EP4658816A1 - Procedes de determination de la radiosensibilite individuelle - Google Patents

Procedes de determination de la radiosensibilite individuelle

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Publication number
EP4658816A1
EP4658816A1 EP24703195.8A EP24703195A EP4658816A1 EP 4658816 A1 EP4658816 A1 EP 4658816A1 EP 24703195 A EP24703195 A EP 24703195A EP 4658816 A1 EP4658816 A1 EP 4658816A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
patient
genes
cancer
patients
radiotherapy
Prior art date
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Pending
Application number
EP24703195.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Isabelle Behm-Ansmant
Guillaume VOGIN
Liza HETTAL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut De Cancerologie De Lorraine
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National Polytechnique de Lorraine
Original Assignee
Institut De Cancerologie De Lorraine
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National Polytechnique de Lorraine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut De Cancerologie De Lorraine, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National Polytechnique de Lorraine filed Critical Institut De Cancerologie De Lorraine
Publication of EP4658816A1 publication Critical patent/EP4658816A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Definitions

  • the present invention relates to the field of anticancer treatments, and particularly radiotherapy.
  • the present invention relates in particular to in vitro methods for determining the individual radiosensitivity of patients.
  • the present inventors have succeeded in identifying a constitutional transcriptomic signature specific to individual radiosensitivity.
  • This signature is 1/ transcriptomic, based on the detection of coding and non-coding RNAs, which, due to their diversity, are the molecules most likely to reflect a difference between 2 individuals, 2/ constitutional, because it makes it possible to determine individual radiosensitivity without requiring prior irradiation of the patient, it therefore makes it possible to predict the risk of radiation-induced toxicity before treatment, and 3/ specific in that it allows powerful discrimination between individuals.
  • the signature according to the present invention comprises 10 genes whose expression is correlated with individual radiosensitivity. These 10 genes therefore represent excellent biomarkers for determining individual radiosensitivity in a patient. Also in a first aspect, the present invention relates to an in vitro method for determining the individual radiosensitivity of a patient, said method comprising a step of measuring, in a biological sample obtained from said patient, the level of expression of at least 1 gene from the group of 10 genes consisting of RP11-159D12.8, MT-TK, KLF11, MIR4482, NEK1, PSPHP1, RNU5B-1, RNU6ATAC, STRN3 and TDG.
  • the method according to the present invention particularly makes it possible to determine whether a patient is radiotolerant or radiosensitive, and therefore whether he is more at risk of developing radiation-induced toxicity such as radiation-induced fibrosis.
  • the method according to the present invention can advantageously be carried out before the initiation of radiotherapy, and therefore from a biological sample obtained before treatment of the patient.
  • the specific signature of individual radiosensitivity according to the present invention was determined by performing an analysis of the blood transcriptome of a cohort of radiosensitive patients and a cohort of radiotolerant patients, treated with breast radiotherapy in the context of a clinical study (SPLICIRAD, NCT03000764). On the basis of this signature, a predictive blood test has been developed. This blood test is non-invasive, fast, simple and inexpensive. It is easily usable and automatable since the technique and equipment required to carry it out are common in medical analysis laboratories.
  • the signature developed in the context of the present invention is based on 10 different genes which are listed in Table 1 below. All the genes included in this signature are known to those skilled in the art. Their sequence as well as that of the corresponding transcripts are also known and easy to access, for example on the Ensembl database.
  • Table 1 list of genes used as RSI biomarkers in the context of the present invention.
  • the present invention relates to an in vitro method for determining the individual radiosensitivity of a patient, said method comprising a step of measuring, in a biological sample obtained from said patient, the level of expression of at least 1 gene from the group of 10 genes consisting of RP11-159D12.8, MT-TK, KLF11, MIR4482, NEK1, PSPHP1, RNU5B-1, RNU6ATAC, STRN3 and TDG.
  • the expression level of 2, but also of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or even of the 10 genes listed above can be measured and make it possible to determine the individual radiosensitivity of the patient.
  • said at least 1 gene may advantageously comprise the RNU6ATAC gene, the sole measurement of the expression level of which makes it possible to determine the individual radiosensitivity of patients with remarkable sensitivity and specificity as is demonstrated in the experimental part below.
  • the method according to the invention comprises measuring the expression level of at least two genes among the 10 genes listed above.
  • these at least two genes can for example comprise RP11-159D12.8 and MT-TK, RNU6ATAC and RP11.159D12.8, MIR4482 and RP11.159D12.8 or even NEK1 and KLF11.
  • the person skilled in the art knows many techniques that he uses on a daily basis in order to determine the level of expression of a gene.
  • the level of expression of a gene is typically determined by analyzing the RNA transcribed from this gene or the cDNA derived from this RNA.
  • These nucleic acid molecules can typically be extracted from the biological sample obtained from the patient and analyzed by standard methods. They will typically be detected by amplification and/or hybridization with, for example, a probe.
  • the isolated RNA can be subjected to several reverse transcription steps coupled with amplifications, for example by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) using oligonucleotide primers specific to the genes of interest, or to a part of these genes.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the measured expression level is typically normalized on the basis of the expression of housekeeping genes.
  • the expression level can typically be normalized to the expression of GAPDH and 5S genes.
  • the method according to the present invention comprises a step in which the level of expression of the RSI signature genes listed above is compared to a reference value.
  • This reference value is determined for each gene. It can be determined experimentally, empirically or theoretically and is set in order to obtain optimal specificity and selectivity.
  • the expression level of the RSI signature genes listed above is typically used to calculate a score. The calculation of such a score is for example illustrated in the experimental part below.
  • This score is then compared to a reference value in order to establish the patient's radiosensitivity status. It is fixed in order to obtain optimal specificity and sensitivity.
  • This reference value can be determined on the basis of results obtained in a control population, for example a population of known radiotolerant or known radiosensitive patients.
  • “Individual radiosensitivity”, or “RSI” represents the constitutional sensitivity to ionizing radiation of the tissues of an individual within a population - their predisposition to develop significant tissue toxicity following a desired occupational or medical exposure ( diagnostic/therapeutic) or unwanted (accidental) depending on the level of radiation dose and the volume of body exposed.
  • radiotherapy used in the loco-regional treatment of cancer can cause adverse effects in the short term (we then speak of early toxicity) or long term (we then speak of late toxicity) which are more or less reversible.
  • a patient will be more or less radiotolerant or radiosensitive depending on their individual radiosensitivity.
  • the most radiotolerant patients have little or no risk of developing radiation-induced toxicity, whereas those who are more radiosensitive have a high risk of developing radiation-induced toxicities. Determining the RSI of a patient therefore makes it possible to determine the risk for this patient of developing radiation-induced toxicity and therefore to determine whether a patient is rather radiotolerant or radiosensitive.
  • Radio-induced tissue toxicities are ubiquitous and are based on a common pathophysiology leading to fibrosis. They are apprehensible clinically from 6 months following the end of treatment in the area irradiated at high dose - which can take on various clinical aspects depending on the anatomical location and the irradiated tissues: induration and thickening of the skin, muscle atrophy, joint ankylosis, lymphedema , mucosal atrophy, ulceration, fistula, hollow organ stenosis, vascular stenoses/occlusions, neuropathy and pain.
  • the method according to the present invention therefore makes it possible to predict the risk for a patient of developing any of these forms of toxicity.
  • the method according to the present invention makes it possible to predict a patient's risk of developing radiation-induced fibrosis or "RIF". Unlike acute inflammation phenomena which can appear immediately or within 6 months following radiotherapy treatment, IRF is a “late” effect which appears more than 6 months with no time limit after radiotherapy.
  • the “biological sample” can be any sample in which RNA can be detected.
  • the sample is a fluid, a tissue, a sample of cells, a biopsy, for example a skin biopsy, etc.
  • the biological sample may particularly be a sample of blood, serum or plasma obtained from from the patient.
  • the biological sample is a blood sample.
  • the signature according to the present invention is constitutional, that is to say it represents an individual phenotypic characteristic and therefore it does not require no irradiation beforehand to be able to be revealed.
  • the method according to the present invention can therefore be carried out from a biological sample obtained before, during or after treatment of the patient by radiotherapy.
  • the biological sample is obtained from said patient before he is treated by radiotherapy.
  • the “patient” or “subject” is a human or an animal, for example a mammal. According to a preferred embodiment, the patient is a human.
  • Radiotherapy is a locoregional treatment of cancer with curative or palliative aims consisting of targeting high-energy ionizing radiation on a tumoral lesion or not, benign or malignant, primary or secondary, in place or operated on, or even a risk area - in order to primarily inactivate pathological cells.
  • Radiotherapy can be delivered using particle accelerators (external radiotherapy).
  • Equivalent doses of 20 to 80 grays (Gy) are typically delivered (classic fractionation - daily sessions of 1.8 to 2.2 Gy spaced at least 6 hours apart).
  • a radioactive therapeutic agent can also be administered in direct contact with the tumor in the body: we distinguish i- brachytherapy during which the unsealed radioactive sources are introduced directly inside or in the immediate vicinity of the areas to be treated the inside of the body; iodine 125 is thus used in brachytherapy in the treatment of prostate cancer or iridium 192 for uterine cancers - and ii- internal vectorized (or metabolic) radiotherapy during which a radiopharmaceutical substance is administered orally or by intravenous injection and will attach to cancer cells; we can cite iodine-131, lutetium-177, yttrium-90, holmium-166, radium-223, strontium-89 and samarium-153.
  • the method according to the present invention can be carried out from a sample obtained from a healthy patient, and therefore who does not suffer from a pathology requiring treatment by radiotherapy.
  • the method according to the present invention makes it possible to determine whether the patient will have a risk of developing radiation-induced toxicity if he were one day to receive radiotherapy treatment or be exposed to ionizing radiation.
  • the method according to the present invention can be carried out from a sample obtained from a patient who suffers from a pathology requiring treatment by radiotherapy, such as cancer.
  • the method according to the present invention makes it possible to determine whether the patient has a risk of developing radiation-induced toxicity and therefore makes it possible to adapt the treatment.
  • the present disclosure therefore also relates to a method of treating cancer in which the radiosensitivity of a patient suffering from cancer is determined according to the method of the present invention, and in which: when the patient is identified as being radiosensitive, the treatment consists of surgery, chemotherapy, immunotherapy and/or radiotherapy such as proton therapy, brachytherapy or radiotherapy with doses lower than those received standardly for the treatment of this cancer; when the patient is identified as being radiotolerant, the treatment includes radiotherapy, possibly with doses higher than those received standardly for the treatment of this cancer.
  • the present invention also relates to a radiotherapeutic agent for use in the treatment of cancer in a patient, wherein said patient has been identified as being radiotolerant according to the method of the present invention.
  • a “radiotherapeutic agent” can be any agent known to those skilled in the art to be used in external or internal radiotherapy.
  • a radiotherapeutic agent can for example be such as those administered as part of brachytherapy (lode-125, Iridium 192) or systemic therapy with a beta-minus or alpha emitting radioisotope such as iodine-131, galium -68, lutetium-177, phosphorus 32, yttrium-90, holmium-166, radium-223, strontium-89, samarium-153, actinium-225, erbium-169, rhenium-186, bismuth-212 (vectorized internal radiotherapy or metabolic radiotherapy).
  • the “cancer” to be treated is any primary or metastatic cancer which can be treated by radiotherapy in adults and children.
  • this cancer is chosen from the group consisting of breast cancer, prostate cancer, lung cancer, cancer of the upper aerodigestive tract (ENT cancer), tumors of the central nervous system, sarcomas, lymphomas, cervical cancer, endometrial cancer, rectal/anal canal cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, liver cancer, stomach cancer, breast cancer esophagus, prostate cancer, testicular cancer, neuroendocrine tumors, thyroid cancer.
  • said cancer is breast cancer.
  • Figure 1 illustrates the validation by qRT-PCR of the variation in the expression of each of the 10 genes composing the blood signature within the blood samples from the SPLICIRAD clinical study (NCT03000764).
  • RS radiosensitive;
  • RT radiotolerant.
  • the Mann-Whitney-Wilcoxon statistical test was used to calculate the p-value: *p ⁇ 0.15; **p ⁇ 0.05
  • Figure 2 illustrates the effectiveness of the proposed model for the discrimination of radiosensitive and radiotolerant individuals based on the expression of the MT-TK and RP11-159D12.8 genes alone (Panels A and C) or of all 10 genes of the signature (Panels B and D).
  • Panels C and D ROC (Receiver Operating Characteristic) curve attesting to the specificity and sensitivity of the proposed models.
  • RNAs were extracted from the PaxGeneTM RNA Blood tubes of radiosensitive or radiotolerant patients from the SPLICIRAD clinical study (NCT03000764) and were hybridized on Affymetrix ClariomTM D chips.
  • - MT-TK and RP11-159D12.8 is performed with a sensitivity of 90%, a specificity of 100% and an AUC of 0.98 ( Figure 2A/2C); - RNU6ATAC and RP11.159D12.8 is performed with a sensitivity of 100%, a specificity of 100% and an AUC of 1;
  • [0038] Discrimination performance of radiosensitive and radiotolerant individuals by measuring the expression of each of the 10 genes and all possible combinations of 2 genes among the 10 genes of the blood signature. The name of the gene or combination of genes, as well as the sensitivity, specificity and AUC are indicated.
  • [0039] List of blood signature genes. The name of the gene and the nature of the gene product (coding or non-coding RNA) are indicated.
  • the test thus developed is distinguished by its pathophysiological relevance (human model, realistic experimental conditions, integrative approach framed on molecular events) and does not require prior ex-vivo irradiation. Indeed, although the data presented here were obtained from patients who received a dose of radiotherapy since their individual radiosensitivity phenotype had to be determined before the study, the data available today demonstrate that the signature identified here is not affected by irradiation.
  • the patients' transcriptome was analyzed from blood samples taken 5 years post-irradiation and it was verified that the expression of the genes of the present signature does not vary in response to irradiation (transcriptomic analysis after irradiation at 2Gy carried out ex-vivo on primary fibroblast cultures from patients in the SPLICI-Rad study).
  • blood cells given their lifespan (from a few hours to a few months) had all been renewed at the time of collection and blood cell progenitors are located in areas "protected" by irradiation schedules because they are organs at significant risk of toxicity if affected.
  • lymphocyte apoptosis test (Azria et al., EBioMedicine 2.12, 2015: 1965-1973), although developed on blood samples taken post-irradiation, confirmed its effectiveness by similar results on blood samples taken before radiotherapy.
  • test developed in the context of the present invention makes it possible to determine individual radiosensitivity before irradiation with great selectivity and specificity.
  • PAXgene® Blood RNA Kit is used for the purification of intracellular RNA from whole blood collected in the PAXgene® Blood RNA Tube.
  • PAXgene® Blood RNA Tubes contain a specific reagent based on patented RNA stabilization technology. This reagent protects RNA molecules from degradation by RNases and minimizes ex vivo changes in gene expression.
  • PAXgene® BRT ensures the stabilization of cellular RNA for up to 3 days at a temperature between 18 and 25°C, up to 5 days between 2 and 8°C and for at least 11 years when stabilized blood is stored at -20°C or -70°C. This system allows the preparation of good quality purified intracellular RNA that can be used for RT-PCR-based molecular diagnostic tests.
  • RNAs thus extracted are then assayed by spectrophotometry at 260 nm.
  • Contamination by proteins or phenolic compounds/salts is estimated by measuring the absorbance ratios 260/280 and 260/230, respectively. If these ratios prove unsatisfactory (ratios 1.7), a phenol-chloroform extraction, followed by precipitation with absolute ethanol in the presence of 0.15 M sodium acetate is carried out in order to eliminate the phenol residues. and proteins and optimize the quality of total RNA.
  • the quality of the RNA as well as non-contamination by genomic DNA is evaluated by capillary electrophoresis.
  • RT reverse transcription reaction
  • the expression of blood signature genes is analyzed by real-time PCR based on SYBR Green chemistry (ITaq Master Mix, Bio-Rad) according to the supplier's protocol.
  • the cDNAs produced by reverse transcription are diluted to 1/10 or 1/100 depending on the abundance of the transcripts of interest.
  • the detected fluorescent signal allows a quantitative measurement of the exponential accumulation of the product during the different PCR cycles.
  • a standard curve is produced for each pair of primers and the signal of the housekeeping genes GAPDH and 5S is used to normalize the data. All amplifications are carried out in technical triplicate. Negative controls, H2O control and non-reverse transcribed control (RT-), are carried out in parallel.
  • the RSI status of the patient analyzed can be established according to the following method:
  • the threshold making it possible to discriminate radiosensitive patients from radiotolerant patients is 0.681:
  • the patient is predicted to be radiosensitive. - If the score is ⁇ 0.681, then the patient is predicted to be radiotolerant.
  • the threshold for discriminating radiosensitive patients from radiotolerant patients is 0.5:
  • the patient is predicted to be radiosensitive.
  • the score is ⁇ 0.5, then the patient is predicted to be radiotolerant.

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Abstract

La présente invention porte sur le domaine de la radiothérapie. Elle concerne notamment un procédé in vitro permettant de déterminer la radiosensibilité individuelle d'un patient. Les inventeurs ont en effet identifié une signature transcriptomique constitutionnelle spécifique de la radiosensibilité individuelle qui permet d'évaluer si un patient est radiosensible ou radiotolérant. Le procédé selon l'invention comprend donc une étape de mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir d'un patient, du niveau d'expression d'au moins un gène parmi le groupe de 10 gènes constituant cette signature, à savoir KLF11, MIR4482, MT-TK, NEK1, PSPHP1, RNU5B-1, RNU6ATAC, RP11- 159D12.8, STRN3 et TDG. La présente invention permet notamment d'adapter les traitements des patients en fonction de leur radiosensibilité.

Description

PROCEDES DE DETERMINATION DE LA RADIOSENSIBILITE INDIVIDUELLE
Domaine technique
[0001] La présente invention concerne le domaine des traitements anticancéreux, et particulièrement de la radiothérapie. La présente invention porte notamment sur des procédés in vitro permettant de déterminer la radiosensibilité individuelle des patients.
Technique antérieure
[0002] Sur 19 millions de nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an dans le monde, la moitié sont traités par radiothérapie (RT) (IARC, 2020). 10 à 15% des patients traités sont exposés à une toxicité aiguë inhabituelle, et 5 à 10% à une toxicité tardive pouvant entraîner des séquelles parfois létales en l'absence de déviation thérapeutique (Mohanti et al., Supportive care in cancer 13.10, 2005, 775-780). Dans le cas du cancer du sein, cette toxicité tardive peut toucher jusqu’à 18% des patientes et se traduit notamment par le développement d'une fibrose cutanée radio-induite (FRI) au niveau de la zone traitée par RT prenant la forme d'une radiodermite scléroatrophique pouvant se compliquer de nécrose (Sperk et al., Breast cancer research and treatment 135.1 , 2012, 253-260). D'autres séquelles peuvent survenir au sein des tissus régionaux irradiés à dose tumoricide - notamment la glande mammaire (fibrose/atrophie), les muscles et tissus mous (fibrose), les vaisseaux (lymphoedème), les nerfs (plexite, neuropathie), les côtes (ostéoradionécrose), le poumon homolatéral (pneumathie, fibrose pulmonaire) ou le coeur (péricardite constrictive, sténose coronaire, fibrose myocardique, valvulopathie, trouble de la conduction). Chaque individu est caractérisé par sa propre sensibilité aux radiations ou radiosensibilité individuelle (RSI). Les bases moléculaires de cette RSI restent largement incomprises et, à l'heure actuelle, aucun test n'en permet une mesure fiable en routine.
[0003] Pour prévenir l'apparition des toxicités précoces et tardives, l'accent a été mis sur l'amélioration des techniques de RT afin de réduire le volume de tissus sains irradiés, et sur la recherche de biomarqueurs prédictifs. Les premiers tests de RSI proposés reposent sur la quantification de la mort cellulaire radio-induite des fibroblastes, mais leur utilisation en pratique clinique a été limitée par la nécessité d'une biopsie cutanée, le temps de culture cellulaire, le coût et le manque de reproductibilité. Plus récemment, un test sanguin reposant sur le taux d'apoptose radio-induite des lymphocytes a été proposé (demande internationale publiée sous la référence WO2018/041960). Les résultats de ce dernier, couplés au statut tabagique et à la présence d'une hormonothérapie, sont très efficaces pour identifier les patients ne présentant pas de risques de FRI (VPN = 93.5%). En revanche, ils peinent à discriminer les patientes à risques, affichant une valeur prédictive positive de seulement 20.9% et une spécificité de 48.7%, notamment à cause de l'existence de pathologies confondantes associées à une apoptose lymphocytaire.
[0004] La compréhension de l'origine de la RSI, ainsi que la prédiction fiable et non-invasive de la RSI de chaque patient constituent des enjeux essentiels de la RT. En effet, elles pourraient aider le praticien à personnaliser les décisions thérapeutiques et en particulier les doses de radiothérapie afin d'optimiser le ratio thérapeutique individuel. Ainsi, il serait envisageable de proposer une escalade de dose aux patients les plus radiotolérants (non à risque de FRI) ou au contraire une désescalade de dose, des techniques de radiothérapie protectrices (protonthérapie, curiethérapie) ou des traitements locaux alternatifs dispensant de RT (chirurgie non conservatrice) pour les patients les plus radiosensibles (à risque de FRI). Plus que guérir, la radiothérapie de demain doit permettre de garantir une guérison sans séquelles des patients en intégrant la variable RSI.
[0005] Il existe donc un réel besoin pour une méthode simple et reproductible, permettant de déterminer la radiosensibilité des patients et ainsi de prédire leur risque de développer une toxicité radio-induite telle que la fibrose radio-induite suite à un traitement radiothérapeutique.
Résumé
[0006] L’invention est définie par les revendications.
[0007] Les présents inventeurs ont réussi à identifier une signature transcriptomique constitutionnelle spécifique de la radiosensibilité individuelle. Cette signature est 1/ transcriptomique, basée sur la détection des ARN codants et non-codants, qui, du fait de leur diversité, sont les molécules les plus à même de refléter une différence entre 2 individus, 2/ constitutionnelle, car elle permet de déterminer la radiosensibilité individuelle sans nécessiter d’irradiations du patient au préalable, elle permet donc de prédire le risque de toxicité radio-induite avant traitement, et 3/ spécifique en ce qu’elle permet une discrimination puissante entre les individus.
[0008] La signature selon la présente invention comprend 10 gènes dont l’expression est corrélée à la radiosensibilité individuelle. Ces 10 gènes représentent donc d’excellents biomarqueurs pour la détermination de la radiosensibilité individuelle chez un patient. Aussi dans un premier aspect, la présente invention porte sur un procédé in vitro pour déterminer la radiosensibilité individuelle d’un patient, ledit procédé comprenant une étape de mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit patient, du niveau d’expression d’au moins 1 gène parmi le groupe de 10 gènes constitué de RP11-159D12.8, MT-TK, KLF11 , MIR4482, NEK1 , PSPHP1 , RNU5B-1 , RNU6ATAC, STRN3 et TDG. Le procédé selon la présente invention permet particulièrement de déterminer si un patient est radiotolérant ou radiosensible, et donc s’il est plus à risque de développer une toxicité radio-induite telle que la fibrose radio-induite. Le procédé selon la présente invention peut avantageusement être réalisé avant l’initiation de la radiothérapie, et donc à partir d’un échantillon biologique obtenu avant traitement du patient.
Description des modes de réalisation
[0009] La signature spécifique de la radiosensibilité individuelle selon la présente invention a été déterminée en effectuant une analyse du transcriptome sanguin d’une cohorte de patientes radiosensibles et d’une cohorte de patientes radiotolérantes, traitées par radiothérapie mammaire dans le cadre d’une étude clinique (SPLICIRAD, NCT03000764). Sur la base de cette signature, un test prédictif sanguin a été développé. Ce test sanguin est non-invasif, rapide, simple et peu coûteux. Il est facilement utilisable et automatisable puisque la technique et le matériel nécessaires à sa réalisation sont communs dans les laboratoires d'analyses médicales.
[0010] La signature élaborée dans le cadre de la présente invention repose sur 10 gènes différents qui sont listés dans le tableau 1 ci-dessous. Tous les gènes compris dans cette signature sont connus de l’Homme du métier. Leur séquence ainsi que celle des transcrits correspondants sont également connues et faciles d’accès, comme par exemple sur la base de données Ensembl.
[0011] Tableau 1 : liste des gènes utilisés comme biomarqueurs de la RSI dans le cadre de la présente invention.
[0012] L’expression des 10 gènes mentionnés ci-dessus représente une signature transcriptomique constitutionnelle spécifique de la radiosensibilité individuelle. Les présents inventeurs ont en effet réussi à démontrer que la mesure de l’expression d’au moins un de ces gènes permettait de discriminer les patients radiosensibles des patients radiotolérants. Aussi, selon un premier aspect, la présente invention porte sur un procédé in vitro pour déterminer la radiosensibilité individuelle d’un patient, ledit procédé comprenant une étape de mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit patient, du niveau d’expression d’au moins 1 gène parmi le groupe de 10 gènes constitué de RP11-159D12.8, MT-TK, KLF11 , MIR4482, NEK1 , PSPHP1 , RNU5B-1 , RNU6ATAC, STRN3 et TDG. [0013] Dans le cadre du procédé selon la présente invention, le niveau d’expression de 2, mais aussi de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou encore des 10 gènes listés ci-dessus peut être mesuré et permettre de déterminer la radiosensibilité individuelle du patient.
[0014] Dans le cadre de la présente invention, ledit au moins 1 gène peut avantageusement comprendre le gène RNU6ATAC, dont la seule mesure du niveau d’expression permet de déterminer la radiosensibilité individuelle des patients avec une sensibilité et une spécificité remarquables comme cela est démontré dans la partie expérimentale ci-dessous.
[0015] Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention comprend la mesure du niveau d’expression d’au moins deux gènes parmi les 10 gènes listés ci-dessus. Selon un mode de réalisation encore plus particulier, ces au moins deux gènes peuvent par exemple comprendre RP11-159D12.8 et MT-TK, RNU6ATAC et RP11 .159D12.8, MIR4482 et RP11 .159D12.8 ou encore NEK1 et KLF11 .
[0016] L’homme du métier connait de nombreuses techniques qu’il utilise au quotidien afin de déterminer le niveau d’expression d’un gène. Le niveau d’expression d’un gène est typiquement déterminé en analysant l’ARN transcrit à partir de ce gène ou de l’ADNc dérivé de cet ARN. Ces molécules d’acides nucléiques peuvent typiquement être extraites de l’échantillon biologique obtenu à partir du patient et analysées par des méthodes standard. Elles seront typiquement détectées par amplification et/ou hybridation avec, par exemple, une sonde. L’ARN isolé peut être soumis à plusieurs étapes de transcription inverse couplées à des amplifications, par exemple par réaction de polymérisation en chaîne par transcriptase inverse (RT-PCR) en utilisant des amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes d’intérêt, ou d’une partie de ces gènes.
[0017] Le niveau d’expression mesuré est typiquement normalisé sur la base de l’expression de gènes de ménage. Le niveau d’expression peut typiquement être normalisé sur l’expression des gènes GAPDH et 5S.
[0018] Selon un mode de réalisation particulier le procédé selon la présente invention comprend une étape dans laquelle le niveau d’expression des gènes de la signature de la RSI listés ci-dessus est comparé à une valeur de référence. Cette valeur de référence est déterminée pour chaque gène. Elle peut être déterminée de manière expérimentale, empirique ou théorique et est fixée afin d’obtenir une spécificité et sélectivité optimales. Le niveau d’expression des gènes de la signature de la RSI listés ci-dessus est typiquement utilisé afin de calculer un score. Le calcul d’un tel score est par exemple illustré dans la partie expérimentale ci-dessous. Ce score est ensuite comparé à une valeur de référence afin d’établir le statut de radiosensibilité du patient. Elle est fixée afin d’obtenir une spécificité et sensibilité optimales. Cette valeur de référence peut être déterminée sur la base de résultats obtenus dans une population contrôle, par exemple une population de patients radiotolérants connus ou radiosensibles connus. Un score supérieur à une valeur seuil déterminée sur la base d’une population de patients radiosensibles et radiotolérants sera associé à un profil radiosensible, alors qu’un score inférieur à cette valeur sera associé à un profil radiotolérant. [0019] La « radiosensibilité individuelle », ou « RSI » représente la sensibilité constitutionnelle aux radiations ionisantes des tissus d’un individu au sein d’une population - sa prédisposition à développer une toxicité tissulaire significative suite à une exposition professionnelle ou médicale désirée (diagnostic/thérapeutique) ou non désirée (accidentelle) selon un niveau de dose de radiations et un volume de corps exposé. Chez certains patients, la radiothérapie utilisée dans le traitement loco-régional du cancer peut entraîner des effets indésirables à court (on parle alors de toxicité précoce) ou à long (on parle alors de toxicité tardive) terme plus ou moins réversibles. Un patient sera plus ou moins radiotolérant ou radiosensible selon sa radiosensibilité individuelle. Les patients les plus radiotolérants ne risquent pas ou peu de développer une toxicité radio-induite alors que ceux qui sont plus radiosensibles ont de forts risques de développer des toxicités radio-induites. Déterminer la RSI d’un patient permet donc de déterminer le risque pour ce patient de développer une toxicité radio-induite et donc de déterminer si un patient est plutôt radiotolérant ou radiosensible.
[0020] Les « toxicités radio-induites tissulaires » sont ubiquitaires et reposent sur une physiopathologie commune aboutissant à une fibrose. Elles sont appréhensibles cliniquement à partir de 6 mois suivant la fin du traitement dans la zone irradiée à forte dose - pouvant revêtir divers aspects cliniques selon la localisation anatomique et les tissus irradiés : induration et épaississement de la peau, atrophie musculaire, ankylose articulaire, lymphœdème, atrophie muqueuse, ulcération, fistule, sténose des organes creux, sténoses/occlusions vasculaires, neuropathie et douleur. Selon les sites anatomiques, on peut encore décrire le trismus, la xérostomie, la dysphonie, l'ostéoradionécrose chez les patients atteints d'une tumeur de la tête et du cou ; myélite, plexite, pneumopathie interstitielle, chez les patients atteints d'une tumeur du sein ou du poumon ; infertilité, plexite, dyspareunie chez les patients atteints d'une tumeur abdominopelvienne, radionécrose gliale, troubles cognitifs, endocrinopathie. Elles incluent la fibrose, les radiodermites, le lymphœdème, l’inflammation aigue ou encore les neuropathies.
[0021] Le procédé selon la présente invention permet donc de prédire le risque pour un patient de développer l’une quelconque de ces formes de toxicité. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon la présente invention permet de prédire le risque d’un patient de développer une fibrose radio-induite ou « FRI ». Contrairement aux phénomènes d’inflammation aigue qui peuvent apparaitre immédiatement ou dans les 6 mois suivant le traitement par radiothérapie, la FRI est un effet « tardif » qui apparait plus de 6 mois sans limitation de durée après la radiothérapie.
[0022] Dans le cadre de la présente invention, l’« échantillon biologique » peut être n’importe quel échantillon dans lequel de l’ARN peut être détecté. Typiquement, l’échantillon est un fluide, un tissu, un échantillon de cellules, une biopsie, par exemple une biopsie de peau, etc... L’échantillon biologique peut particulièrement être un échantillon de sang, de sérum ou de plasma obtenu à partir du patient. Selon un mode de réalisation préféré, l’échantillon biologique est un échantillon de sang.
[0023] Comme indiqué plus haut, la signature selon la présente invention est constitutionnelle c’est- à-dire qu’elle représente une caractéristique phénotypique individuelle et donc qu’elle ne nécessite pas d’irradiations au préalable pour pouvoir être révélée. Le procédé selon la présente invention peut donc être réalisé à partir d’un échantillon biologique obtenu avant, pendant ou après traitement du patient par radiothérapie. Selon un mode de réalisation préféré, l’échantillon biologique est obtenu à partir dudit patient avant qu’il ne soit traité par radiothérapie.
[0024] Le « patient » ou « sujet » est un humain ou un animal, par exemple un mammifère. Selon un mode de réalisation préféré, le patient est un humain.
[0025] La « radiothérapie » est un traitement locorégional du cancer à visée curative ou palliative consistant à cibler des rayonnements ionisants de haute énergie sur une lésion tumorale ou non, bénigne ou maligne, primitive ou secondaire, en place ou opérée, ou encore une zone à risque - afin d’inactiver prioritairement les cellules pathologiques. La radiothérapie peut être délivrée au moyen d’accélérateurs de particules (radiothérapie externe). Des doses équivalentes de 20 à 80 grays (Gy) sont typiquement délivrées (fractionnement classique - séances quotidiennes de 1 .8 à 2.2 Gy espacées d’au moins 6h). Un agent thérapeutique radioactif peut aussi être administré au contact direct de la tumeur dans l’organisme : on distingue i- la curiethérapie au cours de laquelle les sources non scellées radioactives sont introduites directement à l’intérieur ou à proximité immédiate des zones à traiter à l’intérieur du corps ; sont ainsi utilisés en curiethérapie l’iode 125 dans le traitement du cancer de la prostate ou l’iridium 192 pour les cancers utérins - et ii- la radiothérapie interne vectorisée (ou métabolique) au cours de laquelle une substance radiopharmaceutiques est administrée par voie orale ou par injection intraveineuse et va se fixer sur les cellules cancéreuses ; on peut citer l’iode-131 , le lutetium-177, l’yttrium-90, le holmium-166, le radium-223, le strontium-89 et le samarium-153.
[0026] Selon un mode de réalisation, le procédé selon la présente invention peut être réalisé à partir d’un échantillon obtenu d’un patient sain, et donc qui ne souffre pas d’une pathologie devant nécessiter un traitement par radiothérapie. Dans ce cadre, le procédé selon la présente invention permet de déterminer si le patient aura un risque de développer une toxicité radio-induite s’il devait un jour recevoir un traitement par radiothérapie ou être exposé à des rayonnements ionisants.
[0027] Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon la présente invention peut être réalisé à partir d’un échantillon obtenu d’un patient qui souffre d’une pathologie devant nécessiter d’un traitement par radiothérapie, comme le cancer. Selon ce mode de réalisation, le procédé selon la présente invention permet de déterminer si le patient a un risque de développer une toxicité radio- induite et permet donc d’adapter le traitement. S’il est déterminé que le patient est plutôt radiosensible, et donc à risque de développer une toxicité radio-induite, alors il sera possible de réduire les doses de rayonnements reçus, de privilégier des techniques de radiothérapies internes comme la protonthérapie ou la curiethérapie qui sont moins à risque d’entraîner des toxicités que la radiothérapie externe, ou encore de proposer une alternative thérapeutique comme par exemple le recours à des traitements anticancéreux autres que la radiothérapie, comme la chirurgie, la chimiothérapie ou l’immunothérapie (voir Figure 2 de Pereira et al., Cancers (Basel) 14.24, 2022, 6252). Inversement s’il est déterminé que le patient est plutôt radiotolérant, et donc à faible risque de développer une toxicité radio-induite, alors il sera possible d’augmenter les doses de rayonnements reçus.
[0028] La présente divulgation concerne donc également une méthode de traitement du cancer dans laquelle la radiosensibilité d’un patient souffrant de cancer est déterminée selon le procédé de la présente invention, et dans laquelle : lorsque le patient est identifié comme étant radiosensible, le traitement consiste en une chirurgie, une chimiothérapie, une immunothérapie et/ou une radiothérapie telle qu’une protonthérapie, une curiethérapie ou une radiothérapie avec des doses inférieures à celles reçues de manière standard pour le traitement de ce cancer ; lorsque le patient est identifié comme étant radiotolérant, le traitement comprend une radiothérapie, éventuellement avec des doses supérieures à celles reçues de manière standard pour le traitement de ce cancer.
[0029] La présente invention porte également sur un agent radiothérapeutique pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un patient, dans lequel ledit patient a été identifié comme étant radiotolérant selon le procédé de la présente invention.
[0030] Un « agent radiothérapeutique » peut être n’importe quel agent connu de l’homme du métier pour être utilisé en radiothérapie externe ou interne. Un agent radiothérapeutique peut par exemple être tel que ceux administrés dans le cadre d’une curiethérapie (lode-125, Iridium 192) ou d’une thérapie systémique par radioisotope émetteur beta-moins ou alpha tels que l’iode-131 , le galium-68, le lutetium-177, le phosphore 32, l’yttrium-90, l’holmium-166, le radium-223, le strontium- 89, le samarium 153, l’actinium-225, l’erbium-169, le rhénium-186, le bismuth-212 (radiothérapie interne vectorisée ou radiothérapie métabolique).
[0031] Le « cancer » à traiter est n’importe quel cancer primitif ou métastatique qui peut être traité par radiothérapie chez l’adulte et l’enfant. Particulièrement, ce cancer est choisi dans le groupe constitué du cancer du sein, du cancer de la prostate, du cancer du poumon, du cancer des voies aérodigestives supérieures (cancer ORL), des tumeurs du système nerveux central, des sarcomes, des lymphomes, du cancer du col de l’utérus, du cancer de l’endomètre, du cancer du rectum/canal anal, du cancer de la vessie, du cancer du pancréas, du cancer du foie, du cancer de l’estomac, du cancer de l’œsophage, du cancer de la prostate, du cancer des testicules, des tumeurs neuroendocrines, du cancer de la thyroïde. Dans un mode de réalisation particulier, ledit cancer est un cancer du sein.
[0032] La présente invention est présentée de manière plus détaillée dans les exemples ci-dessous. Ces exemples sont fournis uniquement à des fins illustratives et ne peuvent être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.
Brève description des dessins [0033] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
[0034] La Figure 1 illustre la validation par qRT-PCR de la variation de l’expression de chacun des 10 gènes composant la signature sanguine au sein des échantillons sanguins de l’étude clinique SPLICIRAD (NCT03000764). RS = radiosensible ; RT = radiotolérant. Le test statistique de Mann- Whitney-Wilcoxon a été utilisé pour calculer la p-value : *p < 0.15 ; **p < 0.05
[0035] La Figure 2 illustre l’efficacité du modèle proposé pour la discrimination des individus radiosensibles et radiotolérants sur la base de l’expression des seuls gènes MT-TK et RP11- 159D12.8 (Panneaux A et C) ou de l’ensemble des 10 gènes de la signature (Panneaux B et D). Panneaux A et B : score prédit par le modèle pour les patientes de l’étude SPLICIRAD (RS = radiosensible ; RT = radiotolérant). Panneaux C et D : courbe ROC (Receiver Operating Characteristic) attestant de la spécificité et de la sensibilité des modèles proposés.
Exemples
[0036] 1. Identification d’une signature transcriptomique sanguine de la Radiosensibilité Individuelle (RSI)
[0037] La RSI étant constitutionnelle, il est possible d'identifier celle d'un individu à partir de n'importe lequel de ses tissus. Le sang, facilement accessible et analysable, a été choisi comme source biologique car notre objectif à terme était de développer un test prédictif de RSI non invasif et réalisable au sein de tous les laboratoires d’analyse. Le modèle de la fibrose cutanée radio-induite, toxicité tardive fréquente survenant après traitement d'un cancer du sein par radiothérapie, a été pris pour modèle de radiotoxicité pour le développement de cette signature. Les ARN ont été extraits à partir des tubes PaxGene™ RNA Blood des patientes radiosensibles ou radiotolérantes de l'étude clinique SPLICIRAD (NCT03000764) et ont été hybridés sur des puces Affymetrix Clariom™ D. Ces puces haute définition couvrent non seulement les exons des transcrits codants et non-codants, soit 670 402 exons, mais aussi les jonctions exon-exon connues (339 146 jonctions). Une analyse bioinformatique quantitative a ensuite été réalisée avant une analyse fonctionnelle sur R et sur la plateforme DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery). Sur la base de l'analyse du transcriptome des patientes de ces 2 groupes, une signature sanguine a été identifiée. Elle comporte 10 gènes (Tableau 1). Chacun des 10 gènes est significativement différentiellement exprimé entre les patientes radiosensibles et radiotolérantes (Figure 1). La mesure de l’expression normalisée à l’expression de l’ARNm GAPDH et de l’ARNr 5S d’au minimum 1 gène parmi la signature de 10, notamment le gène RNU6ATAC permet une très bonne discrimination des patientes radiosensibles et radiotolérantes avec une sensibilité de 80%, une spécificité de 80% et une AUC de 0.83 (Tableau 2). Les performances prédictives de chacun des 10 gènes et de toutes les combinaisons possibles de 2 gènes parmi les 10 sont décrites dans le Tableau 2. Comme démontré dans ce tableau, la mesure de l’expression d’au moins un de ces dix gènes est suffisante et efficace pour déterminer la radiosensibilité individuelle d’un patient. Ce tableau montre notamment que la discrimination des patientes radiosensibles et radiotolérantes par mesure de l’expression des gènes :
- MT-TK et RP11-159D12.8 est réalisée avec une sensibilité de 90%, une spécificité de 100% et une AUC de 0.98 (Figure 2A/2C) ; - RNU6ATAC et RP11 .159D12.8 est réalisée avec une sensibilité de 100%, une spécificité de 100% et une AUC de 1 ;
- premiR4482 et RP11 .159D12.8 avec une sensibilité de 90%, une spécificité de 90% et une AUC de 0.98 ;
- NEK1 et KLF11 avec une sensibilité de 80%, une spécificité de 90% et une AUC de 0.97 ; tandis que la mesure de l’ensemble des 10 gènes de la signature permet une discrimination parfaite des patientes radiosensibles et radiotolérantes avec une sensibilité de 100%, une spécificité de 100% et une AUC de 1 (Figure 2B/2D).
[0038] [Tableau 2] : Performances de discrimination des individus radiosensibles et radiotolérants par la mesure de l’expression de chacun des 10 gènes et de toutes les combinaisons possibles de 2 gènes parmi les 10 gènes de la signature sanguine. Le nom du gène ou de la combinaison de gènes, ainsi que la sensibilité, la spécificité et l’AUC sont indiquées.
[0039] [Tableau 3] : Liste des gènes de la signature sanguine. Le nom du gène et la nature du produit du gène (ARN codant ou non-codant) sont indiqués.
[0040] Le test ainsi développé se distingue par sa pertinence physiopathologique (modèle humain, conditions expérimentales réalistes, approche intégrative cadrée sur des évènements moléculaires) et ne nécessite pas d’irradiation ex-vivo au préalable. En effet, bien que les données présentées ici aient été obtenues à partir de patientes ayant reçu une dose de radiothérapie puisque leur phénotype de radiosensibilité individuelle a dû être déterminé avant l’étude, les données disponibles aujourd’hui permettent de démontrer que la signature identifiée ici n’est pas affectée par l’irradiation. Premièrement, le transcriptome des patientes a été analysé à partir de prélèvements sanguins réalisés 5 ans post-irradiation et il a été vérifié que l'expression des gènes de la présente signature ne varie pas en réponse à l'irradiation (analyse transcriptomique après une irradiation à 2Gy réalisée ex-vivo sur des cultures fibroblastiques primaires issues des patientes de l’étude SPLICI-Rad). Deuxièmement, les cellules sanguines, étant donnée leur durée de vie (de quelques heures à quelques mois) avaient toutes été renouvelées au moment du prélèvement et les progéniteurs des cellules sanguines sont localisés dans des zones « protégées » par les schémas d'irradiation car ce sont des organes à risque important de toxicité s'ils sont touchés. Enfin, le test d'apoptose lymphocytaire (Azria et al., EBioMedicine 2.12, 2015: 1965-1973), bien qu'ayant été développé sur des échantillons sanguins prélevés post-irradiation, a confirmé son efficacité par des résultats similaires sur des échantillons sanguins prélevés avant radiothérapie.
[0041] Le test développé dans le cadre de la présente invention permet de déterminer la radiosensibilité individuelle avant irradiation avec une grande sélectivité et spécificité.
[0042] Mode de réalisation du procédé selon la présente invention [0043] Le PAXgene® Blood RNA Kit est utilisé pour la purification des ARN intracellulaires à partir de sang total prélevé dans le PAXgene® Blood RNA Tube. Les PAXgene® Blood RNA Tubes (BRT) contiennent un réactif spécifique basé sur une technologie brevetée de stabilisation d'ARN. Ce réactif protège les molécules d'ARN de la dégradation par les RNases et minimise les modifications ex vivo de l'expression de gènes. Les PAXgene® BRT assurent la stabilisation des ARN cellulaires jusqu'à 3 jours à une température comprise entre 18 et 25 °C, jusqu'à 5 jours entre 2 et 8 °C et d'au moins 11 ans quand le sang stabilisé est conservé à -20°C ou à -70°C. Ce système permet la préparation d'ARN intracellulaires purifiés de bonne qualité pouvant être utilisés pour les tests de diagnostic moléculaire basés sur la RT-PCR.
[0044] Les ARN ainsi extraits sont ensuite dosés par spectrophotométrie à 260 nm. La contamination par des protéines ou composés phénoliques/sels est estimée par mesure des rapports d'absorbance 260/280 et 260/230, respectivement. Si ces rapports s'avèrent non satisfaisants (ratios 1.7), une extraction phénol-chloroforme, suivie d'une précipitation à l'éthanol absolu en présence d'acétate de sodium 0,15 M est réalisée afin d'éliminer les résidus de phénols et protéines et d'optimiser la qualité des ARN totaux. La qualité des ARN ainsi que la non-contamination par de l'ADN génomique est évaluée par électrophorèse capillaire.
[0045] La réaction de transcription inverse (RT pour reverse transcription) est réalisée sur un minimum de 50 ng d'ARN totaux en utilisant un mélange d'amorces aléatoires et (dT)18 (Superscript™ IV Vilo Master Mix, Invitrogen) selon le protocole du fournisseur.
[0046] L'expression des gènes de la signature sanguine est analysée par PCR en temps réel reposant sur la chimie SYBR Green (ITaq Master Mix, Bio-Rad) selon le protocole du fournisseur. Les ADNc produits par transcription inverse sont dilués au 1/10eme ou 1/100eme selon l’abondances des transcrits d’intérêt. Le signal fluorescent détecté permet une mesure quantitative de l'accumulation exponentielle du produit au cours des différents cycles de PCR. Une courbe standard est réalisée pour chaque couple d’amorces et le signal des gènes de ménage GAPDH et 5S est utilisé pour normaliser les données. Toutes les amplifications sont réalisées en triplicatat technique. Des contrôles négatifs, contrôle H2O et contrôle non rétro-transcrit (RT-), sont réalisés en parallèle.
[0047] Le statut de RSI de la patiente analysée peut être établi selon la méthode suivante :
[0048] Modélisation du statut de radiosensibilité des patientes à l’aide d’une régression logistique prenant en compte au minimum les niveaux d’expression normalisés des gènes RP11 .159D12.8 et MT-TK, qui pourront être complétés par ceux des gènes cités dans le Tableau 2 et d’autres variables cliniques pertinentes. Ce modèle permet d’établir un score, dont le seuil de discrimination entre les deux phénotypes de patientes est fixé à l’aide de son indice de Youden. En ne prenant en compte que les gènes RP11 .159D12.8 et MTTK, le score est le suivant : Avec A = 25.523 - 25.501 * ÆP11.159D12.8 - 5.214 * MTTK
Dans ce cas, le seuil permettant de discriminer les patientes radiosensibles des patientes radiotolérantes est 0.681 :
Si le score est > 0.681 , alors la patiente est prédite comme radiosensible. - Si le score est < 0.681 , alors la patiente est prédite comme radiotolérante.
[0049] En prenant en compte les gènes RP11 .159D12.8 et MTTK, ainsi que les 8 autres gènes de la signature, le score est le suivant :
Avec A = 74.082 - 144.005 * STRN3 - 150.727 * ÆP11.159D12.8 - 20.528 * MTTK + 0.681 * premiRAA82 + 100.486 * NEK1 + 127.447 * TDG - 37.488 * RNU6ATAC + 47.995
* RNU5B + 626.016 * KLF11 - 88.642 * PSPHP1
Dans ce cas, le seuil permettant de discriminer les patientes radiosensibles des patientes radiotolérantes est 0.5 :
Si le score est > 0.5, alors la patiente est prédite comme radiosensible. - Si le score est < 0.5, alors la patiente est prédite comme radiotolérante.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Procédé in vitro pour déterminer la radiosensibilité individuelle d’un patient, ledit procédé comprenant une étape de mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit patient, du niveau d’expression d’au moins 1 gène parmi le groupe de 10 gènes constitué de RP11- 159D12.8, MT-TK, KLF11 , MIR4482, NEK1 , PSPHP1 , RNU5B-1 , RNU6ATAC, STRN3 et TDG.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le niveau d’expression d’au moins RNU6ATAC est mesuré.
[Revendication 3] Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le niveau d’expression d’au moins 2 gènes parmi le groupe de 10 gènes est mesuré.
[Revendication 4] Procédé selon la revendication 3, dans lequel lesdits au moins 2 gènes comprennent RP11-159D12.8 et MT-TK, RNU6ATAC et RP11 .159D12.8, MIR4482 et RP11.159D12.8 ou NEK1 et KLF11.
[Revendication 5] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le niveau d’expression des 10 gènes est mesuré.
[Revendication 6] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel ledit procédé permet de déterminer le risque de développer une fibrose radio-induite.
[Revendication 7] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ledit échantillon biologique est un échantillon de sang.
[Revendication 8] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel ledit échantillon biologique est obtenu avant traitement du patient par radiothérapie.
[Revendication 9] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le patient est humain.
[Revendication 10] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel ledit patient souffre d’un cancer.
[Revendication 11] Procédé selon la revendication 10, dans lequel ledit cancer est un cancer du sein.
[Revendication 12] Un agent radiothérapeutique pour son utilisation dans le traitement du cancer chez un patient, dans lequel ledit patient a été identifié comme étant radiotolérant selon le procédé de l’une quelconque des revendications 1 à 11 .
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