EP4642241A1 - Isolat de proteine vegetale ameliore via traitement par biomasse de cellule entiere - Google Patents

Isolat de proteine vegetale ameliore via traitement par biomasse de cellule entiere

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Publication number
EP4642241A1
EP4642241A1 EP24706935.4A EP24706935A EP4642241A1 EP 4642241 A1 EP4642241 A1 EP 4642241A1 EP 24706935 A EP24706935 A EP 24706935A EP 4642241 A1 EP4642241 A1 EP 4642241A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
suspension
protein
strain
isolate
weight
Prior art date
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Pending
Application number
EP24706935.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Estelle Fischer
Sophie HUCHETTE-DEFRETIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roquette Freres SA
Original Assignee
Roquette Freres SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roquette Freres SA filed Critical Roquette Freres SA
Publication of EP4642241A1 publication Critical patent/EP4642241A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/006—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from vegetable materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/14—Vegetable proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/185—Vegetable proteins

Definitions

  • the invention relates to the field of plant proteins, in particular legume protein isolates, even more particularly pea protein isolates.
  • Human daily protein requirements are between 12 and 20% of the food ration. These proteins are provided by both animal products (meat, fish, eggs, dairy products) and plant products (cereals, legumes, algae).
  • animal proteins have many disadvantages, both in terms of their allergenic potential, particularly concerning proteins from milk or eggs, and in environmental terms in relation to the harmful effects of intensive farming.
  • soybean has been, and remains, the first plant-based alternative to animal proteins.
  • soy has certain disadvantages.
  • the soybean is more than frequently of GMO origin and obtaining its protein involves a deoiling step using solvent.
  • grain legumes including peas in particular, have developed significantly in Europe, mainly in France, as an alternative protein resource to animal proteins for animal and human consumption.
  • Peas contain approximately 27% by weight of protein materials.
  • the term "pea” is considered here in its broadest sense and includes in particular all wild varieties of "smooth pea”, and all mutant varieties of "smooth pea” and “wrinkled pea", regardless of the uses for which said varieties are generally intended (human food, animal nutrition and/or other uses). These seeds are non-GMO and do not require solvent deoiling.
  • Pea protein mainly pea globulin
  • dry processes so-called “wet” processes.
  • turbo-separation a process commonly called turbo-separation.
  • a second way consists of adding masking or flavoring compounds to the protein as soon as the protein is obtained during its manufacturing process or during its formulation mainly in a food.
  • many problems persist, including in particular the additional cost due to the use of such compounds or the regulatory issues of using a chemical compound for these purposes.
  • An alternative approach consists of using bacterial strains to modulate the organoleptic profile.
  • the strain(s) will be added during the extraction process (preferably at the end of the process, i.e. with the final product) and subjected to physicochemical conditions allowing their growth. During this growth, the strains, through the activation of their metabolisms, will consume several compounds including those responsible for the flavor, the organoleptic profile (e.g. hexanal).
  • problems persist such as the hydrolysis of proteins by the proteases constituting or produced by the strains or even the production of unwanted flavors due, for example, to the production of organic acids such as lactic acid.
  • the present invention relates to a method for improving the organoleptic properties of a material rich in vegetable proteins comprising the following steps:
  • the microbial strain(s) being chosen from strains of lactic acid bacteria, strains of yeast, or a mixture thereof, the strain(s) preferably being one or more strains of lactic acid bacteria, so as to obtain a seeded suspension having a cell density of between 1.10 5 and 1.10 10 cfu/mL, preferably between 1.10 7 and 1.10 9 cfu/mL, preferably between 5.10 7 and 5.10 8 cfu/mL;
  • the method according to the invention is characterized in that the material rich in vegetable proteins from step 1 is in the form of a powder containing a quantity of vegetable proteins greater than 1% by weight, preferably between 70% and 90% by weight, relative to the weight of powder.
  • the powder is preferably essentially derived from seeds, typically legume seeds such as pea or field bean seeds, having been ground and reduced to powder.
  • the powder is preferably a flour.
  • the seeds may of course have undergone preparation steps including, but not limited to, cleaning, sorting, removal of the outer shell (also called "dehulling"), and heat treatment.
  • the method according to the invention is characterized in that the material rich in vegetable protein from step 1 is an isolate or a concentrate, preferably an isolate whose protein content is greater than 70% by dry weight on isolate dry matter, preferably between 75% and 95% by dry weight on isolate dry matter.
  • the protein content values are potentially 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 or 95%.
  • the material rich in vegetable proteins from step 1 is an isolate or concentrate of vegetable proteins, preferably is an isolate of vegetable proteins whose protein content is greater than 80% by dry weight, preferably between 80% and 90% by dry weight, relative to the dry weight of isolate.
  • the method according to the invention is characterized in that the material rich in vegetable protein from step 1 comes from a legume, preferably from a legume selected from the group consisting of peas and field beans, more preferably comes from peas.
  • the method according to the invention is characterized in that the pH of the suspension of material rich in vegetable protein from step 1 is rectified so as to be between 5.0 and 7.5, preferably between 6.5 and 7.5; preferably so as to be equal to 7.0, before implementing step 2.
  • the method according to the invention is characterized in that the sugar content of the suspension of material rich in vegetable proteins from step 1 is rectified so as to contain between 1% and 10% of sugars, preferably between 2% and 8%, even more preferably between 3% and 6%.
  • the method according to the invention is characterized in that the strain(s) of step 2 are selected from a strain of Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus or Saccharomyces cerevisiae, preferentially Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, or Lactobacillus rhamnosus.
  • the terms Limosilactobacillus and lacticaseibacillus can be interchanged with the term Lactobacillus due to a change in taxonomy (see the article Zheng et al., “A taxonomy note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae” (, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020; 70:2782-2858 DOI 10.1099/ijsem.0.004107).
  • the strain(s) in step 2 can therefore be preferentially selected from Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, or Lacticaseibacillus rhamnosus.
  • the strain(s) used in step 2 of the method of the invention have been cultured according to a method comprising: i. inoculating a solid culture medium, for example agar, with a sample of the strain(s); ii. pre-cultivating the strain(s), by incubating the inoculated solid culture medium from step 1 in a non-stirred incubator, preferably for between 10h and 24h; iii. propagating the strain, by inoculating a liquid culture medium with a sample of pre-cultured strain from step ii, and culturing the strain in liquid medium.
  • a method comprising: i. inoculating a solid culture medium, for example agar, with a sample of the strain(s); ii. pre-cultivating the strain(s), by incubating the inoculated solid culture medium from step 1 in a non-stirred incubator, preferably for between 10h and 24h; iii. propagating the strain, by inoculating
  • the incubation time of step 11 is between 10 h and 20 h.
  • the method according to the invention is characterized in that step 3 is followed by a step 4 comprising the following sub-steps:
  • step 4a optionally, the rectification of the pH of the suspension obtained at the end of step 3 to a pH between 5 and 9, preferably between 6 and 9, preferably a pH of 7, preferably by adding soda or lime to said suspension;
  • step 4b heat treatment of the suspension from step 3 or step 4a between 100°C and 160°C for 0.1 to 1 s, and 4c. drying the suspension from step 4b using an atomizer until a vegetable protein isolate is obtained preferably having a dry matter greater than 95% relative to the mass of isolate.
  • the invention also relates to a plant protein isolate capable of being obtained by the process of the invention.
  • the plant protein isolate capable of being obtained by the process of the invention is characterized in that its degree of hydrolysis (or DH) is less than 10%, preferably less than 5%.
  • the plant protein isolate obtainable by the method of the invention is characterized in that its protein content is between 70% and 95% by weight, preferably between 82% and 92% by weight, preferably between 84% and 90% by weight, preferably between 84% and 88% by weight, relative to the total dry matter weight of the isolate.
  • the protein content values are potentially 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 or 95%. As well as any range included between two of each of these values.
  • the plant protein isolate capable of being obtained by the process of the invention is characterized in that its protein content is between 80% and 95% by weight, preferably between 82% and 92% by weight, preferably between 84% and 90% by weight, preferably between 84% and 88% by weight, relative to the total dry matter weight of the isolate.
  • the invention also relates to the use of an isolate capable of being obtained by the process of the invention or obtained according to the process of the invention for industrial applications including food, nutraceutical, pharmaceutical applications.
  • the present invention relates to a method for improving the organoleptic properties of a material rich in vegetable proteins comprising the following steps:
  • the microbial strain(s) being chosen from strains of lactic acid bacteria, strains of yeast, or a mixture thereof, the strain(s) preferably being one or more strains of lactic acid bacteria, so as to obtain a seeded suspension having a cell density of between 1.10 5 and 1.10 10 cfu/mL, preferably between 1.10 7 and 1.10 9 cfu/mL, preferably between 5.10 7 and 5.10 8 cfu/mL;
  • step 2 3. incubation of the suspension from step 2 at a temperature between 20°C and 40°C for a time between 30 and 120 minutes, preferably between 45 and 75 minutes, even more preferably between 50 and 70 minutes.
  • organoleptic is meant all the stimuli that relate to the sensory sphere including taste, flavor, and odor.
  • the organoleptic profile of a compound and/or a food can be evaluated using a sensory panel.
  • a sensory panel is made up of a group of people who will taste the compound and/or the food according to a well-defined protocol, then each member of the panel will give their sensory evaluation, classically composed of a descriptor (e.g. bitter, sweet, pea taste, vegetable flavor, cardboard) and a score indicating the intensity of perception of this descriptor.
  • a descriptor e.g. bitter, sweet, pea taste, vegetable flavor, cardboard
  • the organoleptic properties or “improving the organoleptic qualities” is meant in the present invention a reduction undesirable stimuli associated with plant protein-rich materials (e.g., associated with plant protein isolates), such as plant flavors, typically herbaceous flavors or pea flavors ("beany" flavors).
  • plant protein-rich materials e.g., associated with plant protein isolates
  • this reduction of undesirable stimuli is enabled by the conversion of compounds such as aldehydes, ketones and thiols present in the plant protein-rich material into other compounds (alcohols and/or carboxylic acids) under the action of one or more microbial strains as described in the present application.
  • aldehydes, ketones and thiols are the main contributors to these undesirable stimuli, and the products of their bioconversions have in particular flavors or odors less characteristic of plant protein-rich materials, and/or higher thresholds of perception by the consumer.
  • reducing the amount of aldehydes with green notes (“green-note aldehydes”) leads to an organoleptic improvement of the products, through a reduction in “vegetal” sensory attributes.
  • the method for improving the organoleptic properties of plant proteins of the invention is a method for converting aldehydes, ketones and/or thiols present in materials rich in plant proteins into other compounds having flavors or odors less characteristic of plant proteins and/or higher perception thresholds.
  • the method for improving the organoleptic properties of plant proteins of the invention is a method for converting all or part of the aldehydes having green notes present in the plant proteins into other compounds.
  • plant proteins is meant any composition extracted from a natural raw material such as seeds and preferably having been modified in order to make it more available and effective in its formulation for the ultimate purpose of its consumption. The modifications can be very limited (e.g. a simple grinding of the seed) or very complex (e.g. a wet manufacturing process for an isolate).
  • material rich in vegetable proteins is meant any powder, solution, floc containing at least 1%, preferably 25%, by weight of proteins, relative to the total weight of material rich in vegetable proteins. Mention may be made, without limitation, of flours, concentrates, isolates, seeds.
  • lactic acid bacteria all Gram-positive, anaerobic bacteria that are partially tolerant to oxygen, generally not producing spores, in the form of cocci or rods and capable of fermenting sugars into lactic acid. According to the current taxonomic classification, they belong to the phylum Firmicutes, the class Bacilli and the order Lactobacillales, comprising the following families: Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae and Streptococcaceae. The Bifidobacteriaceae of the order Bifidobacteriales are also classified among the lactic acid bacteria.
  • the genus Lactobacillus is particularly important.
  • Limosilactobacillus and lacticaseibacillus can be interchanged with the term Lactobacillus due to a change in taxonomy (see the article Zheng et al., “A taxonomy note on the genus Lactobacillus'. Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901 , and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020;70:2782-2858 DOI 10.1099/ijsem.0.004107).
  • Lactobacillus fermentum is now equivalent to Limosilactobacillus fermentum
  • Lactobacillus rhamnosus is now equivalent to Lacticaseibacillus rhamnosus
  • Lactobacillus reuteri is now equivalent to Limosilactobacillus reuteri).
  • yeasts we mean all unicellular fungi of variable shape depending on the species (spherical, ovoid or elliptical, bottle-shaped, triangular or apiculate (swollen at each end like a lemon) but generally oval, of about 6 to 10 microns and up to 50 microns, multiplying by budding or by fission (fissiparity). Most are related to the Ascomycetes (truffle type, courtize), some to the other large group of higher fungi, the Basidiomycetes (amanita type, boletes) and others finally are imperfect forms not clearly assignable to a defined group.
  • yeast generally refers to the genus Saccharomyces (brewer's yeast or baker's yeast). There are many other genera of yeast; among the best known are the genus Candida and Pichia.
  • colony forming unit which is used to estimate the number of viable bacteria or fungal cells in a sample. Viability is defined as the ability to multiply by cell division under controlled conditions.
  • cell density we mean the quantity of bacteria or fungal cells present in a sample. It can be expressed in cfu/mL
  • Step 1 of suspension consists of mixing a material rich in vegetable protein in a preferably aqueous solvent, so as to obtain a suspension of vegetable protein reaching between 5% and 20% of dry matter, preferably between 7.5% and 15%, even more preferably between 8% and 12%.
  • the values will therefore potentially be 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% or 25%. As well as any range included between two of each of these values.
  • protein content designates the quantity of nitrogen, typically measured by the Kjeldhal method, multiplied by 6.25 and expressed as % by total weight of protein-rich material or composition according to the invention.
  • the method according to the invention is characterized in that the material rich in vegetable protein from step 1 is in the form of a vegetable powder commonly called flour containing a protein content greater than 1% by weight, preferably between 10% and 40% by weight, relative to the weight of powder, preferably between 20% and 30%.
  • the powder is preferably essentially composed of seeds that have been crushed and reduced to a powder state.
  • the seeds may of course have undergone preparation steps including, but not limited to, cleaning, sorting, removal of the outer shell (also called “dehulling"), and heat treatment.
  • "isolate” is meant a protein-rich material whose protein content is greater than 70% by dry weight, preferably greater than 80% by dry weight, even more preferably between 80% and 90% by dry weight, relative to the total dry matter of the isolate.
  • concentrate is meant a protein-rich material whose protein content is between 25% and 70% by dry weight, preferably between 35% and 60% by dry weight, even more preferably between 40% and 50% by dry weight, relative to the total dry matter of the concentrate.
  • the method according to the invention is characterized in that the material rich in vegetable protein from step 1 is an isolate or a concentrate, preferably an isolate whose protein content is greater than 70% by dry weight on isolate dry matter, preferably between 75% and 95% by dry weight on isolate dry matter.
  • the protein content values are potentially 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 or 95%. As well as any range included between two of each of these values.
  • the method according to the invention is characterized in that the material rich in vegetable protein from step 1 comes from a legume, preferably comes from a legume selected from the group consisting of peas and field beans, more preferably comes from peas.
  • legumes is meant the family of dicotyledonous plants of the order Fabales. It is one of the most important families of flowering plants, the third after Orchidaceae and Asteraceae by the number of species. It has approximately 765 genera grouping more than 19,500 species.
  • legumes are important cultivated plants among which soybeans, beans, peas, fava beans, chickpeas, peanuts, cultivated lentils, cultivated alfalfa, various clovers, broad beans, carob, licorice.
  • pea is meant its broadest definition and including in particular all varieties of “smooth pea” and “wrinkled pea”, and all mutant varieties of “smooth pea” and “wrinkled pea” and this, whatever the uses for which said varieties are generally intended (human food, animal nutrition and/or other uses).
  • pea in the present application includes pea varieties belonging to the genus Pisum and more particularly to the species sativum and aestivum. Said mutant varieties are in particular those called “r mutants", “rb mutants”, “rug 3 mutants”, “rug 4 mutants”, “rug 5 mutants” and “lam mutants” as described in the article by C-L HEYDLEY et al. entitled “Developing novel pea starches” Proceedings of the Symposium of the Industrial Biochemistry and Biotechnology Group of the Biochemical Society, 1996, pp. 77-87.
  • fava bean is meant the group of annual plants of the species Vicia faba, belonging to the group of legumes of the family Fabaceae, subfamily Faboideae, tribe Fabeae. A distinction is made between the Minor and Major varieties. In the present invention, wild varieties and those obtained by genetic engineering or varietal selection are all excellent sources.
  • aqueous solvent any solvent whose composition is predominantly water. By predominantly is meant that more than 50% by weight, preferably more than 90% by weight, even more preferably more than 95%, of the aqueous solvent is water, by weight of solvent, or even the aqueous solvent is “pure” water, i.e. a solvent composed of 100% by weight of water.
  • water is meant any so-called potable water that is suitable for this purpose.
  • potable water is meant water that can be drunk or used for domestic and industrial purposes without risk to health.
  • its conductivity is chosen between 400 and 1100, preferably between 400 and 600 pS/cm. More preferably in the present invention, it will be understood that this potable water has a sulfate content of less than 250 mg/l, a chloride content of less than 200 mg/l, a potassium content of less than 12 mg/l, a pH of between 6.5 and 9 and a TH (Hydrometric Title, i.e.
  • the suspension is thus obtained by intimately mixing the material rich in vegetable proteins and the aqueous solvent.
  • the suspension is thus obtained by intimately mixing the material rich in vegetable proteins and the aqueous solvent.
  • There are several ways of proceeding including the introduction of a powder of material rich in vegetable proteins into the aqueous solvent (dry grinding followed by suspension) or the introduction of the material rich in vegetable proteins into the aqueous solvent followed by a grinding step (suspension followed by wet grinding).
  • This mixture is made so as to obtain a suspension of vegetable protein having a dry matter content (DM value) of between 5% and 20%, preferably between 7.5% and 15%, even more preferably between 8% and 12%.
  • DM value dry matter content
  • the dry matter content is measured by any method well known to those skilled in the art. It describes the percentage of solid in a mixture of substances. The higher the dry matter content, the drier the mixture.
  • the so-called “desiccation” method is used. It consists of determining the quantity of water evaporated by heating a known quantity of a sample of known mass. A previously weighed sample (called fresh mass) is heated. The heating is continuous until the mass stabilizes, indicating that the evaporation of the water is complete.
  • the temperature used is 105°C to allow the residual water to evaporate.
  • the dry residue is weighed and expressed as a ratio. The dry matter content of the sample analyzed is obtained.
  • Step 2 consists of adding one or more microbial strains to the suspension of raw material rich in vegetable protein from step 1, the strain(s) being selected from the group consisting of lactic acid bacteria or yeasts, preferably lactic acid bacteria, and the cell density of the suspension after introduction of the strain(s) being between 1.10 5 and 1.10 10 cfu/mL, preferably between 1.10 7 and 1.10 9 cfu/mL, preferably between 5.10 7 and 5.10 8 cfu/mL; The cell density may therefore be 1.10 5 cfu/mL,
  • a single microbial strain is introduced into the suspension of raw material rich in vegetable protein from step 1.
  • the lactic bacteria or yeasts are cultured in a first sub-step called culture in order to achieve a higher cell density than that described in the present application.
  • the person skilled in the art will know how to adapt the culture conditions to the selected strain in order to achieve this density.
  • the culture step is itself subdivided into two steps: a first pre-culture step aimed at reviving the stored strain (e.g. frozen or freeze-dried) and a second propagation step aimed at multiplying the strain to achieve the desired cell density.
  • the strain(s) used in step 2 have been cultured according to a method comprising: i. inoculation of a solid culture medium, for example agar, with a sample of strain, preferably of frozen or freeze-dried strain; ii. pre-culture of the strain, by incubation of the inoculated solid culture medium from step 1 in a non-stirred incubator, preferably for 15 to 24 h; iii. propagation of the strain, by inoculation of a liquid culture medium with a sample of pre-cultured strain from step ii, and culture of the strain in liquid medium.
  • a method comprising: i. inoculation of a solid culture medium, for example agar, with a sample of strain, preferably of frozen or freeze-dried strain; ii. pre-culture of the strain, by incubation of the inoculated solid culture medium from step 1 in a non-stirred incubator, preferably for 15 to 24 h; iii. propagation of the strain
  • the pre-culture and propagation are preferably carried out at a temperature appropriate to the strain: typically at a temperature of about 35°C-38°C, preferably 38°C for lactic acid bacteria and typically about 28-32°C for yeasts.
  • the culture time of the propagation step 11 is relatively long, typically between 12 and 20 hours, preferably about 15 hours; and the propagation time is between 8 hours and 15 hours, and is preferably at least about 10 hours. Indeed, as shown in the experimental part, a minimum propagation time of 10 hours is preferable for obtaining the maximum technical effect of the invention.
  • a preferred culture protocol is as follows: i. Seeding step: a sample of frozen strain is taken in a cryotube and inoculated into a suitable culture medium, typically agar, the culture medium being contained in a tube, for example in a 10 mL tube; ii. Pre-culture step: The tube is incubated in a non-stirred incubator for 15 to 24 h. iii. Propagation step: The pre-culture tube is then used to inoculate at 1% volume/volume a container (flask or Erlenmeyer flask), containing e.g. 1 L of medium for the above example of a 10 mL tube. The culture takes place at the optimum temperature of each strain for the optimum time of each, such as those detailed for examples of lactic acid bacteria and yeast in Table 1.
  • the second sub-step then consists of introducing a determined quantity of the culture into another quantity of the suspension rich in plant proteins prepared in step 1 in order to finally obtain a cell density of the suspension of between 1.10 5 and 1.10 10 cfu/mL, preferably between 1.10 7 and 1.10 9 cfu/mL, preferably between 5.10 7 and 5.10 8 cfu/mL.
  • the method according to the invention is characterized in that the strain(s) of step 2 are selected from a strain of Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus or Saccharomyces cerevisiae, preferentially of Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, or Lactobacillus rhamnosus.
  • Limosilactobacillus and lacticaseibacillus also mean Lactobacillus due to a change in taxonomy (see the article Zheng et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
  • strain(s) of step 2 can therefore be preferentially selected from Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, or Lacticaseibacillus rhamnosus.
  • a single microbial strain selected from Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus or Saccharomyces cerevisiae, preferably Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, or Lactobacillus rhamnosus is introduced into the suspension of raw material rich in vegetable protein from step 1.
  • two or more microbial strains selected from Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus or Saccharomyces cerevisiae, preferably Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, or Lactobacillus rhamnosus are introduced at the same time into the suspension of raw material rich in vegetable protein from step 1.
  • Lacticaseibacillus rhamnosus - Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, and Saccharomyces cerevisiae
  • two or more microbial strains selected from Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus or Saccharomyces cerevisiae, preferably Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, or Lactobacillus rhamnosus are introduced consecutively into the suspension of raw material rich in vegetable protein from step 1.
  • strains from collection references are Lactobacillus fermentum CIP 102980 T or CNCM I-5802 (now Limosilactobacillus fermentum); Lactobacillus rhamnosus LMG 18243 or ATCC 53103, also known as Lacticaseibacillus rhamnosus GG (now Lacticaseibacillus rhamnosus); Lactobacillus reuteri DSM 17509 (now Limosilactobacillus reuteri); Sacharomyces cerevisiae CBS 8066.
  • a wash is applied to the culture in order to remove the excess culture medium.
  • the culture is centrifuged at 4000 G, at 4 °C for 10 min.
  • the supernatant is removed and the pellet is resuspended in water.
  • a new centrifugation is then carried out and the supernatant removed.
  • the strains are then resuspended in a volume of water, depending on the calculated biomass, in order to be able to inoculate the test medium between 10 6 and 10 9 , preferably between 10 7 and 10 8 , even more preferably at 10 8 CFU/mL (i.e. 10 9 CFU/mL if a suspension is inoculated at 10%, aiming for a final cell density of 10 8 CFU/mL).
  • Step 3 of contacting consists of incubating the seeded suspension from step 2 at 30°C +/- 10°C for a time between 30 and 120 minutes, preferably between 45 and 75 minutes, even more preferably between 50 and 70 minutes.
  • the temperatures may be 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C or 40°C. As well as any range included between two of each of these values.
  • the incubation can be static or agitated, in the latter case the agitation must be sufficient to maintain the suspension homogeneous but not too high because this could degrade the cells.
  • the method according to the invention is characterized in that the pH of the suspension of material rich in vegetable protein from step 1 is rectified so as to be between 5.0 and 7.5, preferably between 6.5 and 7.5; preferably so as to be equal to 7.0, before implementing step 2.
  • the pH may therefore be 5.0; 5.1; 5.2; 5.3; 5.4; 5.5; 5.6; 5.7; 5.8; 5.9; 6.0; 6.1; 6.2; 6.3; 6.4; 6.5; 6.6; 6.7; 6.8; 6.9; 7.0; 7.1; 7.2; 7.3; 7.4 or 7.5.
  • any range included between two of each of these values are provided.
  • the method according to the invention is characterized in that the suspension of material rich in vegetable protein from step 1 contains between 0.1 and 1% of total sugars, preferably between 0.2% and 0.8%, even more preferably between 0.3% and 0.6%.
  • the sugar values totals may be 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% or 1.0%. As well as any range included between two of each of these values.
  • sucrose is meant a set of carbohydrates for example selected from monosaccharides such as glucose, fructose, ribose, galactose, and their mixtures and oligosaccharides such as raffinose, sucrose, melezitose, stachyose and their mixtures.
  • monosaccharides such as glucose, fructose, ribose, galactose, and their mixtures
  • oligosaccharides such as raffinose, sucrose, melezitose, stachyose and their mixtures.
  • the term “monosaccharides” means carbohydrates or carbohydrates composed of a single molecule such as glucose, fructose, mannose, galactose, xylose, arabinose.
  • oligosaccharides means oligomers formed from a number n of oses (monosaccharides) by alpha or beta glycosidic bond.
  • this limit of 10 units is not completely fixed and polysaccharides with a degree of polymerization of 11 to 25 are often assimilated to them.
  • Oligosides comprising 2 oses are disaccharides (sucrose), 3 oses are trisaccharides (raffinose, melezitose) and 4 oses are tetrasaccharides (stachyose). Oligosides can be linear (stachyose), branched or cyclic (cyclodextrin).
  • total sugars is meant by the present invention the composition in monosaccharides obtained after total hydrolysis of the sugars.
  • the oligosaccharides and polysaccharides are completely hydrolyzed chemically (acid or base) and/or enzymatically (amylase), then the hydrolyzed sample is analyzed to determine the composition of the monosaccharides obtained.
  • the total sugars comprise a mixture of glucose, fructose, mannose, galactose, xylose and arabinose.
  • the total sugars comprise between 20% and 30% glucose, between 20% and 30% galactose and between 20% and 30% arabinose.
  • a typical composition of total sugars suitable for the invention is a mixture of 0.15 g/L glucose, 0.058 g/L fructose, 0.03 g/L mannose, 0.12 g/L galactose, 0.03 g/L xylose, 0.19 g/L arabinose and 0.003 g/L raffinose.
  • the total sugars present in the suspension of material rich in vegetable protein of step 1 come partly from a mixture of sucrose, raffinose, melezitose and stachyose.
  • the preferred content of raffinose and stachyose is between 0.02% and 0.05%, preferably between 0.03% and 0.04%.
  • a step 4 comprising sub-steps can then also be carried out. These sub-steps aim to isolate the plant protein, to extract it and to stabilize it for its subsequent use.
  • step 3 of the method according to the invention is followed by a step 4 comprising the following sub-steps:
  • step 4a optionally, the rectification of the pH of the suspension obtained at the end of step 3 to a pH between 5 and 9, preferably between 6 and 9, preferably a pH of 7, preferably by adding soda or lime to said suspension;
  • step 4b heat treatment of the suspension from step 3 or step 4a between 100°C and 160°C for 0.1 to 1 s, and 4c. drying the suspension from step 4b using an atomizer until a vegetable protein isolate is obtained preferably having a dry matter greater than 95% relative to the mass of isolate.
  • Step 4b typically corresponds to a heat treatment of the HTST or UHT type.
  • step 4 can for example include the following sub-steps:
  • step 3 is followed by the following steps: 4a. the optional rectification of the pH of the suspension obtained at the end of step 3 to a pH between 6 and 9, preferably a pH of 7, preferably by adding soda or lime to said suspension;
  • step a optional heat treatment of the suspension of step a between 100°C and 160°C for 0.1 to 1s
  • step 4c drying the vegetable flour suspension from step b until obtaining a vegetable flour isolate with a dry matter greater than 95% using an atomizer.
  • the invention also relates to a plant protein isolate capable of being obtained by the process of the invention.
  • the invention also relates to a plant protein isolate, capable of being obtained by the process of the invention, characterized in that its degree of hydrolysis (or DH) is less than 10%, preferably less than 5.
  • the isolate according to the invention has a degree of hydrolysis (or DH) of less than 10%, preferably less than 5%, including DH of 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% and 1%. As well as any range included between two of each of these values.
  • the degree of hydrolysis can be determined by measuring the free amino nitrogen content by the OPA method described in the article Nielsen et al., 2001 (Nielsen et al., Journal of Food Science, Volume 66, Issue , Pages 642-646, 2001 “Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis”) relative to the total nitrogen measured by the DUMAS method according to ISO 16634-2:2016. [0105] The test for measuring the degree of hydrolysis described below is particularly preferred.
  • amino nitrogen groups of the free amino acids in the sample react with N-acetyl-L-cysteine and Ophthaldialdehyde (OPA) to form isoindole derivatives.
  • Ophthaldialdehyde Ophthaldialdehyde
  • the amount of isoindole derivative formed during this reaction is stoichiometric with the amount of free amino nitrogen. It is the isoindole derivative that is measured by the increase in absorbance at 340 nm.
  • test portion P* In a 100 mL beaker, introduce a test portion P*, exactly weighed, of the sample to be analyzed. This test portion will be 0.5 to 5.0 g depending on the amino nitrogen content of the sample.
  • Prepare solution No. 1 by dissolving a tablet from bottle 1 of the Megazyme kit in 3 mL of distilled water and stir until completely dissolved. One tablet is required per test. Solution No. 1 is prepared extemporaneously.
  • a blank, a standard and a sample are prepared directly in the spectrophotometer cuvettes under the following conditions:
  • sample introduce 3.00 ml of solution no. 1 and 50 pl of the sample preparation.
  • each tank is mixed and the absorbance measurement (A1) of the solutions is read after approximately 2 minutes using a spectrophotometer at 340 nm (spectrophotometer equipped with 1.0 cm optical path cuvettes, capable of measuring at a wavelength of 340 nm, and verified according to the operating procedure described in the manufacturer's technical manual relating thereto).
  • a spectrophotometer at 340 nm spectrophotometer equipped with 1.0 cm optical path cuvettes, capable of measuring at a wavelength of 340 nm, and verified according to the operating procedure described in the manufacturer's technical manual relating thereto).
  • the reactions are then initiated immediately by adding 100 ⁇ l of solution no. 2 which corresponds to the OPA solution from bottle 2 of the Megazyme kit to each spectrophotometer cuvette.
  • the absorbance measurement A2 of the blank, the standard and the sample is then read on the spectrophotometer at 340 nm.
  • AAblc Ablc2 - Ablc1
  • Aech2 absorbance of the sample after addition of solution no. 2
  • the protein nitrogen content is determined according to the DUMAS method according to ISO 16634 - 2016. It is expressed as a percentage by weight relative to the weight of the product.
  • DH degree of hydrolysis
  • the isolate obtainable according to the process of the invention can also be characterized by a reduced content of volatile compounds responsible for undesirable stimuli.
  • the isolate obtainable according to the method of the invention is characterized by a reduced content of volatile compounds responsible for plant flavors, for example herbaceous flavors or pea flavors (“beany” flavors).
  • the organic compounds responsible for plant flavors may in particular be compounds comprising one or more aldehyde groups and/or ketones.
  • aldehyde may be used to designate a compound comprising one or more -CHO groups, preferably 1 or 2 -CHO groups, more preferably only 1 -CHO group.
  • ketone may be used to designate a compound comprising one or more -CO-R groups, preferably one or two -CO-R groups, more preferably only one -CO-R group.
  • Aldehydes responsible for plant flavors are, for example, aldehydes with green notes (“green-note aldehydes”) such as hexanal, nonanal, 2-nonenal, benzaldehyde, 3-methylbutanal.
  • green-note aldehydes such as hexanal, nonanal, 2-nonenal, benzaldehyde, 3-methylbutanal.
  • ketone responsible for plant flavor is 3-octen-2-one.
  • Organic compounds responsible for plant flavors can also be alcohols such as 1-octen-3-ol, or pyrazines such as 2,5-dimethylpyrazine.
  • the isolate obtainable according to the method of the invention has a reduced content of at least 1, 2, 3, or 4 volatile compounds responsible for plant flavors chosen from hexanal, nonanal, 2-nonenal, benzaldehyde, 3-methylbutanal, 3-octen-2-one, 1-octen-3-ol, and 2,5-dimethylpyrazine.
  • the method according to the invention preferably makes it possible to obtain an isolate whose content of at least one volatile compound responsible for plant flavor is reduced by more than 50%, preferably by more than 25%, the reduction values potentially being 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%. 13% 12%, 11% 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4% 3%, 2% or 1%. As well as any range included between two of each of these values.
  • the isolate obtainable by the method of the invention is characterized by a reduced content of compounds comprising one or more thiol groups, in particular a reduced content of methanethiol.
  • the method according to the invention preferably makes it possible to obtain an isolate whose methanethiol content is reduced by more than 30%, 40%, 50%, preferably by more than 50%, the reduction values potentially being 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14% 13% 12%, 11% 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4% 3%, 2% or 1%.
  • the isolate obtainable by the method of the invention is characterized by both a reduced content of volatile compounds responsible for plant flavors and a reduced content of methanethiol.
  • thiol may be used to designate a compound comprising at least one -SH group, preferably comprising 1 or 2 thiol groups, more preferably comprising a single thiol group.
  • the plant protein isolate according to the invention is characterized in that its protein content expressed relative to its total dry matter is between 80% and 95%, preferably between 82% and 92%, preferably between 84% and 90%, preferably between 84% and 88%. It will therefore be considered that a plant protein isolate according to the invention has a protein content expressed relative to its total dry matter of 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% or 95%. As well as any range included between two of each of these values.
  • the invention also relates to the use of the isolate according to the invention or obtained according to the process of the invention for industrial applications including food, nutraceutical and pharmaceutical applications.
  • human and animal food industry is meant industrial confectionery (e.g. chocolate, caramel, jelly sweets), bakery and pastry products (e.g. bread, brioches, muffins), the meat and fish industry (e.g. sausages, minced steaks, fish nuggets, chicken nuggets), sauces (e.g. bolognese, mayonnaise), milk-derived products (e.g. cheese, vegetable milk), beverages (e.g. high-protein drinks, powdered drinks to be reconstituted).
  • industrial confectionery e.g. chocolate, caramel, jelly sweets
  • bakery and pastry products e.g. bread, brioches, muffins
  • meat and fish industry e.g. sausages, minced steaks, fish nuggets, chicken nuggets
  • sauces e.g. bolognese, mayonnaise
  • milk-derived products e.g. cheese, vegetable milk
  • beverages e.g. high-protein drinks, powdered drinks to be reconstituted.
  • the material rich in vegetable proteins whose organoleptic properties have been improved with the process of the invention in other words the composition according to the invention, in particular the isolate according to the invention, can be used in food products at a content of up to 100% by weight relative to the total dry weight of the food, for example, of a quantity from about 1% by weight to about 80% by weight based on the total dry weight of the food or beverage. All amounts in between (i.e., 2%, 3%, 4%...77%, 78%, 79% by weight based on the total weight of the food or beverage) are contemplated, as are all intermediate ranges based on these amounts.
  • Food products that may be contemplated in the context of the present invention include baked goods; baked goods (including, but not limited to, rolls, cakes, pies, pastries, and cookies); pre-made sweet bakery mixes for preparing sweet bakery products; pie fillings and other sweet fillings (including, but not limited to, fruit pie fillings and nut pie fillings such as pecan pie fillings, and fillings for cookies, cakes, pastries, confectionery products and similar products, such as fillings for fat-based creams); desserts, gelatins and puddings; frozen desserts (including, but not limited to, frozen dairy desserts such as ice cream - including regular ice cream, soft serve ice cream and all other types of ice cream - and frozen non-dairy desserts such as non-dairy ice cream, sorbet and similar products); carbonated beverages (including, but not limited to, soft drink carbonated beverages); non-carbonated beverages (including, but not limited to, sweet non-carbonated beverages such as flavored beverages), fruit juices, and sweet
  • animal foods such as pet foods
  • meat products such as emulsified sausages or vegetable burgers.
  • egg replacement formulations can also be used.
  • composition of the invention can be used as a sole source of protein, but can also be used in combination with other plant or animal proteins.
  • plant protein refers to all proteins derived from cereals, oilseed plants, legumes and tuberous plants, as well as all proteins derived from algae and microalgae or fungi, used alone or in a mixture, chosen from the same family or from different families.
  • cereals refers to cultivated plants of the grass family producing edible grains, for example wheat, rye, barley, corn, sorghum or rice. Cereals are often ground in the form of flour, but are also supplied in the form of cereals and sometimes in the form of whole plants (fodder).
  • tubers covers the storage organs, generally underground, which ensure the survival of plants during the winter and often their multiplication by the vegetative process. These organs are bulbous due to the accumulation of storage substances.
  • Organs transformed into tubers can be the root (e.g. carrot, parsnip, cassava, konjac), the rhizome (e.g. potato, Jerusalem artichoke, Japanese artichoke, sweet potato), the base of the stem (more specifically the hypocotyl, e.g. kohlrabi, celeriac), the combination of root and hypocotyl (e.g. beetroot, radish).
  • the term "legumes” means any plant belonging to the family Cesalpiniaceae, the family Mimosaceae or the family Papilionaceae, and in particular: all plants belonging to the family Papilionaceae, for example peas, beans, soybeans, broad beans, green beans, lentils, alfalfa, clover or lupin.
  • This definition includes in particular all plants described in one of the tables of the article by R. Hoover et al., 1991 (Hoover R. (1991) "Composition, structure, functionality and chemical modification of legume starches: a review", Can. J. Physiol. Pharmacol., 69, pp. 79-92).
  • the animal proteins may be, for example, egg or milk proteins, such as whey proteins, casein proteins or caseinate proteins.
  • the pea protein composition may therefore be used in combination with one or more of these proteins or amino acids in order to improve the nutritional properties of the final product, for example to improve the PDCAAS of the protein or to provide other or modify
  • the invention relates in particular to the use of the isolate according to the invention for the manufacture of biscuits, muffins, pancakes, nutritional bars (intended for specialized nutrition/slimming or sports), breads or gluten-free breads enriched with proteins, small cereals obtained by extrusion cooking (“crisps”) high in protein, where high-protein solutions are sought in particular without negative impact on the preparation process or the texture of the preparations or finished products.
  • crisps extrusion cooking
  • the term “powdered nutritional formulations” means powdered formulations comprising at least, preferably only, one legume protein, and in particular pea or field bean protein, according to the invention, which are reconstitutable with an aqueous liquid, and which are suitable for oral administration to a human being.
  • dry blend refers to the mixing of components or ingredients to form a base nutritional powder or, the addition of a dry, powdered or granulated component or powder-based ingredient to form a powdered nutritional formulation. [0130]All percentages, parts and ratios, as described herein, are by weight of the total formulation, unless otherwise indicated.
  • the powdered food formulations and methods of making the same of the present invention may comprise, consist of, or consist essentially of the essential elements of the invention as described herein, as well as any additional or optional elements described herein or otherwise useful in the nutritional formulation applications.
  • the powdered nutritional formulations of the present invention are generally in the form of flowable or substantially fluid particulate compositions, or at least particulate compositions that can be readily molded and measured using a spoon or other similar device, wherein the compositions can be readily reconstituted by the intended user with an aqueous solution, typically water, to form a liquid nutritional formulation for immediate oral or enteral use.
  • aqueous solution typically water
  • use "immediately” generally means within about 48 hours, more typically within about 24 hours, preferably immediately after reconstitution.
  • Powdered food formulations may be formulated with any type and quantity of nutrients sufficient to form a food supplement, or a specialized nutritional formulation intended for use by persons following a particular diet intended for sports and weight loss dietetics.
  • the powdered nutritional formulation may be formulated for use: to repair muscles after intense exercise, for example in athletes,
  • Powdered food formulations may have a caloric density tailored to the nutritional needs of the end user, although in most In this case, reconstituted powders contain about 350 to about 400 kcal/100 ml.
  • Powdered food formulations may have a protein level tailored to the nutritional needs of the end user, although in most cases, reconstituted powders comprise from about 20 to about 91 g protein/100 g, including from about 40 to about 65 g protein/100 g.
  • the formulation may comprise between 20 and 95% of proteins relative to the total weight of the formulation, for example between 20-90%, 30-80%, or 40-60%.
  • the legume protein isolate preferably pea or faba bean, according to the present invention may represent 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% or 90-100% of the total protein of the formulation, or any combination of these percentage ranges. 100% representing the ultimate preferred mode in order to maximize the FGF19 overexpression effect.
  • the powdered food formulations may have a fat content adapted to the nutritional needs of the end user, although in most cases, the reconstituted powders comprise from about 0.5 to about 13 g/100 g, including from about 3 to about 7 g/100 g.
  • the formulation may comprise between 0 and 20% of lipids relative to the total weight of the formulation, for example between 0.5-15%, 1-10%, or 3-7% (in particular % by weight).
  • the powdered nutritional formulations of the present invention may be packaged and sealed in single or multi-use containers and then stored at ambient conditions for up to about 36 months or longer, more typically about 12 to about 24 months.
  • multi-use containers they may be opened and covered for repeated use by the end user, provided that the covered package is then stored at ambient conditions (e.g., avoid extreme temperatures) and the contents used within approximately a month or two.
  • ambient conditions e.g., avoid extreme temperatures
  • the fields of application of the nutritional formulations according to the invention are in particular: - dietary nutrition (sport, slimming),
  • dairy products in the form of yogurts, dairy drinks, dairy creams, frozen desserts or sorbets.
  • Ready-to-drink protein or high-protein drinks then allow the body to benefit from a choice protein intake, with fewer calories.
  • These ready-to-drink beverages can advantageously be prepared with legume protein isolates, preferably from fava beans or peas, in accordance with the invention. They can also be used as the sole source of protein, preferably because they maximize the overexpression effect of FGF19.
  • plant-based drinks as alternatives to cow's milk contain on average 4.5 to 11 g of protein per 100 ml of drink, preferably around 7 g of protein per 100 ml, and are very low in fibre (around 0.5 to 1 g per 100 ml).
  • the beverage may comprise between 1 and 20% of proteins relative to the total weight of the beverage, for example between 3-15%, or 6-8%.
  • the pea protein isolate according to the present invention may represent 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% or 90-100% of the total protein, or any combination of these percentage ranges. Preferably, it represents at least 52%. In particular, the pea protein intake is between 52 and 100% of the total protein intake.
  • the pea protein content may range from 0 to 100%, preferably from 0.01 or 0.1 to 100%.
  • the pea protein isolate of the present invention may represent 0.1-10%, 10-20%, 20-30%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% or 90-100% of the total protein, or any combination of these percentage ranges.
  • enteral nutrition is a therapeutic solution for tube nutrition which is used when the digestive tract is functional and accessible but when the patient cannot eat normally or in cases of severe malnutrition.
  • These nutritional blends are composed of proteins, lipids, carbohydrates, vitamins and minerals with or without fiber.
  • polymeric mixtures standard and semi-elemental mixtures (“predigested"), the latter being indicated in very specific cases (short bowel syndrome, exocrine pancreatic insufficiency, etc.):
  • Semi-elementals are iso or hypercaloric normo or hyperprotein mixtures, based on peptides and medium chain triglycerides.
  • Pea protein isolates as a source of protein, due to their functional properties are particularly well suited for this use.
  • FIG 1 illustrates the impact of strain selection among Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus Reuteri, Limosilactobacillus Rhamnosus and Lacticaseibacillus rhamnosus (Lr) after contact with Nutralys® F85F on their efficiency in modifying volatile compounds.
  • FIG 2 illustrates the impact of the culture time of Limosilactobacillus fermentum (Lf) and Lacticaseibacillus rhamnosus (Lr) strains before contact with Nutralys® F85F on their effectiveness in improving organoleptic qualities.
  • FIG 3 illustrates the impact of sugar composition on the performance of the Limosilactobacillus fermentum strain in modifying the profile of volatile compounds present in a sample.
  • FIG 4 illustrates the proportional distribution of the different volatile compounds grouped by sensory profile in the raw Nutralys® pea isolate and fermented by the different strains in example 1.
  • Example 1 Process according to the invention starting from a pea isolate
  • a 10 mL pre-culture tube of the medium appropriate to the strain is inoculated with a dose.
  • the tube is incubated in a non-agitated incubator, at the optimum temperature for each strain for 15 to 24 hours.
  • the pre-culture tube is then used to inoculate a 1L flask or Erlenmeyer flask with 1% medium.
  • a wash is applied to the different cultures in order to remove the culture medium.
  • test medium Preparation of the matrix (test medium):
  • the test medium or matrix consists of a 10% solution of pea isolate (Nutralys® S85F). 100 g of the pea isolate are introduced into sterile distilled water in a thin stream, with stirring, in order to obtain 900 mL of suspension.
  • test medium After preparation of an inoculum at 10 9 CFU/mL, the test medium is inoculated with 100 mL of inoculum in 900 mL of test matrix.
  • the Pyrex Erlenmeyer flasks with stoppers are placed in a shaking oven at 130 rpm at 30°C for one hour.
  • the sample is spray dried to stop the action of the strains. Spray drying is carried out at 160 °C, with 10% product feed and 100% suction.
  • the sample collected in powder form is stored in a sterile glass vial, until measurement of volatile compounds by SPME-GC-MS.
  • aldehydes and ketones are the main contributors and the products of their bioconversions have less characteristic odors with higher perception thresholds. These undesirable flavors are thus less or even no longer perceived in the product.
  • the reduction in the quantity of aldehydes with green notes (“green-notes aldehydes”) results in an organoleptic improvement of the products, by a reduction in the “vegetable” sensory attributes.
  • Figure 4 shows the proportional distribution of the different volatile compounds within different samples generated using Example 1, grouped by sensory profile.
  • the “Green” group will be composed of Hexanal, Heptanal, 2-Hexenal, 2- Heptenal, (E)-, 2,4-Heptadienal, (E,E)-, 2,6-Nonadienal, (E,Z) -, 1- Heptanol,2-Octen-1-ol, (E)-, 3-Heptanone, Furan, 2-pentyl-, 1-Octanol, 2,4- Octadienal, (E,E)- and 2-Pentenal , (E)-.
  • the “Gras” group will consist of 2-Octenal, (E)-, 2-Nonenal, (E)- and (Z)-,
  • the “Herbal” group will consist of 2-Dodecenal, 1-Hexanol, 3-Octanone and Eucalyptol
  • the “Others” group will be composed of 2,3-Octanedione, Octanoic acid and methyl ester
  • the “Earthy” group will be composed of 1-Octen-3-ol, 2-Octanone, 1-Octen-
  • the “Bitter Almond” group will be composed of Benzaldehyde.
  • the “Roasted Chocolate” group will be composed of Butanal and 3-methyl-Furan, 2-(1-pentenyl)-, (E)- -
  • the “Fermented” group will be composed of Pentanal, 1-Pentanol, Decanoic acid, methyl ester
  • the “Sulfurous” group will be composed of Disulfide and Dimethyl trisulfide
  • the “Fruity/Floral” group will be composed of 2-Pentanone, 1-Nonanol, 1 - Hexanol, 2-ethyl-, 2-Nonanone, 2-Decanone, 5-Hepten-2-one, 6-methyl-, 2 - n-Butyl furan, 2(3H)-Furanone, 5-butyldihydro, 2(3H)-Furanone, 5- hexyldihydro-, Phenylethyl Alcohol, Hexanoic acid, methyl ester, 3-Nonen-2- one, 2-Undecanone
  • the “Solvent / Alcohol” group will consist of 2-Propanone, Acetaldehyde, Ethanol and Furan, 2-ethyl-
  • Limosilactobacillus fermentum Limosilactobacillus reuteri, and Lacticaseibacillus rhamnosus. Aerobic for 16 hours 150 rpm 30°C for Gluconobacter suboxydans and 37°C for Saccharomyces cerevisiae o Preparation of the biomass: Centrifuge the biomass from the Erlenmeyer flasks at 3000g for 10 minutes for all strains except Gluconobacter suboxydans, which will require centrifugation at an acceleration of 10000g. Remove the supernatant and recover the biomasses with 10mL of sterile physiological water at 4°C. (Washing the biomass is not necessary given the inoculum required). Measure the O.D. at 600nm and count the cell suspensions
  • Example 3 Demonstration of the importance of pre-WCB culture time: [0196] The same protocol as for example 1 is applied. However, the tests are carried out on a volume of 250 mL, with 25 g of Nutralys®.
  • Figure 2 illustrates the impact of the culture time of strains of Limosilactobacillus fermentum (Lf) and Lacticaseibacillus rhamnosus (Lr) before contact with Nutralys® F85F on their effectiveness in improving organoleptic qualities.
  • the minimum propagation time to obtain the best biocatalysis activity is 10 hours.
  • the minimum propagation time is 15 hours.
  • Example 4 Demonstration of the importance of sugar concentration during the WCB step:
  • Example 5 Demonstration of the importance of cell concentration before treatment and the possibility of using a freeze-dried inoculum:
  • a lyophilized strain is introduced. Before its implementation, it is dispersed for 30 min at 30°C in a solution demineralized water with glucose at 1 g/L and a pea isolate (such as Nutralys® S85F) at 10 g/L. The inoculum is then used as in example 1, except for their concentrations (see below).

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé pour améliorer les propriétés organoleptiques d'une matière riche en protéines végétales comprenant les étapes suivantes : 1. la mise en suspension d'une matière riche en protéines végétales dans un solvant préférentiellement aqueux de sorte à obtenir une suspension ayant une teneur en matière sèche comprise entre 5% et 20%; 2. l'ajout d'une ou de plusieurs souches microbiennes dans la suspension de l'étape 1, la ou les souches microbiennes étant choisies parmi des souches de bactéries lactiques, des souches de levures, ou un mélange de celles-ci, de sorte à obtenir une suspension ensemencée présentant une densité cellulaire comprise entre 1.105 et 1.1010 cfu/mL; 3. l'incubation de la suspension de l'étape 2 à une température comprise entre 20°C et 40°C pendant un temps compris entre 30 et 120 minutes. L'invention porte également sur un isolat de protéines végétales susceptible d'être obtenu par le procédé de l'invention et son utilisation.

Description

Description
ISOLAT DE PROTEINE VEGETALE AMELIORE VIA TRAITEMENT PAR BIOMASSE DE CELLULE ENTIERE
Domaine technique
[0001]L’ invention relève du domaine des protéines végétales, en particulier des isolats protéiques de légumineuses, encore plus particulièrement des isolats protéiques de pois.
Art antérieur
[0002] Les besoins quotidiens humains en protéines sont compris entre 12 et 20% de la ration alimentaire. Ces protéines sont fournies aussi bien par des produits d'origine animale (viandes, poissons, œufs, produits laitiers) que par des produits d’origine végétale (céréales, légumineuses, algues).
[0003]Cependant, dans les pays industrialisés, les apports en protéines sont majoritairement sous la forme de protéines d'origine animale. Or, de nombreuses études démontrent qu'une consommation excessive de protéines d'origine animale au détriment des protéines végétales est une des causes d'augmentation de cancers et maladies cardio-vasculaires.
[0004] Par ailleurs, les protéines animales présentent beaucoup de désavantages, tant sur le plan de leur potentiel allergène, concernant notamment les protéines issues du lait ou des œufs, que sur le plan environnemental en relation avec les méfaits de l'élevage intensif.
[0005]Ainsi, il existe une demande croissante des industriels pour des composés d'origine végétale possédant des propriétés nutritionnelles et fonctionnelles intéressantes sans pour autant présenter les inconvénients de composés d'origine animale.
[0006] Le soja a été, et reste, la première alternative végétale aux protéines animales. L’utilisation du soja possède néanmoins des désavantages certains. La graine de soja est plus que fréquemment d’origine OGM et l’obtention de sa protéine passe par une étape de déshuilage utilisant du solvant. [0007] Depuis les années 70, les légumineuses à graines, dont en particulier le pois, se sont fortement développé en Europe, majoritairement en France, comme ressource protéique alternative aux protéines animales à destination de l’alimentation animale et humaine. Le pois contient environ 27 % en poids de matières protéiques. Le terme « pois » est ici considéré dans son acception la plus large et inclut en particulier toutes les variétés sauvages de « pois lisse » (« smooth pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » (« wrinkled pea »), et ce quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations). Ces graines sont non-OGM et ne nécessitent pas de déhuilage solvanté.
[0008] La protéine de pois, majoritairement de la globuline de pois, est extraite et valorisée industriellement depuis bon nombre d’années. Plusieurs procédés existent que l’on peut catégoriser en deux grandes familles : les procédés dits « par voie sèche » et les procédés dits « par voie humide ». Les premiers consistent en la réduction granulométrique des graines de légumineuses en farine suivi par une séparation granulométrique à l’aide d’un courant d’air ascendant, procédé communément appelé turbo-séparation. Ces procédés conduisent à l’obtention de concentrats protéiques dont la richesse en protéines ne dépasse pas 60%-70%. Ces procédés ne sont pas à considérer dans le cadre de la présente invention qui s’inscrit dans le domaine des isolats dont la concentration protéique est supérieure à ces teneurs.
[0009]Concernant la seconde famille de procédés dits « par voie humide », on peut citer, comme exemple de procédé d’extraction de la protéine de pois, le brevet EP 1 400 537. Dans ce procédé, la graine est broyée en absence d’eau (procédé dit de « broyage à sec ») afin d’obtenir une farine. Cette farine sera ensuite mise en suspension dans de l’eau afin d’en extraire la protéine par précipitation. La précipitation est réalisée en ajustant le pH isoélectrique et/ou en chauffant le milieu.
[0010] De tels procédés ont plusieurs désavantages dont en particulier l’obtention de flaveurs végétales non désirées.
[0011]Les experts du domaine ont développé depuis longtemps plusieurs méthodes afin d’améliorer cette flaveur. [0012]0n peut tout d’abord citer l’utilisation de procédé thermique en cours du procédé d’extraction et/ou sur le produit final. Un tel traitement thermique va permettre d’éliminer les enzymes endogènes responsables de l’apparition de ces flaveurs non désirées (telle que la lipoxygénase) et/ou les composés organovolatils porteurs de ces flaveurs (p.e. l’hexanal). Ces traitements thermiques tels que bien connus par exemple dans les demandes de brevet WO 2020/260841 ou WO 2020/064822 possède néanmoins plusieurs désavantages comme par exemple un surcout du procédé (du fait de l’acquisition et de l’entretien du matériel adéquat mais également à son utilisation) ou bien encore la dénaturation des protéines potentiellement sensibles au traitement thermique.
[0013] Une seconde voie consiste en l’adjonction de composés masquant ou aromatisant à la protéine dès obtention de la protéine lors de son procédé de fabrication ou lors de sa formulation principalement dans un aliment. Ici encore de nombreux problèmes persistent dont en particulier le surcoût dû à l’utilisation de tels composés ou bien les questions réglementaires d’utilisation d’un composé chimique à ces fins.
[0014] Une voie alternative consiste en l’utilisation de souches bactériennes afin de moduler le profil organoleptique. La ou les souches vont être ajoutées lors du procédé d’extraction (préférentiellement en fin de procédé c’est-à-dire avec le produit final) et soumisses à des conditions physico-chimiques permettant leur croissance. Lors de cette croissance, les souches de par l’activation de leurs métabolismes vont consommer plusieurs composés dont ceux responsables de la flaveur, du profil organoleptique (p.e. l’hexanal). Ici aussi des problèmes persistent tels que l’hydrolyse de protéines par les protéases constitutives ou produites par les souches ou bien encore la production de flaveurs non désirées du par exemple à la production d’acides organiques tels que l’acide lactique.
[0015]On peut enfin citer la demande de brevet EP 0 255 588 qui présente une utilisation de bactéries acétiques afin de réduire la teneur en hexanal et donc la flaveur végétale associée de produits alimentaires dont particulièrement dans les boissons alcooliques. L’exemple 1 présente une utilisation sur un lait de soja de la bactérie acétique Gluconobacter suboxydans. On constate la réduction d’hexanal et le panel sensoriel confirme la diminution de la flaveur « herbe ». Il est à noter que les autres flaveurs sont inchangées et donc d’autres flaveurs comme l’amertume ou le goût acide assez souvent relevés dans les protéines végétales restent inchangées et peut être même renforcées du fait de la disparation de l’hexanal.
[0016] Il est du mérite de la demanderesse d’avoir travaillé dans ce domaine et d’avoir découvert un ensemble de souches permettant d’améliorer le profil organoleptique d’une protéine végétale, ainsi que d’avoir développé le procédé l’utilisant dans le but d’obtenir un isolat protéique dont les caractéristiques fonctionnelles et organoleptiques sont optimisées à un niveau jamais encore atteint. De surcroit, les souches et le procédé selon l’invention les utilisant permettent d’obtenir un isolat de protéines végétales dont les performances organoleptiques sont d’un intérêt certain pour l’industrie agroalimentaire.
[0017] L’ invention sera mieux comprise dans la partie descriptive de la présente demande qui va suivre.
Description générale
[0018] La présente invention concerne un procédé pour améliorer les propriétés organoleptiques d’une matière riche en protéines végétales comprenant les étapes suivantes
1 . la mise en suspension d’une matière riche en protéines végétales dans un solvant préférentiellement aqueux de sorte à obtenir une suspension ayant une teneur en matière sèche comprise entre 5% et 20%, préférentiellement entre 7,5% et 15%, encore plus préférentiellement entre 8% et 12% ;
2. l’ajout d’une ou de plusieurs souches microbiennes dans la suspension de l’étape 1 , la ou les souches microbiennes étant choisies parmi des souches de bactéries lactiques, des souches de levures, ou un mélange de celles-ci, la ou les souches étant préférentiellement une ou plusieurs souches de bactéries lactiques, de sorte à obtenir une suspension ensemencée présentant une densité cellulaire comprise entre 1.105 et 1 ,1010 cfu/mL, préférentiellement entre 1.107 et 1.109 cfu/mL, préférentiellement entre 5.107 et 5.108 cfu/mL ;
3. l’incubation de la suspension de l’étape 2 à une température comprise entre 20°C et 40°C pendant un temps compris entre 30 et 120 minutes, préférentiellement entre 45 et 75 minutes, encore plus préférentiellement entre 50 et 70 minutes. [0019] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la matière riche en protéines végétales de l’étape 1 est sous la forme d’une poudre contenant une quantité de protéine végétales supérieure à 1 % en poids, préférentiellement comprise entre 70% et 90% en poids, par rapport au poids de poudre. Dans ce mode de réalisation, la poudre est de préférence essentiellement issue de graines, typiquement des graines de légumineuses telles que des graines de pois ou de féverolles, ayant été broyées et réduites à l’état de poudre. Autrement dit, la poudre est de préférence une farine. Les graines ont bien évidemment pu subir des étapes de préparations incluant de manière non exhaustive le nettoyage, le triage, l’enlèvement de la coque externe (aussi appelé « dehulling »), un traitement thermique.
[0020] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la matière riche en protéine végétale de l’étape 1 est un isolat ou un concentrât, préférentiellement un isolat dont la teneur en protéines est supérieure à 70% en poids sec sur matière sèche d’isolat, préférentiellement comprise entre 75% et 95% en poids sec sur matière sèche d’isolat. Les valeurs de teneurs en protéines étant potentiellement 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94 ou 95%. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs. Avantageusement, la matière riche en protéines végétales de l’étape 1 est un isolat ou un concentrât de protéines végétales, préférentiellement est un isolat de protéines végétales dont la teneur en protéines est supérieure à 80% en poids sec, préférentiellement comprise entre 80% et 90% en poids sec, par rapport au poids sec d’isolat.
[0021]Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la matière riche en protéine végétale de l’étape 1 est issue d’une légumineuse, préférentiellement d’une légumineuse sélectionnée dans le groupe constitué par le pois et la féverole, plus préférentiellement est issue de pois.
[0022] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que le pH de la suspension de matière riche en protéine végétale de l’étape 1 est rectifié de sorte à être compris entre 5,0 et 7,5, préférentiellement entre 6,5 et 7,5 ; préférentiellement de sorte à être égal à 7,0, avant la mise en œuvre de l’étape 2. [0023] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la teneur en sucre de la suspension de matière riche en protéines végétales de l’étape 1 est rectifiée de sorte à contenir entre 1 % et 10% de sucres, préférentiellement entre 2% et 8%, encore plus préférentiellement entre 3% et 6%.
[0024] Dans un mode de réalisation préféré; le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la ou les souches de l’étape 2 sont sélectionnées parmi une souche de Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus ou Saccharomyces cerevisiae, préférentiellement Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, ou Lactobacillus rhamnosus. Comme expliqué ci-après, les termes Limosilactobacillus et lacticaseibacillus peuvent être interchangés par le terme Lactobacillus du fait d’un changement de taxonomie (cf. l’article Zheng et al., «A taxonomie note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901 , and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae » (, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020; 70:2782-2858 DOI 10.1099/ijsem.0.004107). La ou les souches de l’étape 2 pourront donc être sélectionnées préférentiellement parmi Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, ou Lacticaseibacillus rhamnosus.
[0025] Dans un mode de réalisation préféré, la ou les souches utilisées au cours de l’étape 2 du procédé de l’invention ont été cultivées selon un procédé comprenant : i. l’inoculation d’un milieu de culture solide, par exemple de gélose, avec un échantillon de la ou des souches ; il. la pré-culture de la ou des souches, par incubation du milieu de culture solide inoculé de l’étape 1 en étuve non agitée, de préférence pendant entre 10h et 24h; ill. la propagation de la souche, par inoculation d’un milieu de culture liquide avec un échantillon de souche pré-cultivée de l’étape il, et culture de la souche en milieu liquide.
[0026] Dans un mode de réalisation, le temps d’incubation de l’étape ill est compris entre 10h et 20h. [0027] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que caractérisé en ce que l’étape 3 est suivie d’une étape 4 comprenant les sous-étapes suivantes
4a. optionnellement, la rectification du pH de la suspension obtenue à l’issue de l’étape 3 à un pH compris entre 5 et 9, préférentiellement entre 6 et 9, préférentiellement un pH de 7, préférentiellement par ajout de soude ou de chaux dans ladite suspension ;
4b. le traitement thermique de la suspension de l’étape 3 ou de l’étape 4a entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1 s, et 4c. le séchage de la suspension de l’étape 4b à l’aide d’un atomiseur jusqu’à obtenir un isolat de protéines végétales présentant de préférence une matière sèche supérieure à 95% par rapport à la masse d’isolat.
[0028] L’ invention concerne également un isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention.
[0029] Dans un mode de réalisation, l’isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention est caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse (ou DH) est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5%.
[0030] Dans un mode de réalisation, l’isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention est caractérisé en ce que sa teneur en protéines comprise entre 70% et 95% en poids, préférentiellement entre 82% et 92% en poids, préférentiellement entre 84% et 90% en poids, préférentiellement entre 84% et 88% en poids, par rapport au poids de matière sèche totale de l’isolat. Les valeurs de teneurs en protéines étant potentiellement 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94 ou 95%. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs. De préférence, l’isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention est caractérisé en ce que sa teneur en protéines est comprise entre 80% et 95% en poids, préférentiellement entre 82% et 92% en poids, préférentiellement entre 84% et 90% en poids, préférentiellement entre 84% et 88% en poids, par rapport au poids de matière sèche totale de l’isolat.
[0031]L’ invention concerne également l’utilisation d’un isolat susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention ou obtenu selon le procédé de l’invention pour des applications industrielles comprenant les applications alimentaires, nutraceutiques, pharmaceutiques.
[0032] L’ invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée ci- dessous
Description détaillée
[0033] La présente invention concerne un procédé pour améliorer les propriétés organoleptiques d’une matière riche en protéines végétales comprenant les étapes suivantes
1 . la mise en suspension d’une matière riche en protéines végétales dans un solvant préférentiellement aqueux de sorte à obtenir une suspension ayant une teneur en matière sèche comprise entre 5% et 20%, préférentiellement entre 7,5% et 15%, encore plus préférentiellement entre 8% et 12% ;
2. l’ajout d’une ou de plusieurs souches microbiennes dans la suspension de l’étape 1 , la ou les souches microbiennes étant choisies parmi des souches de bactéries lactiques, des souches de levures, ou un mélange de celles-ci, la ou les souches étant préférentiellement une ou plusieurs souches de bactéries lactiques, de sorte à obtenir une suspension ensemencée présentant une densité cellulaire comprise entre 1 .105 et 1 .1010 cfu/mL, préférentiellement entre 1.107 et 1.109 cfu/mL, préférentiellement entre 5.107 et 5.108 cfu/mL;
3. l’incubation de la suspension de l’étape 2 à une température comprise entre 20°C et 40°C pendant un temps compris entre 30 et 120 minutes, préférentiellement entre 45 et 75 minutes, encore plus préférentiellement entre 50 et 70 minutes.
[0034] Par « organoleptique », on entend l’ensemble des stimuli qui se rapportent à la sphère sensorielle incluant le goût, la flaveur, l’odeur. Le profil organoleptique d’un composé et/ou d’un aliment peut être évalué à l’aide d’un panel sensoriel. Un panel sensoriel est constitué d’un ensemble de personnes qui vont déguster le composé et/ou l’aliment selon un protocole bien défini, puis chaque membre du panel va donner son évaluation sensorielle, classiquement composée d’un descripteur (p.e. amer, sucré, gout pois, flaveur végétales, carton) et d’un score permettant d’indiquer l’intensité de perception de ce descripteur.
[0035] Par « améliorer les propriétés organoleptiques » ou « amélioration des qualités organoleptiques », on entend dans la présente invention une diminution des stimuli indésirables associés aux matières riches en protéines végétales (par exemple, associées aux isolats de protéines végétales), telles que les flaveurs végétales typiquement les flaveurs herbacées ou les flaveurs de pois (flaveurs « beany »). Dans le cadre de la présente invention, cette diminution des stimuli indésirables est permise par la conversion de composés tels que les aldéhydes les cétones et les thiols présents dans la matière riche en protéines végétales en d’autres composés (alcools et/ou acides carboxyliques) sous l’action d’une ou plusieurs souches microbiennes telle que décrites dans la présente demande. En effet, ces aldéhydes cétones et thiols et sont les principaux contributeurs de ces stimuli indésirables, et les produits de leurs bioconversions possèdent notamment des saveurs ou des odeurs moins caractéristiques des matières riches en protéines végétales, et/ou des seuils de perception par le consommateur plus élevés. Par exemple, la diminution de la quantité d’aldéhydes présentant des notes vertes (« green-notes aldehydes ») entraine une amélioration organoleptique des produits, par une diminution des attributs sensoriels « végétaux ».
[0036] Dans un mode de réalisation, le procédé pour améliorer les propriétés organoleptiques de protéines végétales de l’invention est un procédé permettant de convertir les aldéhydes cétones et/ou thiols présents dans les matières riches en protéines végétales en d’autres composés possédant des saveurs ou des odeurs moins caractéristiques de protéines végétales et/ou des seuils de perception plus élevés.
[0037] Dans un mode de réalisation, le procédé pour améliorer les propriétés organoleptiques de protéines végétales de l’invention est un procédé permettant de convertir tout ou partie des aldéhydes ayant des notes vertes présent dans les protéines végétales en d’autres composés.
[0038]Par « protéines végétales » on entend toute composition extraite d’un matériau brut naturel tel que des graines et ayant de préférence été modifié afin de le rendre plus disponible et efficace à sa formulation dans le but ultime de sa consommation. Les modifications peuvent être très limitées (par ex. un simple broyage de la graine) ou bien encore très complexe (par ex. procédé de fabrication d’un isolat par voie humide). [0039] Par « matière riche en protéines végétales » on entend toute poudre, solution, floc contenant au moins 1 %, préférentiellement 25%, en poids de protéines, par rapport au poids total de matière riche en protéines végétales. On peut citer de manière non limitative les farines, les concentrats, les isolats, les graines.
[0040] Par « bactéries lactiques » on entend l’ensemble des bactéries à Gram positif, anaérobies partiellement tolérantes à l'oxygène, ne produisant pas en général de spores, se présentant sous forme de coques ou de bâtonnets et capables de fermenter les sucres en acide lactique. Suivant la classification taxonomique courante, elles appartiennent au phylum Firmicutes, la classe Bacilli et à l'ordre Lactobacillales, comportant les familles suivantes Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae et Streptococcaceae. Les Bifidobacteriaceae de l'ordre des Bifidobacteriales sont aussi classées parmi les bactéries lactiques. Dans la famille Lactobacillacea, le genre Lactobacillus est particulièrement important. Les termes Limosilactobacillus et lacticaseibacillus peuvent être interchangé par le terme Lactobacillus du fait d’un changement de taxonomie (cf l’article Zheng et al., «A taxonomie note on the genus Lactobacillus'. Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901 , and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae », Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020;70:2782-2858 DOI 10.1099/ijsem.0.004107). Ainsi Lactobacillus fermentum équivaut désormais à Limosilactobacillus fermentum; Lactobacillus rhamnosus équivaut désormais à Lacticaseibacillus rhamnosus; Lactobacillus reuteri équivaut désormais à Limosilactobacillus reuteri).
[0041] Par « levures » on entend l’ensemble des champignons unicellulaires de forme variable selon l’espèce (sphérique, ovoïde ou elliptique, en bouteille, triangulaire ou apiculée (renflée à chaque bout comme un citron) mais généralement ovales, d'environ 6 à 10 microns et jusqu’à 50 microns, se multipliant par bourgeonnement ou par scission (scissiparité). La plupart s’apparentent aux Ascomycètes (type truffe, pézize), quelques-unes à l’autre grand groupe de champignons supérieurs, les Basidiomycètes (type amanites, bolets) et d’autres enfin sont des formes imparfaites non rattachables clairement à un groupe défini. Ils sont souvent capables d'accomplir une sporulation soit dans un but de dormance en milieu défavorable, soit dans un but de dispersion. Le terme courant de levure désigne généralement le genre Saccharomyces (levure de bière ou levure de boulanger). Il existe beaucoup d'autres genres de levures ; parmi les plus connues, le genre Candida et Pichia.
[0042] Par « cfu », on entend « colonie formant unité» qui est utilisée pour estimer le nombre de bactéries ou de cellules fongiques viables dans un échantillon. La viabilité est définie comme la capacité de se multiplier par division cellulaire dans des conditions contrôlées.
[0043] Par « densité cellulaire » on entend la quantité de bactéries ou de cellules fongiques présente dans un échantillon. Elle peut s’exprimer en cfu/mL
[0044]L’étape 1 de mise en suspension consiste en un mélange d’une matière riche en protéine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de protéine végétale atteignant entre 5% et 20% de matière sèche, préférentiellement entre 7,5% et 15%, encore plus préférentiellement entre 8% et 12%. Les valeurs seront donc potentiellement 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1 1 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21 %, 22%, 23%, 24% ou 25%. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs.
[0045] Dans la présente invention, l’expression « teneur en protéines » ou « richesse en protéines », notamment relative à une matière riche en protéines ou une composition selon l’invention, désigne la quantité d’azote, typiquement mesurée par la méthode de Kjeldhal, multipliée par 6,25 et exprimée en % en poids total de matière riche en protéines ou de composition selon l’invention.
[0046] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la matière riche en protéine végétale de l’étape 1 est sous la forme d’une poudre végétale communément appelée farine contenant une teneur en protéine supérieure à 1 % en poids, préférentiellement comprise entre 10% et 40% en poids, par rapport au poids de poudre, préférentiellement entre 20% et 30%.
[0047] Dans ce mode la poudre est de préférence essentiellement constituée de graines ayant été broyées et réduite à l’état de poudre. Les graines ont bien évidemment pu subir des étapes de préparations incluant de manière non exhaustive le nettoyage, le triage, l’enlèvement de la coque externe (aussi appelé « dehulling »), un traitement thermique. [0048] Par « isolat » on entend une matière riche en protéines dont la teneur en protéines est supérieure à 70% en poids sec, préférentiellement supérieure à 80% en poids sec, encore plus préférentiellement comprise entre 80% et 90% en poids sec, par rapport à la matière sèche totale de l’isolat.
[0049] Par « concentrât » on entend une matière riche en protéines dont la teneur en protéines est comprise entre 25% et 70% en poids sec, préférentiellement comprise entre 35% et 60% en poids sec, encore plus préférentiellement comprise entre 40% et 50 % en poids sec, par rapport à la matière sèche totale du concentrât.
[0050] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la matière riche en protéine végétale de l’étape 1 est un isolat ou un concentrât, préférentiellement un isolat dont la teneur en protéines est supérieure à 70% en poids sec sur matière sèche d’isolat, préférentiellement comprise entre 75% et 95% en poids sec sur matière sèche d’isolat. Les valeurs de teneurs en protéines étant potentiellement 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94 ou 95%. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs.
[0051] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la matière riche en protéine végétale de l’étape 1 est issue d’une légumineuse, préférentiellement est issue d’une légumineuse sélectionnée dans le groupe constitué par le pois et la féverole, plus préférentiellement est issue de pois.
[0052] Par « légumineuses » on entend la famille de plantes dicotylédones de l'ordre des Fabales. C'est l'une des plus importantes familles de plantes à fleurs, la troisième après les Orchidaceae et les Asteraceae par le nombre d'espèces. Elle compte environ 765 genres regroupant plus de 19 500 espèces. Plusieurs légumineuses sont d'importantes plantes cultivées parmi lesquelles le soja, les haricots, les pois, la féverole, le pois chiche, l'arachide, la lentille cultivée, la luzerne cultivée, différents trèfles, les fèves, le caroubier, la réglisse.
[0053] Par « pois », on entend sa définition la plus large et incluant en particulier toutes les variétés de « pois lisse » (« smooth pea ») et « de pois ridés » (« wrinkled pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » et ce, quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations).
[0054] Le terme « pois » dans la présente demande inclut les variétés de pois appartenant au genre Pisum et plus particulièrement aux espèces sativum et aestivum. Lesdites variétés mutantes sont notamment celles dénommées « mutants r », « mutants rb », « mutants rug 3 », « mutants rug 4 », « mutants rug 5 » et « mutants lam » tels que décrits dans l’article de C-L HEYDLEY et al. intitulé « Developing novel pea starches » Proceedings of the Symposium of the Industrial Biochemistry and Biotechnology Group of the Biochemical Society, 1996, pp. 77-87.
[0055] Par « féverole », on entend le groupe des plantes annuelles de l'espèce Vicia faba, appartenant au groupe des légumineuses de la famille des Fabaceae, sous- famille des Faboideae, tribu des Fabeae. On distingue les variétés Minor et Major. Dans la présente invention, les variétés sauvages et celles obtenues par génie génétique ou sélection variétales sont toutes d’excellentes sources.
[0056] Par « solvant préférentiellement aqueux », on entend tout solvant dont la composition est majoritairement de l’eau. Par majoritairement on entend que plus de 50% en poids, préférentiellement plus de 90% en poids, encore plus préférentiellement plus de 95%, du solvant aqueux est de l’eau, en poids de solvant, voire le solvant aqueux est de l’eau « pure », c’est-à-dire un solvant composé à 100% en poids d’eau.
[0057] Par « eau » on entend toute eau dite potable qui convient pour ce faire. Par « eau potable » on entend une eau que l’on peut boire ou utiliser à des fins domestiques et industrielles sans risque pour la santé. De manière préférentielle, sa conductivité est choisie entre 400 et 1100, préférentiellement entre 400 et 600 pS/cm. De manière plus préférentielle dans la présente invention, on entendra que cette eau potable possède une teneur en sulfate inférieure à 250 mg/l, une teneur en chlorures inférieure à 200 mg/l, une teneur en potassium inférieure à 12 mg/l, un pH compris entre 6,5 et 9 et un TH (Titre Hydrométrique, soit la dureté de l’eau, qui correspond à la mesure de la teneur d’une eau en ions calcium et magnésium) supérieur à 15 degrés français. Autrement dit, une eau potable ne doit pas posséder moins de 60 mg/l de calcium ou 36 mg/l de magnésium. Cette définition inclus l’eau du réseau potable, l’eau décarbonatée, l’eau déminéralisée. [0058] La suspension est donc obtenue en mélangeant intimement la matière riche en protéines végétales et le solvant aqueux. Il existe plusieurs manières de procéder incluant l’introduction d’une poudre de matière riche en protéines végétales dans le solvant aqueux (broyage sec suivi de la mise en suspension) ou l’introduction de la matière riche en protéines végétales dans le solvant aqueux suivi d’une étape de broyage (mis en suspension suivie de broyage humide).
[0059]Ce mélange est réalisé de sorte à obtenir une suspension de protéine végétale ayant une teneur en matière sèche (valeur MS) comprise entre 5% et 20%, préférentiellement entre 7,5% et 15%, encore plus préférentiellement entre 8% et 12%. La teneur en matière sèche est mesurée par toute méthode bien connue de l’homme de l’art. Elle décrit le pourcentage de solide dans un mélange de substances. Plus la teneur en matière sèche est élevée, plus le mélange est sec.
[0060] De manière préférentielle, la méthode dite « par dessication » est utilisée. Elle consiste à déterminer la quantité d’eau évaporée par chauffage d’une quantité connue d’un échantillon de masse connue. Un échantillon préalablement pesé (appelé masse fraîche) est chauffé. Le chauffage est continu jusqu’à stabilisation de la masse, indiquant que l’évaporation de l’eau est complète. De manière préférée, la température utilisée est de 105°C pour permettre à l’eau résiduelle de s’évaporer. Le résidu sec est pesé et exprimé en rapport. On obtient la teneur en matière sèche de l’échantillon analysé.
[0061]L’étape 2 consiste en l’ajout d’une ou de plusieurs souches microbiennes dans la suspension de matière première riche en protéine végétale de l’étape 1 , la ou les souches étant sélectionnée dans le groupe constitué des bactéries lactiques ou des levures, préférentiellement des bactéries lactiques, et la densité cellulaire de la suspension après introduction de la ou des souches étant comprise entre 1.105 et 1.1010 cfu/mL, préférentiellement entre 1.107 et 1.109 cfu/mL, préférentiellement entre 5.107 et 5.108 cfu/mL; La densité cellulaire pourra donc être 1.105 cfu/mL,
2.105 cfu/mL, 3.105 cfu/mL, 4.105 cfu/mL, 5.105 cfu/mL, 6.105 cfu/mL, 7.105 cfu/mL,
8.105 cfu/mL, 9.105 cfu/mL, 1.106 cfu/mL, 2.106 cfu/mL, 3.106 cfu/mL, 4.106 cfu/mL,
5.106 cfu/mL, 6.106 cfu/mL, 7.106 cfu/mL, 8.106 cfu/mL, 9.106 cfu/mL, 1.107 cfu/mL,
2.107 cfu/mL, 3.107 cfu/mL, 4.107 cfu/mL, 5.107 cfu/mL, 6.107 cfu/mL, 7.107 cfu/mL,
8.107 cfu/mL, 9.107 cfu/mL, 1.108 cfu/mL, 2.108 cfu/mL, 3.108 cfu/mL, 4.108 cfu/mL, 5.108 cfu/mL, 6.108 cfu/mL, 7.108 cfu/mL, 8.108 cfu/mL, 9.108 cfu/mL, 1.109 cfu/mL,
2.109 cfu/mL, 3.109 cfu/mL, 4.109 cfu/mL, 5.109 cfu/mL, 6.109 cfu/mL, 7.109 cfu/mL,
8.109 cfu/mL, 9.109 cfu/mL, 1.1010 cfu/mL, 2.1010 cfu/mL, 3.1010 cfu/mL, 4.1010 cfu/mL, 5.1010 cfu/mL, 6.1010 cfu/mL, 7.1010 cfu/mL, 8.1010 cfu/mL, 9.1010 cfu/mL. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs.
[0062] Dans un premier mode, une seule souche microbienne est introduite dans la suspension de matière première riche en protéine végétale de l’étape 1.
[0063] Dans un second mode, deux voire plusieurs souches microbiennes sont introduites en même temps dans la suspension de matière première riche en protéine végétale de l’étape 1 .
[0064] Dans un troisième mode, deux voire plusieurs souches microbiennes sont introduites de manière consécutive dans la suspension de matière première riche en protéine végétale de l’étape 1.
[0065] Pour ce faire les bactéries lactiques ou levures sont cultivées dans une première sous-étape dite de culture afin d’atteindre une densité cellulaire plus importante que celle décrite dans la présente demande. La personne experte dans l’art saura adapter les conditions de culture à la souche sélectionnée afin d’atteindre cette densité. L’étape de culture est elle-même subdivisée en deux étapes : une première étape de pré-culture visant à revivifier la souche stockée (p.e. congelée ou lyophilisée) et une seconde étape de propagation visant à multiplier la souche pour atteindre la densité cellulaire désirée.
[0066]Selon un mode de réalisation, la ou les souches utilisées au cours de l’étape 2 ont été cultivées selon un procédé comprenant : i. inoculation d’un milieu de culture solide, par exemple de gélose, avec un échantillon de souche, de préférence de souche congelée ou lyophilisée ; il. pré-culture de la souche, par incubation du milieu de culture solide inoculé de l’étape 1 en étuve non agitée, de préférence pendant 15 à 24 h ; ill. propagation de la souche, par inoculation d’un milieu de culture liquide avec un échantillon de souche pré-cultivée de l’étape il, et culture de la souche en milieu liquide. [0067] La pré-culture et la propagation sont de préférence menées à une température appropriée à la souche : typiquement à une température d’environ 35°C-38°C, de préférence 38°C pour les bactéries lactique et typiquement d’environ 28-32°C pour les levures. Avantageusement, le temps de culture de l’étape ill de propagation est relativement long, typiquement compris entre 12 et 20h, préférentiellement est d’environ 15h ; et le temps de propagation est compris entre 8h et 15h, et est de préférence d’au moins environ 10h. En effet, comme cela est montré dans la partie expérimentale, un temps minimum de 10h de propagation est préférable pour l’obtention de l’effet technique maximal de l’invention.
[0068] Un protocole de culture préféré est le suivant : i. Etape d’ensemencement : un échantillon de souche congelée est prélevé dans un cryotube et inoculé dans un milieu de culture approprié, typiquement de la gélose , le milieu de culture étant contenu du un tube, par exemple dans un tube de 10 mL ; il. Etape de pré-culture : Le tube est incubé en étuve non agitée pendant 15 à 24 h. ill. Etape de propagation : Le tube de pré-culture est ensuite utilisé pour inoculer à 1 % volume/volume un récipient (flacon ou erlenmeyer), contenant par ex. 1 L de milieu pour l’exemple ci-dessus d’un tube de 10 mL. La culture a lieu à la température optimale de chaque souche pendant le temps optimal de chacune, telles que celles détaillés pour des exemples bactéries lactique et de levure dans le Tableau 1.
[0069] La seconde sous-étape consiste ensuite à introduire une quantité déterminée de la culture dans une autre quantité de la suspension riche en protéines végétales préparée dans l’étape 1 afin d’obtenir au final une densité cellulaire de la suspension comprise entre 1.105 et 1 ,1010 cfu/mL, préférentiellement entre 1.107 et 1.109 cfu/mL, préférentiellement entre 5.107 et 5.108 cfu/mL.
[0070] Par exemple, 10 mL d’une culture de bactérie lactique titrant 1.109 cfu/mL introduite dans 90 mL de suspension riche en protéines végétales va permettre d’obtenir une suspension de 100 mL ayant une densité cellulaire de 1 .108 cfu/mL
[0071]Dans un mode de réalisation préféré ; le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la ou les souches de l’étape 2 sont sélectionnées parmi une souche de Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus ou de Saccharomyces cerevisiae, préférentiellement de Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, ou de Lactobacillus rhamnosus. Les termes Limosilactobacillus et lacticaseibacillus signifiant également Lactobacillus du fait d’un changement de taxonomie (voir l’article Zheng et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020 ;70:2782-2858 DOI 10.1099/ijsem.0.004107). Dans un mode préféré, plusieurs souches telles que celles décrites ci-dessus peuvent être introduites conjointement dans la suspension. La ou les souches de l’étape 2 pourront donc être sélectionnées préférentiellement parmi Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, ou Lacticaseibacillus rhamnosus.
[0072] Dans un premier mode, une seule souche microbienne sélectionnées parmi Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus ou de Saccharomyces cerevisiae, préférentiellement de Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, ou de Lactobacillus rhamnosus est introduite dans la suspension de matière première riche en protéine végétale de l’étape 1 .
[0073]Dans un second mode, deux voire plusieurs souches microbiennes sélectionnées parmi Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus ou de Saccharomyces cerevisiae, préférentiellement de Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, ou de Lactobacillus rhamnosus sont introduites en même temps dans la suspension de matière première riche en protéine végétale de l’étape 1.
[0074] La combinaison de souches pourra ainsi être
- Limosilactobacillus fermentum avec Limosilactobacillus reuteri,
- Limosilactobacillus fermentum avec Lacticaseibacillus rhamnosus,
- Limosilactobacillus fermentum avec Saccharomyces cerevisiae,
- Limosilactobacillus reuteri avec Lacticaseibacillus rhamnosus,
- Limosilactobacillus reuteri avec Saccharomyces cerevisiae,
- Lacticaseibacillus rhamnosus avec Saccharomyces cerevisiae,
Limosilactobacillus fermentum avec Limosilactobacillus reuteri et
Lacticaseibacillus rhamnosus , - Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, et Saccharomyces cerevisiae
- Limosilactobacillus fermentum, Lacticaseibacillus rhamnosus et Saccharomyces cerevisiae
- Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus et Saccharomyces cerevisiae
- Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus et Saccharomyces cerevisiae
[0075] Dans un troisième mode, deux voire plusieurs souches microbiennes sélectionnées parmi Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lacticaseibacillus rhamnosus ou de Saccharomyces cerevisiae, préférentiellement de Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, ou de Lactobacillus rhamnosus sont introduites de manière consécutives dans la suspension de matière première riche en protéine végétale de l’étape 1.
[0076] La combinaison de souches pourra ainsi être
- Limosilactobacillus fermentum puis Limosilactobacillus reuteri, ainsi que l’inverse
- Limosilactobacillus fermentum puis Lacticaseibacillus rhamnosus, ainsi que l’inverse
- Limosilactobacillus fermentum puis Saccharomyces cerevisiae, ainsi que l’inverse
- Limosilactobacillus reuteri puis Lacticaseibacillus rhamnosus, ainsi que l’inverse
- Limosilactobacillus reuteri puis Saccharomyces cerevisiae, ainsi que l’inverse
- Lacticaseibacillus rhamnosus puis Saccharomyces cerevisiae, ainsi que l’inverse
[0077] Des exemples de telles souches provenant de références de collections sont Lactobacillus fermentum CIP 102980T ou CNCM I-5802 (désormais Limosilactobacillus fermentum); Lactobacillus rhamnosus LMG 18243 ou ATCC 53103, également connue sous la dénomination Lacticaseibacillus rhamnosus GG (désormais Lacticaseibacillus rhamnosus); Lactobacillus reuteri DSM 17509 (désormais Limosilactobacillus reuteri); Sacharomyces cerevisiae CBS 8066.
[0078] Les paramètres de culture préférés sont décrites dans le Tableau 1 : [Tableau 1]
[0079] (MRS = gélose de De Man Rogosa et Sharpe ; MW = gélose de Malt Wickerham)
[0080]Comme il sera exemplifié plus bas dans la partie exemples de la description, une propagation de moins de 10h ou de plus de 20h ne permettra pas d’obtenir le maximum des effets attendus. De manière surprenante, la titulaire a découvert que ce temps de culture était nécessaire pour que la ou les souches soient actives.
[0081] De manière préférée à la fin de la première période de culture et avant la seconde étape d’introduction de la quantité de celle-ci dans la suspension de protéines végétale, un lavage est appliqué sur la culture afin de retirer le milieu de culture en excès. La culture est centrifugée à 4000 G, à 4 °C pendant 10 min. Le surnageant est retiré et le culot est re-suspendu dans de l’eau. Une nouvelle centrifugation est alors effectuée et le surnageant retiré. Les souches sont alors resuspendues dans un volume d’eau, en fonction de la biomasse calculée, afin de pouvoir inoculer le milieu d’essai entre 106 et 109, préférentiellement entre 107 et 108, encore plus préférentiellement à 108 UFC/mL (soit 109 UFC/mL si on inocule à 10% une suspension en visant une densité cellulaire finale de 108 UFC/mL ).
[0082]L’étape 3 de mise en contact consiste en l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2 à 30°C +/- 10°C pendant un temps compris entre 30 et 120 minutes, préférentiellement entre 45 et 75 minutes, encore plus préférentiellement entre 50 et 70 minutes. Les températures pourront être 20°C, 21 °C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31 °, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C ou 40°C. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs. Les temps de contact 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51 °C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61 °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C ou 70°C. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs.
[0083] De manière surprenante et inattendue, la demanderesse a découvert qu’un temps de mise en contact compris entre 30 min et 120 min suffisait pour diminuer les flaveurs indésirées mais également en faisant apparaitre de nouvelles flaveurs désirées et de plus tout en limitant l’altération de la protéine comme par exemple une hydrolyse enzymatique.
[0084]La personne du métier n’aurait jamais pris en considération un temps court pour réaliser ces transformations car ce temps correspond au temps de latence nécessaire pour qu’une souche s’adapte avant reprise du catabolisme. Les quantités très faibles de sucres semblent de plus trop faibles pour une reprise efficace du catabolisme. Les composés volatils étant extracellulaires doivent entrer en contact avec les enzymes intracellulaires, être modifiés puis être libérés. Ce mécanisme de transport n’est pas actuellement clairement identifié mais sa complexité semble peu compatible avec la durée courte de biotransformation selon l’invention.
[0085] L’ incubation peut être statique ou agitée, dans ce dernier cas l’agitation doit être suffisante pour maintenir la suspension homogène mais pas trop élevée car cela pourrait dégrader les cellules.
[0086] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que le pH de la suspension de matière riche en protéine végétale de l’étape 1 est rectifié de sorte à être compris entre 5,0 et 7,5, préférentiellement entre 6,5 et 7,5 ; préférentiellement de sorte à être égal à 7,0, avant la mise en œuvre de l’étape 2. Le pH pourra donc être de 5,0 ; 5,1 ; 5,2 ; 5,3 ; 5,4 ; 5,5 ; 5,6 ; 5,7 ; 5,8 ; 5,9, ; 6,0 ; 6,1 ; 6,2 ; 6,3 ; 6,4 ; 6,5 ; 6,6 ; 6,7 ; 6,8 ; 6,9 ; 7,0 ; 7,1 ; 7,2 ; 7,3 ; 7,4 ou 7 ;5. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs.
[0087] Dans un mode de réalisation préféré, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la suspension de matière riche en protéine végétale de l’étape 1 contient entre 0,1 et 1 % de sucres totaux, préférentiellement entre 0,2% et 0,8%, encore plus préférentiellement entre 0,3% et 0,6%. Les valeurs de sucres totaux pourront être 0,1 %, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1 ,0%. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs.
[0088] Par « sucres » on entend un ensemble d’hydrates de carbone par exemple sélectionné parmi les monosaccharides tels que le glucose, le fructose, le ribose, la galactose, et leurs mélanges et les oligosaccharides tels que le raffinose, le saccharose, le mélézitose, le stachyose et leurs mélanges.
[0089] Par « monosaccharides », on entend au sens de la présente invention les glucides ou hydrates de carbone composé d’une simple molécule tels que le glucose, le fructose, le mannose, le galactose, le xylose, l’arabinose.
[0090]Par « oligosaccharides », on entend au sens de la présente invention les oligomères formés d'un nombre n d'oses (monosaccharides) par liaison glycosidique alpha ou beta. Par convention le nombre n varie de 3 à 10. Là, ils sont placés entre les oses simples (n=1 ) et les polyosides (polysaccharides) (n>10). Cependant cette limite de 10 unités n'est pas totalement figée et les polyosides de degré de polymérisation de 11 à 25 leur sont souvent assimilés. Les oligosides comprenant 2 oses sont les diholosides (saccharose), 3 oses les triholosides (raffinose, mélézitose) et 4 oses les tétraholosides (stachyose). Les oligosides peuvent être linéaires (stachyose), ramifiés ou bien cycliques (cyclodextrine).
[0091]Par « sucre totaux » on entend par la présente invention la composition en monosaccharides obtenue après hydrolyse totale des sucres. Les oligosaccharides et polysaccharides sont complètement hydrolysés de manière chimique (acide ou base) et/ou enzymatique (amylase), puis l’échantillon hydrolysé est analysé pour déterminer la composition des monosaccharides obtenus.
[0092] Dans un mode préféré les sucres totaux comprenant un mélange de glucose, fructose, mannose, galactose, xylose et arabinose. De manière préférée, les sucres totaux comprennent entre 20% et 30% de glucose, entre 20% et 30% de galactose et entre 20% et 30% d’arabinose. Par exemple, une composition typique de sucres totaux convenant à l’invention est un mélange de 0,15 g/L glucose, de 0,058 g/L fructose, de 0,03 g/L mannose, de 0,12 g/L galactose, de 0,03 g/L xylose, de 0,19 g/L d’arabinose et de 0,003 g/L de raffinose. [0093] Les sucres totaux présents dans la suspension de matière riche en protéine végétale de l’étape 1 proviennent en partie d’un mélange de saccharose, de raffinose, de mélézitose et de stachyose. La teneur préférée en raffinose et en stachyose est comprise entre 0,02% et 0,05%, préférentiellement entre 0,03% et 0,04%.
[0094] Il est à noter que tous les isolats ne contiennent pas ces sucres, en particulier le mélange de saccharose, de raffinose, de mélézitose et de stachyose. La demande EP 3 071 046 B1 présente par exemple un procédé d’extraction incluant une étape de trempe du grain permettant l’élimination quasi-totale des sucres dont les GOS (galactooligosaccharides) du pois.
[0095] Une étape 4 comprenant des sous-étapes peut alors être également effectuée. Ces sous-étapes visent à isoler la protéine végétale, à l’extraire et à la stabiliser pour son utilisation ultérieure.
[0096]Ainsi dans un mode de réalisation, l’étape 3 du procédé selon l’invention est suivie d’une étape 4 comprenant les sous-étapes suivantes
4a. optionnellement, la rectification du pH de la suspension obtenue à l’issue de l’étape 3 à un pH compris entre 5 et 9, préférentiellement entre 6 et 9, préférentiellement un pH de 7, préférentiellement par ajout de soude ou de chaux dans ladite suspension ;
4b. le traitement thermique de la suspension de l’étape 3 ou de l’étape 4a entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1 s, et 4c. le séchage de la suspension de l’étape 4b à l’aide d’un atomiseur jusqu’à obtenir un isolat de protéines végétales présentant de préférence une matière sèche supérieure à 95% par rapport à la masse d’isolat.
[0097] L’étape 4b correspond typiquement à un traitement thermique de type HTST ou UHT.
[0098] En partant d’une poudre ou d’une farine, l’étape 4 peut par exemple comprendre les sous étapes suivantes :
4a. l’élimination des fractions insolubles (contenant principalement amidon et fibres par centrifugation internes),
4b. la précipitation isoélectrique de la fraction globuline et sa récupération par centrifugation, 4c. la neutralisation du pH à 7,
4d. un traitement thermique de type HTST ou UHT ;
4e. un séchage à l’aide d’un atomiseur.
[0099] Dans un mode de réalisation préféré en partant d’un isolat, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que l’étape 3 est suivie des étapes suivantes : 4a. la rectification optionnelle du pH de la suspension obtenue à l’issue de l’étape 3 à un pH compris entre 6 et 9, préférentiellement un pH de 7, préférentiellement par ajout de soude ou de chaux dans ladite suspension ;
4b. le traitement thermique optionnel de la suspension de l’étape a entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1s, et
4c. le séchage de la suspension de farine végétale de l’étape b jusqu’à obtenir un isolat de farine végétale présentant une matière sèche supérieure à 95% à l’aide d’un atomiseur.
[0100]L’ invention concerne également un isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention.
[0101]L’ invention concerne également un isolat de protéines végétales, susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse (ou DH) est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5.
[0102] Les expressions « isolat susceptible d’être obtenu selon le procédé de l’invention » et « isolat selon l’invention » peuvent être utilisées de manière interchangeable.
[0103] L’isolat selon l’invention présente un degré d’hydrolyse (ou DH) inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5%, incluant le DH de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% et 1 %. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs.
[0104]Le degré d’hydrolyse peut être déterminé en mesurant la teneur en azote aminé libre par la méthode OPA décrite dans l’article Nielsen et al., 2001 (Nielsen et al., Journal of Food Science, Volume66, Issue , Pages 642-646, 2001 « Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis ») par rapport à l’azote total mesuré par la méthode de DUMAS selon la norme ISO 16634-2:2016. [0105] Le Test de mesure du degré d’hydrolyse décrit ci-après est particulièrement préféré. Son principe consiste à déterminer tout d’abord la teneur en azote aminé (fonctions NH2 libre) sur l’échantillon de protéines (préférentiellement avec le kit MEGAZYME (référence K-PANOPA), puis de déterminer la teneur en azote protéique (azote total incluant donc les fonctions NH2 libres et engagées) de l’échantillon, et enfin de calculer le degré d’hydrolyse accessible via le ratio de ces deux mesures.
[0106] Détermination de la teneur en azote aminé :
[0107] Les groupes « azote aminé » des acides aminés libres de l’échantillon réagissent avec le N-acétyl-L-cystéine et l’Ophthaldialdéhyde (OPA) pour former des dérivés d’isoindole.
La quantité de dérivé d’isoindole formée au cours de cette réaction est stoechiométrique avec la quantité d’azote aminé libre. C’est le dérivé d’isoindole qui est mesuré par l’augmentation de l’absorbance à 340 nm.
Dans un bêcher de 100 mL, on introduit une prise d’essai P*, exactement pesée, de l’échantillon à analyser. Cette prise d’essai sera de 0,5 à 5,0 g en fonction de la teneur en azote aminé de l’échantillon. On ajoute environ 50 mL d’eau distillée, on homogénéise et on transvase dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute 5 mL de dodécyle sulfate de sodium (SDS) à 20% et on complète avec de l’eau distillée pour atteindre un volume de 100 mL. On agite pendant 15 minutes avec un agitateur magnétique à 1000 rpm. On prépare une solution n°1 en dissolvant un comprimé du flacon 1 du kit Megazyme dans 3 mL d’eau distillée et on agite jusqu'à dissolution complète. Il faut prévoir un comprimé par essai. La solution n°1 est préparée extemporanément.
On prépare un blanc, un standard et un échantillon directement dans les cuves du spectrophoto mètre dans les conditions suivantes :
-blanc : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 pl d’eau distillée -standard : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 pl du flacon 3 du kit Megazyme
-échantillon : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 pl de la préparation de l’échantillon.
On mélange le contenu de chaque cuve et on lit la mesure d’absorbance (A1 ) des solutions après 2 mn environ au spectrophotomètre à 340 nm (spectrophotomètre équipé de cuves de 1 ,0 cm de trajet optique, pouvant mesurer à une longueur d’onde de 340 nm, et vérifié selon le mode opératoire décrit dans le manuel technique du constructeur qui s’y rapporte).
On amorce ensuite les réactions immédiatement en ajoutant 100 pl de la solution n°2 qui correspond à la solution d’OPA du flacon 2 du kit Megazyme dans chaque cuve de spectrophotomètre.
On mélange le contenu de chaque cuve et on les place environ 20 minutes dans l’obscurité.
On lit ensuite la mesure d’absorbance A2 du blanc, du standard et de l’échantillon au spectrophotomètre à 340 nm.
La teneur en azote aminé libre, exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit, est donnée par la formule suivante :
[Math.1] AAech - àAblc) x 3,15 x 14,01 x V x 100
% azote aminé libre =
6803 x 0,05 x m x 1000
[Math.2]
(AAech - àAblc) x 12,974 x V
% azote aminé libre = - m x 1000 où :
AAech =Aech2 - Aechl
AAblc =Ablc2 - Ablc1
Aech2 = absorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°2
Aechl = asorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°1
Ablc2 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°2
Ablcl = absorbance du blanc après ajout de la solution n°1
V = volume de la fiole m = masse de la prise d’essai en g
6803 = coefficient d’extinction du dérivé d’isoindole à 340 nm (en L. mol-1.cm-1).
14,01 = masse molaire de l’azote (en g. mol-1)
3,15 = volume final dans la cuve (en mL)
0,05 = prise d’essai dans la cuve (en mL)
[0108] Détermination de la teneur en azote protéique : [0109] La teneur d’azote protéique est déterminée selon la méthode de DUMAS selon la norme ISO 16634 - 2016. Elle est exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit.
[0110]Calcul du degré d’hydrolyse :
Le degré d’hydrolyse (DH) est calculé avec la formule suivante: [Math.3]
% azote aminé
DH = - ; - x 100
% azote proteique
[0111]L’ isolat susceptible d’être obtenu selon le procédé de l’invention peut également être caractérisé par une teneur réduite en composés volatils responsables de stimuli indésirables.
[0112]Dans un mode de réalisation, l’isolat susceptible d’être obtenu selon le procédé de l’invention est caractérisé par une teneur réduite en composés volatils responsables de flaveurs végétales, par exemple de flaveurs herbacées ou des flaveurs de pois (flaveurs « beany »).
[0113] Les composés organiques responsables de flaveurs végétales peuvent notamment être des composés comprenant un ou plusieurs groupes aldéhydes et/ou des cétones. Dans la présente demande, le terme « aldéhyde » peut être utilisé pour désigner un composé comprenant un ou plusieurs groupes -CHO, de préférence 1 ou 2 groupes -CHO, de préférence encore 1 seul groupe -CHO. Le terme « cétone » peut être utilisé pour désigner un composé comprenant un ou plusieurs groupe -CO-R, de préférence un ou deux groupes -CO-R, de préférence encore un seul groupe -CO-R.
[0114] Des aldéhydes responsables de flaveurs végétales sont par exemple des aldéhydes présentant des notes vertes (« green-notes aldehydes ») tels que l’hexanal, le nonanal, le 2-nonénal, le benzaldéyhde, le 3-méthylbutanal.
[0115] Un exemple de cétone responsable de flaveur végétale est le 3-octen-2-one.
[0116] Les composés organiques responsables de flaveurs végétales peuvent également être des alcools tels que le 1-octen-3-ol, ou des pyrazines tels que la 2,5-dimétylpyrazine. [0117] Dans un mode de réalisation, l’isolat susceptible d’être obtenu selon le procédé de l’invention à une teneur réduite en au moins 1 , 2, 3, ou 4 composés volatils responsables de flaveurs végétales choisis parmi l’hexanal, le nonanal, le 2-nonénal, le benzaldéyhde, le 3-méthylbutanal, le 3-octen-2-one, le 1-octen-3-ol, et la 2,5-dimétylpyrazine.
[0118] La présence de ces composés, même en de faibles teneurs, dans les isolats classiques du commerce peut leur conférer donner une flaveur dite « végétale » , par exemple une flaveur de pois qui est indésirable lorsque l’isolat est utilisé pour préparer des produits alimentaires. Le procédé selon l’invention permet de préférence l’obtention d’un isolat dont la teneur en au moins composé volatil responsable de flaveur végétale est réduite de plus de 50%, préférentiellement de plus de 25%, les valeurs de réductions étant potentiellement de 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41 %, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31 %, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21 %, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14% 13% 12%, 11 % 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4% 3%, 2% ou 1 %. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs.
[0119] Dans un mode de réalisation, l’isolat susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention est caractérisé par une teneur réduite en composés comprenant un ou plusieurs groupes thiols, en particulier une teneur réduite en méthanethiol.
[0120]On observe la synthèse de ce composé issu de la dégradation des acides aminés soufrés dans les isolats classiques du commerce. Sa présence de l’ordre du ppb suffit à donner une flaveur dite « œuf pourri » ou « hydrogène sulfuré » lorsque l’isolat est utilisé pour préparer des boissons prêtes à boire ou des bandes d’extrusions humides destinées à produire des analogues de viande. Sans être lié par une quelconque théorie, ces procédés en générant une chaleur importante vont provoquer une apparition importante de composés de dégradations issus du méthanethiol. Le procédé selon l’invention permet de préférence l’obtention d’un isolat dont la teneur en méthanethiol est réduite de plus de 30%, 40%, 50%, préférentiellement de plus de 50%, les valeurs de réductions étant potentiellement de 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41 %, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31 %, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21 %, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14% 13% 12%, 11 % 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4% 3%, 2% ou 1 %.
[0121]Dans un mode de réalisation, l’isolat susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention est caractérisé à la fois par une teneur réduite en composés volatils responsables de flaveurs végétales et une teneur réduite en méthanethiol. Dans la présente demande, le terme « thiol » peut être utilisé pour désigner un composé comprenant au moins un groupe -SH, de préférence comprenant 1 ou 2 groupes thiols, de préférence encore comprenant un seul groupe thiol.
[0122]L’ isolat de protéines végétales selon l’invention est caractérisé en ce que sa teneur en protéines exprimées par rapport à sa matière sèche totale est comprise entre 80% et 95%, préférentiellement entre 82% et 92%, préférentiellement entre 84% et 90%, préférentiellement entre 84% et 88%. On considérera donc qu’un isolat de protéines végétales selon l’invention possède une teneur en protéines exprimées par rapport à sa matière sèche totale de 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94% ou 95%. Ainsi que toute gamme incluse entre deux de chacune de ces valeurs.
[0123]L’invention concerne également l’utilisation de l’isolat selon l’invention ou obtenu selon le procédé de l’invention pour des applications industrielles comprenant les applications alimentaires, nutraceutiques, pharmaceutiques.
[0124] Par industrie alimentaire humaine et animale, on entend la confiserie industrielle (par exemple chocolat, caramel, bonbons gélifiés), les produits de boulangerie-pâtisserie (par exemple le pain, les brioches, les muffins), l’industrie de la viande et du poisson (par exemple les saucisses, les steak-hachés, les nuggets de poisson, les nuggets de poulet), les sauces (par exemple bolognaise, mayonnaise), les produits dérivés du lait (par exemple fromage, lait végétal), les boissons (par exemple boissons riches en protéines, boissons en poudre à reconstituer).
[0125]De façon générale, la matière riche en protéines végétales dont les propriétés organoleptiques ont été améliorées avec le procédé de l’invention, autrement dit la composition selon l’invention, en particulier l’isolat selon l’invention, peut être utilisée dans les produits alimentaires à une teneur allant jusqu’à 100 % en poids par rapport au poids sec total de l’aliment, par exemple, d’une quantité d’environ 1 % en poids à environ 80 % en poids par rapport au poids sec total de l’aliment ou de la boisson. Toutes les quantités intermédiaires (c.-à-d. 2 %, 3 %, 4 %... 77 %, 78 %, 79 % en poids par rapport au poids total de l’aliment ou de la boisson) sont envisagées, de même que toutes les gammes intermédiaires fondées sur ces quantités. Les produits alimentaires qui peuvent être envisagés dans le contexte de la présente invention comprennent les produits de boulangerie- pâtisserie; les produits de boulangerie-pâtisserie (y compris, mais sans s’y limiter, les petits pains, les gâteaux, les tartes, les pâtisseries, et biscuits); mélanges de boulangerie sucrés pré-faits pour la préparation de produits de boulangerie sucrés; garnitures de tarte et autres garnitures sucrées (y compris, mais sans s’y limiter, les garnitures pour tartes aux fruits et les garnitures pour tartes aux noix comme les garnitures pour tartes aux pacanes, ainsi que les garnitures pour biscuits, gâteaux, pâtisseries, produits de confiserie et produits similaires, tels que les garnitures pour crème à base de matières grasses); desserts, gélatines et poudings; desserts congelés (y compris, mais sans s’y limiter, les desserts laitiers congelés tels que la crème glacée - y compris la crème glacée ordinaire, la crème glacée à service doux et tous les autres types de crème glacée - et les desserts non laitiers congelés tels que la crème glacée non laitière, le sorbet et les produits similaires); boissons gazeuses (y compris, mais sans s’y limiter, les boissons gazeuses douces); les boissons non gazéifiées (y compris, mais sans s’y limiter, les boissons non gazéifiées douces comme les boissons aromatisées), les j us de fruits et boissons à base de thé ou de café sucré); concentrés de boissons (y compris, mais sans s’y limiter, les concentrés et sirops liquides ainsi que les concentrés non liquides, tels que les préparations lyophilisées et/ou en poudre); yogourts (y compris, mais sans s’y limiter, les yogourts laitiers à teneur élevée en gras, à teneur réduite en gras et sans matières grasses, ainsi que les yogourts non laitiers et sans lactose et les équivalents congelés de tous ces produits); les barres de collation (y compris, sans s’y limiter, les barres de céréales, de noix, de graines et/ou de fruits); les produits du pain (y compris, mais sans s’y limiter, les pains levés et sans levain, les pains levés et sans levain tels que les pains à la soude, les pains comprenant tout type de farine de blé, pains composés de tout type de farine non de blé (comme la pomme de terre, le riz et la farine de seigle), pains sans gluten); mélanges à pain pré-préparés pour la préparation de produits du pain; sauces, sirops et vinaigrettes; pâtes à tartiner sucrées (y compris, mais sans s’y limiter, les gelées, confitures, beurres, tartinades aux noix et autres conserves tartinables, conserves et autres produits similaires); produits de confiserie (y compris, mais sans s’y limiter, les bonbons en gelée, les bonbons mous, les bonbons durs, les chocolats et les gommes); édulcorés et non édulcorés les céréales pour petit-déjeuner (y compris, mais sans s’y limiter, les céréales pour petit-déjeuner extrudées, les céréales pour petit-déjeuner en flocons et les céréales pour petit-déjeuner soufflées) et les compositions d’enrobage des céréales destinées à la préparation de céréales pour petit-déjeuner sucrées. D’autres types de produits alimentaires et de boissons qui ne sont pas mentionnés ici mais qui comprennent habituellement un ou plusieurs édulcorants nutritifs peuvent également être envisagés dans le contexte de la présente invention. En particulier, les aliments pour animaux (comme les aliments pour animaux de compagnie) sont explicitement envisagés. Il peut également être utilisé, après texturation par extrusion, dans des produits carnés tels que les saucisses émulsionnées ou les burgers végétaux. Il peut également être utilisé dans les formulations de remplacement des œufs.
[0126]La composition de l’invention peut être utilisée comme source unique de protéines, mais peut également être utilisée en combinaison avec d’autres protéines végétales ou animales. Le terme « protéine végétale » désigne toutes les protéines dérivées des céréales, des plantes oléagineuses, des légumineuses et des plantes tubéreuses, ainsi que toutes les protéines dérivées des algues et des microalgues ou champignons, utilisées seules ou en mélange, choisies dans la même famille ou de familles différentes. Dans la présente demande, le terme « céréales » désigne les plantes cultivées de la famille des graminées produisant des grains comestibles, par exemple le blé, le seigle, l’orge, le maïs, le sorgho ou le riz. Les céréales sont souvent moulues sous forme de farine, mais sont également fournies sous forme de céréales et parfois sous forme de plantes entières (fourrages). Dans la présente demande, le terme « tubercules » recouvre les organes de stockage, généralement souterrains, qui assurent la survie des plantes pendant l’hiver et souvent leur multiplication par le processus végétatif. Ces organes sont bulbeux en raison de l’accumulation de substances de stockage. Les organes transformés en tubercules peuvent être la racine, par ex. carotte, panais, manioc, konjac), le rhizome (par ex. pomme de terre, topinambour, artichaut japonais, patate douce), la base de la tige (plus spécifiquement I’hypocotyle, p.ex. kohlrabi, céleri-rave), la combinaison racine et hypocotyle (p. ex., betterave, radis). Aux fins de la présente invention, le terme « légumineuses » désigne toute plante appartenant à la famille des Cesalpiniaceae, à la famille des Mimosaceae ou à la famille des Papilionaceae, et notamment : toutes les plantes appartenant à la famille des papilionacées, par exemple pois, haricots, soja, fèves, haricots verts, haricots verts, lentilles, luzerne, trèfle ou lupin. Cette définition comprend en particulier toutes les plantes décrites dans l’un des tableaux de l’article de R. Hoover et coll., 1991 (Hoover R. (1991 ) « Composition, structure, fonctionnalité and chemical modification of legume starches : a review », Can. J. Physiol. Pharmacol., 69, p. 79-92). Les protéines animales peuvent être par exemple des protéines d’œufs ou de lait, telles que les protéines de lactosérum, les protéines de caséine ou de caséinate. La composition en protéines de pois peut donc être utilisée en combinaison avec une ou plusieurs de ces protéines ou acides aminés afin d’améliorer les propriétés nutritionnelles du produit final, par exemple pour améliorer la PDCAAS de la protéine ou pour apporter d’autres ou modifier
[0127JL’ invention concerne notamment l’utilisation de l’isolat selon l’invention pour la fabrication de biscuits, muffins, pancakes, barres nutritionnelles (destinés à la nutrition spécialisée / minceur ou sportif), de pains ou pains sans gluten enrichis en protéines, de petites céréales obtenues par cuisson extrusion (« crisps ») hyperprotéinés, où l’on recherche plus particulièrement des solutions hyperprotéinées sans impact négatif sur le procédé de préparation ou la texture des préparations ou produits finis.
[0128]Au sens de l’invention, on entend par « formulations nutritionnelles en poudre », des formulations en poudre comprenant au moins, préférentiellement uniquement, une protéine de légumineuse, et en particulier de pois ou de féverolle, selon l’invention, qui sont reconstituables avec un liquide aqueux, et qui conviennent pour l'administration orale à un être humain.
[0129JL 'expression « mélange à sec » tel qu'utilisé ici, sauf indication contraire, se réfère au mélange des composants ou des ingrédients pour former une poudre nutritionnelle de base ou, à l'addition d'un composant sec, en poudre ou granulé ou d'un ingrédient à base poudre pour former une formulation nutritionnelle en poudre. [0130]Tous les pourcentages, parties et rapports, tel que décrits ici, se rapportent au poids de la formulation totale, sauf indication contraire.
[0131]Les formulations alimentaires en poudre et les procédés de fabrication correspondant de la présente invention peuvent comprendre, consister ou consister essentiellement en les éléments essentiels de l'invention telle que décrite ici, ainsi que tout élément supplémentaire ou facultatif décrit ici ou autrement utiles dans les applications de la formulation nutritionnelle.
[0132]Les formulations nutritionnelles en poudre de la présente invention sont généralement sous la forme de compositions particulaires aptes à l'écoulement ou sensiblement fluides, ou au moins des compositions particulaires qui peuvent être facilement moulées et mesurées à l'aide d'une cuillère ou d'un autre dispositif similaire, dans lequel les compositions peuvent facilement être reconstitués par l'utilisateur prévu avec une solution aqueuse, typiquement de l'eau, pour former une formulation nutritionnelle liquide pour utilisation orale ou entérale immédiate. Dans ce contexte, l'utilisation « immédiatement » signifie généralement dans environ 48 heures, plus typiquement pendant environ 24 heures, de préférence juste après la reconstitution.
[0133]Les formulations alimentaires en poudre peuvent être formulées avec tous types et quantités de nutriments suffisantes de manière à former un complément alimentaire, ou une formulation nutritionnelle spécialisée destinée à être utilisée chez les personnes suivant un régime alimentaire particulier destiné à la diététique du sport et de la minceur.
[0134] Dans des exemples de réalisations, la formulation nutritionnelle en poudre peut être formulée pour une utilisation : pour réparer les muscles après un effort intense, par exemple chez le sportif,
- pour assurer chez le sportif le maintien ou la construction de la masse musculaire, ou
- comme substitut de repas par des personnes désirant perdre du poids via un effet satiétogène.
[0135] Les formulations alimentaires en poudre peuvent avoir une densité calorique adaptée aux besoins nutritionnels de l'utilisateur final, bien que dans la plupart des cas, les poudres reconstituées comprennent d'environ 350 à environ 400 kcal / 100 ml.
[0136] Les formulations alimentaires en poudre peuvent présenter un taux protéique adapté aux besoins nutritionnels de l'utilisateur final, bien que dans la plupart des cas, les poudres reconstituées comprennent d'environ 20 à environ 91 g de protéines / 100 g, y compris d'environ 40 à environ 65 g de protéines / 100g.
[0137]Ainsi, la formulation peut comprendre entre 20 et 95 % de protéines par rapport au poids total de la formulation, par exemple entre 20-90%, 30-80%, ou 40- 60%.
[0138] Par exemple, l’isolat de protéines de légumineuses, préférentiellement de pois ou de féverolle, selon la présente invention peut représenter 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou 90-100% de la protéine totale de la formulation, ou une quelconque combinaison de ces gammes de pourcentages. 100% représentant le mode préférentiel ultime afin de maximiser l’effet de surexpression du FGF19.
[0139] Par ailleurs, les formulations alimentaires en poudre peuvent présenter un taux de matière grasse adapté aux besoins nutritionnels de l'utilisateur final, bien que dans la plupart des cas, les poudres reconstituées comprennent d'environ 0,5 à environ 13 g / 100 g, y compris d'environ 3 à environ 7 g /100 g. Ainsi, la formulation peut comprendre entre 0 et 20 % de lipides par rapport au poids totale de la formulation, par exemple entre 0,5-15%, 1-10%, ou 3-7% (en particulier % en poids).
[0140] Les formulations nutritionnelles en poudre de la présente invention peuvent être emballées et scellées dans des conteneurs simples ou multi-usage, puis stockées dans des conditions ambiantes jusqu'à environ 36 mois ou plus, plus typiquement d'environ 12 à environ 24 mois.
[0141]Pour multi-utilisation des conteneurs, ils peuvent être ouverts et couverts pour une utilisation répétée par l'utilisateur final, à condition que le paquet recouvert soit ensuite stocké dans des conditions ambiantes (par exemple, éviter les températures extrêmes) et les contenus utilisés dans environ un mois ou deux.
[0142] Les domaines d’applications des formulations nutritionnelles selon l’invention sont notamment : - la nutrition diététique (sport, minceur),
- la nutrition clinique (sous forme de boisson, de crème dessert ou de poche entérale),
- les produits laitiers (sous forme de yaourts, boissons laitières, crèmes laitières, desserts glacés ou sorbets).
- les produits de biscuiterie, produits de pâtisserie, produits de panification et produits céréaliers hyperprotéinés.
[0143]Dans le domaine du sport, il est connu que les protéines participent à l'entretien et à la croissance du muscle. L’apport en protéines est également important pour les athlètes qui pratiquent la musculation ou le renforcement musculaire.
[0144]Ces protéines doivent être équilibrées en termes de profil en acide aminés et doivent respecter les recommandations de la FAO/WHO. Leur digestibilité est un facteur important allant d’une rapide digestibilité à une plus lente digestibilité en fonction du moment de l’apport en protéines.
[0145] Les boissons protéinées ou hyperprotéinées prêtes à boire permettent alors de faire bénéficier l’organisme d'un apport protéique de choix, les calories en moins.
[0146] Ces boissons hyperprotéinées doivent :
- être riches en protéines, pauvres en glucides et en graisses ;
- avoir bon goût ;
- être conçues pour aider à perdre du poids, en stimulant la perte de graisse et en aidant à la récupération musculaire ;
- être satiétogènes ;
- permettre de faire face aux fringales, sans sucres ni graisses ajoutées ;
- présenter un contenu équilibré en acides aminés essentiels, en fibres, en vitamines et minéraux ;
- être hypocaloriques.
[0147] Ces boissons prêtes-à-boire peuvent être avantageusement préparées avec les isolats de protéines de légumineuses, préférentiellement de féveroles ou de pois, conformément à l’invention. Elles peuvent être d’ailleurs utilisées comme seule source de protéines, de manière préférée car maximisant l’effet de surexpression du FGF19. [0148] Par exemple, les boissons végétales alternatives au lait de vache, contiennent en moyenne de 4,5 à 11 g de protéines pour 100 ml de boisson, de préférence de l’ordre de 7 g de protéines pour 100 ml, et sont très pauvres en fibres (de l’ordre de 0,5 à 1 g pour 100 ml).
[0149] Ainsi, la boisson peut comprendre entre 1 et 20 % de protéines par rapport au poids totale de la boisson, par exemple entre 3-15%, ou 6-8%.
[0150] Par exemple, l’isolat de protéines de pois selon la présente invention peut représenter 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou 90-100% de la protéine totale, ou une quelconque combinaison de ces gammes de pourcentages. De préférence, il représente au moins 52 %. Notamment, l’apport en protéines de pois est compris entre 52 et 100 % de l’apport en protéines totales.
[0151] Pour les boissons prêtes à boire, l’apport en protéines de pois peut aller de 0 à 100%, de préférence de 0,01 ou 0,1 à 100 %. Par exemple, l’isolat de protéines de pois selon la présente invention peut représenter 0,1-10%, 10-20%, 20-30%, 40- 50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou 90-100% de la protéine totale, ou une quelconque combinaison de ces gammes de pourcentages.
[0152] Dans le domaine des boissons « minceur », i.e. destinées à être utilisées dans des régimes hypocaloriques ou destinées à la perte de poids, comme mentionné précédemment, ces boissons protéinées ou enrichies en protéines ne sont pas uniquement efficaces pour une prise rapide de muscles. Ce type de boisson est également très avantageux dans le cadre d'un régime minceur basé sur la consommation de protéines.
[0153] Il est connu que les boissons minceurs sont idéales pour aider à la perte de poids. Elles permettent plus particulièrement de :
- procurer un effet de satiété
- protéger les muscles et de tonifier le corps, évitant la reprise de poids.
[0154]Comme pour les boissons « sport », ces boissons minceurs présentent :
- un contenu équilibré en acides aminés essentiels, en fibres, en vitamines et minéraux
- un contenu réduit en sucres, en matières grasses et en calories. [0155]C’est ainsi que les boissons protéinées sont en effet d'une grande efficacité pour perdre rapidement quelques kilos. Ces préparations riches en protéines réduisent ou stoppent simplement la sensation de faim chez la personne qui en consomme. En prenant par exemple une telle boisson, l'utilisateur peut réduire de manière considérable la quantité de nourriture à consommer, et permettre une perte de pois rapide (dans le cadre d’un processus de substitut de repas pour contrôle du poids, ou substitut de la ration journalière totale pour contrôle du poids).
[0156] En nutrition clinique, il est connu que la nutrition entérale est une solution thérapeutique de nutrition par sonde qui est utilisée lorsque le tube digestif est fonctionnel et accessible mais lorsque le patient ne peut s’alimenter normalement ou encore dans les cas de dénutrition sévère.
[0157]Cette technique permet d’apporter directement les nutriments dans le tube digestif. Elle remplace, de manière totale ou partielle, l’alimentation orale traditionnelle par des formules nutritives «complètes» apportant l’ensemble des nutriments nécessaires à l’organisme.
[0158] Ces formules sont généralement conditionnées dans des poches souples (en PVC) et administrées au moyen de sondes naso-gastriques ou, gastrostomies, naso-jéjunale, naso-duodénale, jéjunostomie.
[0159]Ces mélanges nutritionnels sont composés de protéines, lipides, glucides, vitamines et minéraux avec ou sans fibres.
[0160]On distingue plusieurs catégories : les mélanges polymériques (standards) et les mélanges semi-élémentaires («prédigérés»), ces derniers étant indiqués dans des cas bien spécifiques (syndrome du grêle court, insuffisance pancréatique exocrine, etc.) :
- Mélanges polymériques
- hypocaloriques (0,5 - 0,75 kcal /ml), normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- isocaloriques (1 kcal / ml), normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- hypercaloriques (1 ,25 -1 ,5 kcal / ml) normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- formules spécifiques (troubles du métabolisme glycémique, insuffisance respiratoire). [0161] Les semi-élémentaires sont des mélanges iso ou hypercaloriques normo ou hyperprotéinés, à base de peptides et de triglycérides à chaînes moyennes.
[0162] Les isolats de protéines de pois, comme source de protéines, par leurs propriétés fonctionnelles sont particulièrement bien adaptés à cet usage.
[0163] Par ailleurs, ils permettent de préserver les mêmes propriétés que les protéines de lait, et ce pour un coût moindre.
[0164]L’ invention sera mieux comprise avec les exemples suivants qui n’ont pour but que de mieux faire comprendre celle-ci. Ceux-ci n’ont aucune portée limitative.
Brève description des dessins
[0165] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :
[0166] [Fig 1] illustre l’impact de la sélection de souche parmi Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus Reuteri, Limosilactobacillus Rhamnosus et Lacticaseibacillus rhamnosus (Lr) après mise en contact avec Nutralys® F85F sur leur efficacité de modification des composés volatils.
[0167] [Fig 2] illustre l’impact du temps de culture de souches de Limosilactobacillus fermentum (Lf) et Lacticaseibacillus rhamnosus (Lr) avant mise en contact avec Nutralys® F85F sur leur efficacité d’amélioration des qualités organoleptiques. F85F = Nutralys® F85F ; B = blanc ; Lf 5h = Lactobacillus fermentum pré-cultivé pendant 5h ; Lf 10h = Lactobacillus fermentum pré-cultivé pendant 10h ; Lf 15h = Lactobacillus fermentum pré-cultivé pendant 15h ; Lr 5h = Lactobacillus rhamnosus pré-cultivé pendant 5h ; Lr 10h = Lactobacillus rhamnosus pré-cultivé pendant 10h ; Lr 15h = Lactobacillus rhamnosus pré-cultivé pendant 5 à 15 h.
[0168] [Fig 3] illustre l’impact de la composition en sucres sur la performance de la souche Limosilactobacillus fermentum à modifier le profil de composés volatils présents dans un échantillon.
[0169] [Fig 4] illustre la répartition proportionnelle des différents composés volatils regroupés par profil sensoriel dans l’isolat de pois Nutralys® brut et fermenté par les différentes souches dans l’exemple 1.
Exemples [0170] Exemple 1 : Procédé selon l’invention partant d’un isolat de pois
[0171]Souches et conditions de culture :
- À partir d’un cryotube (souche congelée), un tube de pré-culture de 10 mL du milieu approprié à la souche est inoculé avec une ose.
- Le tube est incubé en étuve non agitée, à la température optimale de chaque souche pendant 15 à 24 h.
- Le tube de pré-culture est ensuite utilisé pour inoculer à 1 % un flacon ou erlenmeyer de 1L de milieu.
- La propagation a lieu à la température optimale de chaque souche pendant le temps optimal de chacune.
- Les paramètres de croissance des souches sont récapitulés dans le Tableau 2 ci-dessous :
[Tableau 2]
[0172](MRS = gélose de De Man Rogosa et Sharpe ; MW = gélose de Malt Wickerham)
[0173] Préparation de l’inoculum :
- A la fin de la période de croissance, un lavage est appliqué sur les différentes cultures afin de retirer le milieu de culture.
- Les cultures sont centrifugées à 4000 G, à 4 °C pendant 10 min. Le surnageant est retiré et le culot est re-suspendu dans de l’eau physiologique.
- Une nouvelle centrifugation est alors effectuée et le surnageant retiré.
- Les souches sont alors re-suspendues dans un volume d’eau physiologique, en fonction de la biomasse calculée, afin de pouvoir inoculer le milieu d’essai à 108 CFU/mL (donc afin d’avoir un inoculum à 109 CFU/mL). [0174] Préparation de la matrice (milieu d’essai) :
- Le milieu d’essai ou matrice, est constituée d’une solution d’isolat de pois (Nutralys® S85F) à 10 %. 100 g de l’isolat de pois sont introduits dans de l’eau distillée stérile en fin filet, sous agitation, afin d’obtenir 900 mL de suspension.
- 100 mL d’inoculum seront ajoutés à ce volume afin d’obtenir 1 L de suspension.
- La suspension est laissée sous agitation 30 min afin d’assurer une bonne hydratation et solubilisation de l’isolat protéique.
[0175]Traitement par biomasse de cellule entière (« whole cell biomass », abrégé WCB. Peut également être appelée « whole cell biocatalysis ») : Action des souches sur le milieu d’essai avec un temps de contact court (le principe étant d’utiliser la cellule comme un système de catalyse métabolique, avec peu voire sans croissance cellulaire) :
- Après la préparation d’un inoculum à 109 UFC/mL, le milieu d’essai est inoculé avec 100 mL d’inoculum dans 900 mL de matrice d’essai.
- Une fois le milieu inoculé, les erlenmeyer Pyrex à bouchon sont placés en étuve agitée à 130 rpm à 30 °C pendant une heure.
- Après traitement, l’échantillon est séché par atomisation pour stopper l’action des souches. L’atomisation est réalisée à 160 °C, avec 10 % d’alimentation en produit et 100 % d’aspiration.
- L’échantillon récolté sous forme de poudre est stocké dans un flacon en verre stérile, jusqu’à mesure des composés volatils par SPME-GC-MS.
[0176] Résultats WCB - Interprétations
Les résultats sont présentés en Figure 1 .
L’impact sur les composés volatils est présenté en aire par g d’échantillon (soit l’isolat de pois), moyenne de trois échantillons. Les résultats représentés dans la Figure 1 sont groupés par type de famille chimique.
[0177]Les résultats montrent que le procédé de l’invention permet de modifier le profil en composés volatils de l’isolat de pois (Nutralys® S85F) traité. La conversion des aldéhydes en alcools est très forte chez les hétérofermentaires obligatoires (Limosilactobacillus fermentum et Limosilactobacillus reuteri). Limosilactobacillus reuteri, est également efficace sur les cétones . L’action est également visible chez Saccharomyces cerevisiae. Chez Lacticaseibacillus rhamnosus, on observe également la conversion des aldéhydes en acides carboxyliques (non détectés).
[0178] La conversion des aldéhydes et cétones en autres composés (alcools et/ou acides carboxyliques), entraine une diminution de la saveur indésirable « beany » ou « végétale ». En effet, les aldéhydes et cétones en sont les principaux contributeurs et les produits de leurs bioconversions possèdent des odeurs moins caractéristiques avec des seuils de perception plus hauts. Ces saveurs indésirables sont ainsi moins voire ne sont plus perçues dans le produit. La diminution de la quantité d’aldéhydes aux notes vertes (« green-notes aldehydes ») entraine une amélioration organoleptique des produits, par une diminution des attributs sensoriels « végétaux ».
[0179] Des analyses chimiques sont réalisées et présentées dans le tableau 8 ci- dessous :
[0180]On constate donc qu’avec le procédé selon l’invention :
- La production d’acide lactique et d’éthanol est très faible.
- Le pH et la viabilité ne varient pas, prouvant une absence de croissance.
- Le DH ne varie pas, démontrant une absence d’hydrolyse.
[0181] Un panel composé de 5 personnes a dégusté les différents échantillons :
- L’isolat de pois Nutralys® S85F est décrit comme amer et végétal
- Traité avec Lacticaseibacillus rhamnosus LGG, la note végétale disparait au profit d’une note lactée. Une telle note permet d’envisager un intérêt pour les boissons analogues du lait
- Traité avec Limosilactobacillus fermentum, la note végétale disparait au profit d’une note umami.
- Traité avec Saccharomyces cerevisiae, la note végétale disparait au profit d’une note céréale.
- Traité avec Gluconobacter suboxydans, la note végétale disparait mais ne laisse place à aucune autre flaveur d’intérêt.
[0182] La Figure 4 présente la répartition proportionnelle des différents composés volatils au sein de différents échantillons générés grâce à l’exemple 1 , regroupés par profil sensoriel.
[0183]Le regroupement par profil sensoriel est réalisé sur base de la littérature, en particulier du site web www.thegoodscentscompany.com.
[0184] Ainsi, les regroupements de composés volatils sont les suivants :
- Le groupe “Vert” sera composé de Hexanal, Heptanal, 2-Hexenal, 2- Heptenal, (E)-, 2,4-Heptadienal, (E,E)-, 2,6-Nonadienal, (E,Z)-, 1- Heptanol,2-Octen-1-ol, (E)-, 3-Heptanone, Furan, 2-pentyl-, 1-Octanol, 2,4- Octadienal, (E,E)- et 2-Pentenal, (E)-.
- Le groupe “Gras » sera composé de 2-Octenal, (E)-, 2-Nonenal, (E)- et (Z)-,
2-Decenal, (E)- et (Z)-, 2-Nonen-1-ol, (E)- et 3,5-Octadien-2-one, (E,E)-.
- Le groupe “Herbal” sera compose de 2-Dodecenal, 1-Hexanol, 3-Octanone et Eucalyptol
- Le groupe “Autres” sera composé de 2,3-Octanedione, Octanoic acid et methyl ester
- Le groupe “Terreux » sera composé de1-Octen-3-ol, 2-Octanone, 1-Octen-
3-one et 3-Octen-2-one, (E)-
- Le groupe “Amande amère » sera composé de Benzaldehyde.
- Le groupe “Aldehydique” sera composé de Octanal, Nonanal et Decanal
- Le groupe “Chocolat torréfié” sera composé de Butanal et 3-methyl-Furan, 2-(1-pentenyl)-, (E)- - Le groupe “Fermenté” sera composé de Pentanal, 1 -Pentanol, Decanoic acid, methyl ester
- Le groupe “Sulfureux » sera composé de Disulfide etDimethyl trisulfide
- Le groupe “Fruité/Floral » sera composé de 2-Pentanone, 1-Nonanol, 1 - Hexanol, 2-ethyl-, 2-Nonanone, 2-Decanone, 5-Hepten-2-one, 6-methyl-, 2- n-Butyl furan, 2(3H)-Furanone, 5-butyldihydro, 2(3H)-Furanone, 5- hexyldihydro-, Phenylethyl Alcohol, Hexanoic acid, methyl ester, 3-Nonen-2- one, 2-Undecanone
- Le groupe « Fromage » sera composé de 2-Heptanone
- Le groupe “Solvent / Alcool” sera composé de 2-Propanone, Acetaldehyde, Ethanol etFuran, 2-ethyl-
[0185] La figure 4 s’interprète ainsi :
- Les profils du Nutralys (isolat de pois non traité) et du Nutralys traité avec G. suboxydans sont très proches avec environ % de composés du groupe « Vert ». Si la teneur en en ces composés baisse, le profil sensoriel général reste le même.
- Les profils des Nutralys traités avec S. cerevisiae et L. fermentum sont très proches avec seulement environ 50% de composés du groupe « Vert ». Le reste est donc constitué de composés volatils des autres groupes, prodigant un profil plus complexe.
- Les profils des Nutralys traités avec L. reuteri et L. rhamnosus sont semblables, avec une disparition totale des composés volatils du groupe « Vert ». Leurs profils sensoriels sont radicalement différents.
[0186] En conclusion et en comparaison avec le brevet EP 0 255 588 enseignant l’utilisation de Gluconobacter suboxydans, notre procédé ne se contente pas de réduire la note végétale uniquement. Le procédé selon l’invention permet de le faire tout en créant des profils organoleptiques complexes et uniques.
[0187] Du fait du temps de contact réduit, aucune production d’acide lactique n’a lieu. La protéine n’est pas modifiée, en particulier le degré d’hydrolyse. [01881 Exemple 2 : Procédé hors invention, utilisant les souches d’intérêt mais les utilisant en fermentation :
[0189] Le but de cet exemple est de démontrer qu’un temps de contact long entre l’inoculum et l’isolat, typiquement de 8h ou 24h selon les publications de l’art antérieur, tel que décrit majoritairement dans l’art antérieur avec ces souches ne permet pas d’obtenir la même composition que selon l’invention.
[0190]0btention des inocula :
Milieu :
- MRS (prêt à l’emploi, Merck) pour les souches Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, et Lacticaseibacillus rhamnosus.
- YE glc (Bacto Yeast Extract, Difco 10g/L + glucose 40g/L) pour les souches Saccharomyces cerevisiae et Gluconobacter suboxydans.
Mise en culture : o En Erlenmeyer de 500mL non bafflé contenant 100mL de milieu pour les souches Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, et Lacticaseibacillus rhamnosus, En Erlenmeyer 4 chicanes dans le fond + 1 goutte d’antimousse contenant 100mL de milieu pour les souches Saccharomyces cerevisiae et Gluconobacter suboxydans. o Ensemencement : 1 % avec un tube de stock congelé (1 mL) o Incubation : En anaérobie (cloche) pendant 16h à 37°C, 80rpm
Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, et Lacticaseibacillus rhamnosus. En aérobie pendant 16h 150 rpm 30°C pour Gluconobacter suboxydans et 37°C pour Saccharomyces cerevisiae o Préparation de la biomasse : Centrifuger la biomasse issue des Erlenmeyers à 3000g pendant 10 minutes pour toutes les souches sauf Gluconobacter suboxydans, qui nécessitera une centrifugation à une accélération de 10000g. Eliminer le surnageant et reprendre les biomasses avec 10mL d’eau physiologique stérile à 4°C. (Le lavage de la biomasse n’est pas nécessaire au vu de l’inoculum nécessaire). Mesure la D.O. à 600nm et réaliser un dénombrement des suspensions cellulaires
Fermentation du Nutralys® S85F 10% à pH natif :
- Matériel Erlenmeyers de 2L non bafflés x11 Flacons d’eau déminéralisée stérile ; env. 6L - Mode opératoire : o Mettre à pré incuber les flacons d’eau à 30 et 37°C à 110rpm. o Placer 50g de Nutralys® S85F dans chaque Erlenmeyer o Ajouter de l’eau stérile qsp 500g o Laisser le Nutralys® se réhydrater 30 minutes à la température d’incubation des différents essais.
- Paramètres d’incubation des Erlenmeyers o Nutralys : Nutralys + Gluconobacter oxydans : 30°C 110rpm o Nutralys + Saccharomyces Cerevisiae : 37°C 110rpm o Nutralys + Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, et Lacticaseibacillus rhamnosus: 37°C 60rpm + cloche anaérobie
- Calculer le volume d’inoculum pour atteindre une viabilité initiale de 1 .107 CFU/mL
Corrélations entre DO et viabilité (symbolisées par "V0"):
■ Saccharomyce cerevisiae CBS 8066 : D.0.600nm = 1VO 1 ,1.107 CFU/mL
■ Gluconobacter suboxydans ATCC 19357 (ou ATCC 23773): D.0.600nm = 1VO
2, 5.108 CFU/mL
■ Lacticaseibacillus rhamnosus GG LMG 18243 (LGG) : D.0.600nm = 1VO 6,8.107 CFU/mL
■ Limosilactobacillus fermentum CNCM I-5802 : D.0.600nm = 1VO 3,0.108 UFC/mL
■ Limosilactobacillus reuteri DSM 17509 : D.0.600nm 1 Uo 5,0.107 UFC/mL o Doubler les Erlenmeyers Nutralys® pour chaque souche (2 x 5 souches + 1 Témoin) o Ensemencer l’ensemble des essais au plus tôt le matin o Réaliser un prélèvement de 5mL env. à tO sur 1 des 2 Erlenmeyers o Réaliser les analyses suivantes : pH, Ethanol (Cedex Bio), Lactate (Cedex Bio), Viabilité (inocula + tO), Acide acétique, DH, Teneur en protéines (N6.25), Matière sèche. o Arrêter l’Erlenmeyer Témoin et le transférer en Flacon pour congélation. o Après 8h de fermentation, arrêter l’un des 2 Erlenmeyer pour chaque souche testée. o Réaliser les analyses suivantes : pH, Ethanol (Cedex Bio), Lactate (Cedex Bio), Viabilité (inocula + tO), Acide acétique, DH, Teneur en protéines (N6.25), Matière sèche. o Après 24h de fermentation, arrêter le dernier Erlenmeyer pour chaque souche testée.
Réaliser les analyses suivantes : pH, Ethanol (Cedex Bio), Lactate (Cedex Bio), Viabilité (inocula + tO), Acide acétique, DH, Teneur en protéines (N6.25), Matière sèche.
[0191]Les résultats sont présentés en Tableau 3 et Tableau 4 :
[Tableau 3]
0192]Tableau 3 : Mesures éthanol / lactate / pH /viabilité
[Tableau 4]
0193]Tableau 4 : Mesures M.S. /DH / Nx6,25
[0194] En conclusion, l’utilisation des souches d’intérêt dans un procédé hors invention (temps de contact long) produit un isolat contenant des teneurs élevées en acide lactique. Le DH en particulier pour L. reuteri, S. cerevisae et G. suboxydans augmente signe d’une hydrolyse de la protéine.
[0195] Exemple 3 : Démonstration de l’importance du temps de culture pré- WCB : [0196] Le même protocole que pour l’exemple 1 est appliqué. Cependant, les essais sont réalisés sur un volume de 250 mL, avec 25 g de Nutralys®.
[0197]L’ impact du temps de propagation des souches sur leur efficacité en tant que biocatalyseurs est étudié dans cet exemple. Trois temps de propagation pour préparation de l’inoculum sont testés : les cellules sont récoltées au bout de 5h, 10h ou au bout de 15h .
[0198] Deux souches sont testées : Limosilactobacillus fermentum (Lf) et Lacticaseibacillus rhamnosus (Lr .
[0199] Résultats - Interprétations
[0200] Les résultats sont présentés en Figure 2.
[0201]La Figure 2 illustre l’impact du temps de culture de souches de Limosilactobacillus fermentum (Lf) et Lacticaseibacillus rhamnosus (Lr) avant mise en contact avec Nutralys® F85F sur leur efficacité d’amélioration des qualités organoleptiques.
[0202] Deux cas sont observés :
- Pour Limosilactobacillus fermentum (hétérofermentaire obligatoire), le temps minimal de propagationpour obtenir la meilleure activité de biocatalyse est de 10h.
- Pour Lacticaseibacillus rhamnosus (hétérofermentaire facultatif), le temps minimal de propagation est de 15h.
[0203] Différents temps de culture sont donc nécessaires en fonction des souches pour l’obtention d’un effet maximal. Un temps minimum de 10h de propagation est préférable pour l’obtention de l’effet technique maximal de l’invention.
[0204] Exemple 4 : Démonstration de l’importance de la concentration en sucres lors de l’étape WCB :
[0205] On utilise dans cet exemple le même protocole que celui de l’exemple 1. L’intérêt est ici d’étudier la comparaison de l’impact :
- d’une souche choisie (Limosilactobacilus fermentum),
- sur une matrice modèle (composés volatils responsables des flaveurs non désirées additionnées de tampons) remplaçant l’isolat de protéine de pois (Nutralys® S85F)
- avec et sans sucres. [0206] Comparaison de trois teneurs en sucres :
- Og/L,
- 0,5 g/L (teneur en sucres Nutralys® en solution à 10%, « au cours du procédé)
- 5 g/L (teneur en sucres Nutralys®).
[0207] Une solution à 1 ,6 ppm de composés volatils est réalisée, avec :
- hexanal,
- nonanal,
- 2-nonénal,
- benzaldéyhde,
- 3-méthylbutanal,
- 1-octen-3-ol,
-3-octen-2-one et
- 2,5-dimétylpyrazine.
[0208]A partir de cette solution, trois solutions à trois taux de sucres sont préparées, comme présenté ci-dessous.
- Traceurs 1,6 ppm sans sucres
-Ajout tampon phosphate (pH 6,5 0,1 M) K2HPO4 4,9 g/L et KH2PO4 9,9 g/L
- 6 tubes de 9 mL
- Filtration stérilisante (0,22 pm)
- Traceurs 1,6ppm avec 0,5p de sucres
- Ajout tampon phosphate (pH 6,5 0,1 M) K2HPO4 4,9 g/L et KH2PO4 9,9 g/L
- Ajout sucres :
[Tableau 5]
° Filtration stérilisante (0,22 pm)
[0209]Traceurs 1,6ppm avec 5q de sucres
- Ajout tampon phosphate (pH 6,5 0,1 M) K2HPO4 4,9 g/L et KH2PO4 9,9 g/L
- Ajout de 5g de sucres :
[Tableau 6]
- 6 tubes de 9 mL
- Filtration stérilisante (0,22 pm)
[0210lMise en contact
- Le même protocole que pour la démarche WCB est appliqué.
[02111 Résultats et Interprétations
[0212] Les essais sont faits en trois répétitions, à partir de trois pré-cultures différentes. L’impact de Limosilactobacilus fermentum sur les traceurs en fonction du taux de sucre est présenté dans les figures ci-dessous.
[0213]Les résultats sont présentés en Figure 3 et en Tableau 7.
[Tableau 7] sur la performance de la souche Limosilactobacillus fermentum à modifier le profil de composés volatils présent dans un échantillon.
[0215] Exemple 5 : Démonstration de l’importance de la concentration cellules avant traitement et de la possibilité d’utiliser un inoculum lyophilisé :
[0216]On utilise dans cet exemple le même protocole que celui de l’exemple 1 à l’exception de 3 points :
- Deux souches sont étudiées Limosilactobacillus fermentum et Lacticaseibacillus rhamnosus.
- En plus, d’une souche congelée on introduit une souche lyophilisée. Avant sa mise en œuvre, celle-ci est dispersée 30 min à 30°C dans une solution d’eau déminéralisée avec du glucose à 1 g/L et un isolat de pois (tel le Nutralys® S85F) à 10 g/L . L’inoculum est ensuite utilisé comme dans l’exemple 1 , hormis leurs concentrations (voir ci-dessous).
- Après que les souches ai été re-suspendues dans un volume d’eau, on en introduit la quantité nécessaire afin d’avoir un inoculum à 108, 107 ou 104
CFU/mL).
[0217]On observe les faits suivants :
- Les résultats obtenus avec 104 CFU/mL sont très mauvais : les aldehydes dont en particulier l’hexanal ne sont pas consommés. La composition de protéine est donc inchangée d’un point de vue flaveur.
- Les résultats obtenus avec 108 et 107 CFU/mL sont aussi bons de ce point de vue, que ce soit avec une souche fraiche, congelée ou lyophilisée. La lyophilisation est donc un excellent moyen de conservation avant mise en œuvre des souches.

Claims

Revendications [Revendication 1] Procédé pour améliorer les propriétés organoleptiques d’une matière riche en protéines végétales comprenant les étapes suivantes :
1 . la mise en suspension d’une matière riche en protéines végétales dans un solvant préférentiellement aqueux de sorte à obtenir une suspension ayant une teneur en matière sèche comprise entre 5% et 20%, préférentiellement entre 7,5% et 15%, encore plus préférentiellement entre 8% et 12% ;
2. l’ajout d’une ou de plusieurs souches microbiennes dans la suspension de l’étape 1 , la ou les souches microbiennes étant choisies parmi des souches de bactéries lactiques, des souches de levures, ou un mélange de celles-ci, la ou les souches étant préférentiellement une ou plusieurs souches de bactéries lactiques, de sorte à obtenir une suspension ensemencée présentant une densité cellulaire comprise entre 1 .105 et 1 .1010 cfu/mL, préférentiellement entre 1.107 et 1.109 cfu/mL, préférentiellement entre 5.107 et 5.108 cfu/mL;
3. l’incubation de la suspension de l’étape 2 à une température comprise entre 20°C et 40°C pendant un temps compris entre 30 et 120 minutes, préférentiellement entre 45 et 75 minutes, encore plus préférentiellement entre 50 et 70 minutes.
[Revendication 2] Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la matière riche en protéines végétales de l’étape 1 est sous la forme d’une poudre contenant une quantité de protéine végétales supérieure à 1 % en poids, préférentiellement comprise entre 70% et 90% en poids, par rapport au poids de poudre.
[Revendication 3] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que la matière riche en protéines végétales de l’étape 1 est un isolat ou un concentrât de protéines végétales, préférentiellement est un isolat de protéines végétales dont la teneur en protéines est supérieure à 70% en poids sec, préférentiellement comprise entre 75% et 95% en poids sec, par rapport au poids sec d’isolat.
[Revendication 4] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la matière riche en protéine végétale de l’étape 1 est issue d’une légumineuse, préférentiellement d’une légumineuse sélectionnée dans le groupe constitué par le pois et la féverole, plus préférentiellement est issue de pois.
[Revendication 5] Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le pH de la suspension de matière riche en protéines végétales de l’étape 1 est rectifié de sorte à être compris entre 5,0 et 7,5, préférentiellement entre 6,5 et 7,5 ; préférentiellement de sorte à être égal à 7,0, avant la mise en œuvre de l’étape 2.
[Revendication 6] Procédé selon les revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la teneur en sucre de la suspension de matière riche en protéines végétales de l’étape 1 est rectifiée de sorte à contenir entre 1 % et 10% de sucres, préférentiellement entre 2% et 8%, encore plus préférentiellement entre 3% et 6%.
[Revendication 7] Procédé selon les revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la ou les souches de l’étape 2 sont sélectionnées parmi une souche de Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus ou de Saccharomyces cerevisiae, préférentiellement de Limosilactobacillus fermentum, Limosilactobacillus reuteri, ou de Lactobacillus rhamnosus.
[Revendication 8] Procédé selon les revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la ou les souches utilisées au cours de l’étape 2 ont été cultivées selon un procédé comprenant : i. l’inoculation d’un milieu de culture solide, par exemple de gélose, avec un échantillon de la ou des souches ; il. la pré-culture de la ou des souches, par incubation du milieu de culture solide inoculé de l’étape 1 en étuve non agitée, de préférence pendant entre 10h et 24h; ill. la propagation de la souche, par inoculation d’un milieu de culture liquide avec un échantillon de souche pré-cultivée de l’étape il, et culture de la souche en milieu liquide.
[Revendication 9] Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que le temps d’incubation de l’étape ill est compris entre 10h et 20h.
[Revendication 10] Procédé selon les revendications 1 à 9 caractérisé en ce que l’étape 3 est suivie d’une étape 4 comprenant les sous-étapes suivantes : 4a. optionnellement, la rectification du pH de la suspension obtenue à l’issue de l’étape 3 à un pH compris entre 5 et 9, préférentiellement entre 6 et 9, préférentiellement un pH de 7, préférentiellement par ajout de soude ou de chaux dans ladite suspension ;
4b. le traitement thermique de la suspension de l’étape 3 ou de l’étape 4a entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1 s, et 4c. le séchage de la suspension de l’étape 4b à l’aide d’un atomiseur jusqu’à obtenir un isolat de protéines végétales présentant de préférence une matière sèche supérieure à 95% par rapport à la masse d’isolat.
[Revendication 11] Isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’une quelconque des revendications 1 à 10.
[Revendication 12] Isolat de protéines végétales selon la revendication 11 , caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5.
[Revendication 13] Isolat de protéines végétales selon l’une quelconque des revendications 11 à 12, caractérisé en ce que sa teneur en protéines est comprise entre 70% et 95% en poids, préférentiellement entre 82% et 92% en poids, préférentiellement entre 84% et 90% en poids, préférentiellement entre 84% et 90% en poids, par rapport au poids de matière sèche totale de l’isolat.
[Revendication 14] Utilisation d’un isolat selon l’une quelconque des revendications 11 à 13 ou obtenu selon le procédé de l’une quelconque des revendications 1 à 10 pour des applications industrielles comprenant les applications alimentaires, nutraceutiques, pharmaceutiques.
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