium whose chromosomal modification having made the presence of the plasmid pSOL essential to the survival of said bacterium has been corrected, for manufacturing a genetically modified derived bacterium, usable on an industrial scale for producing a biosourced molecule or a mixture of biosourced molecules, for example a solvent, a biofuel or any intermediate (bio)chemical product, in particular a mixture of fuels, or directly for producing one or more biosourced molecule(s), in particular on an industrial scale.
  • a bacterium belonging to the genus Clostridium distinguished from the corresponding wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential to its survival, or of a bacterium whose chromos
  • the present description also relates to the derived recombinant bacteria thus obtained. It also relates to the use of the recombinant bacterium thus obtained, to produce, thanks to the expression of the nucleic acid(s) of interest voluntarily introduced into its genome, one or more biofuel(s) and/or biosourced molecule(s), preferably on an industrial scale.
  • the invention also relates to a fermentation process involving the use of a genetically modified bacterium as described in the present text, typically a bacterium belonging to the genus Clostridium distinguished from the wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential to its survival, or a bacterium whose chromosomal modification having made the presence of the plasmid pSOL essential to the survival of said bacterium has been corrected.
  • a genetically modified bacterium as described in the present text, typically a bacterium belonging to the genus Clostridium distinguished from the wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential to its survival, or a bacterium whose chromosomal modification having made the presence of the plasmid pSOL essential to the survival of said bacterium has been corrected.
  • kits in particular a kit for transforming and preferably genetically modifying a bacterium belonging to the genus Clostridium, and a kit for producing a biofuel, a biosourced molecule or a mixture of one and/or the other, using such a bacterium.
  • acetobutylicum preferably comprises at least one nucleic acid of interest as described in the present text (for example two or three nucleic acids of interest, typically DNA fragments, each recognizing a target sequence) and all or part of the elements of a genetic editing tool as described in the present text making it possible to transform, and typically genetically modify a bacterium belonging to the genus Clostridium, preferably C. acetobutylicum, so that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential to its survival and/or to correct the chromosomal modification having made the presence of the plasmid pSOL essential to its survival.
  • This kit may further comprise one or more consumables such as for example a preservation medium or a culture medium, one or more gRNAs, a nucleic acid usable as a repair template, at least one pair of primers, a nuclease, one or more selection molecules, an inducer adapted to an inducible promoter present within the genetic editing tool, at least one competent bacterium of the genus Clostridium (i.e. conditioned for transformation), preferably C. acetobutylicum, etc. It may otherwise comprise the essential elements for the operation of an allelic exchange tool (typically at least two nucleic acids usable as a homologous recombination template, and at least one pair of primers).
  • a preservation medium or a culture medium such as for example a preservation medium or a culture medium, one or more gRNAs, a nucleic acid usable as a repair template, at least one pair of primers, a nuclease, one or more selection molecules, an inducer adapted to an
  • the invention more particularly relates to a kit for producing one or more bio-sourced molecule(s), for example a solvent or a mixture of solvents, a biofuel or a mixture of biofuels, an intermediate (bio)chemical product or a mixture of such intermediate products, using a bacterium belonging to the genus Clostridium, preferably C. acetobutylicum, comprising i) a genetically modified bacterium belonging to the genus Clostridium according to the invention (preferably C.
  • acetobutylicum ie, a bacterium distinguished from the wild strain in that it comprises a chromosomal modification making the presence of the plasmid pSOL essential to its survival, for example IFP 969, or a bacterium whose chromosomal modification having made the presence of the plasmid pSOL essential to the survival of said bacterium has been corrected, and ii) a medium, typically a preservation medium or a culture medium for said bacterium.
  • the kit may further comprise an explanatory note.
  • the invention further relates to the possible uses of the method or kit according to the invention for transforming and/or genetically modifying a bacterium of the genus Clostridium, typically a solventogenic bacterium of the genus Clostridium (preferably C. acetobutylicum), for example for generating improved variants of said bacterium.
  • a solventogenic bacterium of the genus Clostridium preferably C. acetobutylicum
  • it relates to the possible uses of the method, the kit or a bacterium of the genus Clostridium transformed and preferably genetically modified according to the invention (preferably C. acetobutylicum), in particular for enabling the production of biosourced molecules, for example solvents, biofuels, (bio)chemical intermediates, or mixtures thereof, typically on an industrial scale.
  • kits comprises an improved variant of the bacterium whose chromosomal modification that made the presence of the pSOL plasmid essential to the survival of said bacterium has been corrected, typically a variant whose pSOL plasmid has been genetically modified so as to allow or improve the production of one or more biosourced molecule(s).
  • kits according to the invention may comprise one or more consumables such as, for example, a preservation medium or a culture medium, one or more gRNAs, a nuclease, one or more selection molecules, an inducer adapted to an inducible promoter present within the genetic editing tool, etc.
  • the medium for preserving or culturing the genetically modified bacteria (belonging to the genus Clostridium) according to the invention present in the kit is preferably supplemented with a carbon source composed of glucose and/or at least one pentose, preferably i) glucose and/or ii) arabinose and/or i) xylose.
  • This medium preferably comprises between 0.1 and 250 g/L, more preferably between 1 and 100 g/L, of said carbon source (composed of glucose and/or arabinose and/or xylose).
  • the medium for preserving or culturing the genetically modified bacteria is preferably an RCM type culture medium, more preferably a GAPES type culture medium, even more preferably a CGM type culture medium.
  • acetobutylicum produces acetate, butyrate and possibly lactate during acidogenesis.
  • butyrate and acetate are reassimilated, and the carbon flux is redirected towards the production of acetone, ethanol and n-butanol.
  • Ack acetate kinase
  • Adc acetoacetate decarboxylase
  • Adh alcohol dehydrogenase
  • Ald aldehyde dehydrogenase
  • Aldc acetolactate decarboxylase
  • Als acetolactate synthase
  • Bcd butyryl-CoA dehydrogenase
  • Buk butyrate kinase
  • CtfA-CtfB butyrate-acetoacetate CoA-transferase (subunits A and B)
  • Crt crotonase
  • EtfA-EtfB electron transfer flavoprotein (subunits ⁇ and ⁇ )
  • Fnor ferredoxin-NAD(P) + oxidoreductase
  • Hbd 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase
  • HydA hydrogenase
  • Ldh lactate dehydrogenase
  • Pdc pyruvate decar
  • EXPERIMENTAL PART Materials and methods Strains, plasmids and culture media
  • C. acetobutylicum DSM 792 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ
  • 2YTG medium tryptone 16 gL -1
  • yeast extract 10 gL -1 , glucose 5 gL -1 , NaCl 4 gL -1 .
  • Escherichia coli NEB 10-beta (New England Biolabs, NEB) was grown at 37°C under aerobic conditions in LB medium (tryptone 10 gL -1 , yeast extract 5 gL -1 , NaCl 10 gL -1 ). Solid media were made by adding 15 gL -1 of agarose to liquid media. If necessary, erythromycin (Em, 40 mg.L -1 ) and/or thiamphenicol (Tm, 15 mg.L -1 ) were used for C. acetobutylicum cultures.
  • Em erythromycin
  • Tm 15 mg.L -1
  • Table 1 Plasmids Characteristics a pCas9acr (SEQ ID NO: 23) ermB, ColE1, pCB102, Pcm-tetO2/1-cas9, Pbgal-acrIIA4, tetR, bgaR (Wasels F.
  • pEC750C (SEQ ID NO: 24) catP, ColE1, pIP404 (Wasels F. et al. al., 2017)
  • pGRNA ind (SEQ ID NO: 25) Derived from pEC750C containing an expression cassette pGRNAcon (SEQ ID NO: 26) Derived from pEC750C containing a gRNA expression cassette (miniPthl promoter) (Wasels F.
  • Plasmid Construction Nucleic acids were purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), and GenElute Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich). PCR amplifications were performed with Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Oligonucleotides used for plasmid construction are shown in Table 2 below.
  • Plasmid pGRNA-pdc (SEQ ID NO: 30) was constructed by cloning the hybridization product of oligonucleotides P07 and P08 into pGRNAcon (SEQ ID NO: 26) using BsaI and T4 DNA ligase (NEB).
  • Plasmid pGRNA-C ⁇ hbd (SEQ ID NO: 32) was constructed by cloning the hybridization product of oligonucleotides P13 and P14 into pGRNAind using BsaI and T4 DNA ligase (NEB).
  • pGRNA-Chbd (SEQ ID NO: 33) was obtained by HiFi assembly (NEB) of pGRNA-C ⁇ hbd digested with BamHI and SalI and amplification products obtained from DSM 792 gDNA using oligonucleotide pairs P15-P16 and P17-P18.
  • Gene editing Plasmid constructs were introduced into C. acetobutylicum as described by Mermelstein LD et al. Gene editing events were selected as described by Wasels F. et al. (2020) and Wasels F. et al. (2017). Oligonucleotides used for confirmation of gene edits are shown in Table 3 below.
  • Table 3 Locus Oligonucleotide Sequence (5'-3') hbd P19 (SEQ ID NO: 19) GTAATATTATAGCAGCTATTTTAAGTTTAC P20 (SEQ ID NO: 20) AAAGGTAAGGAAATGGCTGAG pdc P21 (SEQ ID NO: 21) TTGGCGCTGTTAATGGGCTA P22 (SEQ ID NO: 22) ACCCAGCTAAATGAATGGCCT
  • Other genetic tools such as those based on homologous recombination or the insertion of mobile genetic elements, can make it possible to obtain mutants with equivalent genotypes, i.e.
  • Helium was used as the carrier gas at a flow rate of 1.6 mL.min -1 , and the column was heated from 50 to 250 °C during a 30 min run. Acid detection was performed by high-performance liquid chromatography on an Aminex HPX-87H column (Biorad) coupled with a Spectra System RI-150 refractometer and a Waters 2487 dual ⁇ UV detector set at 210 nm. The mobile phase consisted of a 0.1 M sulfuric acid solution, and the column temperature was set at 60 °C. The results presented are the average of at least three independent runs. Results A ⁇ hbd mutant was constructed in C. acetobutylicum strain DSM 792.
  • the pSOL megaplasmid containing the adhE1 and adhE2 genes encoding enzymes with acetaldehyde dehydrogenase (Ald) activity was targeted using the CRISPR-Cas9 tool (described in application WO2017/064439) used for the creation of the ⁇ hbd mutant.
  • the loss of the megaplasmid is easily achievable in the wild-type strain, and only requires the introduction of a plasmid allowing the expression of a gRNA targeting this nucleic acid (Wasels et al., 2017).
  • the frequency of obtaining transformants of the wild-type strain containing the pCas9acr plasmid with the pEC750C plasmid is of the order of 10 1 to 10 2 cfu. ⁇ g DNA -1 .
  • the frequency of obtaining transformants of the wild strain containing the plasmid pCas9 acr with a plasmid derived from pGRNA targeting the chromosome of the microorganism and not containing an editing template of the targeted locus, in the presence of anhydrotetracycline (aTc), the inducer of the expression of cas9, is zero.
  • the frequency of obtaining transformants of the wild strain containing the plasmid pCas9 acr with a plasmid derived from pGRNA targeting the megaplasmid pSOL in the presence of aTc is of the order of 10 1 to 10 2 cfu. ⁇ g DNA -1 .
  • the frequency of obtaining transformants of the ⁇ hbd mutant containing the pCas9 acr plasmid with the pEC750C plasmid is usually of the order of 10 3 cfu. ⁇ g DNA -1 .
  • the transformation frequency of this mutant with a plasmid derived from pGRNAcon targeting the pSOL megaplasmid in the presence of aTc and not containing an editing template for the targeted locus is zero. This result indicates that the pSOL megaplasmid is essential in the ⁇ hbd mutant and cannot be eliminated, contrary to what is observed in the wild-type strain.
  • the CRISPR-Cas9 tool it therefore becomes possible to use the CRISPR-Cas9 tool to make precise modifications within the megaplasmid in the ⁇ hbd mutant.
  • the pGRNA- ⁇ pdc plasmid was used to inactivate the pdc gene located on pSOL. Transformation of the wild strain DSM 792 with this plasmid induced the loss of the pSOL megaplasmid in the transformants obtained.
  • Butyric Acid Lactic Total DSM 792 1.6 ⁇ 0.5 1.6 ⁇ 0.5 0.0 ⁇ 0.0 3.1 ⁇ 1.0 ⁇ hbd 0.7 ⁇ 0.0 0.0 ⁇ 0.0 0.5 ⁇ 0.0 1.3 ⁇ 0.0 ⁇ hbd ⁇ pdc 0.2 ⁇ 0.0 0.0 ⁇ 0.0 0.0 ⁇ 0.0 0.2 ⁇ 0.0 Following the various genetic edits that can be carried out in the pSOL megaplasmid using the CRISPR-Cas9 tool, the latter can be used to reintroduce the hbd gene, and thus only retain the other modifications, located on the megaplasmid and/or on the chromosome.
  • This complementation at the locus can be carried out for example with the plasmid pGRNA-Chbd (SEQ ID NO: 33) which allows the reintroduction of a functional gene which does not impact the performance of the microorganism compared to the wild strain.
  • the performances of DSM 792 hbd C mutants resulting from the ⁇ hbd mutant are presented in Table 6 below.
  • ClosTron a universal gene knockout system for the genus Clostridium. Journal of Microbiological Methods 70:452–464. doi:10.1016/j.mimet.2007.05.021. - Joseph RC, Kim NM, Sandoval NR. 2018. Recent Developments of the Synthetic Biology Toolkit for Clostridium. Forehead. Microbiol.9:154. doi:10.3389/fmicb.2018.00154. - Lehmann D, Lütke-Eversloh T. 2011.
  • Anti-CRISPR discovery, mechanism and function. Nature Reviews Microbiology, 16(1), 12-17. - Rauch, BJ, Silvis, MR, Hultquist, JF, Waters, CS, McGregor, MJ, Krogan, NJ, & Bondy-Denomy, J. (2017). Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell, 168(1-2), 150-158. - Wasels F, Jean-Marie J, Collas F, López-Contreras AM, Lopes Ferreira N.2017. A two-plasmid inducible CRISPR/Cas9 genome editing tool for Clostridium acetobutylicum. Journal of Microbiological Methods 140:5–11.

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Abstract

La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genre Clostridium, typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium, et l'utilisation possible d'un outil d'édition génétique adapté à la modification du mégaplasmide pSOL au sein desdites bactéries. Elle concerne en outre des méthodes, outils et kits permettant l'élimination, la modification ou l'introduction de séquence(s) codant, ou contrôlant la transcription de séquence(s) codant, des produits d'intérêt, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour produire une molécule biosourcée par exemple un biocarburant.

Description

BACTERIES CLOSTRIDIUM MODIFIEES, OUTIL D’EDITION GENETIQUE DU PLASMIDE PSOL DE BACTERIES CLOSTRIDIUM, ET UTILISATIONS La présente invention concerne la modification génétique de bactéries du genre Clostridium, typiquement de bactéries solvantogènes du genre Clostridium, et l’utilisation possible d’un outil d’édition génétique adapté à la modification du mégaplasmide pSOL au sein desdites bactéries. Elle concerne en outre des méthodes, outils et kits permettant l’élimination, la modification ou l’introduction de séquence(s) codant, ou contrôlant la transcription de séquence(s) codant, des produits d’intérêt, les bactéries génétiquement modifiées obtenues et leurs utilisations, en particulier pour produire une ou plusieurs molécules biosourcées, par exemple un solvant, un biocarburant ou tout produit intermédiaire (bio)chimique. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE Les bactéries appartenant au genre Clostridium sont des bacilles anaérobies strictes à Gram positif, capables de former des endospores et appartenant au phylum des Firmicutes. Ce genre contient de nombreuses espèces étudiées en raison de leur caractère pathogène ou de leur intérêt industriel et médical. Les espèces de Clostridium dites d’intérêt industriel, non pathogènes, sont capables de produire des composés d’intérêt tels que des acides et solvants à partir d'une large variété de sucres et substrats allant du glucose à la cellulose. La croissance des bactéries Clostridium productrices de solvants (dites « solvantogènes ») est dite biphasique. Des acides sont produits lors de la phase d’acidogenèse, qui correspond à la phase exponentielle de croissance. Lorsque la croissance cellulaire cesse et que les bactéries entrent en phase stationnaire, elles entrent en phase de solvantogenèse, réassimilent les acides produits et les transforment en solvants. Clostridium acetobutylicum est naturellement capable de produire un mélange d’éthanol, d’acétone et de n-butanol au cours d’une fermentation dite ABE (Figure 1). C. acetobutylicum est considéré comme un organisme modèle pour l’étude des micro-organismes solvantogènes, en raison des titres relativement élevés obtenus lors de fermentations. Son génome a été séquencé en 2001, et est constitué d’un chromosome et du mégaplasmide pSOL de 180 Kb (Nölling J. et al., 2001), nommé ainsi parce qu’il contient de nombreux gènes impliqués dans la phase de solvantogénèse, dont les produits sont signalés en foncé sur la Figure 1. Lehmann et Lütke-Eversloh ont décrit en 2011 la construction d’un mutant ∆hbd ne produisant plus de butyrate ni de butanol comme produits finaux de fermentation, du fait de l’absence d’enzyme à activité 3- hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase dans ce mutant. Le mutant obtenu produit principalement de l’éthanol, ainsi qu’une faible quantité d’acétone. La connaissance de ce micro-organisme a longtemps été limitée par les difficultés rencontrées lors de son édition génétique, en particulier du fait des faibles efficacités de transformation et des faibles fréquences de recombinaison homologue entre un acide nucléique exogène et le chromosome de ce micro-organisme. De nombreux outils génétiques ont été spécifiquement développés pour pallier ces limitations (Joseph RC. et al., 2018). En particulier, la création d’outils dédiés basés sur la technologie CRISPR-Cas9 permet désormais de réaliser des éditions génomiques spécifiques, précises, rapides et ne laissant aucune marque dans le génome. La force de l’outil CRISPR-Cas9 repose sur la capacité de la nucléase Cas9 à créer une coupure double brin au sein de l’acide nucléique ciblé à un site précis. Lorsqu’un acide nucléique essentiel – tel que le chromosome – est ciblé, le micro-organisme ne pourra survivre qu’en réparant cette coupure, via une modification de la séquence ciblée à l’aide d’une matrice d’édition fournie. Il est également possible d’éliminer un acide nucléique non essentiel, puisque la création d’une coupure double brin dans sa séquence mènera à sa perte plutôt qu’à sa réparation. Il est cependant impossible, ou très fastidieux, d’éditer un acide nucléique non essentiel, dans le cas où aucune condition de culture ne permet de le rendre essentiel). L’inventeur décrit dans le contexte de la présente invention une stratégie d’édition du mégaplasmide pSOL à l’aide d’un outil CRISPR-Cas9 via la création d’un mutant bactérien dans lequel les inventeurs ont découvert, de manière inattendue, que cet élément génétique devenait indispensable. Ce caractère indispensable peut-être exploité afin de réaliser des modifications de manière beaucoup plus simple et rapide que ce qu’il est envisageable de réaliser dans la souche sauvage. La modification décrite dans la présente invention et qui confère au mégaplasmide pSOL son caractère indispensable peut-être annulée en réintroduisant l’information génétique supprimée à l’aide d’un outil génétique tel que l’outil CRISPR-Cas9 par exemple. RESUME DE L’INVENTION Les inventeurs décrivent, dans le contexte de la présente invention, des bactéries du genre Clostridium, typiquement les bactéries solvantogènes, dont le mégaplasmide pSOL peut être modifié génétiquement. Ils décrivent en particulier, pour la première fois, une bactérie C. acetobutylicum dont le gène hbd a été rendu non fonctionnel et son utilisation dans un procédé visant à transformer et de préférence modifier génétiquement son plasmide pSOL, en particulier à l’aide d’un outil de type CRISPR-Cas. Les inventeurs décrivent en particulier l’utilisation d’un outil d’édition génétique, de préférence l’outil CRISPR-Cas, pour modifier génétiquement le plasmide pSOL d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, en particulier Clostridium acetobutylicum, ladite bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. Une modification chromosomique particulière, préférée dans le cas de C. acetobutylicum, est la délétion ou l’inactivation du gène hbd. Une bactérie génétiquement modifiée particulière n’exprimant pas le produit du gène hbd, n’exprime pas le produit du gène de séquence SEQ ID NO : 34, ou exprime une version non fonctionnelle dudit produit. Une bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime en outre pas le gène pdc de séquence SEQ ID NO : 35 ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. La bactérie génétiquement modifiée particulière n’exprimant pas le produit du gène hbd ou exprimant une version non fonctionnelle dudit produit peut en effet être avantageusement utilisée pour obtenir une bactérie n’exprimant pas en outre un acide nucléique présent sur le mégaplasmide pSOL, par exemple un acide nucléique non essentiel tel que le gène pdc, ou exprimant une version non fonctionnelle de celui-ci. Une bactérie génétiquement modifiée particulièrement préférée selon l’invention correspond à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 969, telle qu’enregistrée le 17 février 2023 sous le numéro de dépôt LMG P-32993 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que « Δhbd »). L’invention vise également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celle-ci. Les inventeurs décrivent en outre des procédés de production d’une bactérie recombinante telle que décrite dans le présent texte, en particulier des procédés comprenant la délétion ou l’inactivation du gène hbd, de manière à empêcher ou diminuer l’expression de la protéine fonctionnelle correspondante. Les inventeurs décrivent en outre les plasmides pCas9acr de séquence SEQ ID NO : 23, pEC750C de séquence SEQ ID NO : 24, pGRNAind de séquence SEQ ID NO : 25, pGRNAcon de séquence SEQ ID NO : 26, pAN2 de séquence SEQ ID NO : 27 , pGRNA-hbd de séquence SEQ ID NO : 28, pGRNA-Δhbd de séquence SEQ ID NO : 29, pGRNA-pdc de séquence SEQ ID NO : 30, pGRNA-Δpdc de séquence SEQ ID NO : 31 et pGRNA-CΔhbd de séquence SEQ ID NO : 32, ainsi que l’utilisation de l’un, de plusieurs ou de l’ensemble d’entre eux pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie du genre Clostridium de manière à améliorer sa capacité de production de molécule(s) biosourcée(s), par exemple de solvant(s), de biocarburant(s) ou de tout produit(s) intermédiaire(s) (bio)chimique(s). L’invention vise en particulier un outil CRISPR, en particulier CRISPR-Cas, pour transformer et modifier génétiquement une bactérie. Cet outil génétique comprend une nucléase capable de cibler le mégaplasmide pSOL. Il comprend en outre i) un ARN guide (ARNg) comprenant une structure ARN de fixation à l’enzyme Cas et une séquence complémentaire d’une portion du plasmide pSOL ciblée par l’enzyme Cas, et ii) une matrice de réparation permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le remplacement de la portion ciblée au sein de pSOL par une séquence d’intérêt. L’invention vise également les outils d’échange allélique, tel que l’outil ACE®, pour transformer et modifier génétiquement une bactérie. Cet outil génétique comprend i) un marqueur de sélection, ii) un marqueur de contre-sélection et iii) un acide nucléique, permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, de modifier la portion reconnue ou de remplacer la portion reconnue au sein de pSOL par une séquence d’intérêt. L’invention vise aussi un procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage, ainsi que la bactérie modifiée génétiquement susceptible d’être obtenue par ce procédé. Ledit procédé comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un plasmide sélectionné parmi les plasmides pCas9acr de séquence SEQ ID NO : 23, pEC750C de séquence SEQ ID NO : 24, pGRNAind de séquence SEQ ID NO : 25, pGRNAcon de séquence SEQ ID NO : 26, pAN2 de séquence SEQ ID NO : 27, pGRNA-hbd de séquence SEQ ID NO : 28, pGRNA-Δhbd de séquence SEQ ID NO : 29, pGRNA-pdc de séquence SEQ ID NO : 30, pGRNA-Δpdc de séquence SEQ ID NO : 31 et pGRNA-CΔhbd de séquence SEQ ID NO : 32. De préférence, ledit procédé comprend aussi une étape de délétion ou d’inactivation d’un gène rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie, ou implique autrement une bactérie recombinante du genre Clostridium comprenant déjà une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. Les inventeurs décrivent également l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage correspondante en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, dans un procédé de modification génétique d’une bactérie du genre Clostridium, ou pour fabriquer une bactérie dérivée modifiée génétiquement. Ils décrivent aussi l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage correspondante en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, ou d’une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, pour produire une molécule biosourcée ou un mélange de molécules biosourcées, par exemple un solvant, un biocarburant ou un mélange de carburants, en particulier à l’échelle industrielle. L’invention vise aussi un procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie génétiquement modifiée telle que décrite dans le présent texte, typiquement d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, ou d’une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée. Les inventeurs décrivent enfin des kits, en particulier un kit pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium, et un kit pour produire une molécule biosourcée, par exemple un solvant, un biocarburant ou tout produit intermédiaire (bio)chimique, à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, ledit kit comprenant i) une bactérie appartenant au genre Clostridium selon l’invention, en particulier une bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie ou une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, et ii) un milieu de conservation ou un milieu de culture de ladite bactérie, en particulier un milieu de culture adapté contenant un sucre ou un mélange de sucres, préférentiellement un hexose et/ou un pentose, encore plus préférentiellement du glucose, de l’arabinose et/ou du xylose. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION Bien qu’utilisées en industrie depuis plus d’un siècle, les connaissances sur les bactéries appartenant au genre Clostridium, en particulier sur les bactéries solvantogènes, restent très limitées. Une contrainte majeure rencontrée par les industriels concerne l’impossibilité de modifier de manière simple la séquence du mégaplasmide pSOL à l’aide d’une technologie d’édition, en particulier à l’aide d’une technologie faisant intervenir une nucléase responsable d’une coupure double brins, telle que la nucléase Cas9. L’emploi d’une nickase (enzyme de type endonucléase responsable d’une coupure simple brin au niveau d’un site de restriction) est envisageable mais reste compliquée. Malgré les difficultés, bien connues de l’homme du métier, rencontrées pour modifier génétiquement les bactéries appartenant au genre Clostridium, les inventeurs sont parvenus, pour la première fois dans le contexte de la présente invention, à obtenir une bactérie C. acetobutylicum dont la séquence du mégaplasmide pSOL peut être très avantageusement modifiée de manière simple et rapide, en particulier à l’aide d’une technologie d’édition génétique telle que la technologie CRISPR-Cas. Les inventeurs sont en effet parvenus à réaliser des modifications génétiques précises au sein du mégaplasmide pSOL de la souche de C. acetobutylicum DSM 792. La bactérie Clostridium acetobutylicum étant considérée comme un représentant modèle des Clostridium solvantogènes, les données expérimentales divulguées dans le cadre de la présente description fournissent une preuve de concept à l’homme du métier. Une telle stratégie de modification n’avait jusqu’à présent jamais été employée chez C. acetobutylicum. Les inventeurs révèlent ainsi pour la première fois que le mégaplasmide pSOL est indispensable dans une souche C. acetobutylicum dont le gène hbd a été inactivé (également identifiée dans le présent texte entant que souche « ∆hbd »). La possibilité de modifier le mégaplasmide pSOL avec un outil d’édition génétique tel que l’outil CRISPR- Cas permet de bénéficier des points forts de cet outil et des outils similaires, i.e., de leur précision, de leur facilité d’utilisation, de leur rapidité, du fait qu’ils permettent de réaliser des modifications au nucléotide près, et du fait qu’ils ne nécessitent pas l’intégration d’un marqueur de résistance dans le génome du micro- organisme à modifier, et peuvent donc être utilisés pour introduire de manière séquentielle un nombre non limité de modifications. Grâce à la présente invention, l’ensemble des éléments génétiques constituant en particulier le génome de C. acetobutylicum est désormais modifiable avec un outil d’édition de ce type. Une fois les différentes modifications désirées réalisées, la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie bactérienne peut facilement être corrigée (par exemple le gène hbd délété peut être réintroduit) dans le génome à son locus d’origine, permettant ainsi d’obtenir un micro-organisme ne possédant plus que les modifications génétiques d’intérêt, par exemple des modifications permettant d’améliorer sa capacité à produire un biocarburant ou une molécule biosourcée, tel que par exemple un solvant ou un produit intermédiaire chimique, à partir d’une biomasse ou à partir d’une culture énergétique dédiée. Dans le contexte de la présente invention, on entend par « molécule biosourcée » une molécule, de type alcool ou cétone, dont la spécificité est que la matière première utilisée pour sa production est obligatoirement issue de biomasse végétale, par exemple de biomasse lignocellulosique, et non pas issue de ressources d’origines fossiles telles que le pétrole, le charbon ou le gaz naturel. La mise en œuvre de la présente invention peut, de manière plus générale, être envisagée pour modifier tout élément génétique non essentiel, tel que le plasmide pSOL, dès lors qu’une modification chromosomique préalable a permis de rendre ledit « élément génétique non essentiel » indispensable à la survie de la bactérie (dans au moins une condition de culture donnée de ladite bactérie). La présente description vise ainsi en particulier l’utilisation d’un outil d’édition génétique, de préférence un outil CRISPR, faisant intervenir une (endo)nucléase capable de cibler le mégaplasmide pSOL pour modifier génétiquement ledit plasmide pSOL d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, ladite bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. Elle vise également les outils d’échange allélique pour transformer et modifier génétiquement une bactérie. Un outil d’échange allélique particulier est par exemple un outil ACE® comprenant un acide nucléique comprenant une séquence complémentaire d’une portion du plasmide pSOL utilisable en tant que matrice de recombinaison homologue, permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, de modifier la portion reconnue ou de remplacer la portion reconnue au sein de pSOL par une séquence d’intérêt. Par « bactérie du genre Clostridium », on entend en particulier les espèces de Clostridium dites d’intérêt industriel, typiquement les bactéries solvantogènes ou acétogènes du genre Clostridium. L’expression « bactérie du genre Clostridium » englobe les bactéries sauvages ainsi que les souches dérivées de celles- ci, modifiées génétiquement dans le but d’améliorer leur performance. Par « espèce de Clostridium d’intérêt industriel » ou bactérie « Clostridium d’intérêt industriel » on entend les espèces capables de produire, par fermentation, des solvants tels que l’éthanol, le butanol, l’acétone ou l’isopropanol et/ou des acides tels que l’acide butyrique, l’acide acétique ou l’acide lactique, à partir de sucres ou d’oses, typiquement à partir de sucres comprenant 5 atomes de carbone tels que le xylose, l’arabinose ou le fructose, de sucres comprenant 6 atomes de carbones tels que le glucose ou le mannose, de polysaccharides ou polyosides tels que la cellulose ou une hémicellulose, et/ou de toute autre source de carbone assimilable et utilisable par les bactéries du genre Clostridium (CO, CO2, et méthanol par exemple). Des exemples de bactéries solvantogènes d’intérêt sont les bactéries du genre Clostridium productrices d’acétone, de butanol, d’éthanol et/ou d’isopropanol (propan-2-ol), telles que les souches identifiées dans la littérature en tant que « souche ABE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, de butanol et d’éthanol], « souche IBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’isopropanol (ou propan-2-ol) par réduction de l’acétone, de butanol et d’éthanol] et « souche AIBE » [souches réalisant des fermentations permettant la production d’acétone, d'isopropanol (ou propan- 2-ol), de butanol et d’éthanol]. Dans un mode de réalisation particulier préféré, la bactérie appartenant au genre Clostridium est la bactérie Clostridium acetobutylicum, par exemple une souche sélectionnée parmi ATCC 824, ATCC 55025, LMG 5710, DSM 792, DSM 1731, DSM 1732, LMG 5710, en particulier la souche DSM 792. Dans le présent texte, les termes « outil d’édition génétique » visent tout outil génétique connu de l’homme du métier dont ce dernier sait qu’il ne permet pas de modifier un élément génétique non indispensable à la survie bactérienne de la bactérie sauvage, tel que le plasmide pSOL. Il s’agit par exemple d’un outil génétique permettant de modifier le génome d’un microorganisme telle qu’une bactérie dont le fonctionnement implique des événements de recombinaison homologue requérant l’utilisation d’un marqueur de contre-sélection. L'expression « recombinaison homologue » fait référence à l'événement de substitution d'un segment d'ADN par un autre qui possède des régions identiques (homologues) ou presque. Les procédés de modification connus les plus performants pour obtenir des souches modifiées génétiquement sont basés sur des événements de recombinaison homologue, ceux-ci permettant de modifier le génome de manière précise et stable. Dans le contexte de la présente invention, un « élément génétique non indispensable à la survie bactérienne » est un élément qui peut être supprimé ou inactivé sans que cela ne nuise à la survie de la bactérie, tel que par exemple un plasmide ou tout élément mobilisable ne contenant pas de gène essentiel à la survie de la bactérie dans les conditions de cultures classiquement utilisées par l’homme de métier. Les termes « marqueur de contre-sélection » ou « marqueur de sélection négative » désignent tout produit capable de provoquer la mort de la cellule ou du microorganisme (par exemple de la bactérie) génétiquement modifié dans certaines conditions, contrôlables et connues de l’homme du métier, par exemple toute molécule toxique (toxine) ou tout gène dont le produit d’expression permet la synthèse d’une molécule toxique pour le microorganisme, ainsi que toute nucléase capable de cibler spécifiquement une séquence d’acide nucléique d’intérêt au sein du microorganisme, et toute protéine associée à l’outil CRISPR. La toxine peut être par exemple le 5-Fluorouridine monophosphate (5-FUMP) ou la toxine MazF du système Toxine-antitoxine MazE-MazF d’Escherichia coli. Le gène dont le produit d’expression permet la synthèse d’une molécule toxique pour le microorganisme peut être par exemple upp, dont le produit permet, entre autres, la formation de 5-FUMP à partir de 5- Fluorouracile, ou mazF. La nucléase capable de cibler (reconnaître et lier) spécifiquement une séquence d’acide nucléique d’intérêt au sein du microorganisme, peut être par exemple une enzyme de type TALEN, une nucléase à doigt de zinc, ou une nucléase Cas de type Cas9 ou Cas12, en particulier Cas12a, par exemple MAD7. Dans le contexte de la présente invention, la séquence d’acide nucléique d’intérêt reconnue par la nucléase est un élément génétique non essentiel à la survie de la forme sauvage du microorganisme d’intérêt, par exemple de la bactérie. L’outil d’édition génétique est typiquement un outil de modification du matériel génétique d’un microorganisme par recombinaison homologue, typiquement par mutation, insertion ou délétion d’une séquence d’intérêt. Il peut être sélectionné par exemple parmi les outils d’échange allélique (par exemple l’outil ACE®) ou les outils CRISPR utilisant des nucléases réalisant des coupures double brin au niveau de l’ADN cible. Quel que soit l’outil d’édition génétique choisi, l’enzyme de type (endo)nucléase susceptible d’être utilisée dans le cadre de l’invention doit être capable de reconnaître un élément génétique non essentiel à la survie de la forme sauvage du microorganisme d’intérêt. Dans le cas de la bactérie appartenant au genre Clostridium, en particulier dans le cas de C. acétobutylicum, l’enzyme reconnaît de préférence le mégaplasmide pSOL. Dans un mode de réalisation préféré, l’outil d’édition génétique est un outil CRISPR, de manière préférée CRISPR-Cas9 ou CRISPR-Cas12, de manière encore plus préférée CRISPR-Cas9. L’introduction dans la bactérie de tout acide nucléique d’intérêt peut être réalisée par toute méthode, directe ou indirecte, connue de l’homme du métier, par exemple par transformation, conjugaison, microinjection, transfection, électroporation, etc., de préférence par électroporation (Mermelstein et al, 1993). Par ailleurs, ces acides nucléiques d’intérêt (par exemple des fragments d’ADN, fragments d’ARN, cassettes d’expression ou vecteurs d’expression) peuvent être intégrés au sein du génome bactérien par des techniques elles-aussi bien connues de l’homme du métier. Un objet particulier de l’invention vise ainsi un outil d’édition génétique CRISPR-Cas ou un outil d’échange allélique, pour transformer et modifier génétiquement une bactérie. Le terme « transformation » fait référence à l'incorporation d’au moins un acide nucléique exogène par une cellule, cette acquisition de nouvelle(s) séquence(s), par exemple de nouveau(x) gène(s), étant transitoire (si l’acide nucléique exogène porteur des gènes peut par la suite être éliminé) ou permanente (dans le cas où l’acide nucléique exogène est intégré dans l’ADN de la cellule hôte). Lorsque l’outil d’édition génétique est un outil CRISPR-Cas, il comprend de préférence une nucléase capable de cibler le mégaplasmide pSOL. Il comprend en outre i) un ou plusieurs ARN guides (ARNg), chaque ARN guide comprenant une structure ARN de fixation à l’enzyme Cas et une séquence complémentaire de tout ou partie, typiquement d’une portion, du plasmide pSOL (de 180 kB) ciblée par l’enzyme Cas, et ii) une matrice de réparation permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le remplacement de la portion ciblée au sein de pSOL par une séquence d’intérêt. Les inventeurs ont en particulier mis au point des outils et méthodes, décrits dans le brevet EP3362559 et dans la demande EP3578662 ainsi que dans les demandes EP3898970 et FR3096373 (incorporées par référence), permettant de modifier de façon ciblée le génome de ce microorganisme. Ils ont en particulier décrit un outil faisant intervenir la technologie CRISPR-Cas comprenant deux acides nucléiques, l’un contenant les éléments génétiques permettant l’expression contrôlée de la nucléase Cas (qui réalise une coupure double brin au sein d’une molécule d’acide nucléique), et l’autre au moins un ARN guide (ARNg) ciblant la région d’ADN à modifier ainsi qu’une matrice de réparation. De manière préférée (cf. EP 3578662), au moins l’un desdits acides nucléiques comprend en outre une séquence codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible. L’outil génétique peut autrement comprendre en outre un troisième acide nucléique codant une protéine anti-CRISPR de préférence placée sous le contrôle d’un promoteur inductible. Un outil CRISPR-Cas particulier préféré comprend au moins : - un « premier » acide nucléique codant au moins une endonucléase d’ADN, par exemple l’enzyme Cas9, dans lequel la séquence codant l’endonucléase d’ADN est placée sous le contrôle d’un promoteur, et - au moins un « deuxième » acide nucléique contenant une matrice de réparation permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, le remplacement d’une portion de l’ADN bactérien ciblée (« séquence d’ADN cible ») par l’endonucléase par une « séquence d’intérêt ». Dans cet outil, soit au moins l’un desdits acides nucléiques code en outre un ou plusieurs ARN guides (ARNg) soit l’outil génétique comprend en outre un ou plusieurs ARN guides, chaque ARN guide comprenant une structure ARN de fixation à l’endonucléase d’ADN et une séquence complémentaire de la portion ciblée de l’ADN bactérien. De préférence, soit au moins l’un desdits acides nucléiques comprend en outre une séquence codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible, soit l’outil génétique comprend en outre un troisième acide nucléique codant une protéine anti-CRISPR placée sous le contrôle d’un promoteur inductible. L’homme du métier peut aisément définir la séquence et la structure des ARNg selon la région chromosomique ou l’élément génétique mobile à cibler en utilisant des techniques bien connues (voir par exemple l’article de DiCarlo et al., 2013). Un autre objet particulier de l’invention vise un outil d’édition génétique de type outil d’échange allélique, par exemple un outil ACE®, pour transformer et modifier génétiquement une bactérie, basé sur l’utilisation d’au moins un marqueur de sélection et d’au moins un marqueur de contre-sélection localisés entre deux séquences nucléiques homologues aux régions situées de part et d’autre de la séquence nucléique à modifier. L’outil ACE selon l’invention comprend i) un marqueur de sélection, ii) marqueur de contre-sélection, et iii) une séquence complémentaire d’une portion du plasmide pSOL utilisable en tant que matrice de recombinaison homologue, permettant, par un mécanisme de recombinaison homologue, de modifier la portion reconnue ou de remplacer la portion reconnue au sein de pSOL par une séquence d’intérêt en outre. L’expression « marqueur » ou « gène marqueur » fait référence à une séquence codant une protéine marqueur sous le contrôle d'éléments régulateurs fonctionnels permettant la synthèse de ladite protéine dans Clostridia. Les gènes marqueurs de sélection peuvent être divisés en plusieurs sous-catégories selon qu'ils confèrent une sélection positive ou négative, et selon que la sélection est conditionnelle ou non- conditionnelle à la présence de substrats externes. Les gènes marqueurs dits « de sélection positive » favorisent la croissance des cellules dont le génome a été génétiquement modifiée. La détection de ces gènes marqueurs à sélection positive est subordonnée à l'utilisation d'agents toxiques (antibiotiques, herbicides ou médicaments). Ces gènes sont par exemple des gènes de résistance à un antibiotique comme les gènes nptI et nptII conférant une résistance à l'antibiotique kanamycine; dans ce cas, toutes les cellules ayant acquis le transgène résisteront à l'antibiotique alors que les autres seront tuées. L'utilisation de gènes marqueurs de sélection positive de ce type présente le double « avantage » de permettre à la fois le repérage et un tri rapide des cellules génétiquement modifiées (les seuls à survivre), par rapport à celles n'ayant pas acquis l’acide nucléique d’intérêt (le « transgène »). Inversement, les gènes marqueur dits « de contre-sélection » ou « de sélection négative », « négativement sélectionnables » provoquent la mort des cellules ou organismes génétiquement modifiés dans certaines conditions, contrôlables et connues de l'expérimentateur. Dans le cadre de l’invention, le marqueur de sélection permet typiquement de sélectionner l’événement d’intégration, par recombinaison homologue, dans le génome hôte de la séquence d'intérêt apportée par l’outil génétique. Lorsqu’il est présent, le marqueur de contre-sélection permet de sélectionner le second évènement de recombinaison homologue en lien avec l’excision de l’outil génétique. La technologie ACE® repose par exemple sur l’utilisation d’un mutant auxotrophe (pour l’uracile chez C. acetobutylicum ATCC 824 par délétion du gène pyrE, qui provoque également une résistance à l’acide 5- fluoroorotique (A-5-FO) ; Heap et al., 2012). Le système utilise le mécanisme d’échange allélique, bien connu de l’homme de métier. Suite à une transformation avec un vecteur pseudo-suicide, l’intégration de ce dernier dans le chromosome bactérien par un premier évènement d’échange allélique est sélectionné grâce au gène de résistance présent initialement sur le plasmide. L’étape d’intégration peut être réalisée de deux manières différentes, soit au sein du locus pyrE soit au sein d’un autre locus : dans le cas de l’intégration au locus pyrE, le gène pyrE est également placé sur le plasmide, sans toutefois être exprimé (pas de promoteur fonctionnel). La deuxième recombinaison restaure un gène pyrE fonctionnel et peut alors être sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum, ne contenant pas d’uracile). Le gène pyrE non- fonctionnel présentant également un caractère sélectionnable (sensibilité au A-5-FO), d’autres intégrations sont ensuite envisageables sur le même modèle, en alternant successivement l’état de pyrE entre fonctionnel et non-fonctionnel. Dans le cas de l’intégration à un autre locus, une zone génomique permettant une expression du marqueur de contre-sélection après recombinaison est ciblée (typiquement, un opéron après un autre gène, de préférence un gène fortement exprimé). Cette deuxième recombinaison est alors sélectionnée par auxotrophie (milieu minimum ne contenant pas d’uracile). Dans le contexte de la présente invention, l'expression « séquence d'ADN cible » désigne tout gène, région intergénique, promoteur et/ou séquence régulatrice d'intérêt choisi par l'homme du métier de préférence localisée sur le mégaplasmide pSOL. Il s'agit notamment de gènes codant pour des protéines d'intérêt, par exemple des enzymes impliquées dans le métabolisme cellulaire. Un autre exemple particulier de séquence d’ADN cible correspond i) à tout ou partie de la séquence codant le gène hbd (SEQ ID NO : 34), à une séquence comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 1 et 40 nucléotides, de préférence une séquence comprenant 14, 15, 16, 17, 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucléotides de ladite séquence codante, ii) à une séquence contrôlant la transcription de ladite séquence codante, typiquement une séquence promotrice, ou iii) une séquence flanquant ladite séquence codante. Une séquence flanquante comprend typiquement 1, 10 ou 20 et 1000 nucléotides, par exemple entre 1, 10 ou 20 et 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300 ou 200 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 100 nucléotides, entre 1, 10 ou 20 et 50 nucléotides, ou entre 1, 10 ou 20 et 40 nucléotides, par exemple entre 10 et 40 nucléotides, entre 10 et 30 nucléotides, entre 10 et 20 nucléotides, entre 20 et 30 nucléotides, entre 15 et 40 nucléotides, entre 15 et 30 nucléotides ou entre 15 et 20 nucléotides. Les expressions « séquence d'intérêt » et « acide nucléique d’intérêt » désignent une séquence codante ou non. Par « acide nucléique », on entend au sens de l’invention, toute molécule d’ADN ou d’ARN naturelle, synthétique, semi-synthétique ou recombinante, éventuellement modifiée chimiquement (i.e. comprenant des bases non naturelles, des nucléotides modifiés comprenant par exemple une liaison modifiée, des bases modifiées et/ou des sucres modifiés), ou optimisée de manière à ce que les codons des transcrits synthétisés à partir des séquences codantes soient les codons les plus fréquemment trouvés chez une bactérie du genre Clostridium en vue de son utilisation chez celle-ci. Dans le cas du genre Clostridium, les codons optimisés sont typiquement des codons riches en bases adénines (« A ») et thymines (« T »). Dans un mode de réalisation particulier décrit, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins deux régions complémentaires chacune d’une séquence cible, identiques à 100% ou identiques à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à ladite région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome du microorganisme, par exemple du génome bactérien. Ces régions sont capables de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence telle que décrite ci-dessus comprenant au moins 1 nucléotide, de préférence au moins 100 nucléotides, typiquement entre 100 et 1000 nucléotides. Les régions complémentaires de la séquence cible présentes au sein de l’acide nucléique d’intérêt peuvent reconnaître, de préférence cibler, les régions flanquantes en 5’ et en 3’ de la séquence ciblée dans un outil de modification génétique connu de l’homme du métier, typiquement tout outil basé sur la recombinaison homologue. Dans un mode de réalisation particulier préféré, une partie de l’acide nucléique d’intérêt reconnait en outre (lie au moins en partie), et de préférence cible, i.e. reconnait et permet la coupure, dans le génome d’une bactérie Clostridium d’intérêt, d’au moins un brin i) d’une séquence cible, ii) d’une séquence contrôlant la transcription d’une séquence cible, ou iii) d’une séquence flanquant une séquence cible. La séquence reconnue est également identifiée dans le présent texte en tant que « séquence cible » ou « séquence ciblée ». Dans ce même mode de réalisation particulier préféré, l’acide nucléique d’intérêt comprend au moins une région complémentaire de la séquence cible identique à 100% ou identique à 80% au moins, de préférence à 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% au moins à la région/portion/séquence d’ADN ciblée au sein du génome bactérien et est capable de s’hybrider à tout ou partie de la séquence complémentaire de ladite région/portion/séquence, typiquement à une séquence comprenant au moins 5 nucléotides, de préférence au moins 5, 10, 14, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 nucléotides, typiquement entre 15 et 30 nucléotides, de préférence à une séquence comprenant 18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucléotides. Le ou les acides nucléiques d’intérêt tels que décrits dans le cadre de la présente l’invention sont capables de supprimer la ou lesdites séquences cibles du génome du microorganisme ou de modifier leur expression, par exemple de les moduler/ réguler, en particulier de les inhiber, de préférence de les modifier de manière à rendre ledit microorganisme incapable d’exprimer une ou plusieurs protéines, en particulier une ou plusieurs protéines fonctionnelles, à partir de ladite ou desdites séquences. Selon un autre aspect de l’invention, le ou les acides nucléiques d’intérêt tels que décrits dans le cadre de la présente l’invention sont capables d’introduire une séquence d’intérêt dans le génome du microorganisme de manière à rendre ledit microorganisme capable d’exprimer une ou plusieurs protéines, en particulier une ou plusieurs protéines fonctionnelles, à partir de ladite ou desdites séquences. La séquence d’intérêt peut être une séquence mutée de la séquence d’ADN cible, par exemple du gène cible, du promoteur ou de la séquence régulatrice et/ou d’un marqueur tel qu’un gène de résistance aux antibiotiques ou une enzyme génératrice de couleur. La séquence d’intérêt peut être qualifiée d’« acide nucléique exogène » si sa portion codante ne présente aucune homologie avec la séquence sauvage dont la modification génétique est recherchée. La séquence d’intérêt peut être plus longue ou plus courte que la séquence remplacée (« séquence d’ADN cible »), selon la distance séparant les deux régions homologues. L’acide nucléique d’intérêt peut être un ARN naturel, synthétique ou produit par une technique de recombinaison. Cet acide nucléique d’intérêt peut être préparé par toute méthode connue de l’homme du métier telles que, par exemple, la synthèse chimique, la transcription in vivo ou des techniques d’amplification. Lorsque le ou les acides nucléiques d’intérêt sont introduits dans la cellule directement sous la forme de molécules d’ARN (matures ou précurseurs), par exemple d’ARN guide (ARNg), ces molécules peuvent contenir des nucléotides modifiés ou des modifications chimiques leur permettant, par exemple, d’augmenter leur résistance aux nucléases et d’augmenter ainsi leur durée de vie dans la cellule. Ils peuvent notamment comprendre au moins un nucléotide modifié ou non naturel tel que, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée, telle que l’inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylarnino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l’hybridation. Les acides nucléiques d’intérêt utilisés selon l’invention peuvent également être modifiés au niveau de la liaison internucléotidique comme le sont par exemple les phosphorothioates, les H-phosphonates ou les alkyl-phosphonates, ou au niveau du squelette comme le sont par exemple les alpha-oligonucléotides, les 2'-O-alkyl riboses ou les PNA (Peptide Nucleic Acids) (Egholm et al., 1992). Un exemple particulier d’acide nucléique d’intérêt, utilisé pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie Clostridium d’intérêt, est un fragment d’ADN i) reconnaissant une séquence codant, ii) contrôlant la transcription d’une séquence codant, ou iii) flanquant une séquence codant, l’enzyme Hbd (3- hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase). L’acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le cadre de la présente invention est de préférence capable de supprimer ladite séquence cible du génome du microorganisme, par exemple de la bactérie, ou de modifier son expression, par exemple de la moduler/ réguler, en particulier de l’inhiber, de préférence de la modifier de manière à rendre ledit microorganisme incapable d’exprimer une protéine (typiquement une protéine Hbd), en particulier une protéine fonctionnelle, à partir de ladite séquence. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l’acide nucléique d’intérêt est capable de modifier le microorganisme de manière à le rendre incapable d’exprimer la protéine Hbd. La protéine anti-CRISPR est une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action de l’endonucléase d’ADN, typiquement de Cas, et/ou une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action d’un système CRISPR-Cas, par exemple d’un système CRISPR-Cas de type II lorsque la nucléase est une nucléase de type Cas9, de préférence durant la phase d’introduction des séquences d’acide nucléique de l’outil génétique dans la souche bactérienne d’intérêt. Cette séquence est typiquement placée sous le contrôle d’un promoteur inductible différent des promoteurs contrôlant l’expression de l’endonucléase d’ADN et/ou du ou des ARNg, et est inductible par un autre agent inducteur. Ce promoteur peut être par exemple sélectionné parmi le promoteur Pbgal (inductible au lactose), le promoteur du gène tetA, du gène xylA ou du gène lacI, ou un dérivé de ceux-ci. Le promoteur contrôlant l’expression de la protéine anti-CRISPR permet de maîtriser avantageusement l’action de l’endonucléase d’ADN, par exemple de l’enzyme Cas9, et d’ainsi faciliter la transformation des bactéries et l’obtention de transformants ayant subi les modifications génétiques souhaitées. La protéine anti-CRISPR est typiquement une protéine « anti-Cas9 » ou une protéine « anti-MAD7 », i.e. une protéine capable d’inhiber ou d’empêcher/de neutraliser l’action de Cas9 ou de MAD7. La protéine anti-CRISPR est avantageusement une protéine « anti-Cas9 », par exemple sélectionnée parmi AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3, AcrIIA4, AcrIIA5, AcrIIC1, AcrIIC2 et AcrIIC3 (Pawluk et al, 2018). De manière préférée la protéine « anti-Cas9 » est AcrIIA2 ou AcrIIA4. De manière encore plus préférée la protéine « anti-Cas9 » est AcrIIA4. Une telle protéine est typiquement capable de limiter très significativement, idéalement d’empêcher, l’action de Cas9, par exemple en se fixant sur l’enzyme Cas9 (Dong et al, 2017 ; Rauch et al, 2017). Une autre protéine anti-CRISPR avantageusement utilisable est une protéine « anti- MAD7 », par exemple la protéine AcrVA1 (Marino et al, 2018). Une modification chromosomique particulière, préférée en particulier dans le cas de C. acetobutylicum, est la délétion ou l’inactivation du gène hbd. Une bactérie génétiquement modifiée particulière n’exprime pas le produit du gène de séquence SEQ ID NO : 34, ou exprime une version non fonctionnelle dudit produit. Dans le contexte de la présente invention, le terme « gène hbd » vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 34 (CA_C2708). Le terme « gène hbd » vise aussi les variants de ladite séquence SEQ ID NO : 34, en particulier les variants présentant une homologie de séquence avec ladite séquence SEQ ID NO : 34. Le terme « gène hbd » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine (enzyme) (S)-3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase (Hbd), en particulier une protéine apte à/ capable d’exercer une activité 3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase. Le terme « gène hbd » vise aussi une séquence nucléotidique variante codant une protéine capable de lier en particulier le promoteur du gène « hbd » (CA_C2708, SEQ ID NO : 34). Dans un mode de réalisation particulier, Le terme « gène hbd » vise également une séquence codant un fragment ou variant fonctionnel de la protéine Hbd, en particulier une protéine apte à/ capable d’exercer une activité 3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase. A contrario, la version non fonctionnelle du produit du gène hbd est incapable d’exercer cette activité. Une bactérie particulière décrite par les inventeurs dans le présent texte n’exprime en outre pas le gène pdc de séquence SEQ ID NO : 35 ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Dans le contexte de la présente invention, le terme « gène pdc » vise en particulier la séquence SEQ ID NO : 35 (CA_P0025). Le terme « gène pdc » vise aussi les variants de ladite séquence SEQ ID NO : 35, en particulier les variants présentant une homologie de séquence avec ladite séquence SEQ ID NO : 35. Le gène pdc n’est qu’un exemple visant à démontrer la mise en œuvre possible de la présente invention avec n’importe quel gène d’intérêt. Un exemple typique de variant selon l’invention présente une homologie de séquence avec une séquence d’intérêt telle que la séquence SEQ ID NO : 34 ou avec la SEQ ID NO : 35 comprise entre 95% et 100%, et de préférence entre 96% et 100%. La séquence SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 35 et son variant sont par exemple homologues à au moins 95%, par exemple à au moins 96%, à au moins 97%, à au moins 98%, ou à au moins 99%. Selon un mode de réalisation préféré, la séquence SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 35 et son variant présentent des séquences homologues à au moins 96%, au moins 97%, ou au moins 98%. La bactérie génétiquement modifiée particulière n’exprimant pas le produit du gène hbd ou exprimant une version non fonctionnelle dudit produit peut être avantageusement utilisée pour obtenir une bactérie présentant au moins une autre modification génétique, typiquement une modification génétique du mégaplasmide pSOL. Dans un mode de réalisation particulier, cette bactérie présentant au moins une autre modification génétique, n’exprime pas un acide nucléique présent sur le mégaplasmide pSOL, par exemple un acide nucléique tel que le gène pdc, le gène adhE1, le gène adhE2, le gène ctfA, le gène ctfB, ou le gène adc, ou exprime une version non fonctionnelle de celui-ci. Dans un autre mode de réalisation particulier, cette bactérie présentant au moins une autre modification génétique, exprime une version modifiée d’un gène présent sur le mégaplasmide pSOL et/ou exprime un gène exogène, i.e. absent de la version sauvage du mégaplasmide pSOL. Une bactérie génétiquement modifiée particulièrement préférée selon l’invention correspond à la souche identifiée dans la présente description en tant que IFP 969 telle qu’enregistrée le 17 février 2023 sous le numéro de dépôt LMG P-32993 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que « Δhbd »). L’invention vise également toute bactérie dérivée, clone, mutant ou version génétiquement modifiée de celles-ci. Les inventeurs décrivent en outre des procédés de production d’une bactérie recombinante telle que décrite dans le présent texte, en particulier des procédés comprenant la délétion ou l’inactivation du gène hbd, de manière à empêcher ou diminuer l’expression de la protéine fonctionnelle correspondante, ou encore, voire éventuellement en outre, l’ajout d’une séquence codant un produit d’intérêt, de préférence un procédé faisant intervenir la technologie CRISPR, ainsi que les bactéries modifiées génétiquement susceptibles d’être obtenues par ce procédé, en particulier la bactérie IFP 969. Lorsque le procédé mis en œuvre utilise la technologie CRISPR, il comprend typiquement les étapes d’une méthode décrite dans le brevet EP3362559 ou dans la demande EP3578662. Les inventeurs décrivent en outre des acides nucléiques utilisés pour transformer une bactérie, ou une population de bactéries, appartenant au genre Clostridium. Un tel acide nucléique se présente typiquement sous la forme d’une cassette d’expression (ou « construction ») telle que par exemple un acide nucléique comprenant au moins un promoteur transcriptionnel ou une séquence régulatrice d’intérêt, lié(e) de manière opérationnelle (au sens où l’entend l’homme du métier) à une ou plusieurs séquences (codantes ou non) d’intérêt, par exemple à un opéron comprenant plusieurs séquence codantes d’intérêt dont les produits d’expression concourent à la réalisation d'une fonction d’intérêt au sein de la bactérie, ou un acide nucléique comprenant en outre une séquence activatrice et/ou un terminateur de transcription. Il se présente typiquement sous la forme d’un vecteur, circulaire ou linéaire, simple ou double brin, par exemple un plasmide, un phage, un cosmide, un chromosome artificiel ou synthétique, comprenant une ou plusieurs cassettes d’expression telles que définies ci-dessus. De manière préférée, le vecteur est un plasmide. Les acides nucléiques d’intérêt, typiquement les cassettes ou vecteurs d’expression, peuvent être construits par des techniques classiques bien connues de l’homme du métier et peuvent comporter un(e) ou plusieurs promoteurs, origines de réplication bactérienne (séquences ORI), séquences de terminaison, gènes de sélection, par exemple gènes de résistance à un antibiotique, et séquences (« régions flanquées ») permettant l’insertion ciblée de la cassette ou du vecteur. Par ailleurs, ces cassettes et vecteurs d’expression peuvent être intégrés au sein du génome bactérien par des techniques bien connues de l’homme du métier. Des séquences ORI d’intérêt peuvent être choisies parmi pIP404, pAMβ1, repH (origine de réplication chez C. acetobutylicum), ColE1 ou rep (origine de réplication chez E. coli), ou toute autre origine de réplication permettant le maintien du vecteur, typiquement du plasmide, au sein d’une cellule bactérienne appartenant au genre Clostridium. Des séquences de terminaison d’intérêt peuvent être choisies parmi celles des gènes adc, thl, de l’opéron bcs, ou de tout autre terminateur, bien connu de l’homme de l’art, permettant l’arrêt de la transcription au sein d’une cellule bactérienne. Des gènes de sélection (gènes de résistance) d’intérêt peuvent être choisis parmi ermB, catP, bla, tetA, tetM, et/ou tout autre gène de résistance à l’ampicilline, à l’érythromycine, au chloramphenicol, au thiamphénicol, à la spectinomycine, à la tétracycline ou à tout autre antibiotique pouvant être utilisé pour sélectionner des bactéries du genre Clostridium bien connu de l’homme de l’art. Sont ainsi décrits les plasmides pCas9acr de séquence SEQ ID NO : 23, pEC750C de séquence SEQ ID NO : 24, pGRNAind de séquence SEQ ID NO : 25, pGRNAcon de séquence SEQ ID NO : 26, pAN2 de séquence SEQ ID NO : 27 , pGRNA-hbd de séquence SEQ ID NO : 28, pGRNA-Δhbd de séquence SEQ ID NO : 29, pGRNA-pdc de séquence SEQ ID NO : 30, pGRNA-Δpdc de séquence SEQ ID NO : 31 et pGRNA-CΔhbd de séquence SEQ ID NO : 32, ainsi que l’utilisation de l’un, de plusieurs ou de l’ensemble d’entre eux pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie du genre Clostridium de manière à améliorer sa capacité de production de biocarburant(s) et/ou de molécule(s) biosourcée(s). L’invention vise aussi un procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage, de préférence C. acetobutylicum, ainsi que la bactérie modifiée génétiquement susceptible d’être obtenue par ce procédé. Ledit procédé comprend une étape de transformation de la bactérie par introduction dans ladite bactérie d’un outil de modification par recombinaison homologue tel que décrit ci-dessus, typiquement d’une cassette ou d’un vecteur d’expression, par exemple d’un plasmide sélectionné parmi les plasmides pCas9acr de séquence SEQ ID NO : 23, pEC750C de séquence SEQ ID NO : 24, pGRNAind de séquence SEQ ID NO : 25, pGRNAcon de séquence SEQ ID NO : 26, pAN2 de séquence SEQ ID NO : 27 , pGRNA-hbd de séquence SEQ ID NO : 28, pGRNA-Δhbd de séquence SEQ ID NO : 29, pGRNA-pdc de séquence SEQ ID NO : 30, pGRNA-Δpdc de séquence SEQ ID NO : 31 et pGRNA-CΔhbd de séquence SEQ ID NO : 32. Dans un mode de réalisation particulier dans lequel l’outil d’édition est un outil CRISPR, l’étape de transformation est de préférence réalisée en présence d’un agent inducteur de l’expression de la protéine anti-CRISPR codée par l’une des séquences de l’outil d’édition. Le procédé comprend de préférence également une étape de culture de la bactérie transformée. Cette étape de culture peut être réalisée sur un milieu ne contenant pas (ou dans des conditions n’impliquant pas) l’agent inducteur de l’expression de la protéine anti-CRISPR lorsque celle-ci est utilisée, et permettant typiquement l’expression du complexe ribonucléoprotéique endonucléase d’ADN et de l’ARNg, par exemple Cas9- ARNg (afin de stopper la production de ladite protéine anti-CRISPR et de permettre l’action de l’endonucléase). De préférence, le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage comprend une étape de modification génétique, typiquement de délétion ou d’inactivation, du ou des gènes rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie, ou implique autrement une bactérie recombinante du genre Clostridium comprenant déjà une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. L’étape de délétion ou d’inactivation est de préférence réalisée à l’aide d’un outil d’édition génétique de type CRISPR, par exemple de type CRISPR-Cas. Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie du genre Clostridium comprenant une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie est une bactérie dépourvue du gène hbd ou comprenant un gène hbd non fonctionnel. Le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage comprend de préférence une étape d’introduction dans la bactérie d’un outil génétique selon l’invention. Le procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage comprend de préférence une étape supplémentaire de modification génétique de la bactérie transformée à l’aide d’un outil génétique selon l’invention, de préférence d’un outil de type CRISPR, par exemple de type CRISPR-Cas, de manière à corriger la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie en restaurant la version sauvage de la séquence correspondante. Un procédé particulier selon l’invention est caractérisé en ce que la bactérie du genre Clostridium est une bactérie du genre Clostridium dépourvue du gène hbd ou comprenant un gène hbd non fonctionnel et en ce que l’étape supplémentaire de modification génétique de la bactérie transformée vise à réintroduire le gène hbd dans le génome de ladite bactérie ou à le rendre fonctionnel. Les inventeurs décrivent également l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage correspondante en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, dans un procédé de modification génétique d’une bactérie du genre Clostridium, ou pour fabriquer une bactérie dérivée modifiée génétiquement. Un objet préféré vise ainsi l’utilisation d’une bactérie recombinante selon l’invention, de préférence la bactérie identifiée dans la présente description en tant que IFP 969 telle qu’enregistrée le 17 février 2023 sous le numéro de dépôt LMG P-32993 auprès de la collection BCCM-LMG (également identifié dans le présent texte en tant que « Δhbd »), dans un procédé de modification/d’amélioration génétique d’une bactérie du genre Clostridium. Une telle bactérie est typiquement utilisable comme outil de laboratoire pour obtenir des souches de bactéries du genre Clostridium génétiquement améliorées. Les inventeurs décrivent ainsi également l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage correspondante en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, ou d’une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, pour fabriquer une bactérie dérivée modifiée génétiquement, utilisable à l’échelle industrielle pour produire une molécule biosourcée ou un mélange de molécules biosourcées, par exemple un solvant, un biocarburant ou tout produit intermédiaire (bio)chimique, en particulier un mélange de carburants, ou directement pour produire une ou des molécule(s) biosourcée(s), en particulier à l’échelle industrielle. La présente description vise également les bactéries recombinantes dérivées ainsi obtenues. Elle vise aussi l’utilisation de la bactérie recombinante dérivée ainsi obtenue, pour produire, grâce à l’expression du ou des acides nucléiques d’intérêt introduits volontairement dans son génome, un ou plusieurs biocarburant(s) et/ou molécule(s) biosourcée(s), de préférence à l’échelle industrielle. L’invention vise également un procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie génétiquement modifiée telle que décrite dans le présent texte, typiquement d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, ou d’une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée. Les inventeurs décrivent enfin des kits (trousses), en particulier un kit pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium, et un kit pour produire un biocarburant, une molécule biosourcée ou un mélange de l’un et/ou l’autre, à l’aide d’une telle bactérie. Le kit pour transformer et de préférence modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium, de préférence C. acetobutylicum, comprend de préférence au moins un acide nucléique d’intérêt tel que décrit dans le présent texte (par exemple deux ou trois acides nucléiques d’intérêt, typiquement fragment d’ADN, reconnaissant chacun une séquence cible) et tout ou partie des éléments d’un outil d’édition génétique tel que décrit dans le présent texte permettant de transformer, et typiquement modifier génétiquement une bactérie appartenant au genre Clostridium, de préférence C. acetobutylicum, de manière à ce qu’elle comprenne une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie et/ou à corriger la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie. Ce kit peut en outre comprendre un ou plusieurs consommables tels que par exemple un milieu de conservation ou un milieu de culture, un ou plusieurs ARNg, un acide nucléique utilisable en tant que matrice de réparation, au moins une paire d’amorces, une nucléase, une ou plusieurs molécules de sélection, un inducteur adapté à un promoteur inductible présent au sein de l’outil d’édition génétique, au moins une bactérie compétente du genre Clostridium (i.e. conditionnée en vue de la transformation), de préférence C. acetobutylicum, etc. Il peut autrement comprendre les éléments essentiels au fonctionnement d’un outil d’échange allélique (typiquement au moins deux acides nucléiques utilisables en tant que matrice de recombinaison homologue, et au moins un couple d’amorces). L’invention concerne plus particulièrement un kit pour produire une ou plusieurs molécule(s) biosourcée(s), par exemple un solvant ou un mélange de solvants, un biocarburant ou un mélange de biocarburants, un produit (bio)chimique intermédiaires ou un mélange de tels produits intermédiaires, à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, de préférence C. acetobutylicum, comprenant i) une bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium selon l’invention (de préférence C. acetobutylicum), i.e., une bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, par exemple IFP 969, ou une bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, et ii) un milieu, typiquement un milieu de conservation ou un milieu de culture de ladite bactérie. Le kit peut en outre comprendre une notice explicative. L’invention concerne par ailleurs les utilisations possibles du procédé ou du kit selon l’invention pour transformer et/ou modifier génétiquement une bactérie du genre Clostridium, typiquement une bactérie solvantogène du genre Clostridium (de préférence C. acetobutylicum), par exemple pour générer des variants améliorés de ladite bactérie. Elle concerne enfin les utilisations possibles du procédé, du kit ou d’une bactérie du genre Clostridium transformée et de préférence modifiée génétiquement selon l’invention (de préférence C. acetobutylicum), en particulier pour permettre la production de molécules biosourcées, par exemple de solvants, biocarburants, intermédiaires (bio)chimiques, ou de mélanges de ceux-ci, typiquement à l’échelle industrielle. Un kit particulier comprend un variant amélioré de la bactérie dont la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie a été corrigée, typiquement un variant dont le plasmide pSOL a été modifié génétiquement de manière à permettre ou à améliorer la production d’une ou plusieurs molécule(s) biosourcée(s). Chacun des kits selon l’invention peut comprendre un ou plusieurs consommables tels que par exemple un milieu de conservation ou un milieu de culture, un ou plusieurs ARNg, une nucléase, une ou plusieurs molécules de sélection, un inducteur adapté à un promoteur inductible présent au sein de l’outil d’édition génétique, etc. Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement (appartenant au genre Clostridium) selon l’invention présent au sein du kit est de préférence supplémenté en une source de carbone composée de glucose et/ou d’au moins un pentose, de préférence i) de glucose et/ou ii) d’arabinose et/ou i) de xylose. Ce milieu comprend de préférence entre 0,1 et 250 g/L, plus préférentiellement entre 1 et 100 g/L, de ladite source de carbone (composée de glucose et/ou d’arabinose et/ou de xylose). Le milieu de conservation ou de culture de la bactérie modifiée génétiquement est de préférence un milieu de culture de type RCM, plus préférentiellement un milieu de culture de type GAPES, encore plus préférentiellement un milieu de culture de type CGM. Les exemples et figures ci-après ont pour but d’illustrer plus pleinement l’invention sans pour autant en limiter la portée. En particulier, ces exemples présentent l’obtention et la caractérisation de bactéries selon l’invention, dans lesquels l’inactivation du gène hbd, celle d’un autre gène d’intérêt et/ou l’insertion d’au moins un gène additionnel (simulant un gène d’intérêt), est réalisée selon un mode de réalisation particulier préféré à l’aide d’un outil CRISPR-Cas9. Lesdits gènes peuvent être inactivés, ou introduits, selon d’autres modes de réalisation particuliers, bien connus de l’homme de métier, basés par exemple sur l’inactivation, ou l’introduction, de gène par recombinaison homologue ou par mutagénèse insertionnelle, comme expliqué ci-dessus. FIGURE [Fig 1] La Figure 1 représente le métabolisme central de C. acetobutylicum. C. acetobutylicum produit de l’acétate, du butyrate et éventuellement du lactate lors de l’acidogenèse. Lors de la phase de solvantogenèse, le butyrate et l’acétate sont réassimilés, et le flux de carbone est réorienté vers la production d’acétone, d’éthanol et de n-butanol. Ack, acétate kinase ; Adc, acétoacétate décarboxylase ; Adh, alcool déshydrogénase ; Ald, aldéhyde déshydrogénase ; Aldc, acétolactate décarboxylase ; Als, acétolactate synthase ; Bcd, butyryl-CoA déshydrogénase ; Buk, butyrate kinase ; CtfA-CtfB, butyrate-acétoacétate CoA-transférase (sous-unités A et B) ; Crt, crotonase ; EtfA-EtfB, flavoprotéine de transfert d'électrons (sous-unités α et β) ; Fnor, ferrédoxine-NAD(P)+ oxydoréductase ; Hbd, 3-hydroxybutyryl-CoA déshydrogénase ; HydA, hydrogénase ; Ldh, lactate déshydrogénase ; Pdc, pyruvate décarboxylase ; Pfor, pyruvate ferrédoxine oxydoréductase ; Pta, phosphate acétyltransférase ; Ptb, phosphate butyryltransférase ; Thl, thiolase. PARTIE EXPERIMENTALE : Matériels et méthodes Souches, plasmides et milieux de culture C. acetobutylicum DSM 792 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ) a été cultivée à 34°C en conditions anaérobies (90 % N2, 5 % CO2, 5 % N2) en milieu 2YTG (tryptone 16 g.L-1, extrait de levure 10 g.L-1, glucose 5 g.L-1, NaCl 4 g.L-1). Escherichia coli NEB 10-beta (New England Biolabs, NEB) a été cultivée à 37°C en conditions aérobies en milieu LB (tryptone 10 g.L-1, extrait de levure 5 g.L-1, NaCl 10 g.L-1). Les milieux solides ont été réalisés en ajoutant 15 g.L-1 d’agarose aux milieux liquides. Si nécessaire, de l’érythromycine (Em, 40 mg.L-1) et/ou du thiamphénicol (Tm, 15 mg.L-1) ont été utilisés pour les cultures de C. acetobutylicum. De même, du chloramphénicol (12,5 mg.L-1 en milieu liquide et 25 mg.L-1 en milieu solide) et/ou de la tétracycline (20 mg.L-1) ont été utilisés pour les cultures d’E. coli. Les plasmides utilisés dans cette étude sont présentés dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : Plasmides Caractéristiquesa pCas9acr (SEQ ID NO : 23) ermB, ColE1, pCB102, Pcm- tetO2/1-cas9, Pbgal-acrIIA4, tetR, bgaR (Wasels F. et al., 2020) pEC750C (SEQ ID NO : 24) catP, ColE1, pIP404 (Wasels F. et al., 2017) pGRNAind (SEQ ID NO : 25) Dérivé de pEC750C contenant une cassette d’expression d’ARNg (promoteur Pcm- 2tetO1) (Wasels F. et al., 2020) pGRNAcon (SEQ ID NO : 26) Dérivé de pEC750C contenant une cassette d’expression d’ARNg (promoteur miniPthl) (Wasels F. et al., 2020) pAN2 (SEQ ID NO : 27) tetA, p15A ori, Φ3TI (Heap JT et al.) pGRNA-hbd (SEQ ID NO : 28) Dérivé de pGRNAind, ciblant hbd pGRNA-Δhbd (SEQ ID NO : 29) Dérivé de pGRNA-hbd, avec matrice d’édition Δhbd pGRNA-pdc (SEQ ID NO : 30) Dérivé du pGRNAcon, ciblant pdc pGRNA-Δpdc (SEQ ID NO : 31) Dérivé de pGRNA-pdc, avec matrice d’édition Δpdc pGRNA-CΔhbd (SEQ ID NO : 32) Dérivé de pGRNAind, ciblant la matrice d’édition Δhbd pGRNA-Chbd (SEQ ID NO : 33) Dérivé de pGRNA-hbd, avec matrice d’édition permettant l’insertion d’hbd aermB, gène de résistance à l’érythromycine ; catP, gène de résistance au thiamphénicol et au chloramphénicol ; tetA, gène de résistance à la tétracycline ; ColE1 et p15A ori, origines de réplication chez E. coli ; pIP404, pAMB1 et pCB102, origines de réplication chez C. acetobutylicum. Construction de plasmides Les acides nucléiques ont été purifiés à l’aide des kits QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) et GenElute Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich). Les amplifications PCR ont été réalisées avec la Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Les oligonucléotides utilisés pour la construction des plasmides sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Oligonucléotide Séquence (5’-3’) P01 (SEQ ID NO : 1) TCATACTTGGAGCTAATCACCCAA P02 (SEQ ID NO : 2) AAACTTGGGTGATTAGCTCCAAGT P03 (SEQ ID NO : 3) ATGCATGTCGACCAAAATCCTTCTCTGTAAATTCATG P04 (SEQ ID NO : 4) GAAAAAGGTATATTCAAAATAAGTTTACAAGAATCCCC P05 (SEQ ID NO : 5) ATTTTGAATATACCTTTTTCATTAAACAGACCTCC P06 (SEQ ID NO : 6) ATGCATGAATTCTGCAAATGTTTCTGATGATAAAATAG P07 (SEQ ID NO : 7) TAAGGTACACCACACATTAGGTGA P08 (SEQ ID NO : 8) AAACTCACCTAATGTGTGGTGTAC P09 (SEQ ID NO : 9) AAAAAAGTCGACGCGATCATAATCAGATTCTTTAC P10 (SEQ ID NO : 10) TTTAAAGGTTAACGGTCTAACAAATATCTTC P11 (SEQ ID NO : 11) TTAGACCGTTAACCTTTAAAGTACAAAGTGAAAC P12 (SEQ ID NO : 12) AAAAAAGTCGACATCTTCTTCCTTATCCTCAG P13 (SEQ ID NO : 13) TCATAGAATCCCCATTATCAAATG P14 (SEQ ID NO : 14) AAACCATTTGATAATGGGGATTCT P15 (SEQ ID NO : 15) TTGAAGCTTGAGCTCGGTACCCGGGCTTACCCTTGTATTCTAGTTTCTTGCC P16 (SEQ ID NO : 16) GGGGATTATCAAATCCCCATTTTTTATATATAATATAATTTTAGAGGAGGG A P17 (SEQ ID NO : 17) GGGGATTTGATAATCCCCATTCTTGTAAACTTATTTTGAATAATCG P18 (SEQ ID NO : 18) TCGAGATCTCCATGGACGCGTGACGACAGCTGTTTTACTTGGACATAATAC T Le plasmide pGRNA-hbd (SEQ ID NO : 28) a été construit en clonant le produit d’hybridation des oligonucléotides P01 et P02 dans le pGRNAind (SEQ ID NO : 25) à l’aide de BsaI et de la T4 DNA ligase (NEB). Le fragment obtenu par PCR chevauchante des amplifications obtenues à partir de l’ADNg de DSM 792 à l’aide des couples d’oligonucléotides P03-P04 et P05-P06 a été cloné au niveau des sites BamHI et SalI dans le pGRNA-hbd pour obtenir pGRNA-∆hbd (SEQ ID NO : 29). Le plasmide pGRNA-pdc (SEQ ID NO : 30) a été construit en clonant le produit d’hybridation des oligonucléotides P07 et P08 dans le pGRNAcon (SEQ ID NO : 26) à l’aide de BsaI et de la T4 DNA ligase (NEB). Le fragment obtenu par PCR chevauchante des amplifications obtenues à partir de l’ADNg de DSM 792 à l’aide des couples d’oligonucléotides P09-P10 et P11-P12 a été cloné au niveau des sites BamHI et SalI dans le pGRNA-pdc pour obtenir le pGRNA-∆pdc (SEQ ID NO : 31). Le plasmide pGRNA-C∆hbd (SEQ ID NO : 32) a été construit en clonant le produit d’hybridation des oligonucléotides P13 et P14 dans le pGRNAind à l’aide de BsaI et de la T4 DNA ligase (NEB). Le pGRNA-Chbd (SEQ ID NO : 33) a été obtenu par Assemblage HiFi (NEB) du pGRNA-C∆hbd digéré par BamHI et SalI et des produits d’amplifications obtenus à partir de l’ADNg de DSM 792 à l’aide des couples d’oligonucléotides P15-P16 et P17-P18. Edition génétique Les constructions plasmidiques ont été introduites dans C. acetobutylicum comme décrit par Mermelstein LD et al.. Les événements d’édition génétique ont été sélectionnés comme décrit par Wasels F. et al. (2020) et Wasels F. et al. (2017). Les oligonucléotides utilisés pour la confirmation des éditions génétiques sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous. Tableau 3 : Locus Oligonucléotide Séquence (5’-3’) hbd P19 (SEQ ID NO : 19) GTAATATTATAGCAGCTATTTTAAGTTTAC P20 (SEQ ID NO : 20) AAAGGTAAGGAAATGGCTGAG pdc P21 (SEQ ID NO : 21) TTGGCGCTGTTAATGGGCTA P22 (SEQ ID NO : 22) ACCCAGCTAAATGAATGGCCT L’emploi d’autres outils génétiques, telle que ceux basés sur la recombinaison homologue ou l’insertion d’éléments génétiques mobiles, peut permettre d’obtenir des mutants possédant des génotypes équivalents, i.e. n’exprimant plus les produits des gènes hbd et pdc, ou exprimant une version non fonctionnelle de ceux- ci. Fermentation Les performances fermentaires des micro-organismes décrits dans cette étude ont été évaluées en batch. Des précultures ont été réalisées en chambre anaérobie dans un volume de 1 mL de milieu CGM (KH2PO4 0,75 g.L-1, K2HPO40,75 g.L-1, MgSO4∙H2O 0,4 g.L-1, MnSO4∙H2O 0,01 g.L-1, FeSO4∙7H2O 0,01 g.L-1, NaCl 1,0 g.L-1, Asparagine 2,0 g.L-1, Extrait de levure 5,0 g.L-1, (NH4)2SO42,0 g.L-1, Glucose 80 g.L-1). Après une incubation de 18h, un volume de 500 µL de ces précultures a été utilisé pour inoculer 9,5 mL de milieu CGM dans des fioles. Une fois serties, ces dernières ont ensuite été incubées pendant 96h à 34°C, 100 rpm. En fin de fermentation, des échantillons ont été centrifugés à 5000 g pendant 5 minutes, et les surnageants ont été dilués à l’aide d’un standard interne (concentration finale de 0,5 g.L-1 de n-propanol) puis filtrés à 0,22 µm avant d’être analysés par chromatographie. La détection des solvants a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse sur une colonne PoraBOND- Q (Agilent Technologies) avec un détecteur à ionisation de flamme. L’hélium a été utilisé comme gaz vecteur à un débit de 1,6 mL.min-1, et la colonne chauffée de 50 à 250°C au cours d’un run de 30 min. La détection des acides a été réalisée par chromatographie en phase liquide à haute performance sur une colonne Aminex HPX-87H (Biorad) couplée à un refractomètre Spectra System RI-150 et un détecteur UV Waters 2487 dual λ réglé à 210 nm. La phase mobile consistait en une solution d’acide sulfurique 0,1 M, et la température de la colonne a été fixée à 60°C. Les résultats présentés sont la moyenne d’au moins trois essais indépendants. Résultats Un mutant Δhbd a été construit dans la souche DSM 792 de C. acetobutylicum. Les performances fermentaires de ce mutant par rapport à la souche sauvage sont présentées dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 : Souches Solvants (g.L-1) Ethanol Acétone Propan-2-ol n-Butanol Total DSM 792 1,1 ± 0,2 8,6 ± 0,8 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,7 22,1 ± 0,4 Δhbd 33,3 ± 1,3 2,9 ± 0,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 36,3 ± 1,5 Acides (g.L-1) Ac. acétique Ac. Butyrique Ac. Lactique Total DSM 792 1,6 ± 0,5 1,6 ± 0,5 0,0 ± 0,0 3,1 ± 1,0 Δhbd 0,7 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 1,3 ± 0,0 Ce mutant n’est plus capable de produire de n-butanol ni de butyrate. Il permet la production de quantités importantes d’éthanol, qui devient son produit de fermentation largement majoritaire. La quantité d’acétone produite est diminuée de plus de 65% par rapport à la souche sauvage. Afin de diminuer la quantité d’éthanol produite par ce mutant, le mégaplasmide pSOL contenant les gènes adhE1 et adhE2 codant des enzymes à activité acétaldéhyde déshydrogénase (Ald) a été ciblé à l’aide de l’outil CRISPR-Cas9 (décrit dans la demande WO2017/064439) employé pour la création du mutant ∆hbd. La perte du mégaplasmide est facilement réalisable dans la souche sauvage, et ne nécessite que l’introduction d’un plasmide permettant l’expression d’un ARNg ciblant cet acide nucléique (Wasels et al., 2017). La fréquence d’obtention de transformants de la souche sauvage contenant le plasmide pCas9acr avec le plasmide pEC750C est de l’ordre de 101 à 102ufc.µgADN -1. La fréquence d’obtention de transformants de la souche sauvage contenant le plasmide pCas9acr avec un plasmide dérivé de pGRNAcon ciblant le chromosome du micro-organisme et ne contenant pas de matrice d’édition du locus ciblé, en présence d’anhydrotétracycline (aTc), l’inducteur de l’expression de cas9, est nulle. De plus, la fréquence d’obtention de transformants de la souche sauvage contenant le plasmide pCas9acr avec un plasmide dérivé de pGRNAcon ciblant le mégaplasmide pSOL en présence d’aTc est de l’ordre de 101 à 102ufc.µgADN -1. L’analyse des transformants obtenus montre que ceux-ci ont perdu le mégaplasmide pSOL. La fréquence d’obtention de transformants du mutant ∆hbd contenant le plasmide pCas9acr avec le plasmide pEC750C est habituellement de l’ordre de 103 ufc.µgADN -1. De manière surprenante, la fréquence de transformation de ce mutant avec un plasmide dérivé de pGRNAcon ciblant le mégaplasmide pSOL en présence d’aTc et ne contenant pas de matrice d’édition du locus ciblé est nulle. Ce résultat indique que le mégaplasmide pSOL est indispensable dans le mutant ∆hbd et ne peut être éliminé, au contraire de ce qui est observé dans la souche sauvage. Il devient donc possible d’utiliser l’outil CRISPR-Cas9 pour réaliser des modifications précises au sein du mégaplasmide dans le mutant ∆hbd. A titre d’exemple, le plasmide pGRNA-∆pdc a été utilisé pour inactiver le gène pdc qui se trouve sur le pSOL. La transformation de la souche sauvage DSM 792 avec ce plasmide induit la perte du mégaplasmide pSOL dans les transformants obtenus. En revanche, il a été possible d’obtenir des mutants ∆hbd ∆pdc dont les performances fermentaires sont présentées dans le Tableau 5 ci-dessous. Tableau 5 : Souches Solvants (g.L-1) Ethanol Acétone Propan-2-ol n-Butanol Total DSM 792 1,1 ± 0,2 8,6 ± 0,8 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,7 22,1 ± 0,4 Δhbd 33,3 ± 1,3 2,9 ± 0,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 36,3 ± 1,5 Δhbd Δpdc 32,7 ± 0,7 4,5 ± 0,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 37,3 ± 0,9 Acides (g.L-1) Ac. acétique Ac. Butyrique Ac. Lactique Total DSM 792 1,6 ± 0,5 1,6 ± 0,5 0,0 ± 0,0 3,1 ± 1,0 Δhbd 0,7 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 1,3 ± 0,0 Δhbd Δpdc 0,2 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,2 ± 0,0 A la suite des différentes éditions génétiques qui peuvent être réalisées dans le mégaplasmide pSOL à l’aide de l’outil CRISPR-Cas9, ce dernier peut être utilisé pour réintroduire le gène hbd, et ne conserver ainsi que les modifications autres, situées sur le megaplasmide et/ou sur le chromosome. Cette complémentation au locus peut être réalisée par exemple avec le plasmide pGRNA-Chbd (SEQ ID NO : 33) qui permet de réintroduire un gène fonctionnel n’impactant pas les performances du micro-organisme par rapport à la souche sauvage. Les performances de mutants DSM 792 hbdC issus du mutant ∆hbd sont présentées dans le Tableau 6 ci- dessous. Tableau 6 : Souches Solvants (g.L-1) Ethanol Acétone Propan-2-ol n-Butanol Total DSM 792 1,1 ± 0,2 8,6 ± 0,8 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,7 22,1 ± 0,4 Δhbd 33,3 ± 1,3 2,9 ± 0,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 36,3 ± 1,5 hbdC 1,8 ± 0,4 6,7 ± 0,1 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,1 20,9 ± 0,6 Acides (g.L-1) Ac. acétique Ac. Butyrique Ac. Lactique Total DSM 792 1,6 ± 0,5 1,6 ± 0,5 0,0 ± 0,0 3,1 ± 1,0 Δhbd 0,7 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 1,3 ± 0,0 hbdC 0,9 ± 0,0 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1 1,2 ± 0,0 Les résultats obtenus montrent que la complémentation du gène hbd est fonctionnelle et que le mutant dans lequel le gène a été réintroduit à son locus d’origine se comporte de la même manière que la souche sauvage. Conclusions Au cours de ce travail, les inventeurs sont parvenus à démontrer la possibilité et l’intérêt d’utiliser un outil CRISPR-Cas9 pour réaliser des modifications génétiques précises au sein du mégaplasmide pSOL de la souche de C. acetobutylicum DSM 792. Cette stratégie peut être envisagée pour la modification de tout élément génétique non essentiel à la survie du micro-organisme dès lors qu’une modification chromosomique préalable permet de le rendre indispensable (/ essentiel) à la survie de la bactérie (dans au moins dans une condition de culture donnée). Une telle modification n’avait jusqu’à présent jamais été identifiée chez C. acetobutylicum, et le fait que le mégaplasmide pSOL soit indispensable dans la souche ∆hbd est inattendu. La possibilité de modifier le mégaplasmide pSOL avec CRISPR-Cas9 permet de bénéficier des points forts de l’outil qui sont sa précision, sa facilité d’utilisation, sa rapidité, et le fait qu’il permette de réaliser des modifications au nucléotide près. L’ensemble des éléments génétiques constituant le génome de C. acetobutylicum est désormais modifiable avec un outil de ce type. Une fois les différentes modifications désirées réalisées, le gène hbd peut facilement être réintroduit dans le génome à son locus d’origine, permettant d’obtenir un micro-organisme ne possédant que les modifications d’intérêt. REFERENCES - DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., & Church, G. M. (2013). Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. 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Claims

REVENDICATIONS 1. Utilisation d’un outil d’édition génétique, de préférence l’outil CRISPR-Cas, pour modifier génétiquement le plasmide pSOL d’une bactérie Clostridium acetobutylicum, ladite bactérie se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la bactérie appartenant au genre Clostridium est dépourvue du gène hbd ou comprend un gène hbd non fonctionnel.
3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que la bactérie appartenant au genre Clostridium est la souche IFP 969 enregistrée le 17 février 2023 sous le numéro LMG P-32993 auprès de la collection BCCM-LMG, et une version génétiquement modifiée de celle-ci.
4. Procédé pour transformer, et de préférence modifier génétiquement, une bactérie appartenant au genre Clostridium comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage, caractérisé en ce que le procédé comprend la délétion ou l’inactivation d’un gène rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie, ou en ce que la bactérie du genre Clostridium est une bactérie recombinante comprenant une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la bactérie du genre Clostridium comprenant une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie est une bactérie dépourvue du gène hbd ou comprenant un gène hbd non fonctionnel.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de transformation de la bactérie à l’aide d’un outil CRISPR et une étape de modification génétique de la bactérie transformée de manière à corriger la modification chromosomique ayant rendu la présence du plasmide pSOL essentielle à la survie de ladite bactérie en restaurant la version sauvage de la séquence correspondante.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la bactérie du genre Clostridium est une bactérie dépourvue du gène hbd ou comprenant un gène hbd non fonctionnel et en ce que l’étape supplémentaire de modification génétique de la bactérie transformée vise à réintroduire le gène hbd dans le génome de ladite bactérie ou à le rendre fonctionnel.
8. Bactérie modifiée génétiquement appartenant au genre Clostridium susceptible d’être obtenue par le procédé selon l’une quelconque des revendications 4 à 7.
9. Utilisation selon l’une des revendications 1 à 3, procédé selon l’une des revendications 4 à 7, ou bactérie selon la revendication 8, caractérisé en ce que la bactérie du genre Clostridium est une bactérie solvantogène comprenant un plasmide pSOL à l’état sauvage, de préférence C. acetobutylicum.
10. Utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie, dans un procédé de modification génétique d’une bactérie du genre Clostridium, ou pour fabriquer une bactérie dérivée modifiée génétiquement.
11. Utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie ou d’une bactérie selon la revendication 8, pour produire une molécule biosourcée, par exemple un solvant ou un biocarburant, ou un mélange de molécules biosourcées.
12. Procédé de fermentation impliquant l’utilisation d’une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie ou d’une bactérie selon la revendication 8.
13. Kit pour produire une molécule biosourcée, par exemple un solvant ou un biocarburant, à l’aide d’une bactérie appartenant au genre Clostridium, comprenant i) une bactérie appartenant au genre Clostridium se distinguant de la souche sauvage en ce qu’elle comprend une modification chromosomique rendant la présence du plasmide pSOL essentielle à sa survie ou une bactérie selon la revendication 8, et ii) un milieu de conservation ou de culture de ladite bactérie.
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